Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетическая трансформация гороха (Pisum sativum L.) с использованием Ds-элемента кукурузы

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Генетическая трансформация гороха (Pisum sativum L.) с использованием Ds-элемента кукурузы"

АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ Інститут клітинної біології та генетичної інженерії

Р Г Б ОД

„ На правах рукопису

- 2 ОИТ *305

УДК 577 21 4- 582.739

РАЧЕ К Людмила Іванівна

ГЕНЕТИЧНА ТРАНСФОРМАЦІЯ ГОРОХУ (PISUM SATIVUM L.)

З ВИКОРИСТАННЯМ DS —ЕЛЕМЕНТУ КУКУРУДЗИ

03.00.25 — клітинна біологія

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук

Київ 1995

Роботу виконано у відділі цито<різіології та клітинної інженерії Інституту клітинної біології та генетичної інженерії АИ України.

Науковий керівник - академік АН України,

Ю.Ю. Глеба

Офіційні опоненти: - доктор біологічних наук

В.А. Кунах - кандидат біологічних наук

год на засіданні спеціалізованої ради 0.01.19.01 інституту клітинної біології та генетичної інженерії за адресою: 252143, Київ-143, вуя. Заболотного, 148. і

.3 дмсертаиіею можна ознайомитися в бібліотеці інституту.

Т.М. Чеченєва

їм. Т. Шевченка Мініс-

терства освіти України

о

Автореферат розіслано "

1995 р.

; Бчвний секретар.спеціалізованої раді

кандидат біологічних наук

у Л.В. Налишева

Актуальність теми.____Стрімкий розвиток генетичної та

клітинної інженерії рослин призвів до великих успіхів в розумінні процесів, які відбуваються в рослинній клітині 1 також по появи нових способів поліпшення сільськогосподарських рослин, що альтернативні до існуючих у класичної селекції. Основні завдання, які стоять на даний момент перед спеціа* лістами у галузі генної інженерії рослин - це клонування рослинних генів і введення генів, які. обумовлюють госпо-дарсько-цднні ознаки, в рослинну клітину, що дасть Нові можливості для с‘римання сортів рослин з цінними агрономічними якостями. ■

Вирішення цих задач пов'язано.з розробкою методів генетичної трансформації для найважливіших сільськогосподарських рослин. Незважаючи на те,' шо кількість видів рослин, для яких розроблено техніку генетичної трансформації , постійно зростає, для деяких представників з родини бобозих, зокрема для гороху посівного, поки що не розроблено технологію генетичної трансформації. Основні труднощі у вирішенні проблем генетичної трансформації цих видів поз’язані з проблемою регенерації в умовах in vitro. '

Горох є важлийою сільськогосподарською культурою. Зав-: дяки,симбіотичній системі азотфіксації, на сьогодні горох разом з іншими представниками з родини бобових є основним джерелом надходження білку в раціон людини; У зв’язку а вищевказаним, клонування генів гсроху, які обумовлюють процес азотфіксації іга отримання трансґенних рослин гороху з поліпшеними сільськогосподарськими ознаками є важливими та акту-

альиими завданнями.

Одним з можливих підходів до клонування генів е метод клонування генів за допомогою послідовностей, що транспоэу-ються (gene tagging). Даний підхід використовується для виділення нових генів, у яких або ду*е важко, або взагалі неможливо визначення біохімічних властивостей їх продуктів.

Клонування генів за допомогою методу gene tagging можливо як з використанням ендогенних траиспозонів (гомологічна система транспозонів), так 1 за допомогою траиспозонів, які , були виділені з іншого виду ( гетерологічна система транспозонів). Найбільш вивченим серед рослинних транспозонів є родина контролюючих елементів Ac/Ds кукурудзи. Тому Ac/Ds елементи кукурудзи зараз найчастіше використовують як систему гетерологічних транспозонів при клонуеанні генів за допомогою послідовностей, що транспозуються.

Незважаючи на те, що кількість видів рослин, в.клітинах яких працює гетерологічна система транспозонів Ac/Ds, постійно зростай, поки що немає повідомлень про використання цієї гетерологічної системи для клонування генів у гороху посівного. В той же час , горох являє собою унікальну можливість для ышчення і клонування генів, які беруть участь в симбіотичній системі азотфіксації. Крім того, горох ще з часів Менделя с улюбленим об’єктом досліджень генетиків 1 тому його 14 хромосом дуже добре вивчені в генетичному плані.

Враховуючи ці два фактори, горох е достатньо принадним об’єктом для використання його в дослідах по транспсзоноссму

мутагенезу за допомогою гетерологічної системи елементів

Ac/Ds кукурудзи.

Мета та завдання иоботи.____Метою даної роботи була роз-

- З - t

робка методик генетичної трансформації гороху посівного (Pisum sativum L.), отримання за допомогою цих методик трансгенних клітинних ліній і рослин гороху, які містять Ds-елемент кукурудзи та їх аналіз. ■

До конкретних завдань роботи входило: '

1. Розробити методики генетичної трансформації горох'у шляхом електропорації протопластів і за допомогою А.tumefасі ens.

2. Отримати за допомогою розроблених методик трансгенні клітинні лінії і рослини гороху, які містять Ds-елемент кукурудзи.

3. Провести молекулярно-біологічний аналіз відібраних трансформантів для доказу їх трансгенної природи.

Наукова новизна. Розроблено методику генетичної трансформації гороху шляхом електропорації протопластів. Вперше шляхом електропорації протопластів отримані канаміцинстійкі трансгенні клітинні лінії гороху, що містять Ds-елемент кукурудзи .

Розроблено методику подвійної генетичної трансформації гороху за допомогою штамів А.tumefaciens. Вперше за допомогою A.tumefaciens отримано трансгенні рослини гороху, які містять Ds- елемент кукурудзи.

Практична цінність.__Розроблені нами методики генетичної

трансформації можуть використовуватись для отримання транс-генних рослин гороху з цінними сільськогосподарськими ознаками (підвищений склад запасних білків, стійкість до гербіцидів, вірусних та грибних інфекцій, комах, несприятливих умов навколишнього середовища).

Розроблений нами метод подвійної трансформації гороху

може бути використано в дослідах з генетичної трансформації інших видів рослин, особливо тих, у яких важко отримати регенерацію трансгенних рослин.

Отримані трансгенні клітинні лінії і рослини гороху далі будуть використовуватись в експериментах по трансформації Іх геном транспозази Ас-елемента кукурудзи, що дасть змогу дослідити можливість транспозиції Ов-елементів, які включились в геном отриманих трансформантіе і, таким чином, показати можливість використання гетерологічної системи транспо-зонів Ас/Оэ кукурудзи для клонування і генетичного картування генів гороху.

Апробація роботи. Результати роботи подавались на Конференції з генетики соматичних клітин у культурі (Москва, листопад 1993), на 6-му Європейському конгресі по біотехно-логії (м. Флоренція, червень, 1994 р.), на Міжнародному симпозіумі з генетичної інженерії та біотехнології рослин (м. Київ, жовтень 1994 р.).

Публікації. Основні результати дисертації відображені в 6 друкованих працях, список яких наводиться у кінці автореферату .

Структура та об’єм роботи. Дисертація включає в себе вступ, огляд літератури, матеріали та методи, результати, обговорення, заключну частину, висновки та список літератури, що містить 241 бібліографічних посилань, з яких 232 іноземні. Роботу викладено на 130 сторінках машинописного тексту, серед яких 12 малюнків і 2 таблиці.

- 5 -МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

Плазміда pSK3, яка містить Ds-елемент кукурудзи ,була люб’язно надана доктором Дж. Хілле (Незалежний Університет, Голландія). Плазміда pSLJ7C3, що містить послідовність Ас-влементу, була люб’язно надана доктором Дж.Джонсом ( Великобританія ).

Для виділення плазмід використовували штам Є.сої і JM 101. Плазмідну ДНК виділяли методом лужного лізісу (Маниатис и др.,1984). Трансформацію рослин Pisum sativum L. проводили за допомогою штаму A. tumefaciens LBA4404. Всі бактеріальні штами вирощували на середовищі LB (Маниатис и др., 1984) з додаванням селективної концентрації антибіотиків.

У роботі використовували рослини культивованої протягом 5 років в умовах in vitro, здатної до регенерації лінії 1288-2206-12 гороху посівного (Pisum sativum L.), які були отримані у відділі цитофізіології та клітинної інженерії Інституту клітинної біології і генетичної інженерії (Зубко и др., 1990).

Генетичну трансформацію протопластів методом електропо-рації проводили за модифікованою нами методикою, що була запропонована Потрікусом (1985). Протопласти виділяли, як було описано раніше (Кучук, 1989). Селекцію трансформованих ліній вели на середовищі з канаміцинсульфатом у концентрації 50 мг/л.

Генетичну трансформацію рослин за допомогою А. tumefaciens проводили шляхом кокультивування рослинних екс-плантів з нічною культурою штаму A. tumefaciens, який містив плазміду pSK3. Селекцію трансформантів вели на середовищі,

- б -

яке містило 100 мг/л канаміцинсульфату.

Наявність продукту експресії гену nptll у трансгенних лініях визначали за допомогою відповідних поліклональних антитіл за методом ELISA з використанням набору NPTII ELISA Kit Фірми "5-Prime - З-Prime, Inc." (США). .

Аналіз трансформантів за допомогою тесту на GUS-актив-ність проводили за методикою Джефферсона та інш. (1967). При обробці транформованих ліній деметилюючим агентом використовували такі концентрації 5’-азацитідіну: 10 мкМ, ЗО мкМ, 60

мкМ, 100 мкМ.

Сумарну рослинну ДНК виділяли за стандартною методикою (Murray and Thompson, 1980).

Ампліфікацію ДНК in vitro проводили за допомогою ДНК-ампліфікатора ААГ-66 (НВО "Прогрес", Україна) з використанням раніше розроблених праймерів для ампліфікації частини послідовності 358-промотору вірусу мозаїки цвітної капусти (ВМЦК) (Стороженко, 1994).

Саузерн-блот-rібридизацію вели на нейлонових фільтрах за методикою, яку запропонували Чач та Гілберт (1984). Для зондів фрагменти ДНК мітили 32Р за допомогою набору Random Primed DNA Labelling Kit ("Boehringer Mannheim", ФРН).

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ

1. Генетична трансформація гороху.

Для генетичної трансформації рослин використовували плазміду pSK3. Схема Т-ДНК плазміди представлена на мал. 1. Плазміда pSK3 містить маркерний ген неоміцинфосфотрансферази II (npt II) , Os-елемент кукурудзи, у складі якого знаходиться ген 3 -глюкуроніяази Е.соїі (GUS-ген) під контролем

Ds element ,.

Km

eus

LB

NPT II

HPT II

■ pSK3

TmS-2

Мал. 1. Схема Т-ПНК плазміди рБКЗ. ІВ 1 ЯВ - послідовності, які обмежують Т-ДНК.

RB

355-промотору вник.

Електропораиія протопластів. Пля проведення електропо-рації використовували- 3-4х105 протопластів. При умовах електропорації, що були використані нами (напрузі 400 В/см 1 тривалості імпульсу 5 мс) число протопластів, які вижили, складало приблизно 50% від кількості взятих в досліді. Культивування протопластів проводили згідно розробленій раніше методиці ( Кучук, 1989). На селективному середовищі, що міс-

тило 50 мг/л канаміцинсульфату, попередньо було відібрано 42 колонії,які були здатні до продовження росту і зеленіли на світлі. При подальшому культивуванні на середовищі з канамі-цинсульфатом залишилось лише 7 калусних клонів гороху, стійких до канаміцинсульфату. Ефективність трансформації становила приблизно ЗхЮ'5. Потрібно відзначити що за допомогою методу електропорації протопластів нами вперше отримані трансгенні клітинні лінії гороху, стійкі до канаміцинсульфату. Нам не вдалося отримати регенерацію рослин у відібраних трансформантів. Труднощі, які виникають при індукції регенераційних лроцесів у гороху і загалом у представників родини бобові, обумовлені, очевидно, самим генотипом цих культур.

Генетична трансформація за допомогою А.ЪигоеГаЫепэ. Плазміду рЭКЗ мобілізували в агробактеріальний штам за допомогою методу прямої трансформації. Для підтвердження факту трансформації з агробактеріальних клонів, стійких до канамі-цину та ріфампіцину, виділяли плазмідну ДНК і проводили її рестрикційний аналіз (дані не наведені).

Ми розробили систему генетичної трансформації рослин гороху за допомогою штамів А,,астепэ, яка була названа подвійною трансформацією. Система подвійної трансформації полягає в тому, що як вихідні лінії для трансформації використовувались отримані раніше Зубко та інш. (1990) трансгенні рослини гороху, які мали підвищений морфогенетичний потенціал. Як вихідний рослинний матеріал в дослідах з генетичної трансформації гороху , які були проведені у відділі цитофізіології та клітинної інженерії нашого інституту Зубко та інш. (1990), було використано лінію гороху 1288. Лінія гороху 1288 є зручною для генетичного аналізу внаслідок на-

явності багатьох маркерних ознак у всіх хромосомах (Кунах и др., 1984). В експериментах використовувався "shooty"-мутант A.tumefaciens pGV2206, отриманий на основі плазміди PTIB6S3 шляхом інтеграційного мутагенезу з заміною 2 гену синтезу ауксину Т-ДНК послідовністю плазміди PGV1106, яка містить бактеріальний ген стійкості до канаміиинсульфату (npt II) (Leemans et.al., 1981). В результаті генетичної трансформації гороху шляхом кокультивування експлантів рослин гороху лінії 1288 з A. tumefaciens pGV2206, -було отримано кілька ліній гороху, що мали підвищену регенераційну здатність.

Єкспланти лінії 1288-2206-12 кокультивували з штамом А. tumefaciens, що містив плазміду pSK3. На поживному середовищі з <рітогормонами 1 мг\л 2.4-Д, 0.2 мг\л кінетину,' яке містило 100 мг/л канаміцинсульфату було відібрано 23 канамі-цинстійкі калусні клони гороху. Канаміцинстійкі- калусні тканини переносили на безгормональне середовище з канаміцин-сульфатом з метою ініціювати органогенез та регенерувати нормальні рослини. Нам вдалось о’тримати 5 регенеруючих ліній гороху, з яких були отримані пагони, що зберігали всі морфологічні ознаки вихідних ліній. Отримані канаміцинстійкі пагони гороху підтримуються в культурі in vitro на безгормо-нальному поживному середовищі , яке містить 100 мг/л канамі-цинсульфату.

2. Докази трансгенності селектованих після трансформації клітинних ліній та рослин гороху.

Через те що плазміда pSK3, яку ми використовували для трансформації рослин, містить маркерний ген npt II, першим

- - to -

кроком при аналізі отриманих нами трансформантіа, було риз-иачення в них наявності продукту експресі і' гену за допомогою Поліклон0лі>них антитіл. З відібраних клонів, отриманих як Після едактропорації протопластів, так І після трансформаї ї за допомогою A.tumefaciens, було виділено білковий екстракт

і проведено реакцію ELISA з використанням антитіл проти нео-Міцинфосфатрансферази XI. Як виявилося в результаті аналізів, усі 7 відібраних нами клітинних ліній гороху, які отримано після електропорації протопластів, та всі В рослин, які Суло отримано після трансформації за допомогою A.tumefaciens, містять неоміцинфосфотрансферазу II.. У контрольних нетрансформованих рослин суттєвої реакції з антитілами виявлено не було. Отримані дані свідчать про експресію уведеного гену npt II в трансформованих лініях, які були проаналізовані.

Оскільки плазміда pSK3 містить індикаторний ген В-глк>-куронідази (GUS-ган), експресію якого відносно просто виявити за допомогою тесту на GUS-активність, ми використовували даний аналіз для доказу трансгенності селектованих ліній гороху. Спочатку аналіз трансгенних ліній за допомогою тесту на GUS-активнІсть не дав позитивного результату ні у випадку, коли ми аналізували клітинні лінії, які були відібрані після електропорації протопластів, ні у випадку, коли аналізувались рослини гороху, отримані після трансформації за допомогою штамів агробактерій, Нани було висловлено припущення, що експресія GUS-гену в трансформантах не відбувається внаслідок мети ювання послідовності цього гену.

При вивченні експресії Т-ДНК для деяких пухлинних ЛІНІЙ було показано, що експросія гонів Т-ДНК залежить від метилю-

■ - 11 -вання ДНК ; оброблення цих лінії! депетилгоючим агае ом Б’-азацитідіном повністю відновлювало експресію генів Т-ДЬ,, (Атаг1по еЬ аі., 1984). Мейджером та інш. (1991) при гене-

тичній трансформації рису та Вебером та інш. (1990) при генетичній трансформації тютюну, було показано екпресію биэ-гену тільки після обробки трансфориантів деметилюючим агентом 5’-азаиитідіном шляхом додавання його в поживне середовище. Тому ми також вирішили обробити отримані після генетичної трансформації лінії гороху 5-’а^цитідіном шляхом додавання його в селективне середовище, використовуючи саме такі концентрації 5'-азацитідіну, які були використані у вищевказаних роботах. Оскільки включення 5’-азацитідіну замість и.итозіну відбувається тільки при реплікації ДНК, логічно припустити, що пай агент замінить цитозін в послідовності ДНК саме тих клітин, які будуть інтенсивно ділитись.

Через 7 дніь після додавання в поживне середовище 5’-азацитідіну трансформанти були проаналізовані за допомогою тесту на биэ-активність. Наявність голубого забарвлення, яке свідчить про експресію биз-гену, було виявлено тільки в зразках трансформант і в, які були відібрані після електропо-рації протопластів, причому найбільша кількість забарвлених клітин спостерігалась при аналізі клітинних ліній, що росли на поживних середовищах з концентрацією 5’-азацитідіну 60 мкМ 1 100 мкМ.

Аналіз зразків трансформантіо, які були відібрані після трансформації за допомогою агробактерій, за допомогою тесту на бив-активнііть не дав позитивних результатів навіть після додавання леметилюючого агенту в поживне середовище, на яке були пересаджені рослини ні через 7, ні через 14 днів після-

пересадки. Цей Факт можна пояснити двояко: або GUS-ген при

включенні в геномну ДНК потрапив в ділянки геному , які не експресується, або деметилюючий агент 5’-азацитіаін не може включитись замість цитозіну через те, що відсутня реплікація геномної ДНК рослин гороху внаслідок слабкого росту (поділу) диференційованих клітин.

Метод ампліфікації ДНК in vitro за допомогою полімераз-ної ланцюгової реакції (ПЛР) є відносно простим, зручним і надзвичайно чутливим, тому ми вирішили використати його для аналізу отриманих трансформантів. Оскільки наша конструкція містить послідовність 35S ВМЦК , ми вирішили використати раніше розроблені Стороженко (1994) праймери для апліфікації послідовності частини цього промотору. Для проведення аналізу з відібраних трансформантів виділяли сумарну ДНК і проводили реакцію ампліфікації. Результати аналізу показані на мал. 2. При використанні цих праймерів довжина продукту ампліфікації складає 189 п.н. Як видно з малюнку, всі трансген-ні лінії, які були відібрані як після електропорації протопластів, так і після трансформації за допомогою A.tumefaciens, дають в результаті ампліфікації фрагменти ДНК очікуваного розміру. Отже геномна ДНК усіх ліній, які були проаналізовані, містить шукану послідовність 35S промотора. Ампліфікація ДНК, виділеної з контрольної нетрансформованої рослини не відбувається.

Для подальшого доказу інтеграції ДНК плазміди pSK3 в геном отриманих трансформантів проводили аналіз відібраних ліній з використанням блотинг-гібридизації за Саузерном.

Спочатку за.допомогою блотинг-гібридизації за Саузерном ми проаналізували клітинні лінії, які були отримані після

1 2 3 4 5 6 7 8

189 141

Мал. 2. Результати електрофоретичного аналізу продуктів ампліфікації ДНК трансформованих ліній гороху. А - ліній, які були отримані після електропораці і протопластів. 1-7-ДНК трансформованих ліній від 1 до 7 відповідно; 8 -ДНК контрольної нетранформованої рослини. Б -рослин гороху, які були отримані після трансформації за допомогою А. 'Ьитеґасіепв. 1 -ДНК контрольної нетранформованої рослини; 2-6 -ДНК трансформованих ліній від 1 до 5 відповідно. Стрілкою показано положення фрагменту, що амплірі кується.

електропораиії протопластів. •

У першому еипадку сумарну рослинну ДНК, яка була виділена з відібраних к Ітинних "Іній гороху, розщеплювали рест-риктезою BgIII, фракціонували електрофорезом у агарозному гелі, переносили на нейлонові Фільтри та гібридизували з міченим 2,2 т.п.н. EcoRI-Br/nHI фрагментом плазміди pJA472 (An et. al., 1985), шо містить структурний ген неоміцинфосфот-рансферази II (npt II). Дані, шо наведені на мал. ЗА служать доказом інтеграції гену npt II, що входить до складу плазміди рБКЗ, в геном гороху. Для кожного клону послідовність, яка Гібридизується з зондом, представлена фрагментом різної довжини приблизно 17 т.п.н,, тому шо сайт для ВдІІІ в конструкції ідсутній, і ДНК розщеплюється по сайтам, що знаходяться у складі геномної ДНК. Отримані дані добре узгоджуються з результатами, які були отримані при визначенні NPT II за допомогою ELISA. ДНК контрольної нетранарормованої рослини з зондом не гібридизуйтеся.

У Другому випадку сумарну рослинну ДНК розщепляли ендо-нуклеазою рестрикції EcoRV, гібридизацію фрагментів, які були ' перенесені на фільтри проводили з міченим EcoRI- Hindlll (3,0 т.п.н.) фрагментом П/.азміди рВІ121 (Jefferson et al., 1966), шо містить GUS-ген, Результати блотинг-гібридизації ' «

за саузерном наведені на мал. ЗБ. У всіх семи клонів присутні гібридизаційні сигнали, які повністю відповідають гібридизаційним сигналам плазміди pSK3, шо розщеплювалась також ендонуклеазою рестрикції EcoRV (доріжка N 8). Виходячи з того, що сигнали гібридизації контрольної плазміди поаністю відповідають фрагментам гібридизаиії геномної ДНК трансген-них ліній, можна зробити висновок, шо,' скоріше за все, плаз-

23.1

9.4

6.5

4.3

2.3

2.0

0.5

Мал. 3. Результати блотинг- гібридизації за Саузерном сумарної ДНК ліній гороху, які отримано після електропорації протопластів. А - ДНК обробляли рестриктазою ВдІІІ, гібридизацію проводили з ЕсоІЗІ - ВатНІ - фрагментом плазміди р^472, що містить послідовність гену II. 1-7-ДНК транс-

генних ліній від 1 до 7 відповідно; 8- ДНК контрольної нет-рансформованої лінії. Б - ДНК обробляли рестриктазою ЕсоЯУ, гібридизацію проводили з ЄсоРІ- Н і псі 111 фрагментом плазміди рВІ121, який містить послідовність СиЗ-гену, 1-7 -ДНК транс-генних ліній від 1 до 7 відповідно; 8 - ДНК плазміди рБКЗ, яка була оброблена рестриктазою ЕсоРУ. 9- ДНК нетрансформо-

еаної рослини.

1 2 3 4 5 6

____ 23.1

---- 9.4

--6.5 ---- 4.3

------- 2.3

-------2.0

-------0.3

Мал. 4. Блотинг гібридизація за Саузерном ВашНІ-пере-вару сумарної ДНК ліній гороху, які отримано після трансформації за допомогою А. -Ьитеї^асіепз з КрпІ-НіпсІІІІ - Фрагментом плазміди р5и7СЗ, що містить послідовність Рв-елементу кукурудзи : 1-5-ДНК трансгенних ліній від 1 до 5 відповідно; 6- ДНК контрольної нетрансформованої рослини. '

і

мідна ДНК інтегрувала в геном без делецій та перебудов. От- ;

же, трансгенні лінії гороху містять і Ов-елемент кукурудзи , що знаходиться в складі конструкції. ДНК контрольної нет-рансформованої рослини з зондом не гібридизується.

Рослини гороху, отримані після генетичної трансформації за допомогою А. tumefacjens, також були проаналізовані з використанням методу блотинг-гібридизації за Саузерном.

Сумарну ДНК кожної з відібраних п’яти ліній обробляли _

рестриктазою ВатНІ, Фракціонували за допомогою электрофорезу

І

в 1%-й агарозі, переносили на нейлонові фільтри і гібридизували с КрпІ-НіпсІІІІ-Фрагментом {1 (2 т.п.н.) плазміди

рЭЫ7СЗ, що містить Оэ-элемент кукурудзи. Результати гібридизації наведені на мал. 4. ДНК всіх п’яти рослин, які аналізували, гібридизується з зондом, в той же час як у контролі сигнал відсутній. Отримані результати свідчать про інтеграцію Оз-элементу кукурудзи в склад геномної ДНК отриманих .

рослин гороху, що підтверджує їх трансгенну природу.

ВИСНОВКИ

1. Розроблено методики генетичної трансформації гороху посівного (Pisum .sativum L.) шляхом електропорації протопластів і за допомогою А.tumefaciens.

2. Показана можливість використання канаміцинсульфату як селективного агенту при відборі трансгенних ліній гороху.

3. Отримано трансгенні клітинні лінії гороху за допомогою електропорації протопластів і показана інтеграція Ds-е/іементу кукурудзи в геном трансгенних ліній.

4. Отримано трансгенні рослини гороху, які містять Ds-елемент кукурудзи з використанням методу генетичної трансформації за допомогою A. tumefaciens.

5. Показана можливість інгібування експресії перенесених генів, зокрема гену В-глюкуронідази (GUS -гену) за рахунок метилювання ДНК.

Список робіт, опублікованих по томі дисертації:

1. Рачок Л.М., Кучук Н.В. Тематическая трансформация

гороха конструкциями,содержащими Ас и Оз элементы кукурузы методом электропорации // Конференция по генетике соматических клеток в культуре. Москва.- 1993. -С. 71. .

2. Rachek L.I., Kuchuk N.V. Direct genetic

transformation of psa plants with Ac and Ds element from maize using o1sctroporation//iv International symposium of plant tissue and organ culture. Florance. -1994. -P. 332.

3. рачек Л.И., Стороженко С.В., Кучук Н.В. Генетическая

трансформация гороха Ds-элементсм кукурузы при помощи элакг-ролорации протопластов 11 Цитология и генетика. -1994. -28, И 6. -С. 49-53. '

4. Rachek L.I., Storozhenko S.V., Kuchuk N.V. "Gene tagging" of pea plants // Inernational symposium of plant biotechnology and gonotic engineering. Kiev. -1994. -P. 08.

5. Kuchuk H.V., Simonenko Y.B.,. Rachek L.I. Genetic

transformation of Pisum sativum L,// International symposium of plant biotechnology and genetic engineering. Kiev. -1994. -P. 25. .

6. Рачек Л.И., Стсрояенко C.O., Кучук Н.В. Получение и

молекулярно-биологпчсісдиЛ анализ трансгоннух рлстоний гороха (Рісил oativun L.), содс’рксі'лія Оз-злс;«нт купуругы //Биополимеры и клоткл.- 10*5. - 11, !) 3-4.- С. S2-CS. ■ < •

ANNOTATION.

Rachek L.I. Genetic transformation if pea (Pisum sativum L.} with Ds-element from maize.

. Thesis for a degree of Candidate of biological science, Institute of Cell Biology and Genetic Engineering, Kiev, 1995. .

The thesis deal with obtaining pea (Pieum sativum L.) transgenic lines containing the Ds-element of the -Ac/Ds transposition system. The methods of genetic transformation of pea by mesophyll protoplast electroporation and using the Agrobacterium-mediated transformation have been developed. By protoplast electroporation the transgenic'cell lines have been obtained, some transgenic pea plants using the method of Agrobacterium- mediated •transformation have been obtained* ■ Using some biochemical and . molecular biology methods (NPTII ELISA assay,' GUS - assay, PCR analysis, Southern blott.ing hybridization) the transformation of pea plants and calli lines has been confirmed.

АННОТАЦИЯ,

/

Рачек Л.И. Генетическая трансформация гороха (Різит sativum L.) с использованием Ds-эленента кукурузы.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.25 - клеточная биология, Институт клеточной биологии и генетической инженерии, Киеа, 1995.

Диссертационная работа посвящена получению трансгенных

линий гороха посевного (Pisum sativum L.), содержащих

Ds-элемент системы транспозиции Ac/Os кукурузы. Разработаны

методы генетической трансформации гороха с использование^

' * / электропораиии мезофильных протопластов и кокультивирования

эксплантов с A. tumefaciens. Методом электропорации протопластов получены трансгенные клеточные линии, а при помощи A.tumefaciens- .трансгенйые растения гороха. Трансгенная природа полученных линий доказана с помощью нескольких биохимических и молекулярно-бипологических подходов: NPTII ELXSA,

теста на GUS-активность, П11Р, блотинґ-гибридизации по Сау-

зерну.

Ключові слова: горох, генетична трансформація, трансло-зони, Ds-елемент, електропорація протопластів, Agrobacterium.

ПІдп. до друку 26.07.95. Фовмат 60x8*1/16. Пвп. ове. № 2. ОФс. друк. Ум. ввук. арк. 0,93. Ум. фарбо-відб. 1,1$. 05л.-вид. арк. 0,96. Ти--■ ра* ПО прим. Зам. 5-196. __________________■ -_________•. ■ ■ .

ІЕЗ їм. Е.0,Пагона. 252650 Киї» 5, МСП, аул. Горького, 69.

ПОЛ ІЕЗ 1м. Е.О.Патона. 252650 Київ 5, МСП, вуя. Горького; 69.