Функциональные свойства Ca2+ -активируемых хлорных каналов харовых водорослей

Катаев, Анатолий Ахсарбекович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Функциональные свойства Ca2+ -активируемых хлорных каналов харовых водорослей
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Функциональные свойства Ca2+ -активируемых хлорных каналов харовых водорослей"

На правах рукописи

и03452466

Катаев Анатолий Ахсарбекович

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА Саг+ -АКТИВИРУЕМЫХ ХЛОРНЫХ КАНАЛОВ ХАРОВЫХ ВОДОРОСЛЕЙ

03.00.02-биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 л и

ПУТЦИНО - 2008 °

,03

003452466

Работа выполнена в Институте биофизики клетки РАН.

Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор

Берестовский Генрих Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Зинченко Валерий Петрович,

доктор биологических наук, профессор Булычев Александр Александрович

Ведущая организация: Институт теоретической и экспериментальной

биофизики РАН г.Пущино, Московской области

Защита состоится '' 27 " ноября 2008 г. в 15.30 часов на заседании диссертационного совета Д002.03 8.01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, г. Пущино, Московская область, ул. Институтская, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики клетки РАН

Автореферат разослан " ¿3« октября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Т.И. Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

В плазматических и внутриклеточных мембранах клеток животных и растений имеется широкий набор различных ионных каналов, которые обеспечивают пассивный транспорт неорганических ионов. Кальций - активируемые хлорные каналы являются одними из основных компонент системы, участвующих в процессах функционирования эпителиальной секреции, сенсорной транедук-ции, регулирования нейронной и сердечной возбудимости, регулирования сосудистого тона клеток животных. В клетках растений кальций - активируемые хлорные каналы ответственны, по крайней мере, за состояние тургора клетки, однако полное функциональное назначение этих каналов в жизнедеятельности растений до сих пор не ясно. Известно, что ионные каналы клеток растений и клеток животных по своим основным свойствам и характеристикам во многом похожи (НесЗпсЬ Я., & .ГеготтА. 1992) Поэтому выяснение механизмов работы Са2+- зависимых хлорных каналов растительных клеток и точное описание режимов их функционирования является одной из фундаментальных проблем электрофизиологии.

Актуальность выбранной темы обусловлена тем, что недостаточно исследованы функциональные свойства и режимы работы хлорных каналов плазма-леммы клеток растений. Одна из основных трудностей состоит в том, что растительная клетка имеет две электровозбудимые мембраны - плазмалемму и то-нопласт, каждая из которых дает свой вклад в регистрируемый интегральный ток, что затрудняет интерпретацию экспериментальных данных.

Практическая актуальность темы обусловлена тем, что первой мишенью при воздействии внешних факторов (лекарственные препараты, токсины, химические вещества, физические агенты) является клеточная мембрана и её ионные каналы. Поэтому изменения в клеточной мембране и режиме работы ионных каналов, вызванные этими факторами, приводят к изменению функционального состояния клетки. Исследования влияния внешних факторов на изменения функционирования ион - транспортирующих систем экспериментально достаточно просто и удобно проводить на клетках харовых водорослей. Геометрия и гигантские размеры клеток позволяют проводить оригинальные исследования мембранотропных эффектов различных веществ. Поэтому, можно организовать на этих клетках легкий и обширный скрининг для тестирования и отбора различных лекарственных и биологически активных веществ.

Цель и задачи исследования.

Для изучения свойств и роли Са2+ -зависимых хлорных каналов плазматической мембраны клеток харовых водорослей на уровне целой и перфузируемой изнутри клетки с удаленным тонопласгом поставлены следующие задачи:

1. Выяснить природу процесса активации и инактивации хлорных каналов плазмалеммы клеток харовых водорослей. Найти экспериментальные доказательства того, что хлорные каналы непосредственно активируются ионами Са2+, и определить параметры переходного тока, вызываемого увеличением концентрации Са2+ в клетке

2. Исследовать процесс инактивации хлорных каналов - привести доказательства, что этот процесс стимулируется Са2+, и он необратим.

3. Исследовать функциональную зависимость хлорного тока плазматической мембраны от внутриклеточной концентрации Са2+ и рН раствора.

4. Определить ионную специфичность (ряда двухвалентных катионов) системы активации хлорного канала и их влияние на процесс необратимой инактивации каналов.

5. Изучить влияние ряда ингибиторов и активаторов хлорного тока на Са2' - зависимые хлорные каналы, находящиеся в разных режимах работы.

Научная новизна.

Впервые установлено, что С1 -каналы плазмалеммы активируются за счет увеличения концентрации ионов Са2+ в цитоплазме, а не напряжением, как считалось ранее. Получены интегральные характеристики СГ канала плазмалеммы такие, как зависимость амплитуды тока от концентрации ионов свободного Са2+ в цитоплазме клетки и значением рН внутриклеточной среды. Показано, что ионы Са2+, активирующие хлорные каналы плазмалеммы, являются причиной их необратимой инактивации. Впервые показано, что ряд нетитрируемых аналогов местных анестетиков, амфифильные катионы, такие как: (2X314, (}Х222, 088 и целый ряд других (конкурентов Са2+) способны задерживать наступление необратимой инактивации хлорных каналов и в зависимости от соотношения концентрации амфифильного катиона и ионов Са2+ выводить каналы из состояния необратимой инактивации. Показано, что клетки харовых водорослей можно использовать в качестве тест объекта - мониторинга существующих и скрининга потенциально новых лекарственных препаратов. Показано, что такие известные диуретики, как фуросемид и этакриновая кислота способны эффективно блокировать хлорный канал, находящийся в открытом состоянии, как изнут-

ри клетки, так и снаружи. Установлено, что некоторые представители семейства авермектинов (используемые для борьбы с паразитами животных и растений) являются эффективными ингибиторами хлорных каналов не только клеток животных, но и водорослей, и возможно высших растений. Результаты работы расширяют существующее представление о механизмах регуляции ионной проницаемостью биологических мембран растительных и животных клеток

Практическая значимость работы.

На основе клеток харовыч водорослей разработана новая система скрининга лекарственных и биологически активных веществ, влияющих на ионную проницаемость биологических мембран. Эта система позволяет проводить первичный отбор лекарственных веществ и регистрировать их мембранотропные эффекты. Она дает возможность облегчить трудоемкий и дорогостоящий скрининг этих веществ на клетках животных.

Апробация работы.

Основные результаты данного исследования были доложены на Всесоюзном симпозиуме "Одиночный ионный канал в биологических мембранах" (Пущино, 1986г.). На симпозиуме по биофизике в Югославии (Сараево, 1988г.). На 10-ом Биофизическом конгрессе (Ванкувер, Канада, 1990г.). На международной конференции "Biophysics of membrane processes", (Опатия, Югославия, 1990г.). На конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" (Пущино, 2002г.). На конференции «Проблемы биологической и медицинской физики» (Украина, Киев, 2004г.). На международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2005г.).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, включая 7 статей в рецензируемых журналах, 2 в сборниках и 1 авторское свидетельство, зарегистрированное в Государственном реестре изобретений.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения собственных экспериментальных результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 117 стр., содержит 34 рисунка. Список цитированной литературы содержит 233 ссылки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Эксперименты проводили на междоузлиях харовых водорослей Nitellopsis obtusa и Chara coiallma. Клетки Nitellopsis obtusa брались из Валдайских озер и содержались в охлаждаемых аквариумах, а клетки Chara corallina выращивали в аквариумах с искусственной прудовой водой (ИПВ) следующего состава (мМ): 0,1 KCI, 1,0 NaCl, 0,1 СаС12 рН 8.0 при комнатной температуре 18 - 20°С Многоядерные клетки междоузлий имеют в длину десятки сантиметров и достигают до 1 мм в диаметре.

Перфузия клетки и процедура удаления тонопласга. Нативная клетка размещалась в пазы трехсекционной камеры из фторопласта. Затем клетка подсушивалась на воздухе для уменьшения внутриклеточного давления (тургора). После этого концы клетки, выходящие в боковые отсеки, обрезали и клетку лерфузировали соответствующими растворами. Один отсек заполняли перфу-зионным раствором (ПР) с Са2+ -хелатирующим агентом EGTA (раствор EG-ПР), имевшим состав, (в мМ)" 3 EGTA, 15 KCH3SO4, 280 сахарозы, 20 HEPES/KOH, рН 7.2. Центральный отсек камеры заполнялся раствором ИПВ Для поддержания осмотического равновесия добавляли в раствор ИПВ 180мМ сахарозы и буфер - 1мМ HEPES/NaOH; рН 7.2. Противоположный отсек заполнялся Са2+-содержащим раствором (Са-ПР) по ионному составу идентичному раствору EG-ПР, но с заменой хелатора EGTA на ионы Са2+. Тип и концентрацию токозадающего аниона (А") в растворе Са-ПР варьировали в зависимости от условий задачи. В качестве основного токозадающего аниона использовали СГ, и для уменьшения амплитуды развивающегося тока большой плотности использовали заменители иона СГ: -мстилсульфат (CH3SO¡), изоционат, и SO*~. Состав раствора Са-ПР (в мМ)' 0.05 EGTA 0.5 СаС12, 10 А', 280 сахарозы, 20 HEPES-KOH, рН 7 2, где в качестве А" значился один из вышеперечисленных анионов (указано в тексте). Об удалении тонопласта судили по значению потенциала покоя (ПП) и величине сопротивления мембраны. Заполнение отсеков рабочей камеры проводили таким образом, чтобы в клетке оставался раствор EG-ПР. Скорость протока раствора в клетке составляла 5-10мкм/с. Эксперименты проводились при комнатной температуре.

Фиксация напряжения на мембране. Измерения переходного тока, вызванного изменением напряжения на мембране, проводили в режиме фиксации напряжения на выделенном рабочем участке клетки длиной 2 мм по классической четырехэлектродной методике (Cole K.S. 1968)). Для фиксации напряжения на мембране использовали специализированный усилитель Dagan 8500 (США). В качестве управляющего и регистрирующего устройства использовали компью-

тер с платой ЦАП/АЦП Оа1аТгап51а1юп 012801А и ЬСагс! 1250 Для мониторинга эксперимента использовали специализированный пакет программ Вш-(Зсб! и РС1ашр 6.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Изменение электрических параметров илазмалсммы и характера развития переходных токов в процессе удаление тонопласта.

Изменение потенциала покоя (V,,) и сопротивления мембраны (К,,) клетки в процессе ее перфузии раствором содержащим Са2+ хслатор -ЕСГА (Ев-ПР) имеет характерные изменения (рис. 1). За этапом деполяризации и эффектом периодической спонтанной генерации потенциала действия (ПД), следует этап гиперполяризации мембраны с выходом уровня напряжения на постоянный уровень -100 - -120 мВ, сопровождаемый постепенным ростом сопротивления мембраны в -1.5- 2 раза по сравнению с начальным этапом перфузии клетки и достигает величины 8-12 кОм»см2 на конечном этапе. Начало второго этапа (разрушение тонопласта) совпадает с началом интенсивного выхода из клетки мембранных пузырьков и гранул цитоплазмы, заканчивающегося к середине этапа.

Рис. 1. Изменение мембранного потенциала \'м в процессе удаления тонопласта перфузионным раствором с хелатором ЕвТА (ЕО-Г1Р) и последующей заменой его на раствор с Са2+. Для тестирования изменения электрического сопротивления мембраны на клетку подавались прямоугольные (0 5 с) импульсы тока 1 мкА.

Замена раствора с ЕвТА на расгвор с 1 мМ Са2+ (Са-ПР) вызвала быструю деполяризацию плазмалеммы и падение ее электрического сопротивления (рис. 1). Значение пика напряжения на мембране при появлении Са2+ близко к расчетному равновесному потенциалу для ионов хлора. Избирательность активи-2+

руемьтх ионами Са хлорных каналов для этих же условии по соотношению проницаемостей высокая: Ра/Рк ~ 17.

Процесс удаления тонопласта в режиме фиксированного напряжения на мембране, сопровождается постепенным изменением характера развития переходного тока в ответ на деполяризацию мембраны. На начальном этапе внутриклеточной перфузии клетки раствором Ев-ПР, функционируют кальциевые и хлорные каналы, переходные токи при деполяризации мембраны (топопласт

еще не разрушен) такие же, как и на нативной клетке (рис. 2А и рис. 2Б кривая 1). В процессе перфузии, по мере деструкции и разрушения тонопласта уменьшается амплитуда хлорной компоненты тока В результате, после полного разрушения и удаления тонопласта 8 -15мин) остается только кальциевая компонента тока, без инактивации (рис. 2Б, кривая 6). Изменение параметров развития переходных токов при деполяризации клетки в процессе удаления тонопласта и ее электрических характеристик служили критерием удаления тонопласта у клетки при перфузии ее раствором с пониженной концентрацией ио-

Рис. 2. Изменение характера развития тока плазматической мембраны при перфузии клетки А- ток на нативной клетке (показан суммарный ток, пунктиром выделена кальциевая компонента тока). Б - Трансформация переходных токов в режиме фиксации потенциала (импульсы с -120 до -50 мВ). при перфузии раствором Ев-ПР, демонстрирующая исчезновение электрической активности хлорных каналов в процессе удаления тонопласта из клетки.

2. Активация ионами Са2+ хлорных каналов перфузируемой плазмалсммы клеток харовой водоросли.

При постоянном фиксированном напряжении (У„= -ЮОмВ) на мембране замена раствора ЕО-ПР на Са-ПР в клетке ведет к возникновению входящего переходного тока с характерной кинетикой активации и инактивации (рис. ЗА). Все растворы содержат только один тип аниона - СГ. Концентрация С1- в пер-фузате (17 мМ) выбрана близкой к концентрации в цитоплазме нативной клетки. При замене растворов Са-ПР на ЕО-ПР ток падает практически до нуля.

Последующее удаление ионов Са2+ из клетки (замена раствора Са-ПР на ЕС-ПР), и повторное введение ионов Са2* в клетку после уменьшения амплитуды тока, в процессе инактивации до нулевого значения, не приводит к повторному развитию переходного тока. Вторичное введение ионов Са2+ в клетку не вызывает активации хлорных каналов. Инактивация необратима

Если заменять раствор с Са"+ в незавершенной стадии инактивационного процесса (рис. ЗБ), то можно получить серию импульсов переходного тока убывающей амплитуды в ответ на последовательную смену растворов ЕС-ПР—► Са-ПР —» ЕО-ПР —► Са-ПР и. т.д. Причем амплитуда последующего тока, в ответ на повторное введение ионов Са2+ в клетку, равна по величине току на момент удаления ионов Са2+ из клетки (рис. ЗБ).

А Б

Са

1 инактивации

Са

Са, | Гш1

EGTA

Рис. 3. Активация С1-каиалов ионами Са2+. Записи тока при VM= -ЮОмВ А - непрерывная перфузия раствором с Са2+, Б - последовательная смена раствора с Са2+ на раствор с EGTA. Вертикальные штрихи на токовых кривых отражают моменты подачи пилообразного напряжения на мембрану В - Мгновенные вольтамперные характеристики (МВАХ) плазмалеммы, снятые последовательно после активации хлорной проводимости на спаде тока, МВАХ получали с помощью пилообразного напряжения (30 мс, 150 мВ) на фоне VM =-100 мВ; ER(C1) -значение потенциала реверсии хлорного тока

Каналы инактивируются необратимо: по крайней мере, на отрезке времени 20-30 мин они не восстанавливаются. Процесс инактивации хлорных каналов имеет одноэкспоненциальный вид, с постоянной времени тин = 1 - 3 мин С другой стороны, длительная (до 20 мин) непрерывная перфузия клетки (с уже удаленным тонопластом) раствором с EGTA не приводит к заметной потере хлорными каналами способности активироваться Са2+, хотя при этом из клетки удаляются практически все водорастворимые эндогенные компоненты, в том числе и АТФ. Отсюда следует, что инактивация имеет место только в присутствии Са2т, и ответственны за нее элементы подмембранного цитогеля.

Поскольку постоянная времени рассматриваемой инактивации С1 -каналов (1-3 мин) почти на два порядка больше, чем в нативной клетке (1-3 с), это означает, что инактивация С1-каналов в нативной клетке обусловлена в основном уменьшением концентрации внутриклеточного свободного Са2+, а не наличием собственного инактивационного механизма, как это имеет место у Na- и неко-

торых К -каналов. На рис. ЗВ, приведены мгновенные вольтамперные характеристики (МВАХ), снятые до появления переходного тока (кривая 1) и в процессе его развития. Все МВАХ мембраны с активированными каналами пересекаются в одной точке потенциала реверсии тока, значение Уя = Еп, которая лежит на кривой 1 сборки МВАХ, полученной до введения Са2+ в клетку. Из приведенных данных можно сделать следующие выводы: 1) на всех этапах развития переходный ток создается одной и той же популяцией каналов с неизменной ионной избирательностью, о чем свидетельствует пересечение всех МВАХ в одной точке, определяющей потенциал реверсии переходного тока (Уя); 2) Са2+ не влияет на каналы (калиевые) покоящейся мембраны, поскольку точка Я лежит на исходной характеристике этих каналов. Отсюда следует, что 3) при потенциале покоя (Ум = -100 мВ), соответствующем потенциалу реверсии тока калиевых каналов, переходный ток течет только через вновь открытые хлорные каналы, активируемые Са2\ Причем этот ток создается практически только анионами, поскольку поддерживаемое на мембране напряжение близко к равновесному потенциалу для катионов.

Процесс инактивации хлорных каналов идет только в присутствии ионов Са2+ внутри клетки. Время наступления полной инактивации тока при непрерывной перфузии раствором Са-ПР совпадает с суммарным временем нахождения ионов Са2+ в клетке при попеременной, последовательной замене раствора без Са2+ (Ей-ПР) на раствор с Са2+ (Са-ПР) 'инактивации ин-1 ■

Необходимо однако, отметить, что анионная селективность Са2+ активируемых С1-каналов не идеальна, они проницаемы и для одновалентных анионов и катионов. Был получен ряд величин отношений коэффициентов проницаемости (по убыванию) для следующих ионов: С1~» СНзБО^ К4» БО^, (Ра/Рк > 10, Рк'/Рбо^- ~10).

3. Ионная специфичность активационного механизма хлорного канала

Для выяснения ионной специфичности активационного механизма С1 -канала были испытаны также ионы Mg2+, Бг2+ и Ва2+, а также Сс12+. Mg2+ и Ва2+ даже в концентрациях 10 мМ не активируют С1-каналы, Бг2+ в концентрации 10 мМ вызывает такие же по кинетике и амплитуде токи, как Са2+, но в концентрации на три порядка меньшей. Ионы Сс12+ способны активировать С1-каналы, но в отличие от ионов Са2+ лишь на короткое время - каналы инактивируются за несколько секунд, а не минут, как в случае Са2+. Самое же существенное отличие состоит в том, что инактивация С(12+ -активированных каналов не является необратимой. Кинетика развития Сс12+- индуцируемого тока показана на рис. 6 Б. Это следует из возможности многократной активации каналов путем перио-

дической смены растворов ЕО-ПР и Сс)2+-ПР. В отличие от Са2+ процесс необратимой инактивации С1 - каналов ионами Сс12+ отсутствует. Удаление и повторное введение Сс1"+ в клетку приводит снова к появлению С1- тока.

4. Зависимое! ь амплшуды Са2+-зависимого хлорного тока от внутриклеточной концентрации Са2+ и значения рН раствора.

Концентрационная зависимость амплитуды хлорного тока от [Са2+],„ имеет 8- образный характер (рис. 4). Половинная амплитуда тока достигается при [Са2+],„ = 17± 4мкМ. Оценки показывают (Ьипеузку at.al.1983), что такого же значения (= 20 мкМ) достигает концентрация Са2+ в цитоплазме клетки во время потенциала действия, когда Са2+ входит в клетку через активирующиеся при деполяризации Са -каналы плазмалеммы. Это значит, что во время потенциала действия оказывается одновременно активированной лишь приблизительно половина С1-каналов. При этом пиковые значения токов при Ум= - (80 - 100) мВ составляют обычно для разных клеток 2-4 А/м2, что примерно вдвое меньше токов, вызываемых прямым действием С а2* в концентрациях > 0,1 мМ при содержании С Г в перфузате 15 мМ (что соответствует средней концентрации СГ в цитоплазме нативной клетки).

А/м2

Рис. 4. Зависимость пикового значения С1-тока от концентрации ионов Са2+ в перфузате (рН 7.2).

ю-«

ю5

104

103 ю-2

ГПя^! м

Са2+- индуцированная хлорная проводимость плазмалеммы существенным образом зависит от рН перфузионного раствора Са-ПР (при рСа=соп51). При смещении рН от 8.4 до 5.5 длительность инактивации возрастает в несколько раз (рис. 5 А), а амплитуда тока падает почти до нуля. Уменьшение максимальной амплитуды тока в 2 раза наблюдается в районе рН 5,9. Коэффициент Хил-ла, отражающий степень кооперативности взаимодействия с лигандом, для зависимости амплитуды тока от рН близок к 4, в то время как для зависимости от рСа при постоянном рН он равен 2. Таким образом, можно предположить, что

активационный центр содержит четыре анионные группы, объединенных попарно, и ионы Са2+ активируют канал только связавшись с каждой парой.

Рис. 5.

А- изменение характера развития тока от значения рН раствора

Б - Зависимость амплитуды Са2+- зависимого С1- тока от рН раствора ([Са2+]ш = 02 мМ)

А Б

5. Са2+ -индуцируемая инактивация хлорных каналов.

Необратимая инактивация Са2+-активируемых С1-каналов под влиянием тех же ионов Са2+ существенно ограничивает методические возможности изучения этих каналов Внутриклеточный Са2+, вызывающий активацию хлорных каналов, является причиной их медленной и «необратимой» инактивации.

Поэтому была поставлена задача, подобрать такие антагонисты ионов Са2+, которые не мешали бы ионам Са2+ активировать каналы, но препятствовали бы его инактивирующему действию, конкурентно вытесняя Са2+ из инактивацион-ного центра связывания. Решение данной задачи одновременно доказывало бы и существование как минимум двух различных центров связывания ионов Са2'- активационного и инактивационного Для этого исследовали влияние на характер Са2+ индуцируемой инактивации двухвалентных катионов и

Сс12+, а так же ряда амфифильных катионов -нетитруемых аналогов местных анестетиков (МА+) и производных жирных кислот (ЦТАБ) и др.

5.1. Предотвращение инактивации хлорных каналов двухвалентными катионами.

Ионы введенные в перфузат совместно с Са2+ в соотношении концентраций [Г^2+]/[Са2+] > 102 предотвращают инактивацию хлорного тока (рис.5А). При этом, время задержки развития процесса инактивации зависит от величины отношения [Г^2+]/[Са2+]. Наличие в клетке ионов совместно с

Са2+ приводит к тому, что плазмалемма становится биологическим подобием хлорного электрода, каналы открыты и мембрана проницаема для ионов СГ. Изменение соотношения концентрации ионов хлора приводит к изменению величины и значения потенциала реверсии тока.

Если наряду с ионами Са2< в псрфузате присутствуют ионы Сс12+, процесс развития переходного тока в ответ на замену раствора ЕО-ПР на раствор Са -С<1 - ПР - останется таким же, как в случае наличия только одних ионов кадмия, и отсутствия ионов Са'* в растворе. В этих условиях наличие ионов Са2+ уже не приводит к возникновению необратимой инактивации С1-каналов.

А Б

Рис. 6. Предотвращение необратимой инактивации хлорных каналов ионами (А) -МВ2+- и (Б) -са2+-.

Если сначала активировать хлорные каналы раствором Са-ПР, а затем на инактивационном спаде Са2+-стимулировашгого тока ввести в проток ионы Сс12+, то последует быстрая характерная для Сё2+. инактивация каналов (рис. 6Б).

Из этих данных можно сделать вывод, что Сс12+ эффективно вытесняет Са2+ из активационных и инактивационных центров связывания. Возможно, столь высокая конкурентоспособность Сс12+ в данной ситуации имеет ту же природу, что и в случае взаимодействия Сё2+ и Са2* с комплексоном типа ЭДТА, для которого рКса/рКса ~ Ю6

5.2. Влияние местных анестетиков на инактивацию Са2+ - активируемых хлорных каналов.

В роли антагонистов Са2+ были испытаны местные анестетики (МА) и их не-титруемые аналоги - амфифильные катионы (АК+) 088, (}Х314, <3X222 и др. (рис. 7), вытесняющие Са2+ из клеточных мембран и конкурирующие с ним во

многих биологических процессах, а также ряд других органических катионов. Кривые на рис. 8 демонстрируют появление под влиянием МА+ латентного периода - задержки, в процессе инактивации хлорной проводимости плазмалем-мы

Локальный анестетик 0X314, введенный в клетку вместе с Са2+. способен задерживать начало ииактивационного процесса (рис. 8 Б, Г), не влияя в то же время на активацию С1-каналов. С увеличением концентрации МА+ в инакти-вационном процессе появляется латентный период, приводящий к задержке на длительное время (десятки минут) характерного спада тока. При этом характерное время спада тока заметно не меняется. Длительность задержки (Ь) линейно зависит от отношения концентраций а = [АК+]/[Са2+] (рис. 9), где АК+ -амфифильный катион. Наиболее эффективным из местных анестетиков оказался новокаин (13= 20 мин при а=1). Местные анестетики в нейтральной форме, гидрофильные катионы типа тетраэтиламмония, а также АК+, введенные с наружной стороны клетки, действия на С1 -каналы не оказывают.

Рис. 7. Структурные формулы локальных анестетиков Значения рКа: Ли-докаии 7.9, Тетрокаин 8.5, Прокаии 8 5, Бензокаин 2.6 Коэффициент распределения вода - октанол: Тримекаин 2 59, Лидокаин 1 44, Прокаин 1 4 ЦТАБ 5 65 (Цетилтриметил-аммоний бромид)

Тримекаин (гидрохлорид 2.4,6-триме-тиланилида М,1<-диэтиламиноук-сусной к-ты),

Новокаин(гидрохлорид Ь-диэтиламиноэтилового эфира амино-бензойной к-ты)

Амфифильные катионы изменяя характер инактивации тока Са2+-активируемых хлорных каналов, практически не влияют на амплитуду переходного тока.

Анестетик оказывает свое действие на Са2+-индуцируемые токи только при одновременном введении с Са2+. Предварительная инкубация клетки с раствором Ев-ПР совместно с ()Х-314 в течение 30 - 60 мин не влияла на поведение каналов при последующей их активации раствором Са-ПР без анестетика, ответ был подобен на рис. 8 А Применение анестетика с наружной стороны клетки также не оказывает влияния на характер Са2+-индуцируемого тока, даже если ввести анестетик в наружный раствор задолго до введения Са-ПР в клетку (например, 3 мМ (2Х-314 за 15 мин до возбуждения клетки раствором Са-ПР.

сн, Лидокаин — ()\222 <и,

сн3 Тримекаин-— <24314

N-( С,Н

П1,

Прокаин (новокаин

•5

•НС1

Для ответа на вопрос, являются ли мишенью действия МЛ+ Са2+ -активируемые С1-каналы (система управления ими) или каналы других типов-были изучены мгновенные вольтамперные характеристики (МВАХ) и действие этакриновой кислоты - блокатора хлорных каналов.

|Са2+ |Са'+0 50X314 |Са"'+1 5(2X314 |Са"'+ЗмМ 0X314

Рис. 8. Записи Са2+-индуцируемы\ хлорных токов плазмалемчы при различном содержании во внутриклеточном перфузионном растворе 0X314. Концентрация Са2+ в перфузате равна 0 2 мМ Записи сделаны на разных клетках при фиксированном напряжении -100 мВ Кривые демгшетрируют появление под влиянием МА+ латентного периода - задержки, в процессе инактивации хлорной проводимости плазмалеммы

Из рис 10 видно, что все МВАХ, полученные в разные моменты инактиваци-онного процесса, пересекаются в одной точке Наличие одной точки пересечения всех характеристик указывает на активацию ионами Са2+ + МА+ только одного типа каналов. Потенциал реверсии тока (точка пересечения МВАХ) совпадает со значением равновесного потенциала для ионов СГ (УК=ЕС|). При изменении концентрации ионов СГ по обе стороны мембраны, согласно уравнению Нернста изменялось значение равновесного потенциала для хлора Есь при этом регистрировали смещение значения в ту же сторону, что и Ед Вызванный кальцием и под воздействием МА+ перешедший в состояние без инак-тивиции ток, полностью подавлялся блокатором хлорных каналов - этакриновой кислотой (ЭК) в концентрации 0.6 мМ (рис. 12). Все это указывает на то, что мишенью действия МА+ (конкурента Са2+) являются Са2+ -активируемые С1-каналы.

Аналогичное действие на переходные токи оказывают и другие положительно заряженные соединения с четвертичным аммонием ОХ-222; ()Х-572; 0-88; ПК-95, НПА- и ЦТАБ. Различие состоит в основном в значении эффективных

концентраций (при [Са2+]ш = const), вызывающих одну и ту же задержку инактивации (1з) Са2+-активируемых С1-каналов (рис. 9).

Для выяснения роли заряда анестетика в изучаемом эффекте были выбраны сходные по структуре местные анестетики с третичным аммонием, имеющие разные значения рКа: бензокаин (2 6), тримекаин (7.9) -и новокаин (8.9). Их действие изучалось в диапазоне рН 6.5 - 8.2.

10 :

1 -

о 1

• СХ2Г2

о QX314

▼ QX572

V G88

■ Новокаин

п N-этила мин

ЦТ А Б

Рис. 9. Зависимость времени задержки инактивации С1 - каналов (^ от отношения концентраций испытываемого вещества и ионов Са2+ в растворе Са - ПР для ряда положительно заряженных местных анестетиков и других амфифильных органических катионов

0 1

[АК+]/[Са2

Контрольные опыты с нетитруемыми аналогами местных анестетиков QX-314 и G-88 показали, что их эффект от pH не зависит. Бензокаин в концентрации 3 мМ. на фоне 0.2 мМ Са2+ ни при каком значении pH в указанном выше диапазоне не оказывал действия на инактивацию С1-каналов. Из этого ряда выпал новокаин, который действовал даже эффективнее, чем анестетики группы QX. Если сравнить формулу новокаина с другими местными анестетиками, то можно увидеть серьезные структурные различия. В отличие от других МА , где заместителями в бензольном кольце являются метилы, в новокаине на бензольном кольце присутствует аминогруппа. Хотя при pH 7.2 это группа скорее всего не является протонированной (рКа - 2.2), ее присутствие сильно меняет амфифильность данного анестетика. Пониженная гидрофобность новокаина была показана при связывании ряда анестетиков с монослоем липидов (Hendrickson H.S. 1976). Влияние новокаина в большей степени обусловлено специфическим связыванием со структурами, ответственными за Са2+ процесс инактивации хлорных каналов. Действие тримекаина хорошо коррелировало со степенью протонирования аминогрупп в зависимости от значения pH. В протонированной форме, (pH 6.5) он действовал подобно QX-314, при (pH 7.2) эф-

фективность снижалась, а при (рН 8.2) задержки инактивации не наблюдалось, хотя происходило некоторое замедление (против контроля) инактивационпого спада тока. Эффективными по влиянию на процесс инактивации С1-каналов оказываются только положительно заряженные органические соединения, причем решающим фактором является не структура органического катиона, а наличие у него амфифильных свойств.

о-

-2-

-з-

Са"*+1.5мМОХ314

Ч**«' 150с

V, мВ

Рис. 10. А - Ток полученный в результате перфузии раствором с Са-ПР +1,5мМ

Ьхзн.

Б - МВАХ плазмалеммы. снятые последовательно после активации хлорной проводимости на спаде тока. в условиях, аналогичных (рис. 8В). МВАХ получали с помощью пилообразного напряжения (30 мс. 50 150 мВ) на фоне =-100 мВ;

Как уже отмечалось, инактивация хлорных каналов в присутствии ионов Са2\ но без анестетика, необратима: повторное введение Са2+ после его удаления раствором Ей-ПР не приводит к активации инактивировавшихся ранее каналов (рис. ЗА). С другой стороны, введение МАТ в Са2"-содержащий перфузи-онный раствор после полной «необратимой» инактивации каналов, приводит к восстановлению хлорной проводимости плазмалеммы (рис. 11 А). Заметное восстановление в случае производных местных анестетиков наблюдается при соотношении [МА+]/[Са"т]>10. а для новокаина при меньшем отношении. Восстановленная проводимость, судя по ее исчезновению при введении Ев-ПР, блокирующему действию ЭК и характеру МВАХ, является хлорной. Таким образом, присутствие МА+ в растворе Са-ПР способствует снятию эффекта так называемой «необратимой» инактивации С1 -каналов. Продленные с помощью амфифильных катионов Са2^-индуцированные токи полностью подавляются блокатором С1-каналов - этакриновой кислотой (ЭК) в том же диапазоне концентраций (-0,5 мМ), что и на нативной клетке (рис. 12). При этом блокатор одинаково эффективно действует с наружной и с внутренней стороны мембраны, но на открытые каналы.

Под его действием ток уменьшается наполовину за время порядка нескольких секунд. В случае интактной клетки при наружном введении ЭК блокирова-

ние каналов идет только при стимуляции мемораны деполяризующим напряжением и активации каналов.

При этом С1-каналы открываются всего на несколько секунд и подавление амплитуды хлорного тока наполовину наступает через 15-30 мин. Аналогично ЭК блокируют С1-каналы фуросемид и бензоат натрия, но последний при концентрациях на порядок выше.

(С а^

6мМ МА

| Са2*+МА*

'EGTA

Рис. И. Восстановление хлорной проводимости под влиянием <ЗХ-314 (6 мМ) после полной «необратимой» ее инагогеации при перфузии раствором Са-ПР без <ЗХ-314 ([Са2>0.2 мМ)

3 мин

'80 Этакриновая иИ/1 кислота

Рис. 12. Блокирование продленных с помощью МА+ С1- токов этакриновой кислотой. Эффект наступает сразу после введения блокатора.

Центры связывания ионов Са"+, ответственные за активацию и инактивацию Cl-каналов, существенно отличаются друг от друга и специфичностью к Са2т, и характером взаимодействия с другими катионами. Активационный центр высокоспецифичен к Са2+, даже ближайший щелочноземельный ион Sr2+ на три порядка менее эффективен, а амфифильные катионы (АК1). в том числе заряженные местные анестетики, вообще не оказывают действия на активационный центр. В то же время линейная зависимость длительности латентного периода инактивации t3 от отношения [АК]/[Са2+] (рис. 9) свидетельствует о конкуренции этих катионов в «инактивационном» центре связывания, причем важнейшим свойством органического катиона, делающим его конкурентоспособным, является наличие у него ярко выраженной амфифильности. Последнее указывает на важную роль гидрофобных взаимодействий катиона с молекулярными структурами, ответственными за инактивацию Cl-каналов. Об этом же свидетельствуют опыты с ионами Mg2t, где также наблюдалась задержка инактивации, но при [Mg2+]/[Ca24 ]> >100, т. е. при существенно больших концентрациях

Mg:+, чем AK+.

Инактивационная система С1-каналов, так же как и активационная, расположена с цитоплазматической стороны мембраны, поскольку и ионы Са2+, и АК+ влияют на инактивационный процесс только при внутриклеточном 'введении. Ионы Ca"f вызывают перестройку этой подмембранной системы. Но перестройка не сопровождаем необратимым разрушением системы, как предполагалось ранее. Этот вывод следует из того, что после вызванной ионами Са2+ полной инактивации С1-каналов их можно снова активировать, если наряду с Са2< ввести во внутриклеточный псрфузат амфифильные катионы (рис. 11).

Способность местных анестетиков и других амфифильных катионов предотвращать на длительное время инактивацию С1-каналов создает хорошие перспективы для изучения различных сторон функционирования этих каналов в перфузируемой клетке.

6. Действие природного комплекса аверсектина С и авермектина Ai на Са2+- зависимый хлорный ток плазмалсммы клеток Chara corallína

Природный авермектиновый комплекс аверсектин С и компонент этого комплекса авермектин А,, меняют проводимость Са2+- зависимых хлорных каналов плазмалеммы клеток Chara corallína, действуя только с внешней стороны клеточной мембраны.

Ток, А/м

Контр

О 1цд/ml

Рис. 13. Действие природного комплекса - аверсектина С на Са~+-зависимые хлорные токи в клетках Chara corallína А - записи переходных токов полученных через интервал времени At =15 мин Концентрация препарага указана у токовых кривых. Б -Зависимость эффекта действие аверсектина С от времени и концентрации. Приведена нормированная кривая ///KOllTр

Низкие концентрации аверсектина С и авермектина Ai увеличивают хлорный ток (рис.13, рис.14): половинная концентрация - Куг = 3.5«10"5 мг/мл для всего комплекса и K¡/2 = 2.1 »10"8 мг/мл для авермектина А|. Относительно высокие концентрации подавляют хлорный ток: К|С = 2.2x10*J мг/мл для аверсектина и К]/2 = 4.2х10"6 мг/мл для А|. Коэффициенты Хилла для взаимодействия

авермектина А, с соответствующими мишенями для стимуляции и подавления хлорного тока равны 2.8 и 2.5. Бикукулин, неспецифический блокатор рецепторов у-аминомасляной кислоты, не влияет на стимуляцию хлорных токов, вызванную действием низких концентраций авермектинов, но в то же время блокирует угнетение хлорных токов, связанное с действием высоких концентраций авермектинов.

А Б

Гок, А/м2

Рис. 14. А -Временной ход изменения амплитуды хлорного тока под воздействием авермектина А^

Авермектины Ai, В] (абамектин), В2, и 22,23- дигидроавермектин В, (ивер-мектин) в изученном диапазоне концентраций не влияет на хлорные токи клеток Chara corallma Природный комплекс авермектинов (аверсектин - С) и авермектин А| блокируют Са2+ -зависимый СГ -ток в очень низких концентрациях. Авсрмсктин Ai вероятно имеет собственный рецептор, сопряженный с Са2+- чувствительным хлорным комплексом.

ВЫВОДЫ:

1. Показано, что хлорные каналы плазматической мембраны активируются ионами Са2+ (с внутренней стороны плазмалеммы) и не имеют собственного инактивационного механизма. С1-каналы не активируются напряжением в отсутствие внутриклеточного Са2+.

2. Внутриклеточный Са2' вызывает активацию хлорных каналов и одновременно является причиной их медленной (минуты) и необратимой инактивации. Конкуренты Са2+, амфифильные органические катионы, введенные внутрь клетки вместе с Са2+, задерживают наступление процесса необратимой инактивации тока Длительность задержки линейно зависит от отношения концентраций амфифильного катиона и ионов Са2+. При соотношении

концентрации [АК+]/[Са ] >10, они способны восстанавливать хлорную проводимость после полной инактивации хлорных каналов. Инактивация тока исчезает в присутствии ионов Mg2+, при условии что отношение [Mg2+]/fCa21 > 102.

3. Показано, что процесс связывания ионов кальция с рецептором хлорного канала является кооперативным, при этом необходимо два иона кальция для перехода канала в открытое состояние и четыре иона водорода для предотвращения процесса активации каналов ионами кальция.

4. Ионы Sr2+ активируют хлорные каналы в концентрации на три порядка большей чем ионы Са2+. Ионы Ва2+ и Mg2+ не вызывают активацию хлорных каналов. Ионы Cd2+ вызывает переходной ток, со значительно более быстрой кинетикой развития (секунды).

5. Показано, что используемые в медицинской практике диуретики - фуросе-мид и этакриновая кислота эффективно блокируют Са2+ -активируемый хлорный канал плазмалеммы харовых водорослей, находящийся в открытом состоянии и не влияют на канал в закрытом состоянии. Сравнение этих данных с блокированием фуросемидом и этакриновой кислотой хлорных каналов осморегулирующих органов животных, дает основание сделать вывод о близости структурно-химической организации хлорных каналов харовых водорослей и животных. На этом основании разработана новая система скрининга лекарственных и биологически активных веществ.

6. Найдено влияние природных комплексов авсрсектинов и авермектина А) на переходные хлорные токи плазмалеммы и исследован механизм их действия на Са2+ -зависимые хлорные каналы.

Основные работы, опубликованные по теме диссертации.

1 Kataev A.A. Zherelova О.М. Berestovsky G.N. Ca2+-induced activation and irreversible inactivation of chloride channels in the perfused plasmalemma of Nitel-lopsis obtusa. Gen. Physiol. Biophys., 1984, v.3, pp. 447-462

2. Жерелова O.M., Берестовский Г.Н, Наточин Ю.В., Катаев А.А «Способ определения диуретической активности вещества». Авторское свидетельство № 1118918. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР 15 июня 1984г.

3. Катаев A.A., Жерелова О.М., Берестовский Г.Н. Активация и необратимая инактивация ионами Са2+ и Sr2+ хлорных каналов перфузироемой плазма-

леммы клеток водоросли. В сборнике «Структура и функции биологических мембран». Новосибирск, 1985г. с.56-62. Изд «Наука» Сиб. отделения.

4. Катаев А.А., Жерелова О.М. Предотвращение ионами Mg21" и рядом местных анестетиков инактивации Са2+- активируемых хлорных каналов перфу-зируемых клеток Nitellopsis obtusa. В сборнике «Биоэлектрогенез и транспорт веществ у растений» Изд. г.Горький, 1986, с.62-66.

5. Берестовский Г.Н., Жерелова О.М., Катаев А.А. Ионные каналы клеток ха-ровой водорослей. Биофизика, 1987, т. 3, № 6, с. 1011-1027.

6 Катаев А.А., Жерелова О.М., Берестовский Г.Н. Влияние заряженных местных анестетиков на инактивацию хлорных каналов харовой водоросли. Биофизика, 1988, т.З, № 6, с.1006-1011.

7. Andjus P.R., Vucelic D., Kataev А.А , Pottosin 1.1., Alexandrov A.A., Bere-stovsky, G.N. D20/H20 exchange at the characean cell membrane: transport mechanisms and the solvent isotope effect. Studia biophysica, 1990, v.138, №.1-2, p. 105-114.

8. Andjus P.R., Kataev A.A.. Alexandrov A.A., Berestovsky G.N., Vucelic D. D20-induced ion channel activation in Characeae at low ionic strength. J Membr Biol. 1994 v.142, №.1, p.43-53.

9. Drinyaev VA, Mosin VA, Kruglyak EB, Sterlina TS, Kataev A.A., Berestovsky GN, Kokoz YM. Effect of avermectins on Ca2+-dependent CI- currents in plasmalemma of Chara corallina cells. J Membr Biol. 2001 v.182, № 1, p.71-79.

Ю.Дриняев В А., Мосин B.A , Кругляк Е.Б., Стерлинг T.C., Викторов А В., Катаев А.А., Берестовский Г.Н.,. Катаев Т.С, Кокоз Ю.М. Действие авермекти-нов на Са2+-зависимый хлорный ток плазмалеммы клеток Chara corallina. Антибиотики и химиотерапия. 2001;46(5):6-12

Подписано в печать 08 10 2008 г

Печать трафаретная

Заказ № 1018 Тираж 75 экз

Типография «11-ii ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (499) 788-78-56 wvvw autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Катаев, Анатолий Ахсарбекович

ОГЛАВЛЕНИЕ.

Принятые сокращения.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Характеристика ионных каналов плазматической и вакуолярной мембраны клеток харовых водорослей.

1.1.1 Анионные каналы плазматической мембраны растений.

1.1.2 Кальциевые каналы.

1.1.2 Кальций - активируемые хлорные каналы.

1.1.3 Калиевые каналы плазматической мембраны растений.

1.1.4 Механочувствительные ионные каналы харовых водорослей.

1.2 Роль ионов Са при передаче сигнала в клетках растений.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Растительный материал.

2.2 Процедура удаления тонопласта. Перфузия клетки.

2.3 Фиксация напряжения на плазматической мембране.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1 Изменение электрических параметров плазмалеммы и характера развития переходных токов в процессе удаление тонопласта.

3.2 Активация ионами Са2+ хлорных каналов перфузируемой плазмалеммы клеток харовой водоросли.

3.3 Ионная специфичность активационного механизма хлорного канала.

3.4 Зависимость амплитуды тока от внутриклеточной концентрации

Са2+ и рН раствора.

3.5 Са -индуцируемая инактивация хлорных каналов.

3.5.1 Предотвращение инактивации хлорных каналов двухвалентными катионами.

3.5.2 Влияние местных анестетиков на инактивацию Са -активируемых хлорных каналов харовой водоросли.

3.6 Действие природного комплекса аверсектина С и авермектина Ai на п .1.

Са - зависимый хлорный ток плазмалеммы клеток Chara corallina.

3.6.1 ГАМКа- зависимая регуляция СГ тока в клетках Chara corallina.

3.6.2 Действие аверсектина-С на Са2+-зависимый СГ ток в клетках.

3.6.3 Действие авермектинов А /, А2, В!; В2 на Са - зависимый

СГ ток.

3.6.4. Защитное действие бикукулина.

3.6.5. Действие авермектинов с внутренней стороны плазматической мембраны клеток Chara corallina.

3.6.6. Действие авермектина A j на характерное время перехода Са2+ -зависимых хлорных каналов из инактивированного состояния в закрытое.

Глава 4. ОБУЖДЕНИЕ.

4.1 Роль Са в управлении хлорными каналами.

4.2 Предотвращение необратимой инактивации конкурентами Са

4.3 Действие Авермектинов на Са - зависимый С1- ток плазмалеммы клеток Chara corallina.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Функциональные свойства Ca2+ -активируемых хлорных каналов харовых водорослей"

Актуальность проблемы

В плазматических и внутриклеточных мембранах клеток животных и растений имеется широкий набор различных ионных каналов, которые обеспечивают пассивный транспорт неорганических ионов. Кальций -активируемые хлорные каналы являются одними из основных компонент системы, участвующих в процессах функционирования эпителиальной секреции, сенсорной трансдукции, регулирования нейронной и сердечной возбудимости, регулирования сосудистого тона клеток животных. В клетках растений кальций - активируемые хлорные каналы ответственны, по крайней мере, за состояние тургора клетки, однако полное функциональное назначение этих каналов в жизнедеятельности растений до сих пор не ясно. Известно, что ионные каналы клеток растений и клеток животных по своим основным свойствам и характеристикам во многом похожи (Hedrich & Jeromin 1992b). Анализ недавно расшифрованных генов ряда растений показал, что большинство ионных каналов, кодируемых в этих геномах, гомологичны известным каналам животных клеток (Ward et al. 2008). Поэтому выяснение механизмов работы Са2+- зависимых хлорных каналов растительных клеток и точное описание режимов их функционирования является одной из фундаментальных проблем электрофизиологии.

Актуальность выбранной темы обусловлена тем, что недостаточно исследованы функциональные свойства и режимы работы хлорных каналов плазмалеммы клеток растений. Одна из основных трудностей состоит в том, что растительная клетка имеет две электровозбудимые мембраны — плазмалемму и тонопласт, каждая из которых дает свой вклад в регистрируемый интегральный ток, что затрудняет интерпретацию экспериментальных данных.

Практическая актуальность темы обусловлена тем, что первой мишенью при воздействии внешних факторов (лекарственные препараты, токсины, химические вещества, физические агенты) является клеточная мембрана и её ионные каналы. Поэтому изменения в клеточной мембране и режиме работы ионных каналов, вызванные этими факторами, приводят к изменению функционального состояния клетки. Исследования влияния внешних факторов на изменения функционирования ион - транспортирующих систем экспериментально достаточно просто и удобно проводить на клетках харовых водорослей. Геометрия и гигантские размеры клеток позволяют проводить оригинальные исследования мембранотропных эффектов различных веществ. Поэтому можно организовать на этих клетках легкий и обширный скрининг для тестирования и отбора различных лекарственных и биологически активных веществ.

Цель и задачи исследования

24*

Для изучения свойств и роли Са -зависимых хлорных каналов плазматической мембраны клеток харовых водорослей на уровне целой и перфузируемой изнутри клетки с удаленным тонопластом поставлены следующие задачи:

1. Выяснить природу процесса активации и инактивации хлорных каналов плазмалеммы клеток харовых водорослей. Найти экспериментальные доказательства того, что хлорные каналы непосредственно активируются ионами Са, и определить параметры переходного тока, вызываемого увеличением концентрации Са2+ в клетке.

3. Исследовать функциональную зависимость хлорного тока плазматической мембраны от внутриклеточной концентрации Са и рН раствора.

5. Изучить влияние ряда ингибиторов и активаторов хлорного тока на Са -зависимые хлорные каналы, находящиеся в разных режимах работы.

Научная новизна

Показано, что ионы Са , активирующие хлорные каналы плазмалеммы, являются причиной их необратимой инактивации. Впервые показано, что ряд нетитрируемых аналогов местных анестетиков, амфифильные катионы, такие о I как: QX314, QX222, G88 и целый ряд других (конкурентов Са ) способны задерживать наступление необратимой инактивации хлорных каналов и в зависимости от соотношения концентрации амфифильного катиона и ионов Са выводить каналы из состояния необратимой инактивации. Показано, что клетки харовых водорослей можно использовать в качестве тест объекта -мониторинга существующих и скрининга потенциально новых лекарственных препаратов. Показано, что такие известные диуретики, как фуросемид и этакриновая кислота способны эффективно блокировать хлорный канал, находящийся в открытом состоянии, как изнутри клетки, так и снаружи. Установлено, что некоторые представители семейства авермектинов (используемые для борьбы с паразитами животных и растений) являются эффективными ингибиторами хлорных каналов не только клеток животных, но и водорослей, и возможно высших растений. Результаты работы расширяют существующее представление о механизмах регуляции ионной проницаемости биологических мембран растительных и животных клеток.

Практическая значимость работы

На основе клеток харовых водорослей разработана новая система скрининга лекарственных и биологически активных веществ, влияющих на ионную проницаемость биологических мембран. Эта система позволяет проводить первичный отбор лекарственных веществ и регистрировать их мембранотропные эффекты. Она дает возможность облегчить и заменить трудоемкий и дорогостоящий скрининг этих веществ на клетках животных.

Апробация работы

Публикации

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Катаев, Анатолий Ахсарбекович

ВЫВОДЫ:

1. Показано, что хлорные каналы плазматической мембраны активируются ионами Са (с внутренней стороны плазмалеммы) и не имеют собственного инактивационного механизма. С1-каналы не активируются напряжением в отсутствие внутриклеточного Са2+.

2. Внутриклеточный Са2+ вызывает активацию хлорных каналов и одновременно является причиной их медленной (минуты) и необратимой инактивации. Конкуренты Са - амфифильные органические катионы, введенные внутрь клетки вместе с Са2+, задерживают наступление процесса необратимой инактивации тока. Длительность задержки линейно зависит от отношения концентраций амфифильного катиона и ионов Са2+. При соотношении концентраций [АК+]/[Са2+] >10, они способны восстанавливать хлорную проводимость после полной инактивации хлорных каналов. Инактивация тока исчезает в присутствии 11 ^ I л ионов Mg при условии, что отношение [Mg ]/[Са" ] > 10 .

4. Ионы Sr2+ активируют хлорные каналы в концентрации на три порядка большей чем ионы Са2+. Ионы Ва2+ и Mg2+ не вызывают активацию хлорных каналов. Ионы Cd вызывает переходной ток, со значительно более быстрой кинетикой развития (секунды).

5. Показано, что используемые в медицинской практике диуретики гу , фуросемид и этакриновая кислота эффективно блокируют Са -активируемый хлорный канал плазмалеммы харовых водорослей, находящийся в открытом состоянии и не влияют на канал в закрытом состоянии. Сравнение этих данных с блокированием фуросемидом и этакриновой кислотой хлорных каналов осморегулирующих органов животных, дает основание сделать вывод о близости структурно-химической организации хлорных каналов харовых водорослей и животных. На этом основании разработана новая система скрининга лекарственных и биологически активных веществ.

6. Показано, что авермектин Ai имеет собственный рецептор, сопряженный с Са2+- чувствительными хлорными каналами и природный комплекс авермектинов (аверсектин-С) и авермектин А] блокируют Са зависимый СГ ток в очень низких концентрациях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Гигантские клетки харовых водорослей являются превосходным материалом не только для электрофизиологических исследований, но также и для других областей, таких как движение цитоплазмы, осморегуляции, зависимого от фотосинтеза ионного транспорта, межклеточного транспорта. Интернодальные клетки - большие цилиндрические клетки, имеющие однородный диаметр. Благодаря уникальным особенностям клетки с данным объектом можно проводить большое количество различных внутриклеточных манипуляций. При обрезании конечных участков клетки, получается растительный объект, аналогичный гигантскому аксону кальмара на котором можно проводить те же манипуляции, что и на аксоне: внутриклеточную перфузию растворами с необходимыми заранее заданными компонентами, проводить после замены внутриклеточного раствора перевязку открытых концов клетки и восстанавливать тургорное давление, и др. Применение этих методик на интернодальных клетках, значительно облегчает изучение механизмов электрогенезиса ионного транспорта. Ситуация симметричная с гигантскими аксонами кальмара. Развитие методики внутриклеточной перфузии на гигантских аксонах (Baker et al. 1961; Oikawa et al. 1961) значительно облегчило выяснение механизма мембранной возбудимости, чему способствовали условия возможности контроля химического состава по обе стороны плазматической мембраны. Аналогичные процедуры можно вести и на клетках харовых водорослей. Используя методики внутриклеточной перфузии легко задавать и контролировать химические составы по обе стороны плазматической мембраны и тонопласта. Полученные экспериментальные результаты на клетках харовых водорослей, сформировали базис для исследований функциональных свойств мембран растительных клеток. Таким образом, клетки харовых водорослей могут быть уникальным материалом для всестороннего исследования свойств и характеристик плазматических мембран. Результаты анализа недавно расшифрованных геномов ряда растений показали, что большинство ионных каналов, кодируемых в этих геномах, гомологичны известным каналам животных клеток (Elter et al. 2007; Ward et al. 2008). В работе (Hedrich & Jeromin 1992b) было показано, что ионные каналы клеток растений и клеток животных по своим основным свойствам и характеристикам во многом аналогичны. Таким образом свойства ионных каналов растений не уникальны и в перспективе клетки растений могут быть использованы в качестве тест объекта для изучения мембранотропных эффектов различных веществ, отбора биологически активных потенциальных лекарственных препаратов, и для скрининга уже используемых.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Катаев, Анатолий Ахсарбекович, Пущино

1. Александров А.А., Берестовский Г.Н., Волкова С.П., Востриков И.Ю., Жерелова О.М., Кравчик С., Луневский В.З. 1976. Реконструкция одиночного кальций-натриевого канала клеток в липидный бислой. ДАН СССР. 227, 723-726.

2. Берестовский Т.Н., Востриков И.Я., Луневский В.З. 1976. Ионные каналы тонопласта клеток харовых водорослей. Роль ионов кальция в возбуждении. Биофизика 21: №5, с. 829-833.

3. Берестовский Г.Н., Жерелова О.М., Катаев А.А. 1987. Ионные каналы клеток харовых водорослей. Биофизика 32: с. 1011-1027.

4. Берестовский Г.Н., Катаев А.А., Цыганов М.А. Переходные токи и релаксация Са2+ -градиента в клетках харовых водорослей: теория и эксперимент. Биофизика, 2006, Т.51, №6. 991-1000.

5. Волков Г.А. 1979. Активация возбудимых кальциевых и хлорных каналов плазмалеммы клеток Nitellaflexilis. Ионный транспорт в растениях. Киев, Наукова думка: с. 14-18.

6. Волкова С.П., Луневский В.З., Спиридонов Н.А., Винокуров М.Г. 1980. Химический состав кальциевых каналов клеток харовых водорослей. Биофизика. Т.25, 537-542.

7. Дриняев В.А., Кругляк Е.Б., Мосин В.Л. 1999Авермектин- С: физико -химические и биологические свойства. Прикладная биохимия микробиология. Т.35, №2, С. 199-205.

8. Жерелова О.М., Катаев А.А., Берестовский Г.Н. 1987. Регуляция кальциевых каналов плазмалеммы Nitellopsis obtusa внутриклеточным кальцием. Биофизика, т.32, №.2, с .348-350.

9. Жерелова О.М., Белевич Г.В., Берестовский Г.Н., Дубур Т.Я. 1990. Влияние производных 1,4- дигидропиридина на Са2+- токи плазмалеммы клеток харовой водоросли Nitellopsis obtusa. Биол. Мембр. 7: с. 36-40.

10. Жерелова О.М., Катаев А.А., Берестовский Г.Н. 1987. О необходимости АТФ и Mg для поддержания функциональной активности кальциевых каналов клеток харовых водорослей. Докл. АН СССР 281: с. 183-186.

11. Зинченко В.П., Долгачева Л.П. 2003. Внутриклеточная сигнализация. Электронная версия учебного пособия. Подготовлена в электронном издательстве «Аналитическая микроскопия». Пущино 2003.

12. Катаев А.А., Жерелова О.М., Берестовский Г.Н. Влияние заряженных местных анестетиков на инактивацию хлорных каналов харовой водоросли. Биофизика, 1988, т.З, № 6, с. 1006-1011.

13. Катаев А.А., Александров А.А., Тихонова Л.И., Берестовский Г.Н. 1993. Частотозависимое влияние миллиметровых электромагнитных волн на ионные токи водоросли Nitellopsis. Нетепловые эффекты. Биофизика 38: с. 446-461.

14. Костюк П.Г., Дорошенко П.А., Мартынюк А. 1984. Биол. мембраны. № I.e. 18.

15. Луневский В.З., Жерелова О.М., Александров А.А., Винокуров М.Г., Берестовский Г.Н. 1980. Модель селективного фильтра кальциевого канала клеток харовой водоросли. Биофизика 25: с. 685-691.

16. Опритов В.А., Пятыгин С.С., Ретивин В.Г. 1991. Биоэлектрогенез у высших растений. Москва, Наука. С. 216.

17. Плакс А.В., Соколик А.И., Юрин В.М. 1987. О транспортных свойствах плазмалеммы клеток Nitellaflexilis. Физиология растений 34: с. 335-341.

18. Соколик А.И., Юрин В.М. 1981. Транспортные свойства калиевых каналов плазмалеммы клеток Nitella в состоянии покоя. Физиология растений 28: с. 294-302.

19. Allen,GJ. & Sanders,D. 1996. Control of ionic currents in guard cell vacuoles by cytosolic and luminal calcium. Plant J., 10, 1055-1069.

20. Andjus,P.R., Kataev,A.A., Alexandrov,A.A., Vucelic,D. & Berestovsky,G.N. 1994b. D20-induced ion channel activation in Characeae at low ionic strength. J. Membr. Biol., 142, 43-53.

21. Angermann,J.E., Sanguinetti,A.R., Kenyon,J.L., Leblanc,N. &1. О I

22. Greenwood,I. A. 2006. Mechanism of the inhibition of Ca -activated CIcurrents by phosphorylation in pulmonary arterial smooth muscle cells. J. Gen. Physiol, 128, 73-87.

23. Asahina,T., Kawano,S., Umino,M. & Hiraoka,M. 1998. Effects of propofol on a Ca2+-activated CI- current in rabbit ventricular myocytes. J. Med. Dent. Sci., 45, 177-184.

24. Avdonin,P.V. & Tkachuk,V.A. 1978. Participation of Ca2+ activator in regulating the activity of cardiac adenylate cyclase by calcium ions. Dokl. Akad. Nauk SSSR, 238, 726-729.

25. Ayar,A., Storer,C., Tatham,E.L. & Scott,R.H. 1999. The effects of changing intracellular Ca2+ buffering on the excitability of cultured dorsal root ganglion neurones. Neurosci. Lett., 271, 171-174.

26. Baker,P.F., Hodgkin,A.L. & Shaw,T.I. 1961. Replacement of protoplasm of a giant nerve fibre with artificial solutions. Nature, 190, 885-887.

27. Barish,M.E. 1983. A transient calcium-dependent chloride current in the immature Xenopus oocyte. J. Physiol, 342, 309-325.

28. Barish,M.E. 1991. Voltage-gated calcium currents in cultured embryonic Xenopus spinal neurones. J. Physiol, 444, 523-543.

29. Barsanti,C., Pellegrini,M. & Pellegrino,M. 2006. Regulation of the mechanosensitive cation channels by ATP and cAMP in leech neurons. Biochim. Biophys. Acta, 1758, 666-672.

30. Beilby,M J. 2007. Action potential in charophytes. Int. Rev. Cytol., 257, 4382.

31. Beilby,M.J. & Shepherd,V.A. 2006. The characteristics of Ca -activated Cl-channels of the salt-tolerant charophyte Lamprothamnium. Plant Cell Environ., 29, 764-777.

32. Berestovsky,G.N. & Kataev,A.A. 2005. Voltage-gated calcium and Ca24*activated chloride channels and Ca transients: voltage-clamp studies of perfused and intact cells of Chara. Eur. Biophys. J., 34, 973-986.

33. Berridge,MJ., Bootman,M.D. & Roderick,H.L. 2003. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 4, 517529.

34. Bertl,A., Gradmann,D. & Slayman,C.L. 1992. Calcium- and voltage-dependent ion channels in Saccharomyces cerevisiae. Philos. Trans. R. Soc. LondB Biol. Sci., 338, 63-72.

35. Biskup,B., Gradmann,D. & Thiel,G. 1999. Calcium release from InsP3-sensitive internal stores initiates action potential in Chara. FEBS Lett., 453, 72-76.

36. Bisson,M.A., Beilby,M.J. & Shepherd,V.A. 2006. Electrophysiology of turgor regulation in marine siphonous green algae. J. Membr. Biol., 211, 114.

37. Blatt,M.R. 2000. Ca2+ signalling and control of guard-cell volume in stomatal movements. Curr. Opin. Plant Biol., 3, 196-204.

38. Bleich,E.M., Leonhard-Marek,S., Beyerbach,M. & Breves,G. 2007. Characterisation of chloride currents across the proximal colon in CftrTgH(neoim)lHgu congenic mice. J. Comp Physiol B., 177, 61-73.

39. Bock,A., Krieger-Liszkay,A., Beitia Ortiz,d.Z., I & Schonknecht,G. 2001. CI- channel inhibitors of the arylaminobenzoate type act as photosystem II herbicides: a functional and structural study. Biochemistry, 40, 3273-3281.

40. Boucher,R.C. 1994. Human airway ion transport. Part one. Am. J. Respir. Crit Care Med., 150, 271-281.

41. Bowman,C.L., Gottlieb,P.A., Suchyna,T.M., Murphy,Y.K. & Sachs,F. 2007. Mechanosensitive ion channels and the peptide inhibitor GsMTx-4: history, properties, mechanisms and pharmacology. Toxicon, 49, 249-270.

42. Brini,M. & Carafoli,E. 2000. Calcium signalling: a historical account, recent developments and future perspectives. Cell Mol. Life Sci., 57, 354-370.

43. Brito-Argaez,L., Canto-Canche,B., Hernandez-Sotomayor,S.M., Martinez-Estevez,M. & Pottosin,I.I. 2008. Patch clamp characterization of a nonselective cation channel of ER membranes purified from Beta vulgaris taproots. Physiol Plant, 132, 399-406.

44. Bulychev,A.A., Zykov,S.V., Rubin,A.B. & Muller,S.C. 2003. Transitions from alkaline spots to regular bands during pH pattern formation at the plasmalemma of Chara cells. Eur. Biophys. J., 32, 144-153.

45. Camacho,J., Sanchez,A., Stuhmer,W. & Pardo,L.A. 2000. Cytoskeletal interactions determine the electrophysiological properties of human EAG potassium channels. Pflugers Arch., 441, 167-174.

46. Cantiello,H.F. 1995. Role of the actin cytoskeleton on epithelial Na+ channel regulation. Kidney Int., 48, 970-984.

47. Carafoli,E. & Brini,M. 2000. Calcium pumps: structural basis for and mechanism of calcium transmembrane transport. Curr. Opin. Chem. Biol., 4, 152-161.

48. Chen,C., Houchi,H., Tamald,T. & Nakaya,Y. 1998. Effects of cytosolic ATP and other nucleotides on Ca -activated К channels in cultured bovine adrenal chromaffin cells. Eur. J. Pharmacol., 350, 293-299.

49. Chien,L.T., Zhang,Z.R. & Hartzell,H.C. 2006. Single CI- channels activated by Ca in Drosophila S2 cells are mediated by bestrophins. J. Gen. Physiol, 128, 247-259.

50. Cooper,C.L., Vandaele,S., Barhanin,!, Fosset,M., Lazdunski,M. & Hosey,M.M. 1987. Purification and characterization of the dihydropyridine-sensitive voltage-dependent calcium channel from cardiac tissue. J. Biol. Chem., 262, 509-512.

51. Cosgrove,DJ. & Hedrich,R. 1991. Stretch-activated chloride, potassium, and calcium channels coexisting in plasma membranes of guard cells of Vicia fabaL. Planta, 186, 143-153.

52. Demidchik,V., Sokolik,A. & Yurin,V. 1997. The Effect of Cu2+ on Ion Transport Systems of the Plant Cell Plasmalemma. Plant Physiol, 114, 13131325.

53. Dias,J.M., Szegedi,C., Jona,I. & Vogel,P.D. 2006. Insights into the regulation of the ryanodine receptor: differential effects of Mg2+ and Ca2+ on ATP binding. Biochemistry, 45, 9408-9415.

54. Ding,J.P. & Pickard,B.G. 1993. Mechanosensory calcium-selective cation channels in epidermal cells. Plant J., 3, 83-110.

55. Etherton,B., Heppner,T.J., Cumming,J.R. & Nelson,M.T. 2004. Opposing effects of aluminum on inward-rectifier potassium currents in bean root-tip protoplasts. J. Membr. Biol., 198, 15-22.

56. Fischmeister,R. & Hartzell,H.C. 2005. Volume sensitivity of the bestrophin family of chloride channels. J. Physiol, 562, 477-491.

57. Fraser,C.L. & Sarnacki,P. 1990. Inositol 1,4,5-trisphosphate may regulate rat• • -f- •brain Cai++ by inhibiting membrane bound Na Ca exchanger. J. Clin. Invest, 86,2169-2173.

58. Frings,S., Reuter,D. & Kleene,S.J. 2000. Neuronal Ca2+ -activated Cl-channels—homing in on an elusive channel species. Prog. Neurobiol., 60, 247-289.

59. Frizzell,R.A., Halm,D.R., Rechkemmer,G. & Shoemaker,R.L. 1986a. Chloride channel regulation in secretory epithelia. Fed. Proc., 45, 2727-2731.

60. Frizzell,R.A., Rechkemmer,G. & Shoemaker,R.L. 1986b. Altered regulation of airway epithelial cell chloride channels in cystic fibrosis. Science, 233, 558-560.

61. Fukuda,J., Kameyama,M. & Yamaguchi,K. 1981. Breakdown of cytoskeletal filaments selectively reduces Na and Ca spikes in cultured mammal neurones. Nature, 294, 82-85.

62. Gasbarrini,A., Borle,A.B. & Van Thiel,D.H. 1993. Ca2+ antagonists do not protect isolated perfused rat hepatocytes from anoxic injury. Biochim. Biophys. Acta, 1177, 1-7.

63. Giles,K.R., Humphries,M., Abell,A. & Garrill,A. 2003. The synthesis of NPPB and NPBB by reductive amination and the effects of these compounds on K+ channels of the alga Nitella hookeri. Bioorg. Med. Chem. Lett., 13, 293-295.

64. Gilroy,S., Fricker,M.D., Read,N.D. & Trewavas,AJ. 1991. Role of Calcium in Signal Transduction of Commelina Guard Cells. Plant Cell, 3, 333-344.

65. Gomez-Hernandez, J.M., Lorra,C., Pardo,L.A., Stuhmer,W., Pongs,O., Heinemann,S.H. & Elliott,A.A. 1997. Molecular basis for different pore properties of potassium channels from the rat brain Kvl gene family. Pflugers Arch., 434, 661-668.

66. Greenwood,I.A. & Leblanc,N. 2007. Overlapping pharmacology of Ca -activated CI- and K+ channels. Trends Pharmacol. Sci., 28, 1-5.

67. Grubb,B.R. & Gabriel,S.E. 1997. Intestinal physiology and pathology in gene-targeted mouse models of cystic fibrosis. Am. J. Physiol, 273, G258-G266.

68. Gustin,M.C., Zhou,X.L., Martinac,B. & Kung,C. 1988. A mechanosensitive ion channel in the yeast plasma membrane. Science, 242, 762-765.

69. Hallen,H.E. & Trail,F. 2008. The L-type calcium ion channel cchl affects ascospore discharge and mycelial growth in the filamentous fungus Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum). Eukaryot. Cell, 7, 415424.

70. Hamilton,D.W., Hills,A., Kohler,B. & Blatt,M.R. 2000. Ca2+ channels at the plasma membrane of stomatal guard cells are activated by hyperpolarization and abscisic acid. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 97, 4967-4972.

71. Hartzell,C., Putzier,I. & Arreola,J. 2005. Calcium-activated chloride channels. Annu. Rev. Physiol, 67, 719-758.

72. Harvey,H.J., Venis,M.A. & Trewavas,AJ. 1989. Partial purification of a protein from maize (Zea mays) coleoptile membranes binding the Ca -channel antagonist verapamil. Biochem. J., 257, 95-100.

73. Hedrich,R. & Jeromin,A. 1992. A new scheme of symbiosis: ligand- and voltage-gated anion channels in plants and animals. Philos. Trans. R. Soc. bond В Biol. Sci., 338, 31-38.

74. Hedrich,R. & Kurkdjian,A. 1988. Characterization of an anion-permeable channel from sugar beet vacuoles: effect of inhibitors. EMBO J., 7, 36613666.

75. Hedrich,R. & Marten,I. 2006. 30-year progress of membrane transport in plants. Planta, 224, 725-739.

76. Hegemann,P., Neumeier,K., Hegemann,U. & Kuehnle,E. 1990. The role of calcium in Chlamydomonas photomovement responses as analysed by calcium channel inhibitors. Photochem. Photobiol., 52, 575-583.

77. Heidecker,M., Wegner,L.H. & Zimmermann,U. 1999. A patch-clamp study of ion channels in protoplasts prepared from the marine alga Valonia utricularis. J. Membr. Biol., 172, 235-247.

78. Hirayama,Y., Kuruma,A., Hiraoka,M. & Kawano,S. 2002. Calcium-activated CL- current is enhanced by acidosis and contributes to the shortening of action potential duration in rabbit ventricular myocytes. Jpn. J. Physiol, 52, 293-300.

79. Homann,U. & Thiel,G. 1994. CI- and K+ channel currents during the action potential in Chara. Simultaneous recording of membrane voltage and patch currents. J. Membr. Biol., 141, 297-309.

80. Hosey,M.M. & Lazdunski,M. 1988. Calcium channels: molecular pharmacology, structure and regulation. J. Membr. Biol., 104, 81-105.

81. Hu,Z., Dun,X., Zhang,M., Zhu,H., Xie,L., Wu,Z., Chen,Z. & Xu,T. 2007.1. V l О 4

82. PA lb, a plant peptide, induces intracellular Ca . increase via Ca influxл ithrough the L-type Ca channel and triggers secretion in pancreatic beta cells. Sci. China C. Life Sci., 50, 285-291.

83. Hug,Т., Koslowsky,T., Ecke,D., Greger,R. & Kunzelmann,K. 1995. Actin-dependent activation of ion conductances in bronchial epithelial cells. Pflugers Arch., 429, 682-690.

84. Hume,J.R., Duan,D., Collier,M.L., Yamazaki,J. & Horowitz,B. 2000. Anion transport in heart. Physiol Rev., 80, 31-81.

85. Iwabuchi,K., Kaneko,T. & Kikuyama,M. 2008. Mechanosensitive ion channels in chara: influence of water channel inhibitors, HgCb and ZnCl2, on generation of receptor potential. J. Membr. Biol., 221, 27-37.

86. Iwata,S. 1985. Calcium-pump and its modulator in the lens: a review. Curr. Eye Res., 4,299-305.

87. Jin,Q., Scherp,P., Heimann,K. & Hasenstein,K.H. 2008. Auxin and cytoskeletal organization in algae. Cell Biol. Int., 32, 542-545.

88. Johannes,E., Crofts,A. & Sanders,D. 1998. Control of CI- efflux in chara1. Л Icorallina by cytosolic pH, free ca , and phosphorylation indicates a role of plasma membrane anion channels in cytosolic pH regulation. Plant Physiol, 118, 173-181.

89. Karkanis,T., DeYoung,L., Brock,G.B. & Sims,S.M. 2003. Ca2+-activated Cl-channels in corpus cavernosum smooth muscle: a novel mechanism for control of penile erection. J. Appl. Physiol, 94, 301-313.

90. Kataev,A.A., Zherelova,O.M. & Berestovsky,G.N. 1984. Ca2+-induced activation and irreversible inactivation of chloride channels in the perfused plasmalemma of Nitellopsis obtusa. Gen. Physiol Biophys., 3, 447-462.

91. Katsuhara,M., Mimura,T. & Tazawa,M. 1990. ATP-Regulated Ion Channels in the Plasma Membrane of a Characeae Alga, Nitellopsis obtusa. Plant Physiol, 93, 343-346.

92. Kawano,S., Hirayama,Y. & Hiraolca,M. 1995. Activation mechanism of Ca -sensitive transient outward current in rabbit ventricular myocytes. J. Physiol, 486 (Pt3), 593-604.

93. Kawano,S., Kuruma,A., Hirayama,Y. & Hiraoka,M. 1999. Anion permeability and conduction of adenine nucleotides through a chloride channel in cardiac sarcoplasmic reticulum. J. Biol. Chem., 274, 2085-2092.

94. Kawano,T., Kadono,T., Fumoto,K., Lapeyrie,F., Kuse,M., Isobe,M., Furuichi,T. & Muto,S. 2004. Aluminum as a specific inhibitor of plant TPC124"

95. Ca channels. Biochem. Biophys. Res. Commun., 324, 40-45.

96. Kazachenko,V.N. & Geletyuk,V.I. 1984. The potential-dependent K+ channel in molluscan neurones is organized in a cluster of elementary channels. Biochim. Biophys. Acta, 773, 132-142.

97. Keller,B.U., Hedrich,R., Vaz,W.L. & Criado,M. 1988. Single channel recordings of reconstituted ion channel proteins: an improved technique. Pflugers Arch., 411, 94-100.л I

98. Kikuyama,M. 2001. Role of Ca in membrane excitation and cell motility in Characean cells as a model system. Int. Rev. Cytol., 201, 85-114.

99. Kikuyama,M. & Tazawa,M. 1976. Tonoplast action potential in Nitella in relation to vacuolar chloride concentration. J. Membr. Biol., 29, 95-110.

100. Kimura,Y., Toyoshima,N., Hirakawa,N., Okamoto,K. & Ishijima,A. 2003. A kinetic mechanism for the fast movement of Chara myosin. J. Mol. Biol., 328, 939-950.

101. Kinoshita,Т., Nishimura,M. & Shimazaki,K. 1995. Cytosolic Concentration of Ca2+ Regulates the Plasma Membrane H+-ATPase in Guard Cells of Fava Bean. Plant Cell, 7, 1333-1342.

102. Kitasato,H. 1973. К permeability of Nitella clavata in the depolarized state. J. Gen. Physiol, 62, 535-549.

103. Kitasato,H. & Murayama,K. 1973. Proceedings: 40. The analysis of the K-permeation in terms of affinity and the maximum number of channels. Nippon Seirigaku Zasshi, 35, 398.

104. Kolb,H.A., Marten,I. & Hedrich,R. 1995. Hodgkin-Huxley analysis of a GCAC1 anion channel in the plasma membrane of guard cells. J. Membr. Biol., 146, 273-282.

105. Koppenhofer,E. 1976. Electrical responses of isolated Nitella protoplasm-excitations or artifacts? Pflugers Arch., 361, 263-267.

106. Kostiuk,P.G. 1984. Calcium ion channels in the cell membrane. Fiziol. Zh. SSSR Im I. M. Sechenova, 70, 1081-1091.

107. Kostuk,W.J. & Pflugfelder,P. 1987. Comparative effects of calcium entry-blocking drugs, beta-blocking drugs, and their combination in patients with chronic stable angina. Circulation, 75, V114-V121.

108. Kostyuk,P.G. & Doroshenko,P.A. 1990. Modulation of calcium channel function in nerve cell membrane. Gen. Physiol Biophys., 9, 433-443.

109. Kourie,J.I. 1994. Transient CI- and K+ Currents during the Action Potential in Chara inflata (Effects of External Sorbitol, Cations, and Ion Channel Blockers). Plant Physiol, 106, 651-660.

110. Krupenina,N.A. & Bulychev,A.A. 2007. Action potential in a plant cell lowers the light requirement for non-photochemical energy-dependent quenching of chlorophyll fluorescence. Biochim. Biophys. Acta, 1767, 781788.

111. Kumamoto,C.A. 2008. Molecular mechanisms of mechanosensing and their roles in fungal contact sensing. Nat. Rev. Microbiol.

112. Kuruma,A. & Hartzell,H.C. 1999. Dynamics of calcium regulation of chloride currents in Xenopus oocytes. Am. J. Physiol, 276, C161-C175.

113. Lalonde,M.R., Kelly,M.E. & Barnes,S. 2008. Calcium-activated chloride channels in the retina. Channels (Austin. ), 2, 252-260.

114. Langer,M.G. 2007. Mechanosensitive Ion Channels Investigated Simultaneously by Scanning Probe Microscopy and Patch Clamp. Methods Mol. Biol., 403, 141-164.

115. Large,W.A. & Wang,Q. 1996. Characteristics and physiological role of theI

116. Ca -activated CI- conductance in smooth muscle. Am. J. Physiol, 271, C435-C454.

117. Laus,M.N., Soccio,M., Trono,D., Cattivelli,L. & Pastore,D. 2008. Plant inner membrane anion channel (PIMAC) function in plant mitochondria. Plant Cell Physiol, 49, 1039-1055.

118. Lebaudy,A., Very,A.A. & Sentenac,H. 2007. K+ channel activity in plants: genes, regulations and functions. FEBS Lett., 581, 2357-2366.

119. Lecourieux,D., Mazars,C., Pauly,N., Ranjeva,R. & Pugin,A. 2002. Analysis and effects of cytosolic free calcium increases in response to elicitors in Nicotiana plumbaginifolia cells. Plant Cell, 14, 2627-2641.

120. Ledoux,J., Greenwood,I.A. & Leblanc,N. 2005. Dynamics of Ca2+-dependent CI- channel modulation by niflumic acid in rabbit coronary arterial myocytes. Mol. Pharmacol., 67, 163-173.

121. Lee,J.H., Jeong,S.M., Lee,B.H., Kim,J.H., ICo,S.R., Kim,S.H., Lee,S.M. &• 2+ Nah,S.Y. 2005. Effect of calmodulin on ginseng saponin-induced Ca activated CI- channel activation in Xenopus laevis oocytes. Arch. Pharm.1. Res., 28, 413-420.

122. Levitsky,D.I., Khvorov,N.V., Shnyrov,V.L., Vedenkina,N.S., Permyakov,E.A. & Poglazov,B.F. 1990. Domain structure of myosin subfragment-1. Selective denaturation of the 50 kDa segment. FEBS Lett., 264, 176-178.

123. Liu,D., Tu,L., Wang,L., Li,Y., Zhu,L. & Zhang,X. 2008. Characterization and expression of plasma and tonoplast membrane aquaporins in elongating cotton fibers. Plant Cell Rep., 27, 1385-1394.

124. Liu,K. & Luan,S. 2001. Internal aluminum block of plant inward K(+) channels. Plant Cell, 13, 1453-1465.

125. Liu,X., Shi,W.L., Zhang,S.Q. & Lou,C.H. 2005. Calcium involved in the signaling pathway of jasmonic acid induced stomatal closure of Vicia faba L. Shi Yan. Sheng Wu Xue. Bao., 38, 297-302.

126. Lunevskii,V.Z., Zherelova,O.M., Aleksandrov,A.A., Vinokurov,M.G. & Berestovskii,G.N. 1980. Model of the selective calcium channel of characean algae. Biofizika, 25, 685-691.

127. Lunevsky,V.Z., Zherelova,O.M. & Vostrikov,I.Y.B.G.N. 1983. Excitation of Characeae cell membranes as a result of activation of calcium and chloride channels. J. Membrane Biol., 72, 43-58.

128. Marin,B.P. & Gidrol,X. 1985. Chloride-ion stimulation of the tonoplast H+-translocating ATPase from Hevea brasiliensis (rubber tree) latex. A dual mechanism. Biochem. J., 226, 85-94.

129. Marten,H., Konrad,K.R., Dietrich,P., Roelfsema,M.R. & Hedrich,R. 2007. Ca2+-dependent and -independent abscisic acid activation of plasma membrane anion channels in guard cells of Nicotiana tabacum. Plant Physiol, 143,28-37.

130. Marten,I., Zeilinger,C., Redhead,C., Landry,D.W., al-Awqati,Q. & Hedrich,R. 1992. Identification and modulation of a voltage-dependent anion channel in the plasma membrane of guard cells by high-affinity ligands. EMBO J., 11,3569-3575.

131. Martinac,B., Adler,J. & Kung,C. 1990. Mechanosensitive ion channels of E. coli activated by amphipaths. Nature, 348, 261-263.

132. Martinez-Pinna,J., McLachlan,E.M. & Gallego,R. 2000. Distinct mechanisms• "I* 2+for activation of CI- and К currents by Ca from different sources in mouse sympathetic neurones. J. Physiol, 527 Pt 2, 249-264.

133. Matsumoto,G., Kobayashi,T. & Sakai,H. 1979. Restoration of the excitability of squid giant axon by tubulin-tyrosine ligase and microtubule proteins. J. Biochem., 86, 1155-1158.

134. Matsumoto,G. & Sakai,H. 1979. Restoration of membrane excitability of squid giant axons by reagents activating tyrosine-tubulin ligase. J. Membr. Biol., 50, 15-22.

135. Matveyeva,N.P., Andreyuk,D.S. & Yermakov,I.P. 2003. Transport of Cl-across the plasma membrane during pollen grain germination in tobacco. Biochemistry (Mosc. ), 68, 1247-1251.

136. Mazars,C., Thion,L., Thuleau,P., Graziana,A., Knight,M.R., Moreau,M. & Ranjeva,R. 1997. Organization of cytoskeleton controls the changes in cytosolic calcium of cold-shocked Nicotiana plumbaginifolia protoplasts. Cell Calcium, 22,413-420.

137. McAinsh,M.R. & Staxen,I. 1999. Measurement of cytosolic-free Ca2+ in plant tissue. Methods Mol. Biol., 114, 307-321.

138. McCulloch,S.R., Beilby,M.J. & Walker,N.A. 1990. Transport of potassium in Chara australis: II. Kinetics of a symport with sodium. J. Membr. Biol., 115, 129-143.

139. Meldolesi,J. & Pozzan,T. 1998. The endoplasmic reticulum Ca2+ store: a view from the lumen. Trends Biochem. Sci., 23, 10-14.

140. Miao,Y., Lv,D., Wang,P., Wang,X.C., Chen,J., Miao,C. & Song,C.P. 2006. An Arabidopsis glutathione peroxidase functions as both a redox transducer and a scavenger in abscisic acid and drought stress responses. Plant Cell, 18, 2749-2766.

141. Miledi,R. 1982. A calcium-dependent transient outward current in Xenopus laevis oocytes. Proc. R. Soc. bond В Biol. Sci., 215, 491-497.

142. Montague,M J. 1993. Calcium Antagonists Inhibit Sustained Gibberellic Acid-Induced Growth of Avena (Oat) Stem Segments. Plant Physiol, 101, 399-405.

143. Morris,C.E. & Sigurdson,W.J. 1989. Stretch-inactivated ion channels coexist with stretch-activated ion channels. Science, 243, 807-809.

144. Muallem,S., Pandol,S.J. & Beeker,T.G. 1989. Modulation of agonist-activated calcium influx by extracellular pH in rat pancreatic acini. Am. J. Physiol, 257, G917-G924.

145. Nathan,Т., Jensen,M.S. & Lambert,J.D. 1990. The slow inhibitory postsynaptic potential in rat hippocampal CA1 neurones is blocked by intracellular injection of QX-314. Neurosci. Lett., 110, 309-313.

146. Ogura,T. & Obara,S. 1993. Chloride current observed as calcium-gated tail current in trigeminal root ganglion neurons of the marine catfish, Plotosus. Brain Res., 621, 10-16.

147. Oikawa,T., Spvrofoulos,C.S., Tasaki,I. & Teorell,T. 1961. Methods for perfusing the giant axon of Loligo pealii. Ada Physiol. Scand., 52, 195-196.

148. Pilot,G., Lacombe,B., Gaymard,F., Cherel,I., Boucherez,J., Thibaud,J.B. & Sentenac,H. 2001. Guard cell inward K+ channel activity in arabidopsis involves expression of the twin channel subunits KAT1 and KAT2. J. Biol. Chem., 276,3215-3221.

149. Pineros,M. & Tester,M. 1997. Characterization of the high-affinity verapamil binding site in a plant plasma membrane Ca -selective channel. J. Membr. Biol., 157, 139-145.

150. Pineros,M.A. & Kochian,L.V. 2003. Differences in whole-cell and single-channel ion currents across the plasma membrane of mesophyll cells from two closely related Thlaspi species. Plant Physiol, 131, 583-594.

151. Plant,P. J., Gelli,A. & BlumwaldJE. 1994. Vacuolar chloride regulation of an anion-selective tonoplast channel. J. Membr. Biol., 140, 1-12.

152. Plieth,C. 1999. Temperature sensing by plants: calcium-permeable channels as primary sensors—a model. J. Membr. Biol., 172, 121-127.

153. Poovaiah,B.W., Reddy,A.S. & McFadden,J.J. 1987. Calcium messenger system: role of protein phosphorylation and inositol bisphospholipids. Physiol Plant, 69, 569-573.

154. Pottosin,I.I. 1992. Probing of pore in the Chara gymnophylla K+ channel by blocking cations and by streaming potential measurements. FEBS Lett., 298, 253-256.

155. Pottosin,I.I. & Schonknecht,G. 2007. Vacuolar calcium channels. J. Exp. Bot.,58, 1559-1569.

156. Pottosin,I.I. & Schonknecht,G. 1995. Patch clamp study of the voltage-dependent anion channel in the thylakoid membrane. J. Membr. Biol., 148, 143-156.

157. Proseus,T.E. & Boyer,J.S. 2006. Periplasm turgor pressure controls wall deposition and assembly in growing Chara corallina cells. Ann. Bot. (Lond), 98, 93-105.

158. Proseus,T.E. & Boyer,J.S. 2007. Tension required for pectate chemistry to control growth in Chara corallina. J. Exp. Bot., 58, 4283-4292.

159. Qu,Z., Wei,R.W. & Hartzell,H.C. 2003. Characterization of Ca2+-activated CI- currents in mouse kidney inner medullary collecting duct cells. Am. J. Physiol Renal Physiol, 285, F326-F335.

160. Reddy,M.M., Wang,X.F. & Quinton,P.M. 2008. Effect of Cytosolic pH on Epithelial Na(+) Channel in Normal and Cystic Fibrosis Sweat Ducts. J. Membr. Biol.

161. Roberts,S.K. 2006. Plasma membrane anion channels in higher plants and their putative functions in roots. New Phytol., 169, 647-666.

162. Roelfsema,M.R., Levchenko,V. & Hedrich,R. 2004. ABA depolarizes guard cells in intact plants, through a transient activation of R- and S-type anion channels. Plant J., 37, 578-588.

163. Sakai,H. & Matsumoto,G. 1978. Tubulin and other proteins from squid giant axon. J. Biochem., 83, 1413-1422.

164. Schmidt,С. & Schroeder,J.I. 1994. Anion Selectivity of Slow Anion Channels in the Plasma Membrane of Guard Cells (Large Nitrate Permeability). Plant Physiol, 106, 383-391.

165. Schroeder,J.I. 2003. Knockout of the guard cell K+ out channel and stomatal movements. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 100, 4976-4977.

166. Schroeder,J.I. 1995. Anion channels as central mechanisms for signal transduction in guard cells and putative functions in roots for plant-soil interactions. Plant Mol. Biol., 28, 353-361.

167. Schroeder,J.I. & Hedrich,R. 1989. Involvement of ion channels and active transport in osmoregulation and signaling of higher plant cells. Trends Biochem. Sci., 14, 187-192.

168. Schroeder,J.I. & Keller,В.U. 1992. Two types of anion channel currents in guard cells with distinct voltage regulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 89, 5025-5029.

169. Schroeder,J.I., Raschke,K. & Neher,E. 1987. Voltage dependence of К channels in guard-cell protoplasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 84, 41084112.

170. Schroeder,J.I., Schmidt,C. & Sheaffer,J. 1993. Identification of High-Affinity Slow Anion Channel Blockers and Evidence for Stomatal Regulation by Slow Anion Channels in Guard Cells. Plant Cell, 5, 1831-1841.

171. Schwarz,M., Gross,A., Steinkamp,T., Flugge,U.I. & Wagner,R. 1994. Ion channel properties of the reconstituted chloroplast triose phosphate/phosphate translocator. J. Biol. Chem., 269, 29481-29489.

172. Shabala,S. & Cuin,T.A. 2008. Potassium transport and plant salt tolerance. Physiol Plant, 133, 651-669.

173. Shepherd,V.A., Beilby,M.J., Al Khazaaly,S.A. & Shimmen,T. 2008. Mechano-perception in Chara cells: the influence of salinity and calcium on touch-activated receptor potentials, action potentials, and ion transport. Plant Cell Environ.

174. Shepherd,V.A., Beilby,MJ. & Shimmen,T. 2002. Mechanosensory ion channels in charophyte cells: the response to touch and salinity stress. Eur. Biophys. J., 31, 341-355.

175. Shimmen,T., Mimura,T., Kikuyama,M. & Tazawa,M. 1994. Characean cells as a tool for studying electrophysiological characteristics of plant cells. Cell Struct. Funct., 19, 263-278.

176. Shoemaker,R.L., Frizzell,R.A., Dwyer,T.M. & Farley,J.M. 1986. Single chloride channel currents from canine tracheal epithelial cells. Biochim. Biophys. Acta, 858, 235-242.

177. Sigova,A.A., Zinchenko,V.P. & Kaimachnikov,N.P. 2000. Ca2+ dependence of Ca2+ release from intracellular stores of intact and permeabilized Ehrlich ascites tumour cells. Membr. Cell Biol., 14, 263-275.

178. Sinvany-Villalobo,G., Davydov,0., Ben-Ari,G., Zaltsman,A., Raskind,A. & Adam,Z. 2004. Expression in multigene families. Analysis of chloroplast and mitochondrial proteases. Plant Physiol, 135, 1336-1345.

179. Srivastava,A., Romanenko,V.G., Gonzalez-Begne,M., Catalan,M.A. & Melvin,J.E. 2008. A variant of the Ca2+-activated CI channel Best3 is expressed in mouse exocrine glands. J. Membr. Biol., 222, 43-54.

180. Stewart,G.S., Glanville,M., Aziz,0., Simmons,N.L. & Gray,M.A. 2001. Regulation of an outwardly rectifying chloride conductance in renal epithelial cells by external and internal calcium. J. Membr. Biol., 180, 49-64.

181. Sullivan,M.J., Sharma,R.V., Wachtel,R.E., Chapleau,M.W., Waite,L.J., Bhalla,R.C. & Abboud,F.M. 1997. Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons. Circ. Res., 80, 861-867.

182. Suzuki,M. & Mizuno,A. 2004. A novel human Cl(-) channel family related to Drosophila flightless locus. J. Biol. Chem., 279, 22461-22468.

183. Takahashi,T., Neher,E. & Sakmann,B. 1987. Rat brain serotonin receptors in Xenopus oocytes are coupled by intracellular calcium to endogenous channels. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 84, 5063-5067.

184. Takeshige,K. & Tazawa,M. 1989. Measurement of the Cytoplasmic and Vacuolar Buffer Capacities in Chara corallina. Plant Physiol, 89, 1049-1052.

185. Tavares,L.S., Santos,M.O., Viccini,L.F., Moreira,J.S., Miller,R.N. & Franco,O.L. 2008. Biotechnological potential of antimicrobial peptides from flowers. Peptides, 29, 1842-1851.

186. Taylor,A.R. & Brownlee,C. 2003. A novel CI- inward-rectifying current in the plasma membrane of the calcifying marine phytoplankton Coccolithus pelagicus. Plant Physiol, 131, 1391-1400.о I

187. Tazawa,M. & Kikuyama,M. 2003. Is Ca release from internal stores involved in membrane excitation in characean cells? Plant Cell Physiol, 44, 518-526.

188. Thiel,G. & Dityatev,A.E. 1998. Transient activity of excitatory CI- channels in Chara: evidence for quantal release of a gating factor. J. Membr. Biol., 163, 183-191.

189. Thion,L., Mazars,C., Thuleau,P., Graziana,A., Rossignol,M., Moreau,M. & Ranjeva,R. 1996. Activation of plasma membrane voltage-dependent calcium-permeable channels by disruption of microtubules in carrot cells. FEBSLett., 393, 13-18.

190. Thomine,S., Zimmermann,S., Guern,J. & Barbier-Brygoo,H. 1995. ATP-Dependent Regulation of an Anion Channel at the Plasma Membrane of Protoplasts from Epidermal Cells of Arabidopsis Hypocotyls. Plant Cell, 7, 2091-2100.

191. Thuleau,P., Ward,J.M., Ranjeva,R. & Schroeder,J.I. 1994. Voltage-dependent calcium-permeable channels in the plasma membrane of a higher plant cell. EMBO J., 13, 2970-2975.

192. Tinker,A. & Williams,A.J. 1993. Charged local anesthetics block ionic conduction in the sheep cardiac sarcoplasmic reticulum calcium release channel. Biophys. J., 65, 852-864.

193. Trebacz,K., Schonknecht,G., Dziubinska,H. & Hanaka,A. 2007. Characteristics of anion channels in the tonoplast of the liverwort Conocephalum conicum. Plant Cell Physiol, 48, 1747-1757.

194. Tretyn,A. 1999. Calcium-dependent signal transduction pathways in plants--phytochrome mechanism of action as an example. Pol. J. Pharmacol., 51, 145-151.

195. Trewavas,A. & Gilroy,S. 1991. Signal transduction in plant cells. Trends Genet., 7,356-361.

196. Tsai,T.Y., Wu,S.N., Liu,Y.C., Wu,A.Z. & Tsai,Y.C. 2005. Inhibitory action of L-type Ca current by paeoniflorin, a major constituent of peony root, in NG108-15 neuronal cells. Eur. J. Pharmacol., 523, 16-24.

197. Tsutsui,I. & Ohkawa,T. 2001. Regulation of the H+ pump activity in the plasma membrane of internally perfused Chara corallina. Plant Cell Physiol, 42, 531-537.

198. Vlerick,A., Rolland,N., Joyard,J., Ruysschaert,J.M. & Homble,F. 2003. Regulation of the anion channel of the chloroplast envelope from spinach. J. Bioenerg. Biomembr., 35, 221-229.

199. Wacke,M., Thiel,G. & Hutt,M.T. 2003. Ca2+ dynamics during membrane excitation of green alga Chara: model simulations and experimental data. J. Membr. Biol., 191,179-192.

200. Wang,H. & 01sen,R.W. 2000. Binding of the GAB A(A) receptor-associated protein (GABARAP) to microtubules and microfilaments suggests involvement of the cytoskeleton in GABARAPGABA(A) receptor interaction. J. Neurochem., 75, 644-655.

201. Wang,X. & Iino,M. 1998. Interaction of cryptochrome 1, phytochrome, and ion fluxes in blue-light-induced shrinking of Arabidopsis hypocotyl protoplasts. Plant Physiol, 117, 1265-1279.

202. Ward,J.M., Maser,P. & Schroeder,J.I. 2008. Plant Ion Channels: Gene Families, Physiology, and Functional Genomics Analysis. Annu. Rev. Physiol.

203. Ward,J.M., Pei,Z.M. & Schroeder,J.I. 1995. Roles of Ion Channels in Initiation of Signal Transduction in Higher Plants. Plant Cell, 7, 833-844.

204. White,P.J. 2000. Calcium channels in higher plants. Biochim. Biophys. Acta, 1465, 171-189.

205. White,P.J., Pineros,M., Tester,M. & Ridout,M.S. 2000. Cation permeability and selectivity of a root plasma membrane calcium channel. J. Membr. Biol., 174,71-83.

206. Wilke,R.A., Ahern,G.P. & Jackson,M.B. 1998. Membrane excitability in the neurohypophysis. Adv. Exp. Med. Biol., 449, 193-200.94220. Williamson,R.E. & Ashley,C.C. 1982. Free Ca and cytoplasmic streamingin the alga Chara. Nature, 296, 647-650.

207. Winpenny,J.P., Verdon,B., McAlroy,H.L., Colledge,W.H., Ratcliff,R., Evans,M.J., Gray,M.A. & Argent,B.E. 1995. Calcium-activated chloride conductance is not increased in pancreatic duct cells of CF mice. Pflugers Arch., 430,26-33.

208. Wray,S., Burdyga,T. & Noble,K. 2005. Calcium signalling in smooth muscle. Cell Calcium, 38, 397-407.

209. Wu,X., Davis,G.E., Meininger,G.A., Wilson,E. & Davis,M.J. 2001. Regulation of the L-type calcium channel by alpha 5beta 1 integrin requires signaling between focal adhesion proteins. J. Biol. Chem., 276, 30285-30292.

210. Yamazaki,K., Furukawa,Y., Nakano,H., Kasama,M., Imamura,H. & Chiba,S. 1995. Inhibition of the subsidiary pacemaker activity by zatebradine, an If inhibitor, in the anesthetized dog heart. J. Cardiovasc. Pharmacol., 26, 957964.

211. Ye,Q. & Steudle,E. 2006. Oxidative gating of water channels (aquaporins) in corn roots. Plant Cell Environ., 29, 459-470.

212. Yoshimura,K. 1998. Mechanosensitive channels in the cell body of Chlamydomonas. J. Membr. Biol., 166, 149-155.

213. Zhang,W.H., Ryan,P.R. & Tyerman,S.D. 2001. Malate-permeable channels and cation channels activated by aluminum in the apical cells of wheat roots. Plant Physiol, 125, 1459-1472.

214. Zhang,W.H., Walker,N.A., Patrick,J.W. & Tyerman,S.D. 2004b. Pulsing Cl-channels in coat cells of developing bean seeds linked to hypo-osmotic turgor regulation. J. Exp. Bot., 55, 993-1001.л I

215. Zherelova,O.M. 1989b. Protein kinase С is involved in regulation of Ca channels in plasmalemma ofNitella syncarpa. FEBS Lett., 242, 330-332.

216. Zimmermann,S., Nurnberger,T., Frachisse,J.M., Wirtz,W., Guern,J., Hedrich,R. & Scheel,D. 1997. Receptor-mediated activation of a plant Ca -permeable ion channel involved in pathogen defense. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 94, 2751-2755.

217. Zimmermann,U. & Steudle,E. 1974. The pressure-dependence of the hydraulic conductivity, the membrane resistance and membrane potential during turgor pressure regulation in Valonia utricularis. J. Membr. Biol., 16, 331-352.

218. Zinchenko,V.P. 2005. Physiology and psychology of activity. Usp. Fiziol. Nauk, 36, 102-109.

219. Zorec,R.; Tester,M.; Macek,P.; Mason,W.T. 1990. Cytotoxicity of equinatoxin II from the sea anemone Actinia equina involves ion channel formation and an increase in intracellular calcium activity. J.Membr.Biol. v. 118,3, pp. 243-249.

Информация о работе

Катаев, Анатолий Ахсарбекович
кандидата биологических наук
Пущино, 2008
ВАК 03.00.02

Диссертация

Функциональные свойства Ca2+ -активируемых хлорных каналов харовых водорослей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы