Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональная активность тромбоцитов и гранулоцитов донорской крови в условиях избирательного удаления из нее фибронектина

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Функциональная активность тромбоцитов и гранулоцитов донорской крови в условиях избирательного удаления из нее фибронектина"

? \ О*

х

Академия Медицинских Наук СССР ИНСТИТУТ ПИТАНИЯ

На правах рукописи' Мамцева Галина Ивановна

уда 612.III.7 + 6I2.II2.9j:6Г2.112.115

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ТРОМБОЦИТОВ ' И ГРШЛОЩТГОВ ДОНОРСКОЙ КРОВИ В УСЛОВИЯХ ИЗБИРАТЕЛЬНОГО УДАЛЕНИЯ ИЗ НЕЕ ФИБРОНЕКГИНА

03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва: - 1.9 .9-0 ;

Работа выполнена ео Всесоюзном Гематологическом Научном Цэнтрэ' Мшкстеротва здравоохранения СССР

Научный руководитель Доктор медицинских наук, профессор Н.А.Федоров

■ Официальные оппоненты: Донгор биологических каук, профессор М.М.Левачев Доктор биологических наук, профессор А.А.Карелия

Ведущее учроадение - МГУ

Защита состоится "_" _ 1991 г. в "_"часов

на заседании Специализированного Совета Д 001.02.01 при Институте питания Ш1 СССР (103240 Москва, Устьинский прое: дом 2/14).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института питания АМН СССР.

Автореферат разослан "_"_1991 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат медицинских наук.

В.М.Йишнчен.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРНО 2ЖА РАБОИ

Актуальность- проблемы. Способность тромбоцитов и гранулоци-тов донорской крови легко активироваться под влиянием эндогенных и экзогенных факторов обусловливает их быстроо разрушение не только в условиях экстракорпорального кровообращения, но и в процессе выделения этих клеток и храпения донорской крови С Ължс. Р-. г-.а-. , 1984; £9. «&.«., 1986), В консерви-

рованной крови наблюдается образование михроагрегатов, пред -Ьтавллющих собой микросгустки: размером более 170 «ни и агрегаты разрушенных клеток 10-200 шел, соогояцие в ооновном из фрагментов тромбоцитов, лейкоцитов и фибркновах нитеЗ. Иикроаграга-ты крови при транофузпях могут ЕН&ывагь закупорку капглляров в органах реципиента я быть причиной различных пооттранерузионных осложнений.

Вакнуа роль в образовании мякроагрегагог' играет фибронэк-тин плазмы крови, посредством которого клетки взаимодействуют иезду собой и компонентами межклеточного матрикса,и осуществляется модуляция активации адгезии и агрегации тромбоцитов и гра-яулоцитов. Полифункцконалыюсть фибронактина объясняется наличием в его гликопротовдной молекула специфических доменов и сао -зобноотыо к аугопрогеолизу и прогеолизу с освобождением высоко-активныЗс паптидшпе. фрагментов, содержащих, напршер,'последовательность аргянил-глщил-аспаргил ,

В свете существенной роли тромбоцитов и гранулоцитов в громбогенном потенциале' донорской кропи и разнообразных метаболических и физиологических сдвигах у реципиентов, индуцируемых

биологически актгазшгаи ведесгвала, оовобоздаемыми активированными :: дозрзгданккмп тромбоцитами и гранулоцптами, вполне обоснован:-!:::.: является поиск путей снижения "спонтанной" активации этих клеток г консервированной донорской кров:: и удаления "предаккшлроваязых" тромбоцитов к гразулоцитов, способных адге-знроватьсл йнбронектпну к нелатнку. В связи с этил, нами предпринято ксученке йгтапояаяьнсго состояния тромбоцитов к грану-лоцитов в донорской кров:: в условиях избирательного удаления из нее флбронзктпна (до качала ншлих исследований эти дачные отсутствовали), что представляет большой научный интерес и имеет важное практическое значение как возможный способ стабилизации активности клеток донорской крови.

Ца.^ш я задачи гсодег.ования. Основная цель работы заключалась в пэгучзшш данных о функциональной активности тромбоцитов и гранулоцнтов в условиях избирательного удаления йибронектина из донорехоГ: крозн. Конкретннз задачи исследования заключались

■ в следукдгм:

1. Разработка оптимальных условий сорбции к десорбции фиброяекгпна из цельной донорской крови ка сорбенте силикагель-яелатше.

2. Заявление возмолюстк стабилизации тро?лбоцитоз и грану-лоцитоз донорской крови путем фильтрации ез через силикагель-

■ желатин. • - ,

3. ти^вдение возможности эвдогенной проекции фибронектина ' в процессе хранения донорской крови.

Наущал топтана. Показано, что избирательное удаление фибронектина из донорско" крови,путем сорбции его на силикагель-яелатинз, значительно снимает функциональную активность .тром-

боцкгов и гракулоцктов: агрогационная способность тромбоцитов ашкается з 2-3 раза, а .шяиюдзагквгуая хсиажглзкзсцэктда -гранулсцнтов - в 10-13 раз. Босстанозлзкгс доходно'!; физиологической концентрации длгбронзктияа в про^иьтрозанло;', крови, напротив, повышает функциональные отзоти этих клеток.

Установлено, что при использования нитратного буйера, вместо 4','! мочевины для элюции йисЗронсктинз. с силнкаголъ-г.елагк-ка, внход и частота сйдброяектина нэ умоякшгсь. Выявлено, что овдогвшгого продзпзфэзаншг фгйронекгпяа в процессе "ранения профильтрованной черэз сил2кагэлъ-;;:елаткн донорской крови не происходит.

Практическая тге;гность. Полученные результата свидетельствуют о том, что удаление фиброноктина хз донорской крови значительно снижает ^унюр-ональнуа активность тромбоцитов к грануло-дагсэ, что очень сучосгзэнно для уквикгзгош мн-"роагрегадня донорской крови и еэ троглйоганяоекг. Практическое Бкачекие хг.сэ;./ и наши дашше по разработке опт дальних условий сорбции на сорбенте силикагелъ-.'кеяаткне фибронектина из цельной донорской кров:1; к последующей его десорбции с целю получения рнСронэятп-на плазмы крозк, пригодного для лабораторных, биотеннолсгяческих долой и последующих клинически;: испита!::!::.

'.'атаркэлн исследований додогекн а обсутдвнн на заседают .секции "Бкохнмпя крови" Всесоюзного бпохиг.нкеского общества АН СССР (Москва, ВГНЦ, 27 января 156Э г ) зклхкзкы з программу 2-го Всесоюзного каучно-прахтлчоского с ог,-.икара "Фуакцгокальаое, клиническое и диагностическое значение фгЗродактиаа" (Москва, КМ ГГнПЗ АКЯ СССР, 11-13 дэхаб?.? 1339 г ) и аредоуаглзш; па 1-й Всесоюзной пжолз-сэ;,отара "Тромбоцит как тост-сксте;.'а >;пзкологл-ческлх и патологических состоякпЛ человека" (Моозиэа, НРЛ ГГпПЗ

- 6 -

АМН СССР, 12-14 июня 1ЭЭ0 г ).

; Структгса и объем Еиссаэтсгсти. Диссертация изложена на 116; страницах машинописного текста, включая 13 рисунков и 14 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсузде-ния, выводов к списка цитируемых публикаций, включающего 134 источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОШ

• Материала и кетоди исолоцованпя. Исследования проведены на 55 донорах крови станции переливания крови ВГНЦ и 55 пракгиче-ски здоровых лицах, наблюдавшихся в кардиологическом отделении НИИ гигиены труда и профзаболеваний АМН СССР.

Материалом для исследования была сверкая нитратная кровь и донорская плазма.

Концентрацию фибронектана в плазме крови измеряли при по-меци аффинной, хроматография на коммерческой ;келатин-се$арозе 43 ( ", Швеция) и на силикагелъ-келатине, получен-

ном в лаборатории биохимии ВГНЦ Н.А.Федоровым и соавт. (1987 г), а также турбидикетрнческим методом с использованием коммерческих реактивов фирмы " .Л^/й^я^г- "Австрия) и реакцией гемагглютк-нации келатинизированкых эритроцитов барана (И.Н.Овчарук и соавт., 1990 г ). В большинстве случаев результаты были сопоставимы, но в силу быстроты определение концентрации фибронектина в плазме крови ш осуществляли гурбидиметричеснш методом.

Количество.тромбоцитов и гранулоцитов донорской крови подсчитывали общепринятым-методом в счетной камере Горяева ("Лабо-

- ? -

раторные методы исследования в клинике. Справочник", 1937 г ).

Функциональную активность тромбоцитов донорской крови определяли измерением их атрэгационноя способности, согласно методу (1962 г), на агрегоглетре, сконструированном в ЩУ Е.С.Лебедевым и соавт., с использованием в качестве индук-тороз агрегации аденозиндифос^ата (АДО) ( ФРГ) /0.2; 0,5 я I икЭД/ и арахидбковоЁ кислоты ("Я^мя-*,. США) /250 и1 500 мкМ/-

Функциональную активность гранулоцитов донорской крови определяли путем измерения лшлнолусЕленной хемпдшинесценции (2.0.Смолиговец и соавт. , 1989 г) на лшинометре ХЛМ 1Ц-01 с

11 г\ "

использованием 5кМ раствора лшикола ( ■ж-УЪ' , ФРГ), формил-мотиогал-лейцгш-Зонилаланила ( "¿и^Уча.США)

/5 • ю-3;,! раствор/ и зклозака ( из 3, сит-пп^-яе- рсаъ-зЁ ) ( , США) в качестве активаторов дыхательного взрыва.

Цельную донорскуп кровь (5 мл),без принудительной прокачки, пропускали через колонку Д • 16 см/, заполненную 10 мл сорбента силикагель-келатина,-прадварительяо уравновешенную фосфатно-солевым буфером (ССБ) рН 7.4. аиоцию фибронектина осуществляли 4М мочовиной в 0.05М Т-х^ - буфера (рН 7.4) со скоростью 0,25 мл/мин или 0.05 М нитратным буфером ( рй 5.5) при 37°С, принимая во внимание указания ^й^к^^л'л/ ¿.«,(1934 г).

Чистоту выделяемого фябронектияа плазмы крови оценивали электрофоретическя общепринятым методом в полаакриламидном-геле при-стандартных условиях. ,

Результаты исследований обрабатывали статистически о помощью коэффициента Стьвдекта.,

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Вначале мы попытались выломить, влияет ли фильтрация цельной донорской крови через сорбент ошшкагель-желатин на количество клеток крови. Полученные результаты, представленные в таблицах I и 2 ( р «£ 0.001), показывают, что в профильтрованной через силикагель-иэлатин цельной крови действительно проио-ходлг снижение количества тромбоцитов в среднем на 30$, а лейкоцитов в среднем на 40^ (гранулоцитов на 42%). При этом число эритроцитов л суммарное содерканкэ белков не изменялось. Поскольку походные,функциональна* активность и время циркуляции в крови тромбоцитов и гранулоцигов.иглеют непрерывный спектр значений от "0" до определенного максимума, то в процеосе фильтрации цельной донорской крози через силикагедь-желатин происходит адгезия клеток с максимальной активностью на иммобилизован-' ном желатине и адсорбированном фябронектика.

Таблица I

Количество тромбоцитов и лейкоцитов цельной крови до и после пролуоканвд через сорбент сштсагель-желатин (в I мкл)

! Тромбоцита ! Дейкоциты*

! до Г после ! до ! после

М±т- '-290075±10472 ! 210300+8003 ! 5535+123 ! 3490+110

! Т ~ I !

п-- 20

_ ! _! ! I

х Количество гранулоцигов, лимфоцитов и моноцитов рас' считывалось до лейкоцитарным .Формулам, исходя из общего количества лейкоцитов.

Таблица 2

Количество гранулоцитов, лимфоцитов и моноцитов цельной крови да й поолэ пропускания через сорбент силккагвль-яолатин ( в I мкл)

! ДО ! ПОСЛЕ

1 Грану- 1Ликфо~ Шоно- 'Грану- !Лилфо- Шоко-

¡яоциты ¡циги ¡даты ¡лоциты ¡ЦИТЦ ¡циты

(---------г-------------

!3525± 1592± 433+ 2056± '1225+ 153±

!122 72 50 64 86 31 1

Так как фибронектян обладает высокой адгезивностья и легко фрашеятлруатоя, то возникает необходимость применения нескольких методов измерения его концентрации. При сравнении аф^иннохроматографЕЧэокого определения концентршрэд фябронекти-та плазма крови на ¡хзлатак-оефарозе 43 (^'«ллгии!- *, Швеция) и зюшкагель-желатино, турбйдиметрячеакого метода с использованием набора реактивов фирмы "¿ЗссЖимугь- '* (Австрия) и реакции ?емагглюгинации, ш получили вполне сопоставимые результаты !р <0.001) (рис.1), но предпочтение оладузг все-жа отдать «Йшшохроматографкчеокому методу на сшшкагель-желатине, даа-;ему наиболее, реальную концентрацию фибронектина и реакции •емагглютинации из-за простоты определения, Как было показано Р- , 1984 ), антиснворотни к йибронектину реаги-у»т и с фрагментами,- поэтому иммунофермеятное определение «брокектика в жидкостях моз$от давать заваиешше значения.

При.решении вопроса .о воэмояноетя.эндогенной продукции ■ ибронэкгияа клетками крови в процессе хранения профильтрован-

М ± и^

20

Рис. I. .Средние уровни фибронектина (мкг/шг), измеренные в плазме доноров сорбцией и

десорбцией на келатин-сефарозо 4В (I) и силикагель-келатше (2), турбддшетриэй (3) ■ и реакцией гемагглютинации (4) №+«-).

ной через спллнагель-жолаглп донорской крови Еыяснеко, ч?о в точение 48 часов хранения донорской крови происходит снижение концентрации фибронэктпна: через 24 часа гранения профильтрованной крозя оно составляет 345, через 49 часов - Снияо-няе концентрации фибронектина наблюдалось я в непроФплътрован-кой через сорбент крови: через 24 часа хранения оно составляло 13/', через 43 часов - 25^ (р < 0.001) (рис.2). Следовательно, эндогенного продуцирования фиброиекгкна не происходит в процессе хранения донорской крови, а наоборот, его концентрация скитается, что мы связываем с образованием комплексов фдбровектана з продуктами аутолкэа, и возможно, за счет частичного фермента-гизного расцепления ого, как протеяназаки крови, так п прэтеина-зата, являкщ1с,гися структурно,::! компонентами молекула дсибронек-скна У, „/г.. , 1590 ).

•Разрабатывая оптимальные условия сорбции и десорбции фкбро-!ектина с езлликагель-г.елатияа, используя цельную кровь и цятратнуи глазглу, г,и убедились, что 411 мочевина и нитратный буфер обладают »динаковоН десорблруюдэй активностью (р<0.05) (табл.3). При-:ененнз нйзко:гслярксго нитратного буфера для десорбции фпбро-:ектина позволяет на применять диализ или ультрэдильтратппо пе-1ед лиофилкзацкэй.

Зависимость количества элвкрованного бибронектина от объе-а профильтрованной через силикагелъ-нелатин исследуемой донор-кой крови (рис.3) показывает, что количество элшровашюго яброяектина увеличивается пропорционально объему нанесенной на орбент крови и выход его составляет около &5% от концентрации цельной крови (р-<£ 0.01). Следовательно, образца крови, про-едше через" колонку с силлкагель-келатином, могут еще содержать

/

ей £

£ «

а> К о Л •о к

5

■I

о. . н

к ®

в

о

400

300

200

100

I

-ч

ГО I

Рис. 2.

Концентрация фибронектина (мкг/мл) в цельной донорской крови до и поело фильтрация через сйлихагелг-лшлатин в процессе хранения при +4°": ( М+"1- ): I) свежеполучешгая, стазу после пропускания через силиютоль-желатин, 2) через 24 часа храпения, 3) через 49 часов хранения. Заштрихованные столбики - образец, пропущенный через сорбент; не заштрихованные - • образец, не пропущенный через сорбент.

таблица а.

Десорбция фиброкекгпна (икгЛ"-я) 4!Л мочевиной и цитратяш буфером поело фильтрации цельной донорской кроьи через силикагель-^елатин

Згаоция фкбрсыокгкна 4?Л мочевиной

Злюгшл фкбронеккша цихратнем буфером

Яокцентрают фибро-яектикя (миг/мл) в цельной донорской■ креви (до фильтрации чэроз силакаголъ-желаткн)

10

;л + л»-

163+1.5

Количество десорби-рованного флброигк-тина (ккг) при нанесении на колонку с еилкдагель-желахщзта 5 мл цельной донорской крови

•Кощенттацпя Фибро-¡нектгша* (;лкгДш в ,цельной донорской • крови (до фильтрации •через силккагелъ -•гелагия)

519-1-5.0

174*2.5

Количество десорбя-розагаюго фнбронезн тика (мкг) при нано-сешш на колонку с силикат ель-желатином 5 мл цольной донорской крови

566+2.3

со I

!

фибронектин, ко по-видимому, в форме комплексов, биологически неактивных и не подвергающихся детектировании. В силу того,что всегда присутствующие предактивированкые тромбоциты 'И грануло-циты адгезируются на сорбенте и подвергаются разрушению, а комплексы фкбронектина о клеточными компонентами (ДНК, гепаран-оульфатом и др.) на удерживаются сорбентом, хотя иммунологичэ-ски они дзтектируктся как бибронектин и не удерживаются на ке-латине.

Каши исследования по удалении фибронехтина из цельной донорской крови путем фильтрации через силикагель-хелатин иЬка-зали, что агрегащгонная способность тромбоцитов в профильтрованной крови сннгает^я в 2-3 раза и наблюдается восстановление этой функции тромбоцитов при добавлении ф'лбронектина к про -фильтрованному образцу. Наибольшее восстановление ахрегацион-ного ответа тромбоцитов наступало при добавлении фибронектина к профильтрованной крови до его физиологической концентрации -360 мкг/мл: степень агрегации при этом восстанавливалась на 82$, скорость агрегации - на 83^/мик (если в качестве индуктора агрегации использовали АДФ), при использовании другого индуктора - арахидоновой кислоты соответственно на '79$ и 71^/мин (р < 0.001) (рис. 4 и 5 ).

Функциональная активность гранулоцитов донорской: крови, профильтрованной через силикагель-келапш, снижалась в 10-13 раз, а при добавлении фибронектина происходило восстановление функционального ответа (рис. 6 и ?). Так, максимальное восстановление хемилшинесцентного ответа гранулоцк;ов - на 73$ наступало при добавлении к профильтрованной крови 360 мкг/мл-фибронектина, при использовании в' качестве стимулятора

100 200 i 300 400 500 600

ФИЗрОНЭКТПЕ

(мкг/мл)

inc.'4; Зависимость: I) степени (Я и 2) скорости аэтэагапни тромбоцитов профильтрованной чего? силЕкаголь-зг.елатил донорской крови (вызванной 0.2 мкМ АДФ) от добавленного фябро -пектина (мкг/мл) i^-itv). (Степень и скорость агрегации тромбоцитов 'lie профульттизванной через сорбент крови г.п."тяаттсгти ТЯя П Юл/мик).

Фибронектин (мкг/мл)

Рис.5. Зависимость: I) степени (.%) и 2) скорости

{%/кт) агрегации тромбоцитов профильтрованной через скликагелт-г.слаткн донорской крови (вызванной 250 мкМ арахидоновоЯ кислоты) от добав-лонного фибронектина (мкг/?.*л) iJ^t n^). (Степень г скорость агрегация тромбоцитов Ее пт>.Фильтрованной через сорбент iqpoBE составляли 2П% ж 25%/атв).

-■■Рис.6. ■ Изменение летлшолзавискмой хешшминесценщш (имп/10сек) аииозан-актшзированкых гранулоцитсв донорской крови под действием фибронекмша (мкг/мл): А - хешшшвесцекцЕя гранулоцятов. не профильтрованной через сшшкаголь-аелатки донорской крови, . Б - хводшшс -щенцяя гранулоцитов, профильтрованной доиотской крови, -В - хешшжтинесценция гранулоцитов, после добавления к профильтрованной крови 120 мкг/мл Г - . -"- - 240 мкг/мл. ФН,

Д - ' 330 мкг/мл ФН,

" Е - ■ -я~ - . 460 мкг/мл ФН,

Ж - -"- 600 мкг/глл ФН.

/

6900

8200

я СП

3350

eOUSSSarSZjJ

Ркс. 7.

А -

Б -

В - . Г -

I: £ -

Изменение лкминолзависпмой хемгохгемпнесненнки (нмпДОсек) гранулотщтов донорской крови, вызванной , под действием фиброиоктина (мкг/шг):

хзмилшинесценцкя гранулощттов, не про^ильтрованпол через силикаголь-г:елзткн донорской крови, хемилшиносцетгия грагцгло'щтов, профильтрованной донорской крови,

хемилшинеецэнция гранулоцитов, после добавления к профильтрованной крови 120 мкгАиг ФН,

240 мкгЛлл ФН, v 360 мкг/мл ФН,

460 мкv/мл ФН, 600 мкг/шг ФН.

I на 57$ - при зимозан-индуцированной хомиляминесценции [р< 0.001).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ •

Активированные тромбоциты л гранулоциты донорской крови га только секретируют тромбогешше вещества и протеоллтические [¡ерленты, но и в значительной степени ллзируются л поэтому при рраксфузаях могут вызывать различные посттрансфузконк-ые наруле-!Ия ( А. г.. я.. , 1977; Злумп^ е.а.. , 1933). Извест-

ие. способы снижения активации тромбоцитов и грану юцитов ' [стабилизация крови цитратом натрия, гепарином и др.) не пре-¡упрендают их спонтанную активацию и последующее разрушение, [то способствует накоплению мякроагрегатов и высокотоксическах гродуктов их распада.

Проблема снижения активации тромбоцитов при хранении донор-1К0Й крови и тромбоцитарных концентратов является предавтом ¡ерьезных '."сследований. Потенциальными механизмами активации •ромбоцитов являются их повреждения при центрифугировании, на-|ушения баланса между продукцией тромбина и плаз:,она и их иактивациеЗ белковыми ингибиторами, активация комплемента с ¡бразозанием компонента СЗа, секреция фактора активации тромбо-[итов (ФАТ) и АД5, контакты тромбоцитов ме.?ду собой и пластиковой поверхностью мешка, повышенна чувствительности под влиянием , [итратного консерванта. Совокупность.этих факторов'.действует «тквиругацим образом и на гранулоцпты, которые продуцируат ак-■ивные. форда, кислорода,' лейкбтрпенн .и ФАТ, .оказывающие дополни-■ельное/активирующее .действие 'на тромбоциты,^поэтому увеличение;.:, дела и размеров шпероагрегат'ов ?в. донорской крови имеет, экспо-

нейтральный характер (H.B.Рябчекко, I98S ). «f. в 1990 г

сравнил процент активированных тромбоцитов в тромбоплазмэ здоровых людей и после получения тромбоцитарного концентрата путем центрифугирования тромбоплазмы и установил, что концентрирование тромбоцитов увеличивало процент активированных клеток примерно в 10 раз: в тромбоплазме он составлял 2-3$, а в тромбо-концентрате 20--30;£, Для снижения активации тромбоцитов в процессе их хранения ведутся работы по зедоене плазмы на'искусственные среды, содержащие различные ингибиторы. Параллельно проводятся работы по создании специальных целлюлозно-ацетатных фильтров для избирательного удаления лейкоцитов из тромбоконцентратов и эритромасс о целью уменьшения "спонтанной" активации тромбоцитов при их хранении ( м. с.а.. , 1990; Й-, ел,,

1990; £ , 1990). Определенные патологические состо-

яния, например, 'инфаркт миокарда, ишемичеокая болезнь сердца и др. сопровождаются увеличением чиола агрегированных тромбоцитов в циркулирующей крови ( i* У. е .а,, , 1990), поэтому изучение к создание различных способов, снижающих агрегационную активность тромбоцитов крови представляет большой интерео в плана активной терапии этих заболеваний.

В формировании мик^оагрегатов крови принимает участие фибрнектин, белок'плазмы крови о Молекулярной массой 440 кДа, как за счет включения в фибриновые схустки, так и за счет активации и х&моаттракции тромбоцитов, гранулоцитов и моноцитов. ' Фибронектин участвует в, регуляции процессов гемостаза, регенерации тканей, прикреплении клеток к межклеточному матриксу, взаимодействии клеток между .собой (Федоров H.A. и др. ,.I9G7 j -JUjus -т. i.e., 1980).. '• •

Ранэо проведенные в лаборатории биохимия ВИЦ исследования по изучению влияния связывания фибронектина плазмы крови антителами к нему доказали значительное снижение активации тромбоцитов АДФ, адреналином, коллагеном и тромбином и снижение почти до фона активации гра'гулоцнтоз ^{¿¿Р, форболовым эфиром и зи-моэаном. В настоящее время, созданный Н. А.Федоровым и соавторами аффинный сорбенг для фибронектина силикагель-желатин, обладающий высокой селективностью и проницаемостью для крупных белковых молекул и клеток крови, успешно проиел испытание, в связи с чем мы и поставили задачу по изучению возможности селективного удаления фибронектина и предактявлроваяных тромбоцитов и грануло-цитов из донорской крови с целью снижения спонтанной активации этих клеток в процессе хранения крови ж в период".экстракорпорального кровообращения.

йеши исследования и полученные результаты позволяют констатировать, что аффинный сорбент сшшкагель-яелатян, в отличие от общайзвестннх, например, жэлазин-сефарозн 4В, ;;влатин-целлшозы (фирма , Швеция) и других, дает возможность прово-

дить фильтрацию цельной крови и поэтому является ценным и перспективным для клинического применения в качества- нового с элективного гемосорбеята.

Известно, что экспрессия флбронектиновых и других адгезивных рецепторов происходит при активации тромбоцитов и грануло-цитов крови. Увеличениз адгезивное ти активированных клеток к фибронектину и г.елатину приводит к тому, что' после фильтрации цельной крови через силикагель-'хелатлн имеет место уменьшение числа этих клеток крови:, тромбоцитов - на 30£, гранулоцитов -на 40-45^. Оставшиеся- тромбоциты и гранулоциты.представлены, по-

видимому, иными функциональными и возрастными популяциями, порог чувствительности которых к специфическим стимуляторам активации выке, как исходно, так и в силу значительного снижения концентрации фибронектина в профильтрованной крови.

Вазно отметить, что после фильтрации цельной крови через сорбент силш<агель-.келатин, тромбоциты и гранулоциты функционально полноценны.-Роль фибронектина в снимании их ответов на стимулы демонстрируют результаты наших опытов по добавлению фибронектина к образцам профильтрованной крови. Такое добавление закономерно повивало функциональные ответы тромбоцитов и гранулоцитов крови, пока уровень фибронектина не достигал физиологических значений, а дальнейшее увеличение концентрации фибронектина - до 600 мкг/мл, нэдротпз, уменьшала ответы клеток крови .на индукторы, что вполне согласуется с данными у^июп, £?>. 2. е.а-., 1986; ¿¡^шАп- ^ р- •

Наид исследования по установлению отсутствия секреции фибронектина лейкоцитами в процессе хранения донорской крови после фильтрации ее через сорбент силикагель-келатин, находятся в хорошем соответствии с данными исследователей, занимающихся этим вопросом ( # г- а.., 1990; ЖамАелллЛ- Т. , 1990 ),

которые такта наблюдает уменьшение концентрации фибронектина.

В заключение целесообразно с.метить, что предложенный нами новый простой подход к снижению функциональной активности тромбоцитов и гранулоцитов донорской крови путем избирательного удаления Фибронектина," с целью снижения ее тромбогенности, метаболических и функциональных нарушений под влиянием продуктов' распада тромбоцитов и гранулоцитов, хорошо согласуется, как с дшшширяда гранофузиологов об .уменьшении микро'агреггции донорн

;кой крови и клеточных 60 фракций при умень-пегаш содерзгяния в Н1Х тромбоцитов и гранулоцитов, так и о уменьшением процесса громбообразования при циркуляции крови, лишенной фибронектина, шрез плоскую и круговую камеры, но сравнению с обычной донор-:кой кровью {ЗыШъ- 2-e-.it-. , 1987; ¿.я,, 1983;

1930).

Однако, помимо решения поставленных и сформулированных вы-1е задач в нашей работе показано, что поело фильтрации донор -;кой цитратной крови через сорбент силлкагель-делатин с- последующим элюированием, можно получать в среднем около 65;? фибронек-?ина плазмы крови человека, используя в качестве элюирующих >астворов 4М мочевину или цитратный буфер. Раствор фибронектина \ цитратном буфере при соблюдении стерильных условий фильтрации I элюции может быть подвергнут пряяой лиофилизащгт с целью сальнейшего применения его как для лабораторных целей, так и для жеперименталъных и клинических испытаний. Уместно отметить,что жбронектин из плазмы крови человека, произзодтшй зарубежными зирламя, тлеет очень высокую стоимость: фирма "" /ИгТ) 56 долларов за I мг фибронектина, 125 долларов "

!4РГ) за Г мг фибронектина, 44 доллара •" (США) за

: мг фибронектина, . 124 доллара " " (США) за I мг

жбронектина. Однако, разработка технологии получения препарата фибронектина плазмы крови человека не входила в задачи нашей диссертации, хотя мн активно участвуем в этой работе совместно : другими лабораториями.

•• - - . /

выводи

1. Установлено, что новый аффинный-сорбент фибронектина силикагель-аелаган, пригоден для прямой фильтрации цельной донорской крови. .

2. Показано, что фильтрация цельной донорской крови через силихягедъ-талатгн, избирательно удаляет фибронектин, а также тромбоциты и грацулоццтг, способные адгезироваться к фибронектину н желатину.

3. Агрегационкая активность тромбоцитов з профильтрованной через сил1скагелъ-.\;елат1ш донорской крови снп.":лется в 2-3 раза,

а хемдлшдкесцзнтннй отает гранудотдлтов в 10-18 раз.

4. Функциональная активность тромбоцитов и гранулоцитов цельной донорской.крови, профильтрованной через силикагель-желатин, восстанавливается при добавлении к ней фибронектина.

. 5. .Окбронектпк, сорбированный на скликагель-келатине, легко элюируется цктратнш буфером СрН 5.5, 3?°С) е мохе5 быть использован в качестве препарата для лабораторного и клинического применения.

6. В донорской кроэи, профильтрованной через силикагель-калаткн к хранившейся в течение 48 часов при секреции фибронектина клетка-яд крови не наблюдается.

СПИСОК НАУЧКЛ. '^'АБОТ, ОПТБЛКХОЗАШШ: ПО МАТША1Ж ДИССЕРТАЦИИ

1. Способ стабилизации донорской крови: Н.А.Зедороз,

II.Н. Огчарук, Т.1Г.1Ш&3&. Заявка "> 4730046 1.1КИ А 01 К 35/14; заявд. 18.03.355 -пололскельное решение от 29.03.90.

2. з&шцева Г.Я., Федоров Н.А,, Озчарук И.Н. Функциональная

жтивность тромбоцитов и гранулоцитов донорской крови в усло-!иях избирательного удаления из нее фиброчектина // Вестник Ш СССР. - 1991. - 32. - с. YS'-ifC.

3. Ермолин Т.А., ОвчарукИ.П., Федотов A.B., Коршунова Т.Ю, ¡амцева Г. И. Метода выделения и количественного определения юнцентрации.фибронектина биологических яздаостей // Вестник Jffi СССР. - 1991. - иг. - 0. 5~S-SV.

4. ТопчиЗ К.В., Федотов A.B., Карцева Г.И., Дейнеко Н.Ф., гедоров H.A. Концентрация плазменного фибронектина у больных :роничесглми заболеваниями печени // Вестник A'fil СС5Р. - 1991,->2. - с. S3-5'f,

За.ч, № 355 подп, к начата 27,12,90 г., тир. 100 экз. Ротапринт НИИ ГТиПЗ А.МЧ С ¿ZP