Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетическая трансформация груши (Pyrus communis L.) с помощью Agrobacterium tumefaciens и регенерация трансгенных растений

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Генетическая трансформация груши (Pyrus communis L.) с помощью Agrobacterium tumefaciens и регенерация трансгенных растений"

ч НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГИ ТА ГЕНЕТИЧНО! ІНЖЕНЕРІЇ

4 На правах рукопису

і) , " 'і

Меркулов Сергій Михайлович

УДН 577.2:934.13:621.523:581.143.5 ГЕНЕТИЧНА ТРАНСФОРМАЦІЯ ГРУШІ (РЇИІІЗ СОММЦНІЗ І..}

ЗА ДОПОМОГОЮ АОТОВАСТЕЯіиМ ТШЕРАСІОв І РЕГЕНЕРАЦІЯ ТРАНСГЕННЮС РОСЛИН

Спеціальність 03.00. 25 - клітинна біологія

Автореферат

. дисертації на адобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук

КИЇВ - 1095

Роботу виконано в Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України 1 лабораторії біотехнології плодових 1 ягідних культур Інституту садівництва УААН.

Науковий керівник:

академік НАН України, доктор біологічних наук Ю.Ю.Глеба

Офіційні опоненти:

доктор біологічних каук професор В.А.Кунах кандидат біологічних наук М.Е.Кучук

Провідна сргзнізація:

Центральний ботанічний сад НАН України

Захист дисертації відбудеться "28" і осі я р.(

о ’?С годині, на засіданні спеціалізованої ради Д.01.19.01. по захисту дисертацій при Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 232143, м.КиГв, вул.Заболотного, І 43.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної Інженерії НАНУ.

Автореферат розіслано " ^1995 р.

Вчений секретар спеціалізованої ради кандидат біологічних наук '

Л.В.Малишева

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТІ

Актуальність теми. Генетична і клітинна інженерія рослин за останнє десятиліття досягли великих успіхів у розумінні та управлінні фізіологічними та біохімічними процесами, що відбуваються у рослинному організмі. Створення га допомогою методів біотехнології нових форм рослин з цінними агрономічними ознаками

- завдання, яке на даний момент стоїть перед спеціалістами цієї галузі.

Деревні плодові культури традиційно взнаються валтаді для біотехнологічких методів: культура in vitro, органогенез, трансформація. Висока гетерозиготність, сортові особливості, наявність фвкльис: сполук е характерники ознаками плодових культур, які потребують індивідуального підходу до кожної культури 1 навіть сорту. Водночас, методи традиційної селекції трудомісткі, малоефективні 1 обмежені можливостями статевої гібридизації.

До моменту початку насих досліджень (1990 р.) опубліковано лиш* декілька повідомлень про адвентивний органогене? із листкових ексллантів груші (СПе’.тези et зі., 1939; Predieri et а.1., 1989).

У літературі і Д5 цього часу відсутні дах: про отримання траксгенних рослин для ці?! цінної гіласікггг-колзрмк:! культура.

Кета і гавдзннл дослідження. У гв'яг^ г е;~є сказаним метою даної роботи Сула розробка засобів 1 методів генетично! трансформації листкових експлантів груші (Pyrus ccmur.is L.) за допомогою Ajrrofcacterium tiwefaciens, регенерація траксгекких рослин груп: та їх аналіз. * - '

Відповідна до поставленої мети виникла такі завдання:

1. Розробити прийоми ft методи введення а культуру in vitro та

Мікрокдовальяогс розмноження 8 сортів груп СЄЛ5КЦІІ Інституту садівництва УААН (м. київ). .

2. Розробити методи адвентивного органогенезу із листкових

- г -

експлантів груші. • _ .

3. Провести скрінінг штамів А. ЪшеГасгепг а метов пошуку

вірулентного дав групі втацу агробактерії. '

4. Розробити приват генетичної трансформації листковій експлантів груші: інокуляція, хокультивація 1 селекція канаиїдан-стіЯхих калусних клонів.

5. Регенерувати Із відселектованах калусних клонів адвентивні канаміцин-стійкі пагони.

6. Провести авалів канаміцин-стійких кланів груші дня доказу їх трансгенної природи. .

Наукова новизна. Розроблено ’ метод адвентивного органогенезу для в сортів груші селекції Інституту садівництва УДАЙ. Досягнута ефективність органогенезу дозволить проводити селекцію на клітинному рівні і діапазоні сортів, іцр вивчались. Розроблено метод генетичної тр&ясформаці І листкових експлантів груші сорту Вихница за доаомогов А. (ипеГасіепз. Вперше отримано трансгенні рослини групі (Р. ооипипіз С.). Вперше отам А 231 А. ІитеГасіепз, який містить нюбеззбровну молекулярно-біологічним:! методами плазміду-помічиик рПВо 542 1 бінарний вектор рСУ 730, було використано для трансформаціІ деревних плодових культур. Вперке за допомогою необеааброєиого штаму агробактерії були отримані трансгенні рослини груші які нормальна розмножувались та гкор Назвались іп уіЬго.

Практична цінність. Розроблений вами метод адвентивного органогенезу і» листкових експлантів групі дозволяє використовувати досягнення клітинної та генетичної Інженерії рослин дія отримання цінного вихідного селекційного матеріалу в роді Рупія.

Отримані вами трансгенні рослини груші проходять польові досліди у селекційному розсаднику для тестування фекотдаових відхилень від вихідного сорту- 1 наслідування Інтродукованого НРТІІ гена серед нащадків.

Розроблений нами метод генетичної трансформації ноже вико-' ристовуватись для отримування трзнсгенних рослин груші з цінними агрономічзшми ознаками (стійкість до комах, 'гербіцидів, хворов, несприятливих умов навколипнього середовища) за наявністю не-, обхідних генних конструкція.

Апробація роботи. Матеріали дисертації Сули викладені наї 1. Другому російському симпозіумі "Нові напрямки у біотехнології рослин" (м. Путцияо-на-ОЩ, травень, 1993 p.); 2. П'ятій конференції по генетиці соматичних клітин у культурі (м. Черноголовка, листопад, 1993 p.); 3. Міжнародному, симпозіумі "Plant

biotechnology and genetic enjineorlnj” {м. Київ,. жовтінь, lS&i P.). ' ~

• Публікації. Основні результати дисертації відображені у 9 друкозаних працях, список яких наводиться у кінці автореферату.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, розділів "Огляд літератури", "Матеріали та метода", "Результати досліджень та Гх обговорення", висновків та списку літератури, що включає 150 бібліографічних посилок, • в тому числі 130 іноземних. Робота викладена на 110 сторінках «ашкнописиого тексту, містить 15 рисунків 1 7 таблиць. .

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОЇЙ У роботі Суло використано рослинний матеріал груші (Ругаз communis L.), 6 сортів, виведених 1 районованих в Україні. Сорта Вижниця, Етюд, Львівський сувенір, Черемпкна виникли гід схрещування і подальшого відбору Бере Гарді х Жогефіна Мехелькська. Батьки сорту Ррксолана - Парижанка 1 Бер® Боск. Автор сорті» -провідний селекціонер України В.П.Копаяь. Зимові сорти Етюд. Львівський сувенір, Черемшина характеризуются зимостійкістю, скороплідністю, високої] врожайністю з перлих років тагодоноваяня і стійкістю до парші. Шэкьоэимовий сорт Роксолана відзначається.

- 4 - .

окрім вшцеперелічеких якостей, виключкос лежкістю плодів. Осінній сорт Вижлиця стійкий до парші, зимостійкий, ла« добрий грохай плодів відмінних смакових 1 товарних якостей.

Для введення в культуру іп vit.ro відбирали однорічні пагони молодих дерев 5-6 років без видимих ознак ураження біотичними чи абіотичними факторами. Стерилізацію проводили замочуванням пагонів протягом 15-30 хвилин в О,1-0,3 X роачині нітрату срібла, в який додавали декілька крапель "Тритон X -100”. Окремі екепланти ВМІВуваЛИ У ПрОбІрКИ Є СереДОВИЩеИ ДЛЯ КуЛП'КБуЕаКИЯ (12 изк-росолвй МС (МигазМее, 1962), 1.5 % цукрози, 100 мг/л мезо-інози-толу і 600 иг/л гідролізату казеїна).

Після ровпусканкя бруньок відбирали, стерильні пагони 1 розміщували ка поживне середовище для розмноження: мзкросолі га МС, З X цукрОїи, 100 мг/л мезо-інозитолу, 100 мг-л гідролізату казеїну, 0,7 агару, 1,0 мг/л БАЛ, 0,1 мг/д ІМК, 6,1 нг/л ГЕ (Пббермін}» вітаміни, мг-'л: тіам!н-КС1-0,1, нікотикс-ва кмсло-та-2,0, пІрІдоксин-0,5, біотин-1,0, фолієва кислота-0,01,. гліцин-2,0, Са-пантотензг-0,5, рібофлавін-0,1, р-амікобензойна кислота - 1,0, Ь-тирогик-0,1. Через кожма і тижні пагони живцювали і пересаджували на свіже поживне середовіще. Культивування проводили в контрольованих умовах культуралької кімнати: освітленість - З-8'КЛК,.фотоперіод - 16 годин, температура-22-2<і*С, вологість-60~80?. .

Вкорінювали пагони довжиною 2-3 см, використовуючи двостадійний метод. На першій стадії проводили індукціє ризогеке-*у аа допомогою культивування пагонів на середовищі, яке містить 1/2 макросолай ДО, 1,5 І цукрози, меао-інагитол, гідролізат казеїну і вітаміни в концентраціях, аналогічних концентраціям середо вша для розмноження, ІМК. в межах 0-2,0 мг/л ка протязі 2-5 діб. Потім пагони висаджували на середовище аналогічного складу, ах» без ПІК.

. , ---о -

Вкорінені пагони висаджували у стерильний субстрат (торф:пєрл1т:п1сск у співвідношенні 4:1:1J 1 культивували при підвищеній вологості (60-80 \) протягом 4-6 тижнів, поступово знижуючи вологість. Адаптовані до умов зовнішнього середовища рослини висаджували в теплиця, а потів у відкритий грунт.

Для експериментів по регенерації адвентивних пагонів брали листки одномісячних вкорінених рослин Pyrus-communis L., розріза- . ли Іг перпендикулярно до середньої жилки 1 вміщували у чаики Петр! так, щоб їх адаксіальна сторона була у контакті а серєдовя-щем. Регенераційне середовище містило 1'? мзкгс-солей ЧИ, цунгг.гу (ЗО г/л), мезо-інозитол (100 иг/л), гідролізат казеїну (50 иг/л)

1 вітаміни в концентраціях, аналогічних концентраціям середовища для розмноження. Ростові регулятори БАЛ і ИСК додавали в середовище до автоклзвування, а тідіагурон (ТДЗ) розчиняли в диме-гидсульфоксияі І ВНОСИЛИ у стерильне СйреДГ'ВИЩ*. У всіх експериментах єкспланти Іккубувалк трп тгакг у тінясті .три 25 С, а потік переносили ка середовище без ауксинів ярг. розсіяному світлі (1-2 кЛк).

Для трансформації груші зккорнетегувздг і гтамя Ajrr:t^rt=ri^. timtefaciens: C5SC1 pGV3S5Q:1103nso, А281 pT»£o5±2..pCV720. 5Y31C: рМРЭО RJC'pCVeSl, MF90 pMP9Q/Eir,lS. 2ci плзгшдп містили маркерний ген їіРТП для селекції у рослинах. Бакте;іІ щомісячно переноcjua на агаризованэ YEP середовище і зберігала у холодильнику при -м С. Середовище YEP містило 100 мг/л риіамлїцаку 1 10G мг-л кзе* беніциліку дай перших 3 штамів 1 100 мг-'л канзміцину для Iff 90. Окрему колонів бактерії переносили на ріджке середовище ЇЕР (10 мл) 1 вирощували у темноті при перемішуванні (25 С) на протязі 24 годин. Антибіотики карбеніциліа, канаміцик, .цаіатокеїи стерилізували фільтруванням, а. ріфампіцин розчиняли, в дам*тилсуль$оксад.

- Інокуляція і кокулвтивація A.tuaieraciens І листкових 'експлантів: груші. Суспензійну культуру бактерії центрифугували

- б -

. в ' ■ щ,« і-лО гри протягом 10 хвилин 1 ресуспекзували бактеріальні

клітини в рідтону середовищі КС (двічі). Експланти БНОСІШІ в цю суспензію І культивували 3 години на качалці при 24 С у темної і. ВотШ перекосили експланти яа регенераційне середовище без антибіотиків і культивували в термостаті при 25 С до пояеи видимого бактеріального ураження. .

Селекція та регенерація клонів груші, стійких до какаміцину. Після кокультивації з агробактєрією листкові експланти промивали в ровчияі цефатоксішу (500 мг'л), виділяли надлишок вологи на стерильному фільтрувальному папері та негайно переносили для регенерації ва середовище, яке містить 50 мг/л канаміцину та 500 мг/л цефатоксиму. Щотижня підтримували на середовищі аналогічного складу (6 тижнів). Через 3 місяці клони калусних клітин переносили ва регенераційне середовище, яке містить 25 мг/л канаміцину та 280 мг/л цефатоксиму. . Через 6 місяців отримали перші адвентивні . вагони груші« стійкі до какам1одну, та розмножили їх мікроклональ-ким способом для проведення кулмуральних, 5іохімічіг;ц,-і молекулярних аналізів.

Дкзліа тсансДормованих пагонів груп:. 1

Йультуральні тести: '

. Ріст 1 розмноження трансформованих пагонів ка летальній концентрації канаміцину. Пагони, отримані а калусних клонів, стіЛипх до канаміцику, розмножували паралельно з нетрансформованим контролеина середовиці, яке містило 100 иг/д канаміцину, підтримуючи кожні 4 тижні. Результати досліду оцінювали після 3 пасажів. Калусогенез іа листкових єксплантів трансформованих рослин.

• Листкові експланти трансформованих 1 контрольних пагонів вміщували яга регенерації на середовище, яке містило 50 мг/л канаміцину. Для кожного клону ставили по 2 повторності з 10 експлантами на

* одну чашку. Облік проводили після 4 тижнів культивації в тер-постаті ери 25 с. .

Укорінення стійких до канаміцину клон ів «а середовищі а ка-каміцнном (50 мг/л). Укзогенєз у присутності-канаміцину проводили за розроблено» кали методикою. Середовище для індукції рпзог&негу та безгормсналькз середовище містила по БО мг/л канаміцину. Для кожного клону , брали не менше 25 пагонів» Результати визначали після 4 тижні» культивації. '

Аналіз експресії ген-/ NPTII у трансформованих'тканинах груші. Наявність ферментативної активності .ЧРТІІ у трансформованих тканинах групі проводили за методикою індійських дослідників Роя і Сахарасрабудхе (Hoy, Sahasradbudhe, 1990). Як контрол», використовували А. tirniefactens, яка містить плазміду з геном ИРТІЇ, 1 екстракті: нетраксформоваких тканин rpysrt.

Якісне визначення білку їіРТІІ у мегефільккх тканинах, груш (ELISA) проводили за методикой (Nagel et al., 1992} та рекомендаціями фірми.

Геномну ДНй .трансформованих пагонів груагі Суло виділено за методикою Dellaporca et al. (1933). Електрофорез в агарозному тел; проводили стандартним методом (Maniatis et al.,.1922).

ДНК, виділені’ а трансфзрмсваних г.агсня груп: -.0, 1-С,2. ккг}, .

ампліфікувади методом полімеразко! лакцегего: реалії \П2Р'-, використовуючи праймерк ка гек JJFTi 1, синтезовані з. НДІ "“сліскогс-гяйс?венная біотехнологія", м. Москва. Продукти ПЛР аналізувала в X.5V -агарегюу гелі, забарвленому бромистим «ідіем.

РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ. ’

і. Уведення' в культуру in vitro та иікрскдокаяьнз розмноження шести сортів груді. '

Внаслідок проведених експериментів Сута одержано асептичні лініг для а сортів груші селєкціГ Інституту садіЕТлггза УХДН <м.'

• -a - - ' .

ЕлТ.;) і розроОлено ловну схему їх мікроклонального розмноження.

Ваші зусилля на даному етапі досліджені були сконцентровані ка опямізації умов стерилізації та адаптації вегетативних бруньок групі до культури in vitro. При вксріненні мікрокдонально розмножених пагонів т також аіткнудися з певними труднощами.

Проблему отримання асептичних лівій груші ми розв'язали, використавші як вихідний матеріал п'яти-шестирічні плодоносні дерева сортового саду Інституту садівництва УААН. Сезон спокос (січень -лютий) було вибрано, щсб зменшити можливість бактеріального зараження та використати жорсткіші, стилізатори. Стратифікація, на вазу думку , теж необхідна для індукції й росту деревних плодових культур in vitro. Ефективність розмноження груші ■ культурі варіювала від вести до десяти додаткових пагонів за один пасаж ( 4 явюі) залежно від сорту.; Все ж така ефективність достатня як ДОГ проведення подальших досліджень ( адвентивний ор-ганогенеа, генетична .трансформація), так I для отримання еїітних кореневласних рослин груші для розсадництва. Після проведення низки експериментів а ризогенезу in vitro ми дійшли висновку, цс для груші цей етап повинен бути двостадійюш. На перші» стадії ід: індукували вкорінення пагонів груші протягом 2-5-діб на середовищі з ауксином (ІШС або EQK), а потім перекосили 'пагони на середовищ» без гормонів росту. Очевидно, для ефективного ризогенегу в деревних плодових культур in vitro необхідна короткочасна індукція камбіальних клітин на зрізі стебла за допсмогсс екзогенного ауксину, який дія подальшого росту коріння вже не потрібний

1 навіть шкідливий- ■

Таблиця І. Схема мікроклонального розмноження груші (Рутк смтшпіз І..). •

Основні етапи та : Склад живильних :1іапчні умови

їх тривалість : середовзд. :культивування

1. Введення в культуру :1/'2 МС, Се? горю- : 25 С, 10000 Лпїс

(1-4 місяці) : нів росту :

2. Розмноження : ІЇС, ЕАЛ 1-2 иг/л, : 25 С, 3-8 кЛшс

(3*4 тижні ) : ІМК 0,1-0,2 :

3. Укорінення : І/1 МС, ШК 0,2- £: 25 С, мрксїтгт

(до 4 тижнів, 1-5 Д.: мг/л - індукція : '

індукція ризогенезу): 1/2 Ш, без гормон: 25 С, 3-8-кЛекс

4. Адаптація (до 2 міс): їорф:перліт:пісек : 25 С, каи7ПЖ

: 4:1:1 : зниження вологості

. 2. Адвентивний органогенез із лягткова: ексглзктів ггтд:.

Наступним етапом наше: досліджень був розвиток методу адвентивного органогенезу з листкових екеплгнтів груаі • 2 наша експериментах г адвентивного органогенезу Рупії ССГиИИП із ш хяксрп:тал:: послідовно темнову & світлову фаза. Результати показала, в? синтетичний аналог датокінінів тідіззурок (ТД35 ефективніша у формуванні адвентивній пагонів із листкових екгплантів групі ни ЕАЛ. Очевидно, ТДЗ - активніший та стабільнішій фітогорнон ніж цитокініни, що містять аденін.

Дослідники, що працпзть з культурою тканини яблуні, також поаідомлаїта ара успішна використання ТДЗ для індукції адвентивного органогенезу.. Припускав», що цей факт визначається особливими вимогами даних видів до вмісту цвтокініну в регенераційному

середовищі. ' .

. Ефективність органогенезу в наших експериментах варіюгалз від. 25 до 651 залежно від сорту. Спостерігали як лрямия органогенез, так 1 через стадію калуса. Якщр регенерація йола г калусних тка-кия, то ва середовищі з тідіагуроном, як правило, Формувалися численні адвентивні пагони. Прямий органогенез відмічено в основному на провідних судинах листкової пластинки. Б наших дослідах з Органогенезу з листкових експлант1в ми не зустрічали фенотипічко прояиввані сомаклональні варіації в пагонів -регенерантів. Нині кореневласні рослішії - регенеранти проходяті. польові випробування Ш смвкцівному розсаднику Інституту садівництва УААН.

Таким чинок, розробка метод}’ . адвентивного органогенезу г ХЮИОМх €ксыант1в створила передумови для отримання траксгенких рОСМЯ груж! М допомогоюгекетично! трансформації.

Генетична ттансбормааія дісткових експлактів групі (сорт В;ри-юшя) 21 Допомогою АггоЬасіегіит ПітеГасіепз. . ■ •

Деревні шодов: культури, як правило, мало сприйнятливі де етанів АДШшГасіепБ, загальне віжог;істсву£зк;:я для трансформаці! рослин. Тому одне а завдань, що стояли перед нам:: на .цьому етапі, полягаю в поврчг итаму агроСактерії, вірулентного, щодо гругі. Дія «ксввридехтів з трансформації ю: впіралп сорт Вглниця, як на-ІвфиепанІшкЯ ж навів- регенераційній системі (Меркулов та інші, 1983).

. КМ тестувая чотири ятами А.ЦтеГасіепз, які шрскс впкористо-іЗПйгьев ж експериментах із трансформації рослин і виявилися доступное да нас: С58С1 рвУ3650:1103пео, А 231 РТіВо542/рСУ730, ЗУЗЮІ рМРООЯС/рСУбЗІ, МР90 рІРЗО/ВіпІЗ. Калу сні клони, стійкі до хаяаміцяну,. була отримані на. середовищі доя регенераці І, шр

- мі стять 50 мг/х канаміщщу та 500 иг/л клаферайу при інокуляції листкових експлантія итамомА 281 а плазмідов-помічником рТіВо

542 та бінарним вектором рСУ 730. '

ЦІ результати збігаються з даними Інших авторів про вірулентність цього штаму щодо плодових культур. Звичайно використовують його обеззброєний аналог ЕНА 101. У своїх дослідах ми використовували необеззброєний штам А 281, люб’язно наданий най С.В.Долговим (ФІБХ, РАН). Зараз у ФІЕХ проводиться картування Т ділянки плазмІди-помічника рТіБо 542. Вірулентність цього штаму було підтверджено також на суниці, хризантемі та яблуні.

Урізноманітнюючи умови Інокуляції та кскулітагаціТ, ми розробили спосіб трансформації листкових експлантів груші штамом агро-бактерії А 231 а частотою регенерації калуских клонів, стійких до канаміцину, від 1 до 27.. Хоч така ефективність трансформації досить низька, та при надійній системі регенерації можна використовувати.й цей спосіб. Одним із можливих шляхів підвищення ефективності трансформації груші є застосування спеціального агара "ееїте", оскільки за даними деяких азгорів, звичайний, агар, який ми використовували у своїх експериментах, інг:Сі.руе калусг-генез 1 регенерацію адвентивних пагонів у плодових культур на селективних середовищах.

Застосувавші: розроблену раніше систему регенерації адвектигних пагонів з листкових експлантів груші, ми стримали дев'ять • клонів пагонів, стійких до канаміцину.

Культуральні тести:, розмноження, ризогенеа, калусогєнєз із листкових експлантів на середовидах, які містять канаміцин, показали високу стійкість п'яти трансформованих клонів груші до канаміцину. Ріст 1 розмноження на середовищі; яке містить 100 мг/л канаміцину, ризогенеа у присутності £0' мг/л канаміцину (до 735 в окремих клонів), калусогєнєз І регенерація на середовищі з *га~ наміцинси (50 мг/л). *

Таблиця II.Чуттєвість трансформованих пагонів груші до канаміц;

М клону : К 1 2 3 4 5 6 7 8 S

Ригогенез, :

80 mg/l Km, : 0 41 5 35 10 0 0 78 52 50

X і

Калусогенеа :

t органогенез: - ++ + +4 + + + +4 ++ +

80 мг/л Ки* і

К * контроль (нетрансформовані пагоні; груші}

* + - формування тільки калусюїх тканин (понад 60* вксплантів)

++ » формування калуеких тканин 1 адвентивних пагонів

За дапомогсс паперової хроматографії та ELISA Суло визначено ферментативну активність Ь'РГ II в калуеких ткаюіках і регенерованих 1а них адвентивних пагонах. Результати культуралшіх тестів для клонів груші., які рівняться ступенем стійкості до антибіотика (клани N1, N2}, корелювали а дакі&сг ELISA. За дсдско-гоо методу полімеразиоі ланцюгової реакції доведено присутність у геномиій ДНК Іран сформовано І ліні І груші фрагменту гена NPTIІ

Таблиця III. Результати укорінений иа середовищі, яке містить канаміцин, ЦРТ II активності 1 ПЛР для двох трансформованих клонів груші.

N клону: ЯРТ II активність: Ригогенез, -.ЕП-ІБА, (листя) :

:у калусній тканині: 50 мг/л Кк: пг/1 мг гаг.і ПЛР : : в X : Сілку :

И 1 + 41 3000

N2 + 5’ на рівні ' -

КОНТРОЛЕ

Таким чином, в результаті досліджень ми отримали дві група трансформованих пагонів груші, що істотно різняться за чуттєвістг до канаміцину (табл.ІП. Оскільки ступінь стійкості де канаміцику корелював 1г вмістом 1!?Т II Сілку в листк:в;:х гхзяпнах трансі-: мованих пагонів групі, ми можемо констатувати, и£ ркзогенгг на середовищі, яке містить канаміцин (50 кг/л) г ефективність понад 4ОХ, може служити докзгом трансгекнзі природи цих рослин

(табл.Ш). Це твердження збігається з думкою інші де дослідників. За даними Джеймса з його співавторами, тест на вкорінення трансформованих пагонів яблуні на середовищ, яке містить канаміцин, точно корелює а результатами аналізу за Сауаерном. Крім того, деякі автори стверджують, що вкорінення трансгенних за ЛРТ

II геном рослин яблуні на середовищі у присутності канаміщіяу (5С мг/л) може служити доказом стабільної інтеграції Т-ДНК в геномі, а ефективність ризогенезу (довжина й число адвентивних коренШ може бути міроя експресії МРТ II гену.

. ... • . ' -.14 ’ . .

РЕКОЙЯДАЩ! . ■

1. Для використання в роботі по отриманню в необмеженій кіль-

кості високоякісного садивного матеріалу кореневласних рослин груші науковим організаціям УШІ, розсадницьким господарствам проповуеться ефективний спосіб мікроклонального рогшгакеннк групі. . ,

2. З метою застосування у клітинній селекції, а також для

підвищення ефективності методів традиційно! селекції груші науковій мережі УААН рекомендується новий спосіб адвентивного органогенезу а листкових експлаятів груші (сорти Вижниця, Роксолана, їтюд, Львівський сувенір, Черемшина). .

3. Для підвищення ефективності селекційного процесу та отримання нових фори груші з цінними агрономічними властивостям;! науковим організаціям УААН пропонується метод генетичної трансформації групі 8а допомогою АггоЬасІегіит ЧитеГасіепз.

ВИСНОВКИ .

1. Розроблено схему мікроклонального розмноження для шести сортів груші (Рупія сошипіг Ь.) селекції Інституту садівництва УААН (м.КиІВ).

2. Розроблено та оптимізовако живильне середовище та умови культиваці!, що сприяють ефективній регенераці І адвентивних пагонів Із листкових експлантів для п’яти сорті в груші.

3. Встановлено, що похідне від фенілсечовини тідіазурон є

ефективним індуктором адвентивного органогенезу ? листкових тка-вин групі. :

4. Отам А.сшпеГзсіепз А 281, який містить плази» ду-ломічкж рТіВо Б42 та бінарний вектор рСУ 730, вірулентний для груші і може бути використаний для перенесення генетичної інформації в геном культурних представників родурупія.

5. Розроблено прийоми генетичної трансформації груші за допомогою ЛЛитеГасіеде і регенеровано рослини, стійкі до канаміцику.

6. Аналіз трансформованих клонів груші показав, що ризогенез вагонів на середовищі, яке містить канаміцин (БО мг/л), корелюе а вмістом крт II Сілку в листковому мезсфш та г інтеграцією №1

II гена в рослинному геномі.

Список лраць, onyfialKOBasmt га темов диеертацП:

1. Меркулов C.U., Бартиш И.В., Глеба D.D. Регенерация адвентивных побегов из листовых тканей груш (Pyrus comnynls L.) //Физиология в биохимия культурных растений. - 1393.- 25, N 4.- C.375-38G.

2. Меркулов C.U. Разработка методов генетической трансформации

груши ( Pyrus Cammts L.) с использованием обезоруженных штаммов Agrobacterium' tunefaciens // II Российский симпозиум " Новые методы биотехнологии растений 1993 г., 18-20 мая, г.Пущине.

,-с.зг.

3. Кириченко К.В., Меркулов С.И. Подход к прямой генетической .трансформации груш (Pyrus communis L.) посредством электропорация калдюсной ткани и последующей регенерация растений. .' II Российский симпозиум " Новь» методы биотехнологии растений”.'1993 г., 18-20 мая, г. Пущино.- С. 24.

4. Еартит И.В., Меркулов С.М., Корховой В.К., Копань В.П. Мик,-

роклональное размножение груши (Pyrus comnunts L.) in vitro // визиология и биохимия культурных растений. - 1994.- 26, N 1.-С.84-90. '

5. Меркулов C.U., Бартиш Я.В. Влияние динитроанклинового гербицида оризалина ка адвентивный органогенез у Pyrus communis L.// Пятая конференция по генетике соматических клеток в культуре (животные и растения) in vitro.- Черноголовка: 1993.- С.16.

в. Гаркавая Л.П., В.Е.Середюк, В.К.Корховой, С.М.Меркулов, И.В.Бартиз Изучение сомаклональкой изменчивости у растекий-реге-нерантов плодовых и ягодных культур с помоььс игофермезткого анализа// Пятая конференция по генетике соматических клеток s культуре (животные к растения) in vitro. - Черноголовка: 1933.- С.2.

7. Бартиа И.Б., В .Л. Корховой , С.Ы. Меркулов, В.П. Копань Оптимизация методов культивирования in vitro различных сортов и тоновых подвоев яблони (Malus domestica х Borkh)// визиология и биохимия культурных растений.-1994.- в печати.

8. Бартиш I.B., Копань B.Q., КорховийВЛ., Меркулов С.М. Нов! метода шкроклотадвного размножения перспектквнпх сорпв зернят-«оввх культур // Сад1вницгво. К.: Урожай, 19%.- Вил. 44. - 4 с.

в. Bartlsh I.V., Merkulov S.M., Korcnovoy V.I. Genetic transformation of apple and pear cultivars mediated by Aerobacterium tmefaciens, stjam A ZS1, International Syntposum "Plant Biotechnology and Genetic Eremeertnsc". 3-<3 October, 1994, Kiev. P.42.

записано g пэчати2.60/. 9S~Зак./Х-Г rm./gg размножано гЖ минстата .Украийн ^!Пп