Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Галактозидаза микромицета Penicillium canescens F-436. Препаративное получение и некоторые физико-химические свойства

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Галактозидаза микромицета Penicillium canescens F-436. Препаративное получение и некоторые физико-химические свойства"

На правах рукописи

ЧЕРЕМУШКИНА Ирина В?"-""-""™"»

-ГАЛЛКТОЗИДАЗА МИКРОМИЦЕТА РШСИХШМ САКЕБСЕНБ Р-436 . ПРЕПАРАТИВНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ И НЕКОТОРЫЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

Специальность 03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Воронеж 1998

Работа выполнена на кафедре биохимии и микробиологии Воронежской государственной технологической академии (ВГТА)

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор

Жеребцов H.A.

Научный консультант - кандидат технических наук, доцент

Корнеева О.С.

Официальные оппоненты:- доктор биологических наук, профессор

Ершова А.Н.

кандидат технических наук, доцент Дерканосова Н.М. Ведущая организация - АООТ «Воронежхлеб»

Защита состоится « 1998 года в часов на заседай»

диссертационного Совета Д 063.90.01 при Воронежской государственно технологической академии по адресу: 394017, г. Воронеж, проспекг Революции, 19. С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ВГТА

Автореферат разослан « hL&tV&j^tfL 1998 г. Ученый секретарь

диссертационного Совета, _

доктор технических наук, профессор B.C.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Ферментные препараты широко используются в раз-чных отраслях промышленности. Они уникальны по своей структуре и функциям, использование позволяет получить нелепые продукты высокого качества и с льшим выходом.

В исследовании ферментов наиболее актуальными являются вопросы их бно-нтеза; изучения физико-химических свойств; механизма катализа; изыскание пу-й их рационального использования в технологии пищевых продуктов. Среди гид-литических ферментов особое внимание заслуживает р - галактозидаза.

р - галактозидаза (1С.Ф. 3.2.1.23) распространена в животном и растительном гре, но особенно активно ее синтезируют различные микроорганизмы. Она осуще-вляет гидролиз Р - 1,4 - тликозидной связи лактозы. Образовавшиеся гидролизаты [еют широкую перспективу для применения в производстве хлебобулочных изде-й.

Биотехнология ферментного препарата связана с подбором активных проду-нтов р - галактозидазы. В решении данного вопроса перспективными являются 1кромицеты. Они обладают способностью к интенсивному биосинтезу внеклеточ-й р - галактозидазы.

Настоящая работа выполнялась в соответствии с тематикой научных исследо-1нн кафедры биохимии и микробиологии Воронежской государственной техноло-ческой академии по проблеме «Изыскания оптимальных условий микробного нтеза ферментов и исследование из физико-химических свойств». Данная пробле-включена в координационный план РАН по программе «Микробиологический нтез и научные основы микробиологического получения практически пенных ве-:ств».

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось выделение высокоспенн-[чпого продуцента р - галактозидазы, получение активного препарата для гидро-за лактозосодержащего сырья, исследование его некоторых физико-химических эйств и механизма катализа.

Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следугоши: основных задач:

- отбор активного продуцента р - галактозидазы, исследование условий » биосинтеза и рационального режима культивирования продуцента:

- разработка эффективного метода выделения и очистки р - галактозидазы и культуральной жидкости при глубинном культивировании продуцента;

- исследование некоторых физико-химических свойств фермента;

- идентификация функциональных групп фермента и исследование механиз

• ма их каталитического действия на лактозу;

- сопоставление режимов ферментативного и кислотного гидролиза лактозы:

- использование препарата Р - галактозидазы в производстве некоторых гги шевмх продуктов.

Научная новизна. Отобран микромицет Pénicillium canescetis F-436, осуществ ляющий активный биосинтез р - галактозидазы. Подобраны режимы биосинтеза, оп тнмизирован состав питательной среды для глубинного культивирования микроми цета. Разработан способ получения препарата р - галактозидазы и предложена схем; .его очистки. Найдены оптимальные рН и температура действия фермента. Исследо ван процесс термической и кислотной инактивации р - галактозидазы. На основ« экспериментальных данных проведено сопоставление режимов кислотного и фер мента гшшого гидролиза лактозы. Показана целесообразность применения фермент ного препарата в производстве некоторых хлебобулочных изделий.

Практическая значимость работыi Штамм P.canescens F-436 рекомендуете? для ферментной промышленности в качестве продуцента р - галактозидазы. Препарат р - галактозидазы был апробирован при производстве хлебобулочных изделий i АО «Псковский хлебокомбинат».

Апробация работы. Основные результаты по теме диссертации докладывались на снутрпвузовских, межрегиональных и международных конференциях. Ош

были представлены на Межрегиональной конференции «Пищевая промышленное™

о

2()0!Ь, (г. Казань, 1996), на Международной конференции «Проблемы пишевой тех-

нологии и техники» (Могилев, 1997), на Международных » внутривузовскич кип ференциях ВГТА за 1996 - 1998 гг.

Публикации. Основные результаты диссертационном работы изложены r> 11 губликаииях.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 180 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов ^следования, результатов и их обсуждений, заключения, выводов, списка литера-уры из 189 наименований и приложений. Иллюстрационный материал включает 37 1исунков, 24 таблицы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты исследований. При выборе продуцента Р - галактозидазы использо-али культуры микромицетов родов Aspergillus, Pénicillium и других, полученных из (сероссийской коллекции микроорганизмов.

Кулътинирапаиис продуцента проводили глубинным методом в колбах 750 см\ одержащих 100 см3 питательной среды, на лабораторной качалке с частотой Бра-тения 4 с'1 (уровень аэрации 1,4 Ог/дм3 ч) в течении 96 ч при 28 - 30 °С.

При исследовании влияния источников углерода и азота на биосинтез - галактозидазы последние вносили в таких массовых долях, чтобы количество уг-ерода и азота во всех вариантах было одинаково (соответственно 0,6 и 0,033 %).

Культивирование проводили с учетом подобранных значений начального рН реды, температуры и продолжительности процесса биосинтеза Р - галактозидазы ля отобранного продуцента.

Определение активности фермента. Активность [i - галактозидазы определя-и с использованием в качестве субстратов орто-нитрофенил - р - D - галактопира-озид [Lederberg J., 1950; Kuby S.A., Lardy H.A., 1958] и лактозу [Куликова A К., Леонова Е.В., 1984]. За ферментативную единицу Р - галактозидазы принимали такое шичестко фермента, которое способно расщепить 1 мк моль субстрата (лактозы 1и орто-нитрофенил - Р - D - галактопиранозида) за 1 мин при 30 °С и рН 4,2.

Математическое планирование эксперимента. При подборе оптимально™ состава питательной среды для достижения максимального биосинтеза р - галакто зйдазы использовали полный факторный эксперимент.

Выделение и очистка ферментов. Для выделения препаратов ферментов ис пользовали ультрафильтрацию, осаждение органическими растворителями, фрак ционирование сульфатом аммония и гель-фильтрацию.

Статистическая обработка результатов. Опыты проводились в 3-4 - краг ном повторении. Обсуждаются только те результаты, которые были воспроизведем в каждом опыте.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выбор активного продуцента р - галактозидазы. Из 40 штаммов род; Aspergillus, Pénicillium и других, находящихся в музее кафедры биохимии имикро биологии ВГТА, подобран микромицет, обладающий способностью к активном; биосинтезу р - галактозидазы. Микромицеты выращивали глубинным способом течение 96 ч при 28-30 °С на среде, разработанной в институте биохимии им. А Н .Баха [Тихомирова, 1981]. Наибольшей способностью к биосинтезу р - галактозидаз! обладал микромицет P.canescens F-436.

Подбор условий для глубинного культивирования продуцента. В качестве ос новных факторов, влияющих на биосинтез р - галактозидазы, были выбраны темпе ратура, начальное значение рН питательной среды, продолжительность культивиро ваиия.

Биосинтез р - галактозидазы достигает максимума при культивировании про дуцента при температуре (29 ± 1) °С, начальном значении рН питательной средь 5,8 - 6,0, продолжительности процесса 144 ч. Методом множественной коррзляцш было получено уравнение, адекватно описывающее процесс биосинтеза Р - галакто зйдазы.

Влияние различных источников питания на биосинтез 0 - галактозидазы.. Н; рост культуры и биосинтез р - галактозидазы важное влияние оказывает состав пи

тательной среды. В качестве источников углерода были испытаны самые различные соединения: moho-, ди- и полисахариды, многоатомные спирты, органические кислоты, масла.

Наибольшее накопление биомассы наблюдалось на средах с глюкозой, ксилозой и сорбитом, а максимальная активность (5 - галактозидазы отмечена на средах со свекловичным пектином. Высокий биосинтез фермента на среде с пектином, можно объяснить индуцнрующим действием пектина и находящихся в комплексе с ним арабанов и галактанов.

Индуцирование биосинтеза Р - галактозидазы происходило и под действием природного субстрата лактозы, но в гораздо меньшей степени, что, по-видимому, связано с наличием у нее глюкозного остатка, который интенсивно вовлекается в метаболизм данного фермента.

В качестве источников азота были испытаны как минеральные, так и органические источники.

Наибольшее влияние на биосинтез (3-галактозпдазы оказывают восстановленные формы азота - аммонийные соли, а именно (NH^UPO.; и NH4H2PO4. Они использовались грибом и в качестве источника фосфора, который имеет важное значение в биоэнергетических процессах биосинтеза грибной р-галактозидазы. Наилучшими органическими источниками азота были пептон, кормовые дрожжи, кукурузный экстракт.

Строгой корреляции между накоплением фермента и биомассы не.установлено, но активность р-галактозидазы на средах с неорганическими источниками азота было несколько ниже, чем в средах с органическими источниками.

Соотношение и уровень углерода и азота з питательной среде оказывает существенное влияние на накопление биомассы и биосинтез фермента! Максимальное образование фермента происходило на средах, содержащих 0,26 % азота для всех испытанных концентраций углерода. При этом соотношение C:N лежало в пределах 2,3:1-4,6.1.

Разработка и оптимизация питательной среды dfu l'.anicsivns /•'—/irt. Дальнейшие исследования были направлены на подбор комплексной среды, не содержа-

ь

шей дефицитных компонентов и обеспечивающей высокий выход фермента.

Культивирование проводили с учетом подобранных ранее значений начально! о рН среды, температуры и продолжительности процесса 1! качестве органического источника азота использовали тонкоизмельченные кормовые дрожжи. Среда с максимальным биосинтезом фермента содержала 4 % тыквенных выжимок и 6 % кормовых дрожжей. Активность Р-галактозидазы составляла 126,6 ед/см\ В качестве минерального источника фосфора использовали Ы;ъНР04 в количестве ог I до 7%

При оптимизации питательной среды в качестве основных факторов влияющих на биосинтез Р-галактозидазы Р.сапеасепз Р-436, были выбраны: X! - массовая доля тыквенных выжимок, %; - массовая доля дрожжей, %; X1 - массовая доля Ма)НРО.|, %. Критерием оценки влияния различных (факторов на процесс биосинтеза Р-галактозидазы служила ее активность (У, ед'см"1). Для исследований применяли полный факторный эксперимент. Методом множественной корреляции было получено уравнение, адекватно описывающее исследуемый процесс:

У - 136,21 + 12.13Х, - 3,87Хг + 1,66Х3 - 1,29Х|Х2 - 0,44Х,Х., + 0,44Х2Х,< -

- 11,34Х,2-4,41Х22+0,34Х,2. Поиск условии максимального биосинтеза р-галактозидазы осуществляли по полученному уравнению градиентным методом. В результате были получены следующие оптимальные соотношения параметров,%: массовая доля тыквенных выжимок - 3,4, массовая доля дрожжей - 8,1, массовая доля Ыа2НРО| - 4,0. При таких значениях параметров активность р-галактозидазы равнялась 134,7 ед/см\

Получение препарата (]-га:1акпитакиы т микромиценш ¡'.сипехсепл ¡■-436. Ферментный препарат Р-галактозидазы получали из культуральной жидкости, используя ультрафильтрацию, осаждение растворителями (этанолом, ацетоном, изопропаиолом) и сульфатом аммония, гель-фильтрацией на сефадексах С-25 и С-100 'Эти операции позволили получить препарат со степенью очистки 93,3 и удельной активностью 427 ед/мг белка. Предложенная схема очистки обеспечивает Достаточно высокий выход активного препарата р-галактозидазы (табл. 1). Определение молекулярной массы р-галактозидазы на сефадексе С-100 дало величину 145 кДа,

Таблиц;« I

Очистка р-галактозидазы Р.сапезсепБ Р-436

Стадия очистки Активность р-галакто-зидазы, ед Масса белка, мг Удельная активность, ед/мг белка Степень очистки Выход препарата, %

Культуральная жидкость 15231,2 3328,0 4,6 1,0 100,0

Ультрафильтрация на мембране 0,05 мкм 14820,0 2465,2 6,0 1,3 97,3

Осаждение этанолом в соотношении объемов 1:1,5 11312,9 527,1 21,5 4,7 74,1

Осаждение сульфатом аммония при насыщении 75 - 95 % 8769,7 187,4 46,8 10,2 57,6

Гель - фильтрация на сефадексе С-25 8120,1 113,7 71,4 15,6 53,3

Гель - фильтрация на сефадексе О - 100 2562,7 7,2 354,1 77,3 16,8

Наиболее активная фракция 1067,8 2,5 427,1 93,3 7,0

Некоторые физико-химические счойства р-галактозидазы. При определении рН - и температурного оптимума действия фермента использовали в качестве субстратов орто-нитрофенил - р - О - галактопиранозид и лактозу. Максимальная активность для обоих субстратов была при рН 4,5, температурный оптимум для орто-нитрофенил - р - Б - галактопиранозида - 50 °С, для лактозы - 55 °С.

Опыты по кислотной инактивации р-галактозндазы показали наибольшую стабильность фермента в интервале рН 4,0-6,0. Через 60 ч инкубации при температуре 30 °С фермент сохранял активность при рН 4,0 на 52,2 %, нри рН 5,0 - 70,3 %, при рН 6,0-81,5%.

Изучение совместного влияния на фермент температуры и рН срсды доказало,

что при 40 °С, рН 4,0 за 32 ч остаточная активность была 33 %, при рН 5,0 - 48,8 "А и при рН 6,0 - 69,7 %. При температуре 50 °С и рН 4,0;5,0;6,0 после 12 ч инкубацш остаточная активность составила 22,8; 43,4 и 60,4 % соответственно. Повышение температуры до 60 °С привело к еще большей инактивации фермента: за 4 ч - активность составила 4 %.

Нами было установлено, что инактивация [З-галактозидазы является реакцией первого порядка. Константу скорости термической инактивации рассчитывали ш уравнению:

г 6[Е]

где Е о - исходная активность; Е - активность фермента в момент времени 1 от исходной; К - константа скорости инактивации, ч"1.

В габл. 2 приведены данные кинетики инактивации р-галактозидазь; Р.сапезсепз Р-436.

Таблица 1

Константы скорости термической инактивации Р-галактозидазы ¡\canescens Р-436

Температура, °С К(ч ') при рН

3,0 4,0 5,0 6,0

30 9,74.10"^ 1,07.102 0,61.10"' 0,33.10"1

40 0,58 0,04 0,02 • 0,01

50 1,94 0,13 0,07 0,04

60 6,20 1,96 1,48 0,80

Из табл. 2 видно, что температура и рН являются тесно взаимосвязанными факторами интенсивности процесса инактивации.

Воспользовавшись теорией переходного комплекса, мы дали термодинамическую характеристику процесса инактивации, определив параметры этого комплекса: до'", ДЛ" (табл. 3).

Из табл. 3 видно, что инактивация р-галактозидаш Рхапсксеп5 Р-436 носит сложный характер; в формировании белковой глобулы фермента участвуют, види-

мо, два типа взаимодействий - различные виды электростатических связей и ш . рофобные взаимодействия. Можно предположить существование двух паралж и пых процессов с различными температурными коэффициентами.

Таблица -

Термодинамическая характеристика активированного комплекса процесса кинепм.м инактивации р-галактозидазы Р.сапезсепв Р-436

Температура, °С рН Еакг АН* ДО"* дх*, Дж-град"'-моль '

кДж-моль"1

30-40 3,0 147,6 145,0 78,3 216,6

40-60 3,0 99,6 96,9 77,6 59,8

30-50 4,0 103,4 100,8 85,6 48,6

50-60 4,0 221,1 218,4 80,5 420,4

30-50 5,0 103,4 100,8 86,7 45,1

50-60 5,0 230,2 227,5 81,3 445,7

30-50 6,0 102,5 99,9 88,3 37,1

50-60 6,0 265,7 262,9 82,9 548,8

В зоне рН 4,0-6,0 и температурах (30 - 50 °С) происходит разрушение слабых электростатических связей, по всей видимости, водородных, которые играют незначительную роль в формировании белковой глобулы. Об этом свидетельствуют не-Зольшие изменения энтропии ДЛ'*. При повышении температуры от 50 до 60 "( скорость инактивации возрастает. Тепловая энергия вызывает интенсивное ра 1])) -лсние гидрофобных взаимодействий. В результате происходит более глубокое рач-зертывание полипептндной цепи, случайное расположение ее участков относительно друг друга, что подтверждается высоким приростом энтропии АУ*. При нтки\ температурах (30 - 40 °С) решающую роль в инактивации выполняют ионы Н\ при высоких температурах -теплов;1я энергия.

Идентификация функциональных групп активного центра р-л/и/к/по ".атехсш Р-436. Идентификация функциональных групп является важным н.ичо

дом в исследовании механизма действия ферментов. Чтобы четко идентифициро вать функциональные группы, входящие в активный центр фермента, мы использо пали несколько независимых экспериментальных критериев. Это дало возможносп сделать достаточно убедительное заключение о химической природе групп, участ вующих в гидролизе лактозы р-галактозидазой.

С этой целью были определены величины рК групп, рассчитаны их теплоть ионизации, а также фермент был подвергнут фотоокислению.

Величины рК определили по кинетической зависимости активности фермента от рН (рис. I). Профиль кривой характерен для кривой диссоциации ионных групп аминокислот и свидетельствует о£ участии в элементном акте разрыва р - 1,4 - гликозидной связи лактозы двух функциональных групп.

По методу (Жеребцов, 1997) были определены рК| и рК2; для восходящей и нисходящей ветвей кривой: они оказались равными рК| = 3,2, рК.2 = 6,3. Эти величины свидетельствуют о том, что в формировании активного центра фермента участвуют карбоксильная группа либо глутаминовой, либо аспарагиновой, либо какой-то другой С - концевой аминокислоты и имидазольная группа гистидина.

Наличие в активном центре р-галактозидазы карбоксильной и имидазольной групп подтверждают найденные нами величины теплоты ионизации этих групп. Рассчитанная по уравнению Вант-Гоффа теплота ионизации функциональных групп оказалась равна для восходящей ветви кривой 7,5 кДж/моль и для нисходящей - 26,1 кДж/моль, что соответствует теплотам ионизации карбоксильной и имидазольной групп.

Рис. 1. Зависимость и = <\рН) при температуре, "С: 1 -4; 2-50; о - начальная скорость реакции, % от максимальной.

-0.2

-0.4

-<1.6

Типичной реакцией на имидазольную группу гнстидина является фотоокисление в присутствии метиленового синего, играющего роль фотосенсибилизатора. Р-галактозидаза подвергалась интенсивной фотоинактивации, которая описывается

. уравнением реакции первого hoir к -----------v-----

рядка.

На рис. 2. представлены данные по фотоинактнвации р-гапастшццазы в интервале рН 3,0 - 7,0. С уменьшением концентрации Н+ -ионов в среде скорость фотоинактнвации возрастает. Точка пересечения прямых на кривой К = /(рН) находится при рН 5,8. II ли данные 1>п свидетельствуют об участи и акте катализа имидазольной группы гас-тиднна.

Рис. 2. Загшсимость /,!,'( К) = ДрН) при фо-тоокислеиии Р-галактозидазы P.canescens F-43 6 от рН при температуре 20 "С: к - константа скорости инактивации, ч"'.

СОПОСТАВЛЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ ФЕРМЕНТАТИВНОГО И КИСЛОТНОГО ГИДРОЛИЗА ЛАКТОЗЫ

з.о

4.0

5.0

6.0

При кислотном гидролизе в основе механизма разрыва гликозидной связи в молекуле лактозы лежит электрофильная атака Н+ - ионов на эту связь (рис. 3). Причиной атаки является неравномерное распределение электронной плотности в гликозидной связи лактозы. Атом кислорода этой связи, обладая большим отрицательным эффектом, будет иметь и большую электронную плотность, чем С| - атом остатка р-0 - галактозы. Уменьшение электронной пложосги у последнего связано также с индукционным воздействием на него кислородного ;ж>мп пнрипозного

к.на.ца галактозы. Это является причиной члектрофилыюй атаки атома кислорода -14- гликозидной связи лактозы Н+ - ионами. Чем выше концентрация Н+ - иолов и температура, тем выше скорость гидролиза, тем ниже энергия активации, необходимая для разрыва Р - 1,4 - гликозидной связи.

Однако жесткие факторы гидролиза лактозы ведут к деструкции продуктов гидролиза, к повышению оптической плотности гидролизатов (рис. 4).

но

6'

но

Рис. 3. Механизм разрыва гликозидной связи в молекуле лактозы под действием Н+ - ионор.; р-Оа!р, а-01ср - остатки молекул ()-□-галактопиранозы и а-Э-глюкопиранозы соответственно.

Иная картина при действии р - галактозидазы. Акт разрыва СгО-связи, в случае ферментативного гидролиза осуществляется в результате двусторонней атам этой связи системой карбоксилат-имидазолин (рис. 5).

Двусторонняя атака связи ферментом ведет к резкому снижению энергии активации при разрыве этой связи. Несмотря на жесткие условия кислотного гидролиза (рН 0,8, интервал температур 100 - 120 °С) энергия активации гидролиза была 1 1,4 раза выше, чем при ферментативном гидролизе (рН 4,5, интервал температур 40 50 °С) и была равна 52,7 и 37,5 кДжмоль'1 соответственно. Мягкие условия гидролиза р - гапактозидазой позволяют получить гидролизаты более высокого качества

Об чтом свидетельствует тот факт что-ферментативные гндролизаты ме изменяли оптическую плотность по отношению к исходному рпстпор\ лактозы.

Применение ферментного препарата р - гашктотдам в прс.т-по(>стпе хлебобулочных изделий. Разработан метод получения гидр'олизата ферментативным способом из сиропа с массовой долен лактозы 40 %. Ус-

Рис. 4. Зависимость оптической плотности таковлеио, что наилучшей результат

(Э) от температуры 0, °С) и рН при про- достигается при температуре 50 "С. должительности гидролиза 2,5 ч : 1 - рН

0,8; 2 - температура 120 °С. РН 4-2- Дозировке фермента 285 ед/г

Рис. 5. Механизм расщепления гликозиднон связи в молекуле лактозы Р-галактозидазой Р.сапенсепг Р-436.

Такие условия позволяют достичь за 10 ч степень гидролиза лактозы 98 %.

Получен полуфабрикат диетического назначения и показана целесообразность его использования в технологии хлебобулочных изделий

ВЫВОДЫ

1. Из 40 штаммов проверенных микроорганизмов отобран Pénicillium canes-cens F-436, проявивший значительную потенциальную возможность к биосинтезу [3-галактозидазы..

2. Установлено, что биосинтез р-галактозидазы P. canescens F-436 носит ин-дуцибельный характер. Накопление фермента в кулътуралъной жидкости микроми-цетом резко возрастает в присутствии пектиносодержащих веществ.

3. С использованием математического планирования эксперимента подобрана рациональная питательная среда для культивирования P. canescens F-436 в % мае: тыквенные выжимки - 3,4, дрожжи - 8,1, гидроортофосфат натрия - 4,0. Это позволило повысить выход фермента в 4,3 раза.

4. С помощью методов множественной корреляции получили уравнение, адекватно описывающее экспериментальные условия для глубинного культивирования микромицета: температура 29 °С, продолжительность культивирования 144 ч, рН среды 5,8 - 6,0. .

5. Оптимальные условия для действия р-галактозидазы Pénicillium canescens F-436 являются: рН 4,5 при гидролизе лактозы и о-нитрофенил-p-D-галактопнранозида, температура - 55 и 50 °С для гидролиза лактозы и о-нитрофенил-р-О-галактопиранозида соответственно.

6. Разработан метод получения высокоочищенного препарата р-галактозидазы с удельной активностью 427,1 ед/мг белка и степенью очистки 93,3. Молекулярная масса фермента 145 кДа.

7. Устаноблено, что инактивация фермента описывается уравнением реакции . первого порядка, р-галактозидаза P. canescens F-436 имеет достаточногвысокуто кислотную и термическую стабильность. Расчет термодинамических параметров акти-

пированного комплекса позволил заключить, что в формировании белковой глобулы фермента важную роль играют гидрофобные взаимодействия.

8. Профиль кривой активность ß-галактозидазы - pH, величины рК ионогеи-ных групп, фотоинактивация фермента в присутствии метиленового синего, зависимость константы скорост! фотоинактнвацнн от pH дают основание считать, что в активный центр фермента входит система карбоксилат-нмидазолнй.

9. На основе экспериментальных данных проведено сопоставление режимов кислотного и ферментативного гидролиза лактозы. Предложен вероятный механизм разрыва гликозндных связей под действием Н+-нонов и ß-галактозидазы в молекуле лактозы. Односторонняя атака Н+-ионов на глнкозидную связь при кислотном гидролизе обусловливает использование жестких условий, которые ведут к частичной деструкции продуктов гидролиза. Двусторонняя атака гликозидной связи системой карбоксилат-имидазолнй снижает энергию актиг-о.ция, обусловливает интенсивный разрыв этой связи при мягких условиях гидролиза. Ферментативный гидролиз исключает разложение продуктов гидролиза.

10. Проведенные исследования показали целесообразность применения |1-га-пактозидазы для гидролиза стропов лактозы и нснользовмш.ч гилролнзаюв в производстве хлебобулочных изделий. -

Список работ, онумикоааиных но теме диссертспшч

1. Черемушкина И.В. Ферментные препараты [i-галатозидазы микробного троисхождения// Молодежь и проблемы информационного и экологического мониторинга: Тез. докл. Межд. научн.-техн. конф. - Воронеж, 1996. - С. ¡29.

2. Жеребцов H.A., Черемушкина И.В. Применение ферментных препаратов i-галактозидазы в производстве пищевых продуктов// Пищевая промышленность >000: Тез. докл. Межрегнон. научц.-практ. конф. - Казань, 1996. - С.59-60.

3. Жеребцов H.A., Корнеепа О.С., Черемушкина И.В. ß-гялактозидаза микро-лицетов// Материалы XXXV отчет, научи, конф. ВГТА за 1996 г. - Воронеж, 1997. -.'. 30.

4. Черемушкина И.В. Ферментативное получение гидролизата молочной сы-юроткн// Проблемы пищевой технологии и техники: Тез, докл. Мсгл. конф. - Мо-"илев, 1997. - С.72.

5. Жеребцов H.A., Корнесза О.С, Черемушкина П.В., Ухина Е.Ю. Кислотный •пдролиз дисахарндов// Экология и безопасность жизнедеятельности: Межвуч. сб. )ауч. тр. Вып. 2. - Воронеж,! 997. - С. 95-98.

6 Жеребцов H.A., Корнеева О.С, Черемушкина И.В, Тертычная Т.Н. Перцептивное использование гидролизованной молочной сывортки// Экология и безо-

¡¡;и пость жизнедеятельности: Межвуз. сб. науч. тр. Вып. 2. - Воронеж,1997. - С. 99-

¡М;1

7 Черемушкина И.В., Корнеева О.С., Жеребцов H.A., Сербулов Ю.С. Иссле-.жание и оптимизация процесса кислотного гидролиза лактозы// Вестник ВГТА. -

1997 - № 2. - С.36-38.

8 Корнеева О.С., Жеребцов H.A., Черемушкина И.В. Механизм кислотного I итрозиза лактозы// Материалы XXXVI отчет, научи, конф. ВГТА за 1997 г. - Воронеж. 1998 - С.87.

9. Черемушкина И.В. К вопросу о кислотном гидролизе лактозы// Материалы научи, конф. молодых учен., аспир. и студ. ВГТА за 1996 г. - Воронеж, 1998. - С.98-<)<>

10. Корнеева О.С., Черемушкина И.В., Рязанов А Н., Шахова М.Н. Разработка способа производства ферментных препаратов с использованием сублимационной сушки// Модернизация существующего и разработка новых видов оборудования для пишевои промышленности: Сб. научи, тр. Вып.8. - Воронеж, 1998. - С.78-79.

И. Корнеева О.С., Жеребцов H.A., Черемушкина И,В., Ухина Е.Ю. Исследование механизма расщепления гликозных связей сахарозы ß-фруктофуранозидазой// Ьиохимия. - 1998. -Т. 63. -№ 10. - С. 1433-1438.

12. Corneeva O.S., Pashenco L P., Cheryomushkina I.V., Chursanova E.E. The obtaining of whey hudrolyzates with the aim of their Application in baking// Ecological Congress. - 1998. - V.2. - № 2,- P. 37-39.

13. Корнеева O.C., Жеребцов H.A., Черемушкина И.В. Влияние химической природы гликозидных связей на кислотный гидролиз олиго- и полисахаридов// Хранение и переработка сельхозсырья. - 1998. - № 1. - С. 10- i 3.