Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональные свойства гемоглобина у разных по экологии групп рыб

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Камшилов, Игорь Михайлович, Борок



) /

российская академия наук

ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ВНУТРЕННИХ вод им. И.Д.Папанина

на правах рукописи

УДК 597.442.1.111.05.2 КАМШИЛОВ Игорь Михайлович

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ГЕМОГЛОБИНА У РАЗНЫХ ПО ЭКОЛОГИИ ГРУПП РЫБ ;

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор В.И.Лукьяненко кандидат биологических наук А.С.Васильев

03.00.16 — Экология //

У

Борок 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ................................................................................................ 3

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................. 8

1. Функциональные свойства гемоглобина......................................10

2. Кислородная емкость крови .........................................................14

3. Кривые диссоциации оксигемоглобина........................................ 16

4. Факторы , влияющие на сродство гемоглобина

к кислороду................................................................................... 20

5. Регуляция сродства гемоглобина к кислороду с

помощью модуляторов.................................................................27

6. Влияние насыщения гемоглобина кислородом.......................... 29

7. Взаимосвязь дыхательных пигментов с экологическими

условиями......................................................................................31

8. Биология осетровых и костистых рыб......................................... 40

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.................. 53

Глава 3. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ГЕМОГЛОБИНОВ

КОСТИСТЫХ РЫБ...............................................................59

Глава 4. ВЛИЯНИЕ АТФ НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

ГЕМОГЛОБИНА ЛЕЩА.....................................................75

Глава 5. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ГЕМОГЛОБИНОВ

ОСЕТРОВЫХ РЫБ...............................................................81

1. Функциональные характеристики гемоглобинов

осетровых рыб...........................................................................81

2. Динамика сродства гемоглобина к кислороду у

проходных осетровых рыб......................................................93

3. Функциональные характеристики гемоглобина

стерляди....................................................................................109

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................................................119

ВЫВОДЫ...........................................................................................129

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................131

ВВЕДЕНИЕ

Среди многих сотен функционально специализированных белков позвоночных животных гемоглобин не имеет себе равных по степени изученности молекулярной структуры, физико-химических свойств и функциональных особенностей. Это обстоятельство делает гемоглобин идеальным объектом эколого-биохимических исследований, в центре которых стоит изучение молекулярных основ эврибионтности различных по высоте организации и экологии групп позвоночных животных, в частности рыб.

Один из основоположников науки о дыхательной функции крови Джозеф Баркрофт называл гемоглобин самым удивительным в мире веществом, целенаправленное изучение которого продолжается уже более века.

Основная функция гемоглобина - транспортная, то есть доставка кислорода к тканям с дыхательной поверхности и удалению углекислого газа из тканей во внешнюю среду. Кроме того, гемоглобин играет важную роль в регуляции осмотического давления крови. Детальное изучение молекулярной структуры гемоглобина позволило понять механизм осуществления им жизненно важных функций, прежде всего механизм транспорта кислорода. Эта функция стала возможной благодаря уникальной способности гемоглобина обратимо связывать кислород . Вопросу связывания гемоглобина с кислородом посвящено огромное количество работ (Riggs, 1970; Иржак, 1975, Проссер, 1977; Лукьяненко и др., 1991; Potter et al., 1996).

Согласно современным представлениям молекула гемоглобина, обратимо связывая и отдавая кислород, меняет свою конформацию. Транспорт кислорода гемоглобином осуществляется в два этапа. Первый из них - образование оксигемоглобина. Второй, противоположно направленный этап -диссоциация оксигемоглобина или отдача кислорода дышащим тканям с

образованием дезоксигемоглобина. Эффективность обоих тесно связанных между собой процессов определяется содержанием кислорода в окружающей среде (парциальное давление) и во внутренних тканях, а также сродством гемоглобина того или иного вида позвоночных животных к кислороду. Сродство гемоглобина к кислороду характерезуется величиной Р50, представляющей собой концентрацию кислорода, необходимую для полунасыщения гемоглобина при определенных температуре, рН и ионной силе. Ге-моглобины различных видов, а также разные молекулярные варианты гемоглобина одного вида при одних и тех же условиях существенно различаются по своему сродству к кислороду. Эти различия носят ярко выраженный адаптивный характер.

К настоящему времени накоплен значительный фактический материал по функциональным свойствам гемоглобинов у различных по высоте организации и экологии рыб. Однако, результаты выполненных работ в значительной мере противоречивы, и остро ощущается недостаток данных по гемоглобинам осетровых, одной из наиболее древних групп рыб (Миллер, 1969; Яковлев, 1977 ).

Актуальность проблемы. Осетровые рыбы (Аирешеиёае) — золотой фонд отечественной ихтиофауны, филогенетически древняя, но экологически весьма разнообразная группа рыб. Особое место в этом семействе по праву занимает наиболее многочисленный в видовом отношении род собственно осетров (Аарешег). Абсолютное большинство видов этого рода — анадромные мигранты, однако жизненный цикл некоторых полностью связан с пресной водой (стерлядь, сибирский и озерный осетры). Отдельные виды из этой группы (шип, русский осетр) способны длительное время задерживаться в пресной воде и даже формировать локальные стада и, наконец, осетровые являются одним из важнейших объектов отечественного

рыбоводства в естественных водоемах, что дает возможность для их детального изучения.

Исследования функциональных свойств гемоглобинов у разных по экологии видов костистых рыб проводились для сравнения этих свойств с гемоглобинами осетровых рыб .

Цель и задачи работы. Цель настоящей работы состояла в исследовании функциональных свойств гемоглобинов осетровых, их особенностей в сравнении с костистыми, а так же в изучении сезонной и межгодовой динамики функциональных свойств гемоглобинов осетровых рыб. При этом основное внимание было сосредоточено на:

1. Функциональных параметрах гемоглобинов осетровых и костистых рыб по кривым кислородного равновесия.

2. Сравнительной оценке сродства гемоглобина к кислороду по величине полунасыщения гемоглобина кислородом (Рбо)-

3. Величине эффекта Бора гемоглобинов осетровых и костистых рыб.

4. Степени кооперативного взаимодействия субъединиц тетрамеров гемоглобина костистых и осетровых рыб в процессе окси-дезоксигенации.

5. Изменении функциональных параметров гемоглобина при изменении молярности и рН буферной системы.

6. Влиянии АТФ на сродство гемоглобина к кислороду и на функциональные характеристки гемоглобина.

7. Сезонной и межгодовой динамике аффинитета гемоглобина к кислороду у осетровых рыб.

Научная новизна и теоретическое значение. Сравнительное исследование функциональных свойств гемоглобина у различных как в видовом,

так и в экологическом плане групп рыб проведено на осетровых - Acipenser guldenstadti (Brandt), Acipenser medirostris Ayres, Huso huso (L.), Acipenser stellatus (Pallas), Acipenser ruthenus L., Pseudoscaphirhynchus kaufinanni (Bogdanov) и костистых: Abramis brama (L.), Leuciscus idus (L.), Blicca bjoerkna (L.), Pelecus cultratus (L.), Carassius carassius (L.), Esox lucius L., Lota lota (L.), Silurus glanis L., Perca fluviatilis L.

Впервые:

- разработана методика по определению функциональных свойств гемоглобина, основанная на процессе окси-дезоксигенации пигмента.

- изучены функциональные свойства гемоглобинов 14 видов рыб, в том числе у 6 видов осетровых (русского и сахалинского осетров, белуги, севрюги, стерляди и большого амударьинского лопатоноса) и 9 видов костистых (окуня, карася, леща, густеры, язя, чехони, щуки, налима, сома).

- установлена сезонная и межгодовая динамика сродства гемоглобина к кислороду у осетровых рыб.

- проведено сравнение функциональных свойств гемоглобина русского осетра, белуги и севрюги в морской и речной периоды жизни.

- обнаружена внутрипопуляционная изменчивость по сродству гемоглобина к кислороду верхневолжской стерляди, отловленной в нижнем бьефе Горьковского гидроузла.

Практическое значение. Разработанная нами методика может быть использована для определения особенностей функциональных свойств гемоглобина, животных и человека.

Обнаруженная зависимость функциональных свойств гемоглобинов от экологических условий может служить физиологическим критерием негативного влияния изменений среды обитания на рыб.

Результаты выполненного исследования могут быть использованы при

организации физиолого-биохимического мониторинга.

Полученные данные включены в курс экологической физиологии рыб Ярославского Государственного Университета.

Апробация. Материалы диссертации докладывались на VII всесоюзной конференции по экологической физиологии и биохимии рыб (1989), на 1 и 2 Всесоюзных симпозиумах по экологической биохимии рыб (1987, 1990) и на VIII Всесоюзной конференции по экологической физиологии и биохимии рыб (1992), отчетных сессиях лаборатории экологической биохимии водных животных ИБВВ РАН (1986-1996).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 141 страницах машинописного текста, из которых 30 страниц занимает иллюстративный материал (рисунки). Она состоит из введения, пяти глав, разбитых на разделы, заключения, выводов и списка литературы, состоящего из 119 публикаций, из них 59 иностранных.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Как известно, дыхательная функция организма включает в себя два взаимосвязанных процесса: снабжение клеток кислородом и удаление углекислоты, образующейся в результате обмена веществ.

Способность крови к переносу кислорода обеспечивается, во-первых, растворением его в плазме, и во-вторых, обратимым связыванием кислорода с дыхательным пигментом крови. Количество кислорода, которое может быть растворено в плазме, ограничено, этот вид транспорта у большинства рыб имеет подчиненное значение, однако, кровь некоторых антарктических рыб полностью лишена гемоглобина, и весь кислород транспортируется только в плазме (Шилов, 1985). Также гемоглобин отсутствует в крови у молоди Galaxias maculata, и плазма крови может быть окрашена в зеленый цвет (Busse , Campos, 1996).

Дыхательные пигменты (гемоглобин, гемоцианин, хлорокруарин, гемэритрин) — разнородные в структурном и функциональном отношении группы молекул. Они имеют одну общую химическую особенность: пигменты представляют собой комплексы белка с атомами металла и обладают характерным цветом.

Большинство дыхательных пигментов, находящихся в циркулирующих жидкостях организма, способны присоединять кислород в области дыхательных поверхностей и освобождать его в активно дышащих тканях (Хочачка, Сомеро, 1977; Шилов, 1985). Нециркулирующие пигменты, например, миоглобин, облегчают перенос кислорода из крови к окислительным пигментам.

Гемоглобин относится к группе металлопротеидов. Функциональные свойства гемоглобина, обусловленные его уникальной структурой, специ-

фически соответствуют задачам обеспечения дыхательной функции. Степень насыщения гемоглобина кислородом зависит от концентрации О2, однако, эта зависимость нелинейна и имеет сигмовидную форму. Характер связывания кислорода гемоглобином обеспечивает снабжение тканей необходимым количеством О2 в условиях тех концентраций, которые имеются в дыхательных органах и работающих тканях. Гемоглобин способен взаимодействовать не только с О2, СО2 или СО, но и с другими веществами. Все они носят название лигандов. Одни лиганды присоединяются к макромолекуле в области гема, другие в различных участках глобина. Связывание кислорода гемоглобином тонко регулируется рядом соединений, подобно тому как это имеет место при действии положительных или отрицательных модуляторов на регуляторные ферменты, имеющих четвертичную структуру и состоящих из нескольких субъединиц. Таким действием обладают СО2, РГ, анионы С1 и органические фосфаты (ДФГ у млекопитающих и АТФ у рыб). Если потребление кислорода значительно возрастает, и вследствие этого увеличивается количество СО2 и Н+, то последние, взаимодействуя с НЮ2. снижают его сродство к кислороду и, следовательно, способствуют освобождению кислорода в тканях. В то же время взаимодействие СОг и ЕГ с гемоглобином обеспечивает транспорт этих веществ в органы дыхания и выделения, где и происходит их выделение в окружающую среду. Наконец, и это важно, гемоглобин принимает активное участие в поддержании кислотно-щелочного равновесия и сохранения постоянства рН внутренней среды.

Присоединяя и отдавая лиганд, гемоглобин изменяет свою пространственную конфигурацию - конформацию, отчего существенно изменяются физико-химические и функциональные свойства молекулы (Иржак, 1975).

1. Функции и свойства гемоглобина

Как известно, гемоглобин - наиболее часто встречающийся как среди позвоночных, так и среди беспозвоночных дыхательный пигмент, который, по-видимому, адаптивен к разнообразным условиям среды, как внутренним - физиологическим, так и внешним - экологическим.

Время, требующееся на соединение гемоглобина с кислородом, составляет 0.01 сек., на распад оксигемоглобина - 0.05 сек. При образовании оксигемоглобина железо остается двухвалентным. Следовательно, присоединение кислорода к данному пигменту не должно рассматриваться как окисление последнего (Афонский, 1970 ). Гемоглобин увеличивает кислородную емкость крови до 20 - 25 мл (VI00 мл крови, что в 30 - 40 раз превышает таковую плазмы крови (Коржуев, 1949; Кляшторин, 1982).

Гемоглобины могут иметь, как первично-третичную структуру, так и состоять из изолированных полипептидных цепей, что происходит благодаря процессу диссоциации сложных гемоглобинов высших животных и человека. Вместе с тем, гемоглобин может иметь и четвертичную структуру (Иржак, 1975), к ней относятся: димерные гемоглобины некоторых животных и димеры, выделенные во время естественной или экспериментальной диссоциации, тетрамерные пигменты животных и человека. Обращаясь к гемоглобинам рыб, необходимо отметить, что они, подобно гемоглобинам других классов позвоночных (за исключением круглоротых), представляют собой тетрамеры, состоящие из четырех цепей.

А.М.Кяйверайнен (1980) на основании динамической модели поведения, белка в водной среде предложил механизм действия гемоглобина. Гемоглобин содержит четыре гемовых «кармана» и центральную полость, которая изменяется в результате связывания кислорода. В соответствии с ди-

намической моделью каждая полость тема флуктуирует с частотой 10*8 — 10 * 4 С-1 между «открытой» и «закрытой» конформациями при этом вытесняется и сорбируется определенное количество воды. Образование первого комплекса стабилизирует «закрытое» (а) состояние одного из гемов и дестабилизирует «открытое» (б) состояние. Это приводит к деформации третичной структуры и возмущению кооперативной системы молекул воды в «открытом» состоянии центральной полости, что уменьшает стабильность данного состояния. Сдвиг равновесия влево по принципу обратной связи индуцирует аналогичный сдвиг равновесия между (а) и (б) - состояниями незакрытых активных центров, вследствие чего уменьшается энергия активации образования очередного комплекса, каждый последующий этап этой реакции усиливает этот эффект.

Общепризнанно, что связывание кислорода гемоглобином тонко регулируется рядом соединений. Таким действием обладают углекислый газ, ионы водорода, анионы хлора, органические фосфаты и т.д. Если потребление кислорода тканями возрастает, и, вместе с этим, увеличивается количество оксида углерода и ионов водорода, то последние взаимодействуют с гемоглобином, снижают его сродство к кислороду и способствуют освобождению последнего. В то же время взаимодействие оксида углерода и ионов водорода с пигментом обеспечивает транспорт этих веществ в легкие и почки, где происходит выделение их с выдыхаемым воздухом или путем экскреции (Уайт и др., 1981).

Многие реагенты могут окислять двухвалентное железо в гемоглобине, превращая его в трехвалентное с образованием метгемоглобина, который не присоединяет ни кислород, ни оксид углерода. Метгемоглобин может быть восстановлен до гемоглобина таким восстановителем, как гидросульфит натрия №28204. Железо /III/ в гемоглобине может взаимодейство-

вать со многими анионами, например, при щелочной рН с гидроксид ионами, при кислой рН с ионами хлора. Окисление гемоглобина до метформы выражается по-разному для кислой /1/ и щелочной /2/ среды.

НЬ4+4Н20 = (НЬ+Н20)4+4е /1/ НЬ4+4(ОН) = (НЬ+ОН) +4е /2/

В кислой среде окисление происходит легче, чем в щелочной (Иржак,

1975).

В одной из своих работ JI. И. Иржак и Я. Э. Азаров (1995) показали, что кислородосвязывающие свойства гемо