Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЯДЕРНОГО АППАРАТА ПРИ ВИРУСНОМ ПАТОГЕНЕЗЕ У ТАБАКА

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЯДЕРНОГО АППАРАТА ПРИ ВИРУСНОМ ПАТОГЕНЕЗЕ У ТАБАКА"



Биологический факультет 7

Bei правах рукопис*

Соколовская Ирина Викторовна

■"■■■■.■-...■-■■-■■ ■'. ' ■ ■. " ■ ■ - » і-..

ФУНКЩЮНАДЪЙАЯ XAPAKEEPÎtCTHKà: ЯДЕР^ГО ШІАЇАТІ;. Специальное ть- <{* экология растение- 03.00Л2

Автореферат диссертации учвноя стбпвии -

' кавдвд&табво логических ваук;

ИЗДАТЕЛЬСТВО МОСКОВСКОГО УНИВЕРСИТЕТА • 197V

г-

Работа «ыпвлнвна на кафедре физиологии растений Биолого-почвенного факультете МГУ

Научные руководители: . ■ 7'

Член-корреспондент ВАСХНИД, доктор сельскохозяйственных наук, профессор Б.А.Е^бян .

Кандидат биологических наук, -доцент, Ладыгине М,Е

Официальные оппоненты: V. '.' :;'

Член-корреспондент АМН СХХЗР И.БіЗйарсмй Кандидат биологических наук М.Н.Талиева

Ведущее учреждение - Всесоюзные институт виноградарства и виноделия, . ". '. .:

Защита диссертации состоится 1974 годи

на заседании секционного совета по ботанике физиолого-<5іо-химического отделения МГУ.

Отзывы и,замечания просьба присылать по адресу:; Москва В-234, Ленинокве горы, МГУ, Биологический факультет, Ученому секретарю* .;■

Автореферат разослан О^ ¿-¿-/1374 г.

Ученый секретарь совета

;/Л .Ф. Никола«»«/

* ' • •' : • г

' •• "' • уЫ • . ' -

' "В ояде о те че с т в е нныхс из а ру б е жных Гра бот/Л адыгина ;; Ру б и н , к

яр„1968; ; М((ег а а£?, 1971; М^еийгаиВ, 1964;:

. . ^ -Коркигл а 1969/ показано, что инфекция/вирусная, и;, V-

"V; грибная/ вызывает структурные и функциональные ; изменения^ '• "в различных метаболических, центрах клетки: митохондриях, • ; • хлоропластах, ОИбОСОМЕХ. - V''

^ ' В "частности, ^исследованиями Рубина с сотр./Рубин, Т«*-^

■г '; '' Ладыгина, 1965; Рубин-и др. ,1966/ было у ст ан овл ен о,; чг о ¿у ~ "' " >.: при вирусном пат огенеэе наблюдаются значительные сдвиги ' * • ~ в энеогетическом обмене* растительной клетки, связанному . • \ -; - митохондриями и хлоропластами. При этом была показана -

роль энергетического обмена в явлениях устойчивости: ми- ;. ' тохондрик и хлоропласта Листьев устойчивого'к ВТМ вида-та-• бака сохраняют^ или усиливают и нт ен с и вн ост ъ пр о це сс ов эапа-сания энергии, чего не наблюдается в энергетических ~ . ' • ч .- центрах клетки неиммунного вида. .: ■ '

Шч^.'л. * Работы -по изучению влияния вируса на' энергообмен клет- ' V КИ вплотную ПОДОШЛИ К трет ьему энергетичес кому центру - \ -V' - клеточному ЯДРУ. . ; • . ..

Ядру принадлежит важная соль в метаболизме клетки. С Основными Функциями ядра является воспроизведение и пе- • у - : - • редача генетической информации. В клеточном '.ядре проис- •';•';*.

: ходит также синтез нуклеиновых кислот, белка; кофакто- * •. • -Л- ров и другие реакции проме*уточного обмгна. Ядру принад' •;;• •') лежит важная роль, в стимуляции синтеза белков в клетке." , Под контролем ядра находится и клеточное дыхание. -- Исходя из представления о клетке как единой системе, • ; Х'ЛчД* в которой неразрыно связаны и взаимообусловлены функции .-"У;/;

*:.' . ядра и цитоплазмы, можно ожидать, что вирусная инфекция ; \ должна оказать влияние и на Функции ядра; в частности,' • на его энергообмен. Этому предположению мы находим под-., ■ / / • 'тверждение в работе Зиберта/Зиберт, 1972/, показавшего, > -. что энергетический обмен изолированных животных ядер Н^ТГ ' очень чутко реагирует на метаболические сдвиги в клетке _ ■■ •" Г - под влиянием 'какого-либо фактора. . " .•••; V,- ~ ;

■ 1-1222

I НОСКЬЕШШ (.¡-Д. 3<<;::ипи СЙ-М&З. [

Показательны в этом отношении и цитологические 'наблюдения над. клетками табака, заражёнными ВТи£б которых^в первые.часы после мьцкуляции вирусом около ядра фачинают группироваться митохондрии и хлоропласта, вступая в тесный контакт с ним/и&аМ, 1Э6Х; 1966; Лстас, 1964/1 Подобный феномен обычно наблюдается в молодых, активно метаболизирующих клетках. Вирусная инфекция \

также вызывает активации метаболизма в клетке, то есть создаёт напряжённый метаболизм в клетке, сопряжённый с изменениями энергетического обмена митохондрий, хлоро-пластов и клеточного ядра. Кроме того, рядом;работ показан синтез вирусной РНК, а,возможно, и белка'ВТмУне распространяя это положение на другие растительные вирусы/ в ядрах листьев табака/1964; вскСеуеСу. 19661; 196?; Вка^Са, 1967; 31опс1а,19№/. 1 |

Таким образом, вирусная инфекция либо опосредовано' /через функциональное воздействие клеточных структур/, < либо непосредственно/через синтез вирусной РНК/ воздействует на энергетический обмен клеточного ядра. | /

В связи с этим целью настоящей работы явилось изучение.функционального состояния ядерного аппарата/в|окис-" лительноми энергетическом аспекте/ в норме и динамике развития инфекции-В"Ш. |

Работы по изучению энергетики ядер, изолированных из листовых тканей, отсутствуют* Поскольку данные по 'окислительному обмену растительных ядер ограничиваются 'лишь обнаружением активности пероксидазы/ Я«а, 1973/, сукцин-дегидрогеназы, цитохромоксидаэы и АТС-азы в ядрах Ьаро-дышей пшеницы/Сисакян и др,,1957; Васильева и^др.,1964/ нам представлялось целесообразным дать общую характеристику энергетики ядерной фракции: дыхания, субстратов ,. окисления, фосфорилирующего дыхания, содержания АТФ, при нимая как рабочую гипотезу существование окислительного^ сфорилирошжия в ядрах растений. Исследовался-также фракционный состав гистонов, как возможных регуляторов энергетического обмена.

'.'Л/"/!'-' • ї■. ' ^

МАТЕРИАЛЫ И'иЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ' . V;- ^

. ^ В качестве объектов исследования использовали различ-г',; , ные по устойчивости к ВТМ растения табака: Я Саоасит • •

• сорт Трапезонд 93 с системной реакцией на заражение ' ; -- -у ;/восприимчивый вид/.иМ.уиШма , отвечающий на.инокуля-' цио ВТМ некротической реакцией/устойчивый вид/..Растения / выращивали в теплице и в камерах ЛИК-а при постоянной . V температуре/+26°/, влажности/бОЯ/ и освещённости 8000- • /\

10000 люкс. •' ..-.4*;.;

Возбудитель - вирус табачной мозаики /ВТМ/ , штамм

'. .." обыкновенный. , .. Исследования динамики вирусной инфекции проводили

•¡•'і:'. \через 12, 24, 48 часов после инокуляции вируса, когда ,'. • ^ :<• ••'"•. • видимые симптомы заболевания на листьях NЛаЬасит отсутствуют, а у N. д?и1лло$а едва выражены, а также после ; . ] появления выраженных симптомов заболевания через 7-15 У дней после заражения.

Вирус инокулировали в отделённые от растения листья . \ второго яруса /сверху/, натиранием листьев суспензией, приготовленной из мозаичных растений N. ІаЬасит /і г. ; листьев на Ю мл воды/. Контрольные листья натирали су- ;

спензией, полученной иэ здоровых растений. До анализа / в течение 12, 24 и 48 часов/ инокулированные листья V'ч'', выдерживали во влажной камере. При изучении более дли-, тельного воздействия инфекции на растение /7-15 дней/ ; • заражение проводилось на листьях, не отделённых от рас-'Й.--У-.: ТЄНИЙ.

^^ Ядра из листьев табака выделяли методом ди4Ф«ренци-

. ' • ального центрифугирования по методу, описанному Спенсеру ч р0ы/2^ 1.967/ с некоторыми модификациями. -Щ":^ Лизис клеточных структур /митохондрий, хлоропластов,

микросом/ осуществляли обработкой-ядерной фракции 0.5Я раствором Тритона Х-ЮО. Очистку ядерной фракции прово-■ дили в ступенчатом градиенте плотности сахарозы.

Микроскопический контроль под световым микроскопом показал отсутствие целых клеток и хлоропластов.

После лизиса клеточных структур раствором Тритона Х-100 существовала опасность адсорбции митохондриальных

'•""" '- , я .гЧ, » л •

; ф рагие нт ов нап ове рхнос т и зд ра ;' Эяект р онкомикр ОС К ОПИ ЧЭ кий• контроль ядёр>ной фракции показал отсутствие", адеорби-

- рованных структур. Биохимический тест / по сувцииокеи-'Х ; : дазнойактивности/ также показал отсутствие 'загрязнён- -

ности ядерной фракции митохондриями или их фрагментами; ^ ^ Скорость поглощения кислорода ядерной фракции опреде- -ляли полярогпафическим методом с помощью вращающегося ' -платинового электрода. Ток, -проходящий чзпезячейку, из-" ~ мерялся с помощью фотокомпенсационного МИЛЛИВОЛЬТМИЛЛИ-/ампеометра ф 116/2 для визуального наблюдения за силой : • . >1 тока и усиления выходного сигнала. | ;

.• 'Содержание АТФ в изолированных ядрах определяли биолюминесцентным методом /Мс й(ху, $1гекЫ%г 1949/. | .

-Белок малатдегидрогеназн для энзим-электрофореза эк- , страгировали из изолированных ядер после их осмотического шока трио-глициновым буфером. Из озимы на гелях 'прояв-:

- ляли гистохиыически, тетраэолиевым м ет о до и/Магке-гІ^ МоСИе 1959/..Электрофорез проводили от катода к аноду при силе тока 4 шА 'на одну Трубку и напряжении 400-500. вольт. ..

Гнетони экстрагировали из осадка яде ш ой фракции 0.25 н.,НСІ и проводили разделение гистоновых Фракций по ментолу Фэмброу /З-атЬъоцдк, &&ппечг 1969/. Для электрофореза гистонов применяли 15% полиакриламидный гельЛРазгонка велась от анода к катоду при силе тока 3.5 тА?на одну трубку и напряжении 400-500 вольт. Окраску проводили ■1% раствором амидошварца. Денситографию гелей:проводили •-• на микрофотометре МФ-4. і : ..

*ДНК определяли по схеме Шмидта и Тангаузера и спектро-фотометрически /Галкин,Бердытев, 1968/. -- ! '

Белок определяли методом Лоури /'^очггуа.а1[,19Ы/^

Часть эксперимнеталькых данных обработана статистически /Ллохйнский,1970/, другая часть ввиду значительной' вариабельности абсолютных цифр представлена в сериях ■

опытов.

- ■, РЕЗУЛЬТАТЫ и 5 ОБСУЗДЕНИБ >: .'Лч^ «-; '/'.>: Ч-ї^" а ра кт е р ис ти н а'о н ис л и т е л ь н огоу ет а б ол изи а яде ри з о-'■ • ЛИРОВаННЫХ ИЗ 1Л^су ье В ^ДОРОВИХ растений <-:," т-'л^.

.* . Данный раздел работы, проводился на изолировашой ядер- . V.

ной фракции листьев NиоІСапаЬЛасит а• МіаІіапа <jfutl.rw.sa. . ;- • .. г " . Дыхание и субстраты.окисления. Ядерная фракция листьев • ^"табака обладает эндогенный дыханием. Типичная полярограм- - :^

иа эндогенного дыхания изолированных ядер представлена; -г'на рис.1. ' - V ; . /■ .У!

г; Рис.;ч1. Поглощение кислорода ядерной фракцией ч листьев ИЛаБасит и. М. qtutuгoза • ~..... ^V.--4

9.1

^аз

[OJ-0

Цифры на кривых - скорость поглощения U^ в мкм/мин

0 >Ядра - 0.06 ил'ядерной суспензии, 0.5 мл ядерной суспен- • ' зии содержит 1.5 иг ДНК.. ' "'■>' . ..'Л::

■ ' А - Ядерная фракция листьев N. tafcacum '■■'.'>.■-,

В - ядерная фракция листьев N. gCutinosa. . --..'-Л у' У У; . > Следует отметить - небольшую продолжительность во Вре-'; , мени дыхания ядерной фракции. Дыхательная активность

• ядер сохраняется около,получаса при хранении ядерной сус- . пензии на льду. Далее наступает агрегацйя ядер, и погло-.'•^...щение кислорода прекращается. . -

- ■ Для изолированных ядер животных,.которые изучены более Д '•'••• • полно, вопрос осубстратах дыхания и фосфо рил и ро в ан и я не \ ^ : . решён окончательно. В большинстве работ/показано, что т-ядерная фракция Не окисляет экзогенные цитрат, фумарат," •

1 ; 2-1222 5 ■ ■. ■ 'Г.

ыалат , сукцинат, л-кетоглютарат ./ РеппіаС а. аії, ¿964;~Гай-цхоки, Нейфах,1965; &а*кіхе[акі а аН, 1970; Збарский;■ 1972/. Однако в некоторых работах / ТЗапек^сІ 1965;-V .

Жоигеп, 1967; Миккеуееа.а^1972/ изолированные *Д~\ ; ра тимуса и мозга морской свинки окислялисукцинат, пи-руват и л-кетоглютарат. Причина такой противоречивости ^ пока неясна. Отсутствие окисления экзогенных субстратов,; * возможно, объясняется непроницаемостью кислот цикла Кребса через ядерную мембрану /Мс 1963/, а, ,

возможно, и спецификой ядерного окислительного метабо- -лизма/Збадский, 1972/. - ' >

Поскольку В Процессе выделения ядернойТфракции ИЗ.■■■■'..'.*'■ листьев табака мы применяли обработку Тригоном]х-100, удаляющим внешнюю ядерную мембрану / "Ь'Ме&вЩТтчт, 1969/ и меняющим, таким образом, проницаемость ядер,|было ре- ; шено провести опыты по изучению влияния субстратных добавок на поглощение кислорода изолированными ядрами,_ Были выбраны НАД-зависимые кислоты цикла Кребса: л-ке- , -тоглютарат, малат, а также пируват и НАД.Н, Данные представлены на рис, 2 и 3. ■ | .

Рис.2. Окисление; о£-кегоглютарага ядерной фракцией

листьев табака N Іа&асит /мкмоли Оо/мин/ыгДНК/

" І

.-і? ¡І**

£ з .

ж Е о

і 1 ?гаМ <*-кетоглмтарат т. 15 п»М N V

«ра^

ядро _

і 2 3 4 время, мин, і ■:■ z . з 4 : і

- 6 о <

• " . т - "" * .' ч.. .

.-¿С. V^s . , ■ '^'■^''^''■ '^ч-л—^г,:-■ ■

; - V . ■ ■ - . > ■ . . . ; ■ --■ ;■-■*>- -ц;. ■;

" 's- v ' Рис. 2. /продолжение/ Окисление «^-кетоглютарата

и ыалата ядерной- фракцией листьев табака ' ',.'.

/ / икиоли О^/ит/иг ДНК / / Л ..-Л'

V*' ' '

äs

■ -

щ t-

т

■ - -'С

dt-Ktromtora-рот, 50 mM

Л

о

XÜ2

о *

и

малатЛ^тМ

ч

малаТ*?тМ

' -3 4 t ¿ О . Ч

5Р&НЯ, MUH.

> Мйяат.

.SOmHf

<ч t

Ьргмя, мин,

3

Поглощение кислорода ядерной фракцией проводилось :в инкубационной среде следующего состава: сахароза 0.4.11, КН2Р04 0.008 U, KaCt 0.2 М, li9CE2 0.004 М, трис 0.02 U, pH 7.45, 0.06 ил ядерной суспензии.

•. -Г;. Рис. 3Влияние :различны*-концентраций НАДи' ; ' ; • '" , пирувата на поглощение 02 ядерной фракцией 'листьев'";:; ,/ мкмоли 02'/"ин/«г. ДНК / , • "

■ -Ш-;

| ^АДИ.О.'

Ё' о

15*

^ ■

, Е -

I

м ,

1 3> V

со

л

и I

.0

0.1

йЛ

ядра —а

ядр^

НАДИ >'о.А тМ. • V .

^Г— '.....

1 2 3 4 ■ ' ' НАДН(0,7тМ

2 Д - и вР&ИЯ,М0Н

ПИРУ ВАГ, 5 тМ

н_

1 2-3 Ц

ПИРУ6АТ, 10 тМ

1 г ъ ьмий,мин,:

1 • 1 3 к . 1 2 з; аремя.иин. :

■ .. ' ?

Условия опыта те же, что на рис. 2

%

.г

-і ї } .

; Как видно • из г приведённых данных,' ядерная фракция: ли-; - стьев т а ба к ао кие л ял а et ^ s то гл dt ар ат [ им а лат/р ис. Ztäi и;:" Г Окисление пирувата:и НАД.Н отсутствовало.'

Наличие дыхания ядер,; а также: окислєние ?двух c/d ст р а; ••• тов оставляет в силе предположение о'наличии окислитель- v -ного фосфорилирования в ядрах табака, осуществляющегося через дыхательную цепь. У - vr*''_ Т ■ ; ■

- В связи с этим с помощью ингибиторногоанализа.было решено получить общую характеристику существующем в яд- • pax энергосистемы. Использованы следующие »ягибигоры: ■ антимицин А, олигомицин и 2,4 ДНФ/ рис. 4 /. - ' . f

Рис. 4. Влияние ингибиторов-на[Дыхание-ядерной^-" .. фракции листьев табака/ нкыоли (^/м/н/м'г ДНК. /. -

:. - « 02

ЙШ

. -v з >

...

ШІ-

Sfc-I.v

■С*'-;-'

' С х •

'Г -

--і-. ■ V- ■

- v-

олигомицин

антимицинА

адра

адра

. N

ядра

і

3 4

12 3 4

ВРЄИЯ,Иин.

3:

■ 3-1222

Состав инкубационной смеси тот же, что и на рис. 2,; -' а также ос-кетоглютарат ІбшМ, олигомицин - 2 мкг/мл; ^ -антимицин А - .1 мкг/мл, 2.4 ДНФ - 7.10~7м; .-л' ■■'.'■.V

Ингибирование дыхания ядер антимицином А указывает на функционирование цепи переноса электрона и на существо- -вание, возможно, такого компонента, дыхательной цепи как ; цитохром группы"»! Это хорошо согласуется с предварительным/, данными* по дифференциальному спектрофотометри- ;', рованию.изолированных ядег, листьев.М ІаЬосат ■

в которых обнаружен пик поглощения около 360 ни ти поглощения цитохромов группы "в*. "В"

Следующие два ингибитора: олигомицин и 2.4,Д?

в облае-

Ф пока-..

зали существование фосфоротирующего дыхания в ядеоной цепи*переноса электрона. Олигомицин ингибирует поглощение кислорода примерно на 50%, а ДНФ выступает "как разобщи- ' тель,.усиливая дыхание ядерной фракции. ; |

Следует указать, что актимицин А, олигомицин и 2.4 ДНФ оказываются эффективными-и в случае изолированных ^ ядер'животных тканей/ $wen a aft, 1963; Вульдяева и др., 1972; JUukhe^jee о. а£?ддт2/. '

. Таким образом, на основании полученных данных можно , заключить, что,' по-видимому, в ядрах, изолированных из. . листьев табака, существует определённая цепь переноса, электронов, окисление в которой'сопряжено сvфосфорили- " , рованием. Насколько эта дыхательная цепь подобна|цепи . переноса электронов в ядсах животных тканей-можно будет выяснить после более детального изучения изолированных ядерных мембран, 1 . . ■■

Влияние вирусной инфекции на окислительный и энергетический обмен ядерной Фрпкиии.листьев табака. ] -

Учитывая рель энергетического обмена в устойчивости растений к действию различных патогенных возбудителей, стоящих на разных ступенях эволюции паразитизма/Рубин, Аоциховская; 1968/, нам представлялось целесообразным в плане общей характеристики исследовать дыхание иэоли-\ рованных ядер листьев табака, способность их окислять" субстраты в процессе развития вирусной инфекции.

Даже эти общие показатели должны были указать, затрагивается ли и в какой степени энергообыен',ядра в процесс© патогенеза. {

Дыгпнии и СубСТраТЫ ОКИСЛеНИЯ. j

На рис. d представлены данные по изучению';эндогенного дыхания ядерной фракции табака при заражении^вирусом.

Рис.5. Эндогенное'дыхание ядерной фракции листьев табака в динамике развития вирусной:инфекции - - •

/мкмоли 0^/5 мйн/мг ДНК / - ,

N ¡.сосала ХаЬасшп Н1со11апа д(и1то&а

а-390р. • т-аа^а^

24-ч.

ВРЕНЯ ПОСЛЕ

инокзмячии

Юза - 12 ч. . 2+4 «-. \7дн Состав инкубационной среды такой же, как в опытах рис.2

Из рис.5 видно /что эндогенное дыхание ядерной фрак-"~ -ции под влиянием вируса подвергается изменениям, и'харак-/ тер этих изменений различен для разных по устойчивости видов табака. Стойкому снижении дыхания/начиная с 24-часов после инокуляции вируса/ ядерной франции N. дРи^оо^а противостоит колебательный характер изменения дыхания ядерной фракции №1а6аец(п.

Следует отметить, что колебательные изменения интен-..сивности дыхания и фосфорилирусщей активности митохондрий печени в связи с воздействием вирусной инфекции на'' блюдались в опытах Кондрашовой/Кондрашова, 1970/.Было показано, что на начальных этапах развития вирусной инфекции умеренное снижение богатых энергией соединений в связи с их возрастающими тратами приводит к ускорению дыхания и фосфорилирования. В этот период активно окисляет:: ся сукцинат. При усилении^воздействия.вирусной инфекции Д происходит тормокение~окисления янтарной кислоты, и,при этом активируется субстратное фосфорилирование. , -'.

Возможно, и в наших опытах.по изучению эндогенного .' дыхания и субстратов окисления в динамике, развития ви-• русной инфекции наблюдается та же.зависимость. , ;

^у;:,''1 ' ■ " г-

(О

__________ .. ^"г■ \г^■ ■ ■ ^;^-V

Рис. б. .Окисление субстратов ядерной фракцией листьев разных ■ ■:.>,'у:

по устойчивости видов табака в процессе развития вирусной инфекции ■ > , ' ■

V : КксоКапа дУтоза ; , 1М1соЬапа 1аЬлсцш; у ; г/-

ПИРУВАТ

[

|

-кг?*

а-КЕТОГЛЮТАРАТ

палат

■ 280240

№

2.

160 120

£0 40

малат

1

4-КИОГЛЮТАРАТ

^ 'г?

■ 'г-.1 -V

■ ' - л-'

ПИРУВАТ. Я

''НУ..:

1 ■ ■'■''- ■ 'V 11 >

'Щ у «¿и*.-—-^ЩЩуШ

С/ '.".'.':.".'. ; ■ ^УУ время после инокуляции ВТМ , ^ ■■■ ' '

а:

щ

I

Г

М'^В.'клетках НдСй^лоьа. , где титр вируса увеличивается" до -£ ^определённого предела/Тукеева,1970/, реакция дыхания: : ядер;однот ипна и выражается в снижении дыхания, В ядрах -^'же'М^аЬасипх при постоянной нарастании титра вируса в ^ [■ клетке и усилении воздействия на клетку, наблюдаются опре-;'^ -делённые колебания интенсивности дыхания. Кроме того! • про-¿^ИСХОДЯТ изменения в способности ядерной фракции ОКИСЛЯТЬ "-О: .: субстраты в процессе'развития вирусной инфекции/рис.Ь./: -■ -": ;' " йз рис.6, видно,что изменения в окислении субстратов ' V. под влиянием вирусной инфекции особенно чётко проявляются-^ • Дгв ядерной фракции из листьев N. ХаЬасит 1 в которой от-.

сутствие окисления малата компенсируется значительным - . * ..' усилением окисления л -кетоглютарата, то есть активиро-' -.Званием субстратного фосфорилирования, Эта закономерность - • сохраняется во все сроки развития инфекции. " . , ;:

" В ядрах N. дСи^ш^а та же зависимость выражена слабее. * "-УУоиление окисления малата через 24 часапосле заражения V."' л

- вирусом, а затем его ингибирование слабо компенсируется ^'С :'1'

- активацией<*-кетоглютарата только в,случае 48 часов пос- • " ле заражения. К моменту хорошо выраженных некрозов на- '

блсдается общее падение окисления субстратов« В окисле- л. "V; нии пирувата определённой зависимости не наблюдалось. ' V Для выяснения снижения окисления малата ядерной фрак- -цией исследовали состояние малатдегидрогеназы в связи с ^: 1. ' вирусной инфекцией. " . 1 ■";¥" „;',■:

Ыетодом электрофореза в полиакрипамидном геле в изоли- .; . рованных ядрах табака обнаружено: 2 изозима малатдегидро-геназы у N. Ъабасит и 3 изозима - у №д£ьЛ1ПО$а/рис.7/ V

... .'.■;■■■■■*■'. Рис.7. Электрофоре граммы малатдегидрогеназы ^ -; V . ядерной фракции листьев табака. - ^

С I г з

А" -Й- 1а£>асит в - N. дСи1хпоза

+ ' полоса неизвестной природы

В процессе :развития; вирусной инфекц^:происходят , ,; основной, ; количественные изменения В ИЗОЗИМНОМ спектре „ ; малатдегидрогеназы.. ^ у- ■■■.;":

• В ядрах N. 1а6асит снижается.активность из озима 3,и ^происходит. почтиСполная потеря активности изозима 1 на ; /ранних сроках.-развития инфекции/ 24 и 48 «асов после ино-' куляции ВТЦ/.:При длительном-заражении /7-10 дней после ; 'инонуляции/'В'ШХ'активность иэозимов 3 и 1 восстанавливается и даже появляется новый изозим 2 /рис.8/. ч1; ■ Рис.8. Денситограммы изозимов малатдегидро-.

т. - геназы ядерной фракции табака в динамике развития' вирусной-инфекции

Жсо^ааа ЧаЬасит

' ■ - , з Л ■ . ч

—■ - зара^

Л' и

- В ядрах N.д^Слова в иэозимном спектре происходят лишь ' количественные изменения /увеличение при ¿4«асовом возде действии вируса и снижение при 48 часовом/. Интересно^ что при длительном заражении так же,как и у адер№1аоасищ/ происходит более значительное увеличение активности изо-эимов/рис.9/. •:

Рис.9 . Денситограммы изозимов малатдегидрогеназы -ядерной фракции табака в динамике развития -

вирусной инфекции -

Nicott

itouana

liait

uiosa

• »

? »

П

i-î" in

и

y

з г t

»4

■ч»

Ж

V

2.4 t. ■ 33T

4Й.

>Ьмй

?-103м. -,

- - - japaïtteRHHÛ

| У ^ у - Влитврату^иместся^укаэаниябтом^чтопри'патоло У'у' 5: _ гических нарушениях ;в .тканях может}происходитьактивация .V:; --'¿одного из озима на- фоне; снижения другого ;■ или даже ис чез- : .4:,^ £Дуновение ■ активности некоторыеизовимов/Зка*ку,1973/ -'"-у'Д

Эти изменения могут быть связаны с изменениями концентра- г " : ции. субстратов или. дегенеративными изменениями. -

• По-видимому,! в. ядрах в; результате развития вирусной : ^■ инфекции происходят.изменения в концентрации малата, что ., . ' влечёт за собой определённые изменения в соотношении изо- . ^ "V'1 зимов, и как результат - изменения в окислении малата, ; ','•.;'•.-•* .*'• •' .;"что и. наблюдалось^в наших опытах. / ^ ^

-Обобщая раздел,^ можно заключить, что вирусная инфекция ' ^-¿У; оказывает различное'; воздействие на-начальные этапы окис-; д > - у . ления в ядрах разных по устойчивости видов табака. В ЯЦ- ';. - ',. Урах неустойчивоговидаI в клетках которого происходит ре-': •. продукция ВТМ, нарушение одного пути окисления/через ма-' - - лат/ ¡компенсируется, активацией ^окисления другого субстра-'' /.-"_ . ; ;• та/ <*-кетоглютарата/, то есть происходит сохранение, на

определённо«; уровне функционирования путей окисления. В г- С;;::;-• '.ядрах "же устойчивого вида к моменту появления. видимых ;^ симптомов происходит нарушение в начальных путях окисле--. •. ' ^¿ч ния,; что проявляется: в снижении, дыхания и угнетении окис- 1 Тления субстратов; ; ;У ... ' . '■■"■ -

г , Влияние йнг'ибиторов на дыхание . В опытах с использова-V ' /' нием ингибиторов-антимицина А и олигомицина наблюдался -

противоположный характер изменений в яде он ой фракции ^ устойчивого и восприимчивого к ВТЫ видов табака/рис. 10,11/ у;

: РисV 10.. Влияние антимицина А на дыхение ядзрной\фракции табака в динамике развития вирусной инфекции. " ..

2 Є

в л -8-і

ВРЕМЯ ПОСЛЕ

инокуляции етн

С «л

-31

ВРЕМ* ПОСЛЕ

□ ЗДОРОВЫЙ "Т' " ■ СРАЖЕННЫЙ.

і-

ИНОКУЛЯЦИИ 6ТН

1 Состав инкубационной среды такой же, как в опыте на } рис.2. Добавлен л-кетоглютарат 15гиМ. Концентрация антимицина А - 1 ыкг/мл. _ - ..

у . ' г Если в ядрах М.1а£асит. • , заражённых ВТЫ, уровень • V-: . ингибирования дыхания антимйцином практически сохранялся , на уровне ингибирования дыхания в ядрах здоровых листьев,. . то в ядрах N. £|^иипо&а чувствительность к антимицину й-. снижалась почти вдвое/рис.10/ Интересно отметить,-что снижение чувствительности к действию антимицина в ядер- 9 ной фракцииМ наблюдается только с 24-х часо-У

• вого воздействия ВТМ, а в более ранний срок/через 12 ча-~ Л; .:сов; после инокуляции/ степень ингибирования находится на ; • уровне здоровых растений. Снижение антимицин-чувствигел -^ ной;компоненты дыхания в одрах N. д?и1чпо£а ,, возможно, ^

17

і.

-..л 11-

происходит за счёт7переключенияна,шунтирующий:антимицин-.резистентный:путь;переноса электронов. Это тем более вероятно, что для;жиаотных'ядер 'показано существование ан-¡ тимицинА-нечувствительной НАД .Н-цитохром-С-редуктазы / Легегпеу а. 1970/.

Это Предположение/подтверждается нашими опытами с олигомицином/рис.'П/.

Рис.11. Влияние олигомицина на дыхание '. ядерной фракции^табака в динамике развития .

вирусной инфекции. -

"Мч:.

48«..'

О здоровым ' ; С Л □ зараженный

£ о ее

* «* .3 '' ^

СГ>

ИНОКЫЛЯЦИИ ВТМ

- Условия опыта те же, что и с антимицином. Концентрация олигомицина - 2 икг/ил.

В ядрах N. (^¿¿по&а также снижается чувствительность V дыхания к олйгомицину в вариантах с заражением ВТМ. Та- .. . кая реакция; понятна', если происходит шунтирование основ-,-ной цепи пере нос аэлектронов, на что и указывают данные .. ~ опытов с анТимйцином А.;- ■ ■

' В ядрах *е Ша^асшп характер действия олигомицина в . ^ ■ ' динамике.развития вирусной инфекции, в основном, аналоги-

■Л иен действию на дыхание ядерной фракции здоровых листьев По-видимому, вирусная инфекция вносит определённые изменения в энергосистему ядер М; д?и1Х)гоба и вызывает сни-1 жение её фосфорилирующей способности, чего не наблюдается для ядерной фракции М^аЬисит, ■■/?

Такое заключение хорошо подтверждается данными определения АТФ в ядерной фракции табака при заражении ВТМ /рис .12/

160 т

4 м |

о

- * N

' -во

Рис. 12. Содеожание АТФ в ядесной фракции -п' табака в динамике развития вирусной инФекции Д:

Мсо^апа 1акасит.

ЩРСНЯ поел«

инокуляции ВТМ

МкоНапа д1иКпо5а

-ч, \ . ' • л . .

Из рис. 12 видно, что в ядерной фракции восприимчивого вида/ с сохранением фосфорилирующего дыхания на уровне здоровых растений/ наблюдается повышенное содержание АТ^, в ядрах те устойчивого вида/снижение фосфорилирующего дыхания/ - уменьшение количества АТФ, .

Исследование содержания неспаренных электронов в ядер ной фракции разных по устойчивости к ВТЯ видов табака в динамике развития вирусной инфекции показало также различные по направлению изменения.

Обобщение результатов данного раздела показывает ' "специфику" реакции ядер на заражение ВТМ по сравнению^ митохондриями и хлоропластами. В тканях устойчивого веда

"табака'эне рге т и чес к йе > с и с т емы: ми тох овдр и й 'и: хл оррпл а ст ob .v л ибо; активируются, ,'. либо- остаются н а:уровнв^ здо ро еых рас-" ^ г'| • • тений. • Напротив, .'неустойчивый вид характеризуется ослаб- . Млением энергетических'функциИ" ЭТИХ С Тру ктур..;;',' ' ■ Д^Л-Д^ j- ' " Такое резкое'-отклонение ядер от; однотипной реакции ., •-._ --'•^митохондрий и.хлоропластов на вирусную инфекцию, вероят-'w'^ ^-'•.-•но,' можно объяснить{непосредственным участием ядра в син-'^Д^.

тезе вирусной РНН. .. ^ Д.

vf-./*:• -• • В тканях устойчивого вида активация функций митохон-^ДДдриЙ и■ хлоропластовг.;включающихся в эащитные механизмы ; - ^j Jj .клетки,-- одновременно сопровождается нарушением энергети- v ^.-v'. • 5 >*.' ';чееких систем в .ядре, ' непосредствежО связанном' с СИ нте-|ДДДзом вирусной РНКДТакоё сочетание; приводит кингибир ова- - - .^ДД •:. Г.." - синтеза ВТМ.-У. восприимчивого вида инокуляция ВТМ не Д Д-Д нарушает интенсивности энергетического обмена = ядра, Д.Д

p i^j энергосистема; продолжает функционировать. Возможно, ре- Д.-ДД-ч ,..•-„: продукция ВТМ,,' переключая метаболические процессы на Д ■■'.'' ДД ДДД синтез вируса, - препятствует. проявлению: защитных механиз- - - .;.'•„ ^ДДмов'1 в клетке^. Возможно",, в данном; случае происходит нару-': ' ~ ' •' -Дшение рег7Ляторных механизмов клетки, - ' . : Д .

иДДДД '.'фракционный-состав гистонов ядерной фракции табака ДД'Дд г при заражении ВТЦ.',: •-•" '.'■■ 1. .'■: , '■.■'.'■ ■ . Д/• Д

':Д.. Д Для изу чения *регул яторных механизмов .клетки ПрвДСТаВ-ДЧД Д Д *г:<• ляют интерес гистоны-одной; из Функций которых является ДД Д Дметаболическая-регуляция. Обнаружено, действие ' экзогенных :,*. : S ДД.;Д;гистонов на многие ^внутриклеточные процессы: метаболи- ■: - Д Д - ■:: '-иДДческие состояния "митохондрий , проницаемост ь мембран, гли-Д ДД -Д. кол из, аэробное,фосфорилирование.: В. частности, для живот-ДД;^ ¿ДДД "ых. ядео покаэано^влиянйе экзогенных, гистонов на дыхание Д Л ДД; -ДДД:И Ъэробное фосфорйлирование.1 В .'зависимости -от концентра-:. '':

;• 1 ции гистонов либо слабо активировзлись, лиöo y гнеталисЬ -,'•' • дыхание и аэробный^синтез А'ГО в ядрах тимуса /Таршис', .- ,

т:-'>.;- 19?о/. ■ .••• '; ) '■".;•:"• '.

У В связи со..'способностью гистонов оказывать .влияние: на энергетику "ядра проведено'., изучение гистоновых фракций > * 4 " V; ядер двух видов табака при заражении ВТМ /рис. 13/. 1 •

•: ■ 4 >:'¿о

-Чу Из.. рис.13: видно,лчто? качественных изменений г составе Фракций гистонов ядер обоих видов табака при заражении ВТЫ не обнаружено: не появились новые, не исчезли обнаруженные гистоновыефракции, не произошло смещений в электрофоретическойлодвижности. Однако развитие инфекции оказывает влиянне^на количественное соотношение отдель-* ных Фракций, : и. характер этих изменений несколько различен для разных по устойчивости видов табака. В ядрах N. 1а-'Ьасипг /восприимчивый вид/ впеовые сроки после-заражения/12,24-часовгпосле инокуляции ВГМ/ наблюдается увеличение фракций;IVи 3» такое же увеличение отмечается и при длительном заражении. В дцраж N. $1иЬпоза /ус-

тойчивый вид/в:процессе заражения также увеличивается количество фракции 3,: но количество фракции 1, в противоположность ядрам N. taБacum во все сроки развития инфекции снижено. I

*'.'.. Возможно,, именно количественные изменения гистоновых фракций приводят•к глубоким качественным сдвигам обмена ядра, в частности,- энергообмена."В связи с этим первые полученные результаты являются предпосылкой для дальнейшего, более детального изучения гистоновых фракций, их ■ препаративного выделения и установления влияния на энергообмен ядра. -

'. ВЫВОДЫ ; '

1. Наличие дыхательной активности, способность окис- ; лять малат и «1-кетоглютарат ядерной фракцией листьев табака, а также чувствительность-дыхания к антиыицину А^ 'и олигомицину дают' возможность предполагать функционирование цепи переноса^электронов и фосфорилирующего дыха- . ния в ядрах листьев табака. * -

2. Развитие-вирусной инфекции вызывает различную по характеру реакцию окислительного обмена ядер разных

по устойчивости к ВГМ видов табака:

а/ эндогенное, дыхание ядерной фракции МдЕи1то$а : -снижено во* все .с^оки развития инфекции/исключение сос- .-" тавляет 12 часов.после инокуляции ВГМ/, в ядрах N. 1а- . Басим - носит,колебательный характер, что, вероятно, объясняется различным воздействием вирусной инфекции на . разных этапах'.её развития; ■",

, ; б/снижение окисления малата компенсируется активацит ей окисления/о1-кетоглютарата в ядерной фракции ff, ta-5i $acu-m , что поддерживает окислительные' пройесаылна определённом уровне, в ядрах же N. gtutirwsa такая компенсация слабо выражена, а к моменту хорошо развитых некрозов снижается окисление всех изученных субстратов; . >

в/ происходят количественные изменения ИэОЗИМНОГО спектра малатдегидрогенаэы ядерной фракции N. gfutinosa . в ядрах же М- ta^acum при длительном заражении, помимо • количественных изменений, происходят и качественные -появляется новый изоэимный компонент.

, 3. Развитие вирусной инфекции вызывает также разяич-v нуюпо характеру реакцию энергетического обмена ядер раз ных.по устойчивости видов'табака:

а/ вирусная инфекция не вызывает значительных изменений в транспорте электронов и фосфорилирующем дыхании ' ядерной фракции Ntatiacum во все сроки развития инфек-г!

Содержание &ТФ не только не снижается, а даже несколько повышено;

б/ в ядерной фракции N. gtuUrtosa , по-видимому, происходит шунтирование основной цепи переноса'электронов в процессе развития инфекции. Это подтверждается снижением фосфорилирующего дыхания и содержания АТС в-ядерной ф^ак ции. "

4. Отмечена "специфика" реакций энергетического об-? иена ядра при заражении ВТМ, противоположная реакциям-митохондрий и хлоропластов в разных по устойчивости к ВТМ видов табака. По-видимому.специфичный характер ре- * акции ядеоной-фракции связан с непосредственным участи--' erf ядра в синтезе вкусной рнн\

5. Вирусная инфекция вызывает неодинаковые количественные изменения отдепьинх фр.ЖЦИ^ гистоноп ядзр 'в разных по устойчивости к ЭТУ пгтчх таЗэкэ, что, воз- -можно, приводит к различным качественным сдвигам обмена /веществ ядре И клетки В ЦЙЛС.%

J. •':,: .-••• ; v• .-; - ; • ..'••. ;•: •.'; ; • * ; • ^

•7 .-•:'- • -v .-,-.: >-.*V-v ..".'У\-.'.\ . У • • '¡.-y, •••-'. • . .

^УУ Мат ериальї д исс е рт á ции. из л оже ны'; в: ■ следулщих-раб от ах: '^УУУУУУ г . І.уИ.В.v Назаренко, tí .Е. .Ладыгина' : ;, ' /•• ' т ' ^ ..

—" ^С - и Є ТО ДК К ВИ д в ле Н ИЯЯ Д е рн 0 И - фр а К ЦИ И;; и 3- Г——--ryfirSS r..J„: ■ у листьев табака. С.-х. биология, 5, <Рб, 1970;

'.-"•У. " 935-938. - . :'.>..,.:У':. "" . ' " . У

U^.-ríí' '2.'. B.K. РубйнУ".М.Е.:Ладыгина, И.В. 'Соколовская, ''

у: V -, A.B./ Ку рд юио в a Особенности, энергетического об- у-* :УУУ''. . мена-и свойства основных белков изолирован-у-У.¿..'У

гУУ^У, - - ■ У ных ядер табака при вирусной инфекции. ' -*£•;••:' Г- У У ••, • ": - Сб .. "Вирусные болезни растений Дальнего Вое-'; : ;...У;У* . тока"; Тр. Биолого-почвенного института, 14 у

г г "/117/.;. Владивосток, 1973, 22-33. У у

v : 3. Ладыгина MÍE., Соколовская И.В. , Тимофеев К.

С пёкт ры'э л ект ро н ног оп арам а гн ит н ог о 'резонан-£уУ::У; "са и энергетический метаболизм изолир ованных •- "У - пдеи таба'ка при вирусном патогенезе. Сб. яви- У - :: У Ярусные:болезни, растений Дальнего Востока", - ~ вып."6'.;Тр. Биолого-почвенного института, - ^.л-У^у? ; 1974 :<- ' . ; • ■■■ У

. / - -

' ' '

■і"/1.-* - _ ; ■■ ' . ■'■■ ' ■ -

: „. ПОДП. К ПЕЧАТИ ІЗ/Щ-74 Г. ФОРМАТ 80*00/16

.. • • • :. ФИЗ.П.Л. 1,5. УЧ.-ИЗД.Л.1.0. ЗАКАЗ 1222. ТИР. 200. ■- .. •: ''/.'.

: ОТПЕЧАТАНО НА РОТАПРИНТАХ В ТИП. ИЗД. МГУ '¿-л'

, ,' - ; ^ ' . . МОСКВА, ЛЕНГОРЫ . - : /