Ген гемолизина II Bacillus cereus: клонирование, регуляция экспрессии, идентификация продукта

Бударина, Жанна Игоревна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Ген гемолизина II Bacillus cereus: клонирование, регуляция экспрессии, идентификация продукта
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Ген гемолизина II Bacillus cereus: клонирование, регуляция экспрессии, идентификация продукта"

На правах рукописи

БУДАРИНЛ Жанна Игоревна

Ген гемолизина П Bacillus cereus: клонирование, регуляция экспрессии, идентификация продукта

03.00.15-Генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в ВНТК структурно-функционального анализа генетических систем микроорганизмов Института биохимии и физиолсл ии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина Российской Академии Наук

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

кандидат биологических наук, Солонин A.C.

доктор биологических наук.

профессор

Азизбекян Р.Р.

доктор биологических наук.

профессор

Матвиенко Н.И.

Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится ¥¿-¿^¿зг^-У 2005 года на заседании Диссертационного Совета Д217.013.01 в Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов, по адресу: 117545, Москва, 1-ый Дорожный проезд, д 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Автореферат разослан ¥ ^¿-¿и?_2005г

Ученый секретарь Диссертационного совета, .

Кандидат биологических наук / / В.И. Щербакова

^ MW

SCG¿0

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Возникновение и эволюция патогенности микроорганизмов

является одной из фундаментальных проблем современных микробиологии и медицины Исследование молекулярных основ этого процесса - ключевой подход к решению данной проблемы Среди многообразия токсинов и других веществ, вырабатываемых бактериями для проникновения в макроорганизм, преодоления его защитных систем и развития инфекционного процесса, немаловажная роль в патогенезе принадлежит цитолитическим токсинам, которые для многих бактерий являются основными факторами патогенности. Известно, что патогенные свойства того или иного микроорганизма в значительной мере определяются как спектром его структурных генов, кодирующих факторы патогенности, так и механизмами, обеспечивающими регуляцию этих генов Отсюда возрастающее внимание медиков и биологов к системам, контролирующим экспрессию генов токсинов Изучение цитолитических токсинов и выяснение путей регуляции экспрессии их генов представляется одним из перспективных направлений в исследовании молекулярных основ патогенности и вирулентности микроорганизмов.

Для проведения исследований в данном направлении интересными объектами являются представите.™ цереусной группы микроорганизмов рода Bacillus Эта бактерии широко распространены в природе и имеют ярко выраженные филогенетическое родство, морфологическое и физиолого-биохимическое сходство на фоне широкого диапазона их патогенных свойств Так, В thuringiensis является микроорганизмом, патогенным для насекомых, В .cereus относится к условно-патогенным, а В anthracis печально известен как возбудитель сибирской язвы Все эти микроорганизмы продуцируют ряд цитолитических белков, рассматриваемых в качестве потенциальных факторов патогенности B.cereus, занимая по патогенному статусу промежуточное положение среди представителей данной группы бактерий и продуцируя широкий спектр гемолизинов, может служить прекрасной моделью для изучения этих токсинов

Еще одна причина, которая побуждает к активному исследованию токсинов, вырабатываемых В cereus и его ближайшим родственником В thuringiensis, - широкое распространение этих микроорганизмов в окружающей среде В cereus - один из основных бактериальных загрязнителей производимых промышленностью продуктов питания, лекарственных и косметических препаратов В thuringiensis, широкомасштабно используемый в качестве инсектицидных препаратов, неконтролируемо выбрасывается в окружающую среду Поэтому изучение отдельных токсинов, продуцируемых данными бактериями, с целью определения степени их безопасности для животных и человека является актуальной задачей j до. НАЦИОНАЛЬНАЯ I

I БИБЛИОТЕКА |

! ggäm

На настоящий момент описан ряд гемолитических токсинов B.cereus Это цереолизин, сфингомиелиназа, цереолизин АВ, гемолизин BL, цереолизин-подобный гемолизин, гемолизины И, III и CytK Однако, спектр и свойства гемолизинов, продуцируемых данным микроорганизмом, изучены далеко не полно Это обусловлено сложностью получения индивидуальных препаратов данных белков из исходного микроорганизма В связи с этим существование одного из них - гемолизина II - в течение долгого времени оставалось под вопросом Были описаны некоторые его характеристики (Coolbaugh and Williams, 1978), однако сообщения о его очистке или клонировании гена отсутствовали Высказаны предположения, что гемолитическая активность, приписываемая гемолизину II, обусловлена действием цереолизина АВ (Gilmore et al, 1988; Beecher and MacMillan, 1991) Для выяснения подобных вопросов весьма эффективным является подход, основанный на клонировании отдельных генов, кодирующих цитолизины, и изучении данных цитолизинов в гетерологичных системах

Несмотря на то, что гемолитические токсины В cereus активно изучаются, мало известно об их генетической регуляции, так же как и о регуляции других факторов патогенности этого микроорганизма Обнаружен и описан лишь один плейотропный регулятор, PlcR, который является активатором целого ряда генов В cereus и В thuringiensis (Lereclus et al, 1996) Недавний анализ полных нуклеотидных последовательностей геномов В cereus и В anthracis выявил в них ряд генов, потенциально контрол^ующих транскрипцию (Read et al 2002) Учитывая, что вопрос о регуляции генов токсинов неразрывно связан с регуляцией патогенных свойств микроорганизмов, а также ввиду малой изученности данного вопроса для В cereus весьма актуальным является изучение локусов в геноме этой бактерии, контролирующих экспрессию генов токсинов

Цели и задачи исследования. Данная работа выполнялась в рамках исследовательского направления, имеющего целью обнаружение и идентификацию генов цитолизинов В cereus их структурно-функциональный анализ и изучение функции данных цитолизинов Особый интерес представляло клонирование из генома В cereus гемолитических детерминант, не тождественных ранее клонированным генам Целью настоящей работы являлось клонирование генетической детерминанты гемолизина II, определение ее первичной структуры, функциональной активности в гетерологичной системе и распространение среди бацилл цереусной группы, описание особенностей регуляции экспрессии гена гемолизина II.

Для достижения указанной цели последовательно ставились следующие задачи 1 Создать библиотеку генов В cereus и отобрать гемолитические клоны 2. Идентифицировать генетическую детерминанту гемолизина II

3 Определить нуклеотидную последовательность клонированной генетической детерминанты В cereus и провести ее анализ На основании анализа выведенной аминокислотной последовательности сделать предварительное заключение о механизме действия гемолизина II

4 Исследовать особенности активности гемолизина II в гетерологичных системах (Е coli и В subtilis)

5 Провести скрининг коллекции штаммов бацилл цереусной группы на наличие последовательностей ДНК, гомологичных области, содержащей ген гемолизина II, и на продукцию подобного гемолизина

6 Определить роль нового гена hlylIR, впервые обнаруженного в данной работе, в регуляции экспрессии hlyll и характер этой регуляции

Данная работа выполнена в ВНТК структурно-функционального анализа генетических систем микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г К Скрябина РАН

Научная новизна работы. Результаты, полученные в ходе данных исследований, носят пионерский характер Впервые клонирован ген гемолизина II В cereus, определена его нуклеотидная последовательность и получены данные, позволяющие причислить этот белок к группе ß-складчатых олигомерных порообразующих цитолизинов Впервые установлено, что многие штаммы В ihuringiensis производят гемолизин, гомологичный гемолизину II В cereus. Впервые клонирован ген этого гемолизина В.thurmgiensis Клонирован новый регуляторный ген В cereus, контролирующий транскрипцию гена гемолизина II.

Практическое значение работы. Полученные результаты вносят вклад в изучение молекулярных основ патогенности В cereus и близких видов микроорганизмов Эти данные являются необходимым первоначальным этапом, закладывающим основу для дальнейших исследований гемолизина II выяснения его участия в патогенезе, изучения его структурно-функциональных особенностей Обнаружение подобного токсина у В thurmgiensis, широко применяемого как биологический инсектицид, заставляет усилить внимание к тщательному анализу используемых штаммов на предмет их безопасности для человека и животных Обнаружение нового регуляторного локуса В cereus, контролирующего транскрипцию гена гемолизина II, является шагом к выяснению сложных механизмов скоординированной регуляции генов, обеспечивающих патогенность этого микроорганизма

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи Результаты работы были представлены на Международной конференции, посвященной памяти акал А А Баева (Москва, 1996), на первом, втором и третьем международных семинарах "The Molecular Biology of Bacillus cereus, В anthracis and В thurmgiensis" (Oslo, Norwey, 1997), (Taos, USA, 1999) и (Nice, France, 2003) соответственно, на международных

конференциях "10th World Congress on Animal, plant and microbial toxins" (Singapore, 1991), "The 4th Symposium on Bacteria] genetics and ecology" (Wageningen, Dutch, 1993), "IUBMB/SASBMB Special Meeting on The Biochemical & Molecular Basis of Disease" (Cape Town, SAR, 2001), Gordon Research Conference (Andover, USA, 2004).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на/39 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список цитируемой литературы Список литературы включаетХЛ'источников Работа содержит "Щ.рисунков и 2 таблицы

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Клонирование и идентификация генетической детерминанты гемолизина II.

На основе вектора pUC19 создана fccRV-клонотека генов В.сегеш ВКМ-В771 На кровяном агаре отобраны 11 клонов, обеспечивающих гемолиз Один из них демонстрировал фенотип, характерный для клонов, экспрессирующих гены сфингомиелиназы и цереолизина АВ слабый лизис эритроцитов, тепло-холодовой гемолиз, лещтгиназная активность (Tomita et al, 1991, Гавриленко и др, 1993) Другие 10 клонов характеризовались лучшим проявлением гемолиза при 20°С, чем при 37°С Плазмиды из всех этих 10 клонов содержали идентичные (по результатам рестрикционного анализа) вставочные фрагменты размером -7,2 т.п н На рис 1А представлена физическая карта такого фрагмента из плазмиды р701, отобранной для дальнейшей работы Гемолитическая детерминанта локализована в пределах £coRI-субфрагмента (2 9 т п н ) вставки (рис 1 А) Сконструированы плазмиды pUJl и pUJ2, содержащие данный субфрагмент в pUC19 в разных ориентациях

Ранее из В cereus ВКМ-В164 клонированы гены цереолизина АВ (Гавриленко и др, 1993) и гемолизина III (Baida and Kuzmin, 1995) Гибридизацисниый анализ плазмиды pUJl с использованием в качестве зондов этих генов, помеченых [aMP]dATP, показал, что клонированная детерминанта не гомологична указанным генам и, следовательно, кодирует гемолизин, не тождественный цереолизину АВ и гемолизину III Учитывая способность клонированного гемолизина лизировать эритроциты человека, можно заключить, что он не является и гемолизином BL, который характеризуется отсутствием данного признака (Beecher and MacMillan, 1990)

Идентифицировать продукт клонированного гена позволило использование функциональных тестов, предложенных Кульбахом и Вильямсом (Coolbaugh and Williams, 1978) для характеристики гемолизина II Гемолитическая активность тестировалась в суспензии эритроцитов человека на основе спектрофотометрической регистрации высвобожденного гемоглобина (Bernheimer, 1988) В качестве препаратов клонированного

Pst I

Hind III

Eco RI

Eco RV

Bam HI

1000 н.п.

Eco Eco RI

p701 1 p701-P p701-K u p701-Hl ' p701-B p701-H2

II III

Hind Ш

Eco RI

Kpn 1

X/Hi 1

Eco RV

Psl I

Flac

Kpn i

Hind III

+ +

Ват HI

Eco RI

Hind III

h —

£co RI

pUJ71 pUJ70 pUJ30 pUJ40 pUJ31

- +

Рис. 1. Рестрикционная карта и делеционный анализ клонированного фрагмента геномной ДНК B.cereus ВКМ-В771. А' Физическая карта и делеционные производные исходного fcoRV-фрагмента Б Физическая карта и EwIII-делеционные производные ЕсоШ-фрагмснта, су бронированного в плазмидах pUJl/2 В колонке I указаны названия рекомбинангных плазмид Наличие или отсутствие гемолитического фенотипа у клеток E.coli с этими плазмидами обозначено "+" или "-" соответственно Регистрация фенотипа на агаризованной среде с эритроцитами человека производилась дважды после выращивания клонов в течение ночи при 37°С (II) и по истечении 8-10-часовой их последующей инкубации при комнатной температуре (III) Контурными стрелками указано направление и локализация /ас-промотора векторной плазмиды pUCI9 На рисунке Б жирными стрелками обозначены локализация и направление генов, обнаруженных в пределах данного EcoRl-субфрагмента

гемолизина использовались бесклеточные экстракты рекомбинантных клеток Е coli, трансформированных плазмидой pUJ2 (при экспрессии исследуемой детерминанты в Е coli большая часть гемолитической активности ассоциирована с клеткой) Поскольку известные

для гемолизина II свойства были получены путем сравнения со свойствами цереолизина (Coolbaugh and Wilhams, 1978), в тестировании участвовали также препараты цереолизина

Гемолизин, продуцируемый рекомбинантами Е coli, демонстрировал все характеристики, описанные для гемолизина II. Он абсолютно не ингибировался холестерином в концентрации 500 мкг/мл (для полной специфической инактивации цереолизина достаточно 50 мкг/мл холестерина, а при большей его концентрации неспецифически ингибируются многие другие гемолизины В cereus (Bemheimer and Grushoff, 1967) Клонированный гемолизин демонстрировал эффект Аррениуса - утрачивал свою гемолитическую активность при умеренных температурах и восстанавливал ее после кратковременного прогревания при высоких температурах (Рис. 2) и имел относительно протяженную задержку в кинетике лизиса эритроцитов (Рис. 3).

Рнс. 2. Влияние температуры прединкубации на степень восстановления гемолитической активности гемолизина, кодируемого

клонированным фрагментом ДНК B.cereus (А, Б), и цереолизина (В, Г). В качестве препаратов клонированного гемолизина использовали супернатант из экстрактов разрушенных клеток E.coli Z85 (pUJ2) (А) и концентрат супернатанта культуральной жидкости B.subtihs МС5 (pMJ2) (Б). В качестве препаратов цереолизина использовали концентрат супернатанта культуральной жидкости В cereus ВКМ-В164 (В) и гомогенный цереолизин, выделенный из этого штамма (Г). Исследуемые образцы с исходными активностями гемолизинов - 150 ГЕ/мл, прединкубировали в течение 5 мин при указанных температурах, охлаждали во льду и в каждом измеряли остаточную гемолитическую активность О степени восстановления активности после прогревания судили, сравнивая остаточную активность с исходной

100 ----, Рис. 3. Сравнение кинетик лизиса эритроцитов

: человека очищенным препаратом цереолизина (•) и

jj80, . •* » гемолизином, продуцируемым рекомбинантными

« 60 # * а *л клетками Е. coli Z85(pUJ2), (А). К 0 5%-ной суспензии

с а эритроцитов человека добавляли препараты гемолизинов

| 40 до концентрации около 1,5 ГЕ/мл Реакцию проводили при

ж ' 37°С, отбирая каждую минуту пробы для

, • 4 * спектрофотометрического определения степени гемолиза

^ 5 10 15 20

Время, мин

Это позволяет сделать вывод, что клонированный фрагмент ДНК содержит генетическую детерминанту гемолизина II В cereus Таким образом, впервые доказано существование гемолизина II как нового гемолитического фактора В cereus, отличного от цереолизина AB, гемолизинов BL, I (цереолизин) и III

g g 20 40 00 60 100 40 60 80100

m а Температура, °С

Для экспрессии данной генетической детерминанты в В subtilis исследуемый EcoRl-фрагментДНК был клонирован в составе челночного вектора рМК4-19 (плазмида pMJ2) и введен в клетки В subtilis МС5 В полученном рекомбинантном штамме гемолизин продуцировался в конце логарифмической фазы роста и секретировался в внеклеточную среду Уровни гемолитической активности, тестируемой в рекомбинантных штаммах Е coli и В subtilis, были сопоставимы Концентрат культуральной жидкости В subtilis МС5 (pMJ2) участвовал в проведении функциональных тестов для идентификацш гемолизина II наряду с препаратами из кишечной палочки В обоих случаях гемолизин вел себя аналогичным образом, исключая более высокую его термостабильность при экспрессии в В subtilis (сравнить рис 2А и 2Б).

Рис 4. Профили белков, кодируемых рекомбинантнымн плазмидами, содержащими ген гемолизина II. Радиоавтограф меченых 3äS-метионином белков, продуцируемых мини-клетками Е. coli Р678-54 с плазмидами pUC19 (1), pUJl (2) и рТНЗ (3), после электрофоретического разделения в градиентном ДСН-ПААГ (9-20%). Цифрами указаны молекулярные массы маркерных белков Стрелкой отмечена полоса, принадлежащая гемолизину II.

Использование мини-клеток Е coli (Stoker et а!, 1984), содержащих плазмиду pUJl, позволило идентифицировать гемолизин П как полипептид с молекулярной массой ~42кДа (рис 4, дорожки 1 и 2)

2. Анализ нуклеотидной последовательности гена hlyll Для локализации гена гемолизина в пределах клонированного фрагмента ДНК с помощью экзонуклеазы III был получен набор однонаправленных делеций с правого фланга EcoRI-фрагмента (рис 1 Б) Минимальный фрагмент ДНК, обеспечивающий рекомбинантным Еcoli гемолитический фенотип, имел длину около 1,2 тпн (плазмида pUJ40) Однако клетки с этой плазмидой демонстрировали очень слабый, едва регистрируемый на кровяном агаре гемолиз Клетки, содержащие плазмиду рШЗО с вставкой около 1,4 тпн, при 20°С имели фенотип, сравнимый с фенотипом, который обеспечивается pUJl с исходным 2,9 т п н фрагментом Таким образом, ген гемолизина II можно локализовать в области этих 1,4 т п н

Была определена нуклеотидная последовательность исходного EcoRI-фрагмента (номер в GenBank U94743 и AY212780)

EcoRI

gaattctataatttttttgtatttttttaaacaagaattttaaatatatatttaaaatt

-ЯГ

60 cttgtttaaatcgttattci

Sspl +1

tattGataatagttatcagtaaagaaga

120 gatggaaattagcaaatcaagtgttgatagttattggcataaagattaataaatttctac

Alul

180 attgtaacgttataaatctatctctagtattgagagctaaaaataatacgtttatatctt sd mkkakgiaks

240 ttaaatgtttaagaaggagtggctgtctgtatgaaaaaagcaaagggaatagctaaaagt 11 vavasvimsgslglqatsaf 300 gttgccgtagcttccgttataatgtctggatcacttggtttacaagcaacatctgcattt 31 а i d

360 gcagat............структурная часть гена hlyll-...........

Рис. 5. Нуклеотидная последовательность участка клонированного ЕсоЮ-фрагмента ДНК В. cereus ВКМ-В771, содержащего регуляторную область гена гемолизина П.

Промоторная -10 область выделена черным Крупным жирным шрифтом показан стартовый нуклеотид транскрипции гена, определенный экспериментально Инвертированный повтор, являющийся оператором hlyll, отмечен встречными стрелками Предполагаемая последовательность Шайна-Дальгарно (SD) обозначена жирным шрифтом Начало выведенной аминокислотной последовательности обозначено однобуквенным кодом над соответствующим участком нуклеотидной последовательности Вертикальной стрелкой отмечен предполагаемый сайт расщепления сигнальной пептид азой Стартовый кодон подчеркнут двойной линией Обозначены некоторые сайты эндонуклеаз рестрикции, использованные в работе.

Поиск потенциальных кодирующих участков в данной последовательности выявил две протяженные открытые рамки считывания Первая начинается в позиции 252 и заканчивается терминирующим кодоном ТАА в положении 1506 Вторая ОРС располагается с 1916 по 2519 п. н. Исходя из результатов делеционного картирования, гену гемолизина II (hlyll) принадлежит первая ОРС Потенциальные инициирующие колоны в этой рамке расположены в позициях 258, 270, 321, 435 Однако только перед кодоном ATG(270) на расстоянии 11 п н находится предполагаемый сайт связывания с рибосомой - GAAGGAG, указывая на то, что трансляция, по всей вероятности, начинается с этого АТГ Таким образом, кодирующая часть гена hlyll состоит из 1236 нуклеотидов Точка начала транскрипции и соответственно - промотор для гена гемолизина были определены методом удлинения праймера Использовалась РНК, выделенная из клеток Ecoli, содержащих плазмиду с геном hlyll Выявлен единственный продукт реакции элонгации, которому соответствует транскрипт, начинающийся на расстоянии 174 основания перед инициирующим ATG гена гемолизина II (рис 5 и 6) Этой стартовой точке предшествует протяженный промоторный -10-бокс TGTGTTTTAAT (рис 5), последовательность которого хорошо согласуется с консенсусной (Gaal et al, 2001) Делеция £coRI-5ipI, удаляющая этот участок, приводила к отсутствию продукта реакции элонгации (рис 6), что подтверждает его роль в транскрипции гена гемолизина II Не было выявлено -35-элемента промоторной

области, который, как показано (Barne et al, 1997), не требуется для активности промоторов данного класса На участке ДНК за стоп-кодоном гена (1594-1618 нуклеотиды) располагается потенциальный терминатор транскрипции - совершенный палиндром, способный образовывать шпилечную структуру с свободной энергией -13,3 ккал/моль (программа "HAIRPIN", "PC/Gene") Перед hlyll (26 - 69 нуклеотиды) находится еще один совершенный инвертированный повтор, который способен формировать шпильку с AG -27,8 ккал/моль и, как показано ниже, является оператором гена

Таким образом, анализ нуклеотидной последовательности выявил наличие всех функциональных элементов экспрессирующегося гена открытой рамки считывания длиной 1236 нуклеотидов, инициаторного и терминаторного кодонов, сигналов инициации и терминации транскрипции и сайта связывания рибосомы Из этих данных, а также из находящихся в полном соответствии с ними результатов функционального анализа клонированного ícoRI-фрагмента ДНК следует, что данный фрагмент содержит ген (hlyll), способный экспрессироваться в клетках В subíilts и Е. coli со своего собственного промотора и обеспечивающий хозяйским клеткам гемолитический фенотип Ген гемолизина II, очевидно, является индивидуальной единицей транскрипции. GATC12

Рис. 6. Определение стартовой точки транскрипции гена hlyll. Для реакции удлинения праймера использовалась тотальная РНК, выделенная из рекомбинантных клеток Е. coli с плазмидой pUJl, содержащей интактный ген hlyll (1), и с ее производной, pASspI, несущей делецию EcoRI-Sspl (90 нуклеотидов с левого фланга £coRI фрагмента) (2) В качестве праймера использован олигонуклеотид, комплементарный последовательности начала hlyll Представлен радиоавтограф 6% денатурирующего геля, в котором разделены продукты реакции элонгации и продукты секвенирующей реакции, проведенной с тем же праймером и плазмидой pUJl в качестве матрицы

По данным анализа нуклеотидной последовательности гемолизин II состоит из 412 аминокислотных остатков и имеет молекулярный вес 45,6 кДа В аминокислотной последовательности гемолизина, выведенной из последовательности нуклеотидов, в N-концевой области выявлены структуры, характерные для сигнального пептида (Scott and Silhavy, 1982) (Рис 5) Так, аминокислотные остатки в положении 10-31 образуют потенциальный трансмембранный гидрофобный домен Ему предшествует область^ обогащенная положительно заряженными аминокислотными остатками (4 остатка лизина) Предполагаемый сайт расщепления расположен между 31 и 32 аминокислотными остатками Молекулярная масса предполагаемого зрелого гемолизина равна 42,3 кДа, что хорошо

согласуется с результатами миниклеточного, анализа (рис 4) Очевидно, гемолизин И, являясь секреторным белком, синтезируется в форме предшественника, имеющего сигнальный пептид из 31 аминокислотного остатка, который в ходе процессинга отщепляется сигнальной пептидазой с образованием зрелого белка.

Анализ выведенной аминокислотной последовательности гемолизина П продемонстрировал нетождественность этого гемолизина другим известным бациллярным цитолитическим факторам, подтвердив наш вывод о том, что этот белок является "самостоятельным" гемолизином B.cereus, который кодируется собственным геном, отличным от клонированных на сегодняшний день Таким образом, окончательно опровергаются выдвигавшиеся ранее гипотезы, рассматривающие гемолизин II как протеолитический фрагмент цереолизина (Fossum, 1963) или отождествляющие активность, приписываемую этому гемолизину, с активностью сфингомиелиназы и/или лецитиназы (Gilmore et al., 1989; Bowman et al, 1971).

Hlyll Alpha HL

Hlyll

i:GTfENLQNGG------BVYNSFKT^JM;

dinfktgttdigsnttvjr—gdlvhp<l

fai vtBdBSnidakytinggyy- n| IlvirBkpIiagqyrvyseegank

:k#n«nsik'

EfGlHKKfF'

vSIBdnS

Alpha HL VSIGHTL:

Hlyll Alpha HL

Hlyll Hlyll

:TEfTS--taKlTNRfIS|»lEt,«K|W»eTYNEFFTli]

.fiAiKQQTNlDVI

tte| 81

KWTfiRSSfll

^■knhqvtldnqkapeeqmiginnvnnqlnkgkgklsfsmngnqlka xHekeemtn

tssnagygisyedknvjgifvngekvytfnekttvgnisndinklnikg PYIEIKKI

41 46

88 94

136 139

184 187

231 235

277 283

324 293

372 381

Рис. 7. Сравнение аминокислотных последовательностей гемолизина II B.cereus (Hlyll) и а-токсина S.aureus (Alpha; номер в GenBank - Х01645). Дана последовательность предполагаемого зрелого Hlyll (без сигнального пептида - 31 N-концевого аминокислотного остатка) Выравнивание выполнено с помощью программы FASTA Идентичные аминокислотные остатки выделены черным цветом, подобные - серым. Пунктирами обозначены пробелы, вставленные в последовательности для улучшения выравнивания

Была обнаружена значительная гомология между гемолизином II и а-токсином Staphylococcus aureus (31,2% идентичности) (рис 7) а-Токсин - это гемолизин, продуцируемый большинством патогенных штаммов S aureus Он лизирует все типы клеток

млекопитающих, олигомеризуясь в гептамеры, встраивающиеся в клеточные мембраны с образованием гидрофильных пор (Song et al., 1996)

На сегодняшний день а-токсин S aureus весьма хорошо изучен описана его пространственная структура, установлена роль многих отдельных аминокислотных остатков в процессах связывания токсина с мембраной, его олигомеризации и порообразования (Song et al, 1996; Gouaux, 1998; Krasilnikov et al, 2000). Гомология с а-токсином выявляется на протяжении 317 N-концевых аминокислот Hlyll, тогда как предполагаемый продукт трансляции hlyll на 94 аминокислоты длиннее, чем а-токсин (рис 7) В ходе делеционного анализа было показано, что эти 94 амнокислотных остатка не являются необходимыми для гемолитической функции гемолизина II (плазмида pUJ40, рис 1Б), хотя их делегирование вызывает заметное снижение уровня гемолиза

Данный факт нашел подтверждение в работе Майлса (Miles et al., 2002), исследовавшего свойства гемолизина II, полученного в сопряженной системе транскрипции и трансляции in vitro Роль этих "дополнительных" аминокислотных остатков еще предстоит выяснить Участки гомологии гемолизина II с а-токсином располагаются равномерно по длине белковых молекул Однако в пространственной струетуре последнего эти участки преимущественно группируются в составе домена, который образует наружную гидрофильную часть поры, выступающую из клеточной мембраны, и, вероятно, являются существенными для формирования этого домена Сравнительное выравниваше трехмерной структуры гемолизина II по структуре а-токсина S. aureus ("Spabwiewer") указывает на сходство пространственных укладок этих двух белков Исходя из результатов данною выравнивания, гемолизин II формирует в клеточной мембране поры, состоящие из семи молекул белка, - также, как и в случае с а-токсином. Это экспериментально подкреплено Майлсом (Mlles et al, 2002), показавший что гемолизин II образует в мембранах эукариотических клеток гомогептамерные, селективные для анионов поры, подтверждая его структурную и функциональную гомологию с а-токсином S.aureus. Принимая во внимание имеющуюся гомологию, интересно отметить, что для гемолизина II показаны некоторые свойства, описанные и для а-токсина Так, оба этих белка проявляют выраженный эффект Аррениуса, демонстрируют сходную температурную зависимость (20°С - более оптимальная температура для обоих гемолизинов, чем 37°С) и обладают повышенной специфичностью к кроличьим эритроцитам по сравнению с эритроцитами человека

Помимо а-токсина гомологию с Hlyll продемонстрировали у-гемолизин и лейкоцидины S.aureus. Р-токсин Clostridium perfringens и цитотоксин CytK В cereus (28-37% идентичности) Все эти токсины принадлежат к семейству Р-складчатых олигомерных порообразующих цитолизинов, а а-токсин рассматривается как прототип семейства

(Соиаих,1998, МеиевОта ее а1, 2001) Исходя из обнаруженной гомологии и структурно-функциональных характеристик, гемолизин II причислен к данному семейству цитолизинов 3. Распространение гемолизина II среди бацилл цереусной группы.

Геномные ДНК ряда штаммов В сегеш, В 1кигтреп5и (представляющих различные подвиды) и В.аткгася были протестированы на наличие последовательностей, гомологичных ЕсоШ-фрагменту ДНК В сегеш ВКМ-В771, содержащему ген гемолизина II. Тотальные ДНК исследуемых микроорганизмов гидролизовались рестриктазой ЕсоКУ, полученные фрагменты разделялись в 0 8% агарозном геле, переносились на нитроцеллюлозные фильтры и гибридизовались с указанным фрагментом, меченным 32Р Оказалось, что лишь 4 из 16 проверенных штаммов В.сегеиз содержат фрагменты ДНК, демонстрирующие гомологию с указанным зондом В то же время из 14 тестированных представителей B.thunnglensis гомологию с фрагментом, содержащим ген Ыу\\, проявляют 13 штаммов (т. е подавляющее большинство) (рис.8). Использованные в работе ДНК двух

-1,9

12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Рис. 8. Гибридизационный анализ геномных ДНК различных штаммов В.сегаи и В.гЛиг/п^'/слл'х на наличие последовательностей, гомологичных фрагменту ДНК В.сегеиэ ВКМ-В771, включающему в себя ген гемолизина II. В качестве зонда использован 32Р-меченый £соЯ1-фрагмент (2,9 тпн) из плазмиды рШ1 Дорожки 1-5' В.сегеш ВКМ-В771 (1), ВКМ-В504 (2); ВКМ-В366 (3), ВКМ-В370 (4) и ВКМ-В164 (5), дорожки 6-19 В.Мипп&еми ВКМ-В83 (6); ВКМ-В84 (7), ВКМ-В85 (8), ВКМ-В440 (9), ВКМ-В441 (10), ВКМ-В444 (И), ВКМ-В446 (12), ВКМ-В387 (13), ВКМ-В1555 (14), ВКМ-В1557 (15), ВКМ-В162 (16), ВКМ-В443 (17), ВКМ-В447 (18), ВКМ-В796 (19) Представлены преимущественно штаммы, давшие положительный ответ при гибридизации с указанным зондом

штаммов В аыИгаш (СТИ и вакцины Ценковского) дали при тестировании положительный ответ Отсутствие гибридизации с использованным зондом позволяет сделать вывод о неспособности штаммов производить гемолизин II Однако, положительный ответ при подобном тестировании не может интерпретироваться однозначно, поскольку ДНК зонда содержит не только интересующий нас ген, но и дополнительные участки Кроме того,

присутствие в геноме гомологичной функциональному гену последовательности ДНК не означает наличие самого функционального гена

Поэтому использованные в гибридизационных экспериментах 16 штаммов В cereus и 14 штаммов В. thuringiensis были исследованы также и на способность продуцировать гемолизин II Штаммы выращивали в оптимальных для продукции гемолизинов условиях' в сердечно-мозговом бульоне (3,7%) при 28°С с интенсивной аэрацией В культуральных жидкостях измерялась общая гемолитическая активность и активность, остающаяся после их инкубации с холестерином (0 2 мг/мл) Последнюю мы рассматривали как активность гемолизина II, поскольку холестерин ингибирует SH-токсины цереолизин (Coolbaugh and Williams, 1978) и туринголизин (Pendleton et al, 1973), вносящие основной вклад в суммарную гемолитическую активность В cereus и В thuringiensis (Bernheimer and Grushoff, 1967). При используемой концентрации холестерина происходило неспецифическое подавление и других гемолизинов По характеру влияния холестерина на активность продуцируемых гемолизинов было выявлено два типа штаммов Микроорганизмы первого типа вырабатывали только гемолизины, активность которых полностью ингибировалась холестерином (рис9А и С) Штаммы второй группы помимо этих белков продуцировали гемолизин, активность которого холестерином не подавлялась (рис 9В и Д) - это, очевидно, гемолизин II, характерной особенностью которого является нечувствительность к холестерину Среди микроорганизмов, вырабатывающих этот гемолизин, лишь 4 принадлежали к виду В cereus и 13 - к В thuringiensis Ими оказались те же самые штаммы, которые давали положительный ответ в экспериментах по гибридизации с ДНК-зондом,

0 4 8 12 16 20 24 о 4 8 12 16 20 24

Время, ч

Рис. 9. Продукция внеклеточных гемолизинов различными штаммами В.сегеих и В.ГАигш^/елш (А)-общая

гемолитическая активность в

культуральной жидкости; (•)-остаточная гемолитическая активность в культуральной жидкости после ее инкубации с холестерином, (а) -оптическая плотность культуры В качестве примеров штаммов, различающихся по характеру влияния холестерина на активность продуцируемых ими гемолизинов, представлены В сегеш ВКМ-В164 (А) и В сегеш ВКМ-В771 (Б), В Лип^шт^ ВКМ-В796 (В) и В ¡Ьи-^етк ВКМ-В1555(Г)

содержащим ген гемолизина II (рис 8) Эта корреляция дает основания заключить следующее Во-первых, использованный в данной работе метод идентификадаи гемолизина II в культуральных жидкостях В cereus и В thuringiensis является правомерным Во-вторых, области ДНК в геномах тестированных штаммов, демонстрирующие гомологию с использованным гибридизационным зондом, содержат функциональный ген, который кодирует активный гемолизин II

Десять из проверенных штаммов В thuringiensis имеют в своем геноме EcoRV-фрагмент ДНК размером около 3,5 т п н, который гибридизуется с ДНК-зондом, содержащим ген гемолизина П В cereus (дорожки 6-15 на рис 8) Данный фрагмент ДНК В thuringiensis В1555 был клонирован в составе pUC19 в клетках Ecoli (плазмида рТНЗ). Показано, что он кодирует гемолизин, аналогичный по свойствам гемолизину II из B.cereus В771 Например, он также проявляет эффект Аррениуса, имеет характерную для гемолизина II В cereus кинетику лизиса эритроцитов и идентичен с последним по элекгрофоретической подвижности (рис 4) Это является убедительным аргументом в пользу широкого распространения гемолизина II среди представителей В thuringiensis Что касается В anthracis, то опубликованные недавно данные о первичной структуре геномов двух сибиреязвенных штаммов (Read et al, 2002,2004) подтвердили наличие в нем нуклеотидной последовательности, гомологичной гену hlyll В cereus Однако, у В anthracis выявлены в этом гене четыре нуклеотидные замены, приводящие к сдвигу рамки считывания, возможно, делая ген нефункциональным.

Несмотря на то, что биологическую роль гемолизина II еще предстоит выяснить, представленные нами данные, а также многочисленные исследования, касающиеся потенциальной патогенности В thuringiensis для млекопитающих (Akiyama et al., 1984; Osawa et al, 1984, Jackson et al, 1995; Damgaard, 1995), указывают на то, что штаммы данного вида, используемые как биологические инсектициды, следует серьезно исследовать с точки зрения их возможной опасности для человека и животных В интересах экологической безопасности этому вопросу следует уделить серьезное внимание

4. Регуляция экспрессии гена гемолизина II B.cereus.

В пределах EcoRI-фрагмента ДНК размером 2904 п н , содержащего ген hlyll В cereus, выявлено наличие еще одной ОРС, протяженностью 201 кодон, которая располагается за геном гемолизина Инициирующий кодон ATG находится в позиции 1916, терминирующий TGA - в позиции 2519 Перед инициирующим кодоном на расстоянии 8 нуклеотидов располагается последовательность GAGG - предполагаемый сайт связывания с рибосомой Новой ОРС предшествует потенциально способная к инициированию транскрипции АТ-богатая область с каноническими -10 и -35 промоторными боксами На участке ДНК за стоп-кодоном выявлен совершенный инвертированный повтор - предполагаемый р-

независимый терминатор транскрипции нового гена Подобный терминатор также и предшествует данной ОРС, очевидно, терминируя транскрипцию Ыу11 Таким образом, новый ген, названный нами ЫуПЯ, видимо, может экспрессироваться независимо от Ыу11 Направление транскрипции обоих генов одинаковое

Сравнение аминокислотной последовательности предполагаемого белка Н1у11Я с последовательностями белков, имеющимися в базах данных, выявило его сходство с рядом олигомерных ДНК-связывающих бактериальных регуляторов транскрипции семейства ТеИ^/АсгЯ Уровень общей гомологии ШуИЯ с этими белками составляет 26-29%. Однако, на участке с 12 по 58 аминокислоту Н1у1ГО. проявляет высокую идентичность и подобие до 80% с Ы-концевыми районами указанных регуляторов, содержащими консервативный "спираль-поворот-спираль" ДНК-связывающий мотив Согласно результатам предсказания пространственной укладки ШуПИ, он на участке 30-48 аминокислотный остаток с высокой степенью вероятности способен образовывать классическую "спираль-поворот-спираль" структуру. Таким образом, анализ предсказываемой первичной и пространственной структуры гипотетического белкового продукта гена й(у//Л, указывает на то, что этот белок является регулятором транскрипции

pUJ1-

рН2

pRH2

Iii "У".

hlyllR w

plac

-TL

hlyll

pUC19

j pUC19 I hiyim

plac

±L

p15KS

pUC19 pRH2

pH2 pRH2

pUJl ptSKS

pH2

pl5KS

10 100 Гемолитическая активность (%)

Рис. 10. Влияние гена hlyllR на гемолитическую активность, обеспечиваемую экспрессией hlyll. А Схемы рекомбинангных плазмид, использованных в эксперименте Б Результаты количественной оценки суммарной гемолитической активности в штаммах Е coli с указанными рекомбинангными плазмидами Штаммы выращивались в условиях, оптимальных для продукции гемолизина в жидкой среде LB с аэрацией при 22°С до начала стационарной фазы роста

В ходе функционального картирования icoRI-фрагмента ДНК с геном гемолизина II было обнаружено' концевые делении, не затрагивающие ген гемолизина, но нарушающие hlyllR, приводят к заметному (при определенных условиях) ослаблению гемолитического фенотипа рекомбинантных клеток Е coli (рис 1Б) Для исследования влияния гена hlyllR на экспрессию hlyll были созданы плазмиды, содержащие каждый из этих двух генов по отдельности (рис 10А), и протестирована гемолитическая активность рекомбинантных

клонов Е coli (рис 1 ОБ) Оказалось, что плазмида рН2 с геном одного гемолизина (без предполагаемого регулятора) обеспечивает клеткам гемолитическую активность, на порядок меньшую, чем при наличии обоих генов в составе единого фрагмента ДНК (pUJl) Таким образом, демонстрируется позитивное влияние hlyllR на экспрессию гена гемолизина IT Сам hlyllR (плазмида pRH2) не обеспечивает клеткам Е coli способность лизировать эритроциты

Поскольку плазмиды рН2 и pRH2 созданы на основе совместимых репликонов pUC19 и pl5KS соответственно, была протестирована гемолитическая активность клеток, несущих обе эти плазмиды Показано, что наличие генов гемолизина и регулятора на отдельных плазмидах приводит к десятикратно^ падению гемолитической активности по сравнению с клетками, где присутствует только плазмида с одним hlyü Этот эксперимент свидетельствует, что hlyllR способен оказывать и негативное влияние на проявление гена гемолизина II

Примеры, когда один и тот же регулятор способен быть и активатором, и репрессором. в зависимости от присутствия кофакторов, от его концентрации или от других обстоятельств, описаны для ряда белков-регуляторов транскрипции (Heinrichs and Poole, 1996; Rasmussen et al, 1996) Вероятно, что условием, определяющим, какой именно эффект (позитивный или негативный) проявляет hlyllR, выступает концентрация этого регулятора в клетке Классический пример - репрессор фага X, имеющий множественные сайты связывания на ДНК и характеризующийся кооперативным связыванием В зависимости от концентрации репрессора в клетке он занимает тот или иной операторный участок, что и определяет его позитивный или негативный эффект (Ptashne et al, 1976)

Опираясь на сходство HlyllR с ДНК-связывающими регуляторами транскрипции семейства TetR/AcrR, предположено, что этот белок влияет на экспрессию гена гемолизина II на транскрипционном уровне Для проверки данного предположения исследовалось влияние hlyllR на экспрессию репортерного гена, считываемого с промоторной области hlyff Была сконструирована плазмида pFHlLac, в которой ген ß-галактозидазы lacZ, лишенный своего промотора, слит с ре1уляторной областью hlyll, лежащей перед геном (рис 11А)

Тестировалось влияние совместимой плазмиды, несущей hlyllR, на уровень ß-галактозидазной активности в клетках с pFHILac (рис 11 Б) Показано, что плазмида, содержащая репортерный ген, в клетках Е coli обеспечивает заметный уровень активности ß-галактозидазы Однако, введение в эти клетки еще и плазмиды с hlyllR (pRH2) приводит к десятикратюму падению данной активности Таким образом подтверждается, что HlyllR осуществляет свой контроль (по крайней мере - негативный) на уровне транскрипции, через взаимодействие с регуляторной областью гена гемолизина II

pFHlfc

ЫуП

lacZ

phc

pUC19

phc

pUC19

pFHI tac pFH1 loc pUCIS p1«KS pRH2 pRH2

Рис. 11. Влияние гена hlyllR на экспрессию гена ß-галактозидазы под контролем промоторной области hlyll. А- Схема плазмиды pFHILac, содержащей ген ß-гадактозидазы без собственного промотора (жирная черная стрелка), слитый с регуляторной областью и N-концевой частью гена hlyll (обозначены серым цветом) Б'

Результаты количественной оценки ß-галакгозидазной активности в экстрактах рекомбинантных клеток Е coli, несущих указанные плазмиды

Был выделен и очищен белковый продукт гена hlyllR Для этого структурная часть гена клонирована в специализированной векторной системе pQE30 (Qiagen, Hilden, GERMANY), позволяющей получать высокий уровень синтеза белков с присоединенной N-концевой последовательностью из 6 остатков гисгидина

Рис. 12. Продукция и очистка рекомбинантного белка К6№$Н1у1Ш. 7% ДСН-ПААГ электрофорез белков, продуцируемых клетками Е.соИ М15(рЯер4, рНЯШ) без индукции (дорожка 1), через 1, 3, 5 часов после индукции ИПТГ (дорожки 2-4), белка Ы6Н]5Н1у1Ш после высаливания сульфатом аммония (6) и после снятия с №^ТА колонки (7) Дорожка 5- смесь маркерных белков с молекулярными массами 14, 20, 31, 46, 64 и 82 Ша.

При индукции ИПТГ в клетках Е coli, содержащих полученную плазмиду pHRHis, наблюдалась повышенная экспрессия единственного белка с Мм около 25 kDa (рис 12) Это значение молекулярной массы хорошо коррелирует с соответствующей величиной, рассчитанной на основе нуклеотидной последовательности гена hlyllR Рекомбинангный Швб-маркированный белок HlyllR был очищен из клеточного экстракта до гомогенного состояния в две стадии осаждение 60% сульфатом аммония и хроматография на колонке с Ni-NTA (Qiagen, Hilden, GERMANY) (рис 16) Очищенный препарат белка использовался в дальнейших экспериментах по связыванию с ДНК

Участки ДНК из регуляторной области гена hlyll, с которыми связывается белок HlyllR, выявлялись в экспериментах по задержке в геле (рис 13) Показано, что белок образует комплекс с фрагментом размером 480 п н, включающим в себя регуляторную область гена гемолизина II (EcoRl-BamHl фрагмент плазмиды рН2) В пределах этих 480 п н выявлен субфрагмент длиной 220 п н (EcoR\-Alu\), с которым специфически связывается HlyllR (рис 13А, Б)

Рис. 13. Электрофоретическая подвижность фрагментов ДНК, содержащих

\ Б регуляторную область hlyll, и их комплексов

с N6HisHlyIIR

А Электрофорез в 1%-ном агарозном геле фрагментов ДНК плазмиды рН2, расщепленной EcoKl, Hindlll и ВатШ, до (1) и после инкубации с регуляторным белком (2) Б Радиоавтограф 6%-го ПААГ после разделения в нем у^Р-меченых фрагментов ДНК - продуктов гидролиза 480 п н ВатШ -ЕсоРЛ фрагмента плазмиды рН2 эндонуклеазой A lui (дорожка 3 - без добавления HlyllR, 4 и 5 -после инкубации с HlyllR) Для контроля на специфичность связывания была проведена реакция связывания в присутствии избыточных количеств линейной ДНК pUC19 Стрелками указано положение комплексов ДИК-HlyIIR

HlyllR - +

+ +*

480-

220* .4fc» -180- —

70-

1 2

3 4 5

Для более точной локализации участка связывания ДНК с Н1у1Ш проведены эксперименты по расщеплению ДНКазой I комплексов ЫбН^ШуПЯ-ДНК (рис 14) Установлено, что в пределах указанного субфрагмента (220 п н ) белок специфически защищает от расщепления ДНКазой I область ДНК протяженностью около 50 п н (20-72 нуклеотиды от левого фланга £соЮ-фрагмента) Эта область соответствует совершенному инвертированному повтору размером 22 п н (рис 5). Поскольку для многих транскрипционных регуляторов показано, что именно инвертированные повторы являются их сайтами-мишенями (Соловьев, 1988), можно заключить' указанный 44-нуклеотидный палиндром, центр которого располагается за 48 пн перед точкой начала транскрипции гена гемолизина II, функционирует как операторный участок, узнаваемый белком ЖуНИ Расположение участка связывания этого белка относительно промоторной области гена гемолизина позволяет предположить, что регулятор Н1у1Ж осуществляет свое негативное воздействие на транскрипцию МуП, создавая при связывании с оператором стерическое препятствие для РНК-полимеразы Однако, по предварительным данным, ЖуПЯ может затруднять процесс превращения закрытого промоторного комплекса в каталитически активный открытый комплекс через белок-белковое взаимодействие с РНК-полимеразой

Рис. 14. Фут-принт комплекса №Ш$Н1у1Ш с промоторной областью ЫуП с использованием ДНКазы I. Дмплифипированиый меченный Р32 фрагмент плазмиды рШ1 (1-375 нп. ЕсоШ-вставки), содержащий промоторно-операторную зону ЫуП, инкубировался с белком ШуНЯ (возрастающие концентрации) в присутствии неспецифической ДНК и обрабатывался ДНКазой I. Электрофорез проводился в 6% денатурирующгм ПААГ Стрелками указано положение 44-п н палиндрома перед промотором ЫуП.

Учитывая локализацию генов ЫуП, и регуляторного белка, их однонаправленность, способность Н1у11Я осуществлять позитивный и негативный контроль экспрессии гена ЫуП, можно предположить влияние продукта гена Н1у1Ш. на эффективность и собственной экспрессии По нашим предварительным данным при низких концентрациях регулятора он связывается с дистальным по отношению к промотору участком операторной области и выступает в роли активатора транскрипции гена гемолизина II и, возможно, - ЫуПЯ По мере накопления Н1у11К он заполняет остальную часть оператора и репрессирует транскрипцию гена ЫуП и видимо, собственного гена Вероятно, когда В сегеш находится вне макроорганизма не требуется высокий синтез гемолизина, и данный авторегуляторный механизм направлен на поддержание некоторого невысокого стационарного уровня экспрессии ЫуП Однако в определенных ситуациях (например, в ходе инфекционного процесса) для бактерии целесообрашо резкое увеличение продукции гемолизина Следовательно, должен существовать некий дополнительный механизм или фактор по ¡во чяюший снимать репрессию с гена ЫуП Выяснение данного вопроса, как и дальнейшая проверка предложенной схемы регуляции гена гемолизина II. есть предмет текущих исследований

12 3 4

выводы

1 Обнаружен и впервые клонирован ген гемолизина II Bacillus cereus, определена его нуклеотидная последовательность и на основании анализа аминокислотной последовательности, выведенной из первичной структуры его гена, гемолизин II причислен к семейству ß-складчатых порообразующих олигомерных цитолизинов

2. Установлено, что способность продуцировать гемолизин П является штаммоспецифичным свойством В cereus и B.thuringiensis

3 Идентифицирован и клонирован новый ген В cereus - hlyllR. Установлено, что экспрессия гена гемолизина II В cereus контролируется белковым продуктом hlyllR, который взаимодействует с операторным участком, лежащим перед геном гемолизина II.

4 Показано, что HlyllR способен выступать как в роли позитивного, так и негативного регулятора экспрессии гена гемолизина II.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Синев М А, Бударина Ж И, Гавриленко И В , Томашевский А Ю , Кузьмин Н П 1993 Доказательство существования гемолизина II Bacillus cereus• клонирование генетической детерминанты гемолизина II Молекулярная биология, т 27, в 6, с 12181229.

2 Budarina, ZI, Sinev, М.А., Mayorov, S G, Tomashevski, A.Y , Shmelev, I V , Kuzmin, N P 1994 Hemolysin II is more characteristic of Bacillus thuringiensis than Bacillus cereus Archives of Microbiology, v 161, p 252-257

3 Baida, G, Budarina, ZI, Kuzmin, N P , Solonin, A.S. 1999 Complete nucleotide sequence and molecular characterization of hemolysin II gene from Bacillus cereus FEMS Microbiology Letters, v 180, p 7-14

4 Budarina, ZI, Nikitin, D.V , Zenkin, N., Zakharova, M, Semenova, E, Shlyapnikov, M G, Rodikova, E A, Masyukova, S , Ogarkov, О , Baida, G E , Solonin, A.S , Severinov, К 2004 A new Bacillus cereus DNA-binding protein, HlyllR, negatively regulates expression of B.cereus haemolysin II Microbiology, v 150, p. 3691-3701

5 Kuzmin, N.P., Gavrilenko, IV, Budarina, ZI, Tomashevski, AY, Sinev, MA 1991 Molecular cloning of hemolysin II genetic determinant from Bacillus cereus in Escherichia coli and Bacillus subtilis cells Abstracts of 10л World Congress on Animal, Plant and Microbial Toxins, Singapore, November 3-8, 1991, p 344

6 Budarina, Z I, Baida, G., Kuzmin, N P Hemolysin II from Bacillus cereus Abstracts of the 1st International Workshop on the Molecular Biology of Bacillus cereus, В anthracis and B. thuringiensis , Oslo, May 23-25,1997, p 11

7 Budarina, ZI, Nikitin, D.V, Baida, GE., Solonin, AS HlyllReg, a regulator of hemolysinll gene from Bacillus cereus. Abstracts of the 2nd International Workshop on the Molecular Biology of Bacillus cereus, B. anthracis and B. thuringiensis , Taos, New Mexico, August 11-13,1999, p. 7.

8 Nikitin, D V, Budarina, Z.I, Rodikova, E A, Solonin, A S DNA binding properties of a new hemolysine II regulatory protein from B. cereus Proceedings of the First IUBMB/SASBMB Special Meeting on Biochemical and Molecular Basis of Disease, Cape Town, November 1825, 2001, p. 132.

9. Solonin, S A, Nikitin, D V, Budarina, Z.I, Rodikova, E A., Ogarkov, О, Severinov, К HlyllR is negative transcriptional regulator of hemolysin II expression Abstracts of the 5th Internationa] Conference on Anthrax and 3ri International Workshop on the Molecular Biology of Bacillus cereus, B. anthracis andB. thuringiensis , Nice, March 30 - April 3, 2003, p 58

р-8832

РНБ Руссклй фонд

2006-4 *

16660

Принято к исполнению 06/04/2005 Заказ № 745

Исполнено 07/04/2005 Тираж: 100 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095) 318-40-68 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бударина, Жанна Игоревна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гемолизины как группа бактериальных токсинов 12 1.1.1 .Общие сведения о бактериальных токсинах

1.1.2. Место гемолизинов в классификации токсинов

1.1.3. Гемолизины как факторы патогенности и вирулентности

1.1.4. Эволюционная и адаптационная роль гемолизинов

1.2. Типы бактериальных гемолизинов

1.2.1. Фосфолипазы - цитолизины с ферментативной активностью

1.2.2. Порообразующие гемолизины

1.2.2.1. Гемолизин Е. coli и семейство RTX

1.2.2.2. Гемолизины семейства Proteus/Serratia

1.2.2.3. Р-Складчатые каналобразующие цитолизины.

Семейство SH-токсинов

1.2.2.4. р-Складчатые каналобразующие цитолизины аэролизинового типа: а-Гемолизин S. aureus

1.3. Регуляция экспрессии генов бактериальных гемолизинов

1.3.1. Общие принципы регуляции

1.3.2. Системы, контролирующие гены гемолизинов у Staphylococcus aureus

1.3.3. Генетические механизмы, контролирующие экспрессию гемолизинов у Listeria monocytogenes

1.3.4. Регуляция экспрессии гемолизинов у Clostridiumperfringens

1.4. Гемолизины Bacillus cereus

1.4.1. В. cereus как объект для изучения гемолизинов

1.4.2. Спектр гемолизинов, продуцируемых Bacillus cereus

1.4.2.1. Сф ингомиелиназа и цереолизин АВ

1.4.2.2. Цереолизин (гемолизин I)

1.4.2.3. Гемолизин BL

1.4.2.4. Гемолизин III

1.4.2.5. Гемолизин IV (токсин CytK)

1.4.2.6. Цереолизинподобный гемолизин

1.4.2.7. Гемолизин II

1.4.3. Регуляция продукции гемолизинов у В. cereus

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

II. 1. Материалы

II. 1.1. Штаммы бактерий, фаговые и плазмидные векторы

II. 1.2. Среды и основные буферы

II. 1.3. Материалы и реактивы

II.2. Методы исследования

11.2.1. Выделение тотальной ДНК из микроорганизмов рода Bacillus

11.2.2. Выделение плазмидной ДНК

11.2.3. Выделение одноцепочечной ДНК фага М

11.2.4. Препаративное выделение фрагмента ДНК

11.2.5. Получение компетентных клеток E.coli и их трансформация

11.2.6. Получение компетентных клеток В. subtilis и их трансформация

11.2.7. Отбор рекомбинантных клонов по гемолитическому фенотипу

11.2.8. Тестирование клонов на наличие активности фосфолипазы С

11.2.9. Анализ рекомбинантных клонов

11.2.10. Проведение реакций модификации ДНК

11.2.11. ПЦР-амплификация ДНК

11.2.12. Плазмидные конструкции

11.2.13. Определение и анализ первичной последовательности ДНК

11.2.14. ДНК-ДНК гибридизация

11.2.15. Получение миниклеток и анализ их белков, кодируемых плазмидами

11.2.16. Получение бесклеточных экстрактов

11.2.17. Тестирование гемолитической активности

11.2.18. Тестирование влияния холестерина

11.2.19. Фракционирование клеток

11.2.20. Определение (3-галактозидазной активности

11.2.21. Экспрессия и очистка до гомогенного состояния рекомбинантного белка N6His-HlyIIR.

11.2.22. Электрофорез в ПААГ

11.2.23. Тестирование связывания N6His-HlyIIR с ДНК

11.2.24. «Фут-принтинг»

11.2.25. Реакция удлинения праймера

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

III. 1.Клонирование и идентификация генетической детерминанты гемолизина II 60 III. 1.1.Получение рекомбинантных гемолитических клонов и их фенотипический анализ

III. 1.2.Физическое и делеционное картирование рекомбинантных плазмид 60 III. 1.3. Идентификация гемолизина, кодируемого клонированным фрагментом

HI.1.3.1. Способы идентификации

III. 1.3.2. Гибридизационный анализ

III. 1.3.3. Идентификация с использованием функциональных и биохимических тестов

III. 1.3.4 Гемолизин II и цереолизинподобный гемолизин

111.2. Некоторые свойства гемолизина II, продуцируемого рекомбинантными клетками Е. coli и В. subtilis

111.2.1. Оценка молекулярной массы гемолизина II

111.2.2. Действие гемолизина II на эритроциты различных видов млекопитающих

111.2.3. Продукция гемолизина II рекомбинантными клетками Е. coli и

В. subtilis: локализация, влияние температуры

111.2.4. Температурная инактивация гемолизина II

111.3. Анализ нуклеотидной последовательности гена гемолизина II В. cereus и выведенной аминокислотной последовательности

111.3.1. Локализация гена гемолизина II в пределах клонированного фрагмента ДНК

111.3.2. Анализ первичной структуры гена hly II

111.3.3. Анализ выведенной аминокислотной последовательности гемолизина II

111.3.3.1. Общий заряд белка

111.3.3.2. Анализ предполагаемого сигнального пептида

111.3.3.3. Гомология гемолизина II с а-токсином S. aureus и с другими белками

111.3.3.4. Участие С-концевой области гемолизина II в обеспечении его гемолитической функции

111.4. Распространение гемолизина II среди представителей Bacillus цереусной группы

111.4.1. Тестирование штаммов на присутствие последовательностей ДНК, гомологичных участку, содержащему hlyll

111.4.2. Тестирование гемолитической активности штаммов

III.4.3. Клонирование и идентификация генетической детерминанты гемолизина II В. thuringienssis

III.5. Регулятор экспрессии гена гемолизина II В. cereus

111.5.1. Анализ нуклеотидной последовательности области ДНК, прилежащей к 3'-концу гена hlyll: обнаружение hlyllR

111.5.2. Влияние гена hlyllR на гемолитическую активность, обусловленную экспрессией hlyll

111.5.3. Анализ выведенной аминокислотной последовательности HlyllR

111.5.4. Влияние hlyllR на экспрессию Р-галактозидазы, осуществляемую с промоторной области hlyll

111.5.5. Выделение рекомбинантного белка 6HisHlyIIR

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ген гемолизина II Bacillus cereus: клонирование, регуляция экспрессии, идентификация продукта"

Актуальность работы. Возникновение и эволюция патогенности микроорганизмов является одной из фундаментальных проблем современных микробиологии и медицины. Исследование молекулярных основ этого процесса - ключевой подход к решению данной проблемы. В настоящее время известно, что патогенные бактерии вырабатывают вещества, как непосредственно повреждающие или убивающие клетки и структуры макроорганизма, так и способствующие их проникновению в организм, преодолевая его защитные системы. Эти вещества играют главную роль в развитии заболеваний, вызываемых бактериями (McDonel et al., 1986).

Среди многообразия таких веществ немаловажная роль в патогенезе принадлежит цитолитическим токсинам. Характерными примерами, подтверждающими этот тезис, являются такие цитолизины, как фосфолипаза С Clostridium perfringens - основной фактор, ответственный за развитие газовой гангрены (Stevens et al., 1988), тиол-активируемый токсин Listeria monocytogenes, нарушение продукции которого приводит к потере вирулентности (Cossart et al., 1989), альфа-токсин Staphylococcus aureus, ответственный за целый ряд клинических эффектов при стафилококковых инфекциях (Freer, 1988; Дерябин, 2000).

Не секрет, что патогенные свойства того или иного штамма в значительной мере определяются как спектром его структурных генов, кодирующих факторы патогенности, так и механизмами, обеспечивающими регуляцию этих генов. Отсюда возрастающее внимание медиков и биологов к системам, контролирующим экспрессию генов токсинов. На сегодняшний день описаны сложные регуляторные системы для многих микроорганизмов, например, для С. perfringens (Rood and Lyristis, 1995; Ba-Thein et al., 1996), S. aureus (Heinrichs J.H. et al., 1996; Deora et al., 1997; Chien Y. et al., 1998), L. monocytogenes (Sheehan et al., 1994; Huillet et al.,1999), Vibrio cholerae (DiRita, 1995; Pfau and Taylor, 1998) и ряда других распространенных патогенов.

Интерес к исследованиям цитолитических токсинов не ограничивается лишь медицинской сферой. Изучение этих белков стимулируется и тем, что цитолизины стали ценными инструментами при исследовании клеточной физиологии и функционирования клеточных мембран (Ahnert-Hilger and Weller, 1998; Hucho, 1995), а также являются превосходными модельными объектами для выяснения связи между структурой и функцией белка (Bayley, 1994; Gouaux, 1998).

Таким образом, изучение цитолитических токсинов и их генетических детерминант, включающее в себя клонирование, идентификацию, молекулярный анализ, гетерологичную экспрессию генов цитолизинов, выяснение путей регуляции их экспрессии, а также изучение механизмов действия этих токсинов представляется одним из наиболее перспективных направлений в исследовании молекулярных основ патогенности и вирулентности микроорганизмов.

Важной практической задачей в рамках данной проблемы является удачный выбор объекта исследований. Учитывая тот факт, что большинство бактерий, продуцирующих цитолитические токсины, принадлежат к числу опасных патогенов, удобно использовать в подобных исследованиях микроорганизмы, вырабатывающие цитолизины, но не являющиеся строго патогенными. С этой точки зрения внимание исследователей в течение многих десятилетий привлекает антракоидная группа микроорганизмов рода Bacillus, представители которой широко распространены в природе и имеют ярко выраженные филогенетическое родство и морфологическое и физиолого-биохимическое сходство на фоне широкого диапазона их патогенных свойств. Так, В. mycoides является сапрофитным микроорганизмом, В. thuringiensis - патогенным для насекомых. В. cereus относится к условно-патогенным для теплокровных. В. anthracis печально известен как опасный патоген, вызывающий сибирскую язву. Эти микроорганизмы продуцируют ряд цитолитических белков, рассматриваемых в качестве потенциальных факторов вирулентности. В. cereus, занимая по патогенному статусу промежуточное положение среди представителей данной группы бактерий и продуцируя широкий спектр цитолизинов, может служить прекрасной моделью для изучения этих токсинов.

Еще одной причиной, которая побуждает к активному изучению токсинов, вырабатываемых В. cereus (и его ближайшим родственником В. thuringiensis), является огромная значимость этих микроорганизмов для человека. Сейчас остро встает вопрос экологически чистого производства сельскохозяйственной продукции. При этом важная роль отводится применению микробиологических средств защиты растений, среди которых серьезное место занимают энтомопатогенные бактериальные препараты. Внедрение интенсивных технологий возделывания сельскохозяйственных культур неизбежно влечет расширение применения микробиологических средств защиты растений. Для производства инсектицидных препаратов в настоящее время широко используется В. thuringiensis, приводя к широкомасштабному внесению этого микроорганизма в окружающую среду. Другой важной проблемой является бактериологическое загрязнение производимых промышленностью продуктов питания, лекарственных и косметических препаратов. При этом В. cereus - один из основных бактериальных загрязнителей. В связи с вышеизложенным встает задача определения степени безопасности таких микроорганизмов, как В. cereus и В. thuringiensis, для окружающей среды, животных и человека. В рамках данной задачи изучение отдельных токсинов, продуцируемых этими бактериями, является необходимым звеном.

Хорошо известно, что В. cereus производит ряд внеклеточных токсинов, обладающих гемолитической активностью и рассматриваемых в качестве потенциальных факторов патогенности (Turnbull, 1986; Drobniewski, 1993). На настоящий момент в разной степени описаны цереолизин, сфингомиелиназа, цереолизин АВ, гемолизин BL, цереолизин-подобный гемолизин, гемолизины II, III и CytK. Спектр и свойства гемолитических белков, продуцируемых данным микроорганизмом, изучены далеко не полно. Это обусловлено сложностью получения индивидуальных препаратов данных белков из исходного микроорганизма. В связи с этим, природа одного из них - гемолизина II - до последнего времени оставалась под вопросом. Гемолитическая активность, позднее приписанная ему, была впервые обнаружена в культуральной жидкости одного из штаммов В. cereus еще в 1963 году (Fossum, 1963). Однако до сих пор не существовало данных, свидетельствующих о том, что гемолизин II является продуктом самостоятельного гена, а не произволен от других, уже хорошо описанных гемолитических белков. Активность, приписываемая гемолизину II, считалась обусловленной совместным действием сфингомиелиназы и фосфолипазы С или же она связывалась с проявлением других известных гемолитических факторов В. cereus. Таким образом, вопрос о самом существовании гемолизина II оставался открытым. Для выяснения подобных вопросов весьма эффективным является подход, основанный на клонировании отдельных генов, кодирующих цитолизины, и изучении данных цитолизинов в гетерологичных системах.

Несмотря на то, что гемолитические токсины В. cereus активно изучаются, на сегодняшний день очень мало известно об их генетической регуляции, так же как и о регуляции других факторов патогенности этого микроорганизма. Лишь недавно был обнаружен первый плейотропный регулятор, PlcR, который является активатором генов фосфолипаз, негемолитического и гемолитического энтеротоксинов, а также — целого ряда других генов В. cereus и В. thuringiensis (Lereclus et al., 1996; Agaisse, 1999; Gohar et al., 2003). Учитывая, что вопрос о регуляции генов токсинов неразрывно связан с регуляцией патогенных свойств микроорганизмов, а также ввиду малой изученности данного вопроса для В. cereus, весьма актуальным является поиск и изучение других локусов в геноме этой бактерии, контролирующих экспрессию генов токсинов.

Цели и задачи исследования. Данная работа выполнялась в рамках исследовательского направления, имеющего целью обнаружение и идентификацию генов цитолизинов В.cereus, их структурно-функциональный анализ и изучение функции данных цитолизинов. Особый интерес представляло клонирование из генома В.cereus гемолитических детерминант, не тождественных ранее клонированным. Целью настоящей работы являлось клонирование генетической детерминанты гемолизина II, определение ее первичной структуры, функциональной активности в гетерологичной системе и распространение среди бацилл цереусной группы, описание особенностей регуляции экспрессии гена гемолизина II.

Для достижения указанной цели последовательно ставились следующие задачи:

1. Создать библиотеку генов B.cereus и отобрать гемолитические клоны.

2. Идентифицировать генетическую детерминанту гемолизина II.

3. Определить нуклеотидную последовательность клонированной генетической детерминанты B.cereus и провести ее анализ. На основании анализа выведенной аминокислотной последовательности сделать предварительное заключение о механизме действия гемолизина II.

4. Исследовать особенности активности гемолизина II в гетерологичных системах (E.coli и B.subtilis).

5. Провести скрининг коллекции штаммов бацилл цереусной группы на наличие последовательностей ДНК, гомологичных области, содержащей ген гемолизина II, и на продукцию подобного гемолизина.

6. Определить роль нового гена hlyllR в регуляции экспрессии hlyll и характер (особенности) этой регуляции.

Данная работа выполнена в лаборатории генной систематики и ВНТК генной активности Института биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина РАН.

Научная новизна работы. Результаты, полученные в ходе данных исследований, носят приоритетный характер. Впервые клонирован ген гемолизина II Bacillus cereus. Тем самым положен конец многолетней дискуссии о существовании этого гемолизина и доказано, что он является самостоятельным белком В. cereus, а не произволен от других гемолитических факторов этого микроорганизма. Впервые определена нуклеотидная последовательность гена гемолизина II и получены данные, позволяющие причислить этот белок к группе (3-складчатых олигомерных порообразующих цитолизинов. Впервые показано, что способность В. cereus продуцировать гемолизин II является штаммоспецифичным свойством по причине ограниченного распространения его гена среди штаммов этого вида. Впервые установлено, что многие штаммы В. thuringiensis производят гемолизин, гомологичный гемолизину II В. cereus и сходный с ним по свойствам. Впервые клонирован ген этого гемолизина В. thuringiensis. Обнаружен и клонирован новый регуляторный ген В. cereus и показана его функция как регулятора транскрипции гена гемолизина II.

Практическое значение работы. Полученные результаты вносят вклад в понимание феномена гемолитического фенотипа и молекулярных основ вирулентности В. cereus и близких видов микроорганизмов. Эти данные являются необходимым первоначальным этапом, закладывающим основу для дальнейших исследований гемолизина II: выяснения его участия в патогенезе, изучения его структурно-функциональных особенностей, что позволит в перспективе использовать этот объект при исследовании клеточной физиологии и функционирования мембран клеток. Тот факт, что гемолизин II обнаружен у В. thuringiensis, широко применяемого как биологический инсектицид, заставляет усилить внимание к тщательному анализу и отбору используемых штаммов на предмет их безопасности для человека и животных и заостряет вопрос о правомочности использования данного микроорганизма в качестве инсектицидного препарата. Обнаружение нового регуляторного локуса В. cereus, контролирующего транскрипцию гена гемолизина II, является шагом к выяснению сложных механизмов скоординированной регуляции генов, обеспечивающих вирулентность этого микроорганизма, что в перспективе позволит осуществлять контроль над его патогенными свойствами.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Бударина, Жанна Игоревна

выводы

1. Обнаружен и впервые клонирован ген гемолизина II Bacillus cereus, определена его нуклеотидная последовательность и на основании анализа аминокислотной последовательности, выведенной из первичной структуры его гена, гемолизин II причислен к семейству р-складчатых порообразующих олигомерных цитолизинов.

2. Установлено, что способность продуцировать гемолизин II является штаммоспецифичным свойством В.cereus и В.thuringiensis.

3. Идентифицирован и клонирован новый ген В.cereus - hlyllR. Установлено, что экспрессия гена гемолизина II В. cereus контролируется белковым продуктом hlyllR, который взаимодействует с операторным участком, лежащим перед геном гемолизина

И.

4. Показано, что HlyllR способен выступать как в роли позитивного, так и негативного регулятора экспрессии гена гемолизина II.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бударина, Жанна Игоревна, Пущино

1. Abdel-Hameed A. and Landen R. (1994) Studies on Bacillus thuringiensis strains isolated from Swedish soils: insect toxicity and production of Bacillus cereus-diarrhoeal-type enterotoxin. World J. Microbiol. Biotechnoi, V. 10, P. 406-409.

2. Adler H.I., Fisher W.D., Cohen A., Hardigree A.A. (1967) Miniature Escherichia coli cells deficient in DNA. Proc. Natl Acad. Sci. USA, V. 57, P. 321-326.

3. Agaisse H., Gominet M., Okstad O.A., Kolsto A-B., Lereclus D. (1999) PlcR is a pleiotropic regulator of extracellular virulence factor gene expression in Bacillus thuringiensis. Mol. Microbiol., V. 32, P. 1043-1053.

4. Ahnert-Hilger G. and Weller U. (1998) Alpha-toxin and streptolysin О as tools in cellbiological research. P. 103-110. Cell Biology: A Laboratory Handbook, V. 4, Acad. Press, New York.

5. Akiyama Т., Osawa N. and Kameya T. (1984) Experimental infection of mice with Bacillus thuringiensis. I. Influence of Inoculum size and route of injection. Kitasato Med., V. 14, P. 236-247.

6. Alouf J.E. (2000) Cholesterol-binding cytolytic protein toxins. Int. J. Med. Microbiol., V. 290, P. 351-356 Int. J. Med. Microbiol., V. 290, P. 295-299.

7. Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.// Nucleic Acids Res. 1997.25: 3389-3402.

8. Anagnostopoulos C. and Spizizen J. (1961) J. Bacteriol., V. 81, P. 74110. Arbuthnott J.P., Freer J.H. and Bernheimer A.W. (1967) Physical states ofstaphylococcal a-toxin. J. Bacteriol., V. 94, P. 1170-1177.

9. Ash C, Collins MD. (1992), Comparative analysis of 23S ribosomal RNA gene sequences of Bacillus anthracis and emetic Bacillus cereus determined by PCR-direct sequencing. FEMS Microbiol Lett.',73(1-2), 75-80.

10. Ash C, Farrow JA, Dorsh M, Stackebrandt E, Collins MD. (1991) Comparative analysis of Bacillus anthracis, Bacillus cereus, and related species on the basis of reverse transcriptase sequencing of 16S rRNA. Int.JSyst. Bacteriol. 41,343-346.

11. Awad M.M. and Rood J.I. (2002) Perfringolysin О expression in Clostridium perfringens is independent of the upstreampfoR gene. J. Bacteriol., V. 184, P. 2034-2038.

12. Baida G.E. and Kuzmin N.P. (1996) Mechanism of action of hemolysin III from Bacillus cereus. Biochim Biophys. Acta, V. 1284, P. 122-124.

13. Baida G.E., Sidorov I.A. and Kuzmin N.P. (1997) Hemolysin III from Bacillus cereus. P. 48. Abstracts of the First International Workshop on The Molecular Biology ofB. cereus, B. anthracis andB. thuringiensis, May 23-25, Oslo.

14. Ballard J., Crabtree J., Roe B.A.,Tweeten R.K. (1995) The primary structure of Clostridium septicum alpha-toxin exhibits similarity with that of Aeromonas hydrophyla aerolysin. Infect. Immun., V. 63, P. 340-344.

15. Banu S., Ohtani K., Yaguchiet H., Swe Т., Cole S.T., Hayashi H., Shimizu T. (2000) Identification of novel VirR/VirS-regulated genes in Clostridium perfringens. Mol. Microbiol., V. 35, P. 854-864.

16. Barne K.A., Bown J.A., Busby S.J., Minchin S.D. (1997) Region 2.5 of the Escherichia7 Лcoli RNA polymerase о subunit is responsible for the recognition of the 'extended 10' motif at promoters. EMBOJ., V. 16, P. 4034-4040.

17. Ba-Thein W., Lyristis M., Ohtani K., Nisbet I.T., Hayashi H., Rood J.I., Shimizu T. (1996) The virR/virS locus regulates the transcription of genes encoding extracellular toxin production in Clostridium perfringens. J. Bacteriol., V. 178, P. 2514-2520.

18. Ba-Thein W., Lyristis M., Ohtani K., Nisbet I.T., Hayashi H., Rood J.I., Shimizu T. (1996) The virR/virS locus regulates the transcription of genes encoding extracellular toxin production in Clostridium perfringens. J. Bacteriol., V. 178, P. 2514-2520.

19. Bayley H. (1994) Triggers and switches in a self-assembling pore-forming protein. J. Cell. Biochem., V. 56, P. 177-182.

20. Beecher D.J. and Wong A.C.L. (1994) Improved purification and characterization of hemolysin BL, a hemolytic dermonecrotic vascular permeability factor from Bacillus cereus. Infect. Immun., V. 62, P. 980-986.

21. Beecher D.J. and Wong A.C.L. (1994a) Identification of hemolysin Bl^producing Bacillus cereus isolates by a discontinuous hemolytic pattern in blood agar. Appl. Environ. Microbiol., V. 60, P. 1646-1651.

22. Beecher D.J. and Wong A.C.L. (1997) Tripartite hemolysin BL from Bacillus cereus: hemolytic analysis of component interactions and a model for its characteristic paradoxical zone phenomenon. J. Biol. Chem., V. 272, P. 233-239.

23. Beecher D.J. and Wong A.C.L. (1999) Tripartite hemolysin BL: Experimental and ^ predictive analysis of structure and function. P. 14. Abstracts of the 2nd International

24. Workshop on The Molecular Biology ofB. cereus, B. anthracis and B. thuringiensis, August 11-13, Taos.

25. Beecher D.J., Pulido J.S., Barney N.P., Wong A.C.L. (1995) Extracellular virulence factors in Bacillus cereus endophthalmitis: Methods and implication of involvement of hemolysin BL. Infect. Immun., V. 63, P. 632-639.

26. Beecher D.J., Schoeni J.L. and Wong A.C.L. (1995a) Enterotoxic activity of hemolysin BL from Bacillus cereus. Infect. Immun., V. 63, P. 4423-4428.

27. Benz R., Schmid A., Wagner W., Goebel W. (1989) Pore formation by Escherichia coli hemolysin: evidence for an association-dissociation equilibrium of the pore-forming aggregates. Infect. Immun., V. 57, P. 887-895.

28. Bergmeyer H.U., Grassl M. and Walter H.-E. (1983) Malate dehydrogenase.P. 246-247. ф Methods of Enzymatic Analysis, vol. 2, Bergmeyer H.U. (ed.), Weinheim: Verlag Chemie1. GmbH.

29. Bernadac A., Bolla J.M., Lazdunski C., Inouye M., Pages J.M. (1987) Precise localization of an overproduced periplasmic protein in Escherichia coli: use of double immunogold labelling. Biol.Cell, V. 161, P.141-147.

30. Bernheimer A.W. (1976) Mechanisms in bacterial toxinology, Wiley, New York.

31. Bernheimer A.W. (1988) Assay of hemolytic toxins. Meth. Enzymol., V. 165, P. 213217.

32. Bernheimer A.W. and Grushoff P. (1967,6) Cereolysin: production, purification and partial characterization. J. Gen. Microbiol., V. 46, P. 143-150.

33. Bernheimer A.W. and Grushoff P. (1967a) Extracellular hemolysins of aerobic sporogenic Bacilli. J. Bacteriol., V. 93, P. 1541-1543.

34. Bhakdi S., Bayley H., Valeva A., Walev I., WalkerB., Weller U., Kehoe M., Palmer M., (1996) Staphylococcal alpha-toxin, streptolysin-O, and Escherichia coli hemolysin: prototypes of pore-forming bacterial cytolysins. Arch. Microbiol., V. 165, P. 73-79.

35. Bhakdi S., Mackhan N., Nicaud J.-M., Holland I.B. (1986) Escherichia coli hemolysin may damage target cell membranes by generating transmembrane pores. Infect. Immun., V. 52, P. 63-69.

36. Bhakdi S., Tranum-Jensen J. and Sziegoleit A. (1985) Mechanism of membrane damage by streptolysin-O. Infect. Immun., V. 47, P. 52-60.

37. Bhakdi S., Walev I., Palmer M., Valeva A. (2000) Staphylococcal a-toxin. P. 509-527. Bacterial protein toxins, Aktories K. and Just I. (eds.), Springer, Berlin.

38. Boehm D.F., Welch R.A. and Snyder I.S. (1990) Domains of Escherichia coli hemolysin (HlyA) involved in binding of calcium and erythrocyte membranes. Infect. Immun., V. 58, P. 1959-1964.

39. Bowman M.N., Ottolenghi A.C. and Mengel C.E. (1971) Effects of phospholipase С on human erythrocytes. J. Membr. Biol., V. 4, P. 156-164.

40. Brendel V. and Trifonov E.N. (1984) Computer algorithm for testingpotential prokaryotic terminators. Nucl. Acids Res., V. 12, P. 4411-4427.

41. Brillard J. and Lereclus D. (2004) Comparison of cytotoxin cytK promoters from Bacillus cereus strain ATCC 14579 and from a B. cereus food-poisoning strain. Microbiology, V. 150, P. 2699-2705.

42. Brinton G.S., Topping T.M., Hyndiuk R.A., Aaberg T.M., Reeser F.H., Abrams G.W. (1984) Posttraumatic endophthalmitis. Arch. Ophthalmol., V. 102, P. 547-550.

43. Carlson C.R., Caugant D.A. Kolsto A.-B. (1994) Genotypic diversity among Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains. Appl. Environ. Microbiol., V. 60, P. 1719-1725.

44. Carlson C.R., Johansen Т. and Kolsto A.-B. (1996) The chromosome map of Bacillus thuringiensis subsp. canadensis HD224 is highly similar to that of the Bacillus cereus type strain ATCC 14579. FEMS Microbiol. Lett., V. 141, P. 163-167.

45. Cassidy P. and Harshman S. (1976) Studies on the binding of staphylococcal 125I-labeled a-toxin to rabbit erythrocytes. Biochemistry, V. 15, P. 2348-2355.

46. Cheung J.K. and Rood J.I. (2000) The VirR response regulator from Clostridium perfringens binds independently to two imperfect direct repeats located upstreamof the pfoA promoter. J. Bacteriol., V. 182, P. 57-66.

47. Chien Y., Manna A.C. and Cheung A.L. (1998) SarA level is a determinant of agr activation in Staphylococcus aureus. Mol. Microbiol. V. 30, P. 991-1001.

48. Claus D. and Berkeley R.C.W. (1996) Genus Bacillus. P. 1105-1139. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Sneath P.H.A., Mair N.A., Sharpe M.E. Holt J.G. (eds.), Williams and Wilkins, Baltimore, MD.

49. Clinkenbeard K.D. and Thiessen A.E. (1991) Mechanism of action of Moraxella bovis hemolysin. Infect. Immun., V. 59, P. 1148-1152.

50. Coolbaugh J.C. and Williams R.P. (1978) Production and characterization of two hemolysins of Bacillus cereus. Can. J. Microbiol., V. 24, P. 1289-1295.

51. Cooper L.Z., Madoff M.A. and Weinstein L. (1966) Heat stability and species range of purified staphylococcal a-toxin. J. Bacteriol., V. 91, P. 1686-1692.

52. Cortajarena A.L., Goni F.M., Ostolaza H. (2003) A receptor-binding region in Escherichia coli alpha-hemolysin. J. Biol. Chem. V. 278, P. 19159-19163.

53. Cortajarena A.L., Goni F.M., Ostolaza H. (2001) Glycophorin as a receptor for Escherichia coli alpha-hemolysin in erythrocytes. J. Biol. Chem. V. 276, P. 12513-12519.

54. Cossart P. and Lecuit M. (1998) Interactions of Listeria monocytogenes with mammalian cells during entry and actin-based movement: bacterial factors, cellular ligands and signaling. EMBOJ., V. 17, P. 3797- 3806.

55. Cossart P. and Mengaud J. (1989) Listeria monocytogenes: a model system for the molecular study of intracellular parasitism. Mol. Biol. Med., V. 6, P. 463-474.

56. Cossart P., Vincente M.F., Mengaud J., Baquero F., Perez-Diaz J.C., Berche P. (1989) Listeriolysin О is essential for virulence of Listeria monocytogenes: direct evidence obtained by gene complementation. Infect. Immun., V. 57, P. 3629-3636.

57. Cowell J.L., Grushoff-Kosyk P.S., Bernheimer A.W. (1976) Purification of cereolysin and the electrophoretic separation of the active (reduced) and inactive (oxidized) forms of the purified toxin. Infect. Immun., V. 14, P. 144-154.

58. Crowell K.M. and Lutz F. (1989) Pseudomonas aeruginosa cytotoxin: the influence of sphingomyelin on binding and cation permeability increase in mammalian erythrocytes. Toxicon, V. 27, P. 531-540.

59. Damgaard P.H. (1995) Diarrhoeal enterotoxin production by strains Bacillus thuringiensis isolated from commercial Bacillus thuringiensis-hased insecticides. FEMS Immun. Med. Microbiol., V. 12, P. 245-250.

60. Deora R., Tseng T. and Misra Т.К. (1997) Alternative transcription factor aSB of Staphylococcus aureus: characterization and role in transcription of the global regulatory locus sar. J. Bacteriol. V. 179, P. 6355-6359.

61. DiRita V.J. (1995) Three-component regulatory system controlling virulence in Vibrio cholerae. P. 351-365. Two-component signal transduction, Hoch J and Silhavy T. (ed.), American Society for Microbiology, Washington, D.C.

62. Domann E., Wehland J., Niebur K. (1993) Detection of a prfA-independent promoter responsible for listeriolysin gene expression in mutant Listeria monocytogenes strains lacking the PrfA regulator. Infect. Immun., V. 61, P. 3073-3075.

63. Drobniewski F.A. (1993) Bacillus cereus and related species. Clin. Microbiol. Rev. V. 6, P. 324-338.

64. Dubnau D. and Davidoff-Abelson R. (1971) J. Mol. Biol., V. 56, P. 209

65. Eckhardt T. (1978) A rapid method for the identification of plasmid deoxyribonucleic acid in bacteria. Plasmid, V. 1, P. 584-588.

66. Elek S.D. and Levy E. (1954) The nature of discrepancies between haemolysins in culture filtrates and plate haemolysin patterns of staphylococci. J. Pathol. Bacteriol., V. 68, P. 31-40.

67. Estruch J.J., Carozzi N.B., Desai N., Duck N.B., Warren G.W., Koziel M.G. (1997) Transgenic plants: an emerging approach to pest control. Nat. Biotechnoi, V. 15, P. 137141.

68. Fagerlund A., Ween O., Lund Т., Hardy S.P., Granum P.E. (2004) Genetic and functional analysis of the cytK family of genes in Bacillus cereus. Microbiology, V. 150, P. 2689-2697.

69. Fossum K. (1964) The heat sensitivity of Bacillus cereus hemolysin. Acta Path. Microbiol. Scan., V. 60, P. 523-527.

70. Freer J.H. (1988) Toxins as virulence factors of gram-positive pathogenic bacteria of veterinary importance. P. 264-288. Virulence mechanisms of bacterial pathogens, Roth J. A. (ed.), American Society for Microbiology, Washington, D.C.

71. Freer J.H., Arbuthnott J.P. and Bernheimer A.W. (1968) Interaction of staphylococcal a-toxin with artifical and natural membranes. J. Bacteriol., V. 95, P. 1153-1168.

72. Gaal Т., Ross W., Estrem S.T., Nguyen L.N., Burgess R.R., Gourse R.L. (2001)о

73. Promoter recognition and discrimination by Ea RNA polymerase. Mol. Microbiol., V. 42, P. 939-954.

74. Gallegos M.-T., Schleif R.,Bairoch A., Hofmann K., Ramos J.L, (1997) AraC/XylS £ family of transcriptional regulators. Microbiol. Mol. Biol. Rev., V. 61, P. 393-410.

75. Garvis S., Mein J.M., Ruiz-Albert J., Holden D.W. (2002) Staphylococcus aureus svrA: a gene required for virulence and expressionof the agr locus. Microbiology, V. 148, P. 32353243.

76. Gaviria Rivera A.M., Granum P.E., Priest F.G. (2000) Common occurrence of enterotoxin genes and enterotoxicity in Bacillus thuringiensis. FEMS Microbiol. Lett., V. 190, P. 151-155.

77. Geoffroy C. and Alouf J.E. (1983) Selective purification by thiol-disulfide interchange chromatography of alveolysin, a sulphydryl-activted toxin of Bacillus alvei. J. Biol. Chem., V. 258, P. 9968-9972.

78. Gohar M., Okstad O.A., Gilois N., Sanchis V., Kolsto A.-B., Lereclus D. (2002) Two-dimensional electrophoresis analysis of the extracellular proteome of Bacillus cereus reveals the importance of the PlcR regulon. Proteomics, V. 2, P. 784-791.

79. Gouaux E. (1998) a-Hemolysin from Staphylococcus aureus: An archetype of ^-barrel, ф channel-forming toxins. J. Struct. Biol., V. 121, P. 110-122.

80. Gouaux E., Hobaugh M.R. and Song L. (1997) a-Hemolysin, y-hemolysin and leukocidin.

81. Granum P.E. (1997) Bacillus cereus. P. 327-336. Food Microbiology, Fundamentals and Frontiers, Doyle M.P., Beuchat L.R., Montville T.J. (eds.), ASM Press, Washington, DC.

82. Granum P.E. and Lund T. (1997) Bacillus cereus and its food poisoning toxins. FEMS Microbiol. Lett., V. 157, P. 223-228.

83. Hacker J., Hughes C., Hof. H., Goebel W. (1983) Cloned hemolysin genes from Escherichia coli that cause urinary tract infection determine different levels of toxicity in mice. Infect. Immun., V. 42, P. 57-63.

84. Hager P.W. and Rabinowitz J.C. (1985) Translational specificity in Bacillus subtilis. P. 1-32. The molecular biology of the Bacilli, Dubnau D.A. (ed.), Acad. Press, New York.

85. Hansen B.M. and Hendriksen N.B. (2001). Detection of enterotoxic Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains by PCR analysis. Appl. Environ. Microbiol., V. 67, P. 185-189.

86. Hardy S.P., Lund Т., Granum P.E. (2001) CytK toxin of Bacillus cereus forms pores in • planar lipid bilayers and is cytotoxic to intestinal epithelia. FEMS Microbiol. Lett., V. 197,1. P.47-51.

87. Harvie D.R., Vilchez S., Steggles J.R., Ellar D.J.(2005) Bacillus cereus Fur regulates iron metabolism and is required for full virulence. Microbiology, V. 151, P. 569-577.

88. Heinrichs D.E. and Poole K. (1996) PchR, a regulator of ferripyochelin receptor gene (fptA) expression in Pseudomonas aeruginosa, functions both as an activator and as a repressor. J. Bacterid., V. 178, P. 2586-2592.

89. Heinrichs J.H., Bayer M.G. and Cheung A.L. (1996) Characterization of the sar locus and its interaction with agr in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol., V. 178, P. 418-423.

90. Heinrichs J.H., Beecher D.J., Macmillan J.D., Zilinskas B.A. (1993) Molecular cloning and characterization of the hblA gene encoding the В component of hemolysin BL from Bacillus cereus. J. Bacteriol., V. 175, P. 6760-6765.

91. Hertle R. (2000) Serratia type pore forming toxins. Curr. Protein Pept. Sci., V. 1, P. 7589.

92. Hertle R. (2002) Serratia marcescens hemolysin (ShlA) binds artificial membranes and forms pores in a receptor-independent manner. J. Membr. Biol. V. 189, P. 1-14.

93. Heuck A.P., Tweten R.K., Johnson A.E. (2003) Assembly and topography of the prepore complex in cholesterol-dependent cytolysins. J. Biol. Chem., V. 27.

94. Hildebrand A., Pohl M. and Bhakdi S. (1991) Staphylococcus aureus a-toxin. Dual mechanism of binding to target cells. J. Biol. Chem., V. 266,17195-17200.

95. Honda Т., Shiba A., Seo S., Yamamoto J., Matsuyama J., and Miwatani T. (1991) Identity of hemolysins produced by Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus. FEMS Microbiol. Lett., V. 79, P. 205-210.

96. Hotze E.M., Heuck A.P., Czajkowsky D.M., Shao Z., Johnson A.E., Tweten R.K. (2002) Monomer-monomer interactions drive the prepore to pore conversion of a p-barrel -forming cholesterol-dependent cytolysin. J. Biol. Chem., V. 277, P. 11597-11605.

97. Hucho F. (1995) Toxins as tools in neurochemistry. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., V. 34, P. 39-50.

98. Huillet E., Larpin S., Pardon P., Berche P. (1999) Identification of a new locus in Listeria monocytogenes involved in cellobiose-dependent repression of hly expression. FEMS Microbiol. Lett., V. 174, P. 265-272.

99. Ikezava H., Mori M. and Taguchi R. (1980) Studies on sphingomyelinase of Bacillus cereus: Hydrolytic and hemolytic actions on erythrocyte membranes. Arch. Biochem. Biophys., V. 199, P. 572-577.

100. Ikezawa H., Matsushita M., Tomita M., Taguchi R. (1986) Effects of metal ions on sphingomyelinase activity of Bacillus cereus. Arch. Biochem. Biophys., V. 249, P. 588-595.

101. Jackson S.G., Goodbrand R.B., Ahmed R., Kasatiya S. (1995) Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis isolated in a gastroenteritis outbreak investigation. Lett. Appl. Microbiol., V. 21, P. 103-105.

102. Johnson C.E. and Bonventre P.F. (1967) Lethal toxin of Bacillus cereus. I.Relationships and nature of toxin, hemolysin, and phospholipase. J. Bacteriol., V. 94, P. 306-316.

103. Kehoe M.A., Miller L., Walker J.A., Boulnois GJ. (1987) Nucleotide sequence of the streptolysin О (SLO) gene: structural homologies between SLO and other membrane-damaging, thiol-activated toxins. Infect. Immun., V. 55, P. 3228-3232.

104. Knapp S., Hacker J., Jarchau Т., Goebel W. (1986) Large, unstable inserts in the chromosome affect virulence properties of uropathogenic Escherichia coli 06 strain 536. J. Bacteriol., V. 168, P. 22-30.

105. Kramer J.M., Turnbull P.C.B., Jorgensen K., Parry J., Gilbert R.J. (1978) Separation of exponential growth exotoxins of Bacillus cereus and their preliminary characterization. J. Appl. Bact. V. 45, P. 19-23.

106. Kreuzer K., Pratt C. and Torriani A. (1975) Genetic analysis of regulatory mutants of alkaline phosphatase of E. coli. Genetics, V. 81, P. 459-468.

107. Krug E.L. and Kent C. (1984) Phospholipase С from Clostridium perfringens: preparation and characterisation of homogenous enzyme. Arch. Biochem. Biophys., V. 231, P. 400-410.

108. Lacy D.B. and Stevens R.C. (1998) Unraveling the structure and modes of action of bacterial toxins. Curr. Op. Struct. Biol., V. 8, P. 778-784.

109. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, V. 227, P. 680-685.

110. Lazzaroni J.C., Atlan D., Portalier R.C. (1985) J. Bacteriol., V. 164, P. 1376-1380.

111. Lereclus D., Agaisse H., Grandvalet C., Salamitou S., Gominet M. (2000) Regulation of toxin and virulence gene transcription in Bacillus thuringiensis. Int. J. Med. Microbiol., V. 290, P. 295-299.

112. Liu Y.-B., Tabashnik B.E., Moar W.J., Smith R.A. (1998) Synergism between Bacillus thuringiensis spores and toxins against resistant and susceptible diamondback moths (Plutella xylostella). Appl. Environ. Microbiol., V. 64, P. 1385-1389.

113. Ludwig A., Schmid A., Benz R. and Goebel W. (1991) Mutations affecting pore formation of hemolysin from Escherichia coli. Mol. Gen. Genet., V. 226, P. 198-208.

114. Lund Т., De Buyser M.-L., Granum P.E. (2000) A new cytotoxin from Bacillus cereus that may cause necrotic enteritis. Molecular Microbiology, V. 38, P. 254-261.

115. Lyristis M., Bryant A.E., Sloan J., Awad M.M., Nisbet I.T., Stevens D.L., Rood J.I. (1994) Identification and molecular analysis of a locus that regulates extracellular toxin production in Clostridium perfringens. Mol. Microbiol., V. 12, P. 761-777.

116. Makrides S.C. (1996) Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol. Rev., V. 60, P. 512-538.

117. Marmur J. (1961) A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms. J. Mol Biol V. 3, P. 208-218.

118. McDonel J.L. (1986) Toxins of Clostridium perfringens types А, В, C, D and E. P. 477517. Pharmacology of Bacterial Toxins, Dorner F. and Drews J. (eds.), Pergamon Press, Oxford.

119. McDonel J.L., Dorner F. and Drews J. (1986) The role of toxins in bacterial pathogenesis. P. 1-4. Pharmacology of Bacterial Toxins, Dorner F. and Drews J. (eds.), Pergamon Press, Oxford.

120. Menestrina G. (1988) Escherichia coli hemolysin permeabilizes small unilamellar vesicles loaded with calcein by a single-hit mechanism. FEBSLett., V. 232, P. 217-220.

121. Menestrina G., Dalla Serra M., Prevost G. (2001) Mode of action of p-barrel pore-forming toxins of the staphylococcal a-hemolysin family. Toxicon, V. 39, P. 1661-1672.

122. Mengaud J., Dramsi S., Gouin E. (1991) Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene which is autoregulated. Mol Microbiol, V. 4, P. 2273-2283.

123. Menzies B.E. and Kernodle D.S. (1994) Site directed mutagenesis of the alpha-toxin gene of Staphylococcus aureus: Role ofhistidines in toxin activity in vitro and in a murine model. Infect. Immun., V. 62, P. 1843-1847.

124. Meredith F.T., Fowler V.G., Gautier M., Corey G.R., Reller L.B. (1997) Bacillus cereus necrotizing cellulitis mimicking clostridial myonecrosis: Case report and review of the literature. Scan. J. Infect. Dis., V. 29, P. 528-529.

125. Mezes P.S.F. and Lampen J.O. (1985) Secretion of proteins by Bacilli. P. 151-183. The molecular biology of the Bacilli, Dubnau D.A. (ed.), Acad. Press, New York

126. Miles G., Bayley H., Cheley S. (2002) Properties of Bacillus cereus hemolysin II: a heptameric transmembrane pore. Protein Sci., V. 11, P. 1813-1824.

127. Miles G., Movileanu L., Bayley H. (2002) Subunit composition of a bicomponent toxin: Staphylococcal leukocidin forms an octameric transmembrane pore. Protein Sci., V. 11, P. 894-902.

128. Miller J.F., Mekalanos J.J., Falkow S. (1989) Coordinate regulation and sensory transduction in the control of bacterial virulence. Science, V. 243, P. 916-922.

129. Miller J.H. (1972) Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

130. Mitsui К., Mitsui N. and Hase J. (1973) Clostridium perfringens exotoxins. I. Purification and properties of the a-toxin. Jpn. J. Exp. Med., V. 43, P. 65-80.

131. Miwatani Т., Takeda Y., Sakurai J., Yoshihara A., Taga S. (1972) Effect of heat ^ (Arrenius effect) on crude hemolysin of Vibrio parahemolyticus. Infect. Immun., V. 6, P.131.133.

132. Mollby R. (1978) Bacterial phospholipases. P. 367-424. Bacterial toxins and cell membranes, Jeljaszewicz J. and Wadstrom T. (eds.), Academic Press Ltd., London.

133. Morgan P.J., Hyman S.C., Rowe A.J., Mitchell T.J., Andrew P.W., Saibil H.R. (1995) Subunit organization and symmetry of pore-forming, oligomeric pneumolysin. FEBS Lett., V. 371, P. 77-80.

134. Nikolaev I., Epishin S., Zakharova E., Kotenko S., Vinetskii I. (1992) Molecular cloning of the gene for secreted beta-galactosidase of the filamentous fungus Penicillium canescens. Molecular Biology, V. 26, P. 869-875.

135. Osawa N., Akiyama Т., Sasahara Т., Kameya T. (1984) Experimental infection of mice with Bacillus thuringiensis. Further studies of potential pathogenicity of B. thuringiensis in warm-blooded animals. Kitasato Med., V. 14, P. 320-329.

136. Pages J.M., Anba J., Lazdunski C. (1987) J. Bacteriol., V.169, P. 1386-1390.

137. Palmer K.L., Goldman W.E. and Munson Jr.R.S. (1996) An isogenidc haemolysin-deficient mutant of Haemophilus ducreyi lacks the ability to produce cytopathic effects on human foreskin fibroblasts. Mol. Microbiol., V. 21, P. 13-19.

138. Panbangred W., Kondo Т., Negoro S., Shinmyo A., Okada H. (1983) Mol. Gen. Genet., V. 192, P.335-341.

139. Parker D.A. and Goepfert J.M. (1978) Enhancement of synthesis of Bacillus cereus enterotoxin using a sac-culture technique. J. Fd. Protect., V. 41, P. 116-117.

140. Parker M.W., van der Goot F.G. and Buckley J.T. (1996) Aerolysin the ins and outs of a model channel-forming toxin. Mol. Microbiol., V. 19, P. 205-212.

141. Paton J.C., Berry A.M., Lock R.A., Hansman D., Manning P.A. (1986) Cloning and expression in Escherichia coli of the Streptococcus pneumoniae gene encoding pneumolysin. Infect. Immun., V. 54, P. 50-55.

142. Pfau J.D. and Taylor R.K. (1998) Mutation in /ojcR and toxS that separate transcriptional activation from DNA binding at the cholera toxin gene promoter. J. Bacteriol. V. 180, P. 4724-4733.

143. Pflugfelder S.C. and Flynn H.W. (1992) Infectious endophthalmitis. Infect. Dis. Clin. N. Am.,V. 6, P. 859-873.

144. Poole K. and Braun V. (1988) Iron regulation of Serratia marcescens hemolysin gene expression. Infect. Immun., V. 56, P. 2967-2971.

145. Portnoy D.A., Jacks P.S. and Hinrichs D.J. (1988) Role of hemolysin for the intracellular growth of Listeria monocytogenes. J. Exp. Med., V. 167, P. 1459-1471.

146. Ptashne M., Backman K., Humayun M.Z., Jeffrey A., Maurer R., Meyer B.,Sauer R.T. (1976) Autoregulation and function of a repressor in bacteriophage "k. Science, V. 194, P. 156-161.

147. Pugh G.W. and Hughes D.E. (1968) Experimental bovine infectious keratoconjunctivitis caused by sunlamp irradiation and Moraxella bovis infections: correlation with hemolytic ability and pathogenecity. Am. J. Vet. Res., V. 29, P. 835-839.

148. Read T.D., Salzberg S.L., Pop M. & 10 other authors (2002) Comparative genome sequencing for discovery of novel polymorphisms in Bacillus anthracis. Science, V. 296, P. 2028-2033.

149. Renzoni A, Klarsfeld A., Dramsi S., Cossart P. (1997) Evidence that PrfA, the pleiotropic activator of virulence genes in Listeria monocytogenes, can be present but inactive. Infect. Immun., V. 65, P. 1515-1518.

150. Rood J.I. (1998) Virulence genes of Clostridium perfringens. Annu.Rev. Microbiol., V. 52, P. 333-360.

151. Rood J.I. and Lyristis M. (1995) Regulation of extracellular toxin production in Clostridium perfringens. Trends in Microbiol., V. 3, P. 192-196.

152. Rosenberg M., Court, D. (1979) Regulatory sequences involved in the promotion and termination of DNA transcription. Ann. Rev. Genet., V. 13, P. 319-353.

153. Ryan P.A., Macmillan J.D. and Zilinskas B.A. (1997) Molecular cloning and characterization of the genes encoding the LI and L2 components of hemolysin BL from Bacillus cereus. J. Bacteriol., V. 179, P. 2551-2556.

154. Said-Salim В., Dunman P.M., McAleese F.M., Macapagal D., Murphy E., McNamara P.J., Arvidson S., Foster T.J., Projan S.J., Kreiswirth B.N. (2003) Global regulation of Staphylococcus aureus genes by Rot. J. Bacteriol., V. 185, P. 610-619.

155. Sambrook, J., Fritsch, E. and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, New York.

156. Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. PNAS, V. 74, P. 5463-5467.

157. Sato N., Kurotaki H., Watanabe Т., Mikami Т., Matsumoto T. (1998) Use of hemoglobin as an iron source by Bacillus cereus. Biol. Pharm. Bull, V. 21, P. 311-314.

158. Schlebel E. and Braun V. (1989) Integration of the Serratia marcescens haemolysin into human erythrocyte membranes. Mol. Microbiol., V. 3, P.445-453.

159. Schnepf E., Crickmore N., Van Rie J., Lereclus D., Baum J., Feitenson J., Zeigler D.R., Dean D.H. (1998) Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal protein. Microbiol. Mol. Biol. Rev., V. 62, P. 775-806.

160. Schoeni J.L. and Wong A.C. (2005) Bacillus cereus food poisoning and its toxins. J. Food Prot.,V. 68, P. 636-648.

161. Scott D.E. and Silhavy T.J. (1982) Molecular components of the signal sequence that function in the initiation of protein export. J. Cell Biol., V. 95, P. 689-696.

162. Sekiya K., Satoh R., Danbara H., Futaesaku Y. (1993) A ring-shaped structure with a crown formed by streptolysin О on the erythrocyte membrane. J. Bacteriol., V. 157, P. 5953-5961.

163. Sekizawa J. and Fukui S. (1973) Isolation, solubilization and reaggregation of outer membrane of Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta, V. 307, P. 104-117.

164. Shannon J.G., Ross C.L., Koehler T.M., Rest R.F. (2003) Characterization of anthrolysin O, the Bacillus anthracis cholesterol-dependent cytolysin. . Infect. Immun., V. 71, P. 31833189.

165. Shaw G.-C. and Fulco AJ. (1992) Barbiturate-mediated regulation of expression of the cytochrome Р450вм-з gene of Bacillus megaterium by BM3R1 protein. J. Biol. Chem. V. 267, P. 5515-5526.

166. SheehanB., Klarsfeld A., Msadek Т., Cossart P. (1995) Differential activation of virulence gene expression by PrfA, the Listeria monocytogenes virulence regulator. J. Bacteriol., V. 177, P. 6469-6476.

167. Shewen P.E. and Wilkie B.N. (1982) Cytotoxin of Pasteurella haemolytica acting on bovine leukocytes. Infect. Immun., V. 35, P. 91-94.

168. Shimada Y., Maruya M., Iwashita S., Ohno-Iwashita Y. (2002) The C-terminal domain of perfringolysin О is an essential cholesterol-binding unit targeting to cholesterol-rich microdomains. Eur. J. Biochem., V. 269, P. 6195-6203.

169. Shinagawa K., Ichikawa K., Matsusaka N., Sugii S. (1991) Purification and some properties of & Bacillus cereus mouse lethal toxin. J. Vet. Med. Sci., V. 53, P. 469-474.

170. Simonen M. and Palva I. (1993) Protein secretion in Bacillus species. Microbiol. Rev., V. 57, P. 109-137.

171. Slamti L. and Lereclus D. (2002) A cell-cell signaling peptide activates the PlcR virulence regulon in bacteria of the Bacillus cereus group. EMBOJ., V. 21, P. 4550-4559.

172. Slamti L. and Lereclus D. (2005) Specificity and polymorphism of the PlcR-PapR quorum-sensing system in the Bacillus cereus group. J. Bacteriol., V. 187, P.1182-1187.

173. Smith NR, Gordon RE, and Clark FE. (1952) In Aerobic Spore-forming Bacteria, 56-67. Washington, DC: US Department of Agriculture.

174. Song L., Hobaugh M.R., Shustak C., Cheley S., Bayley H., Gouaux J.E. (1996) Structure of staphylococcal a-hemolysin, a heptameric transmembrane pore. Science, V. 274, P. 18591866.

175. Souckova A. and Soucek A. (1972) Inhibition of the hemolytic action of a and (5 lysins of Staphylococcus pyogenes by Corynebacterium hemolyticum, C. ovis and C. ulcerans. Toxicon, V. 10, P. 501-509.

176. Steinthorsdottir V., Halldorsson H., Andresson O.S. (2000) Clostridium perfringens beta-toxin forms multimeric transmembrane pores in human endothelian cells. Microb. Pathog., V. 28, P. 45-50.

177. Steitz J.A. (1979) Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA. P. 349399. Biological regulation and development. V. 1. Gene Expression, Goldenberger R.F. (ed.), Plenum Press, New York.

178. Stevens D.L., Troyer B.E., Merrick D.T., Mitten J.E., Olson R.D. (1988) Lethal effects and cardiovascular effects of purified a and 0 toxins. J. Infect. Dis., V. 157, P. 272-279.

179. Stoebner J.A. and Payne S.M. (1988) Iron-regulated hemolysin production and utilization of heme and hemoglobin by Vibrio cholerae. Infect. Immun., V. 56, P. 28912895.

180. Stoker N.G., Pratt J.M. and Holland I.B. (1984) The minicell system. P. 164-171. Transcription and translation. A practical approach, Hames B.D. and Higgins S,J. (eds), IRL Press, Oxford.

181. Sugahara Т., Takahashi Т., Yamaya S., Ohsaka A. (1977) Vascular permeability increase by a-toxin (phospholipase C) of Clostridium perfringens. Toxicon, V. 15, P. 81-87.

182. Sugavara N., Tomita T. and Kamio Y. (1997) Assembly of Staphylococcus aureus y-hemolysin into pore-forming ring-shaped complex on the surfase of human erythrocytes. FEBSLett., V. 410, P. 333-337.

183. Takahashi Т., Sugahara T. and Ohsaka A. (1981) Phospholipase С from Clostridium perfringens. Methods Enzymol., V. 71., P. 710-725.

184. Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins DG The CLUSTALX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools.// Nucleic Acids Res. 1997.15:4876-4882.

185. Thompson N.E., Ketterhagen M.J., Bergdoll M.S., Schantz E.J. (1984) Isolation and some properties of an enterotoxin produced by Bacillus cereus. Infect. Immun., V. 43, P. 887-894.

186. Titball R.W. (1993) Bacterial phospholipases C. Microbiol. Rev., V. 57, P. 347-366.

187. Tobkes N., Wallace B.A. and Bayley H. (1985) Secondary structure and assembly mechanism of an oligomeric channel protein. Biochemistry, V. 24, P. 1915-1920.

188. Tobkes N., Wallace B.A. and Bayley H. (1985) Secondary structure and assembly mechanism of an oligomeric channel protein. Biochemistry, V. 24, P. 1915-1920.

189. Tomita M., Taguchi I.R., Ikezava H. (1991) Sphingomyelinase of Bacillus cereus as a bacterial hemolysin. J. Toxicol.-Toxin Rev., V. 10, P. 169-207.

190. Tomita Т. and Kamio Y. (1997) Molecular biology of the pore-forming cytolysins from Staphylococcus aureus, a- and "/-hemolysins and leukocidin. Biosci. Biotech. Biochem., V. 61, P. 565-572.

191. Trees D.L. and Morse S.A. (1995) Chancroid and Haemophilus ducreyi: an update. Clin. Microbiol. Rev., V. 8, P. 357-375.

192. Turnbull P.C. and Kramer J.M. (1991) Bacillus. P. 296-303. Manual of clinical microbiology, 5th ed., Balows A., Hausler W.J., Herrmann K.L., Isenberg H.D., Shadomy H.J. (eds.), American Society for Microbiology, Washington, D.C.

193. Turnbull P.C., Kramer J.M., Jorgensen K., Gilbert R.J., Melling J. (1979) Properties and production characteristics of vomiting, diarrheal, and necrotizing toxins of Bacillus cereus. Amer. J. Clin. Nutr., V. 32, P. 219-228.

194. Turnbull P.C.B. (1986) Bacillus cereus toxins. P. 397-448. Pharmacology of Bacterial Toxins, Dorner F. and Drews J., (eds.), Pergamon Press, Oxford.

195. Tweten R.K. (1988) Nucleotide sequence of the gene for perfringolysin О (theta-toxin) from Clostridium perfringens: significant homology with the genes for streptolysin О and pneumolysin. Infect. Immun., V. 56, P. 3235-3240.

196. Unger В., Klock G., Hillen W. (1984) Nucleotide sequence of the repressor gene of the RA1 tetracycline resistance determinant : structural and functional comparison with three related Tet repressors. Nucl. Acids Res., V. 12., P. 7693-7703.

197. Valeva A., Weisser A., Walker В., Kehoe M., Bayley H., Bhakdi S., Palmer M. (1996) Molecular architecture of a toxin pore: A 15-residue sequence lines the transmembrane channel of staphylococcal a-toxin. EMBO J., V. 15, P. 1857-1864.

198. Vazquez-Boland J.A., Kocks C., Dramsi S. (1992) Nucleotide sequence of the lecithinase operon of Listeria monocytogenes and possible role of lecithinase in cell-to-cell spread. Infect. Immun., V. 60, P. 219-230.

199. Waite M. (1987) The phospholipases.Handbook of lipid reseach, V. 5, Hanahan D.J. (ed.), Plenum Press, New York, London.

200. Weiss M.S. and Schulz G.E. (1992) Structure of porin refined at 1.8 A resolution. J. Mol. Biol., V. 227, P. 493-509.

201. Welch R.A. (1991) Pore-forming cytolysins of Gram-negative bacteria. Mol. Microbiol., V. 5, P. 521-528.

202. Wimley W.C. and White S.H. (1996) Experimentally determined hydrophobicity scale for proteins at membrane interfaces. Nat. Struct. Biol., V. 3, P. 842-848.

203. Wissmann A., Baumeister R., Muller G., Hecht В., Pfleiderer K., Hillen W. (1991) Amino acids determining operator binding specificity in the спираль-поворот-спираль motif of TnlO Tet repressor. EMBOJ., V. 10, P. 4145-4152.

204. Yanish-Perron C., Viera J. and Messing J. (1985) Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13 mpl8 and pUC19 vectors. Gene, V. 33, P. 103-119.

205. Yuan Z., Hansen B.M., Andrup L., Eilenberg J. (2002) Detection of enterotoxin genes in mosquito-larvicidal Bacillus species. Curr. Microbiol., V. 45, P. 221-225.

206. Zabeau M. and Stanley K.K. (1982) Enhanced expression of cro-(3-galactosidase fusion proteins under the control of the PR promoter of bacteriophage X. EMBO J., V. 1, P. 12171224.

207. Бицаев А.Р. и Езепчук Ю.В. (1987) Молекулярная природа патогенного действия, вызываемого Bacillus cereus. Мол. Генет. Микробиол. Вирусол., N 7, С. 18-23.

208. Гавриленко И.В., Байда Г.Е., Карпов А.В., Кузьмин Н.П. (1993) Нуклеотидная последовательность генов фосфолипазы С и сфингомиелиназы Bacillus cereus ВКМ-В164. Биоорган, химия, Т. 19, С. 133-138.

209. Гловер Д. (1988) Клонирование ДНК. Методы. Мир, Москва, 538 с. (перевод с английского).

210. Дерябин Д. Г. (2000) Стафилококки: Экология и патогенность. Екатеринбург: УрО РАН, 240 с.

211. Ермолаева С. А. (2001) Генетические механизмы вирулентности Listeria monocytogenes. Генетика, Т. 37, С. 286-293.

212. Завильгельский Г.Б. и Манухов И.В. (2001) "Quorum sensing", или как бактерии разговаривают друг с другом. Молекулярная биология, Т. 35, С. 268-277.

213. Зайцев Е.Н., Зайцева Е.М., Бакланова И.В., Горелов В.Н., Кузьмин Н.П., Крюков

214. B.М., Ланцов В.А. (1986) Клонирование и секвенирование гена гесА из штамма Pseudomonas aeruginosa. Генетика, Т. 22, С. 2721-2727.

215. Иванов С.В., Потапов В.А. и Калачиков С.М. (1990) Блот-гибридизация ДНК на капрновых мембранах. С. 35-38. Методы молекулярной генетики и генной инженерии, Мазин А.В., Кузнеделов К.Д., Краев А.С., Холодилов Н.Г. и др., Новосибирск: Наука.

216. Мазин А.В., Кузнеделов К.Д., Краев А.С., Холодилов Н.Г. и др.(1990) Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Наука, Новосибирск, 248 с.

217. Михалева Н.И., Золов С.Н., Сузина Н.Е., Мелкозернов А.Н., Несмеянова М.А. (1995) Проницаемость внешней мембраны Escherichia coli для ионов этидия и периплазменной щелочной фосфатазы при ее повышенном синтезе. Биохимия, Т. 60,1. C. 1161-1170.

218. Ратнер Е.Н., Ушаков В.М. и Фихте Б.А. (1972) Оборудование для дезинтеграции микроорганизмов посредством экструзии. С. 240-248. Дезинтнграция микроорганизмов. Материалы всесоюзной конференции, Фихте Б.А. (ред.), Пущино.

219. Соловьев В.В. (1988) Генетические сигналы. I. Структура и функции регуляторных последовательностей в геномах прокариот. ИЦиГ СО АН СССР, Новосибирск, 80 с.

220. Сомов Г.П., Варвашевич Т.Н., Тимченко Н.Ф. (1991) Психрофильность патогенных бактерий. Новосибирск: Наука, 204 с.

221. Цой Т.В., Чувильская Р.А., Атакишиева Я.Ю., Джавахишвили Ц.Д., Акименко В.К., Воронин A.M. (1987) Clostridium thermocellum как новый объект генетических исследований. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, Т. 11, С 18-23.

222. Юдина Т.Г. и Бурцева Л.И. (1997) Действие 6-эндотоксинов четырех подвидов Bacillus thuringiensis на различных прокариот. Микробиология, Т. 66, С. 25-31.1. Благодарности

223. Автор благодарна своим научным руководителям к.б.н. Солонину Александру Сергеевичу и к.б.н. Кузьмину Николаю Петровичу за предоставление темы и возможности выполнения данной диссертационной работы.

224. Автор выражает признательность Ульяновой Любови Александровне за квалифицированную и безотказную лаборантскую помощь при приоведении экспериментов, а также за теплое дружеское участие.

225. Автор бесконечно благодарна Москаленко Анатолию Андреевичу и Фокиной Виктории Валерьевне за неоценимую помощь в подготовке презентации и в оформлении диссертации.

226. Самое главное "Спасибо" моей маме Будариной Людмиле Александровне - за все-за все.

Информация о работе

Бударина, Жанна Игоревна
кандидата биологических наук
Пущино, 2005
ВАК 03.00.15

Диссертация

Ген гемолизина II Bacillus cereus: клонирование, регуляция экспрессии, идентификация продукта - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы