Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Функционально-активные ионы кальция и марганца в фотосистеме II
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Функционально-активные ионы кальция и марганца в фотосистеме II"

РГб

од

" 8 опт к

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.ВЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

--------------------На правах рукописи

СЕМИН Борис Константинович

ФУНКЦИОНАЛЬНО-АКТИВНЫЕ ИОНЫ КАЛЬЦИЯ И МАРГАНЦА В ФОТОСИСТЕМЕ П

специальность 03.00.02 - биофизика

Диссертация в форме научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва -1996

Официальные огшонен гы:

доктор биологических наук, профессор Тихонов А.Н.

доктор биоло! ичсских наук, профессор Карапетям Н.В.

доктор биологических наук Бухов II. Г.

Ведущая органн шипя: Институт почвоведения и фотосинтеза РАН

Зашита состоится 1996г. /У^час

на заседании Специализированного Учено! о Совета Д.053.05.53 при Московском государственном университете по адресу: 119899 Москва. Воробьевы горы, МГУ, Биологический факулмст (ЛИК).

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Диссертация в виде научно! о докдада разослана // " 1996г.

Ученый секретарь Специализировашшого совета, доктор биологических наук.

профессор I • У I Т.Е.Кренделева

ОГЛАВЛЕНИЕ

Принятые сокращения 2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 3

Актуальность проблемы 3

Цель и задачи исследования 5

Научная новизна _ 6

Научно-практическая значимость работы 6

Апробация работы 7

Публикации ________8

Методические аспекты раооты 8

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 9

Часть I. РОЛЬ Са2+ В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ ВОДОРАЗЛАГАЮ-ЩЕГО КОМПЛЕКСА ФС2 9

1.1. Действие блокаторов кальциевых каналов на электрон-транспортную цепь ФС2 в тилакоидных мембранах 10

- Влияние блокаторов кальциевых каналов на электрон-транспортную цепь в тилакоидных мембранах 10

- Локализация участка ингибирования электрон-транспортной цепи блокаторами кальциевых каналов 12

- Факторы, модулирующие взаимодействие блокаторов кальциевых каналов с кислород-выделяющим комплексом 12

•Заключение 14

1.2. Действие локальных анестетиков на электрон-транспортную цепь тилакоидных мембран 14

- Влияние локальных анестетиков па электронный транспорт в тилакоидных мембранах 15

- Идентификация участка ингибирования локальными анестетиками электрон-транспортной цепи в хлоропчастах 16

- Совместное действие анестетиков и блокаторов па ЭТЦ в

ФС2 18

- Взаимодействие дикаина с бактериородопсином в пурпурных мембранах 20

1.3. Функциональная роль Са2+ в системе фотолиза воды 22 Часть II. Са2+ -ЗАВИСИМЫЙ УЧАСТОК ТРАНСПОРТА ЭЛЕКТРОНА НА АКЦЕПТОРНОЙ СТОРОНЕ ФС2 24

11.1. Ингабирование акцепторного участка ФС2 в ТМ при рН-зависи-мой экстракции кальция 27

- Локализация кальций-зависимого участка инактивации ЭТЦ в

ТМ 28

- Исследование природы лигандов, участвующих в связывании

Са2+ 30

11.2. Сравнительный анализ влияния рН-зависимой экстракции кальция из мембранных препаратов ФС2 и из ТМ на транспорт электронов и связанные процессы 31

- Экстракция кальция из мембранных препаратов ФС2 и ТМ 31

- Влияние света на кальций-зависимую реактивацию ЭТЦ в препаратах ФС2 и ТМ 31

- Зависимость реактивации Э ТЦ в препаратах ФС2 и ТМ

от концентрации кальция 32

- Уровень электрон-транспортной активности реактивированных препаратов в присутствиии различных акцепторов 32

- Км для капьций-свяшвающего участка в препаратах ФС2 и ТМ 32

- Кинетика индукции флуоресценции в препаратах ФС2 и ТМ до

и после кальций зависимой реактивации ЭТЦ 33

II.3. Заключение 35 Часть III. ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ МАРГАНЦЕВОГО КЛАСТЕРА В КИСЛОРОД-ВЫДЕЛЯЮЩЕМ КОМПЛЕКСЕ ФС2 37

III.I. Связывание катионов железа с марганец-связывающим центром

в ФС2 39

- Взаимоде испили' катионов Мп(Н), Fe (II) и Fe (III)

с Мп-связывающим участком 40

- Влияние анионов на связывание катионов металлов с Мп-связывающим участком 41

- Прочность связывания катионов железа с Мп-связыва-

к^щим участком и их редокс состояние в связанном положении 41

- Влияние восстановителей на взаимодействие Fe (II)

Мп-связывающим участком 43

- Влияние света на связывание Fe(II) с Мп-связывающим участком 44

- Кинетический анализ механизма связывания Fe (II) с

Мп-связывающим участком 46

- Заключение Al

III.2. Замещение марганца в каталитическом центре КВК

на мессбауеровский изотоп железа (^Fe) и мессбауеровские спектры полученных при замещении препаратов ФС2 49

- Связывание катионов Fe (II) и Fe (111) с мембранными компонентами фотосистемы помимо Мп-связывающего участка 49

- Мессбауеровские спектры "специфически " и "неспецифически" связанных катионов железа в препаратах ФС2(-Мп) 49

Ш. 3. Модель координационной сферы марганцевого кластера

в КВК 52

- Сравнительный анализ аминокислотной последовательности белков DI и D2 и двухъядерных железо-содержащих белков 52

- координационная сфера двухъядерного марганцевого центра, вхоищего в состав четырехъядерного марганцевого кластера

КВК 55

Часть IV. ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ 58

ВЫВОДЫ 61

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ . 63

Принятые сокращения: БКК, блокаторы кальциевых каналов; БР, бакгернородопсин; ДГП, 1,4-дигидропиридин; ДФК, 1,5-дифенилкарбазпд; ДХФИФ, 1,6-дихлорфснолиндофснол; ЗФ, замедленная флуоресценция; КВК, кислород-выделяющий комплекс; ЛА, локальные анестетики; МС, мессбауеровская спектроскопия; ММОГ, метанмонооксигеназа; РЦ, реакционный центр; Cal, Са2+, локализованный в КВК; Са2, , локализованный во внешнем антенном

комплексе ФС2; ТМ, тилакоидные мембраны; ФЦ, феррнцианид; ФС2, фотосистема 2; ФС2(-Мп), ФС2, из которой экстрагирован марганец; ЭДАК, 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид; ЭТЦ, электрон-транспортная цепь; R2, R2 компонент рибонуклеотидредуктазы.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из важнейших элементов фотосинтетического аппарата, осуществляющего конверсию солнечной энергии, является макромолекулярный комплекс "фотосистема 2" (ФС2). Трансформация энергии света в энергию химических связей высокоэнергетических соединений сопряжена с окислением фотосистемой 2 воды , являющейся источником протонов и электронов для последующих фотосинтетических реакций, а также молекулярного кислорода, играющего ключевую роль в жизнедеятельности подавляющего числа организмов на Земле. ФС2 представляет собой одну из наиболее важных, сложно организованных и широко распространенных природных систем. Однако, структурная и функциональная организация этого комплекса все еще недостаточно выяснена, хотя многие годы интенсивно исследуется с применением новейших теоретических и методических подходов.

В нашей работе мы сосредоточили свое внимание на выяснении структурной и функциональной роли важнейших катионов, кальция и марганца, входящих в состав этого макромолекулярного комплекса. Интерес к этим ионам обусловлен тем, что во многих биологических системах ноны металлов играют важную и разнообразную роль - структурную, каталитическую, регуляторную, транспортную и т. д.. Так, марганец и кальций входят в состав многих важных белков. В некоторых из них марганец играет структурную роль как, например, в пируваткарбоксилазе или конканавалине А, но в подавляющем числе известных Мп-содержащих ферментов марганец функционирует как каталитический центр, в котором используются его окислительно-восстановительные свойства. Большая часть Мп-содержащих ферментов участвует в метаболизме кислорода, осуществляя активацию кислорода в каталитическом цикле ( марганец-содержащая рибонуклеотид редуктаза) или дезактивацию его активных форм (супероксиддисмутаза, пероксидаза, бактериальная каталаза). Эти ферменты содержат либо один атом марганца (супероксиддисмутаза), либо двухъядерный кластер (бактериальная рибонуклеотидредуктаза, аргиназа, тиосульфатоксидаза, пероксидаза, бактериальная каталаза). Кислород-выделяющий комплекс ФС2 оксигенных организмов (высших растений, водорослей и цианобактерий), является наиболее распространенным и важным представителем класса Мп-содержащих

ферментов. Марганцевый кластер в КВК организован наиболее сложно. Он состоит из 4-х атомов марганца, последовательность редокс-переходов которых обеспечивает его каталитическую функцию. При поглощении света реакционным центром марганцевый кластер аккумулирует четыре окислительных эквивалента, требующихся для генерации молекулы кислорода, при этом каждой стадии окисления соответствует определенное редокс-состояние кластера - S-цикл (Kok и г:р., 1970). Кислоро/д выделяется при переходе кластера из S3 в S0 с промежуточным состоянием S4. В1 настоящее время накоплена обширная информация об этом кластере, касающаяся главным образом его состава и окислительно-восстановительных переходов, сопровождающих процесс поглощения света. В тоже время, многие аспекты структурно-функциональной организации марганцевого каталитического центра КВК изучены в значительно меньшей степени. К числу важнейших, но мало исследованных проблем, имеющих исключительно важное значение для выяснения механизма фотолиза воды, относятся локализация марганцевого центра в ФС2, структура марганцевого кластера, природа лигандов, связывающих ионы марганца. В последнее время исследования этих проблем начинают интенсивно развиваться. Так, на основе данных EXAFS-измерений предложена модель двухдимерной структуры марганцевого кластера (Sauer et al., 1992); с использованием функциональных тестов (Preston, Seib.,;rt, 1991; Blubaugh, Cheniae, 1992) и спектроскопических методов (Tang et ill., 1994) получены свидетельства в пользу участия карбоксильных групп аминокислот и гистидиновых остатков в связывании марганца. Возможность ^функционирования некоторых аминокислотных остатков в качестве лигандов марганца начинает активно изучаться с применением метода точечного мутагенеза (Vermaas, 1993). Однако, имеющейся информации по этим вопросам явно недостаточно и, учитывая их большую важность для расшифровки механизма фотолиза воды, требуется проведение дальнейших интенсивных исследований в данном направлении.

Ионы кальция играют важную регуляторную роль во многих биологических процессах, таких, например, как мышечное сокращение, выделение нейротрансмиттеров, гормональные реакции и др., выступая в качестве внутриклеточного мессенджера в передаче регуляторной информации. Функциональная активность этого катиона реализуется, как правило, через взаимодействие с кальций-связывающими белками. В кальций-содержащих белках кальций может играть структурную роль, обеспечивая определенную

конформацию белка, которая либо является необходимой для проявления каталитической активности (фосфолипаза А2), либо повышает его термоустойчивость, как, например, в термолизине или предотвращает автолиз белка (трипсин). Однако, важнейшей физиологической функцией кальция является регуляторная, реализуемая при специфическом взаимодействиии катиона с Са2+-связывающими белками типа тропонина или калылодулнна. Общей особенностью кальций-связывающих белков, лежащей в основе механизма регуляции, является изменение конформации белка при связывании кальция, сопровождающееся изменением белок-белковых взаимодействий.

Важная роль в ФС2 до последнего времени оставалась незамеченной. К моменту начала выполнения настоящей работы появились лишь первые указания на участие кальция в функционировании системы фотолиза воды в ФС2. Позднее было установлено, что ФС2 содержит два катиона кальция в расчете на один реакционный центр, один из которых расположен в КВК (Cal), а другой (Са2) локализован во внешнем антенном комплексе ФС2. Однако, роль этих катионов (структурная или регуляторная) и механизм их функционирования в ФС2 изучены в еще меньшей степени, чем марганца, поскольку лишь совсем недавно была окончательно установлена абсолютная необходимость кальция как кофактора в процессе окисления воды, экстракция которого полностью подавляет реакцию выделения кислорода.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было выяснение структурно-функциональной организации центров связывания катионов кальция и марганца, а также каталитической и регуляторной роли этих катионов в работе электрон-транспортной цепи ФС2.

В соответствии с этим в работе были поставлены следующие основные экспериментальные задачи:

- исследовать механизм участия кальция в процессе фотолиза воды в ФС2 и природу молекулярных структур, обеспечивающих функционирование этого катиона в КВК;

- изучить роль кальция в функционировании акцепторного участка электрон-транспортной цепи ФС2 и исследовать природу молекулярных центров, связывающих этот катион;

- исследовать лигандный состав координационной сферы марганцевого кластера, обеспечивающий его функционирование в КВК.

Научная новизна. Обнаружено, что блокаторы кальциевых каналов (БКК) являются эффективными ингибиторами кислород-выделяющего комплекса. Эффективность ингибирования находится в соответствии с их способностью инактивировать кгльциевые каналы в клетках, что указывает на аналогию в организации Са2+-связывающих участков в КВК и кальциевом канале.. Высказано предположение, что в _JfJ5K с помощью кальция осуществляется регуляция процесса выведения протонов из гидрофобной зоны во внутритилакоидное пространство при разложениии воды.

Показано, что в тилакоидных мембранах (ТМ) на акцепторной стороне ФС2 имеется кальций-зависимое звено цепи перекоса электронов. В аминокислотной последовательности полипептида D2 выявлен участок (Е225-А235), соответствующий EF-центру кальмодулина и расположенный с внешней стороны тилакоидной мембраны вблизи первичного хинонного акцептора Qa. Этот участок совместно с минорным белком СР29 внешнего антенного светособирающего комплекса, очевидно, формируют координационную сферу катиона кальция (Са2), после экстракции которого и наблюдается ингибирование электрон-транспортной цепи на акцепторной стороне ФС2.

Впервые обнаружено высокоэффективное связывание катионов железа Мп-связывающим участком ФС2, которое по своим характеристикам аналогично связыванию марганца с этим участком. В С-концевых участках полипептидов D1 и D2 реакционного центра выявлены районы, аналогичные районам, связывающим двухъядерный кластер - железа в железо-содержащих ферментах

(рибонуклеотидредуктаза, метанмонооксигеназа, десатураза). Сформулировано положение о том, что обнаруженные районы (аминокислотные остатки D319, Е329 и Н332 полипептида D1 и Е324, D334 и Н337 полипептида D2) формируют, координационную сферу марганцевого димера, входящего в состав четырехъядерного марганцевого кластера КВК. В стабилизации координационной сферы этого димера участвуют аминокислотные остатки E333(D1) и E338(D2), образующие водородные связи с Н337 (D2) и Н332 (D1) соответственно.

Научно-практическая значимость работы. Полученные в работе экспериментальные результаты и теоретические обобщения расширяют представления о механизмах функционирования кальция в КВК, дают возможность использования в фотосинтетических исследованиях БКК и ЛА в

качестве новых классов ингибиторов донорного участка ФС2 и открывают

/ I

перспективы разработки экспресс-методов в скрининге биологической активности производных дигидропиридина, имеющих фармакологическое применение.

Обнаружение кальциевой .чувствительности переноса электронов на акцепторной стороне ФС2 и предложенная модель взаимодействия между реакционным центром и светособирающим комплексом открывают возможности более глубокой интерпретацию! структурно-функциональной организации макромолекулярных комплексов ФС2 и, в том числе, механизмов регулирования рассеивания энергии.

На основе обнаруженного высокоэффективного связывания • -катионов двухвалентного железа с Мп-связывающим участком КВК разработана методика замещения Мп на катионы железа в КВК, позволяющая использовать метод мессбауеровской спектроскопии для изучения координационной сферы марганцевого кластера и взаимодействия этого кластера с другими кофакторами КВК. Сравнительный анализ аминокислотной последовательности белков О! и 02 реакционного центра ФС2 и диферро-оксо ферментов выявил аминокислотные остатки, наиболее вероятно участвующие в связывании марганцевого димера, входящего в состав четырехъядерного марагнцевого кластера КВК, что открывает новое перспективное направление в исследованиях механизма фотолиза воды, в том числе и с использованием точечного мутагенеза.

Апробация работы. Результаты исследования докладывались на Всесоюзных и Международных конференциях и съездах: Международная конференция по применению Мессбауеровского эффекта (Индия, • 1981); 1-й Всесоюзный биофизический съезд (Москва, 1982); Всесоюзная конференция "Кинетика и механизмы электронного переноса в белковых системах и их моделях" (Вильнюс, 1985); Международный симпозиум "Электромагнитные поля и биомембраны" (Болгария,1989); : Международная конференция по применению Мессбауеровского эффекта (Венгрия, 1989); 3-й Конгресс Европейского общества по фотобиологии (Венгрия, 1989); Всесоюзная конференция "Преобразование световой энергии в фотосинтезирующих системах и их моделях" (Пущино, 1989); Международная конференция по применению Мессбауеровского эффекта (Китай,1991); IX Международный Конгресс по фотосинтезу (Япония, 1992); 11-я ежегодная региональная конференция по фотосинтезу (США, 1994); 12-й Немецко-Российский семинар по использованию Мессбауеровской спектроскопии (ФРГ, 1994); 2-й Международный симпозиум по биологической физике (ФРГ, 1995); Международная конференция "Биоэнергетика фотосинтеза" (Пущино, 1996).

Отдельные разделы работы выполнены при финансовой поддержке Российского Фонда фундаментальных исследований, Совета Канады по естественным наукам и инженерным исследованиям (Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada), Немецкого научно-исследовательского общества (Deutsche Forschungsgemeinschaft) и Фонда химической индустрии Германии (Germany, Fond der Chemischer Industrie).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 50 работ в центральных академических и международных изданиях.

Методические аспекты работы. В качестве объектов исследования б^иш использованы тилакоидные мембраны и ВВY-препараты ФС2 (Berthold et al., 1981), выделенные из листьев гороха или шпината.

Скорость транспорта электронов измеряли, регистрируя выделение кислорода (полярограф LP7E или прибор Hansatech с электродом Кларка ) или восстановление 2,6-дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ, 6=21.8 мМ"' см"' для ионной формы).

Экстракцию кальция из исследуемых объектов нитратным буфером с низким pH проводили по методу Оно и Иноуе (Ono, Inoue, 1988). Марганец из КВК экстрагировали 0.8М Трисом с pH 8,5 (Hsu et al., 1987). Для регистрации связывания марганца или катионов железа с Mn-связывающим участком применяли метод Хсу с соавт. (Hsu et al.,1987). В качестве модификаторов карбоксильных групп аминокислот были использованы 1-этил-З-(диметиламинопропил)карбодиимид (ЭДАК) (McCubbin and Kay, 1973) и дициклогексилкарбодиимид. Содержание железа в растворах определяли с помощью о-фенантролина (Umland et al., 1971). Стабильные при физиологических pH растворы трехвалентного железа получали по методу Чарлей с соавт. (Charley et al., 1963).

Инструментальные методы. Кинетику индукции флуоресценции в минутном диапазоне измеряли на установке Hansatech (Hansatech Instruments Limited, UK), в секундном диапазоне на флуориметре РАМ-101 (Walz, Effeltrich, FRG). Интенсивность миллисекундной замедленной флуоресценции (ЗФ) измеряли в стационарной фазе индукционной кривой, а долгоживущую ЗФ через 2 с после выключения света при помощи фосфоросколической установки (Васильев и др., 1988). Данные ЗФ обрабатывали с помощью программы GIM, позволяющей разложить кривую затухания на сумму экспонент (Provencher, 1976). Относительный выход постоянной и переменной флуоресценции хлорофилла

измеряли при помощи импульсного флуориметра (Лядский и др., 1987). Оптические характеристики препаратов измеряли при комнатной температуре и температуре жидкого азота на спектрофотометрах СФ-10, Hitachi-557 и спектрофлуориметре MPF-2A. Спектры ЭПР измеряли на радиоспектрометре РЭ-1307. Калориметрические исследования были выполнены с помощью дифференциального сканирующего микрокалориметра ДАСМ-1М. Мессбауероьские спектры регистрировали на спектрометре с равноускоренным перемещением источника излучения ^Со в Rh при неподвижном поглотителе.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Часть I. РОЛЬ Са2+ В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ ВОДОРАЗЛАГАЮЩЕГО КОМПЛЕКСА ФС2.

Участие в работе КВК высших растений было обнаружено в

экспериментах по исследованию реактивации системы разложения воды в мембранах ФС2 с удаленными периферическими белками 17 и 24 KDa ( Ghanotakis et al.,1984; Miyao, Murata, 1984 ). Это открытие стимулировало многочисленные исследования роли в фотосинтетической ЭТЦ, направленные на выяснение

таких вопросов как содержание и локализация Са2+ в КВК, природа групп, связывающих Са^+, а также механизм функционирования этого катиона в системе фотолиза воды. Одним из основных подходов при выяснении механизма функционирования Са^+ в системе фотолиза воды является исследование эффектов, наблюдаемых при удалении кальция из ФС2 раствором NaCl (1 - 2 M) в присутствии ЭДТА (Ghanotakis et al.,1984) или цитратным буфером с низким значением pH (Ono, Inoue, 1988).

Известно, что функциональная активность Са2+ в клеточных процессах реализуется, как правило, через взаимодействие с Ca2"1" -связывающими белками. К настоящему времени накоплен обширный научный потенциал и разработаны разнообразные методы исследования самых различных аспектов структурно-функциональной организации Са^-связывающих центров. Одним из эффективных и широко применяемых подходов к изучению кальций-связывающих белков и кальций-зависимых процессов является использование специфических реагентов. В качестве таких реагентов наиболее часто применяются блокаторы кальциевых каналов и антагонисты кальций-связывающего регуляторного белка кальмодулина. По сравнению с экстракционным методом исследование влияния

подобных соединений на тот или иной -зависимый процесс позволяет не только делать выводы об участии Са^+ в изучаемом явлении, но и решать ряд дополнительных задач . К числу важнейших подобных задач относится выяснение типа Са2+-связывающих молекулярных структур, что крайне важно для расшифровки механизма функционирования кальция. Например, приниыи:о-т_. пи участие в связывании кашц::« Е>-центры, характерные для регуляторных кальций-связывающих белков (кальмодулин, парвальбумин, тропонин), или Са^+-связывающие структуры, изменяющие свою эффективность связывания в процессе единичного акта функционирования как, например, в Са2+-АТФ-азе или кальциевом канале. Высокая перспективность данного методического подхода не вызывает сомнений, однако, в области фотосинтетического транспорта электронов к началу наших исследований были опубликованы только первые работы в этом направлении ( Ban: et аЦ 1Э82; Pistorius, 1983; Чаморовский, Маторин, 1984; Carpentier, Nakatani, 1985). Между тем, принимая во внимание вышесказанное, такой подход заслуживает более пристального внимания и широкого использования. В связи с этим мы изучили влияние на электрон-транспортную цепь в ФС2 блокаторов кальциевых каналов, а также локальных анестетиков, многие эффекты которых, по литературным данным (Low et al.,1979), являются результатом их влияния на кальций-зависимые процессы. 1.1. Действие блокаторов кальциевых каналов на электрон-транспортную цепь ФС2 в тилакоидных мембранах.

Влияние БКК на электронный транспорт в ТЫ. Блокаторы кальциевых каналов подавляют перенос кальция через канал. Известно, что одними из наиболее эффективных БКК являются производные 1,4-дигидропиридина (ДГП), такие как никардипин, нифедапин, риодипин. Меньшей эффективностью обладает БКК, относящийся к классу фенилалкиламинов, - верапамил. Проведенные эксперименты показали, что все перечисленные БКК ингибируют транспорт электронов в хлоропластах на участке Н2О - ДХФИФ или ФЦ (акцепторы электронов для ФС1 и ФС2 в ТМ). Эффективность действия производных ДГП в хлоропластах, также как и в кальциевых каналах, выше, чем верапамила. Полученные результаты показывают, что имеется определенная взаимосвязь между способностью блокаторов блокировать кальциевые каналы и их влиянием на ЭТЦ. С целью более детального выяснения этой взаимосвязи нами было изучено действие на ЭТЦ ряда производных ДГП (16 соединений), отличающихся заместителями в кольце и имеющих известную физиологическую (гипотензивную)

активность, обусловленную их специфической эффективностью как блокаторов кальциевых каналов.

Из работ (, Тгцщ1е, 1983; ) известно, что для того, чтобы ДГП (рис.1) был блокатором кальциевого канала, в его молекуле

а) атом азота должен быть незамещенным;

б) в положении 4 предпочтительным является бензольное кольцо, положение заместителей в котором также важно для активности; активным являются орто-и мета- замещенные соединения, в то время как заместители в пара ' положении резко снижают активность;

в) в положениях 3 и 5 (или хотя бы в одном них) должна быть сложноэфирная группа; длина алкильных цепей этих

заместителей также отражается на активности; их удлинение сопровождается снижением способности блокировать Са2+ каналы.

Проведенные эксперименты показали, что соединения, имеющие короткие алкильные цепи в положениях 3 и 5 и обладающие выраженной гипотензивной активностью, эффективно подавляют перенос электрона в хлоропластах гороха. В то же время соединения с длинными алкильными цепями и со слабо выраженной гипотензивной активностью ингибируют транспорт электрона примерно в два раза слабее, чем соединения с короткими цепями. Таким образом, взаимосвязь между химической структурой и ингибировзнием ЭТЦ, обнаруживаемая при изменении заместителей я ^ , соответствует приведенным выше

представлениям о связи структуры и способности ингибировать Са2+ транспорт.

При замене атома водорода в Я* на более объемные заместители способность ингибировать транспорт электронов в ТМ у двух соединений группы ДГП не изменяется и уменьшается у третьего.

Соединения ДГП, у которых бензольное кольцо (Я^)' заменено па фурильное, вещества, имеющие большую величину ЕОзд ( эффективная доза, снижающая аретериальное давление на 30% ), в целом менее эффективно ингибируют ЭТЦ в хлоропластах.

Н 1*4

Рис. 1 .Структурная формула производных ДГП

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о взаимосвязи между характером действия ДГП как БКК и их способностью ингибировать ЭТЦ в тилакоидных мембранах.

I

Локализация участка ингибирования фотосинтетической электрон-транспортной иепи блокаторами калъииевых каналов. Для выяснения локализации участка действия БКК мы использовали известный метод регистрации ЗФ, которая генерируется практически исключительно в ФС2 в результате вторичного возбуждения хлорофилла при реакции рекомбинации восстановленных переносчиков электрона акцепторной стороны ФС2 с окисленными переносчиками донорной (.Гигетю, 1986 ). Кривая затухания ЗФ может быть представлена в виде суммы кинетических компонент с различным временем затухания. Подавление миллисекундной ЗФ свидетельствует об ингибировании акцепторной стороны, однако, может быть связано также с разрушением протонного градиента, а подавление долгоживущей ЗФ со временем затухания т)/2=2с обусловлено ингибированием донорного участка (Ьауоге1 й а1., 1982). Изучая изменения интенсивности этих\ компонент под влиянием исследуемых ингибиторов, можно идентифицировать участок ингибирования в ФС2.

Исследованные нами БКК подавляют как миллисекундную, так и долгоживущую ЗФ хлоропластов гороха. 50% ингибирование миллисекундной ЗФ риодипином, нифедипином и никардипином наблюдается в области концентрации 50 |дМ . В присутствии же протонофора метиламина, разрушающего протонный градиент на мембране, миллисекундная ЗФ подавляется БКК в значительно меньшей степени, чем долгоживущая. Этот факт указывает на то, что БКК подавляют миллисекундную ЗФ в основном за счет уменьшения ДрН на тилакоидной мембране и практически не затрагивают процесс переноса электронов на акцепторной стороне. В тоже время, более значительное подавление блокаторами долгоживущей ЗФ, по сравнению с миллисекундной, свидетельствует о том, что действие этих веществ затрагивает в основном транспорт электрона на донорной стороне ФС2 на уровне КВК (Дигеиис, 1986).

Дополнительные подтверждения того, что БКК ингибируют КВК, получены в опытах с использованием искусственного донора электронов 1,5-дифенилкарбазида (ДФК). Известно, что ДФК восстанавливает транспорт электронов в ФС2 с инактивированным КВК. В наших опытах ДФК восстанавливал электронный транспорт в ФС2 после обработки ее БКК.

Факторы, модулирующие взаимодействие БКК с КВК.

Влияние катионов. Известно, что двухвалентные катионы изменяют эффективность действия БКК на кальциевые каналы. Принимая во внимание отмеченную выше аналогию в действии БКК на кальциевые каналы и КВК в ФС2 мы исследовали возможность влияния катионов металлов и на ингибирование блокаторами кислород-выделяющего комплекса. Было установлено, что в присутствии одновалентных и двухвалентных катионов (Mg2+ , Са?+ , Ва2+ , Na+, К+) эффективность действия блокаторов на ФС2 возрастает. Достаточно высокие концентрации катионов (10 мМ для двухвалентных и 100 мМ для одновалентных), при которых наблюдается этот эффект, свидетельствуют о том, что усиление влияния блокаторов может быть связано с изменением катионами поверхностного потенциала мембраны. В свою очередь изменение этого потенциала влечет за собой изменение примембранной концентрации блокатора. Подобный механизм действия катионов обычно имеет место и в случае совместного действия БКК и катионов металлов на кальциевые каналы (Костюк, 1986).

Среди исследованных катионов особое место занимает Ва2+ , поскольку эффективность его влияния на взаимодействие БКК с КВК была значительно выше по сравнению с другими катионами. Следует отметить, что Ва2+, в отличие от ряда других проникающих в канал двухвалентных катионов, необратимо инактивирует канал, возможно, за счет необратимого связывания с кальций-связывающим участком внутри канала (Костюк и др., 1985).

Влияние активатора. Помимо БКК существуют также активаторы кальциевого канала, которые взаимодействуют с кальциевыми каналами, но не ингибируют его работу, а стабилизируют открытое состояние канала. Нами было обнаружено, что в отличие от блокаторов, активатор, CGP-28392, практически не оказывает влияния на транспорт электронов в ТМ в концентрациях, соответствующих ингибирующим концентрациям производных ДГП и верапамила.

Из литературы известно, что участки связывания активатора кальциевого канала и БКК являются сходными (Schramm et al., 1983). Принимая это во внимание, нами было исследовано совместное действие БКК и активатора на транспорт электронов в ФС2; Добавление активатора кальциевого канала CGP-28392 до или после БКК значительно ( почти в два раза) увеличивает ингибирующий эффект БКК в ТМ. Таким образом, активатор, не оказывающий влияния на транспорт электронов в ФС2, усиливает ингибирующее действие блокаторов при их совместном применении. Мы не наблюдали синергетического

эффекта при совместном действии различных блокаторов на ЭТЦ хлоропластов. Эти данные позволяют заключить, что сенсибилизирующее влияние активатора обусловлено его специфическими свойствами как активатора кальциевого канала.

Заключение:^ В проведенных нами экспериментах обнаружено ингибирование БКК системы разложения воды в ФС2. Концентрации БКК, при которых наблюдается этот эффект, выше концентраций, при которых БКК ингибируют кальциевые каналы в животных метках, однако, сопоставимы с концентрациями ингибирования кальциевых каналов в растительных клетках - 50 - 100 мкМ для нифедипина ( Shina, Tazawa, 1987 ). Совокупность полученных результатов свидетельствует о том, что имеется взаимосвязь между эффективностью соединения как блокатора и его способностью инактивировать КВК. Активатор, как реагент, оказывающий на кальциевые каналы действие противоположное блокаторам (стабилизирует открытое состояние канала), не ингибирует электронный транспорт в хлоропластах. При совместном введении в суспензию хлоропластов БКК и активатора наблюдается неаддитивность в действии этих соединений ( также как и в случае кальциевых каналов ). Полученные результаты свидетельствуют об определенном сходстве в механизмах действия БКК на кальциевый канал и КВК. Конечно, ФС2 не содержит кальциевый канал, подобный кальциевому каналу в нервных или мышечных клетках, однако, полученные результаты указывают на то, что кальций-связывающая структура КВК имеет некоторую аналогию с таковой в кальциевом канале. 1.2. Действие локальных анестетиков на электрон-транспортную цепь тилакоидных мембран.

Другим классом химических соединений, способных влиять на кальций-зависимые процессы и взаимодействовать с кальций-связывающими белками, являются локальные анестетики. Механизму биологического действия ЛА посвящено большое количество работ. Накопление экспериментальных данных, указывающих на то, что Л А ингибируют главным образом клеточные функции, связанные с участием Са^+, привело к появлению кальций-зависимой модели действия анестетиков (Low et al,, 1979). Согласно этой модели взаимодействие ЛА с мембраной приводит к вытеснению Са^+ из участков его связывания, что и является причиной нарушения многих клеточных функций. Вытеснение кальция осуществляется более эффективно электронейтральной формой анестетика, а не заряженной, что свидетельствует о стерическом механизме вытеснения кальция анестетиком (Low et al., 1979). Стерический механизм, возможно, обусловлен

"разрыхлением" структуры интегральных белков за счет разрушения анестетиком внутримолекулярных водородных связей в белках ( Buchet et al., 1989 ). Кальций-зависимое действие анестетиков на мембранные процессы в ряде случаев может быть также реализовано через взаимодействие анестетиков с кальций-связывающими регуляторными белками типа кальмодулина (Tanaka, Kidaka, 1981) или с некоторыми кальциевыми каналами (Antoniu et al., 1985).

Принимая во внимание наличие в КВК функционально-активног-э катиона кальция, а также возможность влияния JIA на мембранные процессы посредством модификации Са2+-связывающих участков, в следующей части нашей работы было проведено исследование действия локальных анестетиков на транспорт электронов в хлоропластах.

Влияние локальных анестетиков на электронный транспорт в тилакоидных мембранах. В работе были использованы локальные анестетики прокаинового ряда, относящиеся к третичным аминам (дибукаин, дикаин, тримекаин и др.). В проведенных нами экспериментах было обнаружено, что они подавляют транспорт электронов в тилакоидных мембранах на участке ФС2. Известно, что эффективность ингибирования анестетиками проведения возбуждения по нерву возрастает в ряду тримекаин < дикаин < дибукаин (Low et al., 1979). Способность анестетиков ингибировать электронный транспорт в ФС2 также увеличивалась аналогично в ряду тримекаин < дикаин < дибукаин.

ЛА прокаинового ряда, которые были использованы в работе, могут существовать в заряженной (атом третичного азота в молекуле протонирован) и нейтральной форме (атом третичного азота депротонирован), за исключением бензокаина, не имеющего третичного атома азота и существующего только в нейтральной форме. С целью выяснения, какая из этих двух форм анестетика вызывает ингибирование ЭТЦ в ТМ, мы исследовали рН-зависимость действия ЛА. Как показали проведенные эксперименты, с увеличением рН ингибирующий эффект ЛА значительно увеличивается. Так, например, степень ингибирования тримекаином (4,1мМ) ЭТЦ в ТМ увеличивается от нескольких процентов при рН7,6 до 100% при рН8,5. Эффективность действия на ЭТЦ локального анестетика бензокаина, существующего только в нейтральной форме, не зависит от рН. Полученные результаты указывают на то, что инактивирование ЭТЦ осуществляется нейтральной формой молекулы и рН-зависимосгь ингибирования не может быть объяснена протонированием/депротонированием молекул, входящих в состав тилакоидной мембраны.

Большая эффективность ингибирования ФС2 нейтральной формой, чем заряженной, возможно, обусловлена большей способностью этой формы проникать в гидрофобную зону мембраны. В этом отношении известно, что депротонирование анестетика сопровождается резким изменением коэффициента распределения его между органической фазой и водой. Например, для дикаина этот коэффициент возрастает от 22 ( при рН 5,5, преобладает заряженная форма ) до 630 ( при рН 9,5, преобладает нейтральная форма ) ( Boulanger et al., 1980 ).-Опыты, проведенные нами с использованием метода дифференциальной сканирующей кщкрокалориметрии подтвердили, что степень влияния нейтральной формы анестетика на липидную фазу (изменение температуры плавления синтетического фосфолипида димирисгоилфосфатидилхолина) существенно выше, чем заряженной формы.

Таким образом, совокупность полученных результатов свидетельствует о том, что ингибирование ЭТЦ локальными анестетиками обусловлено нейтральной формой молекулы, проникающей в тилакоидную мембрану, т.е. мишень ингибирующего действия анестетика находится в гидрофобной зоне мембраны.

Идентиёикаиия участка ингибирования локальными анестетиками электрон-транспортной цепи в хлоропластах.

РЛействие ДФК. Для локализации участка ингибирования ЭТЦ локальными анестетиками был использован искусственный донор электронов ДФК, который восстанавливает электронный транспорт к акцептору ДХФИФ в случае донорного ингибирования, но не восстанавливает при инактивировании акцепторного участка ФС2. В проведенных нами экспериментах было установлено, что ДФК восстанавливает скорость электронного транспорта в ТМ, обработанных JIA, практически до исходного уровня (>90%). Полученные результаты свидетельствуют о том, что ингибирование J1A фотовосстановления ДХФИФ связано главным образом с ингибированиеи донорного участка ФС2.

2) Измерение выхода переменной флуоресценции. Ингибирование ЛА донорной стороны ФС2 сопровождается подавлением выхода переменной флуоресценции ( Fv ), как это видно из рис. 2. Уменьшение Fv происходило за счет уменьшения Fmax , т.к. выход быстрой флуоресценции ( F0 ) практически не изменяется в пределах ингибирующих концентраций локального анестетика дикаина. Такого рода подавление переменной флуоресценции является следствием блокирования части реакционных центров ФС2, причем, принимая во внимание

приведенные выше результаты, на их донорном участке. Донорная сторона ФС2, как известно, содержит два электрон-транспортных компонента - КВК и вторичный донор Хг (тирозин 161 в полипептиде 01), расположенный между КВК и первичным донором электронов Р680. Для уточнения участка ингибирования ЭТЦ анестетиком мы исследовали действие ингибитора КВК (триса) на выход переменной флуоресценции Бу. Было установлено, что ингибирование КВК практически не сопровождается изменением выхода переменной флуоресценции. Из этих результатов следует, что анестетик ингибирует перенос электронов на уровне вторичного донора У2. '

3) ЭПР-измерения. ФС2 содержит помимо тирозинового остатка У2 ,

переносящего электрон от КВК к первичному донору Р680+, тирозиновый остаток Ус _ расположенный симметрично относительно У2 (позиция 161 в лолипелтиде Б2). Ближайшее окружение тирозинов У0 и У2 во многом одинаково (Уегтааз, 1993). В окружении тирозинов У2 и У0 имеются аналогичные аминокислотные остатки, формирующие водородные связи. Например, согласно модели структурной организации доменов, содержащих У2 и У0 (БуепББОп й а1., 1990 ), в пределах формирования водородной связи с соответствующим остатком тирозина расположены гистидиновые остатки Н190 в П2 и Н190 в 01. У0, также как и У2,

окисляется на свету первичным донором Р680+, но не принимает участия в линейной цепи транспорта электронов от воды к пулу пластохинонов. При окислении Ус образуется стабильный радикал с периодом полураспада несколько часов. Стабилизация этого радикального состояния тирозина, согласно современным представлениям, обеспечивается водородными связями ( 51упп° е1 а1., 1993). Так, при окислении тирозина Уц азот имидазольного кольца Н190 полипептида Б 2 акцептирует фенольный протон тирозина У161, образуя с ним водородную связь ( Тап§ й а1., 1993). Окисление У о сопровождается появлением ЭПР сигнала, который обозначается как сигнал БПд.

Нами бьшо обнаружено, что дикаин значительно увеличивает скорость исчезновения сигнала 8П5. Принимая во внимание роль водородных связей в стабилизации радикала У^, а также возможность нарушения анестетиком системы водородных связей в мембранных компонентах ( В^й й а1.,1989; Мос1ог й а!., 1993), можно предположить, что значительное увеличение скорости исчезновения

сигнала ЭПР ЗН8 под действием дикаина является результатом дестабилизации им системы водородных связей радикала У0 .

Поскольку ближайшее аминокислотное окружение тирозинов Ус и У2 одинаково, полученные результаты позволяют полагать, что анестетик аналогичным образом дестабилизирует и ближайшее окружение тирозина У2. Это свидетельствует о том, что ингибирование ЭТЦ* анестетиками связано с нарушением системы функционально важных водородных связей в области вторичного донора У2.

Совместное действие анестетиков и блокаторов на ЭТЦ в ФС2. Локальные анестетики в области концентраций меньших, чем ингибирующие, оказывают на ТМ протонофорное действие, о чем свидетельствует увеличение скорости транспорта электронов (рис. 3). Протонофорный эффект увеличивается с увеличением концентрации анестетика, доел лгая своего максимума, например, в случае дикаина, при концентрации около 0,3 мМ, после чего скорость транспорта электронов не изменяется в некоторых пределах концентраций, а затем уменьшается вследствие ингибирования анестетиком ЭТЦ.

При исследовании совместного действия ЛА и БКК на транспорт электронов в ТМ было обнаружено, что анестетики значительно увеличивают эффективность ингибирования КВК блокаторами. Величина ингибирующего эффекта блокатора зависит от концентрации анестетика (рис.3). Как видно из представленного рисунка, в отсутствии анестетика риодипин (26 мкМ) ингибирует ЭТЦ приблизительно ка 10%. При добавлении дикаина эффективность ингибирования блокатором (в той же концентрации) транспорта электронов увеличивается одновременно с увеличением концентрации добавляемого дикаина. Это увеличение наблюдается в области концентраций анестетика, при которых имеет место возрастание протонофорного эффекта дикаина. После достижения концентрации, при которой анестетик начинает ингибировать ЭТЦ, ингибирующие эффекты риодапина и дикаина суммируются.

Полученные результаты указывают на то, что сенсибилизирующее влияние дикаина на взаимодействие блокаторов с КВК может быть связано с протонофорный действием анестетика. Действительно, исследование действия БКК на КВК в присутствии протонофоров ЫН4С1 и БССР показало, что оба протонофора увеличивают эффективность БКК, однако, следует отметить, что ИССР и ЫНЦС существенно слабее стимулируют действие блокаторов, чем дикаин. Последнее, с нашей точки зрения, обусловлено особенностью влияния ЛА

Р, отн.сд.

Д.,

1 2 3 | днкани мМ Рис. 2. Зависимость выхода быстрой Р0 (1) и переменной Ру (2) флуоресценции и электрон-транспортной активности хлороплас-тов (3) от концентрации ликашт.

й Л,чгн.ед.

15 10 .1 -10 -35 -Л>

Рис. 4. Изменение спектра поглощения пурпурных мембран под воздействием диканиа: а - 1.0 мМ; б • 2 мМ; а ■ тоже, что и б, но рН смещено до 7.0 добавлением НС1. Среда: трицин 100 мМ, рН 9,5

Рис. 3. Влияние дикаина на транспорт Р|1С-5- Влнянис феррицланида (1,6 мМ) электронов в хлоропластах в отсутствш ш скорость инактивации мембранных

(I) м в присутствии 26 цМ (2) и 52,5 цМ пРепаРатов ФС2 (-)11 тилакоид-

(3) рнодипнна. "ых мембРа» (-----)• о (о ) без

феррицианида; » (• ) в присутствии феррициаинда.

на протонные градиенты на мембране. Специфичность действия ЛА (дикаин, дибукаин, прокаин), по сравнешда с другими протонофорами, бьша продемонстрирована при исследовании процессов фосфоридарования в ТМ ( Laasch, Weis, 1988, 1989; Laasch et al„ 1993 ). Анестетики, как и классические протонофоры (например, FCCP), вызывают разрушение трансмембранного протонного градиента, но ингибирукя выход протоков из внутримембранных участков, что в результате приводит к стабилизации локального протонного градиента ( Laasch, Weis, 1989 ). Подобный механизм влияния на мембранные протонные градиенты рассматривается, например, при исследовании действия дибукаина на нефотохимическое тушение флуоресценции хлорофилла в хлоропластах (Noctor et al., 1993).

Таким образом, в области малых концентраций анестетиков, при которых наблюдается их влияние на мембранные протонные градиенты, JIA значительно повышают эффективность действия БКК. Взаимосвязь между ингибированием анестетиками высвобождения протонов из протон-связывающих участков и усилением эффективности действия блокаторов на КВК указывает на важную роль протон-проводящих структур в стабилизации и/или функционировании кальций-связывакмцего участка.

Взаимодействие дикаина с бактериородопсином в пурпурных мембранаС целью более детального исследования механизма действия Л А на ЭТЦ в ФС2 нами в качестве объекта были использованы пурпурные мембраны (ПМ), содержащие интегральный белок бактериородопсин (БР), функционирующий в качестве светозависимого протонного канала. Этот белок является удобным экспериментальном объектом для идентификации молекулярных мишеней, на которые направлено действие ЛА, поскольку с одной стороны, он содержит катионы н Mg2+; а с другой стороны, имеет функционально активную систему водородных связей, нарушение которых под влиянием того или иного фактора отражается на спектральных свойствах БР. Нами было изучено влияние на спектральные характеристики ПМ локального анестетика дикаина в нейтральной! pH 9,5) и заряженной форме (pH 7,0).

Нейтральная форма. На рис. 4 показаны изменения спектра поглощения суспензии ПМ при действии дикаина при рН9,5. Появление в дифференциальном спектре максимума при 460 нм свидетельствует об образовании новой формы БР с максимумом поглощения < 500 нм (максимум поглощения в абсолютном спектре 470 нм - форма БР-470). Спектральные изменения, индуцируемые нейтральной

формой дикаина, исчезают при доведении рН среды инкубации до нейтральных значений ( рис. 4 ), что может быть связано с появлением заряда в молекуле дикаина в результате протонирования анестетика. При концентрации дикаина > 1 мМ форма БР-470 начинает необратимо распадаться с высвобождением ретинальоксима и дактериоопснна. Для интерпретации этих эффектов следует отметить, что спектрально сходный продукт ( максимум 460 нм ) образуется при депротонировании Шиффовч основания (ШО) ретиналя и лизина ( Овчинников и др. 1980; Каулен, Зорина, 1988), тогда как удаление катионов из БР сопровождается сдвигом максимума поглощения в противоположном направлении -в область 605 нм (Fiescher,Oesterhelt, 1979).

Подтверждение депротонирования ШО при действии дикаина на БР было получено при исследовании состояния хромофорной группы методом спектроскопии резонансного комбинационного рассеивания света ( РКР ). При обработке БР дикаином в спектрах РКР появляется интенсивная полоса в области 1560 см"1, имеющая плечо в области 1570 см"1, и увеличивается отношение амплитуды полосы 1620 см-1 к амплитуде полосы 1640 см"1. Известно, что ШО депротонируегся в ходе фотоцикла БР на стадии образования интермедиата М412. При этом в спектре РКР появляются полосы при 1570 см-1 и 1620 см'1 (Campion et al., 1977). Следовательно, результаты спектроскопии РКР свидетельствуют о том, что при действии анестетика на БР появляется продукт с депротонированным ШО ( линии 1570 и 1620 см-1). Исследования влияния дикаина На фотоцикл БР, проведенные в полосе поглощения ключевого интермедиата фотоцикла М412 показали, что нейтральная форма дикаина вызывает замедление распада интермедиата М, не влияя на скорость его образования.

Заряженная форма. Дикаин в заряженной (протонированной) форме (рН7,0) не влияет на спектральные свойства БР в исследованной нами области концентраций (0-5 мМ).

Проведенные на пурпурных мембранах эксперименты показывают, что, во-первых, только нейтральная форма анестетика способна индуцировать изменения в интегральном белке; во вторых, дикаин-индуцированная форма БР спектрально сходна с продуктом, образующимся при депротонировании Шиффова основания, что предполагает либо непосредственное взаимодействие анестетика с этим ионом водорода, либо нарушение системы водородных связей, приводящее к депротонированию ШО. Высвобождение ретиналя при достаточно высокой концентрации дикаина происходит также, возможно, в результате взаимодействия

анестетика с ионами водорода внутри белка, поскольку экстрагировать ретиналь могут только органические растворители, содержащие водород-связывающие группы ( Mitaku et al.,1987 ). Таким образом, результаты исследования действия JIA на БР указывают на то, что мишенью анестетиков являются водородные связи в гидрофобной зоне белка. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что первичным актом в ингибировании анестиками ЭТЦ в ТМ являются структурные изменения, вызываемые дестабилизацией функционально важной для донорного участка системы водородных связей в гидрофобной зоне мембраны,. 13. Функциональная роль Са2+ в системе фотолиза воды.

В настоящее время нет сомнений в том, что КВК содержит функционально активный катион кальция (см.обзоры Yocura, 1991; Debus, 1992; Rutherford et al., 1992). Экстракция Ca2+ сопровождается ингибированием переноса электрона между марганцевым кластером и Yz- , по-видимому, вследствие блокирования перехода S3 - (S4) - So (Boussac, Rutherford, 1988). Участок связывания Са2+ расположен вблизи марганцевого кластера, о чем свидетельствует модификация сигнала ЭПР от марганцевого кластера в S2 состоянии при удалении кальция

(Boussac et al., 1989). Взаимодействие с Мп осуществляется через

карбоксилатный мостик, как показали эксперименты с применением инфракрасной Фурье-сиектроскопии (Noguchi et al., 1995). Тем не менее, роль Са^+ в процессе фотолиза воды продолжает оставаться неясной. Предполагается, что он может играть структурную роль, стабилизируя марганцевый комплекс (Ghanotakis, Yocum, 1990), или регулировать доступ воды к марганцевому кластеру (Rutherford, 1989; Sivaraja et al., 1989).

Как уже отмечалось выше, ряд особенностей ингибирования КВК блокаторами кальциевых каналов находится в соответствии с особенностями их взаимодействия с кальциевыми каналами нервных и мышечных клеток. ФС2 не содержит кальциевого канала, подобного таковому в нервных или мышечных клетках. Однако, полученные нами результаты указывают на некоторые общие принципы в структурной организации Са^+-связывающего участка и его функционирования в КВК и кальциевом канале.

Одним из основных свойств капьций-связывающего участка в кальциевом канале является модификация его сродства к кальцию в процессе функционирования канала. Совокупность полученных результатов по ингибированшо системы разложения воды БКК позволила нам высказать

предположение о том, что и участок связывания кальция в КВК может изменять свою связывающую активность в зависимости от функционального состояния марганцевого кластера (S-цикла). Одновременно это предположение получило экспериментальное подтверждение в работе (Boussac, Rutherford, 1988), где было показано, что эффективность экстракции кальция из ФС2 обработкой NaCl и, соответственно, степень ингибнрования выделения кислорода зависит от S-состояния марганцевого кластера в соответствии со следующей последовательностью: S3 > S0 s S2 > Sj. Обсуждая результаты, авторы также

указали на сходство между рядом характеристик участка связывания Са2+ в КВК и в кальциевом насосе саркоплазматического ретикулума. В последнее время опубликованы работы, которые подтвердили наши данные о том, что эффекты действия БКК и активаторов на КВК обусловлены их влиянием на кальций-связывающий участок (Krieger et al., 1993; Krieger, ¡995). Взаимодействие БКК и активаторов с КВК приводит к изменению сродства к кальцию кальций-связывающего участка. Так, например, активатор кальциевого канала трансформирует низкоаффинный Са2+-связывающий участок в высокоаффинный, уменьшая при этом Км для Са2+ почти на три порядка (Krieger, 1995).

Известно, что в некоторых мембранных системах кальций может участвовать в регуляции протонных каналов (Костюк, 1987). Участие кальция в модулировании и работе протонных каналов установлено для АТФ-азы ( Chiang, Dilley, 1989 ) и бактериородопсина ( Chronister, El-Sayed, 1987 ). Эти факты представляют особый интерес в свете выяснения функциональной роли кальция в КВК, поскольку депротонирование воды в КВК должно быть сопряжено с работой протон-выводящей структуры, так как каталитический центр разложения воды расположен в гидрофобной зоне (Rashid, Hornarm, 1992) и протоны воды сначала выделяются в мембраносвязанный пул, а уж затем во внутритилакоидное пространство ( Theg, Junge, 1983; Johnson et al., 1983 ). В этой связи представляет интерес обнаруженное нами влияние на функциональную активность ФС2 локальных анестетиков в сочетании с БКК. Значительное увеличение эффективности действия БКК на КВК в присутствии дикаина, по-видимому, отражает взаимосвязь кальций-связывающего участка в КВК с пулом локализованных протонов. Поскольку основным источником протонов в этом пуле являются молекулы окисляемой в КВК воды (Theg, Junge, 1982), полученные результаты могут указывать на участие кальция в регулировании своеобразного

"протонного канала", отводящего протоны от марганцевого кластера в наружную среду.

Таким образом, результаты исследования действия БКК и ЛА на ЭТЦ в ФС2 свидетельствуют о том, что Са^+ в КВК играет скорее регуляторную, чем структурную роль. Регуляторная роль кальция обеспечивается модулированием эффективности связывания кальция в кальций-связывающем участке_при изменении редокс-состояния марганцевого кластера. В свою-очередь процессы "связывания-высвобождения" кальция могут регулировать работу локального "протонного канала", участвующего в депротоноровании воды в КВК. ЧАСТЬ II. Са2+ -ЗАВИСИМЫЙ УЧАСТОК ТРАНСПОРТА ЭЛЕКТРОНА НА АКЦЕПТОРНОЙ СТОРОНЕ ФС2

ФС2 согласно данным атомной адсорбционной спектрофотометрии содержит 2 атома кальция на реакционный центр (Cammarata, Cheniae, 1987; Shen et al., 1988; Ono, Inoue, 1988). Один из этих атомов (Cal) локализован в КВК и участвует в реакции фотолиза воды. Второй атом кальция (Са2), как было установлено совсем недавно (Han, Katoh, 1993), находится во внешнем антенном светособирающем комплексе ФС2, функция этого катиона кальция в настоящее время неизвестна.

Внешний антенный комплекс (хлорофилл а/Ь-связывающие белки) содержит 12 копий тримерного светособирающего комплекса ФС2 (CCKII) и три минорных хлорофилл а/Ь-связывающих белка СР24, СР26 и СР29 (согласно номенклатуре Bassi et al., 1987; см. также обзор Jansson, 1994). Локализованный в антенном комплексе Са2 (1 Са2+ на 1 реакционный центр ФС2 (Han, Katoh, 1993)) более вероятно связан с одним из минорных белков, поскольку минорные белки присутствуют приблизительно в эквивалентном соотношении с РЦ ФС2 (Dainese, Bassi, 1991), а количество комплексов CCKII составляет гораздо большую величину -12 (Dainese, Bassi, 1991). Из этих минорных белков возможность участия СР29 в связывании Са2 выглядит более предпочтительной, поскольку установлена высокая Са2+-связывающая эффективность этого полипептида (Irrgang et al., 1991).

Недавно высказано предположение, что Са2 может участвовать в ассоциации белков внешней светособирающей антенны между собой или во взаимодействии этих белков с РЦ ФС2 (Han, Katoh, 1993). Наличие кальций-связывающего участка в одном из минорных белков (СР29) в сочетании с результатами, свидетельствующими о расположении минорных белков в

непосредственной близости от РЦ (Dainese et al., 1992; Bratt, Akerlund, 1992) побудило нас более внимательно исследовать возможность участия Са2 в ассоциации внешнего антенного комплекса с реакционным центром ФС2.

Реакционный центр ФС2 образован двумя интегральными полипептидамн D1 и D2, аминокислотная последовательность которых известна (Svensson et al., 1991). Поиск в аминокислотной последовательности этих полипепетидов участков, способных связывать кальций, обнаружил несколько районов с повышенной концентрацией карбоксил-содержащих аминокислотных остатков (см. обзор Yocum et al., 1991). Один из подобных районов (Coleman, Govindjee, 1987) расположен в белке D2. Предпринятый нами анализ показал, что этот участок, включающий в себя аминокислотные остатки Е225 - А235, хорошо соответствует Са2+ -связывающему участку типа EF-центра в Са2+ -связывающих кальмодулин-подобных белках (Семин и др., 1989), как это видно из расположенной ниже схемы. Схема 1.

225 235

Полипептид D2 V Е -NT L F Е DGDG AN Г FR А

+Х t-Y +Z X -z

Кальмодулин мозга человека К Е AFS LFD К DGDG TI Г ТКЕ

20

32

Катион Са2+ в ЕР-центре координируется пятью кислородными лигандами, обозначаемыми +Х, +У, +Ъ, -X, -Ъ. Лиганд +Х представлен остатком аспарагиновой кислоты, несущей отрицательный заряд. В полипептиде 02 роль этого лиганда выполняет остаток глутаминовой кислоты, также имеющей отрицательный заряд. Последующее звено белка 02 -001Х}- очень хорошо соответствует достаточно консервативной последовательности БОБО в ЕР-участке и содержит лиганд +У (как правило, аспарагиновая кислота), а также лиганд +Ъ (кислород-содержащая аминокислота). Четвертым лигандом (-Х) на участке ЕР-руки является аминокислота, содержащая кислород. В белке Б2 это треонин, также как и в одном из Са^+ -связывающих центров кальмодулина. Положение лиганда -Ъ занимает в ЕР-участке остаток глутаминовой кислоты. В белке 02 в этой позиции расположен остаток аланина и, по-видимому, лигандом в данном случае может являться молекула воды (как, например, в ЕР-участке парвальбумина в положении лиганда -X). Таким образом, район 225 - 235 белка Э2 хорошо соответствует общему принципу строения участка ЕР-руки Са2+ -

связывающих белков и, по-видимому, может являться участком связывания Са2+ в ФС2.

Возможный центр связывания i альция (Е225 - А235) имеет важную особенность, а именно, он расположен в непосредственной близости от места локализации аминокислотных остатков, участвующих в связывании и обеспечении функциональной активности Qa и атома негемового железа. Предполагается, что аминокислотный остаток W253 полипептида D2 участвует в транспорте электрона от феофитина к Qa(Vermaas, 1993). Замещение этого аминокислотного остатка на L приводит к потере структуры и функциональной активности ФС2 (Vermaas et al., 1990). Лигандом, возможно, участвующим в связывании Qa, является Н214 (Vermaas et al., 1988), локализованный в трансмембранной спирали D. Таким образом, два очень важных для проявления функциональной активности Qa аминокислотных остатка W253 и Н214 расположены в непосредственной близости от предполагаемого участка связывания Са2+ Е225 - А235. Более того, Н214 и Н269, локализованный в соседнем (Е) трансмембранном участке лолипептида D2, являются лигандами для атома негемового железа (Michel, Deisenhofer, 1988).

Таким образом, проведенный анализ позволяет заключить, что Са2, находящийся во внешнем антенном светособирающем комплексе ФС2, может быть связан также с полипептидом D2 реакционного центра ФС2 вблизи акцепторной пары Qa - негемовое железо. Следует ожидать, что такая локализация участка связывания кальция вблизи этих электрон-транспортных компонентов будет проявляться в виде зависимости от кальция переноса электронов на акцепторной стороне ФС2.

В этой связи следует отметить, что в литературе имеются указания на возможность существования кальций-зависимого участка переноса электронов на акцепторной стороне ФС2 (Вагг et al., 1980), однако, данный вопрос практически не изучен. Учитывая вышеизложенное, мы провели исследование с целью выяснения участия кальция в обеспечении транспорта электрона на акцепторной стороне ФС2.

Согласно модели организации белка D2 (Draber, Trebst, 1984) участок возможного /связывания Са2 локализован в петле, которая соединяет трансмембранные спирали D, Ей расположена с внешней стороны тилакоидной мембраны. Таким образом, в отличие от кальций-связывающего участка в КВК, находящегося с внутренней стороны ТМ, обсуждаемый участок на акцепторной стороне расположен с наружной стороны ТМ. Отсюда следует, что

использование замкнутых ТМ для исследования роли кальция на акцепторной стороне ФС2 более предпочтительно по сравнению с частицами ФС2, поскольку кальций-направленным воздействиям в первую очередь будет подвергаться внешняя сторона ТМ и соответственно акцепторная сторона ФС2. Еще одним преимуществом ТМ является их большая нативность, поскольку выделение ФС2 из ТМ может сопровождаться модификацией детергентами акцепторной стороны ФСгО^йа!., 1990).

В качестве экспериментального подхода при решении поставленной задачи у бош применен метод экстракции кальция из ФС2 в ТМ с последующим исследованием влияния экстракции на электрон-транспортную активность фотосистемы и возможности реактивации ее активности с помощью кальция. Одним из эффективных методов экстракции, разработанных при изучении роли кальция в КВК ФС2, является обработка препарата цитра гаым буфером с низким значением рН (Опо, 1поие, 1988). Данный метод экстракции кальция и был применен в нашей работе.

ПЛ. Ингибирование акцепторного участка ФС2 в ТМ при рН-зависимой экстракции кальция.

Кратковременная (несколько минут) инкубация ТМ в цитратном буфере с рН меньше 5 приводит к ингибированию транспорта электронов (скорость переноса электронов измеряли после доведения рН среды инкубации до 7,5). Степень ннгибирования возрастала с уменьшением рН, достигая практически 100% при рНЗ,0. Электрон-транспортная активность после обработки ТМ средой с низким значением рН может быть восстановлена в результате последующей инкубации их с СаС12. Степень реактивации электрон-транспортной активности зависит от рН среды прединкубации: она составляет 10-20%, если ТМ были обработаны средой с рН 3,0 - 3,2, и достигает 75 - 100% после прединкубации ТМ в среде с рН 3,4 - 3,6. Из полученных результатов видно, что минимальное побочное (не связанное с экстракцией кальция) действие на электрон-транспортную цепь в ТМ оказывает кислая среда с рН 3,4 - 3,6. Указанные значения рН и были использованы в наших экспериментах. Реактивация электрон-транспортной активности наблюдается только при использовании ионов кальция. При добавлении других двухвалентных катионов (Mg2+, Мп2+ , Ва2+, Ре2+ ) к предобработанным ТМ реактивация не наблюдалась. Таким образом, причиной ингибирования ЭТЦ при обработке ТМ средой с низким значением рН, по-видимому, является экстракция кальция (или глубокая модификация

координационной структуры кальция), которая, возможно, обусловлена протонированием (согласно значениям pH, при которых происходит экстакция кальция) карбоксильных групп, участвующих в его связывании,

Локализаиия калъиий-зависимо?,о участка инактивации ЭТ11 в ТМ. Для выяснения локализации кальций-зависимого участка инактивации нами были использованы искусственные доноры и акцепторы электронов, донирующие или акцептирующие электроны на различных участках ЭТЦ в ТМ. Резулпагы экспериментов показали следующее. Экстракция кальция эффективно ингибирует транспорт электронов в ТМ от воды через ФС2 и ФС1 (к акцепторам электронов от ФС1 - ДХФИФ или метилвиологену), но не влияет на скорость переноса электронов только через ФС1 (от искусственных доноров для ФС1 ДХФЙФН2 или Ы.Ы.Ы'.Ы'-те^раметил-р-фенилендиамина восст. к искусственному акцептору для ФС1 - метилвиологену). Эффект экстракции кальция проявляется на уровне ФС2 (участок ЭТЦ от Н2О к искусственным акцепторам ФС2 - фенил-р-бензохинону, диметил-р-бензохинону, N.N.N'.N'-TerpaMenm-p-

фенилендиамину0КИСЛ (ТМФД0КС>). Полученные результаты свидетельствуют о том, что объектом pH-зависимой инактивации в ТМ является ФС2.

В опытах по выяснению локализации кальций-зависимого участка ингибирования ЭТЦ в ФС2 было установлено, что ДФК, искусственный донор электронов для ФС2, не восстанавливает электрон-транспортную цепь в ТМ, из которых был экстрагирован кальций. Это свидетельствует о том, что участок ингибирования расположен на акцепторной стороне ФС2,

В качестве другого метода определения локализации кальций-зависимого участка ЭТЦ в ФС2 был использован метод ЗФ. Метод основан на том, что различные компоненты кривой затухания ЗФ содержат информацию о состоянии определенных участков ЭТЦ. Долгоживущая компонента (2 - 4с) связана с реакцией рекомбинации S2Qa" (Lavorel et al„ 1982) и подавляется при ингибировании электронного транспорта на донорной стороне ФС2. Подавление миллисекундных компонент имеет место при инактивировании акцепторной стороны ФС2, например, диуроном (ДСМУ, ингибитор акцепторного участка), в концентрации, ингибирующей восстановление Qb (Hideg, Demeter, 1985). В нашей работе компьютерная обработка кривых затухания ЗФ контрольных хлоропластов позволила представить эти кривые в виде суммы трех компонент, имеющих время жизни 0,09с (первая компонента), 0,29с (вторая компонента) и 1,58с (третья компонента). Нами было исследовано влияние низких значений pH и

последующего добавления Са2+ на амплитуды этих компонент. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1. Параметры разложения кривых затухания ЗФ. апроксимированных суммой экспонент.

Измерение Компонента Время жизни Амплитуда

с отн.ед.

при рН 7,6 1 0,09 , • 29,4

2 0,29 18,2

3 1,58 2,9

при рН 7,6 1 - -

в присутствии 2 0,33 3,4

ДСМУ(ЮдМ) 3 2,47 1,6

при рН 7,6 1 0,09 3,8

(после обработки 2 0,50 2,9

средой с рН 3.3) 3 2,89 1,0

при рН 7,6 1 0,13 11,2

в присутствии 2 0,57 5,3

Са2+(10мМ) 3 3,2 1,4

(после обработки

средой с рН 3.3)

Из приведенных данных следует, что обработка ТМ нитратным буфером с низким значением рН приводит к подавлению преимущественно первой и второй компонент и слабому ингибированию третьей; добавление кальция ведет к восстановлению главным образом первой и второй компонент. Относительно слабое влияние обработки ТМ средой с низким значением рН на долгоживущую компоненту (1,58с) показывает, что эта обработка мало затрагивает донорную сторону ФС2. С другой стороны подавление быстрых компонент ЗФ свидетельствует о преимущественном ингибировании акцепторного участка. Ингибитор (ДСМУ) акцепторного участка подавлял компоненты ЗФ

аналогичным образом. После добавления ЮцМ ДСМУ короткоживущая компонента (0,09с) полностью исчезает, вторая компонента (0,29с) подавляется на 80%, а долго живущая (1,58с) на 45%. Полученные данные, как и результаты экспериментов с применением ДФК, также свидетельствуют о том, что участок кальций-зависимого ингибирования ЭТЦ, обнаруживаемый при обработке ТМ средой с низким значением рН, находится на акцепторной стороне ФС2.

Исследование природы лигандов. участвующих в связывании Са?+ . Известно, что в Са2"1"-связывающих белках (кальмодулин, тропонин и др.) в связывании этого катиона участвует только кислород, причем, главным образом кислород карбоксильных групп аминокислотных остатков. Для выявления участия карбоксильных групп в связывании тех или иных атомов металлов используются химические модификаторы карбоксильных групп аминокислот, среди которых наиболее часто применяется 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (ЭДАК). Этот карбодиимид водорастворим и не проникает в мембрану. В качестве липорастворимого карбодиимида с целью модификации карбоксильных групп полипептидов в гидрофобной зоне мембраны часто используется дициклогексилкарбодиимид (ДЦКД) (см. обзор НаБэтеп, УиокИа, 1993). Мы исследовали действие этих двух реагентов на процесс реактивации ЭТЦ в ТМ, обработанных цитратным буфером, с целью выяснения участия карбоксильных групп аминокислот в связывании кальция при реактивации. Проведенные эксперименты показали, что ДЦКД практически не влияет на уровень реактивации, тогда как добавление ЭДАК перед кальцием приводит к полному подавлению реактивации. Эти результаты свидетельствуют о том, что химическая модификация карбоксильных групп, осуществляемая ЭДАК, предотвращает связывание кальция и т.о. реактивацию ЭТЦ. Поскольку подобный эффект наблюдается при действии гидрофильного карбодиимида, но не гидрофобного, это указывает на то, что связывающие карбоксильные группы расположены с внешней стороны тилакоидной мембраны.

Таким образом, обработка ТМ средой с низким значением рН, используемая как метод экстракции кальция, сопровождается ингибированием ЭТЦ. Электрон-транспортная активность восстанавливается при добавлении кальция и реактивация специфична по отношению к данному катиону. Участок кальций-зависимого ингибирования расположен в акцепторной части электрон-транспортной цепи ФС2. Топологически он локализован с внешней стороны ТМ.

Из литературы известно, что аналогичная обработка частиц ФС2

сопровождается экстракцией кальция (Cal) из КВК фотосистемы (Ono, Inoue, 1988). С целью выяснения различий в свойствах кальций-связывающих участков на донорной и акцепторной стороне ФС2 в дальнейшей части нашей работы мы провели сравнительное исследование эффектов, наблюдаемых при рН-зависимой экстракции кальция из мембран ФС2 и ТМ.

11.2. Сравнительный анализ влияния рН-зависимой экстракции кальция из

мембранных препаратов ФС2 и из ТМ транспорт электронов и связанные процессы.

Экстракции калъиия из мембранных препаратов ФС2 и ТМ. Экстракция кальция из препаратов ФС2 и ТМ кислой средой сопровождается ингибированием ЭТЦ и протекает более медленно в случае препаратов ФС2. В присутствии феррицианида процессы инактивации ЭТЦ в этих объектах существенно различаются. В частицах ФС2 скорость инактивации ЭТЦ значительно увеличивается, тогда как в ТМ она замедляется (рис.5). Возможно, в первом случае эффект объясняется тем, что ФЦ изменяет устойчивость кальций-связывающего участка к действию рН, влияя на редокс-состояние марганцевого кластера. В ТМ акцепторный участок может претерпевать некоторые изменения в результате окисления негемового железа под действием ФЦ (Petrouleas, Diner, 1986). С этим согласуются результаты экспериментов Ренгера с соавторами (Renger et al., 1988), в которых была обнаружена взаимосвязь между редокс-состоянием негемового железа и устойчивостью акцепторного участка к действию атразина-.

Влияние света на калъиий-зависимую уеактиватю ЭТЦ в препаратах ФС2 и ТМ. Обнаружено существенное различие между не содержащими кальций ТМ и мембранами ФС2, заключающееся в различной чувствительности реактивации к освещению: в мембранах ФС2 комнатное освещение снижает уровень реактивации до 30%, тогда как в ТМ он повышается почти в два раза по сравнению с темновыми условиями. Известно, что ингибирование донорного участка в ФС2 сопровождается повышением чувствительности электрон-транспортной цепи к действию света (так называемое, "донорное фотоингибирование" (Blubaugh et al„ 1991)). Это и может быть причиной снижения уровня реактивации в случае частиц ФС2, в котором кислая среда экстрагирует кальций со стороны донорного участка. Противоположное действие света на процесс реактивации в случае ТМ может означать необходимость наличия восстановленных переносчиков электронов на акцепторной стороне для оптимизации связывания кальция.

Зависимость реактивации ЭТЦ в препаратах ФС2 и ТМ от концентраты Сд2+ . В мембранах ФС2, обработанных кислой средой, уровень реактивации достигает максимального значения пгш концентрации СаС12 50 - 60 мМ. В обработанных ТМ оптимальные концентрации СаС12 значительно меньше и составляют 5-10 мМ. При более высоких концентрациях кальция уровень реактивации в ТМ снижается до нулевого значения пр;;лонцентрации катиона 60 мМ.

Уровень электрон-транспортной активности реактивированных препаратов в присутствиии различных акцепторов. В качестве искусственных акцепторов электронов при измерении электрон-транспортной активности ФС2 наиболее часто используют феррицианид и бензохиноны (например, фенилбензохинон). Для интактных мембранных препаратов ФС2 фенилбензохинон является гораздо более эффективным акцептором, чем ФЦ. Скорость выделения кислорода в присутствии ФЦ составляет лишь около 10% от величины скорости, наблюдаемой в случае с фенилбензохиноном. В реактивированных частицах ФС2, из которых предварительно был экстрагирован кальций, скорость транспорта электронов также значительно больше при использовании фешшбензохинона, чем ФЦ.

В интактных ТМ и фенилбензохинон и ФЦ являются эффективными акцепторами электронов.-Однако, ЭТЦ, поддерживаемые этими акцепторами, инактивируются обработкой кислой средой (рН 3,5) в разной степени: в случае ФЦ уровень остаточной активности 50 - 60%, а в случае фенилбензохинона 20 - 30% . Эффективность реактивации кальцием ЭТЦ ТМ при использовании этих акцепторов также различается: цепь, поддерживаемая ФЦ, реактивируется полностью, тогда как при использовании фенилбензохинона уровень реактивации не превышает 40%. Более того, было обнаружено, что бензохиноны ингибируют перенос электронов от воды к ФЦ в реактивированных ТМ. Факт ингибирования бензохинонами выделения 02 в случае совместного использования с ФЦ показан в работе Боулби и Йокум (Во\у1Ьу, Уосшп, 1993) на препаратах ФС2, в которых обработкой холатом был нарушен акцепторный участок ФС2.

К^ для калъиий-сеяшваюшего участка в препаратах ФС2 и ТМ. Кажущаяся константа м'ихаэлиса, используемая как характеристика прочности связывания кальция с ' кальций-связывающим участком, является одной из важных характеристик этого участка. Значение Км, определенное из графика Лайнуивера-Бэрка для ТМ, обработанных средой с низким значением рН, составило 0,5 мМ.

Для сравнения укажем, что для Са^4" в КВК были получены два значения Км , лежащих в пределах 50 - 100 цМ (высокоэффективный участок связывания) и 1 - 7 мМ (низкоэффективный участок связывания) (Boussac et al„ 1985; Homann, 1988).

Кинетика индукиии фпх-оресценции в препаратах ФС2 и ТМ до и после

кальиий-зависимой реактивации ЭТЦ_^Различная локализация участка

—ингибирования в электрон-транспортной цепи при обработке цитратным буфером с низким значением pH мембранных препаратов ФС2 и ТМ особенно наглядно проявляется при измерении кинетики индукции флуоресценции. Освещение растительных объектов сопровождается появлением флуоресценции, возникающей главным образом, в результате реакций в ФС2 (Krause, Weis, 1991). После достижения максимума интенсивность флуоресценции уменьшается со временем, достигая стационарного уровня через несколько минут. В настоящее время установлено, что максимум флуоресценции наблюдается при максимальном уровне восстановления первичного пластохинонного акцептора Qa. Снижение уровня флуоресценции обусловлено "фотохимическим" тушением (в результате окисления Qa* пулом пластохинонов) и "нефотохимическим" тушением (одной из основных причин которого является образование трансмембранной разности потенциалов).

На рис. 6 представлены результаты сравнительного измерения кинетики индукции флуоресценции (в минутном диапазоне) для ТМ и мембранных препаратов ФС2. В интактных препаратах (А, I и II) в процессе освещения интенсивность флуоресценции уменьшается от Fmax до стационарного значения в течение нескольких минут. Экстракция кальция из ТМ и ФС2 цитратным буфером с низким значением pH влияет на кинетику флуоресценции этих объектов совершенно различным образом (рис 6Б). В обработанных TM Fmax значительно меньше, чем в необработанных препаратах (практически на уровне стационарной флуоресценции), что свидетельствует о низкой степени восстановленности Qa (Krause, Weis, 1991). В мембранных препаратах ФС2, из КВК которых экстрагирован кальций, Fmax составляет 75-90% от Fmax в контрольных препаратах. Затем флуоресценция в мембранах ФС2, не содержащих кальций, очень быстро уменьшается до стационарного уровня и скорость этого уменьшения гораздо больше, чем в интактных препаратах ФС2. Подобная кинетика флуоресценции наблюдается также и при ингибировании КВК гидроксиламином. Добавление Са2+ к мембранам ФС2 или ТМ, из которых был'

Й

90-1

. / 6 0-

ё зо-

| 0-

ы

5

в 60-;

о £

е 30

В

г

10 т!п

1 I I 1 I I I

ПГЕМЯ. МИН

Рис. б, Кинетика аддукции флуоресценции в мембранных препаратах ФС2 (I) и тилакоидньшмембранах (II). А - контроль; Б - после рН обработки; В - после рН обработки и Ю шш. инкубации в присутствии 50 мМ (доя ФС2) или 20 мМ (для ТМ) СаС1г; Г --1 акжекак и Б, но с добавлением 0,5 мМ ДФК. Измерения были проведены при рНб,5 в случае препаратов ФС2и 7,6 для ТМ. Интенсивность возбуждающегосвета 480 цмолей кваитов/м^ с.

100'

э

к

ь О

80-

§ 60-

х

ы

В 40-

ы

а.

О

§ 20-

а \

I

б

в \

2 т1л

Т

~ 1-Г

ВРЕМЯ

Рис. 7. Кинетика индукции флуоресценции в мембранных препаратах ФС2 (I) и ТМ (II). а - контроль; 6 - после рН обработки; в - после рН обработки и 10 мин. инкубации в присутствии 50 мМ (ФС2) или 20 мМ (ТМ) СаС12. Измерения были проведены при'рН 6,5 в случае ФС2 и рН 7,6 для ТМ. Интенсивность возбуждающего света 240 цмолей квантов/м2 с. -

0

б

а

экстрагирован кальций, восстанавливает кинетику индукции флуоресценции как в случае ТМ, так и в случае ФС2 (рис.бВ).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что экстракция кальция ингибирует различные участки ЭТЦ в ТМ и ФС2. Это видно также при сравнении кинетики индукции флуоресценции, наблюдаемой в результате добавления ДФК к препаратам, из которых экстрагирован кальций (рис.бГ)- В мембранах ФС2 ДФК (0 5 мМ) восстанавливает кинетику индукции флуоресценции, подтверждая ¿ем самым, что участок ингибирования расположен на донорной стороне ЭТЦ. В случае ТМ ДФК абсолютно неэффективен, что может быть объяснено только тем, что участок ингибирования расположен на акцепторной стороне ФС2. Подавление переменной флуоресценции в ТМ в результате экстракции из них кальция в сочетании с отсутствием способности ДФК восстанавливать транспорт электронов в таких мембранах указывают на то, что участок ингибирования в ТМ, обработанных кислой средой, расположен на акцепторной стороне на уровне Qa или между Р680-Од.

Различия в кинетике индуции флуоресценции между мембранами ФС2 и ТМ, обработанными средой с низким значением рН, имеют место и в секундном диапазоне. Измерения в этом диапазоне продемонстрировали также, что, хотя кальций и восстанавливает максимальный уровень флуоресценции в ТМ, скорость нарастания ее до этого уровня существенно ниже, чем в контроле. Особенно наглядно этот эффект наблюдается при измерении кинетики индукции флуоресценции в минутном диапазоне с использованием малых интенсивностей возбуждающего света (рис.7). Как видно из представленного рисунка, добавление Са2+ к обработанным кислой средой ТМ практически полностью восстанавливает уровень флуоресценции, однако, скорость достижения ею максимального значения значительно уменьшается. Данный факт свидетельствует о том, что экзогенный кальций не полностью восстанавливает флуоресцентные характеристики ТМ, обработанных средой с низким значением рН. 113. Заключение.

Полученные нами результаты показали, что РЦ ФС2 помимо участка связывания катиона кальция (Cal) в КВК содержит еще один кальций-связывающий участок. Экстракция кальция из этого участка приводит к ингибированию цепи переноса электронов к Qa на акцепторной стороне ФС2. Анализ полученных результатов и литературных данных указывает, что катион кальция из внешнего светособирающего антенного комплекса, возможно, связан

также с кальций-евязывающим участком на акцепторной стороне ФС2, обеспечивая тем самым ассоциацию РЦ с этим комплексом.

Устойчивость кальция, связанного с акцепторным кальций-евязывающим участком ФС2, к действию экстрагирующего фактора (среда с низким значением pH) гораздо меньше в ТМ,. чем в изолированных частицах ФС2. Это различие может объясняться модификацией детергентами акцепторной стороны ФС2 при выделении частиц ФС2 из ТМ. Действительно, в работе (Haag et al., 1990) было показано, что обработка ФС2 детергентами в процессе экстракции частиц ФС2 из ТМ сопровождается удалением большей части пластохинонового пула и модификацией структуры Qt> участка. Различия свойств акцепторного участка в частицах ФС2 по сравнению с ФС2 в ТМ проявляются также в разной способности некоторых акцепторов электронов акцептировать электроны, а также в различной величине pH среды, оптимальной для переноса электронов в ФС2. Например, для частиц ФС2 оптимум pH лежит в области 6,5, тогда как для ФС2 в ТМ эта величина равна 7,5. В тоже время в ТМ, которые не содержат внешнего светособирающего антенного комплекса и имеют только один атом кальция на РЦ ФС2, оптимум/pH для функционирования ФС2 равен 6,5 (Jahns, Junge, 1992). Следует отменить, что в последние годы стали появляться прямые данные, свидетельствующие об йнгибировании ЭТЦ на акцепторной стороне ФС2 и в мембранных препаратах ФС2 при экстракции из них кальция (Andreasson et al., 1995).

В проведенных нами экспериментах мы не наблюдали влияния кислой среды на кальций-связывающий участок на донорной стороне ФС2 в ТМ. Отсутствие такого влияния может объясняться следующим. Если обработка хлоропластов средой с низким значением pH приводит к высвобождению кальция из КВК, то этот катион будет попадать во во внутритилакоидное пространство. Однако, малый объем и замкнутость внутритилакоидного пространства обеспечат высокую концентрацию кальция внутри этого пространства и при восстановлении pH реактивация данного участка будет происходить и без добавления кальция извне, как это недавно бшо показано (Krieger et al., 1993).

Близкая локализация участков связывания Са2 и Qa в полипептиде D2 дает основание предположить, что воздействие на Са2 может приводить к модификации свойс.з комплекса Qa - негемовое железо и наоборот. В этой связи следует отметить обнаруженный Кригер и Вейс (Krieger, Weis, 1993) сдвиг окислительно-восстановительного потенциала Qa на 160 мв (от -120 до +40мв) при

подкислении среды, а также обнаруженное нами увеличение устойчивости к действию кислой среды при добавлении ФЦ, окисляющего негемовое железо (Petroleus, Diner, 1986). Близость участков связывания Qa и Са2 указывает также на

возможность электростатического взаимодействия между восстановленным Qa~ и кальцием и влияния таким образом Qa" на координационную сферу кальция и через нее на конформационную структуру минорного белка СР29 антенного комплекса. Мы полагаем, что подобное взаимодействие может лежать в основе механизма "фотохимического" тушения флуоресценции (когда уровень флуоресценции зависит от степени восстановленности Qa), имеющего место, по мнению ряда авторов, в минорных белках антенного комплекса ФС2 (Crofts, Yerkes, 1994). В этой связи следует отметить также недавнее предположение Басси (Bassí, 1992) о том, что минорные хлорофилл а/Ь связывающие белки, по-видимому, участвуют в регуляции рассеивания избытка световой энергии в тепло. Са2, таким образом, может играть роль сопрягающего фактора между электрон-транспортным процессом, протекающим в реакционном центре ФС2, и процессами миграции и рассеивания световой энергии в антенном комплексе. ЧАСТЬ III. ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ

ОРГАНИЗАЦИИ МАРГАНЦЕВОГО КЛАСТЕРА В КИСЛОРОД-ВЫДЕЛЯЮЩЕМ КОМПЛЕКСЕ ФС2 Одним из ключевых вопросов, касающихся структурной организации марганцевого кластера в КВК и механизма фотолиза воды, является природа лигандов, связывающих марганец. В соответствии с уже известной структурой Мп-содержащих центров других марганцевых белков в качестве наиболее вероятных лигандов марганца предполагаются карбоксильные группы аминокислот (аспарагиновой и глутаминовой) и гистидин. Имеющиеся экспериментальные работы, в которых исследовалась природа марганцевых лигандов в КВК, в соответствии с применяемым методом можно разбить на три группы. В первой группе работ используются химические модификаторы аминокислотных остатков - диэтилпирокарбонат для гистидина и карбодиимиды для карбоксил-содержащих аминокислот. С помощью этих реагентов установлено, что в связывании Мп принимают участие как карбоксильные группы, так и азот гистидиновых остатков (Preston, Seibert, 1991; Blubaugh, Cheniae, 1992). Вторая группа работ включает исследования с применением современных спектроскопических методов (например, двойной электронно-ядерный парамагнитный резонанс), позволивших показать наличие гистидина в координационной сфере марганца (Tang et al., 1994).

Третью группу работ образуют исследования на мутантах цианобактерий, в которых изучаются функциональные параметры ФС2 при замещении аспарагиновой, глутаминовой аминокислот и гистидина в белках DI, D2 на другие аминокислоты. При этом было установлено, что замена Asp59, Glu65, Aspl70, GIu 189, His 190, His332, GIu333 и His337 в белке DI приводит к подавлению или исчезновению фотоавтотрофного роста. Возможным кандидатом на роль лиганда является также Glu70 в полипептиде D2 (см. обзоры Debus, 1992 и Verrojas, 1993). Однако, наблюдаемые эффекты в исследованиях с использованием модификаторов аминокислотных остатков или мутантов могут быть в определенной степени результатом конформационных изменений в полипептидной цепи при замещении и модификации ее аминокислотных остатков. В этой связи возникает потребность применения другчх методов, позволяющих получить информацию о координационной сфере марганцевого кластера.

Одним из эффективных методов исследования структурно-функциональной организации металл-содержащих центров в белках является метод замещения нативного металла на катионы другого металла. Это позволяет определить специфичность замещаемого катиона в обеспечении функциональных характеристик белка. Кроме того, включение другого металла в металлсодержащий центр вместо исходного позволяет использовать для изучения этого центра новые физико-химические методы. Возможность связывания с Мп-связывающим участком КВК была изучена для Со, 2n, Mo, Са, Ва, Си (Hsu и др. 1987; Preston, Seibert 1991) и показана их значительно меньшая эффективность связывания по сравнению с марганцем. Проведенный нами анализ показал, что более привлекательны и перспективны в этом отношении катионы железа. По своим основным физико-химическим характеристикам, имеющим значение для связывания, ионы железа очень близки к катионам марганца: 1) координационное число равно 6 в обоих случаях; 2) ионные радиусы равны 0,80А/0,66А и 0,74/0,64А соответственно для пар Mn(lI)/Mn(III) и Fe(II)/Fe(III) и 3) катионы железа, также как и катионы марганца, редокс-активны при физиологических условиях, что реализуется в большом количестве разнообразных железо-содержащих белков. Кроме того, в случае успешного замещения марганца в КВК на железо возможно применение для изу- ения структуры координационной сферы каталитического центра метода мессбауеровской спектроскопии (МС), показавшего свою высокую эффективность в области химии координационных соединений. Эффект Мессбауера, на котором основана МС, ьаблюдаегся на узком круге элементов,

включающем стабильный изотоп железа Марганец в число таких элементов не входит, поэтому использование метода МС для изучения лигандной структуры связывающего участка в КВК становится возможным только после замещения марганца на 57ре, Принимая во взимание вышесказанное, мы исследовали взаимодействие Ре(И) и Ре(Ш) с Мп-связывающим_участком КВК. Щ.Л^Связывание катионов железа с марганец-связывающим центром в ФС2.

Для успешного замещения одного металла на другой в каталитическом центре белков необходимо применение метода экстракции исходного металла, при котором сохраняется нативность белковой структуры. Для марганцевого кластера ФС2 подобные методы уже разработаны. Марганец может быть экстрагирован гидроксиламином (Татига, СЬешае, 1985) или трисом (Климов и др., 1982; Ки;уаЬага, Мига1а, 1983) с сохранением нативносги связывающего центра. В дальнейшем эти препараты мы будем обозначать ФС2(-Мп).

Лишенный марганца в результате подобной обработки Мп-связывающий участок КВК способен вновь связывать марганец в процессе инкубации мембранных препаратов ФС2(-Мп) с Мп(Н). Процесс связывания требует освещения препарата светом слабой интенсивности (комнатное освещение или несколько более интенсивное - 30 - 50 цмолей квантов/м^ с). Свет обеспечивает разделение зарядов в реакционном центре ФС2 и окисление на донорном участке РЦ катионов Мп(Н) до Мп(Ш), которое сопровождается связыванием катионов марганца с Мп-связывающим участком. В процессе формирования четырехъядерного кластера свет необходим для связывания только первых двух катионов марганца, связывание двух других катионов не требует освещения и может протекать в темноте. Марганец связывается с Мп-связывающим участком в препаратах ФС2(-Мп) с низкой эффективностью; необходима достаточно длительная инкубация (30-60 мин) мембранных препаратов ФС2(-Мп) с Мп(Н) для формирования четырехъядерного кластера. Сформированный марганцевый кластер не способен катализировать реакцию расщепления воды, для этого необходим еще и катион кальция. Возможно, что для осуществления фотолиза воды достаточно двух катионов марганца, остальные два катиона играют структурную роль (Аллахвердиев и др., 1983; АНасЬуегсПеу й а1., 1995).

Препараты ФС2, из которых экстрагирован марганец, не способны окислять воду, но окисляют искусственные доноры электронов, например, ДФК. Мембраны ФС2(-Мп), окисляя ДФК, восстанавливают акцептор электронов, в качестве которого наиболее часто используется ДХФИФ. В 1987 г. Хсу с соавт.

обнаружили, что добавление катионов мараганца к препаратам ФС2(-Мп) приводит к ингибированию транспорта электронов от ДФК к ДХФИФ. Ингибирование реакции ДФК - ДХФИФ наблюдается после кратковременной (время в пределах приготовления обрзца) инкубации препаратов ФС2(-Мп) с Mn(II) в условиях комнатного освещения. Исследование механизма этого эффекта показало следующее: ДФК донируег электроны в ФС2(-Мп) через Мп-связывающий участок; связывание катионов марганца с Мп-связывающим участком предотвращает донирование электронов дифенилкарбазидом через этот участок; ингибирование реакции ДФК - ДХФИФ, по-видимому, отражает связывание первого катиона марганца из четырехъядерного кластера, хотя этот вопрос в настоящее время изучен недостаточно. Адекватность интерпретации результатов в данной модели была подтверждена в дальнейшем ( Preston, Seibert, 1991) и в настоящее .фемя эта модель используется достаточно часто при изучении КВК (Kullander et al„ 1995; Ghirardi et al., 1995).

Метод Hsu с соавт. (1987) дает возможность исследовать связывание с Мп-связывающим участком не только марганца, но и катионов других металлов. Данный метод и был использован нами для изучения связывания катионов железа с Мп-связывающим участком.

Последовательность решаемых в работе задач была следующей: 1) изучение связывания Fe(II) и Fe(III) с Мп-связывающим участком КВК и сравнительный анализ характеристик связывания катионов железа и марганца с этим участком; 2) разработка метода приготовления образцов для МС и измерение мессбауеровских спектров; 3) анализ и интерпретация полученных результатов.

Взаимодействие катионов Mn(ll). Feill) и FefHI) с Мп-связываюши.м участком. Добавление Mn(II) к мембранам ФС2(-Мп) (мембраны ФС2, из которых экстрагирован марагнец) приводит к уменьшению скорости восстановления в этих мембранах ДХФИФ от донора электронов ДФК, что, как отмечалось выше, обусловлено связыванием этих катионов с Мп-связывающим участком КВК. В наших экспериментах уже при концентрации марганца около 2 цМ это уменьшение достигает максимальной величины (50% в данном тесте) (рис.8).

Инкубация мембран ФС2(-Мп) в среде, содержащей Fe(II), также приводит к снижению скорости фотовосстановления ДХФИФ от ДФК. При этом было обнаружено, что 50% ингибирование переноса электрона к ДХФИФ достигается даже при несколько меньших концентрациях железа в среде, чем в случае

марганца. Данный факт демонстрирует высокую, сопоставимую с Мп, эффективность связывания Fe(II) с Mn-связывающим участком. Отметим, что катионы других металлов связываются с марганцевым центром гораздо менее эффективно - концентрация насыщения связывания более 20 цМ (Hsu et al.,1987; Preston, Seibert, 1991). В отличие от Fe(II) катионы трехвалентного железа практически не оказывают никакого влияния на эшшюнный транспорт в мембранах ФС2(-Мп) в присутствии ДФК и -ДХФИФ (измерено до концентрации 80цМ), что означает отсутствие связывания Fe(III) с Mn-связывающим центром этих препаратов (рис.8). Это свойство Fe(III) не связано с нестабильностью Fe(III) в растворах с рН>2 (Kragten, 1978), поскольку в экспериментах были использованы стабилизированные сахарозой по методу Charley et al., (1963) растворы трехвалентного железа.

Влияние анионов на связывание катионов металлов с Мп-связываюшим участком. Hsu и др. (1987) обнаружили, что эффективность связывания Мп с Мп-связывающим участком изменяется в присутствии различных анионов. Степень влияния анионов на процесс связывания марганца коррелирует с их способностью реактивировать процесс выделения кислорода в ФС2, не содержащей анионов хлора. Принимая во внимание описанное выше большое сходство в концентрационной зависимости связывания катионов марганца и двухвалентного железа, в последующих экспериментах мы сравнили эффекты различных анионов на взаимодействие Mn(II) и Fe(II) с Mn-связывающим участком. Изученные анионы (соли натрия) ингибировали связывание марганца в следующей последовательности эффективностей SO^" > СН3СОО" > Br' > С1". Эта последовательность практически совпадает с последовательностью, установленной Hsu и др. (1987). Связывание Fe(II) также ингибировалось этими анионами в близкой последовательности: SO42"« СН3СОО' > CI" > Вг. На рисунке 9 показано ингибирование фотовосстановления ДХФИФ катионами металлов в присутствии различных анионов как функция объема аниона. Зависимости для Fe(II) и Mn(Il) практически совпадают и соответствуют графику реактивации выделения кислорода различными анионами в тилакоидных мембранах, не содержащих С1". Эти результаты показывают, что связывание марганца и железа с марганец-связывающим участком модулируется различными анионами практически одинаково.

Прочность связывания катионов железа с Мп-связываюшим участком и их рфокс состояние в связанном положении. Катионы железа, связанные с Мп-

О 2 4 6 8- 10 12 Концентрация катиона,

Рис. 8

Рис. 8. Влияние Мп(Н) ( о ), Ре(П) ( д. ) и Ре(Ш) ( □; ) на транспорт электрона от ДФК к ДХФИФ в мембранных препаратах ФС2, не содержащих марганца. По оси ординат к=скоросггь восстановления ДХФИФ в присутствии катиона металла / скорость • воссггановленвдДХФИФ в отсутствии катиона металла.

Рис. 9. Связывание Ми(П)( О )и Ре(И) (Л ) с Мп-связывающим участком в присутствии различных анионов.

Рис. 10. Ингибированиекатионами Ре(Н) ( Д ) и Мп(Н) ( ° ) фотовосстановлсння ДХФИФ от ДФК в мембранных препаратах ФС2, не содержащих марганца. Построение в координатах: наклон прямых из координат Лайнунвср-Бэрх - концентрация ингибитора.

0.00 0.20 0.40 0.60 Объем аниона, нм^

. Рис. 9

0.00 0.30 0.60 0.90

1.2С

КОНЦЕНТРАЦИЯ КАТИОНА, цМ Рис. 10

связывающий участком, устойчивы к действию хелаторов (ЭДТА, а.а'-дипиридил, нитрилотриуксусная кислота, ChelexX-100, трискарбоксиметилэтилендиамин). Этот факт свидетельствует о высокой прочности связывания катионов железа и в свою очередь указывает на то, что связанное железо находится в окисленной форме (прочность комплексов Fe(III) с хелатирующими соединениями, как правило, гораздо выше, чем комплексов с Fe(II)). Этот вывод был подтвержден в эксперименте, в котором перед хелатором добавляли сильный восстановэтель -дитионит натрия. В этом случае хелатор (а,а'-дипиридил) экстрагировал связанный катион железа и активность мембран ФС2(-Мп) (реакция ДФК -ДХФИФ) восстанавливалась практически до исходной величины (93%). Полученные результаты свидетельствуют о том, что связывание железа сопровождается его окислением, точно также как и связывание марганца (Miller, Brudvig, 1989).

Влияние восстановителей на взаимодействие Fe (11) с Мп-связываюшим участком. При изучении влияния анионов нами было обнаружено сильное ингибирующее действие на фотовосстановление ДХФЙФ анионов иода (соль Nal), являющихся восстановителем с окислительно-восстановительным потенциалом 0,53в. Принимая это во внимание мы измерили концентрационную зависимость действия Nal, а также таких восстановителей как ферроцианид (Ео=0,43в) и аскорбат (Ео=0,08в) на транспорт электронов в ФС2(-Мп) от ДФК к ДХФИФ. Было обнаружено, что эти соединения ингибируют электронный транспорт. Характер концентрационной зависимости ингибирования соответствует характеру концентрационной зависимости ингибирования для Мп, т.е. имеет место насыщение при ингибирования (60% для ферроцианида и аскорбата и около 40% для Nal). Последовательность концентраций, при которых наблюдается 50% ингибирование, совладает с последовательностью их окислительно восстановительных потенциалов: аскорбат натрия > ферроцианид > Nal. Форма зависимости ингибирования переноса электронов от ДФК к ДХФИФ от концентрации восстановителя указывает на то, что восстановители ингибируют донирование электронов дифенилкарбазидом через Mn-связывающий участок. Это может означать, что Mn-связывающий участок содержит редокс-активный компонент и его восстановление делает невозможным взаимодействие ДФК с этим участком. В связи с этим можно также ожидать, что и связывание железа будет ингибироваться восстановителями. Результаты экспериментов действительно показали, что добавление аскорбата перед железом предотвращает связывание

катионов железа, тогда как добавление восстановителя после Fe(II) не влияет на взаимодействие катионов металла с Mn-связывающим участком. Отсюда следует, что редокс-а1'хивный компонент либо сам участвует в связывании железа, либо оказывает сильное влияние на процесс связывания железа с Мп-связывающим участком.

Имеется два ряда фактов, указывающих на существование редокс-активного компонента на донорной стороне ФС2. Первое, после экстракции Са2+ из КВК появляется ЭПР сигнал с g-фактором около 2 в Бз-состоянии марганцевого кластера. На основании спектров поглощения в ультрафиолетовой области (Boussac и др., 1990) было установлено, что этот ЭПР сигнал появляется в результате окисления гистидина. Второе, существование фотоокисляемого остатка гистидина на донорном участке было предположено на основании результатов измерения термолюминесценции. Полоса Ат, появляющаяся в мембранах ФС2 после экстракцци марганца, исчезала при обработке препаратов ФС2(-Мп) химическим модификатором остатков гистидина (Опо и Inoue, 1991). Эти авторы также предположили , что остаток гистидина является редокс-активным лигандом для марганца (One и Inoue, 1991).

Ингибируюи.ий эффект различных восстановителей на фотоактивацию в условиях непрерывного (Tamura, Cheniae, 1987) или импульсного освещения (Опо и Inoue, 1987) был показан и в случае реактивации марганцем КВК. Авторы высказали предположение, что восстановитель ингибирует связывание, восстанавливая окисленный (Mn(III)) катион марганца. Наши результаты показывают, что восстановитель (по крайней мере, в случае Fe(II)) может взаимодействовать не только с катионом металла, но и с редокс-компонентом связывающего участка.

Влияние света щ связывание Fefll) с Мп-связыеаюшим участком. Связывание железа с Mn-связывающим центром, как показали результаты предыдущих экспериментов, сопровождается его окислением. Этот процесс может быть результатом автоокисления при координации атома железа на участке связывания, либо фотоокисления как в случае взаимодействия марганца с Мп-связывающим участком. Для получения однозначного ответа в последующих экспериментах мы прежде всего исследовали влияние света (комнатное освещение, около 15 цмолей квантов/м^ с) на связывание Fe(II) с Mn-связывающим участком.

. Fe(II) добавляли в отсутствии света к адаптированным к темноте мембранам ФС2(-Мп), после чего инкубировали в условиях комнатного освещения

в течение 6 мин или же инкубировали в темноте. Далее, среду инкубации с железом заменяли с использованием центрифугирования на среду, не содержащую железо, для того, чтобы на стадии измерения скорости фотовосстановления ДХФИФ, требующей освещения образца насыщающим светом, железо в растворе отсутствовало. На этой стадии может иметь место связывание катионов железа под измеряющим лучом света. После замены среды инкубации определяли электрон-транспортную активность препаратов (таблица 2).

Таблица 2. Влияние света (комнатный. 3 мин) на связывание ИеПП с Мп-связываюшим участком в ФС2(-Мп). •

Образец Свет Центрифугирование Электрон-транспортная активность

СДФК-ДХФИФ), %

ФС2(-Мп) + 100

ФС2(-Мп) + + 80

ФС2(-Мп)

в присутствии Fe(II) + - 45

ФС2(-Мп)

в присутствии Fe(II) + + 49

ФС2(-Мп) - + 115

ФС2(-Мп)

в присутствии Fe(ll) - + 108

Полученные данные показывают, что нескольких минут инкубации мембран ФС2(-Мп) с Ре(Н) при комнатном освещении достаточно для связывания катиона железа с марганцевым участком. В тоже время после инкубации мембран с Ре(Н) в темноте электрон-транспортная активность образцов сохранялясь на исходном уровне, т.е. связывание отсутствовало. Из полученных результатов следует, что взаимодействие железа с Мп-связывающим участком является светозависимым процессом. Максимальное связывание наблюдается приблизительно через 3 мин освещения образца комнатным светом. Полученные данные свидетельствуют о том, что окисление железа в процессе связывания осуществляется с участием фотоиндуцируемого в мембранных препаратах ФС2(-Мп) оксиданта. Наиболее вероятно, что в качестве такого оксиданта участвует остаток гистидина. В пользу

этого свидетельствуют следующие факты: 1) в связывании марганца в КВК участвует гистидин (Tang et al., 1994); 2) в КВК имеется гистидиновый остаток, окисляющийся в процессе светоиндуцированного разделения зарядов в реакционном центре ФС2. Окисление гистидина сначала было обнаружено в препаратах ФС2, не содержащих марганца, с применением методов термолюминесценции (Ono, Inoue, 1991) и в препаратах ФС2, не содержащих кальция, с примечанием ЭПР (Boussac et al., 1990). Предположено, что этот редокс-активный остаток гистидина участвует в связывании марганца (Ono, Inoue, 1991). Совсем недавно было установлено, что окисление гистидинового остатка в центре связывания марганца в КВК имеет место и в нативных препаратах ФС2 (Haumann et al., 1996). ■

Кинетический анализ механизма связывания Fe(II) с Мп-связываюшим участком. В дальнейших экспериментах, используя методы ферментативной кинетики, мы исследовали механизм взаимодействия железа с марганец-связываюшим участком. С этой целью были измерены концентрационные зависимости ингибирования марганцем и железом реакции фотовосстановления ДХФИФ препаратами ФС2(-Мп) для нескольких концентраций субстрата (ДФК). Полученные данные были представлены в координатах Лайнуивер-Бэрк. Совокупность прямых для различных концентраций ингибитора в случае марганца имеет общую точку пересечения, лежащую в верхней левой части системы координат вблизи оси ординат. Это свидетельствует о том, что ингибирование реакции окисления ДФК марганцем протекает по смешанному типу, т.е. имеет место как конкурентный, так и неконкурентный механизм ингибирования, но с большей долей конкурентного типа. Полученный нами результат согласуется с данными Hsu и др. (1987), показавших конкурентный механизм ингибирования для марганца. В случае железа эта точка пересечения лежит на оси ордиьат, что указывает на конкурентное взаимодействие железа и ДФК с Мп-связываю, дим участком.

Параметры кривых в координатах Лайнуивер-Бэрк были использованы для представления полученных результатов в координатах: наклон прямой в координатах Лайнуивер-Бэрк - концентрация ингибитора. Из графиков, приведенных на рис.10, видно различие между ингибирующими эффектами марганца и железа. В данных координатах зависимость для марганца имеет форму прямой линии, свидетельствующей о линейном характере ингибирования, тогда как в случае железа эта зависимость имеет параболическую форму. Параболическая форма кривой, с точки зрения ферментативной кинетики (Roberts,

1977) означает, что иншбирование обусловлено связыванием двух молекул ингибитора, причем связывание первой молекулы значительно облегчает связывание второй. То есть, в нашем случае это свидетельствует о связывании двух катионов железа, окисляющихся при взаимодействии с Мп-связывающим участком, и формировании таким образом кластера (Ре(Ш)]2-

Из литературных данных известно, что сборка марганцевого тетрамера протекает в два этапа. Первый этап - светозависимый (в условиях низкой интенсивности света) и заканчивается формированием кластера [Мп(Ш)]2. Второй этап не требует света, на этой' стадии связываются остальные два катиона двухвалентного марганца. То есть, состав кластера, образующегося на светозависимой стадии, одинаков для марганца и железа. Прямая, а не параболическая линия в координатах наклон - концентрация ингибитора для марганца обусловлена, как установлено в проведенных нами экспериментах, значительно более низкой скоростью связывания марганца, чем железа. Это приводит к тому, что в процессе кратковременной инкубации мембран ФС2(-Мп) с марганцем при комнатном освещении связывание этого катиона имеет место практически только на стадии измерения фотовосстановления ДХФИФ, на которой препарат облучается светом большой интенсивности. По-видимому, в таких условиях (сильный свет) формирование димера марганца не происходит. Это и обуславливает разницу в ходе зависимостей для марганца и железа в координатах наклон-концентрация ингибитора.

Заключение. Таким образом, подводя итог проведенным измерениям, можно выделить следующие наиболее важные моменты. Инкубация мембран ФС2(-Мп) в растворе Ре(П) сопровождается светозависимым процессом связывания катионов железа с Мп-связывающим участком, при этом происходит окисление железа. Схема процессов, наблюдаемых при изучении связывания Ре(Н) с Мп-связывающим участком КВК приведена на схеме 2. Другим и наиболее важным моментом является то, что в процессе изучения взаимодействия железа с Мп-связывающим участком впервые обнаружено большое сходство по целому ряду параметров между связыванием железа и марганца с марганцевым центром (табл. 3). Это открывает возможность замещения марганца в КВК на железо и

использования МС для изучения координационной сферы Мп-связывающего участка.

Схема 2. Транспорт электронов в препаратах ФС2,1 - ФС2, транспорт от Н2О к ДХФИФ; II - ФС2(-Мп), транспорт от ДФК к ДХФИФ; Ш - ФС2(-Мп) после инкубации с Мп(Н), транспорт от ДФК к ДХФИФ; IV - ФС2(-Мп) после инкубации с Ре(П), транспорт от ДФК к ДХФИФ

2Н20 02

ч

Оь

дхфиф дхфифн2 680+

(£> V

/ I р

0ь_

дхфиф дхфифн2

дфк /

ш

о

1/4

дхфиф дхфпфн2 680+

ДФК

п

о

/V

У Р680+

дхфиф дхфифн2

ДФК

IV

Таблица Ъ. Характфистики связывания МпСТП и Ре(Ш с Мп-связываюшим участком КВК.

Характеристика Мп(И) Ре(И)

Концентрация насыщения связывания ~ 2 цМ ~2 цМ Влияние анионов БО^' > СЩСОО' > Вг > С1" БО^" ~ СН3СОО- > С1->Вг

Окисление при связывании + +

Ингибирование связывания восстановителями + +

Зависимость связывания от света + + Кластер, формирующийся на светозависимом

этапе связывания . [Мп(Ш)]2 [Ре(Ш)]2

Ш.2. Замещение марганца в каталитическом центре КВК на мессбауеровский изотоп железа (^Fe) и мессбаусровские спектры полученных при замещении препаратов ФС2.

Связывание катионов Feilt) и Fe fill) с мембранными компонентами фотосистемы помимо Мп-связываюшего участка. Помимо Мп-связывающего центра мембранные препараты ФС2 могут иметь и другие участки, способные взаимодействовать с катионами железа. Катионы железа, связанные с этими участками, имеют большое значение в случае мессбауеровских измерений, поскольку MC регистрирует все катионы железа: и связанные с Мп-связывающим участком ("специфическое" связывание) и связанные с другими мембранными компонентами ("неспецифическое" связывание). Поэтому вопрос о "неспецифическом" связывании катионов железа с мембранами ФС2 был исследован специально.

Общее связывание катионов железа с мембранными компонентами определяли с помощью аналитического метода с использованием о-фенантролина, регистрируя содержание железа в растворе до и после инкубации с мембранами. Полученные результаты показали: 1) Fe(III) с высокой эффективностью (до 3000 катионов на один реакционный центр) связывается "неспецифически" с мембранными компонентами препаратов ФС2(-Мп); 2) Fe(II) не связывается "неспецифически"с мембранными компонентами препаратов ФС2(-Мп); 3) на свету в препаратах ФС2(-Мп) (помимо связывания катионов железа с Мп-связывающим участком) имеет место окисление катионов железа до трехвалентного состояния, по-видимому, на участке Yz электрон-транспортной цепи. Образующиеся катионы Fe(III) интенсивно взаимодействуют "неспецифически" с мембранными компонентами. В соответствии с полученными данными была отработана методика приготовления образцов для MC, обеспечивающая минимальное количество в препаратах пула"неспецифически" связанного железа.

Мессбауеровские спектры "специфически" и "неспеиифически" связанных катионов железа в препаратов ФС2(-Мп). Оптимизация условий опыта с целью уменьшения доли "неспецифически" связанного железа показала, что длительность инкубации препаратов ФС2(-Мп) в растворе Fe(II) должна быть в пределах 0,5 - 1 мин (при плотности фотонного потока 44 цмоль квантов/ м^ с). В течение этого временного интервала достигается максимальное связывание Fe(II) с Мп-связывающим участком. Все последующие операции с образцами, учитывая

процесс окисления двухвалентного железа на участке Yz в препаратах ФС2(-Мп) на свету, проводили в темноте.

Мессбауэровские измерения показали следующее.

]. Величина мессбауеровского эффекта для образца ФС2(-Мп), инкубированного в темноте в растворе ^Fe(II), бЬ1Ла мала (0,7%). Спектр представляет собой дуолет.

2. В результате кратковременного (30 с) освещения такого же образца в процессе инкубации в pi створе ^^Fe(II) величина эффекта значительно возрастает (5%). Спектр представляет немного ассиметричный дублет с параметрами: квадрупольное расщепление (QS) =0,75мм/с и изомерный сдвиг (IS) =0,38 мм/с. Подобная разница в величине эффекта, возникающая в результате освещения, еще раз демонстрирует светозависимость взаимодействия Fe(II) с мембранными препаратами ФС2(-Мп). Согласно изложенным выше результатам этот препарат должен содержать и "специфически" и "неспецифически" связанное железо. Для того, чтобы иметь возможность идентифицировать в мессбауеровском спектре компоненты, соответствующие каждому из этих пулов железа, необходимо иметь образец, имеющий или только "специфически" или только "неспецифически" связанное железо (или свести к минимуму один из этих компонентов).

Как было показано ранее, Fe(lII), в отличие от Fe(II), не взаимодействует с Mn-связывающим. участком, а связывается в препарате ФС2(-Мп) только "неспецифически". Этот эффект был использован для приготовления контрольного образца, в котором мессбауеровский спектр представлен только "неспецифическим " компонентом. Мессбауеровский спектр "несиецифически" связанного железа при температуре 70К оказался практически аналогичен спектру, полученному в результате световой инкубации мембран ФС2(-Мп) с Fe(II) ("специфически" связанное железо), но ассиметрия отсутствовала. Таким образом, при температуре жидкого азота спектры "специфически" и "неспецифически" связанного железа практически одинаковы.

Однако, при снижении температуры измерения до гелиевой начинает проявляться существенная разница в спектрах, наиболее четко выраженная при температуре 5К (рис, 11). Спектр контрольного образца, содержащего только "неспецифически" связанное железо состоит из 6 линий, характерных для высокоспинового Fe(III) (Johnson, 1976). Опытный образец, содержащий "специфически" связанное железо, имеет совершенно другую форму спектра и содержит минимум два основных компонента, отсутствующих в мессбауэровском

100.0

s 99.5

о"

£ 99.0

F

■Ч-

V

i

i£» A л ^

с о о. С

98.5

98.0

а

-Н-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-

+

99.5

v*Vn л/V

V

-15.0 -10.0

to.o

-5.0 0.0 5.0 Скорость, мм/с

Pue. 11. Мессбауеровские спектры препаратов ФС2, не содержащих марганца, после инкубации в растворе 57fc(1I) (а) или 57ре(ц у (б). Температура 5 К.

15.0

спектре контрольного образца. Сравнивая спектры контрольного и опытного образцов, можно отметить, что опытный образец содержит очень небольшое количество "неспецифически" связанного железа по сравнению с пулом "специфически" связанного железа. Т.е. измерения при температуре жидкого гелия показали, что в полученном образце в Мп-связывающем центре марганец замещен на 57ре, Спектр этого образца представлен практически толькя_компонентами, отражающими ' специфически" связанные катионы "железа. Очевидно, что эти результаты открывают принципиально новые возможности для исследования структуры и механизма работы каталитического центра КВК новым в этой области методом мессбауеровской спектроскопии. III. 3. Модель координационной сферы марганцевого кластера в КВК.

Исключительно большое сходство между взаимодействием Мп(П) и Ре(Н) с Мп-связывающим участком КВК указывает на то, что координационная сфера Мп в ФС2 хорошо соответствует и Ре(П). Это очень важное обстоятельство не является совершенно неожиданным, поскольку существуют белки, содержащие в каталитическом центре Мп или, Ре и выполняющие одни и те же функции. В число этих белков входят супероксиддисмугаза, каталаза, рибонуклеотидредуктаза, диоксигеназа, кислая фосфатаза (Ос1ш1, 1990). Для многих из таких белков установлена структура металл-связывающего центра и идентифицированы лиганды центральных атомов. Эту информацию можно использовать, принимая во внимание высоко эффективное связывание Ре(П) с Мп-связывающим участком, для поиска в ФС2 ргйоноа, аналогичных железо-связывающим районам в таких белках. Учитывая отм ученное выше светозависимое формирование двухъядерного кластера железа в процессе связывания, двухъядерные белки выглядят более предпочтительными для данного поиска. В связи с этим нами был проведен поиск в аминокислотной последовательности полипептидов 01 и Б2 районов, аналогичных районам, связывающим кластеры железа в двухъядерных железосодержащих белках.

Сравнительный анализ аминокислотной последовательности белков Р1 и Р2 и двухъядерных железо-содержащих белков. Группа двухъядерных железосодержащих белков включает в себя такие белки, как гемеретрин, метанмонооксигеназу (ММОГ), рибонуклеотидредуктазу (ее К2 компонент) и некоторые другие.На основании различий в природе лигандов для кластера железа эти белки делятся на два класса. Класс I содержит гемеретрин , а класс II включает в себя такие ферменты, как, ММОГ, Я2 и десатуразу жирных кислот.

Белки последнего класса содержат два основных консервативных района ЕХХН, участвующих в связывании двух атомов железа (Fox и др. 1994). При анализе аминокислотной последовательности полипептидов DI, D2 подобные районы были обнаружены нами в их карбоксил-содержащих концах. D1 содержит район E329-V-M-H332, а полипептид D2 содержит аналогичный район D334-Q-P-H337. Эти районы содержатся в 38 последовательностях полипептидов D1 и 15 последовательностях полипептидов D2 из раата ¡пых организмов (Svensson и др., 1991). Последний район содержит аспарагиновую кислоту вместо глутаминовой, но эта разница не принципиальна, поскольку обе они содержат карбоксильную группу. Таким образом, эти два района точно соответствуют железо-связывающим районам в R2, ММОГ и десатуразе.

Две копии района ЕХХН в двухъядерных железосодержащих белках обеспечивают четыре лиганда для кластера железа. Два других лиганда в этих белках представлены остатками аспарагиновой и глутаминовой аминокислот, предшествующими району ЕХХН. Сравнение аминокислотных последовательностей С-концов белков D1 и D2 между собой при выравнивании по районам ЕХХН (рис.12) позволило обнаружить две пары остатков аминокислот, расположенных перед ЕХХН с интервалом 9 и 20 остатков соответственно. Это пары D308/E313 и D319/E324. Одна из этих пар по аналогии с парой D84/E204 в полипептиде R2 может играть роль пятого и шестого лиганда. Анализ ближайшего окружения этих пар показывает, что такой парой может быть D319/E324. Это предположение основано на следующих наблюдениях. 1) После аминокислотных остатков D84 и Е204, которые являются пятым и шестым лигандом в R2, расположены 186 и 1206. Аналогично, в той же позиции относительно D3I9(D1) и E324(D2) расположены 1321 и 1326. 2). С интервалом в один аминокислотный остаток перед Е204 в E-спирали R2 расположен А202 (или L202 в зависимости от вида организма). В той же самой позиции относительно Е324 (D2) расположен L322. 1321 и 1326 имеются во всех последовательностях белков D1 и D2, кроме синезеленых водорослей, a L322 является консервативным остатком во всех 15 опубликованных последовательностях полипептида D2 (Svensson et al., 1991).

Таким образом, С-концевые участки полипептидов DI и D2 содержат все аминокислотные лиганды , координирующие атомы железа в двухъядерных железосодержащих ферментах типа R2, ММОГ и десатуразы. Очень интересным представляется то, что большее сходство аминокислотных остатков вокруг ключевых лигандов обнаруживается в белке R2, чья функция связана с генерацией

Бе (А) - участок

К2 КН1Р18МЬКУ(2 70

ммог

ДЕСАТУР

В - спираль — Ь Ь

Б УУ Б

- 305 ' 308

1)2 РЕР Е

310 313

Б <5 С? Р V I N

W А

ТРУТКМ1 Ь Ь N

322

ДЕСАТУР ММОГ

И2 ККЬУЬСЬМЭУЫАЬ

191 202

§?

щ Ш

РХ>1

ш

■324

|Й щ

ш Ш

204

кщ

ш

ъ ОКБ ..... Р 8

ш

N И А N Ьб М Я А XV М А А С

Ж>

КРУ

■ Е- спираль

Щ

Ш

ж

— С- спираль Т • I

I К

N II

V М <2 Р

К я

ь к

А Ь

ш

ж

'1т!Ф Ж

$37

ш

т

>244;

ш

«к-

Б II. Б'.У Т 123

Т'НР ; 150 \

ОБЬ1 182

КИАНМРОЮЬА 344

N Ь I Р РЕЕУЬРЯб

350

Е Т А У 269

М А N в

250

Ь ютд

24«

Ие (В) участок

Б -1 спираль ■

Рис. 12.Сравненпе ашшокяслотной последовательности С-кошевых участков полипегттидов и Б2 реакционного центра ФС2 с железо-связывающими участками даухъядерных ферментов . Лпгаяды катпонов железа и аминокислотные остатки, участвующие в образовании водородных связей, в двухьядерных ферментах п идентичные остатки в полппепгидах 01 и^ £ И2 заключены в заштрихованные рамки. Идентичные остатки аминокислот с неизвестной функцией заключены в не закрашенный рамки. Остатки, отмеченные утолщенным шрифтом, представляют идентичные, но не симметрично расположенные

5

К

стабильного радикала тирозина, поскольку поглощение света ФС2 также сопровождается появлением стабильного радикала тирозина (сигнал ЭПР

Помимо аминокислотных ■ остатков, связывающих катионы железа, двухъядерные железосодержащие ферменты имеют также аминокислоты, формирующие водородные связи с гистидинами - лигандами железа. ММОГ, десатураза ихпиральный участок И полипептида 112 имеют такие консервативные - -аминокислотные остатки Е1Т>, образующие совместно с районами ЕХХН консервативные последовательности (ЕЮ)ЕХХН. Так, например, ММОГ имеет 0143 (спираль С) и Э242 (спираль Р), образующие водородные связи соответственно с Н246 (спираль И) и Н147 (спираль С). ЕЮХХН районы полипептидов 01 и Ш не содержат подобных аминокислотных остатков на стороне Е/О, но имеют ЕЗЗЗ и Е338, расположенные со стороны гистидиновых остатков.

Подобная противоположная локализация остатков глутаминовой кислоты может быть понята, если мы сравним взаимное расположение доменов, несущих эти лиганды, в'01 и 02 и, например, в ММОГ. Двухъядерный кластер железа в ММОГ расположен внутри четырех ос-спиралей (рис. 13а, показано три а-спирали). Спирали С и И, содержащие районы Ш2ХХН имеют противоположное направление, что определяет расположение карбоксил-содержащих аминокислот напротив соответствующих гистидиновых остатков. Для С-концевых участков полипептидов и Б2 антипараллельное расположение менее вероятно, поскольку трансмембранные спирали Е и Е, продолжением которых являются С-концевые участки, сшиты между собой катионом негемового железа с участием гистидинов 272 (01) и 269(02) (рис. 136). Согласно модели связывания двухъядерного кластера железа в ММОГ (рис. 13а) аминокислотные остатки, участвующие в формировании водородной связи, должны быть расположены напротив друг друга. Если мы примем во внимание параллельное расположение С-концевых участков полипептидов 01 и 02, то водород-донирующие аминокислоты должны быть расположены со стороны гистидинов, что и имеет место на самом деле.

Координационная сфера двухъядерного марганцевого иентра. входящего в состав четырехъядерного марганцевого кластера КВК. Таким образом, С-концевые участки 01 и Э2 содержат все ключевые районы и аминокислоты, образующие координационную сферу кластера железа в двухъядерных железосодержащих белках, относящихся к классу II. Имеется ряд аргументов, свидетельствующих о

том, что эти районы и аминокислоты С-концевых участков D1 и D2 участвуют в координации марганцевого димера, являющегося составным компонентом тетраядерного марганцевого центра КВК:

- замещение Н332 (Diner et al.,1991) и ЕЗЗЗ (Debus et al., 1991) в D1 приводит к потере кислород-выделяющей активности;

- согласно экспериментам с применением химических сшивающих реагентов, области С-концевых участков D1 (D308 - А334) и D2(Y297 - L353) находятся в непосредственной близости друг от друга (Tomo, Satoh, 1994);

- LF-1 мутант Scenedesmus obliquas не имеет поспрансляционного удаления удлиненного С-концевого участка полипептида D1 и не обладает способностью к формированию функционально-активного марганцевого комплекса (Seibert et al., 1989).

- в мутантах, в которых трансляция D2 заканчивается преждевременно, и мутантах , имеющих делении в области С-концевого участка этого полипептида, КВК не формируется (Vermaas et al., 1993);

- С-концегые участки D1 и D2 среди оксигенных организмов обладают высокой степенью консервативности (Svensson et al., 1991);

- L и M субъединицы реакционного центра пурпурных бактерий (не выделяющих кислород) имеют значительную гомологию в аминокислотной последовательности^ D1 и D2 полипептидами, но обладают значительно более короткими С-концевыми участками (Michel, Deisenhofer, 1987), чем полипептиды D1 и D2 кислород-выделяющих организмов;

Таким образом, представленные выше факты дают основание предположить, что обнаруженные в С-концевых участках вышеуказанные районы и аминокислоты формируют координационную сферу марганцевого димера, входящего в состав четырехъядерного кластера. В соответствии с идентифицированными структурами каталитических центров в белках R2 и ММОГ мы предлагаем структуру для этого марганцевого димера, указанную на рис. 14. В предлагаемой модели биядерный кластер в КВК координируется двумя гистидиновыми остатками [Н332 (D1) и H337(D2)], остатком глутаминовой кислоты E329(D1), формирующим карбоксильный мостик между атомами марганца, остатком глутаминовой кислоты E324(D2) и двумя остатками аспарагиновой кислоты [D319(D1) и D334(D2)]. E338(D2) и E333(D1) образуют водородные связи с Н332 (D1) и H337(D2) соответственно. Поскольку все двухъядерные железо-содержащие белки имеют моно-ц-оксо (или гидроксо)

»1 > 272

И1 •

0

О

в

. |о

т

б

Рис. 13, Схематическое представление

расположения консервативных районов ОЕХХН в ММОГ (а) и ЕЮХХНЕ (б) в С-коицевых участках субъединиц ОI и 02.

Азр319

ньззг (01)

ЛБр334 (02)

1 А Л. <Ии324 (02)

н

аи329 (01)

Н1з337 (02)

С1а338 (02)

О О

] С1иЗЗЗ (01)

Рис. 14. Предполагаемая координационная сфера двухъядерного марганцевого центра, входящего в состав четырехъядерного марганцевого кластера КВК, образованная аминокислотными остатками С-концевых участков полилептидов 01 и Б2.

мостик и подобный мостик был предположен на основании EXAFS измерений препаратов ФС2, мы включили моно-ц-оксо/гидроксо мостик в нашу модель тоже. Монокарбоксилатный мостик между катионами марганца может быть сформирован и D334(D2), а не E329(D1), но несколько большее сходство между первичной последовательностью D1 и В-С спиралями R2, в которых El 15 образует карбоксилатный мостик, и соответственно между D2 и E-F спиралями R2, отдают предпочтение E;329(D1) как мостик-образующему лиганду.

Согласно структурной модели марганцевого кластера КВК, предложенной на основании EXAFS измерений (Saueret al.,1992), марганцевый кластер состоит из двух (р2-оксо) димеров, соединенных между собой кислородным и одним или двумя карбоксилатными мостиками. Таким образом, приведенный на рис.14 д-оксо, моно-карбоксилатный димер может быть составной частью модели Sauer с соавт. (1992), исходя из которой можно также предположить, что Х[ и Х2 это атомы кислорода кислородных мостиков, соединяющих Mnl с третьим катионом марганца, а Х3 может быть представлен анионом хлора ( в этом случае структура марганцевого кластера должна быть ассиметричной относительно ц-оксо, моно-карбоксилатного димера, ассиметричный вариант структуры не исключается Yachandra с соавт. (1993)).

^ ЧАСТЬ IV. ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты лроведенных нами исследований показали наличие Са2+-зависимого участка транспорта электронов на акцепторной стороне ФС2 в тилакоидных мембрчнах, расположенного с внешней стороны мембраны и образованного карбоксильными группами аминокислотных остатков. Эффекты, наблюдаемые при экстракции кальция из кальций-связывающего участка на акцепторной стороне и реактивации этого участка, значительно отличаются по целому ряду параметров от эффектов, сопровождающих экстракцию кальция из КВК мембранных препаратов ФС2. Полученные результаты продемонстририровали наличие кальций-зависимого участка на акцепторной стороне ФС2 в ТМ и находят свое подтверждение в последнее время (Andreasson et al., 1995).

Предложена модель, согласно которой чувствительность к кальцию акцепторного участка определяется катионом Са2, локализованным во внешнем антенном комплексе. Модель основана на наличии в аминокислотной последовательности полипептида D2 реакционного центра ФС2 домена,

соответствующего Са2+-связывающему участку типа EF-руки в кальмодулине (Coleman,Govindjee,1987; Семин и др.,1989) и расположенного с внешней стороны мембраны вблизи акцепторного. комплекса Qjj-негемовое железо. Согласно предложенной нами модели Са2 осуществляет связывание минорного белка СР29 внешнего светособирающего комплекса ФС2 с полипептидом D2. Участие Са2 в ассоциации внешнего антенного комплекса с реакционным центром ФС2 и локализация участка его связывания в полипептиде D2 РЦ вблизи Qa обеспечивают чувствительность к кальцию транспорта электронов на акцепторной стороне, а такáce возможность влияния электронного транспорта ( например, через электростатическое взаимодействие Ca2"1" - Qa" ) на конформацию белка(ов) светособирающего комплекса и тем самым на процессы миграции и рассеивания в них энергии. Интересно отметить, что в литературе уже были гчсказаны предположения, что минорные хлорофилл а/Ь связывающие белки, локализованные между РЦ и тримерными комплексами CCKII ( Dainese et al., 1992), обеспечивают рассеивание избытка световой энергии в тепловую (Bassi et al., 1992 ) и играют центральную роль в процессе тушения флуоресценции ( Crofts,Yerkes,1994). Таким образом, на основе полученных результатов и литературных данных нами впервые предложена модель структурной организации участка связывания Са2, позволяющая по новому взглянуть на роль Са2 в функционировании ФС2. Расположение Са2 между антенным комплексом и реакционным центром ФС2 позволяет ему играть роль сопрягающего фактора между процессами транспорта электронов в РЦ и процессами миграции и рассеивания энергии во внешнем светособирающем антенном комплексе.

Проведенные исследования позволили установить, что БКК ингибируют КВК и эффективность инактивирования ими процесса фотолиза воды находится в соответствии с их способностью инактивировать кальциевые каналы в клетках. Совокупность полученных результатов указывает на определенную аналогию в структурно-функциональной организации кальций-связывающего участка в КВК и кальциевом канале. Обнаружено, что донорная сторона ФС2 ингибируется также локальными анестетиками прокаинового ряда, ингибирующая активность которых коррелирует с их специфической активностью. Участок ингибирования анестетиками ЭТЦ расположен после КВК, возможно, на уровне переносчика Yz. Блокаторы кальциевых каналов и локальные анестетики являются новыми классами ингибиторов донорной стороны ФС2 и используются в настоящее время в исследованиях функциональной роли кальция в ФС2 (Krieger et al., 1992; Krieger,

1995). Результаты проведенной работы позволили предположить, что эффективность связывания кальция в КВК изменяется в процессе функционального цикла КВК. Объектом кальциевой регуляции является, по-видимому, своеобразный "протонный канал", обеспечивающий отведение протонов, выделяющихся при фотолизе воды, из гидрофобной зоны катализа в наружную среду. ^

Новый методический подход к исследованию марганцевого кластера позволил обнаружить большое сходство по целому ряду параметров в связывании Мп(П) и Fe(II) с I ln-связывающим участком. Поведение катионов железа при связывании с Мп-св^.зывающим участком КВК во многом аналогично поведению катионов марганца, но полученные в результате замещения препараты не окисляют воду. Одной из основных причин этому может быть более высокий редокс-потенциал пары Fe(II)/Fe(Ili> по сравнению с Mn(II)/Mn(III). Возможно, в дальнейшем при подборе другого экзогенного донора удастся реализовать фотоиндуцированный электронный транспорт в таких КВК. Разработана методика приготовления препаратов ФС2 с замещенным в КВК марганцем на мессбауеровский изотоп железа ^Fe. Мессбауеровские спектры образца, содержащего только "неспецифически" связанное железо, и образца, содержащего также катионы железа, связанные с марганцевым центром, показали значительные различия при температуре жидкого гелия. Большое сходство между параметрами связывания Mn(II) и Fe(II) с Mn-связывающим участком стимулировало поиск в аминокислотных последовательностях белков РЦ ФС2 районов, аналогичных районам, связывающим катионы железа в железо-содержащих ферментах, которые могут функционировать и при замещении железа на марганец. Подобные районы, связывающие (р-оксо)диРе центр в двухъядерных железосодержащих белках класса II, были обнаружены в С-концевых участках полипептидов Dl, D2 реакционного центра. Анализ литературных данных и полученные результаты позволяют предположить, что эти районы участвуют в связывании двух катионов марганца, образующих димер, являющийся составной частью четырехъядерного марганцевого кластера в КВК. Эти катионы соединены между собой кислородным (или гидроксильным) и карбоксилатным мостиками и координируются следующими аминокислотными остатками: Asp319(Dl), Glu329(Dl), His332(Dl), Glu324(D2), Asp334(D2) и His337(D2). His332(Dl) и His337(D2) образуют водородные связи соответственно с аминокислотными остатками Glu338(D2) и Glu333(Dl). Участие гистидинового (гистидиновых) остатка(ов) в связывании

катионов марганца в КВК было недавно показано при использовании метода двойного электронно-ядерного парамагнитного резонанса (Tang et al., 1994). Авторами было предположено, что этот(эти) остаток(остатки) участвуют в депротонировании воды. В предлагаемой нами модели гистидиновые остатки, являющиеся лигандами для катионов марганца, связаны водородными связями с карбоксильными группами аминокислотных остатков, образуя таким образом своеобразные "протонные каналы". Эи; карбоксильные группы могут играть роль акцепторов протонов, выделяющихся при фотолизе воды и связываемых первоначально азотами гистидинов. Возможно, что эти "протонные каналы" и находятся под контролем кальция, как было предположено нами из экспериментов с применением БКК и анестетиков. ВЫВОДЫ

1. Установлено, что БКК ингибируют КВК ФС2 и эффективность ингибирования блокаторами системы фотолиза воды находится в соответствии с их способностью блокировать кальциевые каналы, что свидетельствует об аналогии в структурно-функциональной организации кальций-связывающего участка КВК и кальциевого канала.

2. Обнаружен новый класс ингибиторов донорного участка ФС2, состоящий из Л А прокаинового ряда. Ингибирующая активность данной группы соединений находится в соответствии с их специфической активностью. Совокупность полученных результатов указывает на то, что ЛА дестабилизируют водородные связи в области переносчика электронов Yz, определяющие функциональную активность донорного участка ФС2.

3. Высказано предположение, что функциональная роль кальция в КВК заключается в регуляции им процесса депротонирования воды и/или связывания ее протонов протон-акцепторными группами. В свою очередь кальций является объектом регуляции со стороны марганцевого кластера, обеспечивающего изменение эффективности связывания кальция в КВК в процессе каталитического цикла.

4. Установлено, что помимо кислород-выделяющего комплекса в ФС2 имеется Са2+ -зависимый участок ЭТЦ с Км=0,5 мМ на акцепторной стороне ФС2 на уровне переносчика Qa. Топологически этот участок расположен с внешней стороны ТМ. Установлены значительные различия в условиях реактивации (pH, свет, концентрация, акцепторы электронов) функциональной активности кальций-связывающих участков в КВК и на акцепторной стороне ФС2.

5. Предложена модель участия Са2+ в регулировании транспорта электронов на акцепторной стороне ФС2, согласно которой Са2+, локализованный во внешнем светособирающем антенном комплексе ФС2 (Са2), связан также с участком Е225 - А235 полипептида D2 РЦ. Данный участок расположен в непосредственной близости от места связывания Qa и негемового

железа, благодаря чему изменения в координационной сфере Са2 способны влиять -----

на транспорт электронов через этот акцепторный комплекс. Са2, участвуя в ассоциации светособирающего комплекса и реакционного центра ФС2, может играть роль сопрягающего фактора (через взаимодействие с Qa" ) между процессами транспорта электрона в реакционном центре и миграции и рассеивания энергии в светособирающем комплексе.

6. Обнаружено высокоспецифичное связывание катионов Fe(II) ( но не Fe(III)) с Mn-связывающим участком ФС2. Характеристики связывания Fe(II) и Мп(Н) аналогичны по следующим пунктам: близкая концентрация насыщения связывания; имеет место окисление катионов металлов при связывании; окисление является светозависимым процессом; анионы влияют на связывание Мп(И) и Fe(II) сходным образом; восстановители ингибируют связывание катионов; состав кластера, формируемого на светозависимой стадии связывания, одинаков для Mn(II) и Fe(H). __

7. Измерение при температуре жидкого гелия мессбауеровских спектров препаратов ФС2, содержащих в каталитическом центре КВК вместо марганца катионы 57Fe , продемонстрировало спектр, состоящий из двух основных компонент, свидетельствующих о наличии в марганец-связывающем центре двух типов участков связывания катионов железа с несимметричным лигандным окружением.

8. Обнаружено, что С-концевые участки полипептидов D1 и D2, образующих реакционный центр ФС2, содержат консервативные районы (ЕХХН) и аминокислотные остатки, участвующие в связывании двухъядерного кластера железа в рибонуклеотидредуктазе, ферменте, в функционировании которого, также как и в КВК, принимает участие радикал тирозина.

9. Экспериментальные результаты по взаимодействию Fe(II) с Мп-связывающим участком и сравнительный анализ аминокислотных последовательностей полипептидов D1 и D2, образующих реакционный центр ФС2, и двухъядерных железосодержащих ферментов позволили: 1) определить полипептиды ФС2, связывающие марганцевый кластер - это С-концевые участки

полипептидов D1 и D2; 2) предложить структуру марганцевого димера, являющегося составной частью марганцевого кластера КВК - это димер, в котором катионы марганца соединены между собой карбоксильным мостиком E329(D1) и кислородным (или гидроксильным) мостиком; 3) провести идентификацию аминокислотных остатков, принимающих участие в связывании катионов марганца в КВК - это D319, Е329 и Н332 полипептида D1 и Е329, D334 и Н337 полипептида D2, кроме того, в образовании водородной связи с Н33?-и Н337 участвуют аминокислотные остатки ЕЗЗЗ (D1) и E338(D2). СПИСОК РСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Семин Б.К., Новакова А.А., Александров А.Ю., Иванов И.И. Исследование

взаимодействия ионов железа с лецитином методом Мессбауеровской спектроскопии// Научные доклады высш. школы. Биол.науки 1979,6, с.29-32.

2. Семин Б.К., Новакова А.А.,Сидорова Г.В.,Александров А.Ю., Иванов И.И.

Исследование методом Мессбауеровской спектроскопии образующегося комплекса Ре(Ш)-лецитин на окисление Ре(Н)//Научные доклады высш. школы. Биол.науки 1981, №9, с.45-50.

3. Semin В.К., Novakova А.А., Aleksandrov A.Yu., Ivanov 1.1., Rubin A.B., Kuzmin

R.N. Mossbauer spectroscopic study of iron metabolism and intracellular distribution in liver of rats// Internat. Conference on the applications of the Mossbauer effect 1981, India, Srmagar,p.53.

4. Ананиева Л.К., Семин Б.К. Дифференциальная сканирующая калориметрия

хлоропластов гороха//1 Всесоюзный биофизический съезд 1982, Москва, т.1, с.298.

5. Ананиева Л.К., Семин Б.К. Исследование структурных переходов в

хлоропластах гороха методом дифференциальной сканирующей калориметрии// Труды XIII конференции молодых ученых биологического фак-та МГУ 1982, с.46-50/деп.ВИНИТИ, 5913-82/.

6. Semin В.К., Novakova АА., Aleksandrov A.Yu., Ivanov I.I., Rubin A.B., Kuzmin

R.N. Mossbauer spectroscopy of iron metabolism and iron intracellular distribution in liver of rats// Biochim.Biophys.Acta 1982, v.715, p.52-56.

7. Ананиева Л.К., Семин Б.К., Иванов И.И. Калориметрическое исследование

структурных переходов в мембранах хлоропластов гороха// Физиол.раст. 1983, т.ЗО, №3, с.552-555.

8. Semin В.К., Saraste М., Wikstrom М. Calorimetric studies of cytochrome oxidase-

phospholipid interactions// Biochim.Biophys.Acta 1984, v.769, p. 15-22.

9. Семин Б.К., Кормановский А.Я. Изучение влияния бензилового спирта на

фотосинтетическую активность хлоропластов// Физиол.раст. 1984, т.31, вып.6, с.1043-1048.

10. Кормановский А.Я.,Семин Б.К. Фотодеструкция пигментов и липидов в присутствии бензилового спирта// Биофизика 1985, т.ХХХ. вып.2, с.253-258.

П.Семин Б.К., Кормановский А.Я., Иванов И.И. Электронный транспорт в

пигмент белковых комплексах. Влияние локальных анестетиков// Конференция " Кинетика и механизм электронного переноса в белковых системах и их моделях" 1985, Вильнюс, с.38. 12. Семин Б.К., Ганчев Ц., Кукарских Г.П., Иванов И.И. Изучение взаимодействия Н+-АТФ-азы (СФ]-СФо) и сопрягающего фактора (СФ|) с липидами методом дифференциальной сканирующей калориметрии// Биол.мембраны 1986, т.З, с.161-166.

13. Семин Б.К., Чудиновских М.Н., Иванов И.И. Изучение влияния анестетиков на транспорт электронов в хлоропластах гороха// Биохимия 1986, т.51, №4, с.546-552.

14. Aleksandrov A.Yu.'„Novakova А.А., Semin В.К. A Mossbauer spectroscopy study of the conformational dynamics of native memebrane proteins// Physics Letters A 1987, v,123,n3,p.I5I-I54.

15. Семин Б.К., Чудиновских M.H., Иванов И.И. Изучение механизма ингибирования локальными анестетиками транспорта электронов на донорном участке фотосистемы II// Биохимия 1987, т.52, вып.8, с.1279-1285.

16. Семин Б.К., Лядский В.В., Чудиновских М.Н., Венедиктов П.С., Иванов И.И. Влияние локальных анестетиков на выход быстрой и переменной флуоресценции хлоропластов// Биофизика 1988, т.ХХХШ, вып.З, с.448-451.

17. Семин Б.К., Чудиновских М.Н., Тимофеев К.Н., Иванов И.И. Влияние у • соединений, взаимодействующих с Са^"1" -связывающими участками на сигнал lis хлоропластов гороха// Биофизика 1988, т.ХХХШ, вып. 5, с. 809-811.

18. Семин Б.К., Иванов И.И., Рубин А.Б. Индукция выхода ионов кальция из мембран хлоропластов гороха дикаином; взаимосвязь с ингибированием электрондонорного участка/] ДАН СССР 1988, т.301, №5, с.1244-1247.

19. Ивашнева М.Н., Семин Б.К., Иванов И.И. Роль в структурно-функциональной организации донорного участка фотосистемы II// Успехи совр. биол. 1988, т.106, вып.З(б), с.340-346.

20. Александров А.Ю., Новакова А.А., Малышев К.В.. Семин Б.К.. Иванов И.И., Рубин А.Б. Исследование динамических свойств мембранных белков методом Мессбауэровской спектроскопии// Биофизика 1988, т.ЗЗ, вып.6, с.962-967.

21. Novakova A.A., Aleksandrov A.Yu., Semin В.К., Lovyagina E.R. A study of dynamic characteristics of membrane proteins as a function of electronic state of Fe atoms and viscosity of the medium// Intemat. Conference on the Application of Mossbauer Effect 1989, Hungary, Budapest, p.13.13.

22. Semin B.K., Tshudinovskich М.Ы., Ivanov I.I. Local anesthetic-induced inhibition of chloroplast electron transport//Gen. Physiol. Biophys. 1989, N8, p.233-244.

23. Semin B.K., Ivanov I.I., Rubin A.B. Effect of calcium-channel blockers and activator on electron transport in pea chloroplasts// Biochim. Biophys. Acta 1989, v.975, p.239-243.

24. Semin B.K., Ivanov I.I. Effect of the electrochemical potential on the interaction between calcium chanel blockers or calcium and chloroplast membrane// Electromagnetic fields and biomembranes, Pleven, 2-8 Oct. 1989, p.86.

25. Семин Б.К., Иванов И.И., Рубин А.Б. Сравнительный анализ последовательности белка Д2 реакционного центра фотосистемы 2 и некоторых -связывающих белков// Мол. биол. 1989, т.23, вып.5, с.1350-1354.

26. Semin В.К., Ivanov I.I., Rubin A.B. Tetracaine inhibition of electron transport in pea chloroplasts is coupled to calcium displacement by the local anesthetic// Gen. Physiol. Biophys. 1990, v.9, p.65-70.

27. Семин Б.К., Иванов И.И. Ингибирование потенциалуправляемого канала антагонистами кальмодулина; наличие в аминокислотной последовательности рецептора 1,4-дигидропиридинов участка подобного участку связывания антагонистов в кальмодулине/Биол. мембраны 1989, т.6, с.892-893.

28. Семин Б.К., Васильев И.Р., Иванов И.И. Локализация ингибирующего действия блокаторов кальциевых каналов 1,4-дигидропиридинов на фотосистему II// Физиол.растений 1990, т.37, №2, с.317-322.

29. Семин Б.К., Иванов И.И., Рубин А.Б. Влияние блокаторов и активатора кальциевого канала на электронный транспорт в хлоропластах гороха: участие кальция в функционировании фотосистемы II// Биохимия 1990, т.55.,

вып.З, с.451-457.

30. Семин Б.К., Иванов И.И. Сравнительный анализ аминокислотной последовательности белка Д2 реакционнного центра фотосистемы II и некоторых Са-связывающих белков в связи с функциональной ролью кальция в системе фотосинтетического разложения воды// Всесоюзная конференция "Преобразование световой энергии в фотосинтетических системах и их моделях" 1989, Пущино, с. 138.

31. Semin В.К., Ivanov iVir Inhibition of electron transport in pea chloroplast by calcium-channel blockers// Third Congress of the European Soc. for Photobiol. 1989, Hungary, Budapest, p.227.

32. Aleksandrov A.Yu., Novakova A.A., Semin B.K., Lovyagina E.R., Kaurov Yu.N. Mossbauer spectroscopy studyof iron-containing electron carriers of photosystem 11 of thermophylic green-blue algaII Internat. Conference on the Applicatior of the Mossbauer effect (ICAME), Hungary, 4-8 sept., 1989, v.2, p. 13.2.

33. Семин Б.К., Чудиновских M.H., Иванов И.И., Рубин А.Б. Вытеснение диканном кальция из мембран хлоропластов гороха в процессе ингибнрования донорного участка фотосистемы II// Научн.доклады высшей школы.

Биол.науки 1990,№8,с.44-51.

34. Семин Б.К., Ким Ч.К., Тимофеев К.Н., Иванов И.И. Влияние рН на сигнал ЭПР lis в хлоропластах шпината. Уменьшение сигнала в области рК тирозина// Биофизика 1990, т.35, №1, с.86-88.

35. Броун Л .С., Семин Б.К., Иванов И.И., Кононенко А.А., Чаморовский С.К., Чурцн А.А. Дикаин индуцирует образование спектральной формы бактериородопсина БР-470 в пурпурных мембранах галобактерий// Биохимия 1991, т.56, №2, с.241-249.

36. Semin В.К., Loviagina E.R., Aleksandrov A.Yu., Kaurov Yu.N., Novakova A.A. Effect of formate on Mossbauer parameters of thenon-heme iron of PSI1 particles ofcyanobacteria// FEBS Lett. 1990, v.270,nl,2,p,184-186.

37. Novakova A.A., Semin B.K.., Aleksandrov A.Yu., Tsurkina L.N. A Mossbauer study of spinach chloroplasts with substituted functionally active Ca2+ for ^Fe// Internat. Conference on the application of the Mossbauer spectroscopy, 16-20 sept. 1991, China, Manjing,p.l2.22.

38. Семин Б.К., Иванов И.И. Изучение особенностей ингибнрования блокаторамп кальциевого канала транспорта электронов в хлоропластах гороха// Вестник Моск.университета 1991, №4, с.73-76.

39. Чуркина Л.А., Семин Б.К. Влияние низких значений рН среды на транспорт электронов в хлоропластах// Доклады МОИП. Общая биология за 19891990гг, Москва, Наука, 1992, с.71-73.

40. Ловяпша Е.Р., Семин Б.К., Александров А.Ю., Кауров Ю.Н., Новакова А.А. Влияние формиата на Моссбауеровские спектры негемового железа в частицах фотосистемы II цианобактерий//Физиол.растений 1992, т.39, вып. 1, с.66-72.

41. Семин Б.К., Чуркина Л.А. Влияние низких значений рН среды на функционирование в электрон-транспортной цепи хлоропластов// Физиол.растений 1992,т.39, вып.З, с.13-20.

42. Белевич Г.В., Семин Б.К., Иванов И.И., Дубур Г.Я., Рубин А.Б. Влияние производных 1,4-ДГП на транспорт электронов в хлоропластах гороха. Взаимосвязь с гипотензивной активностью// Биол.мембраны 1992, т.9, вып. 1, с.26-31.

43. Semin В.К., Tsurkina L.A., Aleksandrov A.Yu., Novakova A.A, Mossbauer study of Ca2+ binding site in PSII of thylakoid membranes// Photosynth.Res. 1992, v.34, Nl,p.l38, Abstr. IX Int.Congresson Photosynthesis, August 30-September 4,Nagoya, Japan.

44. Novakova A.A., Semin B.K., Aleksandrov A.Yu., Tsurkina L.A. A Mossbauer

study of spinach chloroplasts with substituted functionally active Ca2+ for 57pe3+ //Hyperfine Interactions 1992, v.71, p.1311-1314.

45. Семин Б.К., Чуркина JI.А., Конев Ю.Н., Солнцев М.К., Васильев И.Р., Иванов И.И. рН-зависимая инактивация электрон-транспортной цепи хлоропластов и ее реактивация кальцием// Мол. биология 1994, т.28, вып.З, с.521-529.

46. Semin В.К., Ivanov I.I., Rubin А.В., Carpentier R. Action of low pH Ca2+ -extraction procedure on PS11 submembrane fractions and PS11 complex in thylakoid membranes// Eleventh Annuel Eastern Regional Photosynthesis Conference, March 25-27 1994, Woods Hole, Massachusetts, USA, abstr.16.

47. Semin B.K., Alexandrov A.Yu., Ivanov 1.1., Parak F., Rubin A.B. Investigation of functional activity of spinach PSI1 by Mossbauer spectroscopy//12 Germany-Russian seminaron the using of Mossbauer spectroscopy, October 1994, Munich, FRG. ; '

48. Семин Б.К., Александров А.Ю., Иванов И.И., Новакова А.А., Парак Ф., Рубин А.Б. Исследование Е.заимодействия 57ре3+ с Са2+ -связывающим участком кислородвыделяющих частиц ФСН// Биол.мембраны 1995, т.12,Т4, 341-350.

49. Semin В.К., Ivanov IЛ., Rubin А.В., Parak F. High-specific binding site in Mn-depleted PSII memebranes from spinach// FEBS Lett. 1995, 375, 223-226.

50. Семин Б.К., Иванов И.И., Рубин А.Б., Парак Ф. Высокоспецифическое связывание катионов Fe(II) с Mn-связывающим участком кислород-выделяющего комплекса фотосистемы II// Международная конференция "Биоэнергетика фотосинтеза", Пущино, 17-21 июня 1996, с.16.