Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетическая трансформация растений томата геном preS2-S, кодирующим основной антиген оболочки вируса гепатита B, с целью получения кандидатной съедобной вакцины

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Генетическая трансформация растений томата геном preS2-S, кодирующим основной антиген оболочки вируса гепатита B, с целью получения кандидатной съедобной вакцины"

На правах рукописи

Столбиков Алексей Сергеевич

ПГТПГТШПГПГ А СГ TP А НГ^ЪПРЛ/Т Л ТТТ/ГСТ

- ж. ЛЛ X .». A JL V-X JL 1. Т JL/.JL JL-1Ж Ж.ЖЖ.

РАСТЕНИЙ ТОМАТА ГЕНОМ рге82-8, КОДИРУЮЩИМ ОСНОВНОЙ АНТИГЕН

ОБОЛОЧКИ ВИРУСА ГЕПАТИТА В, С ЦЕЛЬЮ ПОЛУЧЕНИЯ КАНДИДАТНОЙ СЪЕДОБНОЙ ВАКЦИНЫ

03.00.12 - физиология к биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск - 2008

003172202

Работа выполнена в Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН, г Иркутск

Научный руководитель: доктор биологических наук Рюрик Константинович Саляев Член-корреспондент РАН

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, Владимир Ильич Кулинский

профессор

кандидат биологических наук, Татьяна Васильевна Копытина Ведущая организация:

Иркутский государственный университет, г. Иркутск

Защита диссертации состоится "26" июня 2008 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 003 047 01 при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу 664033, г Иркутск, ул Лермонтова, 132, а/я 317 Факс (3952) 510754, e-mail matmod@sifibr irk ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН

Автореферат разослан "24" мая 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета

Д 003 047 01

кандидат биологических наук

ГП Акимова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Одним из перспективных и быстро развивающихся направлений растительного "биофарминга" является использование трансгенных растений в качестве продуцентов съедобных вакцин нового поколения, создающих перспективу широкой и эффективной иммунизации населения Съедобные вакцины обладают существенными преимуществами во-первых, они дешевы и относительно легки в получении, что позволит распространять их в страны с разным уровнем экономического благополучия, во-вторых, применение оральных вакцин сводит к минимуму риск возникновения аллергических реакций Съедобные вакцины являются более безопасными, так как не содержат живых ослабленных патогенных организмов Кроме того, в отличие от инъекционных вакцин процесс применения оральных вакцин не вызывает болевых ощущений, что немаловажно при вакцинации детей Инъекционные вакцины в основном индуцируют системный иммунитет, в то время как иммунизация слизистой часто приводит к стимуляции не только мукозного, но и системного иммунитета

Гепатит В очень распространенная и опасная вирусная инфекция Каждый год в мире фиксируется 50 млн заболевших только острой формой гепатита В Из них до 600 тыс больных умирает [Амосов, 2006] Число носителей этого заболевания возросло за 10 лет с 200 млн до 300 млн человек [Purcell, 1994, Thanavala et al, 1995]

В 1992 году появилось первое сообщение об экспрессии поверхностного белка гепатита В HBsAg в трансгенных растениях табака [Mason, 1992] Позже проводились эксперименты с использованием других растений в качестве продуцентов основного поверхностного антигенного белка гепатита В, так, в частности, польские ученые создали вакцину на основе трансгенных растений люпина [Kapusta, 1999] Однако, применение таких вакцин в широкой практике вызывает некоторые затруднения, одним из которых является непривлекательность для человека табака и люпина в качестве пищевого продукта Для создания эффективной и в то же время приятной при употреблении в пищу съедобной кандидатной вакцины против гепатита В желательно было выбрать растительный объект, который можно употреблять в сыром виде Кроме того, этот растительный объект должен культивироваться почти во всех климатических зонах земного шара и иметь низкие затраты при выращивании Растения томата удовлетворяют этим условиям Поэтому последние работы по созданию съедобной вакцины против гепатита В часто осуществляются на основе томата [Salyaev et al, 2004, Shchelkunov et a!, 2004, Щелкунов и др , 2004, Щелкунов и др , 2005, Xiao-Ming et al, 2007]

Большинство эти\ работ основано на введении в геном растения гена S, который кодирует основной антигенный поверхностный белок вирусной

частицы гепатита В HBsAg Однако некоторые исследования показывают, что при совместной экспрессии генов Б и ргеБ2 иммунный ответ проявляется сильнее Из этого следует, что при введении двух этих генов в геном растения, можно получить более эффективную вакцину против гепатита В Для большей стабильности и увеличения содержания антигенного белка в ряде работ используют сигнальную последовательность ГГОЕЬ (гистидин-аспартат-глутамат-лейцин), адресующую синтезируемый антиген в эндоплазматический ретикулум Поэтому в настоящей работе в качестве целевого гена использована последовательность рге52-5-НОЕЬ

Цель и задачи исследований Целью настоящей работы явилось получение и биохимическая характеристика трансгенных по гену рге82-5-НБЕЬ растений томата, продуцирующих основной анппенный белок вируса гепатита В HBsAg

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи

1 Подобрать необходимый состав питательных и селективных сред для выращивания А%гоЬаШгтт Iите/аиет с плазмидами, несущими селективный ген прШ и целевой ген рге52-8-НОЕЬ

2 Провести генетическую трансформацию эксплантов томата геном рге82-8-НОЕЬ

3 Провести селекцию полученных эксплантов на среде с канамицином

4 Подобрать методику адаптации прошедших селекцию на канамицине трансформированных проростков к условиям внешней атмосферы и субстрата

5 Провести ПЦР и иммуноферментные анализы для установления инсерции и экспрессии целевого гена рге82-8-ТГОЕЬ

6 Получить плоды трансформированных растении поколения 1о и Т|, содержащие антигеный белок гепатита В HBsЛg

7, Определить влияние степени зрелости плодов на содержание в них основного антигенного белка гепатита В

Научная новизна Проведена успешная трансформация растений томата геном рге82-8-ПОЕЦ который кодирует поверхностный белок оболочки вирусной частицы гепатита В и сигнал адресации в эндоплазматический ретикулум Разработана эффективная методика адаптации растений, подвергшихся генетической трансформации, к условиям внешней среды Получены плоды трансформированных растений поколений Т0 иТ|, содержащие поверхностный антигенный белок гепатита В

Теоретическая и практическая значимость работы Результаты работы открывают перспективу дальнейших исследований в области создания кандидатной вакцины орального применения на основе трансгенных растений томата Плоды генетически модифицированных геном рге82-8-НОЕЬ растений томата в дальнейшем могут быть использованы в

предклинических и клинических испытания, как кандидатная вакцина Полученный экспериментальный материал может быть полезным для создания съедобной вакцины против гепатита В

Публикации и апробация работы По материалам диссертации опубликовано 4 работы Результаты исследований по теме диссертации были представлены на международной научной конференции «Современная физиология растений от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007), а также на Всероссийской научной конференции молодых ученых «Экология в современном мире взгляд научной молодежи» (Улан-Удэ, 2007) и на научной сессии СИФИБР СО РАН (2008)

Структура и объем работы Диссертационная работа изложена на 125 страницах машинописною текста, содержит 5 таблиц и 25 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, методической части, экспериментальной части, обсуждения, заключения, выводов и библиографии Библиография включает 165 наименования, из них 41 на русском языке

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для исследований использовались растения томата (LYCOPERSJCON esculentuni) сорта Вентура

Растения получали путем проращивания стерильных семян на среде Мурасиге и Скуга (MS) без добавления растительных гормонов и витаминов Перед проращиванием, среду подвергали стерилизации в автоклаве и разливали в стерильные пластиковые сосуды Для проведения селекции трансформированных эксплантов среда готовилась аналогичным способом только с добавлением антибиотика канамицнна в концентрации 50 мг/л Перед тем, как поместить семена растений на среду MS их подвергали стерилизации, которая проходила в 3 этапа сначала семена выдерживали 2 минуты в 70° этиловом спирте, после этого их помещали на 10 минут в 10% раствор гипохлорита натрия, затем проводили трехкратное промывание аерпльиой бидистиллироваиной водой Вся процедура проводилась в ламинарном боксе После стерилизации семена помещались в пластиковые сосуды типа "Magenta'', содержащие среду MS Пластиковые сосуды с семенами на 14 суток помещали в специально оборудованную лампами дневною света комнату для проращивания

Для генетической модификации использовали агробактерию обезоруженного штамма LBA 4404, содержащую плазмиду pBINp35SpreS2-S-HDEL несущую ген preS2-S, и нуклеотидньш участок, кодирующий С-концевоп сигнал HDEL (гистидин-аспартат-глутамат-лепцин) Плазмида была предоставлена сотрудниками ГНЦ ВБ "ВЕКТОР" С Н Щелкуновым и С Г Поздняковым В плазмиду также была встроена кодирующая последовательность гена неомицинфосфотрансферазы II (nptll) под контролем промотора ubi3 из кукурузы для осуществления селективного отбора эксплантов на средах с канамицином

Для увеличения количества и усиления стабильности антигена в клетках трансформированных растений в генетической конструкции присутствовал и нуклеотидный участок, кодирующий С-концевой сигнал HDEL (гистидин-аспартат-глутамат-лейцин), необходимый для адресования антигенного белка в эндоплазматнческий ретикулум

Культивация агробактериальных колоний проводилась на среде YPD, которая содержала 50 мг/л канамицина и 25 мг/л рифампицина Для улучшения роста колоний в среду вносили бетаина гидрочлорида до концентрации 20 мМ

Наличие целевого гена в плазмиде проверяли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) Бактерии для ПЦР переносили петлей из чашек Петри в полипропиленовые сосуды, туда же добавляли 100 мкл бидистиллированной стерильной воды Сосуды помещали в термостат и нагревали до температуры 90 °С в течение 10 минут, затем остужали и центрифугировали при 14000g 2 минуты Для ПЦР использовали праймеры к фрагменту 164-363 п н синтетического гена preS2-S, оптимизированного для растений [Sojikul et al, 2003]

Праймеры прямой 5'CCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCCTG-3', обратный 5' -GCATGGTCCCGCGCTGGTGGTTGAAAGATCC-3'

Для проведения ПЦР использовались наборы Ready Mix Tag PCR Reaction Mix фирмы "SIGMA" ПЦР проводили на приборе GENE CYCLER (BioRad, USA)

Для электрофоретического разделения продуктов амплификации использовали 1,2% агарозный гель в ТАЭ буфере (40 мМ TRIS-base, рН 7,6, 0,1 мМ ЭДТА) с добавлением 5 мкг/мл бромистого этидия при напряжения 80-110 В Гель фотографировали в ультрафиолете с помощью системы Digi Doc-it Imaging System фирмы NVP или же системы фирмы Bioiad

Трансформация эксплантов проводилась двумя способами Первый способ - укол инфицированной Agrobactermm tumefaciem иглой в верхушечную точку роста между семядолями [Щелкунов и др, 2004] Вторым способом трансформации являлся так называемый метод "фламинго", согласно которому производилось отсечение одной семядоли у основания и инфицирование места среза [Pozueta-Romero et al, 2001] Затем трансформированные проростки помещали на селективную среду содержащую 50-60 мг/л канамицина, где в течение 2-4 недель у них образовывались зачатки корешков, в случае если трансформация прошла успешно

Устойчивость к антибиотику определяли по способности растений к корнеобразованию и дальнейшему росту, а также отсутствию хлороза После того как у эксшшпов образовывались корешки, растения пересаживались с селективной среды в воду на одни сутки, а затем в сосуды с влажной фильтровальной бумагой, где они находились до тех пор, пока у них не

образовывалась разветвленная корневая система, обычно этот процесс занимал от 2 до 4 недель

После того, как растения образовали хорошо разветвленную корневую систему, их пересаживали в сосуды с влажным стерильным песком В этих сосудах растения подвергались адаптации к внешним условиям, в особенности к воздействию более сухом атмосферы Затем растения пересаживали в почву Образовавшиеся плоды в недозрелом и зрелом состояниях собирали и помещали на хранение в холодильную камеру с температурой воздуха -20 °С

Успешность инсерции целевого гена в геном томата выявляли с помощью ПЦР анализа листьев и плодов растений, которые прошли селекцию на канамицине Для анализа использовался свежий растительный материал массой 0,1 г ДНК выделяли с помощью набора Nucleón Phytopure фирмы "Ameisham Biosciences" (Ашлпя) Количество ДНК измеряли на спектрофотометре Intiospect 2100pro UV/Visible Spectrophotometer ("Amersham Biosciences", Англия)

Для ПЦР использовали праймеры к фрл менту 164-363 пн последовательности, кодирующей HBsAg, оптимизированной для растений [Sojikul, 2003] Полученную ДНК подвергали полимеразной цепной реакции, методика которой описана ранее

Наличие основного антигенного белка гепатита В в тканях трансформированных растений выявлялось с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) Для проведения ИФА использовались готовые наборы D-0556 фирмы "Вектор-Бест" (Кольцово) Чувствительность этих тест-систем доходит до 0,1 нг/мл HBs-антигена в режиме инкубации в течение 2 часов при 37°С [Рукавишников и др , 19с)9]

Определение оптической плотности проводили на планшетном фотометре Biotiak II Visible Plate Reader фирмы "Amersham Biosciences" (Англия) при длине волны 450 нм)

Экстракты из листьев и плодов томатов получали следующим образом Взвешивали по 500 мг каждого образца и помещали в ступку, добавляя 100 мл буфера (50 мМ HEPES, 2%Nondet, 150 мМ NaCl, ингибитор пептидаз), и растирали Полученную кашицу помещали в 1,5 мл пробирку, смесь встряхивали на термомиксере в течение I часа Экстракт центрифугировали два раза по 20 млн при 12000 оборотов/мин ротора на центрифуге Beckman Coulter (USA)

Полученный супернатант анализировали на наличие белка HBsAg методом ИФА ИФА проводили в соответствии с руководством к тест-системе

После положительного ИФА, в целях избежания случайной ошибки, а также для подтверждения эффективности тест-системы, проводили подтверждающий ИФА Для проведения подтверждающего

иммуноферментного анализа использовались готовые наборы [>0558 фирмы "Вектор-Бест" (Кольцово).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Генетическая трансформация растений томата геном preS2-S и проведение селекции полученных эксплантов на среде с канамицином

Для того чтобы приступить к генетической трансформации растений томата, необходимо было убедиться в том, что плазмиды рВ IN агробактериального штамма LBA 4404 действительно содержат ген preS2-S-HDEL. С этой целью бактерии, которые прошли селекцию на среде, содержащей антибиотик канамицин, были подвергнуты ПЦР-анализу с использованием праймеров к фрагменту 164-363 пар нуклеотидов гена S, кодирующего HBsAg. Анализ показал наличие в агробактериальных плазмидах фрагмента целевого гена (рис. 1).

' :■--.'■...■■■.■■■ — 2001ТИ

12 3 4 5 6 7 8

Рис. 1. Электрофорез амилификатов шшмидной ДНК агробактсрии штамма [,ВЛ 4404. 1-4.7 дорожки - HI II5 продукты из плазмид pBlNp35SpreS2-S-HDl:L афобактериального штамма 1„ВЛ 4404; 5-6 дорожки - контрольные образцы; 8 дорожка — маркер

Модификация метода введения в асептические растения клеток агробактерии в настоящие время широко используется для трансформаций растений, поскольку позволяет избежать этапа получения протопластов п культивирования клеток in vitro [Жукова и др., 1997; Shchelkunov et al., 2004; Chang et al., 1994; Clough, 1998; Ye et al., 1999; Mysore et al., 2000; Щелкунов и др., 2004J.

Генетической трансформации подвергались 14-дневные экспланты растений, выращенные in vitro на среде 'Л MS без дополнительного внесения витаминов и растительных гормонов. При введении растений томата в культуру in vitro было стерилизовано и высажено более 1000 семян. В итоге было получено около 850 14-дневных готовых к трансформации эксплантов. Трансформация эксплантов была проведена двумя методами: с помощью укола инфицированной иглой в зону апикальной меристемы и методом "фламинго". Методом укола иглой, содержащей на кончике агробактериальную культуру, трансформировано 650 проростков. Остальные 200 проростков были трансформированы с помощью метода "фламинго"".

Отбор трансформантов происходил на селективных средах, содержащих антибиотик канамицин. Для контрольных растений была характерна высокая чувствительность к канамицнну: уже при концентрации 20 мг/л происходило угнетение корнеобразования и роста, приводящие в конечном итоге к гибели растения. Трансформанты имели значительно более высокую устойчивость к канамицнну по сравнению с контрольными

8

растениями При помещении эксплантов на среду с высокой концентрацией антибиотика (до 60 мг/л) наблюдали полную i ибель контрольных растений и слабый рост трансгенных растений, сопровождающийся незначительным корнеобразованием [Столбиков, 2007]

При селекции на селективной среде MS, содержащей 50 мг/л канамицина, было отобрано 25 растений, у которых не наблюдалось некротических процессов и которые были способны к образованию корней Процесс корнеобразования занимал от 2-х до 4-х недель, в некоторых случаях 6 недель Эффективность трансформации составила 2,3% У трансгенных растений наблюдали образование корней и дальнейший морфогенез, в то время как у контрольных растений происходило ингибирование ростовых процессов, что в конечном итоге приводило к их гибели

2. Адаптация прошедших селекцию на канамицине трансформированных проростков к условиям внешней атмосферы

Процесс переноса растений из условий in vitro в условия вегетационного опыта и в грунт сопровождался их резким увяданием и приводил к гибели Поэтому возникла необходимость в создании системы постепенной адаптации растений к условиям внешней среды

Трансформированные проростки из сосудов с селективной средой аккуратно перемещали в сосуды со стерильной водой сроком на одни сутки, затем их переносили в пластиковые емкости с влажным стерильным песком Использовался также вариант, когда после адаптации в водной среде растения помещали не сразу в песок, а на 2-4 недели в сосуды с влажной фильтровальной бумагой Этот вариант адаптации был более длительным, но в то же время и более надежным Все операции проводили в условиях влажной камеры

В сосудах с песком у эксплантов начинала развиваться разветвленная корневая система После тою, как у растений образовывалась хорошая корневая система, приступали к основной фазе адаптации, то есть к приспособлению растений к внешней атмосфере путем открывания сосуда, в котором поддерживалась влажная среда Было установлено, что максимальное время первоначачыюго контакта не должно превышать 5 минут Проростки, имевшие первоначальный контакт с внешней атмосферой 7 и более минут, потеряли тургор и вскоре погибли

После первого контакта с окружающей атмосферой растениям давали "отдохнуть" 30 мин, а затем повторяли процедуру, увеличивая каждый раз время контакта на 10 секунд

В результате адаптации было получено 12 вполне здоровых растений, фенотипически ничем не отличающихся от контрольных При достижении трансформированными растениями длины стебля 10-15 см они были перемещены из сосудов с песком в почву

3. Молекулярно-биологические доказательства трансформации 3.1. ПЦР-анализ ДНК плодов трансформированных томатов поколения То

При проведении ГЩР с образцами ДНК, выделенной из трансгениых растений, использовались праймеры к фрагменту гена рге82-8-НОЕЬ. В результате наблюдался синтез продуктов ПЦР, соответствующих по размеру искомому фрагменту гена (200 п.н.) (рис. 2, дорожки 4,5,6,8). В образцах ДНК из нетрансформированного растения амплификатов в 200 п.н. не наблюдалось (дорожка 2).

Рис. 2. ПЦР-продукты полученные с ДНК плодов трансгенных растений томата поколения То с праймерами к гену рге82-8-1ГОЕЬ200 п.н.

1-стандарт ДНК; 2-контрольное растение, 3-контрольная проба без ДНК; 4,5,6,8-ПЦР-з„„ продукты трансгенных растений;

7-плазмидная ДНК А. ШтеГашепз с клонированным геном рге82- Б-НОЕЬ.

12 3 4

б 7

Рис. 3. ПЦР-продукты полученные с ДНК плодов трансгенных растений томата поколения То с праймерами к гену рге52-5-НЭЕЬ 200 п.н.

1-стандарт ДНК; 2-контрольное растение;

3-контрольная проба без ДНК;

4-7-Г1ЦР-продукты трансгенных растений; 8-плазмидная ДНК А. СитеГаЫепв с клонированным геном рге82- Э-ННРХ.

Был проведен еще один ПЦР анализ, в котором использовались фрагменты ДНК из других трансформированных растений. Данные анализа показали, что почти во всех исследуемых трансформированных растениях присутствует целевой ген (рис. 3). Однако, электрофоретическое разделение продуктов амплификации одного из растений не выявило фрагмента искомого гена (дорожка 6). Был проведен повторный ПЦР-анализ, который подтвердил, что в плодах этого растения отсутствует необходимый ген. Это можно объяснить неполной интеграцией чужеродных генов в геном растения. В данном случае ген прШ, по-видимому, успешно интегрировал в геном растения и эффективно экспрессировался, что дало возможность растению выживать на среде с канамицином; в то же время инсерция целевого гена рге82-8-ЕШЕЬ прошла неудачно или же вообще не осуществилась.

В целом, итоги ПЦР-анализа показали, что в результате трансформации у подавляющего большинства растений, прошедших селекцию на канамицине произошла интеграция гена рге82-8-ЕГОЕЬ в геном растений томата.

3.2. Иммуноферментный анализ экстрактов листьев и плодов растений томата поколения Т0

Для подтверждения синтеза конечного продукта трансформации геном рге82-8-НТ)Ш, был проведен иммуноферментный анализ экстрактов, полученных из плодов и листьев трансформированных растений на HBsAg.

На рис. 4 приведен результат ИФА экстрактов листьев трансформированных растений. Из рисунка видно, что в растениях под номерами 5, 6, 8, 9, 10, 11, 13, 14, антигенного белка содержится достаточно большое количество - сравнимое с положительным контролем (сыворотка крови человека больного гепатитом В).

10 11 12 13 14 15

Рис. 4. Анализ экстрактов, полученных из листовых пластинок трансгенных растений томата поколения Т0 на наличие HBsAg.

Диаграмма значений ОП при длине волны 450 нм отражает результаты ИФА на HBsAg в разбавленных (2х) экстрактах листьев томата поколения То трансформированных геном рге52-8-ШЕЬ. По оси абсцисс - номера образцов, по оси ординат - ОП. Столбец №1 - отрицательный контроль; №2-слабый положительный контроль ЖЗ-положительный контроль, №4-котрольное растение, №5-15-образцы трансформированных растений.

Иммуноферментный анализ плодов трансформированных растений также подтвердил наличие в них антигенного белка НВзА§ (рис. 5). Обработка результатов выявила то, что уровень антигенного белка в плодах трансформированных растений ниже, нежели в листьях, тем не менее он значительно превышает уровень отрицательного контроля (сыворотка крови здорового человека), а у некоторых растений значительно превышает показатели контрольных растений. Однако, одно из трансформированных растений показало результат ниже, чем у контрольных растений.

5 х о

Щ

ч-

о. с

0,7

о о т ь

о

Ц

0,5 0,4

0,3 -| 0,2 0,1

а:

I 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Рис. 5. Анализ экстрактов, полученных из плодов трансгенных растений томата поколения То на наличие HBsAg. Диаграмма значений ОП при длине волны 450 им отражает результаты ИФА на HBsAg в разбавленных (2х) экстрактах плодов томата трансформированных геном. рге82-8-НОЕ1^. По оси абсцисс - номера образцов, по оси ординат - ОП №1-положительный контроль (сыворотка крови человека больного гепатитом В 100 мкл), №2-отрицательный контроль, №3,4-контрольные растения; № 5-16-образцы плодов трансформированных растений.

Таким образом, в листьях и плодах трансгенного томата поколения Т0 было достаточно четко показано значительное количество основного антигена гепатита В HBsAg. Причем в листьях количество антигена было больше, чем в плодах.

3.3. Иммуноферментный анализ экстрактов листьев растений томата поколения

Известно, что при агробактериальной трансформации иногда остаточные количества агробактерии могут присутствовать в растении в течение первого поколения и могут влия ть на результаты экспериментов.

Исходя из этого, был проведен ИФА листьев трансформированных растений поколения Т,. Результаты анализа показали наличие целевого белка в растениях (рис. 6).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 12 13 14 15

Piic. 6. Анализ экстрактов, полученных из листовых пластинок трансгенных растений томата поколения Т| на наличие HBsAg.

Диаграмма значений ОП при длине волны 450 нм отражает результаты ИФА на HBsAg в разбавленных (2х) экстрактах листьев томата, трансформированных геном preS2-S-HDEL. По оси абсцисс - номера образцов, по оси ординат - ОП. Столбец Л» 1-отрицательный контроль; №2-положительный контроль (100 мкл); №3-контролыше растения; №4-1.'¡-образцы трансформированных растений.

Из рисунка видно, что у большинства растений количество антигенного белка находится на значительном уровне, сопоставимом с положительным контролем.

3.4. Подтверждающий иммуиоферментный анализ экстрактов плодов растений томата поколения Т,

Для дополнительной верификации полученных данных был проведен иммуиоферментный подтверждающий анализ. После проведения прямого иммуноферментного анализа, который входит в комплекс подтверждающего ИФА, были получены результаты, свидетельствующие о наличии в исследуемых образцах антигенного белка HBsAg. Из рис. 7, видно, что оптическая плотность образцов, полученных из плодов трансформированных растений, в среднем соответствует аналогичным показателям сыворотки крови человека больного гепатитом В (положительный контроль). Средняя оптическая плотность образцов значительно превосходит не только показатели экстрактов, полученных из нетрансформированных растений и отрицательный контрольный образец, но и имеет величину большую, нежели слабоположительный контроль (рис. 7 и 8, серые столбцы).

Подтверждающий анализ (рис. 8, сетчатые столбцы) показал, что все образцы трансформированных растений имели подавление сигнала более

50%, что свидетельствует о достоверности результатов прямого иммуноферментного анализа, а значит и о наличии в плодах растений поколения Т, основного антигенного белка НВвАц. Средний процент подавления среди исследуемых экстрактов растений составил 78,9 %. Это довольно высокий результат. Как видно из рис. 8, показатели у экстрактов контрольных растений при прямом и подтверждающем ИФА практически не изменяются. Процент подавления в случае использования экстрактов из плодов нетрансформированиых растений составляет всего 0,9%, что входит в рамки допустимой ошибки эксперимента. Этот можно объяснить тем, что в плодах контрольных растений не содержится основного антигенного белка гепатита В, поэтому при конкурентном анализе специфические антитела никак не влияют на показатели оптической плотности.

0,45

1*ис. 7 Анализ экстрактов, полученных из плодов траиегенпых растений томат поколения Т, на наличие ПBsAg.

Диаграмма значений ОМ при длине волны 450 им отражает результаты ИФА на llBsЛg в разбавленных (2") экстрактах листьев томата поколения Т| трансформированных геном рге82-Я-НОЕЬ. По оси абсцисс - номера образцов, по оси ординат - 011. К'- сыворотка крови здорового человека; К'сл-сыворотка крови человека больного гепатитом В при сильном разведении; К+Змкл-сыворотка крови человека больного гепатитом В (3 мкл); контр-контрольпос растение: №1-9 образцы трансформированных растений.

^□прямой ИФА |П подтверждающий ИФА

й

и

Ч-

Л

Рис. 8. Результаты прямого и подтверждающего ИФА. ¡С-отр и нательный контрольный образец; К'Змкл-сыворотка крови человека больного гепатитом В (3 мкл); контр-контрольное растение; №1-8-образцы трансформированных растений.

Таким образом, полученные результаты показали, что в плодах трансгенного томата поколения Т] синтезируется значительное количество антигенного белка HBsAg.

4. Изменение уровня основного антигенного белка гепатита В в плодах томата различной степени зрелости

Для выяснения изменения содержания белка HBsAg при созревании плодов был проведен иммуноферментный анализ несозревших (светло-зеленого цвета) и созревших (красных) плодов растений поколения Т| (рис. 9).

о >r, rt

s

О, С Л h u о в н o ч с к я ¿6

н с

о

0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05

о |—BL

Ч-" Л* 4-

£

□ зеленые плоды

□ красные плоды

г

ч?

Рис. 9. Анализ экстрактов, полученных ич несозревших и красных плодов трансгенпых растений томата поколения Т| на наличие HBsAg.

Диаграмма значений оптическая плотность (Ol!) при длине волны 450 им отражает результаты ИФА на HBsAg.

Ilo оси абсцисс - номера образцов, но оси ординат - ОП. Столбцы темного цвета - ОН образцов из тест-системы: К - сыворотка крови здорового человека, К+сн-слабоноложигельный контроль (сыворотка крови человека больного гепатитом В при сильном разведении), К+Змкл- сыворотка крови человека больного гепатитом В (3 мкл)

Сравнительный анализ экстрактов показал, что уровень антигенного белка HBsAg в зрелых плодах значительно ниже, нежели в несозревших. Причина этого не очень ясна, но, возможно объясняется повышенной активностью гидролитических ферментов на заключительной стадии созревания.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Во многих лабораториях продолжаются разработки новых типов вакцин, в частности, вакцины орального применения на основе трансгенных растений. Эти вакцины позволяют существенно снизить стоимость вакцинации. В научных лабораториях созданы и продолжают создаваться

десятки оральных (съедобных) кандидаты* вакцин против гепатита В на основе трансгенных растений Для получения вакцин используются различные растительные объекты (люпин, салат, табак, томат, банан, картофель) и разнообразные генетические конструкции [Xiao-Ming, et al, 2007, Щелкунов и др, 2005, Salyaev et al, 2004, Shchelkunov et al, 2004, Mason, 1992, Kapusta et al, 1999, Ehsani, 1997, Sunil Kumar et al, 2007]

В настоящей работе была предпринята попытка получить трансгенные растения томата, содержащие в своем геноме ген preS2-S-HDEL Ген S кодирует основной поверхностный белок HBsAg гепатита В, который является главным антигенным белком, обусловливающим возникновение иммунного ответа Выбор гена preS2 обоснован тем, что, как показывают некоторые исследования, при совместной экспрессии генов S и pieS2 иммуногенность вакцины повышается [Jilg, 1998, Joung et al, 2007]

Поэтому была проведена трансформация растений TOMaia 1еном preS2-S-HDEL, которую осуществляли методом m planta, исключающим этап культуры тканей и заключающимся во внесении агробактериального вектора с клонированными целевым и селективным генами при поранении апикальной части экспланта инфицированной иглой с последующей селекцией на среде с канамицином Вариант preS2-S с сигнальной последовательностью HDEL был выбран для адресации конечного продукта HBsAg в эндонлазматический ретикулум, что должно было положительно сказаться на уровне антигенного белка в растениях

Полученные результаты позволили заключить, что данный метод трансформации вполне пригоден для растений томата Результаты селекции на среде с канамицином подтвердили экспрессию гена npt II в трансгенных растениях Была подобрана система адаптации растений, прошедших селекцию, к условиям внешней среды В итоге были получены вполне здоровые и жизнеспособные трансгенные растения, обладающие нормальным плодоношением, фенотипически не отличающиеся от контрольных не трансформированных растений С помощью ПЦР и иммуноферментного анализов установлена интеграция и экспрессия целевого гена prcS2-S-HDEL в листьях и плодах трансформированных растений поколения Т0 Получены также растения поколения Ti в листьях и плодах которых с помощью прямого и подтверждающего иммуноферментного анализа обнаружено значительное количество основного антигенного белка гепатита В HBsAg, что свидетельствует об успешной экспрессии целевого гена

Таким образом, в результате проведенных исследований достигнута цель, поставленная в диссертационной работе В процессе достижения этой цели были решены и сформулированные в данной работе задачи

выводы

1 Осуществлена успешная генетическая трансформация растении томата геном preS2-S-HDEL

2 Отобраны экспланты томата, прошедшие селекцию на канамицине, у которых в дальнейшем методами ПЦР подтвердили инсерцшо целевого гена

3 Иммуноферментным анализом в поколениях Т0 и Ti подтверждена экспрессия целевого гена и установлен синтез основного антигенного белка HBsAg в листьях и плодах томата

4 Дополнительная верификация наличия HBsAg подтверждающим иммуноферментным анализом в плодах томата поколения ^ дала положительный результат

5 Проведен сравнительный иммуноферментный анализ незрелых и зрелых плодов томата, который показал, что уровень основною антигеппою белка гепатита В в незрелых плодах трансформированных растений выше по сравнению с уровнем в созревших плодах

6 Полученные результаты открывают возможность использования в дальнейшем плодов трансгенных по гену preS2-S-HDEL растений томата в предклинических и клинических испытаниях в качестве кандидатной съедобной вакцины против гепатита В

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1 Саляев, Р К Синтез в плодах томата, трансгенного по гену preS2-S, поверхностною антигена вируса гепатита В / Р К Саляев, Н И Рекославская, АС Столбиков // Доклады Академии Наук - 2007 - Т416 №5 -С 702-705

2 Саляев, Р К Получение растений томата, трансгенных по гену PreS2-S, продуцирующему поверхностный антиген вируса гепатита В с целью создания съедобной вакцины / Р К Саляев, Н И Рекославская, А С Столбиков // Современная физиология растений от молекул до экосистем Материалы Всероссийской научной конференции, Сыктывкар, Республика Коми 18-24 июня 2007 г - Сыктывкар, 2007 - С 264-265

3 Salyaev, R К Synthesis of Hepatitis В Virus Surface Antigen in Tomato Plants Transgenic for the pieS2-S Gene / R К Salyaev, N1 Rekoslavskaya, A S Stolbikov et al // Doklady Biochemistry and Biophysics -2007 -V416 №5 -P 290-293

4 Столбиков, А С Генетическая трансформация растений томата (Lycopersicon) геном оболочки гепатита В preS2-S с целью получения кандидатной съедобной вакцины /АС Столбиков // Экология в современном мире взгляд научной молодежи Материалы Всероссийской конференции

молодых ученых, Улан-Удэ, Республика Бурятия 24-27 апреля 2007 -С 382-383

Подписано в печать 22 05 08 Формат 150x210 1/16 Бумага офисная Печать ризограф Тираж 50 экз Заказ 23

Отпечатано в ИП Овсянников «Академкопия» 664033, Иркутск, ул Лермонтова, 128

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Столбиков, Алексей Сергеевич

клеток в вегетативных органах трансформированных растений поколения Т0 (Табл. 1, 2).

Стабильность генетической трансформации обычно проверяется на растениях поколения Т1. Поэтому из собранных плодов Т0 необходимо было получить жизнеспособные семена.

После извлечения из плодов семена растений поколения То прошли стерилизацию и были высажены на среду МБ. Через 14 дней проростки были перенесены на селективную среду с антибиотиком. Процент растений прошедших селекцию составлял в различных случаях 30-50%, что является вполне приемлемой величиной для поколения Т[. После соответствующей адаптации в связи с тем, что летний период подходил к концу, растения были высажены в камеру фитотрона.

После того как растения адаптировались в новых условиях, был проведен иммуноферментный анализ их листовых пластинок с целью обнаружения основного антигенного белка НВз

§, кодируемого геном Б. Иммуноферментный анализ показал присутствие целевого белка в вегетативных органах растений томата поколения Т1 (рис. 22).

Так как конечной целью работы являлось получение плодов трансформированных растений, содержащих HBsAg белок, то необходимо было провести соответствующие анализы, которые подтвердили бы наличие антигена именно в плодах трансгенных растений поколения Т[. Для этой цели были использованы как прямой, так и подтверждающий иммуноферментный анализы. Прямой иммуноферментный анализ показал значительное содержание основного антигенного белка HBsAg в плодах растений поколения Т).

Относительно высокое содержание основного антигеного белка гепатита В в плодах трансформированных растений вызвало некоторые сомнения в достоверности результатов, которые могли быть искажены в силу ряда факторов, в частности, наличием в полученных из плодов растений экстрактов, некоторых веществ которые могли быть способны неспецифически связываться с подложкой, загрязнением реакционной смеси с субстратом для пероксидазы ионами металлов. Поэтому вторая часть подтверждающего ИФА должна была верифицировать полученные результаты. Обработка данных подтверждающего ИФА показала, что все исследуемые образцы трансформированных растений имели процент подавления сигнала более 50%, что свидетельствует о достоверности результатов прямого иммуноферментного анализа, а значит и о наличии в плодах растений поколения Т1 основного антигеного белка HBsAg. Средний процент подавления среди исследуемых экстрактов составил 78,9%, это довольно высокий результат. Средний процент подавления среди сывороток крови человека больного гепатитом В в разных разведениях составил 84,2%, что сопоставимо со средним показателям у трансформированных растений. При обработке результатов иммуноферментного анализа экстрактов контрольных растений было отмечено, что оптическая плотность при прямом и подтверждающем ИФА практически не изменяется. Процент подавления в случае использования экстрактов из плодов ^трансформированных растений составлял всего 0,9%, что не выходит за пределы допустимой ошибки эксперимента. Это можно объяснить тем, что в плодах контрольных растений не содержится основного антигеного белка гепатита В, поэтому при проведении подтверждающего иммуноферментного анализа показатели оптической плотности практически не меняются. Это дополнительно указывает на корректность результатов. Исходя из полученных данных с большой долей вероятности можно предполагать, что в плодах трансформированных растений поколения Т1 происходит успешная экспрессия целевого гена рге82-8-НЕ)ЕЬ.

Для выяснения изменения содержания белка HBsAg при созревании плодов был проведен иммуноферментный анализ несозревших (светло-зеленого цвета) и созревших (красных) плодов. Сравнительный анализ экстрактов показал, что уровень антигенного белка HBsAg в зрелых плодах значительно ниже, нежели в несозревших. Причина этого не очень ясна, но, возможно, объясняется повышенной активностью гидролитических ферментов на заключительной стадии созревания.