Фотоиндуцированные процессы и их роль в функционировании бактериородопсина

Дегтярева, Ольга Васильевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Фотоиндуцированные процессы и их роль в функционировании бактериородопсина
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Фотоиндуцированные процессы и их роль в функционировании бактериородопсина"

На правах рукописи

Дегтярева Ольга Васильевна

Фотоиндуцированные процессы и их роль в функционировании бактериородопсина

Биофизика 03.01.02

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

Пущине-2014

£ Г/'/'"; ^ о л 1

00554Эиоо

005549056

Работа выполнена 8 Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт

биофизики клетки Российской академии наук, лаборатория структуры и динамики

биомолекулярных систем

Научный консультант

Хечинашвили Николай Николаевич доктор физико-математических наук, Федеральное

государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки Российской академии наук, заведующий лаборатории структуры и динамики биомолекулярных систем

Официальные оппоненты

Полозов Роберт Валентинович доктор физико-математических наук. Федеральное

государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук, ведущий научный сотрудник лаборатории структуры физической биохимии

Кару Тийна Йоханнесовна доктор физико-математических наук, профессор. Федеральное

государственное бюджетное учреждение науки Институт проблем лазерных и информационных технологий Российской академии наук, заведующий лаборатории лазерной биомедицины

Любимов Валерий Юрьевич доктор биологических наук. Федеральное государственное

бюджетное учреждение науки Институт фундаментальных проблем биологии Российской академии наук, ведущий научный сотрудник группы экологии и физиологии фототрофных организмов

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова, лаборатория структуры и функции мембран

Защита диссертации состоится «29 » 05 2014 года в 14 ч. 00 мин

на заседании Диссертационного совета Д 002.038.01 Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биофизики клетки Российской академии наук по адресу: 142290, г. Пущино Московская область, ул. Институтская 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Пущинского научного центра РАН. г. Пущино Московская область, ул. Институтская 3.

Автореферат разослан « » 2014 года

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук , Смолихина Татьяна Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Введение. Актуальность проблемы

Свет, взаимодействуя с фоточувствительными или фоторецепторными системами, такими как фотореакционные центры или родопопсин-содержащими комплексами обеспечивают живые системы информацией или энергией, необходимой для образования химических связей. Поглощение света инициирует в этих структурах движение и направленный перенос зарядов (электронов или ионов) в цепи последовательных донорно-акцепторных взаимодействий, завершающихся синтезом АТФ. Исследование молекулярных механизмов функционирования фоточувствительных биосистем является одной из наиболее важных проблем фундаментальной науки. Это объясняется как значимостью такого рода процессов в природных системах, так и растущим практическим интересом по применению фотоуправляемых процессов и гибридных молекулярных систем в современных информационных технологиях, в которых биологические молекулы часто используются в качестве активных сред, а свет является их ключевым элементом управления [Boldyreva, 2007]. В настоящее время эта тема очень важна так же с точки зрения практической медицины, где свет, активно используется не только как средство диагностики, но и как тонкий инструмент микрохирургического манипулирования [Bowman et al., 2013] и фотодинамической терапии [Кару, 1989; Каги, 2005].

Действие света на вещество исследуют более тысячи лет и, несмотря на столь длительную историю, механизмы взаимодействия света с веществом все еще остаются до конца не изученными. Хрестоматийные представления, привлекаемые для анализа фотобиологической активности света, основываются на предположении об избирательном характере взаимодействия излучения со .сложными молекулярными биологическими системами через селективное поглощение и изменение населенностей электронных энергетических уровней в молекулах-мишенях или хромофорах. При отсутствии в системе специфических молекул-мишеней, эффект воздействия излучения на биосистему, как правило рассматривается с точки зрения нагревания вещества, при том, что в этом случае величина градиента может составлять только десятые доли градуса. Такое рассмотрение не дает понимания причины создаваемого температурным градиентом фотобиологического эффекта, как и не дает ответа на вопрос о средстве доставки энергии света к удаленным органеллам, клеткам и даже тканям, в которых регистрируется биологический эффект.

В то же время при рассмотрении фотофизического взаимодействия важно учитывать не только характеристики внешнего излучения, но и свойства самой системы, на которую оказывается воздействие. В этом отношении, полезно вспомнить, что многие биологические молекулы и структуры по своей организации являются жидкими кристаллами, т.е. они обладают жесткой стержнеобразной конформацией с большой степенью асимметрии (отношение длины к диаметру). Между тем в физике хорошо известно, что жидкие кристаллы, достаточно легко переориентируются относительно слабыми (до нескольких милливатт) оптическими полями, вызывая сильную ориентационную нелинейность среды. Оптическое поле в такой среде может порождать пространственно-неоднородные поля пространственного заряда, напряженность которых существенно превосходит таковую самой оптической волны. Поэтому можно ожидать, что в мембранных структурах, которые по структурной организации и свойствам являются жидкими кристаллами, небольшие световые потоки способны вызывать в них перераспределение заряда и тем самым выполнять определенную регуляторную роль в функционировании системы. Опираясь на такие данные о фотофизических свойствах можно лучше понять молекулярные механизмы функционирования биологических молекул внутри живой клетки, так и сами физические механизмы фотоконтролируемого поведения биологических систем.

Бактериородопсин (БР), ретинальсодержащий, ион-транспортирующий белок галобактерий Н. solinarium, является известной биофизической моделью. Он является своего рода парадигмой транспортных белков и в частности, простейшей протон-транспортной системой. Процесс трансформации энергии и транспорта ионов в бактериородопсине, интенсивно

исследуются в последние несколько десятилетий. БР - белок в 26 кДа, содержится в пурпурных мембранах (ПМ) галофильных архебактерий, обитающих в среде с экстремальным содержанием соли №аС1 (3-4М). В аэробных условиях эти организмы синтезируют АТФ через респираторную цепь. В анаэробных условиях они синтезируют большое количество БР, светопоглощающего белка, который преобразует энергию солнечного света в химическую энергию, проталкивая протон против градиента через мембрану. Хромофором БР является молекула ретиналя, который имеет полностью транс геометрию в основном состоянии и претерпевает транс-цис изомеризацию при поглощении видимого света. Ретиналь, представляет собой полиеновую цепь, соединенную с белком через Шиффово основание в положении лизина 216. Первичное фотособытие термально запускает целый каскад событий, включая серию спектрально различимых интермедиатов, в течение которых Шиффово основание отдает свой протон во внеклеточный канал и затем забирает протон из цитоплазматического канала. В течение 10-20 миллисекунд ретиналь реизомеризуется обратно в полностью-транс форму и БР уже готов к новому циклу. В настоящее время БР исследован как никакой другой известный белок. С большой точностью определены кристаллографические структуры основной формы и всех стабильных интермедиатов фотоцикла, установлены их кинетические и спектральные характеристики. Так же, изучена последовательность основных этапов и молекулярных событий всего процесса переноса протона через плазматическую мембрану БР. Однако, несмотря на многочисленность теоретических и экспериментальных данных все еще не существует однозначного понимания того, каким именно образом в БР реализуется активный транспорт протонов. Существующие противоречия в интерпретации данных прежде всего обусловлены ограничениями и погрешностью, присущей каждому из используемых методов. Вопросы, касающиеся детального понимания молекулярных механизмов функционирования мембранных белков, стимулируют разработку и использование новых и более чувствительных методов исследования.

В последние годы, все больше и больше подвергаются ревизии устоявшиеся представления о физических процессах, приводящих к изомеризации ретиналя в белковом окружении. Долгое время неоспоримым считались данные резонансного комбинационного рассеяния и утверждение о том, что реакция изомеризации начинается сразу после возбуждения и завершается в первые 500 фсек, до образования первого стабильного продукта, К-интермедиата. В этом случае, исходят из понимания того, что глобула белка не играет никакой активной роли ни в процессе изомеризации, ни транспорте протона, выполняя роль стерического фактора среды по обеспечению направленности процесса изомеризации из полностью - транс в 13-цис состояние ретиналя и некоего резервуара по запасанию энергии поглощенного кванта. Запасание энергии осуществляется посредством изменения конформации белка, в ответ на изменение структуры ретиналя. Запасенная таким образом энергии затем поэтапно расходуется в термальной стадии на последующую реорганизацию структуры, тем самым создавая условия для направленного переноса протона в пигмент-белковом комплексе БР. В то же самое время уже существовали данные, указывающие на наличие конформационных изменений в стадии фотовозбуждения, но не связанные с фотоизомеризацией ретиналя, однако попытки связать эти изменения с переходом от одной изомерной формы ретиналя к другой привели к разноречивым результатам. В настоящее время все больше доказательств получают модели, рассматривающие в качестве первичного действия света не изомеризацию, а разделение или перенос заряда в БР. Однако в этом, как и в первом случае, конформационные изменения белка рассматривают причинно-связанными с фотовозбуждением ретиналя, и белку отводится та же самая пассивная роль реорганизующейся структуры, не способной к активному взаимодействию с возбуждающим светом.

В то же время, данные нелинейных методов показывают, что бактериородопсин обладает сильной оптической нелинейностью, которая может иметь определенное функциональное значение в биологической активности БР. Однако этот аспект в БР является совсем не изученным. Мы полагаем, что нелинейно оптические свойства не только ретиналя, но и белка, могут иметь важное значение в функционировании белка. Белковая глобула в БР обладает выраженной структурной анизотропией и потому может сама проявлять нелинейную оптическую активность, инициируя перераспределение зарядов, напрямую не связанное с возбуждением ретиналя. Таким образом, свет может выступать в роли кофактора в процессе транспорта протона.

В частности, высокие электрические поля наведенных действующим светом разделенных зарядов могут вызывать сильные молекулярные взаимодействия между полярными и заряженными химическими группами или ионами. Под действием сильных полей, обусловленных появлением фотоиндуцированных зарядов, белок может претерпевать функционально-важные конформационные реорганизации. Такие реорганизации, в свою, очередь, могут сильно влиять на энергию и кинетику процесса переноса заряда за счет модулированного действия движущих сил и энергии реорганизации. Эти эффекты, напрямую не связанные с поглощением света ретиналем, мог/т быть важными для динамики переноса протона, но они до сих пор тщательно не исследовались.

В данной работе исследуется светом-индуцированный ИК-эмиссионный отклик в бактериородопсине и модельных соединениях - основных компонентах структуры БР - в условиях непрерывно действующего видимого света умеренной мощности. В работе используется оригинальный подход комбинированного изучения спектральных свойств и динамики поведения многоатомных молекул и жидкостей в возбужденном электронном и колебательном состоянии. ИК-эмиссионные, флуоресцентные и оптические измерения, проведенные на ретинале in vitro и в белке in situ и на водных растворах глициновой и лизиновой аминокислот позволяют наблюдать и понять роль колебательного возбуждения и зависящих от энергии и микроокружения движущих сил процессов изомеризации и транспорта ионов водорода в ион-транспортных системах.

Цель и основные задачи диссертационной работы

Целью настоящей диссертации является исследование фотоиндуцированных процессов в биологических молекулах и их роли в молекулярных механизмах оптического контроля структуры и функционирования бактериородопсина.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать спектральные и энергетические характеристики светом-индуцированной ИК-эмиссии бактериородопсина в условиях умеренной мощности света.

2. Сравнить эффекты индуцированного действия света на спектральные параметры модельного соединения ретиналя в условиях электронного и колебательного возбуждения.

3. Исследовать влияние инфракрасного света на структуру и спектральные свойства 1-лизина при селективном возбуждении репортерных групп.

4. Исследовать ИК-эмиссионный отклик в образцах лизина и глицина при воздействии видимым светом низкой интенсивности

5. Исследовать свойства растворов аминокислот в электронных спектрах поглощения и флуоресценции в УФ-и видимой области.

6. Оценить эффект теплового действия света в водных растворах биомолекул в условиях стационарного освещения видимым светом умеренной мощности.

7. Оценить эффект индуцированного действия видимого света на процесс кластеризации и ассоциирования молекул аминокислот в растворе.

8. Выявить механизмы опосредованного действия индуцированных эффектов на структуру и ион транспортные свойства биологических молекул.

Научная новизна

В результате проведенных исследований было впервые выявлено индуцированное действие света на межмолекулярные взаимодействия в белке бактериородопсине в условиях освещения светом низкой интенсивности. Показано, что низкоинтенсивный видимый свет вызывает генерацию функционально-значимого ИК-излучения в хромофорном ретинале и белковых компонентах.

Анализ экспериментальных данных показал, что фотоиндуцированная динамика молекулы бактериородопсина определяется не одним каналом реакции изомеризации ретиналя, а комбинацией нескольких различных каналов в возбужденном и основном электронных состояниях. Было определено, что вовлеченным в фотомодулированный ответ элементом структуры БР, может бьггь не только молекула ретиналя, но так же молекулярные структуры, включающие в себя димерные комплексы и молекулы воды.

Впервые показано, что низкоинтенсивный видимый свет может активировать среду не через энергозависимое поглощение, а посредством индуцированного электромагнитным полем световой волны перераспределения зарядов и выстраивания заряженных групп аминокислотных остатков в систему с кооперативными водородными связями. Также показано, что индуцированные низкоинтенсивным оптическим излучением процессы могут вызывать серьезные структурные перестройки в водных растворах аминокислот и БР. В частности выявлено образование сложных ассоциатов и пространственных неоднородностей разного геометрического профиля. Установлено, что среди образующихся ассоциатов могут быть образованы зародыши кристаллических структур.

Впервые экспериментально показано, что ненасыщенные растворы аминокислот в присутствии низко интенсивного видимого света проявляют свойства одноосных жидких кристаллов, создавая в прозрачной и исходно оптически однородной водной среде волноводные структуры и центры окраски.

Положения, выносимые на защиту:

1. Свет является важным кофактором в процессе однонаправленного переноса протона через плазматическую мембрану. В бакгериородопсине наблюдается параллельно несколько процессов - электронное поглощение света и связанное с ним движение населенностей электронных уровней в хромофорном ретинале и индуцированные нелинейным взаимодействием процессы, не затрагивающие населенностей электронных уровней ретиналя, но создающие внутри белка центры инфракрасного излучения, а так же высокие напряженности электрических полей. В первом случае активация ретиналя запускает реакцию изомеризации из полностью-транс в 13-цис состояние. Во втором случае, индуцированные процессы инициирует структурные перестройки и межмолекулярные взаимодействия непосредственно внутри белковой глобулы.

2. В механизм фотоконтролируемого поведения молекулы бактериородопсина вовлечено не только генерируемое внутри белка функционально значимое ИК-излучение, которое способно повлиять на донорно-акцепторные свойства боковых аминокислотных остатков, но также способность света регулировать число молекул, вступающих в ФЦ.

3. Когерентный и некогерентный видимый свет способен не только активировать, но и вызывать значительные структурные перестройки в биологических молекулах и системах в условиях низкой и умеренной мощности.

Научно-практическая ценность

До настоящего времени не проводилось работ, посвященных раскрытию механизмов нелинейного действия света на структурные и функциональные свойства биологических молекул, экспонированных действию низкоинтенсивных оптических полей.

Полученные данные вскрывают новые аспекты функционирования фотозависимых процессов в белках и сложных биологических системах, свидетельствуя о важной роли наряду с уже известными процессами поглощения и нагревания, нелинейных механизмов.

Выявленные эффекты светоиндуцированных структурных перестроек и формирования волноводных и транспортных структур в водных растворах аминокислот могут послужить основой для понимания механизмов терапевтического действия лазерной медицины.

Выявленные условия проявления нелинейных эффектов существенно расширяют возможности по управлению динамикой молекул в неразрушающих условиях и представляют широкий интерес для широкого спектра приложений, включающего разнообразные спектроскопические стереохимические задачи по анализу молекулярной структуры, исследованию и контролю внутримолекулярной динамики и динамики химических реакций, кристаллизации вещества, ряду приложений в лазерной физике, таких как генерация ИК- и терагерцового излучения, и множества других задач по реализации квантовых логических устройств. Результаты данной фундаментальной работы могут иметь практическую значимость для биофизиков, биохимиков, фармакологов и физиков, медиков и материаловедов.

Апробация работы

Результаты работы докладывались на различных международных и российских конференциях, симпозиумах и съездах, в том числе на 22-м, 24-м, 25-м и 30-м европейском конгрессе по молекулярной спектроскопии European Congress on Molecular Spectroscopy - 22-ом (EUSMOS-XXII) 1994, Германия; 24-ом (EUSMOS-XXIV) 1998 , Чехия; 25- м EUSMOS-XXV) 2000, Португалия; 30-м (EUCMOS- XXX), 2010, Италия; 10 и 11-ой международных конференциях по ИК-Фурье спектроскопии (International on Fourier Transform spectroscopy ICOFTS-IO, 1995, Венгрия; 11th (ICOFTS-ll), США, 1997)); 3-ем международном симпозиуме по достижениями инфракрасной и Раман спектроскопии ( 3th International Symposium orí Advanced Infrared and Raman Spectroscopy (AIRS-lli)), Австрия 1998; 45-ой ежегодной конференции американского общества по оптике и технологиям (Annual Meeting The International Symposium on Optical Science and Technology ), 45th SPIE, 2000, США; 9-й и 11-й конференции по ретинальным белкам (Interational conference on retinal proteins) - 2000, Венгрия; 2004, Германия; 3-й и 4-й конференции по достижениям колебательной спектроскопии (International Conference on Advanced Vibrational Spectroscopy) -(ICAVS-3), 2005, США; (ICAVS-4), 2007, Греция; конференции «от современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям» - 2001 и 2001, Пущино, Россия; 20-ой международной по фотохимии (IVP-XX) 2001, Москва; 2-м и 3-м международном симпозиуме по молекулярной фотонике (International symposium on Molecular photonics dedicated to academician A.M. Terenin) - 2006 и 2011, С.-Петербург, Россия; 14-й европейской конференции по биоэнергетике (European Bioenergetlc Conference (ЕВЕС)), 2006, Москва, Россия; Троицкая конференция по медицинской физике и инновациям в медицине (ТКМФ), 2008 и 2010, г. Троицк, Россия; 1, 2-м и 3 м съезде биофизиков России - 2004, 2012, Москва, Н.Новгород, Воронеж, Россия; XVIII Менделеевский Съезд по общей и прикладной химии, 2007, г. Москва, Россия, конференция ФИАН «Комбинационное рассеяние-80 лет исследований», 2008, г. Москва, Россия; 5-м Съезде Российского фотобиологического общества, 2011, п. Шепси, Россия; III международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» - 2011 и 2013, г. Пущино, Россия.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 работ.

Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, 4 глав, заключения и списка цитируемой литературы. Объем диссертации составляет 165 страниц машинописного текста, включая 36 рисунков, таблиц 8 и 350 библиографических ссылок.

Основное содержание работы

Во введении показана актуальность исследуемой темы, перечислены основные проблемы, связанные со свойствами и функционированием БР , сформулированы цели и главные задачи работы, отражена научная новизна, практическая значимость, защищаемые положения, апробация работы, а также кратко описана структура диссертации.

Первая глава представляет содержание литературного обзора, посвященного описанию основных характеристик структуры и функции бактериородопсина (БР), ретиналь-содержэщего белка галофильных бактерий Halobactertum sallnarium (Н. salinarium). Изложены современные представления о механизме трансформации энергии и транспорта протонов через плазматическую мембрану архебактерий. Особое внимание уделено использованию

спектроскопических методов для получения структурной и кинетической информации о фотоцикле белка БР. Более подробно рассмотрен метод инфракрасной ИК-Фурье спектроскопии в исследовании роли воды и водородосвязывания при функционировании БР. Кроме этого, в обзоре литературе рассмотрены особенности строения и свойств водородных связей, а также проблемы, связанные с изучением взаимодействий с участием молекул воды внутри белков и в растворе. Литературный обзор также включает описание нелинейных свойств биологических молекул и их практическую привлекательность. Описаны общие положения о механизмах нелинейных явлений и кратко рассмотрены современные представления о значении нелинейных свойств БР для его функциональной активности. В заключении указаны проблемы, стоящие на пути понимания механизмов функционирования БР, и являющиеся предметом исследования в диссертационной работе. Показано, что комбинированное изучение спектральных свойств и динамики поведения многоатомных молекул и жидкостей в возбужденном электронном и колебательном состоянии с использованием модельных соединений являются наиболее адекватными для понимания роли светом индуцированных процессов и движущих сил изомеризации и транспорта протонов в БР.

Во второй главе описаны материалы и методы, использованные в работе. В качестве объектов исследования в работе использовали изолированные пурпурные мембраны (ПМ) из архебактерий H.salinarium штамма дикого типа ET 1001 (суперпродуцента БР с пониженным содержанием газовых вакуолей и каротиноидов). Штамм был любезно предоставлен Д. Остерхельтом. Подробно описаны процедуры выращивания клеток, получения и выделения ПМ. В работе использовали модельное соединение полностью-транс ретиналя, который был синтезирован и любезно предоставлен проф. A.A. Ходоновым (Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова). Использованы коммерческие препараты глицина и L-моногидрохлорида лизина (Sigma, США).

Измерения ИК-Фурье спектров были выполнены на уникальном двулучевом двухканальном ИК-Фурье спектрометре ФС-02, сконструированном в НТЦ УП РАН (г. Москва). Условия измерения - спектральный диапазон 4000-400 см'1 , спектральное разрешение 4 см'1, накопление 400-600 сканов. Рассмотрены основные принципы ИК-Фурье спектроскопии и устройство экспериментальной установки. Здесь же дано краткое описание представлений о природе индуцированного ИК-излучения и принципиальная схема для регистрации спектров ИК-эмиссии на базе ИК-Фурье спектрометров. Представлены характеристики и условия регистрации спектров поглощения и флуоресценции в УФ-видимом диапазоне. Измерения были выполнены на спектрофотометре UV/VIS Evolution 600 («Thermo Scientific», США) и спектрофлуориметре Lumina Fluorescence («Thermo Scientific», США). Детально описано оптическое устройство созданной в работе установки для визуализации и регистрации динамики микрообъектов в растворе. Тепловизионные измерения были выполнены с помощью тепловизионной установки на базе ИТЭБ РАН. Кристаллографическое исследование кристалла лизина было проведено на базе ИНЭОС РАН им. А.Н. Несмеянова на оборудовании Bruker Smart Apex II (Германия).

Результаты и их обсуждение

Разработка метода стимулированной видимым светом ИК-эмиссии на основе техники адсорбционной ИК-Фурье спектроскопии

Ифракрасная эмиссионная спектроскопия с преобразованием Фурье (далее по тексту ИКЭС) является новым методом. В биологии традиционно используется метод ИК-поглощения, который, однако, не всегда позволяет получить желаемый результат. Например, получение прямых данных об ИК- колебательных переходах в ретинальном хромофоре внутри белка представляет собой не решаемую задачу в рамках традиционного метода. Потому спектроскопию ИК-поглощения используют в дифференциальном режиме, отслеживая только те переходы, которые в ходе реакции претерпели определенные изменения. Альтернативой адсорбционным могут быть ИК-эмиссионные измерения. Хотя ИКЭС имеет те же преимущества, что и известный метод флуоресценции в УФ-видимой области, в настоящее время она достаточно редко

используется в эксперименте. По большей части из-за того, что отсутствует соответствующая специализированная техника, позволяющая проводить рутинные измерения. В то же время явные преимущества ИКЭС побуждают к поиску новых решений для развития этого метода. Одним из них является использование адсорбционной ИК-Фурье техники, которую адаптируют для ИК-эмиссионных измерений. Чтобы усилить сигнал, в такого рода измерениях обычно используют нагрев образцов (до 100 градусов и выше), что является не пригодным для биологических образцов. В качестве альтернативы вместо высокого нагрева используется видимый свет, однако этот подход находится еще в стадии развития, поскольку еще не существует его однозначного теоретического описания. Мы впервые применили данный подход к биологическим образцам в независимых экспериментах.

По хронологии, первые светом-индуцированные ИК-эмиссионные измерения были выполнены в 1971 году на образцах веществ, находящихся в газообразном состоянии в условиях низкого давления [см. обзор Robinson, Dake, 1974]. Хотя уже на этом этапе были продемонстрированы высокие аналитические возможности данного подхода, сложность в интерпретации ряда деталей в полученных спектрах не позволила авторам продолжить свои эксперименты. Спустя почти 20 лет, две другие группы [Un, 1988; Tsuge, 1989] использовала этот подход на базе появившейся новой спектральной ИК-Фурье техники, которую модифицировали по схеме термоэмиссионных измерений, удалив стандартный источник ИК-излучения и заменив им непосредственно исследуемый образец. ИК-эмиссию образца усиливали действием видимого света. В качестве источника видимого света использовали низкоинтенсивный лазер. Используемая в данном случае геометрия отражения позволяла исследовать любые вещества и сканировать их поверхности, что было продемонстрировано на большом числе твердых веществ. Как и в предыдущем случае, авторами было отмечено наличие четкой корреляции между спектрами ИК-поглощения и регистрируемой ИК-эмиссии, которая касалась набора и положения большинства полос, но не относительного распределения интенсивности между ними. Так же как в предыдущем опыте экспериментаторы столкнулись с трудностями в интерпретации ряда особенностей, выявленных в спектрах. Рассматривая регистрируемое ИК-излучение как термостимулированный процесс, не удалось объяснить те наблюдения, которые находились в явном противоречии с этой гипотезой. В частности, при термостимулированном процессе, при котором тепло равномерно подводится ко всем модам, распределение внутримолекулярной энергии должно происходить неселективно. В действительности, спектры демонстрировали усиление отдельных типов колебаний. Другое наблюдение было связано с изменением геометрии освещения. В частности, расширение площади освещаемого пятна до размеров, значительно превышающих его дифракционный предел, должно было понизить мощность действующего света, и соответственно уменьшить интенсивность регистрируемого спектра. В отличие, в спектрах наблюдали увеличение интенсивности и усиление контрастности спектра. Таким образом, несмотря на высокий потенциал и очевидные преимущества этот метод в работах зарубежных авторов не получил своего дальнейшего развития. Анализ литературных данных показал, что возбужденная видимым светом ИК-эмиссия - это процесс, который гораздо сложнее, чем просто ИК-флуоресценция [Robinson, Dake, 1974] или термостимулированная ИК-эмиссия[ип, 1988; Tsuge, 1989].

Приступая к своим экспериментам, мы предполагали с помощью ИК-эмиссионных измерений получить прямые ИК-данные о ретинале внутри белка. По аналогии с методом резонансного комбинационного рассеяния света (РКРС) логично было предположить, что избирательно возбуждая видимым светом хромофорный ретиналь, можно увидеть усиленный ИК-эмиссионый отклик ретиналя вследствие повышения его колебательной энергии в результате поглощения или флуоресценции. Имеющийся у нас в распоряжении оригинальной конструкции высокочувствительный отечественный ИК-Фурье спектрофотометр ФС-02 позволял регистрировать слабые сигналы при комнатной температуре и атмосферном давлении. Используя для возбуждения ИК-эмиссии многочастотный видимый сеет и охлаждаемые жидким азотом низкотемпературные ИК-приемники (см. глава Материалы и методы), мы впервые получили спектры БР в среднем ИК-диапазоне, где содержится основная структурная информация о ретинальном хромофоре БР. Полученные спектры содержали большой набор дискретных линий в области частот, где расположены базовые колебания ретиналя. С помощью данных РКРС,

дифференциальной ИК-Фурье спектроскопии, а также литературных данных мы охарактеризовали большинство из наблюдаемых полос в спектрах ИК-эмиссии БР. Предварительно в дополнительных экспериментах с более простыми по составу и строению веществами (СаСОЗ, СС1.4, С6Н6, родамин 6Ж, лизин, полностью-транс ретиналь) были установлены корреляции между их спектрами ИК-эмиссии и ИК-поглощения (рис. 1), что позволяло использовать соответствующие собственные и литературные данные для идентификации полос в спектрах ИК-эмиссии БР. Рис. 1 наглядно иллюстрирует наличие корреляций между спектрами ИК-поглощения и ИК-эмиссии.

1200 1000 Волновое число (см':}

Рис. 1. (А) Упрощенное изображение схемы эксперимента: 1- ксеноновая лампа (100Вт);2-собирающая стеклянная линза; 3-стеклянные фильтры (ослаюляющие и окрашенные); 4- образец; 5-сферическое зеркало; 6- интерферометр Майкельсона; (Б)- Спектры поглощения и ИК-эмиссии модельного изомера полностью транс ретиналя.

Исходно предполагая, что в основе регистрируемого сигнала лежит прогрев, мы так же обнаружили особенности в спектрах, которые трудно было объяснить с такой точки зрения, поскольку по ряду причин регистрируемое ИК-излучение отличалось от излучения черного тела. Во-первых, форма кривой фонового излучения не совпадала с теоретической кривой равновесного распределения. Во-вторых, вместо равномерного распределения наблюдалось селективное усиление определенных типов колебаний, среди которых были выявлены такие, которые были запрещены правилами отбора в ИК-поглощении, но разрешены в комбинационном рассеянии (КР). Последнее было типично для нелинейных и не характерно для традиционных методов. В-третьих, характерным свойством этого процесса являлась зависимость спектрального поведения от условий

освещения (положения образца по отношению к возбуждающему лучу, размеру светового пятна и спектрального состава возбуждающего света), что не типично при термоэмиссии, но могло иметь место при нелинейном процессе.

Исследование зависимости интенсивности ИК-спектров всех без исключения образцов показало квадратичную зависимость от мощности, как это иллюстрирует рис. 2а. Этот факт является прямым свидетельством нелинейности процесса появления ИК-эмиссии в образцах в данных экспериментальных условиях.

Рис.2 (А) - Зависимость интенсивности ИК-эмиссии БР от мощности в интервале 42-660 мВт; (Б) - Схематическое изображение процесса образования ИК-эмиссии при возбуждении многочастотным видимым светом.

Отмеченные выше особенности ИК-эмиссии позволили нам сделать предположение о бигармонической накачке, как основном механизме происхождения стимулированной ИК-эмиссии. В рамках этой гипотезы было установлено эмпирическое соотношение между интенсивностью ИК-сигнала, мощностью и величиной спектрального интервала действующего света (см. рис. 2Б). Согласно этой гипотезе, в условиях стационарного освещения два световых луча в образце могут перекрываться в пространстве и времени. При наличии нелинейности среды и выполнении условий фазового синхронизма (закон сохранения импульса) взаимодействие волн будет приводить к появлению биений на суммарных или разностных частотах. В том случае, когда частота биений, соответствующая разности частот возбуждающих лучей ov озг совпадет с частотой собственных колебаний молекулы, произойдет резонансное взаимодействие, которое приведет либо к заселению соответствующего колебательного уровня, либо к вынужденному сбросу ИК-кванта с заселенного уровня. Причина для появления активного ИК-эмиссионного отклика заключается в том, что поглощаемая на частоте биений энергия не полностью переходит в тепло, а возвращается обратно в окружающую среду в виде стимулированного ИК-излучения. Вследствие этого устанавливается стационарный режим излучения, при котором интенсивность сигнала не изменяется. При использовании полихроматического возбуждения и фокусирующей геометрии создаются предпосылки для реализации той или иной комбинации волновых векторов, число которых будет определяться величиной спектрального состава, мощности и геометрией возбуждающей оптики (рис. 2Б). Подобный характер взаимодействия способствует созданию когерентных возбужденных состояний и появлению когерентной ИК-эмиссии. Эта гипотеза позволила нам на качественном уровне объяснить наблюдаемые особенности в полученных спектрах. Более того, наши работы стимулировали проведение таких исследований на БР за рубежом. В работах Громы [Groma et al. 2004] и Эль-Саеда с соавторами [Wang, El-Sayed,

Ci*wa лрецкяа Саеяви на разишвей хлггот»

100 200 300 Ж» 500 «00 Î мощность, mBi

I- (,» чао)',

i .адГ«НСИВ»ОСГ»> ШЙШНйСМИ;

ц « (л«;'- кнтексивмость « величин« спектрального кнг«р«я«а ¡а си-*) сеет»

2002], выполненных с большим временным разрешением, было показано, что появление ИК-эмиссии происходит в течение первых 15 фсек облучения БР [Groma et al. 2011], т.е. генерация ИК-эмиссии s хромофорном ретинале - это сверх быстрый процесс, который происходит за более короткий период чем завершается изомеризационый процесс. Оказалось, что при выключении действующего света БР продолжал излучать ИК-кванты довольно сложным образом: фазе релаксации предшествовала фаза резкого подъема ИК-сигнала в течение 22 нсек. Релаксация происходила по закону биэкспоненциального распада с периодом полураспада 120 мксек и 3 мсек [Wang, E!-Sayed, 2002]. В настоящее время эти работы активно развиваются на базе нелинейного метода оптической рестрикции (сжатие среды в световом поле £), благодаря чему удалось установить присутствие в эмиссионном сигнале наряду с частотами среднего ИК-диапазона, так же частот терагерцового диапазона [Groma et al. 2011]. Таким образом, наши эксперименты позволили не только обнаружить генерацию многочастотной ИК-эмиссии в БР, но также стимулировали дальнейшее развитие ИК-эмиссионных измерений в биологии. В представленной работе ИКЭС является основным методом исследования.

Изучение спектральных характеристик БР в области 1700-700 см'1

ИК-эмиссионные измерения были выполнены на пленочных образцах БР и в суспензии ПМ. Анализ спектров этих образцов выявил большое сходство между ними. В то же время было показано, что спектры БР в пленке и растворе не являются идентичными. Это привело нас к заключению о том, что хотя вода в эмиссионных измерениях в отличие от ИК-логлощения не является лимитирующем фактором, она между тем оказывает определенное влияние на спектры. Поэтому все последующие эксперименты были выполнены на влажных пленках (с относительной влажностью не менее ~60 %), в которых БР, как это было установлено ранее, в том числе и в нашей лаборатории, сохраняет свою функциональную активность.

н - в неплос к.

-1-1-1-■-1-1-1-■-1

1600 1400 1200 1000 80

волнове число, см"1

Рис. 2. Спектры ИК-эмиссии в области 1650-800 см'1. Спектры записаны на влажной пленке (0056в = 1-5) на подложке из КЙ5-5 при освещении светом (340 <Л.< 700 нм, 92 мВт) со спектральным разрешением 4 см"1 и накоплением 400 сканов при Ткомн.

Нам удалось охарактеризовать большинство полос в спектрах ИК-эмиссии БР между 1700 и 700 см'1, где содержится максимальная диагностическая информация о ретинале.

Ретиналь, содержит в своем составе р-иононовое кольцо и полиеновую цепь с сопряженной системой л-электронов. Поскольку колебания (5-иононового кольца не участвуют в л

->71* переходе при возбуждении, то они слабо проявляются в спектрах РКРС и ИК-поглощения (рис. 1), в то же время они присутствовали в спектрах ИК-эмиссии БР большинства образцов и порой имели относительно высокую интенсивность в спектре (рис. 2).

А»нд NH'.lT^i С*С аап«мг,к0Л8б. С*С вал««.копеб. .«анкеры &Р

'. юмй. ^hJ ^ н. кнаппоск. копвб.

Рис. 3. Спектры ИК-эмиссии БР в области: (а) - 1600-1500см~'; (б)-1100-850 см"1, записанные при освещении светом (верхняя кривая) - Х> 360 нм, 500 мвт/см2; (средняя кривая) -360<А.<550 нм, 320 мвт/ см2; (нижняя кривая)- А> 360 нм, 250 мвт/см2.

Обычно, для диагностики геометрии и конформации ретиналя используют колебания полиеновой цепи, которая включает С=С валентные колебания связанные с растяжением длины связей, колебания, связанные с подвижностью атомов водорода (деформационные колебания, связанные с вращением, изгибами и выходом колебаний из плоскости, т.н. HOOP колебания. Эффект л -мг" возбуждения в ретинале сопровождается растяжением связей, которое в центре цепи имеет самую большую величину и поэтому эти валентные колебания имеют максимальную интенсивность в спектрах КР и ИК-поглощения ретиналя и БР.

В колебательных спектрах интермедиа™ фотоцикла БР идентифицируют по положению частоты С=С валентного колебания в области между 1600-1500 см"1, которое является маркером состояния БР. Ранее эти корреляции были определены на основании эмпирически установленного линейного соотношения между положением максимума полосы электронного поглощения интермедиата и частотой его валентного колебания. Обнаруженные в спектрах ИК-эмиссии БР полосы при 1529 см"1 и/или 1516 см"1, являлись характеристиками основной формы БР568 с максимумом полосы поглощения 568 им и К590-подобного интермедиата, с максимумом поглощения 590 нм, соответственно. При этом было отмечено, что в отличие от спектров KP в спектрах ИК-эмиссии эти фундаментальные полосы имели относительно невысокую интенсивность. Присутствие достаточно большого числа характеристичных полос в области «отпечатков пальцев» между 1380 -1100 см"1 в спектрах ИК-эмиссии позволило определить конфигурацию полиеновой цепи хромофора в этих формах, что более детально рассмотрим ниже. Помимо полос, обусловленных колебанием ретиналя, в спектрах были выявлены полосы в области 1640-1610 см"1, где локализованы колебания, связанные с Шиффовым основанием (ШО) (рис.2).

Полосы при 1529 см"1 и/или 1516 см"1 в спектрах ИК-эмиссии БР наблюдали при варьировании спектрального состава и мощности действующего света в широких пределах. Это указывало на то, что при освещении немонохроматическим светом в колебательных спектрах присутствуют только две формы - БР56а и К590-подобного интермедиата, тогда как в спектрах электронного поглощения в подобных условиях освещения обычно определяют многокомпонентную смесь. Валентное С=С колебание, проявлялось в виде одиночной полосы при 1529 см"1 или 1516 см"1, либо в виде дуплета 1529 см'1 и 1516 см"1 как это демонстрирует рис. За.

Хотя интенсивность всего спектра ИК-эмиссии монотонно изменялась с увеличением мощности, мы не обнаружили соответствующего монотонного изменения интенсивности отдельных полос, включая те, что были отмечены выше. В то же время, была выявлена сложная зависимость интенсивности главных маркерных, как и всех остальных полос от мощности и спектрального состава действующего света, что иллюстрирует рис. 4.

visible light intensity (mW/cm2)

visible light wavenumbers

IR-emission intensity

Рис. 4. сложный характер появления К-подобного интермедиата в зависимости от изменения спектрального состава и мощности света.

Далее, анализируя спектральный состав 100-Хе лампы и света, используемого в данном эксперименте и сопоставляя их с интенсивностью главных маркерных полос, нам удалось установить наличие определенных корреляций между ними. В частности, было показано, что

соотношение форм - БР568 и К590-подобного интермедиата изменяется пропорционально изменению соотношения между красными и синими квантами в спектре действующего света.

Таблица 1. Отнесение полос в спектрах ИК-эмиссии БР, изображенных на рис. 3.

Данные КАРС Отнесение Спектры, изображенные на рис. 3 (кривые)

БР568 ■1б25 К590 верхняя средняя нижняя

830™, 850 „„ 883 жи» 959 ууу, 982 ^ 830Ь5 860 Ьб 887 Ьз 919 Ь5 950 Ь5 984 Ьз 805у* 824уж 855 V* 896« 939 957 С-С-Н деформационное внеплоскостное колебание 871т 893т 931т5 991 пи 871« 898\лд/ 931У5 985т 871т« 891т« 924 т« 939 тт 982«

1008т 10001« 1013У5 С9-СН3, Сц-СНз вален. пл1011т5 ЮООне разр. 1011«

1048 уууу 1041 1081 С9-СН19деф внепл. С-С, С-Н деф.пл. 1062т 1029« 1062« 1090« МЗбщ пл1078 VI 10920«

1122 1116 ШЗУЛ 1135« Сц-Ск валентное колебание ИОЗУБ 1119« 1141« 1130У5

1171т 5 1167т Б С-С валент. 1164т 1164« 1178 тщ

1202т 1213т 1197т 1209т 11865 НЭбгт 12006т 1220т С-С валентные колебания, СН3 деф. колебания пл119бт« 1210т« 1234уи/ пл1196« ШОуи 1207 т» ПЛ1220 т

1254У VI 1254т Дв-е полиен. ц, вкл. шо 1265У$ 1259« 1259 т

1274у w 1274т 1276 С-С-Р деф + С=С или С-С валент. 1295т« 1296т не разр.

1324т 1349т 1377 1324 1349 1300 1327 1348 1362 Обл-ть деф. кол. метильной группы при С13И С9 1328У« 1351« 1376У« 1311т 1346« 1376« 1393« 1311« 1331т 1365У« 1390«

Белок (NN4) деф. сим. 1406т 1420

1456 1459 1450 С1з-С2оН3асим. деф. 1443т 1482т 1443УУ/ 1473У« 1446\ЛА/ 1471\м

1526У5 1580 1601 1519У$ 1532 1580 1601 1524УБ 1555У« С-С валентные колебания 1529т« 1569т 1594т 1516« 1529« 1561« 1589« 1517 т пл1552 VI 1570« 1590«

1638 1638 1619 С=№ валент. колеб. 16379т 1624« 1637« №1618

Примечание: 5, Ь$ т, тж, w, - обозначение интенсивности полос, соответственно, сильная, очень сильная, сильная широкая, средняя, средне-, очень слабая; пл., - плечо; не разр. - не разрешенная полоса

Такая закономерность хорошо согласовывалась с представлением о наличии прямой и обратной фотореакций на БР<-> К переходе. Как хорошо известно, контроль за равновесием между прямой и обратной фотореакциями в фотоцикле БР осуществляется посредством именно синих или красных квантов.Для того, чтобы более точно охарактеризовать излучающие состояния, наблюдаемые в спектрах ИК-эмиссии БР, были проведены отнесения для всех остальных полос. В таблице 1 приведено детальное описание полос в спектрах ИК-эмиссии, изображенных на рис. 3. Данные сопоставлены с литературными данными, полученными методом КАРС. Детальное описание полос позволило определить конформацию ретиналя БР в каждом из наблюдаемых спектров. В частности, анализ представленных на рис.3 спектров показал, что в состоянии, определяемом как БР5£а, ретиналь имел признаки полностью-транс геометрии ретиналя, что находилось в полном соответствии с известными фактами. В то же время в спектрах К-подобного интермедиата были частично выявлены признаки структуры полностью-транс и 13-цис одновременно. Это позволило сделать вывод о геометрии ретиналя в К-подобном интермедиате как промежуточной между полностью-транс и 13-цис конформацией. В обеих формах было отмечено наличие интенсивных полос, обусловленных деформационными колебаниями в области ниже 1000 см"1, которые указывали на существенные искажения в структуре ретиналя (рис. 36). Было отмечено, что К-подобное состояние в зависимости от условий возбуждения имело в разной степени признаки К590 или .^-интермедиата. Согласно литературе, одной из основных полос, по которым диагностируют J62s — интермедиат в спектрах ИР, является полоса при 1000 см'1, которая обусловлена деформационным колебанием метильной группы, локализованным на атомах углерода С9 и С13. Эта полоса не активна в ИК-поглощении, но активна в КР. В спектрах КАРС основной формы БР колебание этой группы проявляется при 1008 см'1 и по данным разных авторов эта полоса имеет высокую, либо умеренную интенсивность. В J525 - интермедиате эта полоса не проявляется, вместо нее наблюдается полоса при 1000 см"1 с низкой интенсивностью. В K590 -интермедиате ни одна из этих полос, не выявляется, вместо них наблюдается полоса при 1013 см"1 . Сдвиг частот и варьирование интенсивности этих полос свидетельствует об изменении подвижности метильных групп при БР—> isa -v KSM переходе. Для ■1б25-интермедиата в спектрах КАРС также типично появление достаточно большого числа интенсивных полос в области деформационных (HOOP) между 950 и 850 см'1, которая является областью, особо чувствительной к конформации ретиналя. В спектрах ИК-эмиссии БР эти внеплоскостные деформационные колебания цепочечных атомов водорода выявлялись по-разному (в разном сочетании и относительном распределении интенсивности между полосами) в зависимости от условий возбуждения (рис.ЗБ).

Таким образом, было установлено, что среди излучающих ИК-эмиссию состояний находится состояние, имеющее признаки J-интермедиата, который, как известно, относится к, т. н. «горячему» состоянию, которое предшествует образованию К-интермедиата. Из этого следовало, что ИК-эмиссия, регистрируемая в спектрах БР, происходит не с квази-равновесных, а с высокорасположенных колебательно-возбужденных подуровней основного электронного состояния. Это позволило предположить, что состояние БР5ев, выявляемое в этих спектрах, так же является колебательно-возбужденным, «горячим», состоянием основной формы БР. На схеме, представленной на рисунке 6, БР56» и J625 являются единственными квазиустойчивыми колебательно-возбужденными состояниями. Все другие состояния - L, М, N и О образуются в т.н. «темновой» стадии ФЦ, происходящей без участия света. Маловероятно, что будучи срелаксированными, т.е. образованными после распада колебательно-возбужденного состояния, L, М, N и О-интермедиаты могут вносить существенный вклад в регистрируемый ИК-сигнал, поскольку на этих колебательных подуровнях, расположенных вблизи равновесного подуровня сильную конкуренцию излучательным переходам составляет процесс безизлучательной релаксации, протекающий с более высокой скоростью (10"12 -10'" сек'1) и эффективностью.

Рис. 5. Схематическое изображение образования ИК-излучаюицих состояний в БР (рисунок адаптирован из [ Хи ег а1., 1996]).

Обнаруженный в спектрах ИК-эмиссии большой набор полос указывал на то, что первичная фотодинамика БР происходит с участием большого числа мод, что тем самым подтверждало гипотезу о многомодовом характере первичного процесса. Вовлеченность большого числа мод в релаксационный процесс, как и сильная чувствительность эмиссионных спектров к условиям возбуждения указывают на то, что профиль потенциальной поверхности в БР является достаточно сложным. Это допускает существование разных релаксационных путей с, соответственно, разной эффективностью образования К-интермедиата. Данный вывод согласуется с наличием большого разброса в данных среди разных исследовательских групп при определении величины квантового выхода первичной реакции от 0.28 до 0.65, которую на ранних этапах получали в разных условиях освещения.

В проведенных выше экспериментах без ответа остался вопрос, касающийся причины несоответствия между эмиссионными и традиционными спектрами ИК-поглощения и КР в интенсивности главных маркерных полос, обусловленных С=С валентными колебаниями и колебаниями р-иононового кольца. Как уже было отмечено выше, С=С валентные колебания которые обычно занимают почти половину интенсивности спектров КР и ИК-поглощения, в спектрах ИК-эмиссии они имели относительно слабую интенсивность. И наоборот, колебания р-кольца, которые обычно скрыты от традиционных методов, как правило, присутствовали в спектрах ИК-эмиссии БР иногда даже в виде достаточно интенсивных полос. И, что особенно важно, 8 спектрах ИК-эмиссии БР были обнаружены полосы в высокочастотной области выше 1700 см'1, где обычно не наблюдаются ретинальные полосы, но присутствуют полосы, обусловленные белком.

Для того, чтобы прояснить все эти вопросы мы применили данный подход к модельным соединениям - полностью-транс изомеру ретиналя и аминокислотам Ь-моногидрохлориду и глицину.

Исследование спектроскопических характеристик ИК-эмиссии модельного соединения полностью-транс ретиналя при колебательном и электронном возбуждении

Использование ИК и видимого света для возбуждения ретиналя позволило изучить закономерности распределения внутримолекулярной энергии в ретинале в разных условиях возбуждения и понять отмеченные выше особенности в спектрах БР. К настоящему времени мы получили и охарактеризовали спектры ИК-эмиссии полностью-транс ретиналя в условиях возбуждения видимым (резонанс, вне- резонанса) и инфракрасным светом. Исследования были выполнены на пленках полностью-транс ретиналя, полученных путем высаживания растворенного ретиналя в гексане в концентрации 10'3 М на подложку из К(*5-5. Эксперименты были выполнены в нескольких повторностях с новыми пленками.

Задача выявления спонтанных излучательных ИК-переходов в равновесном состоянии, является трудно выполнимой из-за малой энергетичносги процесса, обусловленной наличием высоко конкурирующего процесса безлучательного распространения внутримолекулярной энергии. По этой причине спонтанные излучательные переходы в ретинале являются слабо изученными. Благодаря уникальности оптической схемы, разработанного совместно с нашей лабораторией отечественного ИК-Фурье спектрометра ФС-02 и использованию охлаждаемых ИК-приемников, нам впервые удалось зарегистрировать ИК-флуоресценцию при комнатной температуре при возбуждении ретиналя ИК-светом среднего ИК-диапазона при мощности от 1.5 до 4 мВт. Спектры регистрировали в спектральном диапазоне 1680-750 см'1. Было обнаружено, что независимо от того, в каких колебаниях происходила первоначальная концентрация колебательной энергии, распределение полученного избытка колебательной энергии внутри молекулы происходило не равномерно и не по всем модам. При этом наблюдали усиление отдельных типов колебаний. Спектры наблюдаемой пассивной ИК-эмиссии (далее по тексту -ИК-флуоресценции), содержали ограниченный набор полос, среди которых были колебания С=0 группы (1664 см'1) , валентные С=С колебания при 1597см'1, а также колебание р-иононового кольца при 791 см'1.

На рис. 6 представлены спектры ИК-флуоресценции полностью-транс изомера ретиналя записанные при освещении образцов выделенными участками ИК-диапазона на частотах 1667, 1124 и 667 см"1. Эти частоты соответствовали разрешенным колебательным ИК-переходам альдегидной С-0 группы, С-С валентных и деформационных колебаний. В каждом из отмеченных выше случаев наблюдали усиление определенного типа колебания, связанного с колебанием р-иононового кольца . Оно проявлялось в спектре в виде широкой и наиболее интенсивной полосы при 791 см"1. Среди других интенсивных эмиссионных полос наблюдали полосу С=С валентного колебания, интенсивность которого была сопоставима или меньше интенсивности колебаний концевой или метильных при 1480 см"1 групп.

5 £

I I

Л Л ОО 1200 -! ООО

ЧИСЛО, с^

Рис. 6. Спектры ИК-эмиссии полностью-транс ретиналя при ИК-возбуждении с использованием узкополосных инфракрасных фильтров 1667 см"1 с полушириной пропускания (0у2, - 64 см"1) (кривая 1), 1124 см'1 (01/2/ - 126 см"1) (кривая 2) и 667 (01/2, - 18 см"1) (кривая 3) в микронного размера толщины пленках в области 1600-600 см'1. Вертикальные (жирные) стрелки возбуждение репортерных групп.

Таким образом, флуоресцентные измерения модельного соединения полностью-транс изомера ретиналя в средней ИК-области позволили подтвердить участие колебания р -иононового кольца в релаксационном процессе, что объясняло его закономерное присутствие в спектрах ИК-эмиссии БР. Они так же позволили объяснить относительно высокую интенсивность колебания р - иононового кольца вместе с относительно слабой интенсивностью эмиссионных полос ОС валентного колебания особенностями внутримолекулярного распространения колебательной энергии в ретинале. Так же было установлено, что в спектрах ИК-флуоресценции слабо проявляются или отсутствуют колебания, локализованные в области 1460 - 1330 см'1 и практически не участвуют деформационные колебания, расположенные в области 1000- 800 см"1. Отсутствие сильных деформационных колебаний, характеризующих искажения в геометрии молекулы, указывало на то, что жесткая структура ретиналя сохраняет планарность своей структуры в равновесном состоянии, проявляя слабую чувствительность к колебательному возбуждению, что хорошо согласовывалось с литературными данными.

Наконец, что особенно важно, эксперименты с селективным возбуждением репортерных групп: С=0, С-С и ССС групп позволили непосредственно наблюдать движение внутримолекулярной энергии в процессе релаксации ретиналя. Было обнаружено, что в равновесных условиях концентрация и, соответственно, испускание колебательной энергии происходит не только на ИК-разрешенных сильных переходах (С=С валентных колебаний), но и слабо разрешенном переходе колебания р-иононового кольца. Весьма интересен установленный с помощью ИК-флуоресценции факт переноса энергии между обеими половинами молекулы, который не зависел от числа промежуточных групп. Механизм подобных переходов хорошо изучен в случае электронных переходов, что нельзя сказать о колебательных переходах. Из этого следовало одно очевидное обстоятельство, что термализация избытка колебательной энергии, сообщаемого отдельной группе молекулы в отсутствие электронного возбуждения принципиально отличается от последнего. Наряду с движением вниз, в направлении от высоко- на низко расположенные энергетические уровни (рис. 7. А), что, как известно, типично при каскадном (ступенчатом) размене энергии, наблюдалось движение колебательной энергии в противоположном направлении. Более того, при ИК-возбуждении низкочастотных мод (например, при 667 см"1) наблюдался перенос энергии в сторону высокочастотных мод , в частности, в колебания р-иононового кольца и далее на С=0 группу (рис. 6 и 7. Б) . В этом случае наблюдали перенос энергии на противоположные части молекулы, разделенные расстоянием в несколько длин связей (> юА), что возможно только при наличии тесного взаимодействия связей и ангармонического сцепливания между модами. Этот вывод хорошо согласуется с литературными данными.

с=о с=с с-с

Р- ион.к-цо

¡ишж

кт

Рис.7. Уровни энергии отдельных типов колебаний ретиналя и переходы между ними при поглощении и испускании инфракрасного света.

Анализ данных показал, что избыток колебательной энергии перколируется преимущественно в колебательные моды С=С валентных колебаний и р-иононого кольца. Последнее означает, что ретиналь может взаимодействовать с белком так же со стороны р-иононого кольца, что до настоящего времени считалось не совсем очевидным фактом.

Исследование действия видимого света на модельный изомер полностью-транс ретиналя показало, что в отличие от действия ИК-света, видимый свет продуцировал в ретинале ИК-излучение, в составе которого было значительно больше частот. Эти частоты были расположены в широком спектральном интервале от 4000 до 700 см"1. При оптическом возбуждении было отмечено достаточно сильное усиление разных типов деформационных колебаний, связанных с большими искажениями скелета молекулы, что свидетельствовало о высокой подвижности молекулы и значительном искажении геометрии ее структуры при электронном возбуждении (рис. 8). В данных условиях возбуждения мы обнаружили в ретинале два резко отличающихся между собой состояния, которые были выявлены в условиях вне резонанса и в резонансе с максимумом полосы электронного поглощения. Помимо интенсивности, спектры различались по набору полос, относительному распределению интенсивности между отдельными полосами, а также полушириной спектральных линий - 12.S см"1 при резонансе и 25 см"1 вне резонанса и чувствительностью к условиям возбуждения, что могло быть следствием изменения электрон-фононного взаимодействия, и/ или энергетического состояния, с которого происходят обратные индуцированные ИК-переходы. Для ретиналя известно три низко-расположенных энергетических уровня, хотя порядок их расположения все еще не известен В*и (лл*), А8"(пл*) и пл*. В фотоизомеризации могут принимать как возбужденное триплетное, так и возбужденное синглетное состояния. Детальный анализ полученных спектров ИК-эмиссии модельного соединения полностью-транс ретиналя подтвердил, что спектры, изображенные на рис. 8 относятся к энергетически разным состояниям, структуры которых более детально рассмотрим ниже.

В спектре, записанном при освещении светом с длиной волны 340<Л<460 нм, т.е. в условиях сильного резонанса с полосой электронного поглощения (Рис. 8, верхняя кривая) в спектральной области 2000- 600 см"1 содержится большой набор полос. В спектре наблюдается группа полос при 1943, 1279, 817 и 591 см'1 , которые являются наиболее сильными в спектре. Высокочастотная полоса при 1943 см'1 является вторым обертоном интенсивной низкочастотной полосы при 878 см"1, обусловленной деформационным внеплоскостным (HOOP) колебанием цепочечных атомов водорода в углеродной цепи. Другая высокочастотная интенсивная полоса при 1780 см'1 обычно не наблюдается в спектрах ИК-поглощения и КР равновесного состояния ретиналя, а выявляется при резонансном возбуждении в спектрах РКР. Согласно литературным данным полоса при 1780 см"1 является С=С валентным колебанием (ag - типа), которое наблюдается в возбужденном электронном состоянии. В возбужденном электронном состоянии

она обычно наблюдается в паре с другой, не такой интенсивной полосой С=С , которое в нашем случае это была полоса при 1575 см"1. Присутствие такой пары С=С валентных колебаний при 1780 и 1575 см'1 было характерно для Б! состояния.

обертоны о сост. частоты о

(Ж- гезопапс

I <?

I-1-1-1-1-1-1-'-1-1-1—

2000 1800 1600 1400 1200 1000

Волновое число, см'1

800 600

Рис. 8. ИК-эмиссии в области 2000-600 см" . Спектр записан (Х>560 нм, 160 мВт) в условиях попадания действующего света в край полосы поглощения ретиналя (вне-резонанса -нижяя) и максимум полосы поглощения (резонанс- верхняя кривая)

Это возбужденное электронное состояние характеризуется наличием в области « отпечатков пальцев» полос при 1279, 1248, 1232 и 1210 см"1. Эти КР-активные колебания были так же обнаружены в рассматриваемом спектре. Отметим, что полоса при 1279 см'1, обусловленная деформационными колебаниями, включающими колебания цепочечных атомов водорода и С-С-Н группы, является одной из интенсивных в этом спектре. Другие сильные полосы были расположены в низкочастотной области при 817 см'1 и 591 см"1. Наиболее сильная полоса при 817 см"1 принадлежала колебанию р-иононового кольца. Другая полоса при 591 см"1 вместе с полосой при 658 см"1 обусловлена деформациями в скелете полиеновой цепи на участке С9-С19Н3 и С13-С20Н3, соответственно. Эти колебания сильно взаимодействуют между собой. Дополнительно отметим одну важную особенность представленного спектра: в этом спектре отсутствует характеристичная для всех изомеров ретиналя полоса при 1007 см'1. Эта полоса, будучи ИК не активной, присутствует в спектрах КР всех изомеров ретиналя. Согласно литературе ее отсутствие в спектрах ретиналя характерно для возбужденного электронного состояния ^и* -типа. Таким образом, обнаруженное в условиях резонансного возбуждения состояние имело все признаки возбужденного электронного состояния ретиналя.

Что же характеризует другое состояние. Типичный его спектр изображен на рис. 8 (нижняя кривая). Для него был характерен другой набор полос и другое относительное распределение интенсивности между отдельными полосами. В частности, отмеченная выше полоса С=С валентного колебания при 1780 см"1 имела слабую интенсивность и отсутствовала полоса при 1579 см'1, вместо нее присутствовала полоса при 1555 см'1. При этом наблюдали наличие полосы

1007см'1, которая имела сильную интенсивность. Согласно данным литературы высокая интенсивность полосы при 1007 см"1 происходит из-за сильного смешивания этой моды, обусловленными крутильными колебаниями метильных групп на участке цепи (С9-СН3 и Сц-СНз) с соответствующим С=С валентным колебанием, выполняющим роль первопреемницы при релаксации электронного возбуждения. В этом колебательно-возбужденном состоянии происходит сильное растяжение связи между атомами углерода С14-С15, что так же подтверждает высокая интенсивность полосы при 1134 см"1. Сильная низкочастотная полоса при 848 см'1' обусловленная внеплоскостным деформационным (HOOP) колебанием характеризует электронное состояние с типом симметрии, отличным от В+и (лтт*) типа.

Этот, как и предыдущий спектр, содержал большой набор полос в области обертонов и составных частот. Наличие таких высокочастотных колебаний дополнительно свидетельствовало о том, что данное состояние является высокоэнергетическим состоянием молекулы, имеющим большие искажения в геометрии ее структуры.

Таким образом, эксперименты с оптическим возбуждением модельного соединения полностью-транс ретиналя показали, что индуцированная видимым светом ИК-эмиссия БР, происходит с неравновесных колебательных подуровней основного электронного состояния, возможно, и возбужденного электронного состояния. Они так же показали наличие между колебательными модами тесного ангармонического взаимодействия, а результате которого в спектрах ИК-эмиссии БР появляется то или иное колебание, включая колебание р -иононового кольца. Было показано, что интенсивность этой полосы сильно зависит от условий возбуждения, которые влияют на характер и силу электрон-фононного взаимодействия. Так же было установлено, в С=С моде, рассматриваемой как первопреемницы электронного возбуждения не происходит максимальной концентрации колебательной энергии. Вероятно, что относительно слабая интенсивность С=С валентного колебания в спектре обусловлена существованием на этом переходе сильной конкуренции между излучательным и безизлучательным процессом в пользу последнего.

И наконец, данные эксперименты с использованием модельное соединение полностью-транс изомера ретиналя позволили изучить спектральные характеристики хромофора в равновесных и не равновесных условиях и, тем самым, объяснить спектральное поведение хромофорного ретиналя в спектрах ИК-эмиссии БР.

Вернемся к спектрам ИК-эмиссии БР и рассмотрим спектральные характеристики в области 2200 - 1700 см"1, не связанной с ретиналем.

Спектоальныех свойства в спектрах ИК-эмиссии БР в области 2200 -1700 см"'

Как уже было отмечено выше, наличие полос в высокочастотной области 2200 -1700 см"1 в колебательных спектрах БР характеризует участие молекулярных групп белковой глобулы и молекул связанной воды в фотоцикле БР. Последнее было определено в конце прошлого столетия благодаря данным кристаллографических исследований, выполненных с высоким пространственным разрешением и дифференциальной ИК-Фурье спектроскопии. Кристаллографические исследования позволили установить присутствие молекул связанной воды внутри протон переносящего канала, тогда как дифференциальная ИК-Фурье спектроскопия позволила увидеть изменения в 2200 - 1800 см"1 области на самых ранних стадиях фотоцикла БР. К сожалению, спектральные данные, касающиеся спектрального диапазона между 2200 и 1800 см"1 весьма немногочисленны и в настоящее время эта высокочастотная область является все еще слабо изученной. И это касается не только БР, но всех остальных белков, а так же растворов аминокислот. Основная трудность подобных исследований состоит в том, что в эту область попадает большое число сильно перекрывающих полос поглощения множественных осцилляторов белковых компонентов и воды, которые образуют слабый сплошной континииум. Однако, в отличие от адсорбционного, метод ИЮС позволяет наблюдать в этой области целый ряд спектрально-разрешенных и относительно интенсивных дискретных полос, что является одним из важных преимуществ данного метода. В частности, в спектрах, представленных на рисунке 9 можно видеть наличие ряда полос в области выше 1800 см"1. Спектры ИК-эмиссии БР записаны в условиях освещения, представленных на рис. 3.. Присутствие спектральных полос в

1850-1600 см"1 в области в спектрах ИК-эмиссии БР указывает на наличие в них колебаний, обусловленных молекулами связанной воды или структур, включающих связанную воду. Из этого следует, что данные молекулярные группы способны участвовать в ИК-активном отклике в БР в данных экспериментальных условиях.

В высокочастотной области помимо полос, расположенных между 2200 и 1800 см"1, мы наблюдали полосы в интервале 1780-1700 см"1. Как хорошо известно, эта область является наиболее важной в ИК-спектроскопии, поскольку здесь расположены характеристичные колебания С=0 группы протонированной карбоксильной группы, которые не перекрываются ни с какими другими колебаниями. Положение этой полосы отражает интенсивность локальных электрических полей, стабилизирующих дипольный момент СООН группы. На молекулярном уровне эта феноменологическая корреляция означает наличие специфических взаимодействий на уровне водородной связи - усиление или ослабление либо изменение диэлектрической проницаемости. С помощью сочетанного действия двух методов - сайт направленного мутагенеза и дифференциальной ИК-Фурье спектроскопии в БР были идентифицированы ключевые аминокислотные остатки, участвующие в переносе протона через плазматическую мембрану. К сожалению, на сегодняшний день в этой области идентифицированы только четыре остатка аспарагиновой аминокислоты - Asp-85, Asp-96, Asp-115 и Asp-212.

волновое число, см'1

Рис. 9. Спектры ИК-эмиссии БР в области 1850-1600 см"1, записанные при освещении светом (верхняя кривая) - Х> 360 нм, 500 МВт/см2; (средняя кривая) - 360<Х<550 нм, 320 МВт/ см2; (нижняя кривая)- Х> 360 нм, 250 МВт/см2.

Как иллюстрирует рис. 9, в спектрах ИК-эмиссии БР колебания на частотах Asp групп проявляются вместе с другими высокочастотными колбенаиями, набор и относительное распределение интенсивностей которых зависели от условий возбуждения. Зачастую эти белковые полосы имели интенсивность сопоставимую с интенсивностью С=С и C=NH валентных колебаний. Согласно кристаллографическим данным, молекулы внутренней воды, как и аспарагиновые остатки - Asp85, Asp 112 и Asp 115, по расположению внутри глобулы не имеют такого тесного контакта с ретиналем, как лизин в положении 216, образующий с ретиналем ковалентную связь (ШО). Следовательно, колебательное возбуждение с ретиналя не может напрямую передаваться по этим модам в белок. Передача избытка колебательной энергии в этих СООН группах должна

происходить за счет, каких- то других электромагнитных факторов и механизмов. В частности, не исключено, что в подобных условиях реализуется дальнодействующий механизм индуктивной передачи испускаемой возбужденным ретиналем энергии, при котором на разрешенных переходах происходит резонансное поглощения ИК-излучения. Как уже было отмечено выше, ретиналь излучает ИК-кванты 8 широком интервале частот, тем самым ретиналь представляет собой локальный молекулярный источник ИК-излучения с частотами, способными активировать соответствующие диполи, например, из близко расположенного белкового окружения и, тем самым, вызвать ИК-активный белковый отклик в БР. Можно ли в таком случае ожидать появления ИК-сигналов в в области 2000-1700 см"1 спектрах ИК-эмиссии БР? Ответ на этот и другой вопрос, касающийся участия других механизмов, обусловливающих появление подобного в спектрах ИК-эмиссии БР, мы нашли в экспериментах с модельными соединениями лизиновой и глициновой аминокислоты.

Исследование воздействия инфракрасного света среднего ИК-диапазона на лизин

Эти исследования были выполнены на пленках из-за того, что вода сильно поглощает ИК-свет в этой области.

- 1

-< н к

-И - -1—1— -т-1-и-

- *—* — ^ —• —г»,-*,»

-Г—г-

гэсф

волновой число{ сггГ'}

На рис. 10 Спектры ИК-флуоресценции лизина, записанные при ИК-возбуждении с использованием узкополосных инфракрасных фильтров - 1667 см"1 (с полушириной пропускания 01/2, - 64 см"1), 1301 (01/2, - 120 см'1), 1240 (01/2, - 126 см"1), 1003 (01/2, - 32 см"1), 1124 см'1 (01/2, - 126 см"1) и 936 (О^г, - 18 см"1) в микронной толщины пленках в области 1600-600 см"1. Стрелками обозначены частота в максимуме пропускания фильтра. Точками обозначены полосы с интенсивностью меньше или равной 100 условных единиц.

Микронного размера пленки Ь-лизина моногидрохлорида получали высаживанием капли концентрированного (1.0-1.5 М) раствора на подложку из кристаллического кремния с последующим ее высушиванием при комнатной температуре. В качестве источника инфракрасного света использовали стандартный глобар (300 Вт по накаливанию). Для выделения узких участков ИК-спектра использовали ослабляющие и узкополосные ИК-фильтры (Япония). Данные эксперименты позволили установить, что молекулы лизина поглощая инфракрасный свет, способны переизлучать энергию в широком спектральном интервале 3000-700 см"1 среднего ИК-диапазона с большим набором частот (рис. 10). В частности, ИК-возбуждение образца Ьлизина монохлорида узким участком спектра продуцировало ИК-излучение, которое охватывало широкий диапазон частот в области 2000-1700 см'1. Среди регистрируемых полос были наиболее сильные полосы (см., например, рис. 10). На рис. 10 представлены спектры ИК-флуоресценции лизина, записанные при воздействии разными участками ИК-спектра с максимумом излучения при 1667, 1301, 1240, 1006 и 936 см'1. При возбуждении 1301, 1240 и 936 см"1 в области 2000-1700 см'1 обнаружены наиболее интенсивные полосы. Этот результат свидетельствовал о том, что возбуждение аминокислот внутри белковой глобулы в БР с помощью потенциального ИК-источника (например, ретиналя) может вносить вклад в регистрируемые эмиссионные спектры. Однако учитывая характер взаиморасположения ретиналя и аминокислотных остатков, потенциально способных таким образом взаимодействовать с ретиналем, было затруднительно ответить, насколько этот вклад мог быть существенным. В этом отношении было полезно рассмотреть вариант непосредственного влияния видимого света на белок и ответить на вопрос может ли видимый свет вызвать ИК-активный отклик в белке в данных экспериментальных условиях. Исходя из распространенных представлений, следует ожидать отрицательный ответ на этот вопрос, поскольку аминокислоты, как известно, не поглощают видимый свет. Традиционно полагают, что в подобных экспериментальных условиях видимый свет не способен оказывать какого-либо воздействия на белок, соответственно, не существует причин для появления ответной реакции со стороны белка в данных условиях освещения. По этой причине в литературе отсутствуют подобные сведения не только о белках, но и аминокислотах. В данной работе, используя разные экспериментальные подходы, мы впервые исследовали влияние видимого света на аминокислоты лизина и глицина и их взаимодействия в растворе и твердом состоянии. Одним из используемых методов был разработанный нами подход ИКЭС. Прежде чем перейти к рассмотрению этих экспериментов, отметим ряд важных, на наш взгляд выводов, которые следовали из представленных выше экспериментов по инфракрасному возбуждению лизина. Первое - было четко показано, что инфракрасное возбуждение вызывает в молекуле лизина сильное колебательное взаимодействие между модами. При этом было отмечено, что колебательная энергия переносилась с репортерных групп (локально возбужденных ИК-сеетом атомных групп) на разные части молекулы, расстояния между которыми варьировали от длины одной С-С связи (-1.5 А) до нескольких единиц А. Хотя перенос энергии с донорной на акцепторную часть молекулы напоминает перенос электронной энергии, по своей природе они качественно различны. Было установлено, что в лизине, как и ретинале колебательная релаксация происходит не по каскадному механизму. Внутримолекулярный перенос колебательной энергии происходит по механизму тесного ангармонического взаимодействия между модами, которое сопровождается усилением отдельных типов колебаний, разных в зависимости от условий возбуждения. В частности, было обнаружено, что движение энергии от низкочастотных колебаний в направлении энергетически более высоко расположенные высокочастотных колебаний (рис. 10).

Второе - особенно важным представляется результат, который показал, что спектры лизина обладают высокой чувствительностью к величине и частоте возбуждающих колебательных квантов, что хорошо согласуется с представлением о высокой подвижности лизина и о возможности конформационных переходов в аминокислотах при колебательном возбуждении. Согласно литературным данным конформационные переходы в аминокислотах сильно зависят от потока внутримолекулярной энергии, необходимой для преодоления энергетических барьеров. Обнаруженная в наших экспериментах высокая чувствительность структуры 1.-лизина к колебательному возбуждению позволяет сделать важный вывод о способности возникающего

внутри БР ИК-излучения влиять на конформационное состояние молекул аминокислот при резонансном взаимодействии на функционально важных ИК-частотах. Полученный результат показал, что конформационные переходы лизина затрагивают множество разнообразных движений молекулы, многие из которых могут совершаться с большой амплитудой. Это имеет большое функциональное значение для биологической активности БР, как и других белков.

Исследование действия видимого света на аминокислоты с помощью ИК-Фурье спектроскопии

Используя в дальнейших экспериментах образцы аминокислот, мы исходили из распространенных представлений о том, что аминокислоты являются адекватными моделями, имитирующими поведение белков или самих аминокислот внутри .белка. В такого рода экспериментах ИК-спектроскопия - это единственный метод, который может установить присутствие специфических форм аминокислот в твердом состоянии, так и растворе. Использование разработанного нами эмиссионного подхода позволяло проводить эти исследования в более широком по сравнению с традиционным методом ИК-диапазоне и изучать взаимодействие между аминокислотами на качественно другом уровне.

Прежде всего, было обнаружено, что видимый свет умеренной и низкой интенсивности способен вызывать в образцах [.-лизина моногидрохлорида и глицина активный ИК-эмиссионный отклик, который можно было надежно регистрировать с помощью имеющейся у нас ИК-Фурье-техники. Было обнаружено, что генерация ИК-сигнала возникала как в пленочных образцах, так и ненасыщенном растворе (при концентрации 1.0 М). В последнем случае ИК-сигнал был сопоставим (в 1.5-2.5 раза ниже) того, что наблюдали в микронного размера пленках, высаженных на подложку из тонкой пластины кристаллического кремния. Отметим, что исходные водные растворы были оптически однородными и не содержали нерастворенных частиц или агрегатов. Перед измерением растворы предварительно фильтровали с помощью микронного размера миллипоровых фильтров и контролировали по светорассеянию на длине волны 660 нм. Исследование зависимости интенсивности ИК-сигнала в эмиссионных спектрах образцов 1.-лизина монохлорида и глицина от мощности действующего света в диапазоне 42 - 660 мВт показало квадратичную зависимость от мощности (рис.11). Таким образом, на основе этих данных можно было заключить, что видимый свет может продуцировать подобный ИК-активный отклик непосредственно в белке. Предстояло определить насколько этот отклик может проявляться в спектрах БР в области 2000-1700 см'1 и какова его природа.

МОЩНОСТЬ. МВТ

Рис. 11. Зависимость интенсивности спектров ИК-эмиссии 1,-лизина моногидрохлорида от мощности в интервале от 42 мВт до 660 мВт. (•*•)- пленка; (•)- раствор в концентрации 1.0М.

Спектры ИК-эмиссии l-лизина моногидрохлорида и глицина регистрировали в широком спектральном диапазоне 2400-700 см"1, который содержал большой набор полос. При этом было отмечено присутствие ряда достаточно интенсивных полос, расположенных в области между 2000 -1700 см"1, что позволяло сделать вывод о том, что появление полос в этой области в спектрах ИК-эмиссии БР могло быть следствием непосредственного влияния видимого света на белковую часть молекулы БР. Предстояло определить какие связи или структуры обусловливают появление этого отклика в образцах аминокислот и в БР.

Анализ литературы показал, что твердые кристаллические формы L-лизина моногидрохлорида и глицина обладают высокой нелинейной оптической активностью. Это позволило предположить, что подобная нелинейная оптическая активность обусловливает нелинейный ИК-эмиссионный отклик в пленочных образцах данных аминокислот, которые, по сути, являются поликристаллами. В то же время генерация ИК-эмиссии в растворах аминокислот мало соответствовало тому, что аналогичный эффект мог проявиться в образцах, где молекулы находятся преимущественно в виде свободных мономеров, а не плотно упакованных димеров, образующих кристаллы аминокислот. В противном случае следовало предположить, что в растворе под действием видимого света могут образовываться структуры, подобные кристаллическим. Чтобы проверить это предположение провели детальный анализ спектров растворов и пленок образцов L-лизина моногидрохлорида и глицина и их сравнительное описание. С помощью доступных экспериментальных и теоретических литературных данных нам удалось описать подавляющее большинство полос в области 1800-800 см'1, где локализованы принципиальные аминокислотные ИК-полосы. Что касается отнесений в более высокочастотной области между 2200-1900 см'1, такие данные малочисленны и в основном представлены теоретическими расчетами. Согласно литературным данным колебания в этой области обусловлены сильными водородными связями в связанных структурах, включая различного рода димеры.

Как уже было рассмотрено выше, особой информативностью в ИК-спектроскопии отличаются полосы протонированной карбоксильной группы, проявляющиеся в области выше 1700 см'1 (С=0 валентное колебание) и возле 1260 см'1 (С-0 валентное колебание), а так же базовые колебания ионизованной карбоксильной СОО" группы - валентные СОО" (антисимметричное (vlc1610-1560 см"') и симметричное (возле vc«M 1410 см'1) ) колебания. Положение этих полос зависит от того, на каком расстоянии от заряженной СОО' находится NH3* группа, в частности уменьшение волнового числа обусловлено сильным взаимодействием между этими группами (например, в цвиттерионе лизина положение этой группы проявляется при 1580 см"1). На рисунке 11 представлен спектр ИК-эмиссии лизина в растворе 1700-1000 см'1 области с обозначением характеристичных колебаний лизина.

В спектре раствора лизина были выявлены все рассмотренные выше базовые колебания -протонированной (1724, 1767 и 1814 см'1) и заряженной карбоксильной (антисимметричное колебание при 1570 и 1632 см'1 и симметричное колебание при 1405 см'1) группы, а также колебание заряженной NH3* группы, локализованной возле 1506 см'1. Вместе с этими наблюдали ряд деформационных колебаний возле 1328, 1350 и 1440 см'1, обусловленных колебаниями СН2 группы, а так же симметричные С-О(Н) валентные колебания в области 1160-1090 см"1, и деформационные колебания типа (C-C-N), расположенные в области 900-830 см"1. Присутствие в спектре колебаний заряженных СОО' и NH3* групп означало существование в растворе чистой воды цвиттерионной формы (*NH3-CH2-COO~) лизина. В то же время, присутствие колебаний протонированной СООН группы указывало на то, что в растворе вместе с цвиттерионом существует так же незаряженная форма лизина. Обе эти группы в спектрах ИК-эмиссии лизина имели не одну, а несколько частот, что свидетельствовало о том, что в растворе эти химические группы существуют в разном окружении. Наличием в спектре ряда высокочастотных полос выше 1800 см'1 свидетельствовало об образовании сильных водородных связей в сложных структурах типа димеров аминокислота - вода или даже цвиттерион- цвитгерион. Это позволяло заключить, что в растворе наряду с простыми формами моноионов существуют их сложные образования. В частности, в спектре раствора лизина (рис. 12) особо обращал на себя факт присутствия высокоинтенсивных полос при 1485 и 1665 см'1, которые являются не типичными для растворов лизина. Согласно литературным данным, обе эти интенсивные полосы характерны для протон-

волново» число, см'1

Рис.12 Спектры ИК-эмиссии 1.0М раствора L-лизина моногидрохлорида, записанные на ИК- Фурье спектрометре ФС-02 со спектральным разрешением 4 см"1 и накоплением 400 сканов при возбуждении видимым светом (340 <?.<700 нм, 92 мВт).

связанного димера лизина (Lys)2H*. Этот результат нам представлялся особенно важным, поскольку он подтверждал образование в растворе полярных связей и ионных пар. Как хорошо известно, димеризация цвиттерионов является отправной точкой кристаллизации аминокислот. Для димеров аминокислот характерно наличие полярной водородной связи 0-Н...0=С, 0-H...N<, N-Н...О=С или С-Н...О-Н или связи типа («голова- хвост» С0)0" .... (NH2 )Н*, возникающей между цвиттерионными парами. Таким образом, исследованный спектр лизина содержал доказательства того, что низкоинтенсивный свет способен активировать в растворе взаимодействие аминокислот между собой и с молекулами воды в результате которого могут образовываться полярные связи и полярные структуры типа ('NHj-CI-U-COO-^ Высокие полярные и электрические свойства подобных связей и структур вероятнее всего обусловливают высокие нелинейные оптические свойства аминокислот в растворе и твердом состоянии в данных экспериментальных условиях.

Описание спектров ИК-эмиссии пленок лизина было проведено на основе совпадающих литературных данных. Анализ этих спектров показал, что в них содержатся все базовые колебания заряженных С00" и NHj*, групп в областях отмеченных выше, так же как и колебания протонированной СООН группы в области 1860-1700 см'1 (С=0 валентное колебание) и возле 1260 см'1 (С-О(Н) валентное колебание). Были выявлены колебания, типичные для цвиттерионов и и их димеров в кристаллических формах лизина. Помимо базовых колебаний был выявлен целый ряд деформационных колебаний, включая те, что были расположены в области ниже 1000 см'1.

Сравнительный анализ спектров пленки и раствора показал наличие определенного сходства между спектрами, но при этом не было обнаружено полного совпадения между ними. Это касалось набора полос, положения максимумов отдельных полос и относительного распределения интенсивности между ними. Учитывая высокую чувствительность колебательных спектров к структуре аминокислот, можно утверждать, что структуры аминокислот, вовлеченные в ИК-активный отклик, не являются полностью идентичными. В то же время наличие определенного сходства, как и сам факт появления ИК-эмиссии в обоих образцах означал, что природа ИК-эмиссионного отклика в растворе и пленке является одной и той же, и, скорее всего, связана с наличием полярных связей или заряженных структур типа(*МНз-СНг-СОО-Ь •

Подобным образом были проанализированы спектры глицина в разном агрегатном состоянии. В результате мы пришли к аналогичному заключению относительно природы появления нелинейного оптического отклика в растворе и пленке глицина. При этом было обнаружено, что спектры возбужденной видимым светом ИК-эмиссии в глицине, как и лизине содержали большой набор дискретных полос, которые располагались в широком спектральном диапазоне (2500 -700 см"1 в глицине и 2000-700 см'1 в лизине). В спектрах ИК-эмиссии раствора глицина были выявлены базовые колебания ионизованной карбоксильной СОСГ группы валентные СОО" (антисимметричное (v,c1610-1560 см'1) и симметричное (возле vc„M 1410 см'1) ) колебания, а также характеристичные колебания заряженной аминогруппы - деформационные NH3* (ассимметричные колебания возле 1523 см"1 и симметричные колебания возле 1630 см'1), которые указывали на существование в растворе цвиттерионной формы глицина. Так же было обнаружено присутствие незаряженной формы мономера глицина, который определили по наличию полос (ОО валентное колебание) в области между 1780-1700 см'1. Среди характеристичных колебаний заряженной и протонированной форм карбоксильной группы, в области частот выше 1700 см"1 были выявлены диагностические полосы димеров глицина. В частности, наблюдаемое в спектре ИК-эмиссии понижение одной из высокочастотных полос по сравнению со средней (1723±12 см'1) частотой до 1703 см'1, обусловлено согласно литературным данными, ослаблением карбонильной связи за счет образования через водородосвязывание димеров глицина. Наряду с полосой возле 1703 см'1 в спектре ИК-эмиссии глицина были выявлены аномально высокие полосы С=0 колебания карбонильной СООН в области 1В60-1760 см"1, а также полосы выше 1900 см"1, что согласно литературным данным характеризует наличие сильной водородной связи в данной системе. Таким образом, полученные результаты показали существование в растворе глицина, как лизина более сложных по сравнению с мономерами форм, включая димеры или более сложные комплексы с сильными водородными связями. Аналогично лизину, сравнительный анализ спектров ИК-эмиссии раствора и пленочного образца глицина показал наличие определенного сходства и одновременно существование различий между ними. Последнее доказывало, что структуры, ответственные за ИК-эмиссионный отклик в растворе и пленке не являются идентичными. Это находится в соответствии с литературными данными, согласно которым большое многообразие доноров и акцепторов протонов в глицине позволяет разнообразное позиционирование свободной формы глицина в пространстве, что в свою очередь, приводит к большому числу возможных комбинаций (0-Н...0=С, 0-H...N<, N-H...OC, С-Н...О-Н) димерных структур в глицине. В то же время причиной появления ИК-эмиссионного отклика могут быть полярные водородные связи и заряженные структуры, которые исходно существуют в поликристаллах глицина и индуцировано возникают в растворе в данных экспериментальных условиях. Таким образом, проведенный анализ позволил четко доказать, что низкоинтенсивный видимый свет способен вызывать ИК-активный отклик в белковых компонентах БР, среди которых могут быть ионные пары или включающие молекулы внутренней воды большие молекулярные кластеры.

Было интересно определить, насколько структура аминокислот чувствительна к изменению условий возбуждения. Мы исследовали спектры ИК-эмиссии L-лизина моногидрохлорида и глицина при варьировании мощности действующего света. Оказалось, что спектры ИК-эмиссии обеих аминокислот как в твердой форме, так и в растворе были очень чувствительны к варьированию мощности действующего света в пределах 42 мВт - 660 мВ. Это проявлялось в перераспределении интенсивности между отдельными полосами, в результате чего могли исчезать одни и появляться другие полосы, как это иллюстрирует рис. 13. На этом рисунке представлен спектр пленки глицина в низкочастотной области 960 - 840 см'1, где наблюдалась наиболее сильная широкая полоса с максимумом при 917 см"1, которая как нам удалось при разрешении показать, содержит две компоненты при 918 и 892 см"1. Полоса 918 см'1 включает в себя ряд колебаний, в том числе и деформационные колебания СН групп и согласно литературе, частота этого колебания используется для распознавания чистых форм а и у-кристаллов в глицине. Деформационное колебание при 892 см"1 обладает особой чувствительностью к силе водородной связи между заряженными СОО' и NHj*, группами в глицине. Как видно, незначительные изменения в интенсивности действующего света могли вызвать сильные пертурбации в этой области спектра в виде сдвигов максимумов отдельных

полос, относительного перераспределения интенсивности между отдельными полосами, или полного исчезновения одних и появления других полос в спектре. При этом была отмечено сохранение относительно высокой интенсивности полосы при 917 -905 см'1. В другом случае наблюдали изменение интенсивности, при котором не происходило сдвига максимумов полос (рис. 14).

Рис. 13. Приведенные ИК-Фурье спектры ИК-эмиссии глицина в пленке в области 960- 830 см'1. Спектры записаны со спектральным разрешением 4 см'1 и накоплением 400 сканов при освещении видимым светом 340 <Л<700 нм, мощностью -кривая- (1)- 72 мВт; (2)- 93 мВт; (3)-(146)- (4) -146; (5)-170 мВт; (6)-660 мВт.

На рис. 14 спектр ИК-эмиссии глицина представлен в области 1460-1420 см"1, где расположена широкая полоса при 1444 см"1 • обусловленная деформационными колебаниями СН2 группы. Как видно изменение интенсивности этой полосы носит не монотонный характер (рис.14 б). Рассмотренные выше случаи были типичными для спектров глицина и лизина, регистрируемых в аналогичных условиях. Характер спектральных изменений, представленных на рисунке 13 и 14 отражает изменения, которые могли произойти в результате переориентации молекул. Если в растворе такая чувствительность спектров могла быть объяснена высокой подвижностью растворенных молекул, то подобная чувствительность в связанной структуре в твердых образцах

Рис. 14. Приведенные ИК-Фурье спектры ИК-эмиссии глицина в пленке в области 14701400 см'1. Спектры записаны со спектральным разрешением 4 см'1 и накоплением 400 сканов при освещении видимым светом 340 <>.<700 нм, мощностью -кривая- (1)- 72 мВт; (2)- 93 мВт; (3)-(146)- (4) -146; (5)-170 мВт; (6)-660 мВт.

Таким образом, было обнаружено, что конформация молекул лизина и глицина в нелинейных структурах обладает особой чувствительностью не только к инфракрасному излучению, но и видимому свету. Однако природа такой чувствительности в каждом из этих случаев была различной. При ИК-возбуждении эта чувствительность в большей степени была обусловлена внутримолекулярными межмодовыми взаимодействиями, тогда как при оптическом возбуждении эта чувствительность была обусловлена скорее межмолекулярными, чем внутримолекулярными взаимодействиями. В таком случае, оптический ответ среды в значительной степени зависел от локального поля, действующего на индивидуальный излучатель, чем от среднего макроскопического поля. В условиях оптического возбуждения именно ориентационные механизмы играют ключевую роль во взаимодействиях между молекулами, вызывая усиление взаимодействия и перестройки их структуры. Хотя большинство аминокислот в растворе в воде не имеет заряда, но они существуют как цвиттерионы, которые имеют большой дипольный момент. Будучи высоко анизотропными, молекулы аминокислот, наподобие жидких кристаллов, легко переориентируются под действием электромагнитного излучения. В условиях электромагнитного излучения в молекулах аминокислот появляется наведенный дипольный момент, а в системе появляется наведенная анизотропия. За счет подобных процессов в рассматриваемой системе может произойти значительное увеличение напряженности электрических полей. Для жидких кристаллов хорошо известно, что, будучи высокой, напряженность электрических полей при появлении наведенной анизотропии может увеличиться на три порядка величины, т.е. в 103 раз. В этом случае пространственное выстраивание анизотропных полярных молекул может включать ряд других механизмов, включая те, которые обусловливают нелинейный показатель преломления, наведенное двулучепреломление, вынужденное комбинационное рассеяние света и генерацию ИК-излучения. Вполне вероятно, что нелинейные взаимодействия выполняют роль модулирующих сил, обусловливающих самосогласованные донорно-акцепторные взаимодействия при функционировании БР. Чтобы окончательно убедиться в том, что низко интенсивный видимый свет способен оказать существенное влияние на структуру и взаимодействия аминокислот мы использовали другие подходы.

Изучение спектральных характеристик лизина и глицина в электронных спектрах

Хотя УФ-спектроскопия не является диагностической как ИК-спектроскопия, она может быть использована для определения хромофор содержащих видов в растворах аминокислот. Информативным в этих спектрах являются сдвиги полос, которые могут быть показателем степени протонированности ауксохроомных групп, которой, например, в глицине является его аминогруппа.

Мы обнаружили в спектрах поглощения растворов 1-лизина и глицина в чистой воде появление новой полосы при 270 нм, что было не типично для аминокислот, которые в отличие от поглощающих в этой области ароматических аминокислот (фенилаланин, тирозин и триптофан) не имеют коньюгированных связей. Между тем эти данные согласовывались с литературными данными по лизину, в одном случае, появление новой полосы в его растворе связывали с димеризацией лизина, в другом случае с образованием сольватных комплексов с водой. Эти процессы могли вызывать смещение электронного уровня лизина в сторону более длинных длин волн. Было так же установлено, что поглощение этой полосы увеличивалось с концентрацией, что могло быть обусловлено увеличением концентрации новой структуры в растворе. Это согласовывалось с известными данными, показывающими увеличение вязкости в растворе лизина с повышением его концентрации от 0.5 до 1.5 М.

Флуоресцентные измерения выявили дополнительные структуры, которые поглощали в видимой области между 310 и 500 нм. Оказалось, что эти структуры способны так же излучать видимый свет.

На рис. 15 а представлены спектры флуоресценции лизина, записанные при разных длинах волн возбуждения. Каждый спектр представлял собой сложную по форме широкую полосу, расположенную в области между 310 и 500 нм. Изменение длины волны возбуждающего света приводило к изменению формы, интенсивности и сдвигу максимума спектральной кривой. Так,

при возбуждении светом с длиной волны 290 нм максимум флуоресценции наблюдался около 426 нм, тогда как при возбуждении 310 нм или 410 нм максимум располагался, при 410 и 476 нм, соответственно.

Рис. 15 - 1М Ьлизин моногидрохлорид. Спектры возбуждения- кривые : 1 ( Х,„ис = 435 нм), 2-(^эмис = 455 нм) и 3 - = 471.нм); Б - спектры флуоресценции - кривые-. - 1(Х.смб = 290 нм), 2 -(Я.,0!б = ЗЮнм), 3 IX,01б = 355нм) и 4 -[Ко,б = 410нм). На вставке аппроксимация спектра флуоресценции = 355 нм) с компонентами в разложении с помощью приближения Лоренца.

Аналогичные изменения наблюдалось в спектрах возбуждения 1-лизина моногидрохлорида при варьировании длины волны испускания (рис.2 б). Таким образом, было выявлено, в исходно оптически однородном растворе существует множество разнородных структур вещества. Разложение спектральных кривых лизина позволило определить как минимум три разных состояния с положением максимумов при 383,426 и 475 нм в спектрах флуоресценции и при 320, 345, 374 нм в спектрах возбуждения. Эти результаты находятся в полном соответствии с литературными данными. Аналогичные свойства в растворе глицина были нами выявлены впервые. В растворе глицина новые структуры поглощали при 280, 335 или 354-369 нм. Максимумы их флуоресценции наблюдались возле 410 нм и 456 нм (А.ВОЗб = 290, 326 или 355 нм) нм и 478 нм (Я.,„б = 410 нм). Было установлено, что интенсивность полос в спектрах глицина была слабее по сравнению с лизином, однако их интенсивность могла увеличиваться (иногда даже в несколько раз) при «старении» раствора.

Таким образом, эти эксперименты четко показали, что в растворах исследуемых образцов аминокислот в чистой воде при концентрациях, далеких от насыщения молекулы лизина могут самопроизвольно или индуцировано самоорганизовываться в кластеры. В последнем случае мы наблюдали рост интенсивности флуоресценции в максимуме полосы при увеличении мощности действующего света, а так же появление под действием зондирующего излучения флуоресценции, которую можно было наблюдать невооруженным глазом.

Исследование индуцированных процессов в растворах аминокислот при воздействии излучением низкой интенсивности

Чтобы более детально исследовать светящиеся структуры в растворе мы разработали устройство с использованием видеокамеры, схематическое изображение которого представлено на рисунке 16.

Рис. 16 Схематическое изображение лабораторного устройства по наблюдению и регистрации поведения растворов при лазерном освещении.

Установка включала в себя непрерывный источник видимого света - низко интенсивный лазер Ыс):УА6 с длиной волны 532 нм (мощностью 18 мВт) или Не-№ лазер с длиной волны 633 нм (мощностью 4 мВт), систему ослабляющих фильтров, образец, помещаемый в прозрачную кювету и систему регистрации. Последняя состояла из увеличительной оптики, ирисовой диафрагмы, видеокамеры и компьютера. Обработка, регистрация изображения и вывод изображения на дисплей проводилась с помощью разработанных лабораторных электрических схем и программного обеспечения.

С помощью этого устройства было обнаружено, что воздействие света приводит к образованию твердых агрегатов с размерами от 0,2 до 20 мкм, появление которых мы наблюдали на экране благодаря их сильной отражательной способности. Образование этих структур происходило сразу после включения света при высоких (1.0М) и низких концентрациях (до 0.1 М), а так же при снижении мощности до 1.4 мВт.

Так же было обнаружено, что в оптически изотропном растворе под действием видимого света формируется протяженная анизотропная область, рассеяние или флуоресценцию которой можно было наблюдать в прозрачном объеме жидкости в виде окрашенной протяженной и с высокой частотой осциллирующей структуры. Наиболее контрастная картина получалась при использовании лазерного излучения с диаметром пучка ~1.5 - 2 мм. Эту необычную структуру в жидкости исследовали с двадцати кратным увеличением при длинах волн 532 нм или 633 нм. В отсутствие поглощения (при длине волны 633 нм) структура имела окраску входящего излучения, тогда как при использовании лазерного излучения с длиной волны 532 нм наблюдалась ее флуоресценция в виде ярко желто-окрашеного светящегося трэка. На рис. 17 представлено увеличенное изображение этой структуры при лазерном возбуждении 633 нм.

Рис. 17. (А) - увеличенное изображение (20х) структуры жидкости внутри светящегося «трэка»; (Б) - образование аморфных форм АК на поверхности кюветы в месте светового пятна

Было установлено, что полученное изображение представляет собой подобие спекл-картины - диффузной структуры, состоящей из темных и светлых пятен различной формы и величины и распределенных в пространстве случайным образом, которое формируется из-за вариаций в показателе преломления, обусловленных наличием в среде неоднородностей, которые по своим макроскопическим параметрам (структуре, плотности и т.п.) существенно отличающимся от жидкости в целом. Чаще всего центрами образования таких неоднородностей являются кластеры - ассоциированные молекулы, которые могут включать в себя макроскопическое количество молекул. Появление спекл-картины происходит в результате интерференции света, рассеянного ансамблем многих оптических неоднородностей в среде, что тем самым однозначно свидетельствует о кластеризации вещества. Появление такой структуры в растворе аминокислот характеризует их поведение как жидких кристаллов. Хорошо известно, что сильное Рэлеевское рассеяние в видимой области, которое позволяет наблюдать оптическое прохождение света внутри прозрачной среды является важным оптическим свойством нематических жидких кристаллов. Свет рассеивается в нематике 105 раз больше, чем в изотропной жидкости. Фактически 8 жидких кристаллах сильное Рэлеевское рассеяние обусловлено вариациями в диэлектрическом тензоре, обусловленные флуктуациями в плотности, показателе преломления, температуре или ориентации.

В этих экспериментах на основании визуального наблюдения за данной областью нам удалось разделить, по крайней мере, два различающиеся характером и динамикой процесса. Оказалось, что, т.н. «спекл»-картина обладает динамической неустойчивостью в пространственно-временном масштабе. С одной стороны, было заметно движение диффузных пятен - изменялись их форма и размер - пятна поочередно появлялись и исчезали без какого-либо заметного перемещения в пространстве. Эти изменения имели осциллирующий характер. Вместе с мерцанием среды наблюдали так же другой тип движения, который по сложным траекториям внутри трэка совершали различные по размеру и форме твердые структуры. Эти плотные структуры высаживались на противоположные стенки кюветы, образуя непрозрачные области внутри освещенного пятна (рис. 176). Было показано, что образование агрегатов в каждом из образцов происходили в интервале 1,4 -18 мВт без порога. Мощность действующего света влияла на число образующихся твердых частиц, интенсивность свечения протяженной структуры и характер распределения в ней диффузных пятен. Температура и концентрация вещества так же влияли на число, размеры и подвижность частиц. Вместе с аморфными формами в трэке происходило образование наноразмерных кристаллических форм аминокислотных образцов.

Рис. 18 А-В. Изображение микрокристаллов лизина (А) и глицина (Б), образовавшихся после выпаривания облученных растворов при комнатной температуре. Снимки получены с помощью камеры Webbers 320М на микроскопе OptiTech с увеличением 400х

Это было подтверждено медленным выпариванием облученных образцов при комнатной температуре. На рис. 18 представлено фото микрокристаллов лизина и глицина, образовавшихся после облучения лазером с длиной волны 532 нм в течение 10 минут при комнатной температуре. В то же время было установлено, что в неосвещенных тех же самых растворах аминокислот медленное выпаривание не приводило к образованию кристаллических форм, подобно освещенным растворам. С помощью микроскопа были обнаружено, что множество образованных кристаллов имело разные форму и размер (длиной от 0.1 мкм до 5 мм) (рис. 18 А и Б). Кроме этого было установлено, что образование кристаллов не связано с лазерным излучением. На рисунке 18в представлен результат одного из таких экспериментов, где образование кристаллов наблюдали в 1.0 М растворе лизина при освещении его многочастотным видимым светом от ксеноновой лампы мощностью до 200 мВт.

Рис. 18 В. Изображение кристаллов лизина, выращенных после выпаривания освещенного раствора. Раствор освещали многочастотным светом от ксеноновой лампы при мощности 200 мВт.

Кристаллы лизина размером от 1 до 1.5 см в длину (рис. 18 В) образовались в результате медленного выпаривания облученного раствора при комнатной температуре. В качестве контроля использовали неосвещенный раствора при той же концентрации, в котором нам не удалось обнаружить образования кристаллических форм за аналогичный период наблюдения при выпариванием раствора при комнатной температуре. С помощью рентгеноструктурного анализа определили параметры одного из выращенных кристаллов 1_-лизина монохлорида (1_1_МН1). Из

дифрактометрического анализа было обнаружено, что исследуемое соединение закристаллизовано в моноклинную систему и что кристалл принадлежит к пространственной группе P2i. Параметры решетки находятся в хорошем соответствии с литературными данными.

Таким образом, в этих экспериментах было подтверждено, что видимый свет умеренной и низкой мощности способен оказывать определенное влияние на свойство и взаимодействие молекул аминокислот в прозрачном растворе. Очевидно, что в данных экспериментальных условиях этот эффект определялся не столько интенсивностью внешнего источника света, сколько внутренними высоко анизотропными свойствами аминокислот, которые значительно усиливаются в присутствии света и растворителя (в данном случае воды). Например, необычайно высокий дипольный момент, который, например в глицине в 8 раз больше дипольного момента воды, в его димере он становится еще больше (15.5 D для свободной формы глицина и 27.6 D для димера глицина). Высокая исходная анизотропия аминокислот, под воздействием видимого света дополнительно может усиливаться за счет наведенной анизотропии и ориентационного эффекта Керра, в котором поляризованный электромагнитный луч, взаимодействуя с зарядами молекул, инициирует упорядочивание молекул и тем самым усиливает взаимодействие между молекулами, индуцируя образование макроскопических наноразмерных структур, включая зародыши кристаллов. Согласно литературе по такому механизму происходит кристаллизация аминокислот при использовании мощных лазеров. В этом случае кристаллизация включает кавитационный механизм, который предусматривает сильный нагрев среды и уплотнение среды при разрыве пузырьков воздуха, что исключается при использовании непрерывных источников с низкой интенсивностью света. Чтобы оценить нагрев среды при использовании лазерного источника света были проведены эксперименты с помощью тепловизионной установки.

Мы использовали тепловизионную систему с матрицей, работающей в диапазоне длин волн 3-5 мкм с температурной чувствительностью не хуже 0,02°С при скорости регистрации 150 кадров в секунду с пространственным разрешением 320хх240 элементов на кадр. Возможности оптики позволяли регистрировать события с пространственным разрешением до 30 мкм. Уменьшая количество кадров путем накопления сигнала была повышена температурная чувствительность тепловизора до 0. 01 - до 0.005°С, что позволило определить наличие температурных градиентов в среде при прохождении лазерного излучения 633 нм, мощности до 4 мВт.

КЮ 1&6 1« 120 «« ISO 1SS «И1>1

Рис. 19. Температурный профиль по перечному направлению в светящемся трэке. Масштаб: 1 мкм равен 8 рх. По оси абсцисс отложено расстояние в пикселях. По оси ординат-температура в градусах по Цельсию

Было показано, что в растворе лизина концентрацией 1.0 М на пути распространения светового луча длиной волны 633 нм и мощностью 1. 4 мВт в течение 10 минут создается градиент температуры по отношению к неосвещенному раствору величиной менее одной десятой доли

градуса (рис.19). Такой градиент может быть обусловлен механизмами аналогичными тем, что наблюдаются при ориентационном выстраивании в диэлектриках. Наличие же перепадов в параметрах среды (в данном случае температуры), в свою очередь создает согласно литературе предпосылки для проявления таких эффектов как термолинза, самофокусировка, ВКР, каналирование светового луча (рис. 17), изменение показателя преломления, генерация ИК-эмиссии. Природа этого эффекта обусловлена тем, что под действием гауссовой формы светового пучка, нелинейная среда становится оптически неоднородной: в центре пучка, где больше интенсивность, показатель преломления больше, чем для краёв пучка. Это приводит к искажению первоначально плоского волнового фронта и искажениям в среде, в результате которых первоначально однородная среда становится своеобразной объёмной собирающей линзой, создающей концентрацию энергии световой волны. В этих условиях нелинейный показатель преломления нелинейно растёт с увеличением амплитуды поля С:

п-п0 + пнл (|Ер), где

п- показатель преломения среды, п0-линейный показатель преломления среды, нелинейный показатель преломления среды, величина которого меняется пропорционально квадрату напряженности электрического поля. Эти эффекты в обычных материалах наблюдаются при очень высоких мощностях света, в то время как в материалах обладающих высокой оптической нелинейностью, особенно в жидких кристаллах, эти эффекты проявляются на предельно низких мощностях света до 1 мВт и ниже. Согласно литературным данным такие ориентационные эффекты значительно (103 раз) увеличивают напряженности электрических полей внутри нелинейных материалов.

Таким образом, полученные данные показывают, аминокислоты как белки обладают свойствами жидких кристаллов, в которых слабые световые потоки вызывают сильные ориентационные эффекты и структурные перестройки.

С уверенностью можно утверждать следующее:

1. Под действием видимого света заряженные формы аминокислот в растворе вступают в тесное взаимодействие между собой и с молекулами воды, образуя межмолекулярные соединения или сольваты определенного стехиометрического состава.

2. Влияние низкоинтенсивного видимого света на молекулы аминокислот ил_и белковую глобулу, происходит по механизму не прямого фотохимического или теплового воздействия излучения на биомолекулы, а посредством нелинейных взаимодействий, в основе которых лежит высокая нелинейная оптическая активность биологических молекул.

3. Понимание донорно-акцепторных взаимодействий при фотоиндуцированном транспорте зарядов внутри сложных биологических систем требует учета влияния нелинейных взаимодействий и фотоиндуцированных процессов, обусловленных самим белком.

Заключение

В аспекте настоящего исследования существенно подчеркнуть, что рассматриваемые процессы построены на различных по своей природе и свойствам механизмам, вовлеченным в функционирование БР, как впрочем, и всех остальных ретинальных белков. Полученные данные и анализ литературы позволяют высказать предположение, что высокие нелинейные свойства биологических молекул, должны в значительной мере, определять их фотобиологическую активность. Это обстоятельство вытекает, прежде всего, из молекулярной организации пигмент-белкового комплекса, характеризующегося высокой степенью ассимметрии ее структуры и поляризационных свойств. Нетривильность в содержании такого утверждения состоит в том, что нелинейные свойства БР обусловлены не только регинальным хромофорным, но и полярными структурами, существующими или индуцировано возникающими внутри белка, и что эти свойства играют большую роль в условиях низкой освещенности БР. Традиционно предполагали, что

биологическая активность, как например, в бактериродопсине, светом-индуцированной протонной помпы, исключительно связана с поглощением и изомеризации ретиналя вокруг критической двойной связи (в БР - это С13=С14 связь (транс-цис изомеризация)), которая обусловливает все последующие структурные перестройки внутри белковой глобулы, приводящие, в конечном счете к транспорту протона через плазматическую мембрану. Однако, появление фототермальных методов, атомной силовой микроскопии и метода генерации второй гармоники, показало, что структурные изменения происходят как в нативных молекулах БР, так и его аналогах, содержащих неизомеризующиеся формы ретиналя. Более того, накоплены свидетельства того, что ряд других катализируемых видимым светом химических реакций (отличных от тех, что наблюдаются при фотоцикле), сопровождающиеся фотоиндуцированными изменениями белковой конформзции, не связаны с изомеризацией ретиналя. Так же накоплены данные о том, что существует корреляция между структурными перестройками и нелинейной активностью БР. Речь идет о встраивании ретиналя в белковую глобулу в присутствии света или удалении ретиналя из БР в реакции с использованием гидроксиламина. На основе этих доказательств было сделано заключение о том, что в таких случаях белок активируется за счет механизма, который не включает транс-цис изомеризацию. Было высказано новое предположение, что основным механизмом активации белка является первичная делокализация заряда, возникающая в возбужденном состоянии хромофора, которое в значительной степени подкреплялось теоретическими данными. Эти данные послужили тому, что в настоящее время, наряду с рассмотренной выше изомеризационной моделью первичных процессов, существует гипотеза, в которой в качестве альтернативного механизма проявления функциональной активности БР рассматривают светом-индуцированное разделение зарядов в ретинальном хромофоре. Однако согласно представлениям, высказанным в обоих этих гипотезах, активность белка-это вторичный процесс, обусловленный первичным поглощением света ретиналем. Обнаруженные в настоящей работе факты показали, что белок в отсутствие поглощения может напрямую активироваться видимым светом. Согласно полученным данным активация может включать ряд нелинейных механизмов, среди которых мы выделяем ориентационный, и механизм, связанный с генерацией стимулированного ИК-излучения. Анализ литературы показал, что эти процессы внутри БР происходят на временной шкале реакции изомеризации. Эти выводы несколько неожиданны при традиционном рассмотрении, согласно которому нелинейные оптические эффекты связывают с высоко интенсивными электромагнитными полями, как правило, только внешних, мощных источников лазерного излучения. В то же время, уже накоплен достаточный материал со свидетельством того, что нелинейные оптические эффекты возникают в условиях низкой освещенности в таких материалах, как жидкие кристаллы (ЖК). Сильная кубическая нелинейность в жидких кристаллах обусловлена их высоко анизотропными свойствами и ориентационными взаимодействиями между молекулами, которые значительно усиливаются в присутствии внешних электромагнитных полей. При взаимодействии со светом в ЖК возникают высокие напряженности электрических полей, которые на несколько порядков превышают таковые в обычных материалах. Аналогия, которую мы проводим между мембранными белками и жидкими кристаллами вполне уместна, поскольку это является давно установленным фактом. Это подтвердили наши модельные эксперименты с лизиновой и глициновой аминокислотами. Мы полагаем, что подобное жидким кристаллам свойство БР является ключевым для проявления его функциональной активности. В этом случае свет может выступать в роли кофактора в процессе транспорта протона, вызывая перераспределение зарядов, и тем самым, инициируя функционально-важные конформационные перестройки в протон-переносящем канале внутри белковой глобулы. Такие реорганизации, в свою очередь, могут сильно влиять на энергию и кинетику процесса переноса заряда за счет модулированного действия движущих сил и энергии реорганизации.

Таким образом, проведенный анализ полученных и литературных данных, дает основание заключить, что ориентационные механизмы и нелинейные эффекты в белках ключевым образом определяют их функциональную активность.

В проведенной работе видится и практический аспект проблемы - в создании искусственных нелинейных материалов и возможности их фотоуправляемого поведения.

Выводы

1. Разработаны и применены подходы к изучению фотоиндуцированных процессов в фоторецепторном белке бактериородопсине на основе спектральной техники ИК-Фурье спектроскопии, оптической адсорбционной спектроскопии, спектрофлуориметрии и оптической микроскопии и модельных соединений ретиналя и аминокислотных образцов.

2. Предложен метод оптического детектирования светом-индуцированных процессов в жидких образцах с временным и пространственным разрешением.

3. Впервые исследованы спектральные характеристики ИК-изучения образцов модельного изомера полносгью-транс ретиналя и [.-лизина монохлорида при релаксации колебательно-возбужденных репортерных групп.

4. Впервые исследована генерация ИК-эмиссии в жидких и твердых образцах Ь-лизина монохлорида и глицина при воздействии видимым светом умеренной мощности.

5. Впервые экспериментально показана высокая чувствительность конформации 1,-лизина монохлорида и глицина при воздействии видимым светом умеренной мощности.

6. Впервые выявлены и спектрально охарактеризованы излучающие в среднем ИК-диапазоне состояния бактериородопсина

7. Впервые продемонстрирована способность белка излучать ИК-излучение наряду с хромофорным ретиналем.

8. Определена природа и молекулярные механизмы светом индуцированной ИК- эмиссии в модельных системах полностью-транс изомера ретиналя и образцах Ь-лизина монохлорида и глицина при воздействии видимым светом умеренной мощности.

9. Впервые продемонстрированы высокие нелинейные оптические свойства растворов образцах (.-лизина монохлорида и глицина при создании волноводных структур под действием видимого света умеренной низкой мощности.

10. Впервые с помощью тепловизионных измерений исследованы температурные параметры среды и их основные свойства, и показана их роль в наблюдаемых эффектах.

11. На примере бактериородопсина и модельных соединений полностю-транс ретиналя и аминокислот Ь-лизина монохлорида и глицина разработан общий подход к изучению влияния фотоиндуцированных процессов на структуру фотозависимых систем с помощью эмиссионной ИК-фурье спектроскопии, оптической адсорбционной спектроскопии, микрофлуориметрии и оптической микроскопии.

12. Впервые исследованы фотоиндуцированные процессы в бактериородопсине и показана их важная роль при функционировании БР.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

1. Terpugov, E.L., Degtyareva, O.V., FT-IR and Resonance Raman studies of structural changes of bacteriorhodopsin under dehydration Microchim Acta [Suppl.], 1997. -14. - P. 459-461.

2. Терпугов, Е.Л., Висковатых, В.В., Дегтярева, О.В., Фесенко, Е.Е., Исследование структуры ретинального хромофора в бактериородопсине с помощью двулечевой ИК-Фурье спектроскопии. - Биофизика. -1998. - V.43. - Р. 1002-1011.

3. Terpugov, E.L., Degtyareva, O.V., Investigation of thin films using FT-IR emission spectroscopy.-Proc. SPIE. - 2000. - V. 4129. -.P. 97-81.

4. Terpugov, E.L., Degtyareva, O.V., Infrared emission from photoexcited bacteriorhodopsin: studies by FT-IR spectroscopy. - J. Mol. Struct.. - 2001. - No. 565-566. - P. 287-292.

5. Терпугов, Е.Л., Дегтярева, О-В. Инфракрасный колебательный спектр эмиссии лизина возбужденный видимым излучением умеренной мощности. - Письма в ЖЭТФ. - 2001. - т. 73. -вып.6. - С. 320-323. / E.L Terpugov, O.V. Degtyareva, Lysine IR-Emission spectrum excited by moderately intense visible radiation, JBTF Letters, v.73, N 6, pp 282-284,2001.

6. Терпугов, Е.Л., Дегтярева, О.В., Инфракрасные спектры эмиссии бактериородопсина в колебательно-возбужденном состоянии Биохимия (Москва). - 2001. - вып.66. - No. 11. - С. 16281637. /Terpugov E.L., Degtyareva O.V., FTIR emission spectra of bacteriorhodopsin in a vibrational excited state. Biochemistry (Moscow), 2001, v. 66, N11, 2001, pp. 1315-1322.

7. Терпугов, Е.Л, Дегтярева, O.B., Гагаринов, А.Г., Савранский, В.В., Генерация ИК-излучения биологических пленок под воздействием широкополосной оптической накачки. - Краткие сообщения по физике ФИАН. - 2004. - т. 12. - с. 13-22.

8. Горелик, В.С, Дегтярева, О.В., Гагаринов, А.Г., Савранский, В.В., Терпугов, Е.Л., Инфракрасное излучение в монокристалле кальцита, возбуждаемое коротковолновым излучением. Неорганические материалы. - 2006. - Т. 42. - No.11. - С.1369-1373./ V.S. Gorelik, A.G.Gagarinov, O.V. Degtyareva, V.V. Savranskii, E.L. Terpugov Infrared emission of single-crystal calcite under broadband short- wavelength excitation. Inorganic Materials, 2006, Vol. 42. - No 11. - P. 1251-1254.

9. Gagarinov, A.G., Degtyareva, O.V., Khodonov, A.A., Terpugov, E.L., Stimulated infrared emission in all-trans retinal and wild-type bacteriorhodopsin under CW optical pumping: studies by FTIR spectroscopy. Vibrational Spectroscopy. - 2006. - V. 42. - Issue 24. - P. 231-238.

10. Terpugov, E.L., Gagarinov, A.G., Degtyareva, O.V., Khodonov, A.A.- Vibrational motions In photoactive biomolecules such as ail-trans retinal and wild type bacteriorhodopsin: an infrared emission spectroscopic study. - Biochem. Biophys. Acta. Bioenergetics. - 2006. - V.14. - P. 239-240.

11. Терпугов, Е.Л., Дегтярева, О.В., Стимулированное видимым светом инфракрасное излучение в исследовании биомолекул и мембранных комплексов. - Альманах клинической медицины. -2008.-Т. XVII.-№ 1.-С. 98-111.

12. Чудинова, Г.К. Наговицын, И.А. Дегтярева, О.В., Кононов, М.А., Савранский, В.В., Раков, З.Г. Комиссаров, Г.Г., Бионано композиты, включающие бактериородопсин и углеродные нановолокна. Исследование методом атомно - силовой микроскопию - Краткие сообщения по физике ФИАН. - 2008. - №2. - С. 11-21.

13. Дегтярева О.В., Афанасьев В.Н., Хечинашвили Н.Н., Терпугов ЕЛ. Структура и свойства L-лизина монхлорида и глицина в жидкой фазе при воздействии оптическим излучением нзкой интенсивности. Современные проблемы науки и образования. - 2013. - N2 4; URL: http://www.science-education.ru/110-10010/flaTa обращения: 03.09.2013.

Избранные публикации в сборниках

1. Terpugov, E.L., Degtyareva, O.V., IR-emission of bacteriorhodopsin under visible light excitation. 11-th International Conference on Fourier Transform Infrared Spectroscopy.- USA. -1997- P. M. 26.

2. Гагаринов, А.Г., Дегтярева, О.В., Кабанов, А.В., Терпугов, Е.Л., Нелинейные эффекты и инфракрасная эмиссия образцов молекул в умеренно интенсивных полях электромагнитного излучения 13 международная конференция «Математика, компьютер, образование». -Москва-Ижевск. - Издательство R&C Dynamics Р X D.- 2006. - вып. 13. - С. 201.

3. Терпугов, Е.Л., Дегтярева, О. В., Стимулированное видимым светом инфракрасное излучение образов как источник новой информации об их молекулярной структуре и динами и в колебательно- возбужденном состоянии. -XVIII Менделеевский Съезд по общей и прикладной химии. - М. - изд-во Граница. - 2007,-Т. 4. - С. 43.

4. Дегтярева О.В., Терпугова С. Е., Никитин Д.И., Савранский В.В., Терпугов Е.Л., Возможности использования инфракрасной спектроскопии при исследовании биологических объектов и молекулярных клеточных компонентов (ред. В.П.Зинченко, С.С. Колесников. А.В. Бережнов).-2011. - Т. 1,-С. 409-410.

5. Terpugova, S.E., Degtyareva, O.V., Savransky, V.V., Terpugov, E. L., Mlcromachlning of the transparent liquids by use of a low-intense visible light. - 3-ero международный симпозиум "Molecullar photonics" dedicated to academician A.N. Terenin. - 2012. - P. 134.

6. Дегтярева, О.В., Терпугова, С.Е., Савранский, В.В., Терпугов, Е.Л., Новые спектроскопические эффекты аминокислот при воздействии лазерного излучения низкой интенсивности. - 4 съезд биофизиков России. - H. Новгород. - 2012. - Т. 3. - С. 71.

7. Дегтярева, О.В., Афанасьев, B.H., Терпугов Е.Л., Анизотропия и светом наведенная самосборка лизиновой аминокислоты в ненасыщенном водном растворе. - Международная конференция «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (ред. В.П. Зинченко, С.С. Колесников, А.В. Бережное).- 2013.- Т. 1. - С. 20 - 24.

Список цитируемой литературы

1. Bowman, R.W. Optical trapping and binding/ R.W. Bowman, M.J. Padgett// Reg. Prog. Phys. -2013. - Vol. 76. -No. 026401 - P. 1-28.

2. Boldyreva, E. V. Crystalline amino acids - a link between chemistry, materials science and biology // In: Models, Mysteries, and Magic of Molecules (eds. J. C. A. Boeyens, J.F.Ogilvie). - Springer Verlag. -2007.- P. 169.

3. Groma G.I. Resonant optical rectification in bacteriorhodopsin / G. I. Groma, A. Colonna, J.-. Lambry, J. W. Petrich, G. VSrd, M. Joffre, H. Vos. Marten, J.-L. Martin //Proc. Natl. Acad. Scl. U S A. -2004,- Vol.-105.- No.-19.- P. 6888-6893.

4. Groma, G. I. Vibrational motions associated with primary processes in bacteriorhodopsin studied by coherent infrared emission spectroscopy/ I.G. Groma, A. Colonna, J.-L. Martin, H. Vos Marten // Biophys. J. - 2011. - Vol. 100. - No. 6. - 1578-1586.

5. Karu, T. Photobiology of low-power laser effects/T. Karu// Health Phys.-1989.-Vol. 56. - P. 691704.

6. Karu, T. Absorption measurements of a cell monolayer relevant to phototherapy: Reduction of cytochrome с oxidase under near IR radiation/ T. Karu // J. Photochem. Photobiol. 2005,- Vol.81.-P.98-106.

7. Karu, T. Molecular mechanism of the therapeutic effect of low - intensity laser irradiation/ T. Karu// Lasers Life ScL -1988. - Vol. 2. - P. 53-74.

8. Lin, L.T. Preliminary studies of laser-induces thermal emission spectroscopy of condensed phases /L.T. Lin, D. D. Archibald, D. E. Honigs// Appl. Spectrosc. -1988. Vol. 42. -No.3.- P. 477-483.

9. Robinson, J.W. Remote sensing of air pollutants by laser-induced fluorescence-a review /J.W. Robinson, J.D. Dake// Anal. Chim. Acta 1974. - Vol. 71,- No. 2. - P. 277-288.

10. Tsuge, A. Applications of laser-induces thermal emission spectroscopy to various samples / A. Tsuge, Y. Uwamino, T. Ishizuka, // Appl. Spectrosc. 1989. - Vol. 43,- No. 7. - P. 1145-1149.

11. Wang, J. Time-resolved long-lived infrared emission from bacteriorhodopsin during its photocycle/J. Wang, M.A. El-Sayed // Biophys.J.- 2002. - Vol. 83.- No.3 - P. 1589-1594.

Подписано в печать:

28.02.2014

Заказ № 9945 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 vvww.autoreferat.ru

Информация о работе

Дегтярева, Ольга Васильевна
доктора биологических наук
Пущино, 2014
ВАК 03.01.02

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Фотоиндуцированные процессы и их роль в функционировании бактериородопсина ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Фотоиндуцированные процессы и их роль в функционировании бактериородопсина"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Фотоиндуцированные процессы и их роль в функционировании бактериородопсина
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика