Фотогенерация электрических потенциалов и транспорт ионов в мембранах хлоропластов и клетках растений

Булычев, Александр Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Фотогенерация электрических потенциалов и транспорт ионов в мембранах хлоропластов и клетках растений
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Фотогенерация электрических потенциалов и транспорт ионов в мембранах хлоропластов и клетках растений"

Р Г Б ОД

о г июн 1яя7

На правах рукописи УДК 581.132:577355

БУЛЫЧЕВ АЛЕКСАНДР АЛЕКСАНДРОВИЧ

ФОТОГЕНЕРАЦИЯ ЭЛЕКТРИЧЕСКИХ ПОТЕНЦИАЛОВ И ТРАНСПОРТ ИОНОВ В МЕМБРАНАХ ХЛОРОПЛАСГОВ И КЛЕТКАХ РАСТЕНИЙ

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА - 1997

Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН Рубин А. Б.

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор Берестовский Г.Н.

доктор биологических наук Каулен А.Д.

доктор биологических наук Балнокин Ю.В.

Ведущая организация: Институт почвоведения и фотосинтеза РАН

Защита состоится "_"_1997 г. в_на заседании

Диссертационного Совета Д.053.05.53 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899 Москва, Воробьевы горы, Биологический факультет МГУ, кафедра биофизики (Новая ауд.).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан "_"_1997 г.

Ученый секретарь Диссертационнного Совета, доктор биологических наук,

Т.Е. Кренделева профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Хлоропласты зеленых растений осуществляют уникальный процесс фотосинтеза, продуцируя кислород и органические вещества. Фотобиологическая функция хлоропластов, их жизнедеятельность и взаимоотношения с клеткой тесно связаны с мембранными электрохимическими процессами, которые развиваются на нескольких структурных уровнях: в тилакоидах, оболочке хлоропласта и плазматических мембранах клетки.

В тилакоидах происходит первичное разделение зарядов с образованием электрохимического градиента протонов. При этом возникают ионные потоки и меняется ионный состав, что важно для синтеза АТР, регуляции фотосинтеза и связано со структурными перестройками мембранной системы. Оболочка, состоящая из двух мембранных слоев, контролирует обмен с цитозолем (Douce, Joyard, 1990), а также импорт белков, которые синтезируются в виде предшественников в цитоплазме и попадают внутрь по гипотетическим транслокационным порам при участии АТР. Потоки ионов и метаболитов через оболочку хлоропласта лежат в основе ответных электрофизиологических реакций листа и целого растения на смену светового режима. Включение регуляторных механизмов на уровне клетки и плазмалеммы вызывает ориентационные движения хлоропластов, активацию электрогенного Н+ насоса я гиперполяризацию плазмалеммы, что стимулирует накопление К+ в цитоплазме, набухание замыкающих клеток и открывание устьиц.

В настоящее время наиболее очевидна роль мембранных процессов, происходящих в тилакоидных мембранах (ТМ). Энергия света используется на разделение зарядов или теряется в виде тепла и флуоресценции (Кукушкин, Тихонов, 1988). Благодаря векторной организации ЭТЦ, фотоперенос электрона создает в люмене положительный потенциал. Электрохимический градиент Дцн+- с его электрической (Дер) и химической (ДрН) компонентами играет центральную роль в биоэнергетике, так как служит формой запасания энергии, движущей силой для синтеза АТР (Скулачев, 1989) и непосредственно регулирует активность мембранной Н+-АТРазы и ЭТЦ (Graber et al., 1984), Формирование Ацн+ сказывается на плотности поверхностных зарядов ТМ (Barber, 1980), активности реакционных центров (РЦ) фотосистем I и II (Weis, Berry, 1987; Schreiber, Neubauer, 1990), выходе быстрой и замедленной флуоресценции хлорофилла (Vos, 1992).

Фотогенерация электрического потенциала и ионные потоки являются неотъемлемым проявлением фотосинтетической активности, однако электрические процессы изучены недостаточно вследствие методических

трудностей (в частности, малых размеров хлоропластов) и ограничений, присущих косвенным методам их изучения.

Важные успехи достигнуты при встраивании мембранных фрагментов (в основном бактериального происхождения) в модельные мембранные системы (Драчев, 1985), но этот метод почти не использовался для исследования электрогенных систем хлоропластов. Метод, основанный на электрохромизме нативных пигментов (Witt, 1979; Junge, Jackson, 1982; Vredenberg, 1981), дает обширную информацию, однако он применим лишь в сочетании с короткими вспышками. При переходе к секундному диапазону электрохромный сдвиг АА515 перекрывается с сигналами другой природы и теряется в изменениях светорассеяния. Соответственно, невозможно предсказать как меняется мембранный потенциал (МП) в индукционный период фотосинтеза, каков стационарный уровень МП, как зависят эти характеристики от внешних условий и состояния объекта.

Эти вопросы требуют выяснения, поскольку фотогенерация МП отражает и количество активных РЦ и частоту разделения зарядов в электрогенных комплексах. Это важно и потому, что МП связан с проницаемостью мембраны и наличием в мембране электрического поля, которое может влиять на перенос заряда в РЦ и на выход замедленной и быстрой флуоресценции. Мембранный потенциал может оказывать прямое действие на активность Н+-АТРазы и опосредованно влиять на фотосинтетические процессы, вызывая перераспределение ионов между тилакоидами и стромой и цитоплазмой. В связи с этим необходимы прямые методы изучения электрических процессов и мембранных свойств хлоропластов (на уровне тилакоидов и оболочки) и сопряженных транспортных и электрических процессов в интактнон клетке.

Уже в начале этой работы был разработан прямой метод регистрации электрического потенциала ТМ. Преимущества такого подхода связаны с возможностью проводить измерения МП с миллисекундным разрешением как на изолированных пластидах, так и на хлоропластах in situ, измерять в одном опыте МП тилакоидов и плазмалеммы. По временному разрешению прямая регистрация намного превосходит метод, основанный на перераспределении красителей. С другой стороны, метод позволяет применять световые стимулы любой длительности, чем выгодно отличается от сигналов АА515.

Модификации микроэлектродного метода открыли дополнительные возможности для исследования электрогенеза и транспорта ионов в клетках и хлоропластах. Применение рН-микроэлектродов позволяет измерять профили распределения pH в примембранных слоях, а также фотоиндуцированные потоки Н+ на уровне тилакоидов, оболочки пластид и целых клеток. В варианте пэтч-кламп микроэлектродный метод позволяет

смещать потенциал ТМ, что в сочетании с микрофлуориметрией открывает новый подход к изучению функциональной роли МП хлоропластов.

К началу данной работы почти все эти направления еще не были представлены. Оставались спорными вопросы о кинетике изменешш МП в индукционный период и о стационарном уровне МП на свету. Не было ясности в вопросах о природе ионов, транспортируемых между тилакоидами и стромой под действием МП, о роли фотосистем I и II (ФС I и II) в генерации МП. Оставалась нераскрытой роль заряженных редокс медиаторов в электрогенезе и генерации электрохимических градиентов на уровне ТМ. Эти и другие вопросы рассмотрены в данной работе.

Цель и задачи исследования. Основная цель работы заключалась в изучении механизмов фотогенерации электрического потенциала на ТМ в связи с энергетическим сопряжением, трансмембранным переносом электронов и протонов, а также в исследовании ионного обмена в системе хлоропласг-цитоплазма-среда для выяснения процессов, приводящих к трансформации фотостимула в ответную физиологическую реакцию растительной клетки. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Разработать прямые методы измерения фотогенерации потенциала в ТМ хлоропластов; исследовать динамику изменений МП при импульсном и непрерывном освещении в разнообразных условиях, в т.ч., при раздельном функционировании ФС I и ФС II, в условиях энергетического сопряжения и разобщения, модификации индукционных процессов путем темновой адаптации и предварительного освещения.

2. По влиянию ионного состава среды и ионофоров на фотогенерацию МП и транспорт природных и редокс-активных ионов охарактеризовать проводящие системы ТМ; изучить фото- и потенциал-зависимые ионные токи в мембранах тилакоидов и оболочки хлоропласта.

3. Исследовать связь МП с другими фотопроцессами, выявляемыми по флуоресценции хлорофилла а; по эффекту приложенного потенциала на флуоресценцию оценить возможное влияние фотогенерации МП на процессы разделения, стабилизации и рекомбинации зарядов в ФС II.

4. Исследовать светозависимые изменения МП и транспорт протонов в системах с разным уровнем организации (изолированные тилакоиды, целые хлоропласты, капля протоплазмы с интактными пластидами, клетки водорослей, мхов и высших растений) доя выявления электрических и ионных сигналов, осуществляющих связь фотопроцессов в хлоропластах с ответной электрофизиологической реакцией клеток и целого листа зеленых растений.

Научная новизна. Впервые разработаны прямые методы исследования фотогенерации электрического потенциала на фотосинтетичсских мембранах целых хлоропластов. Выявлена зависимость индукционных кривых МП от скорости электронного транспорта и ионной проводимости ТМ. Сформулированы представления о диффузионной и электрогенной составляющих МП, и оценены проводимости ТМ в разных условиях. Показано наличие в индукционной кривой МП задержанного по времени электрогенного компонента, обусловленного фотоактивацией транспорта электронов в области ФС I. С помощью рН-микродатчика прослежена динамика установления Дцн+ в одиночном хлоропласте. Впервые показано усиление и ослабление флуоресценции хлорофилла а при сдвигах МП тилакоидов в положительную и отрицательную стороны, соответственно. Показано, что чувствительность флуоресценции хлорофилла к сдвигам МП изменяется при переходе акцептора ФС II (О) в восстановленное состояние. На клетках мхов, содержащих одиночные крупные хлоропласта, выявлены запускаемые светом потенциалы действия, и изучена их природа. Методом пэтч-кламп впервые измерены ионные токи ТМ, вызываемые короткими вспышками и длительным освещением. Изучены электрические свойства мембран оболочки хлоропластов, и показано влияние МП и физиологически-активных факторов на их проводимость.

Научно-практическая ценность работы. Полученные результаты указывают на важную роль МП при фотосинтезе. Они послужили одним из доказательств хемиосмотической гипотезы энергетического сопряжения и отражены в обзорных и справочных изданиях по фотосинтезу и физиологии растений. Разработанные методы анализа МП и ионных токов ТМ, наряду с микрометодами регистрации трансмембранных потоков Н+ и профиля рН у поверхности клеток и органелл, расширили круг подходов к изучению фотоэлектрических и ионных процессов в мембранных системах и внедрены в ряде отечественных и зарубежных лабораторий. Данные о кинетике индукции МП легли в основу моделирования электрохимических процессов при фотосинтезе. Разработаны мембранные электроды, чувствительные к заряженным редокс-медиаторам, которые выявили трансмембранный перенос редокс-активных катионов при циклическим транспорте электронов, образование градиентов концентрации экзогенного иона и взаимодействие нативных и искусственных транспортных систем. Данные о влиянии МП тилакоидов на флуоресценцию хлорофилла послужили основой для теоретической модели процессов разделения-рекомбинации зарядов во внешнем электрическом поле и подтверждены в ряде лабораторий (Бац й а!.,

1991; Dau, Sauer, 1991). Результаты используются при обучении студентов, отражены в учебных пособиях и практикумах.

Апробация работы. Результаты работы были доложены или представлены на Всесоюзных конференциях по биофизике мембран (Паланга, 1971-1976), Международных биофизических конгрессах (1972, 1975, 1978), Всесоюзном симпозиуме "Структурная лабильность мембран" (Минск, 1974), XII Международном ботаническом конгрессе (Ленинград, 1975), Всесоюзных конференциях по фотоэнергетике растений (1978, 1980), Всесоюзном симпозиуме по ионному транспорту в растениях (Черкассы, 1977), Международном симпозиуме по мембранным рецепторам (Смоленице, ЧССР, 1981), на Первом всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), рабочем совещании по программе "Ионный канал" (Каунас, 1983), Международном совещании по мембранному транспорту в растениях (Прага, 1983), конференции по биологии клетки (Тбилиси, 1985), межуниверситетском семинаре преподавателей кафедр биофизики (Воронеж, 1987), Втором всесоюзном съезде общества физиологов растений (Минск, 1990), научных семинарах кафедры биофизики биологического факультета МГУ и отдела биоэнергетики межфакультетской лаборатории биоорганической химии им. А.Н. Белозерского (1974-1992), на семинаре отдела биоэлектрохимии Института электрохимии РАН (1993), рабочем совещании по липидам и мембранам (Лунтерен, Голландия, 1994), научных семинарах в университете г. Вагенингеи и в центре исследования биомембран и энзимояогии липидов университета г. Утрехт (1994), на международных курсах по биоэнергетике и транспорту ионов в мембранах растительной клетки (Турку, 1994), курсах по биофизике растений (Вагенинген, 1994), X международном конгрессе по фотосинтезу (Монпелье, 1995), на международном совещании по мембранной биоэнергетике (Москва, 1995), международной конференции по биоэнергетике фотосинтеза (Пущино, 1996).

Результаты доложены и обсуждены на специализированном научном семинаре в Московском государственном университете.

Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 90 статьях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, описания объектов и методов исследования, пяти глав с изложением полученных результатов, заключения, выводов и списка литературы из 261 наименования. Работа изложена на 185 страницах, иллюстрирована 4 таблицами и 84 рисунками.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. Основным объектом служили хлоропласты и клетки листьев высшего растения Peperomia metallica и слоевища печеночного мха Anthoceros. Крупные размеры пластид у этих видов (20-50 мкм) облегчают измерения потенциала и тока на ТМ, хотя фототок выявлен и в хлоропласгах других видов. Для получения интактных хлоропластов использовали среды, содержащие буферные смеси с pH 7,5-7,8 (25 мМ трис-НС1, Hepes-KOH и др.), сахара (0,25 М сахароза или 0,3 М сорбит), соли К+ (1-100 мМ) и Mg2+ (0,1-3 мМ) и другие компоненты (фиколл, 25 г/л, БСА и др.). Благодаря крупным размерам, целые пластиды визуально отличимы от поврежденных.

Препараты листа и слоевища помещали в раствор, содержащий 0,1 мМ KCl, 1,0 мМ NaCl, 0,5 мМ Ca(N03>2 и 5 мМ Hepes-KOH. При измерениях pH в микрослоях вблизи клетки и пластид использовали среды без буфера.

Препараты тилакоидов получали из гороха и шпината путем гомогенизации листьев на холоду в буферном растворе (25-50 мМ) с 0,25 М сахарозой и 3 мМ MgCl2- Перед опытом густую суспензию разбавляли до 50 мкг хл/мл. Препараты проявляли фотофосфорилирование, а также фотовыделение и поглощение О2 в присутствии феррицианида и метилвиологена, соответственно.

Модельной системой для исследования хлоропласт-цитоплазменных взаимодействий служила капля протоплазмы с интактными хлоропластами (Свинтицких и др., 1985). Каплю получали из клеток харовых водорослей в среде, сходной по составу с вакуолярным соком (80 мМ KCl, 50 мМ NaCl, 5 мМ СаС12 или аналогичные нитратные соли). Транспорт Н+ в модельной системе изучали на бислойных липидных мембранах, сформировашшх по методу Мюллера из растворов азолектина в декане.

Микроэлектродные измерения. Мембранный потенциал измеряли капиллярными микроэлектродами с временным разрешением 0,1-1 мс в условиях компенсации входной емкости. В методе пэтч-кламп микропипетки заполняли средой выделения (R»10 МОм при [КС1]-50 мМ). Трансмембранные токи измеряли прибором разработки СКВ Пущино, усилителями ЕРС-5 и ЕРС-7 (List, Germany). Сигналы регистрировали на потенциометре и осциллографе или выводили через АЦП на компьютер.

Для регистрации сопротивления хлоропласта командный потенциал Vfj модулировали синусоидальным напряжением (100 Гц, 10 мВ), и измаяли модулированный ток селективным усилителем. Для пропускания тока через мнкрозлектрод (< 100 нА) применяли стабилизатор тока (Purves, 1981). Продолжительность опыта на хлоропласте достигала 3-6 ч.

Фотостимуляция объекта. Однократное разделение зарядов в РЦ вызывали вспышками стробоскопической лампы (t|/2 = 8 мкс), свет от которой поступал к объекту по световоду. Интенсивность постоянного света составляла <500 Вт/м2. Диаметр освещаемого участка меняли от 50 мкм до 1 см (локальное и общее освещение), что обеспечивало раздельное и совместное измерение сдвигов МП на хлоропласте и плазмалемме.

проводили па установке с флуоресцентным микроскопом Люмам И-3. Флуоресценцию хлорофилла возбуждали синим светом через водный фильтр, отделяя ее с помощью скрещенных светофильтров. Флуоресценцию одиночного хлоропласта in situ отделяли от свечения соседних клеток системой встроенных диафрагм.

Фотоиндупированный транспорт ионов (Н+, К+, Mg2+) в суспензиях тилакоицов измеряли селективными электродами. Электроды, чувствительные к ФМС+ и ТМФД+, готовили па основе мембран из ПВХ. Измерения проводили при освещении суспензии красным (^>600 нм), белым -и монохроматическим светом.

Фотоиндуцированные изменения абсорбции напгвных пигментов (А A5i5) и редокс медиаторов измеряли на однолучевом дифференциальном спектрофотометре. Для разделения измерительного и действующего лучей использовали скрещенные светофильтры и систему модуляции лучей.

Ионселективные микроэлектподы готовили из стеклянных капилляров, заполненных сурьмой (рН-электрод), и из селективных стекол (рН-, pNa-, и рК-электроды). Торцевой рН-микродатчик подводили перпендикулярно к поверхности мембран устройством шаговой подачи с шагом 1 мкм.

Скорость фотосинтетического переноса электронов определяли по выделению и поглощению Ог полярографически платиновым электродом в присутствии феррицианида, ТМФД или метилвиологена.

Электропорашпо хлороп ластов в суспензии осуществляли с помощью генератора (Цымбалюк и др., 1989), создающего импульсы поля до 20 кВ/см с длительностью т~1 мс. Для электропорации одиночных пластид использовали металлические микроэлектроды в стеклянной изоляции.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Фотогенерация мембранного потенциала в тилакондах хлорошшетов 1.1. Фотоиндуцировсишый МП: связь с фотосинтезом и градиентом протопоп

Микроэлектродные измерения

Мембранный потенциал неосвещенных изолированных хлоропластов близок к нулю. На свету происходит быстрая генерация МП. В хлоропласгах обоих видов (P. metallica и Anthoceros) МП достигает пика за 20-50 мс

(амплитуда изменений до 120 мВ), претерпевает индукционные переходы и выходит к стационарному уровню 10-25 мВ (Рис. 1). Изменения обратимы и многократно воспроизводятся при сменах светового режима. Индукционные кривые МП в хлоропластах двух видов в основном совпадают, отличаясь в деталях. Например, вторичное нарастание МП выражено слабо у Р. тегаШса и отчетливо у АпЛосегоз.

Зависимости фотогенерации МП от интенсивности и спектрального состава света, температуры, длительности освещения и темповой адаптации свидетельствуют о ее связи с фотосинтетическим транспортом электронов. Световые кривые имеют характерное для фотосинтетических процессов насыщение. Спектр действия фотопотенциала сооответствует спектру поглощения хлорофилла и каротиноидов. Фотопотенциал, генерируемый микросекундными вспышками, был в 2-3 раза меньше уровня пика.

Изменения МП хлоропластов Р. пшаШса при световых экспозициях <100 мс проявляют сходство с изменениями абсорбции листьев этого же растения ДА515, имеющими электрохромную природу. Времена релаксации МП и ДА515 после действия коротких фотостимулов совпадали (т « 90 мс). Высокая скорость фотогенерации МП и сходство с сигналами АА515 подтверждают предположение, что эти изменения МП протекают на ТМ.

В отличие от методов оптической регистрации, электродные измерения непосредственно отражают величину МП и, что наиболее важно, несут уникальную информацию о динамике МП в индукционный период и стационарном уровне МП. В обычных условиях стационарный уровень ниже индукционного пика, однако, при высокой скорости электронного транспорта (устранение фотосинтегаческого контроля разобщителями) этот уровень превосходит величину индукционного пика.

Изменения МП чувствительны к модификациям электронного транспорта. Его стимуляция путем предотвращения образования АрН в присутствии нигерицина или солей ИЩ4" с акцептором (метилвиологен) значительно повышает МП в индукционный период, а обработка диуроном практически устраняет фотогенерацию МП. Фотоответы, подавленные диуроном, восстанавливаются и усиливаются кофакторами ФС I (ФМС, ТМФД, восст. ДХФИФ с метилвиологеном). Дибромтимохинон, ингибитор окисления пластохинона снижал стационарный МП до нуля, уменьшая и индукционный пик МП.

При действии монохроматических лучей выявлено кооперативное участие ФС II и ФС I в генерации МП: фотоответ на возбуждение ФС I дальним красным светом (ДКС) многократно усиливался при чередовании ДКС с лучом А,=640 нм, возбуждающим обе фотосистемы. Индукционный

Время, с

Рис. 1. Фотогенерация мембранного потенциала в изолированны* хлоропластах P. metallica (1) и хлоропластах Anihoceros in situ (2).

Рис. 2. Кинетика изменений МП хлоропласта Р. тешШса после короткой (10 мке) вспышки и ее представление в виде суммы двух компонент (1,2): V = 38,8ехр(-//107)-12,5ехр(-г/14), где размерности V и г—мВ и мс. На вставке показана фаза темпового нарастания МП и ее аппроксимация.

пик МП слабо зависит от температуры в диапазоне 4-35°С, что подтверждает преобладающую роль фотохимических реакций в генерации фотопотенциала.

Измерения методом пэтч-клалт.

Для изучения мембранных свойств и ионных токов хлоропластов впервые применен метод готч-кламп. Метод позволяет получать контролируемый контакт с оболочкой и тилакоидами, проводить измерения в режимах измерения токов и измерения МП. Результаты измерений МП методом пэтч-пииеток соответствуют данным микроэлектродных измерений. На практике этот метод более удобен, т.к. не требует дополнительной пипетки, поддерживающей хлоропласт в момент введения микроэлектрода. Этот метод открывает новые возможности, т.к. позволяет изучать влияние приложенного к ТМ напряжения на фотопроцессы в хлоропласте.

Регистрация электрохимического градиента протонов.

При введении в хлоропласт торцевого рН-микроэлектрода и локализации кончика в люмеиальном объеме микродатчик должен реагировать как на фотогеиерацию МП, так и на закисление внутреннего объема. Действительно, при введении торцевых рН-микроэлектродов с диаметром кончика <1 мкм под действием света регистрировали кинетически сложный сигнал, который интерпретирован как результат сложения быстрых изменений МП и медленного понижения рН внутри тилакоидов на ~1,8 ед.

В присутствии NH4C1, мешающего формированию ДрН, капиллярные и рН-микроэлектроды детектировали фотоиндуцированные сигналы одинаковой формы (т.е. Дер), что подтверждает связь медленного NH4+-чувствителыюго компонента с подкислением в люмене. Так как рН в строме сдвигается меньше чем в люмене, можно считать, что сигнал рН-микроэлектрода отражает динамику формирования Дцц+ на ТМ при освещении. Поскольку рН в тилакоиде понижается при освещении на 1,8 ед., а рН стромы возрастает на 0,4 ед. (Ohmori et al., 1985), получаем оценку ДрН ~ 2,2, что близко к ДрН =2,5, найденному другими авторами по распределению NH4+.

Результаты указывают на то, что стационарный уровень Дцн+ примерно одинаков в контроле и в присутствии NH4+, хотя вклад Дф и ДрН различен. Очевидно, понижение ДрН по действием NH4+ компенсируется, по крайней мере частично, возрастанием Д<р. Это может объяснять слабую чувствительность фотосинтеза интактных хлоропластов к действию NH4C1. Полученные данные соответствуют расчетной кинетике Дрн+> построенной из модели энергетического сопряжения (Van Kooten 1986). В дальнейшем внимание уделено исследованию электрической составляющей Дцн+.

1.2. Мембранный потенциал при коротких вспышках и ионная проницаемость тилакоидов

Характеристика фотогенеращш потенциала

Изменения МП при однократном срабатывании РЦ наиболее удобны для анализа и позволяют оценивать проводимость ТМ. При действии микросекундной вспышки в изменениях МП (Рис. 2) выявляются несколько стадий: (1) быстрая генерация потенциала за время <1 мс, (2) нарастание МП после вспышки в течение 20-50 мс, (3) темновой спад потенциала со временем *1/2 50-100 мс, обусловленный пассивным переносом ионов. Аналогичные стадии присутствуют и в изменениях АА515 (Эскк, \Vhitmarsh, 1982; ЛоНо^ .1о1ю1:, 1985). Потенциал, вызываемый вспышкой составляет 30-40 мВ.

Кинетика изменений МП после вспышки аппроксимируется суммой двух компонент, имеющих разные времена нарастания и одинаковые времена релаксации (~100 мс). Компоненты с фронтом нарастания <1 мс и 20-50 мс отражают соответственно разделение зарядов в РЦ и медленное темновое разделение зарядов, предположительно в реакциях <3-цикла (Рис. 2). Эти компоненты описываются уравнениями: ^(г) = Дехр(-г/ г,) и К2(г) = А,схр(-г / г,)-Л2ехр(-£/ г2) соответственно, где Т|-постоянная времени темнового спада, т2-постоянная времени генерации медленной компоненты.

Аналогичные компоненты присутствуют в фототоке, измеряемом методом пэтч-кламп. Отрицательный знак тока обозначает направление тока в пипетку. Площади над кривыми соответствуют количествам зарядов, перенесенных в РЦ и в цитохромном комплексе. Доля медленной компоненты в суммарном переносе заряда при вспышке составляет от 30 до 50%. Медленная компонента лабильна и видна не во всех пластидах, что связано с вариабельностью работы <2-цикла.

Темновой спад потенциала как показатель проводимости мембраны

Постоянная времени т темнового спада МП совпадает с постоянной времени мембраны ЯС, которую можно найти, пропуская импульс постоянного тока через пэтч-пипетку. По скорости темнового спада МП можно судить о проводимости мембраны дт в различных условиях. Т.к. емкость биомембран Ст ~1 мкФ^см2, можно проводить количественные оценки сопротивления (Лт) и проводимости ТМ: т = ЯтСт = Ст

Эта интерпретация подтверждена в опытах с ионофорами и средами различного ионного состава. Повышение проводимости ТМ путем внесения К^-ионофора (валиномицин) и нарастающих количеств К.4" приводило к ускорению спада МП и снижению х от ~ 100 до 5-7 мс (Табл. 1).

В присутствии валиномицина и 50-100 мМ К+ значения т совпадают с расчетами по формуле т= НТСт !РгРкск, где Я, и Т - газовая постоянная,

число Фарадея и температура, Р/с-4 Ю-7 см/с- проницаемость ТМ для К+ в присутствии валиномицина, а ск - концентрация К+ в строме и тилакоидах, предположительно равная уровню К.+ в среде.

Табл. I. Постоянные времени спада МП хлоропласта после вспышки при различных концентрациях КС1 в среде (в скобках указано число опытов)

Высокая чувствительность скорости релаксации МП к действию ионофора показывает, что электрическая утечка незначительна и не искажает измеряемые характеристики ТМ. Изменение концентрации К+ и Mg2+ в отсутствие ионофоров не оказывало влиния на времена релаксации х, что объясняется низкой проницаемостью мембранной оболочки хлоропласта для катионов и относительным постоянством ионного состава стромы. Изменение смё от 0,1 до 10 мМ на фоне 1 мМ КС1 в присутствии Mg2+-ионофора А23187 (10 мкМ) понижало х от 108 до 42 мс, соответственно.

Преобладание калиевой проводимости в темповом состоянии.

Так как в интактном хлоропласте с^~100 мМ выше уровня других ионов, К+ вероятно вносит основной вклад в проводимость ТМ и выходит на свету из тилакоидов в обмен на поступление Н+. Выход К+ при освещении действительно наблюдается в суспензиях хлоропластов Nitella и шпината. Времена релаксации МП после вспышки (т я 100 мс) у хлоропластов Peperomia, соответствуют расчетам по формуле г-RTCmlF2PKcK с взятыми из литературы данными о =4 Ю-8 см/с. Очевидно, в ТМ неосвещенных хлоропластов доминирует К"1" проводимость.

Этот вывод подтверждается данными о присутствии К+-каналов во фрагментах ТМ, встроенных в липидный бислой (Tester, Blatt, 1989), и в набухших тилакоидах - блебах (Pottosin, Schonknecht, 1996). Проводимость Са2+-, Mg2+- и С1_-капалов в реконструированной системе значительно меньше чем у К+-каналов, даже при аномально высоких (60-80 мМ) концентрациях Са2+ и Mg2+ (Enz et al., 1993). В ТМ присутствуют также С1~ каналы (Schonknecht et al., 1988), однако, вклад С1~-проводимости в

[КС11 мМ Время релаксации т (мс)

без добавок +0,2 мкМ вал.

1 88 + 22(15) 30 ±6 (7)

10 91 ±32(18) 20 ±9 (6)

50 84 ±24 (6) 14 ±2 (6)

100 78 + 32(10) 7 ± 3 (6)

интактном хлоропласте вероятно намного меньше, чей в блебах вследствие низкого (1-4 мМ) уровня cq (Stevenink et al., 1988).

Повышение H+ проводимости под действием света

Освещение хлоропластов (10 с) приводило к ускорению спада МП после вспышки, что может отражать возрастание Непроводимости в связи с почти 1000-кратным повышением внутренней концентрации Н+ при освещении. Проводимость ТМ Anthoceros при переходе темнота-свет возрастала от 20 до 40 мкСм/см2, т.е. светозависимая Непроводимость составляет 20 мкСм/см2. Обработка Anthoceros ингибитором Н+-АТРазы дициклогексилкарбодиимидом (ДЦКД, 50 мкМ) устраняла зависимость времени релаксации потенциала т от предварительного освещения. Очевидно, светозависимая проводимость связана с Н+-АТРазой и обусловлена переносом Н+ через CF0-CF j.

Данные об относительном содержании Э'ГЦ и CF0-CFi и плотности расположения ЭТЦ в ТМ (0,1 пмоль Р700/см2) позволяют оценить плотность расположения Н+-АТРаз в ТМ, и по значению светозависимой ДЦКД-чувствительной проводимости рассчитать проводимость одиночного комплекса CFo-CFj. Это значение усредненной по времени проводимости составляет ~1 фСм. При Дцц+, эквивалентном 200 мВ (АрН =3 и Дф=20 мВ), поток через CF0-CFi составит около 1200 Н+/с, что при стехиометрии Н+ : АТР = 3:1 соответствует реальной скорости синтеза АТР~400 с-1. Близкое значение Непроводимости CF0-CFi получено при реконструкции АТРазы хлоропластов в липидном бислое (Wagner et al., 1989).

1.3. Электрогенная и диффузионная составляющие МП

При освещении МП нарастает от уровня потенциала одиночной вспышки (ср0) до пика, в 2-3 раза выше q>0. Последующее торможение активности РЦ в сочетании с пассивными потоками ионов понижает МП к стационарному уровню. Изменения МП в индукционный период определяются соотношением скоростей зарядки мембраны за счет разделения зарядов в РЦ и других электрогенных стадий, а также скоростью переноса заряда пассивными потоками: dVldt=I 1Ст, где dV- изменение потенциала за время dt, Ст - мембранная емкость, а / - трансмембранный ток, создаваемый фотосистемами, потоком Н+ через АТРазный комплекс и диффузионными потоками Н+, К+, Mg2+ и С1\

Фапюиндуцированпые потоки К+ и Mg~ +

В суспензиях тилакоидов светозависимое поглощение Н+ связано с выходом К+ и Mg2+ и котранспортом Cl", причем потоки К+ и Mgz+

определяются содержанием этих катионов в среде. При концентрациях К+ и 0,5 и 0,1 мМ в среду поступает -40 нмоль/мг хл. катионов какого вида. При высоком отношении (50 мМ / 1 мМ) преобладает поток К+, а

при низком - выход В нативном хлоропласте уровень сщ в строме (<3

мМ) намного меньше (-100 мМ); поэтому светозависимый поток М22+ меньше потока К4", хотя и достаточен для активации цикла фиксации СС>2-Варьирующий вклад К+- и 1^2+-потоков в компенсацию заряда Н+ может объясняться низкой селективностью катионных каналов ТМ (Роиояп, 1996).

Фотоиндуцированные потоки К+ и Mg2+ в изолированных хлорспластах изменяют направление под действием индукторов К+/Н+ и обмена. В присутствии нигерицина (индуктор К+/Н+ обмена) свет вызывает поглощение К+, а при индукции Mg2+/H+ обмена ионофором А23187 освещение приводит к поглощению из среды Мц2+. Разобщающее действие А23187 и нигерицина проявляется в подавлении светового поглощения Н+ и ускорении фотопереноса электронов.

Ответы МП на выключение света

Стационарный уровень МП складывается из: (1) электрогенной компоненты, которая непосредственно связана с фотопереносом электронов, и (2) диффузионного потенциала, который обусловлен созданием неравномерного распределения Н+ и других ионов в освещенном хлоропласте. При переходе свет-темнота электрогенный перенос электронов прекращается, и на ТМ временно устанавливается потенциал, обусловленный диффузией ионов (Рис. 1, 3). Диссипация ионных градиентов сопровождается исчезновением диффузионного потенциала.

Эти процессы описываются моделью мозаичной мембраны, в которой имеются генераторы тока и участки пассивной проводимости. Эквивалентная схема включает параллельно соединенные э.д.с. насоса Ер и диффузионный путь с сопротивлении мембраны Ят и э.д.с. У^ В стационарном состоянии в цепи протекает круговой ток 1, определяемый скоростью электрогенного переноса электронов; при этом МП равен У^ +1Ят (диффузионная и электрогенная компоненты, соответственно). При выключении света МП быстро сдвигается на величину злектрогенной составляющей Шт к уровню диффузионного потенциала У^.

Изложенные представления основаны на опытах с ионофорами. В норме переход свет-темнота индуцирует отрицательный диффузионный потенциал (см. рис. 1). Этот потенциал не проявляется в присутствии нигерицина, который препятствует образованию ДрН, и исчезает после обработки хлоропластов ДЦКД, который блокирует Непроводимость сопрягающего фактора. Очевидно этот потенциал обусловлен диффузией Н+

Рис. 3. Диффузионная (У^) и электрогенная (Уе) составляющие МП в освещенных хлоропласгах Р. тегаШса. (а) Положительный диффузионный потенциал, создаваемый в присутствии валиномицина и 10 мМ К+; (б) стимуляция элекгрогенной составляющей под действием ионофора А23187, индуцирующего электронейтральный М02+/Н+ обмен.

Рис. 4. Задержанная активация электрогенного транспорта в хлоропласгах Аыкосего$ после предварительной темповой адаптации, (а, б) Изменения МП, вызываемые первым (1) и повторным (2) освещением с интервалом (а) 20 с и (б) 30 с; (в) корреляция вторичного нарастания МП (1) с фазой тушения флуоресценции хлорофилла (2).

из тилакоидов. Следует отметить, что вследствие большого числа буферных групп и высокой скорости реакций протонирования-депротонирования концентрация свободных протонов в тилакоиде определена с высокой точностью (-1%), т.е. понятие pH к тилакоидам применимо (Junge, 1989).

Положительный диффузионный потенциал наблюдается, например, при обработке хлоропластов К+ионофором (валиномицин) на фоне 1-10 мМ К.+. В этом случае при генерации потенциала сказываются преобладающая К+-проводимость ТМ и возникающий на свету К+-градиент, имеющий встречную по сравнению с градиентом протонов направленность (Рис. 3).

Модификация электрогенной составляющей МП ионофорами

Амплитуда сдвига МП при выключении света пропорциональна скорости транспорта электронов, и обратно пропорциональна проводимости TM: Ve~I Rm=l/gm- Валиномицин понижает амплитуду быстрого темнового сдвига МП, т.к. значительно повышает gm. Ионофоры нигерицин и А23187, индуцируя электронейтральный Н+/К+ и H+/Mg2+ обмен, повышают амплитуду сдвига. Электрогенная компонента в этих условиях повышена в связи с ускорением транспорта электронов при неизменном уровне gm.

Понижение мембранной проводимости

Предсказания модели модели мозаичной мембраны выполняются и при понижении проводимости ТМ. Значительное снижение gm достигается при замене воды в качестве растворителя на D2O. В этих условиях постоянная времени т темнового спада МП возрастает в 2-3 раза, достигая 220 мс. О снижении gm свидетельствует и более высокий уровень МП в индукционный период, отмечаемый в средах с D2O.

Хотя уровень МП в индукционный период в средах с D2O был выше, чем в средах с Н2О, потенциал, создаваемый вспышкой, отличался меньшей амплитудой. Это свидетельствует о снижении эффективности разделения зарядов в РЦ при изотопном замещении.

1.4. Сравнительная эффективность фотосистем в фотогенерации МП

Согласно принятым представлениям (Witt, 1979), разделения зарядов в ФС I и ФС II вносят равный вклад электрическое поле на ТМ. Однако, не исключено, что электрохимические градиенты, генерируемые ФС I и ФС И, не являются в равной мере делокализованными, а энергизованное состояние, создаваемое активностью ФС I и ФС II, имеет различную природу (Dilley, Prochaska, 1978; Крендеяева, Тулбу, 1981). В связи с этим, мы исследовали фотогенерацию МП при раздельной работе ФС I и ФС II в присутствии ингибиторов и кофакторов электронного транспорта.

Сочетание диурона, восст. дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ) и оксалоацетата обеспечивало работу ФС I, а комбинация дибромтимохинона с окисленным п-фенилендиамином поддерживала активность ФС И. Типичные результаты представлены в табл. 2.

Табл. 2. Параметры МП хлоропластов Р. тешШса в контроле, в присутствии 10 мкМ диурона, 0.1 мМ восст. ДХФИФ и 0.1 мМ оксалоацетата (ФС I), а также в среде с 10 мкМ дибромтимохинона и 0.1 мМ п-фенилендиамнна (ФС II).

При действии вспышек МП, связанный с ФС II был примерно вдвое меньше, чем фотопотенциал, генерируемый ФС I. Активность ФС II в условиях постоянного освещения приводила к медленному нарастанию МП От = 90 мс). В отличие от этого, при работе ФС I на непрерывном свету нарастание МП было быстрым (11/2 = 6 мс). Это указывает на более низкую квантовую эффективность фотогенерации МП в ФС II по сравнению с ФС I.

Низкая электрогенная активность ФС II выявлена и в работе е\. а1. (1987) с помощью макроэлектродов методом светового градиента. Авторы не обнаружили электрогенного эффекта ФС II в нативных хлоропластах, однако электрогеиные свойства ФС II появлялись после набухания тилакоидов. По мнению авторов, в нашвной системе возбужденыс состояния быстро перераспределяются по всей поверхности тилакоида, что нивелирует эффект светового градиента. Однако, аналогия с нашими данными склоняет нас к предположению о разной электрогенной эффективности ФС I и ФС II.

Периодическая импульсная фотостимуляция хлоропласта с частотой 5 Гц в условиях работы ФС II индуцировала ответы одинаковой амплитуды, что указывает на отсутствие прямой связи между величиной фотопотеициала и Б-состояниями 02-выдешоощего комплекса. Этот факт может означать, что протоны, освобождаемые при окислении воды не участвуют в формировании делокализованного МП. Вероятно, что протоны, получаемые из воды, удерживаются в особых внутримембранных доменах и не обмениваются с Н+ тилакоидного объема (ОШеу й а1., 1982). Об этом говорит и отсутствие корреляции между периодичностью выделения Н+ Ог-выделяющим комплексом и амплитудой изменений АА515 (Г)с1пеи, Кове^аг«!, 1993).

Контроль ФС 1, ФСИ,

п=15 п=6 п=6

Потенциал Д<р 32 ±4 14 + 4 6±1

при вспышке, мВ

Время нарастания И ±6 6 ± 2 90+17

11/7, мс

Стационарный 19 + 8 24+5 52+10

уровень Лф, мВ

1.5. Задержанная фотоактивация тектрогенного транспорта электронов

Различная кинетика МП у темпоадаптированных и предосеещенных пластид

Опыты с Anthoceros выявили разный ход индукционных изменений МП у хлоропластов, адаптированных к темноте, и пластид, подвергнутых короткому (1с) освещению. Первое освещение после темновой адаптации вызывало ответ с двумя пиками потенциала, достигаемыми через 20 и 500 мс от момента включения света (Рис. 4). При повторном освещении (через 5-120 с) второй максимум МП смещался в сторону первого, иногда накладываясь на него. Задержанный пик МЛ характерен лишь для интактных хлоропластов, и не выявляется по АА515 на препаратах ТМ. Кинетику изменений МП можно представить в виде суммы двх компонент. Развитие второй компоненты начинается после продолжительного лаг-периода в темноадаптированных пластидах, но длительность задержки сокращается после предварительного освещения.

Различия в кинетике изменений МП у темноадаптированных и предосвещенных хлоропластов исчезают под действием ингибитора Н+-АТРазы ДЦКД. В этих условиях задержанный пик МП не проявлялся. Эти факты указывают на связь второго пика МП с изменениями Н+-АТРазы при ее переходе на свету в активное состояние. Известно, что для активации Н+-АТРазы необходимо восстановление переносчиков в акцепторной части ФС I; с другой стороны восстановление акцепторов ФС I активирует ФС I-зависимый перенос электронов (Satoh, 1981). Очевидно, второй пик МП связан либо с резким ускорением транспорта электронов на уровне ФС I после некоторого лаг-периода, либо с АТР-зависимым электрогенным переносом Н+ после активации Н+-АТРазы.

Параллельные измерения МП и флуоресценции хлорофилла

Связь задержанного пика МП с фотоактивацией ФС 1-зависимого электронного транспорта подтверждена одновременными измерениями МП и флуоресценции отдельных хлоропластов. При коротких световых экспозициях изменения флуоресценции отражают редокс-состояние акцептора Q ФС II, которое определяется балансом между восстановлением и окислением Q фотосистемами II и I (Карапетян, 1977; Krause, Weis 1991). Индукционные кривые флуоресценции Anthoceros содержат все характерные стадии (OPMS переходы). При освещении происходит сильное тушение флуоресценции от пика Р к стационарному уровню S. Этот переход, связаный с формированием АрН за время ~20 с, немонотонен. В интервале ~2 с происходит переход от пика Р через локальный минимум S1 к вторичному максимуму или "плечу" М, называемый PSj переходом (Satoh, 1982).

Первое освещение после темповой адаптации вызывает изменения МП с двумя максимумами и изменения флуоресценции с выраженным РБ1 переходом (Рис. 4в). Начало вторичного нарастания МП совпадает по времени с началом стадии РБр При повторном освещении после короткого темнового интервала в индукционной кривой МП второй пик отсутствовал, а в изменениях флуоресценции исчезала стадия временного уменьшения РЯ].

Корреляция второго пика потенциала со стадией Р8[ при варьировании световых условий и при действии химических агентов (дибромтимохинон, дитионит) свидетельствуют о том, что задержанный пик МП обусловлен активацией электрогенного транспорта электронов в области ФСI (предположительно на уровне ферредоксин-МАЛЗР-редуктазы) после лаг периода около 200 мс. Активация переноса электронов в области ФС I, сопряженная с транслокацией Н+, приводит к возрастанию МП и, параллельно, к реокислеиию <3 и уменьшению флуоресценции РЭ1.

2. Влияние мембранного потенциала на флуоресценцию хлоропласта и разделение зарядов в ФС II в электрическом поле

Результаты первого раздела показывают, что ТМ осуществляет свои функции в сильном (-107 В/м) меняющемся во времени электрическом поле, которое обусловлено совместной активностью двух фотосистем. Поле оказывает влияние на процессы переноса заряда через мембраны, и вероятно может влиять на разделение и рекомбинацию зарядов в РЦ (Вопкоу е1 а1., 1980). В зависимости от ориентации, электрическое поле может стабилизировать или дестабилизировать состояние с разделенными зарядами.

В связи с этим были изучены изменения флуоресценции одиночных хлоропластов, вызываемые внешним электрическим полем и сдвигами МП при пропускании тока через микроэлектрод. Выявлены электроиндуцируемые изменения флуоресценции двух типов: (1) необратимые изменения, связанные с разрушением мембран оболочки под действием электрического поля, и (2) обратимые изменения, обусловленные смещением потенциала на ТМ.

2.1. Электроетимулируемое разрушение оболочки хлоропласта

Изменения флуоресценции одиночных хлоропластов

В случае воздействия электрополя на сферические везикулы на полюсах индуцируется МП, величина которого зависит от напряженности Е и радиуса везикул Я: Ут - \.5ЛЕ .При действии внешнего поля на пластиды Р. тешШса наиболее сильный сдвиг МП происходит на мембранах оболочки. Это вызвано большими различиями в размерах тилакоидов и целого хлоропласта.

Импульсы поля напряженностью <1 кВ/см не оказывали влияния на флуоресценцию хлорофилла, а при напряженности >2 кВ/см вызывали

плавное (за время 1-10 с) необратимое повышение свечения, сопровождаемое набуханием хлоропласта. Изменения составляли 20-80% от исходного уровня флуоресценции и зависели от ориентации хлоропласта в световом луче. Необратимое возрастание флуоресценции вызвано набуханием и изменением оптических свойств пластид при электростимулируемом повреждении мембран оболочки. При набухании хлорофилл распределяется на большей площади, что приводит к более равномерному освещению объекта, меньшему взаимоэкранированию пигментов и большему поглощению света. Изменения МП и сдвиги рН в примембранном слое

Нарушение барьерных свойств оболочки после электроимпульса проявляется по изменениям МП и сдвигу рН вблизи отдельных хлоропластов. Набуханию соответствовал плавный сдвиг МП в положительную сторону и последующий сброс МП, связанный очевидно с разрывом мембран оболочки.

Воздействие повреждающего электроимпульса приводило к быстрому временному сдвигу рН у поверхности хлоропласта в связи с облегчением обмена Н+ между стромой и средой. Электропорация мембран не вызывала сдвига рН в примембрашых слоях среды лишь при отсутствии ДрН на мембранах оболочки. Основанный на этом метод нулевого сдвига рН был применен для определения рН стромы хлоропластов при фотосинтезе и его инактивации. Установлено, что освещение приводит к повышению рН в строме хлоропластов до рН 8,1, а ингибирование фотосинтеза диуроном значительно понижает рН стромы.

Импульсы электрического поля могут быть использованы для избирательного повреждения и изучения механической стабильности мембран оболочки. Электроиндуцируемое набухание пластид вызвано нарушением осмотического равновесия между стромой и средой после образования во внутреннем слое оболочки долгоживущих пор, проницаемых для ионов и сахарозы. По этим порам сахароза диффундирует в хлоропласт, что влечет движение воды, осмотическое набухание и разрушение оболочки.

2.2. Электроиндуцируемые изменения флуоресценции тилтоидов

Выход флуоресценции ФС II изменяется под влиянием внешнего электрического поля (МаЪш^ й а1., 1983), но интерпретация эффектов осложнена тем, что МП, индуцируемые на разных сторонах везикулы, имеют противоположную полярность. Этой проблемы не возникает при сдвигах МП путем пропускания тока через микроэлектрод, введенный в тилакоиды.

Создание внутри тилакоида положительного МП (при пропускании тока выходящего направления) усиливало, а приложение отрицательного потенциала ослабляло флуоресценцию (Рис. 5). Электроиндуцируемые

изменения флуоресценции подавлялись грамицидином D, т.к. повышение проводимости мембран снижает МП, создаваемый пропусканием тока.

В контрольных условиях на ярком свету флуоресценция возрастает на 5 -10% при пропускании через хлоропласт выходящего тока силой 30 нА и снижается примерно на равную величину при токе противоположной полярности. Время нарастания и спада сигналов флуоресценции соответствует постоянной времени RC тилакоидной мембраны (т~100 мс).

В присутствии диуропа (полное восстановление Q при освещении) положительное смещение МП не оказывало влияния на уровень свечения, а отрицательное смещение МП вызывало сильное уменьшение флуоресценции.

Для поддержания Q в преимущественно окисленном состоянии на свету применяли гидроксиламш! с метилвиологеном; при этом тормозится перенос электронов в донорной части ФС II и активируется окисление Q за счет ФС I. В этих условиях положительные сдвиги МП вызывали сильное увеличение флуоресценции, а отрицательные сдвиги МП оказывали слабое действие.

Таким образом, изменения флуоресценции, вызываемые на ярком свету током разной полярности, примерно симметричны в контроле, но становятся асимметричными как при восстановлении, так и окислении Q. Эти выводы подтверждены в работе Dau, Sauer (1991), которые смещали МП методом создания солевого градиента в непрерывном потоке. Подтверждено возрастание флуоресценции ФС II при положительных сдвигах МП и се уменьшение при отрицательных МП, а также изменение чувствительности флуоресценции к МП по мере восстановления Q.

Приложение импульсов ~1 В к цепи, включающей только электрод и хлоропласт, вызывало сдвиги флуоресценции амплитудой до 10%. Из соотношения сопротивлений в этой цепи следует, что изменения свечения вызваны смещениями МП <0,3-0,4 В. В опытах с хлоропластами Р. metallica изменения свечения -1% наблюдали при внешнем напряжении 250 мВ. Следовательно смещения потенциала на ТМ -100 мВ достаточны для воздействия на выход флуоресценции.

2.3. Модель потенциалозатсимых изменений флуоресценции

Модель потенциалозависимых изменений флуоресценции хлорофилла ФС II основана на схеме процессов фоторазделения и рекомбинации зарядов в ФС II (Климов, 1986) и в ряде положений сходна с моделью обратимой радикальной пары, используемой в работах Dau, Sauer (1991, 1992).

Влияние МП объясняется изменением соотношения констант прямого и обратного переноса электронов между Р680* и феофитином, а также изменением вероятности безызлучательной рекомбинации восстановленного

0.05

0.4 С

0.3 с

Рис. 5. Изменения флуоресценции хлоропласта АпЛосегох при пропускании импульсов тока через микроэлектрод, (а) Изменения флуоресценции (Р), вызываемые биполярными импульсами напряжения (У=1 В); отклонения V вниз соответствуют приложению отрицательного напряжения к люмену; (б) изменения флоуоресценшш, вызываемые током в присутствии диурона; сигналы флуоресценции 1 и 2 вызваны первым и повторными импульсами тока (I); отклонение тока вниз (входящий ток) соответствует сдвигу МП в отрицательную сторону. Стрелками отмечены моменты включения света.

Разность потенциалов, мВ

1,5 с

Рис. 6. Расчетные зависимости выхода флуоресценции от разности потенциалов на участке мембраны между Р680 и феофитином при разной степени восстановления акцептора О: (1) 8=0, <3 полностью восстановлен; (2) 0=0,1; (3) 6=0,5; (4) 6=1 (<3 полностью окислен).

Рис. 7. Параллельные изменения флуоресценции (1) и МП (2) одиночного хлоропласта в присутствии гидроксиламина (2 мМ) и ФМС с аскорбатом.

феофитана с окисленным Р680. Исходное положение состоит в том, что в РЦ, получивших энергию кванта, достигается быстрое уравновешивание состояний Р680+ Фео~ и Р680*. При равновесии вероятности состояний Р680+Фео- и Р680*, обозначаемые х и у, связаны соотношением x/y = exp(-(v~ у0)), где y/=<pFIRT - безразмерная разность потенциалов на расстоянии между Р680 и феофитаном, а у0- разность феднеточечных редокс-потенциалов Р680 и феофишна в безразмерных единицах.

В этой модели вероятности дезактивации состояния Р680+ Фео~ в РЦ и обратного ухода кванта в антенну пропорциональны равновесным концентрациям Р680+ Фео~ и Р680*. В этом случае выход флуоресценции может быть описан выражением

Ф» = кф, !{кф> + к? ^^Лв*)

^ N у N у

где кфл - константа скорости флуоресценции, кт - константа безызлучательных потерь в антенне, к' и к" - константы скорости распада состояния Р680+Фео~ за счет безызлучательной рекомбинации и образования триплетного состояния Р680+ соответственно, fcg - константа скорости переноса электрона на хинонный акцептор Q, в - доля окисленных молекул акцептора Q, а N - число молекул хлорофилла, приходящихся на один РЦ. Приведенные уравнения качественно описывают зависимость выхода

флуоресценции от МП при разной степени восстановления Q.

Максимальный выход флуоресценции ]1(\ + к'р/кфл) достигается при

полном восстановлении Q (6=0) и высоких значениях МП (у-*°о). На рис. 6 представлены зависимости относительного выхода флуоресценции Ф' = Ффл! Ффлмаксот разности электрических потенциалов на участке ТМ,

рассчитанные для случая ^7дг=3-108 с-1, k'+k"=5-108 с"1, icq =10'° с"', N=100 и разности среднеточечных потенциалов Р680 и феофитина, равной 0,1 В, при разной степени восстановления Q (0=1 при полном окислении Q и 0=0 при полном восстановлении Q).

Расчетные кривые имеют S-образньш вид и отражают закономерности, выявляемые в эксперименте. В случаях, когда выход флуоресценции занимает промежуточный уровень, смещения МП положительной и отрицательной полярности должны вызывать увеличение и уменьшение флуоресценции примерно равной амплитуды. При высоком уровне флуоресценции положительный сдвиг МП не должен оказывать влияния на выход свечения, а отрицательный сдвиг МП должен сопровождаться тушением флуоресценции.

Судя по наклону расчетных кривых, сдвиг флуоресценции AF ~ 20% происходит при смещении напряжения на 10 мВ на участке мембраны между

Р680 и феофитином. При расстоянии между Р680 и Фео «0,2 от толщины диэлектрического слоя ТМ, наклон соответствует AF ~ 4% при сдвиге МП на 10 мВ. Этот результат сравним с чувствительностью к МП стадии первичного разделения зарядов (сдвиг на 6% при смещении потенциала на 10 мВ по данным Dau, Sauer, 1992). По другим оценкам, выход флуоресценции меняется на 5,4% при сдвиге МП на 10 мВ (Dau et al., 1991).

Более шикая чувствительность флуоресценции к МП в нашей модели по сравнению с имеющимися в литературе данными, возможно отражает потенциалозависимость переноса электрона от Фео на акцептор Q. Поэтому модель может быть дополнена в предположении, что перенос электрона с Фео на Q сопряжен с преодолением активационного барьера высотой ~0,1 эВ, т.е. константа скорости восстановления Q является потенциалзависимой.

Фотопндуцировашшй МП представляется достаточным, чтобы влиять на процессы захвата возбуждений и стабилизации зарядов в ФСII. Очевидно, изменения МП в индукционный период следует отнести к числу факторов, влияющих на кинетику флуоресценции в интактных хлоропластах.

2.4 Влияние фотоиндуцировшиюго МП на флуоресценцию

Чтобы выявить влияние природного МП на флуоресценцию были измерены индукционные кривые свечения в условиях с низким и высоким фотоиндуцированным МП, причем уровень пика МП регулировали, воздействуя на активность ФС I. Состояние с низким МП создавали с помощью гидроксиламина, подавляющего донорную часть ФС IJ. Переход к состоянию с высоким МП осуществляли путем стимуляции циклического потока электронов при добавке ФМС и аскорбата; влияние ДрН исключали путем добавления ионофора А23187 (индуктор H+/Mg2+ обмена). При этом обнаружили параллелизм между изменениями МП и флуоресценции (Рис. 7).

Добавка ФМС приводила к возрастанию пикового значения МП (от ~ 15 до 80-160 мВ) и амплитуды изменений свечения. В ходе освещения выход флуоресценции возрастал (изменения AF/F » 15%) и снижался, повторяя ход индукционной кривой МП. Поскольку в этих опытах активность ФС II заторможена, представляется вероятным, что быстрое возрастание флуоресценции в начальный период освещения было вызвано не восстановлением Q, а фотогенерацией МП.

По этим опытам можно оценить чувствительность флуоресценции к сдвигам МП (AF -10% при сдвиге МП на 100 мВ). Таким образом, сложная кинетика изменений флуоресценции хлорофилла в листьях может быть частично связана с влиянием МП на выход свечения.

3. Образование электрохимических градиентов на ТМ как результат фотонидуцнронанного транспорта заряженных рсдокс медиаторов

Фотосинтетический транспорт электронов включает редокс реакции, связанные с присоединением и освобождением Н+ на границах раздела мембрана-раствор. В реакциях окисления-восстановления на границах раздела могут участвовать и другие ионы, в частности катиошше редокс медиаторы, такие как ФМС и ТМФД (Prince et al., 1981). Восстанавливаясь на внешней стороне ТМ, они теряют заряд, и переходят в липофильную форму. Разная локализация окисленной (гидрофильной) и восстановленной форм создает условия для искусственного циклического транспорта электронов.

Можно ожидать, что восстановление и окисление медиатора на разных сторонах мембраны должно приводить к транслокации заряженного медиатора из внешней среды внутрь тилакоида. В этом случае транспорт электронов должен быть сопряжен с образованием трансмембранных градиентов ФМС+ или ТМФД+, которые могут взаимодействовать с Н+ насосом и включаться в регуляцию электронного транспорта.

3.1. Светозависимый электрогенный транспорт ФМС*

Редокс-медиатор ФМС стимулирует электронный транспорт и фотофосфорилирование, повышает изменения МП в хлоропласгах до 150 мВ. Установлено, что при циклическом потоке электронов в ФМС-содержащих системах происходит не только перенос Н+, но и активный транспорт катиона ФМС+. Одновременная работа двух ионных насосов на ТМ модифицирует светозависимые ионные потоки, электрогенез и энергетическое сопряжение, объясняет ранее неясные побочные действия медиаторов (подавление фотофосфорилирования высокими концентрациями медиатора, обращение направления фотоиндуцированных потоков Н+ и др.). Вывод о фотогенерации электрохимического градиента ФМС"1" на фотосинтетической мембране при действии света основан на ряде экспериментальных доказательств.

(1) Разработаны мембранные селективные электроды, чувствительные к ФМС+; с их помощью показано быстрое уменьшение наружной концентрации ФМС+ в суспензиях хлоропластов при освещении. Убыль [ФМС+] в препаратах, обработанных диуроном отражает поглощение ФМС+ тилакоидами, т. к. восстановленная форма медиатора в этих условиях не накапливается. Поглощение ФМС+, измеряемое электродами, кинетически совпадает с фотовыцветанием ФМС+, измеряемым по ДА3(;>!. Поглощение ФМС+ не связано напрямую с образованием ДрН на ТМ и сохраняется в присутствии грамицидина D, исключающего образование ДрН. Кроме того поглощение Н+и ФМС+ существенно различаются по оптимуму рН.

(2) Обработка хлорошастов одиночным импульсом электрического поля (=10 кВ/см) в целях необратимой элскггропорации и разрушения тилакоидов подавляет фотоиндуцировщшые изменения [ФМС+], причем повреждающее дейстие поля выражено на осмотически набухших везикулах и не проявляется в средах высокой тоничности. Очевидно, значительная часть поглощения ФМС+ под действием света обусловлена накоплением ФМС+ в свободном виде внутри тилакоидов. Воздействие повреждающего электроимпульса во время освещения приводит к повышению [ФМС+] в среде, вероятно вследствие утечки ФМС+ из поврежденных тилакоидов.

(3) Образование трансмембранного градиента [ФМС+1 проявляется по изменениям МП при переходе свет-темнота. Как показано в 1.3, выключение света выявляет диффузионный МП, отражающий ио1шые градиенты. В контроле этот МП обусловлен диффузией Н+ из тилакоидов и подавляется нигерицином. Последующая добавка диурона и ФМС восстанавливает отрицательный постсветовой МП, который в данном случае очевидно вызван диффузией ФМС+ по градиенту, созданному светозависимым насосом.

При измерениях тока методом пэтч-кламп в присутствии диурона, ФМС и нигерицина после выключения света наблюдается выходящий ток, что соответствует данным о накоплении ФМС+ в тилакоидах на свету и диффузии ФМС+ наружу в последующий темновой период.

Фотоиндуцированный транспорт ФМС+ сходен по механизму с транспортом Н+ и основан на пространственном разделении стадий окисления и восстановления медиатора. Восстановление ФМС происходит на внешней стороне ТМ и сопровождается переходом медиатора из воды в мембрану. Окисление нейтральной липофильной формы происходит на внутренней стороне ТМ; образующийся при этом ФМС+ поступает в люмен.

Активный светозависимый транспорт ФМС+ изменяет соотношение электрической и химической компонент Дцц+ в пользу повышения А<р. Образование на ТМ электрохимического градиента ФМС+, сходного с Ацн+, объясняет высокую устойчивость ФМС-зависимого фосфорилирования к протонофорам и другие черты искусственных энергосопрягающих систем.

3.2. Фотоиндуцированный транспорт ТМФД+

Взаимодействия ТМФД с ТМ при освещении изучены с помощью ТМФД+-элекггродов, электропорации мембран, микроэлектродных измерений МП и регистрации токов при фиксации потенциала. Освещение суспензии хлоропластов сопровождается убылью концентрации ТМФД+ в среде. Изменения, регистрируемые ТМФД+-электродом, сходны с изменениями абсорбции ТМФД+ (ДА5бо)- Одновременные измерения сдвигов [ГМФД+] в суспензиях хлоропластов, динамики выделения и поглощения О2,

а также изменений рН при освещении показывают, что в начале освещения ТМФД+ служит акцептором в реакции Хилла. Образующаяся при этом восстановленная (липофильная) форма ТМФД накапливается в ТМ.

При длительном (~Ю с) освещении выделение 02 прекращается и сменяется его поглощением. Очевидно ири этом включается процесс реокисления ТМФД фотосистемой I, а конечным акцептором становится 02. Реокисление сопровождается образованием ТМФД+ у внутренней поверхности ТМ, переходом этого катиона в люмен и образованием градиента Дцтмфд-

Модификация реакций ТМФД в процессе освехцения

На двухстадийность фотовзаимодействий ТМФД с ТМ указывает резкое различие во временах релаксации [ГМФД+] после коротких (~3 с) и длительных (>30 с) световых экспозиций. Восстановление уровня [ТМФД+] после короткого освещения происходит за десятки минут, а после длительного - менее чем за 30 с. Обработка ТМ цианидом, действующем между ФС II и ФС I, устраняла быструю релаксацию [ГМФД+1 после 30-с освещения. Аналогичные светозависимые изменашя [ТМФД"1"] с медленной темновой релаксацией наблюдались и на частицах ФС II. Очевидно, медленная релаксация [ГМФД+] отражает реокисление восстановленного медиатора, а быстрая релаксация вызывана диффузией ТМФД+ из люмена и служит показателем накопления этого катиона внутри тилакоидов.

Присутствие в среде NII4"1", который препятствует образованию ДрН, устраняло быструю темновую релаксацию [ТМФД+1, а последующее подавление ФС II диуроном, напротив, приводило к резкому сокращению времени релаксации [ГМФД+1. Очевидно, накопление ТМФД+ в люмене может происходить лишь при торможении редокс реакций пластохинона градиентом рН или ингибиторами.

Циклический транспорт электронов

Установлено, что ТМФД способен поддерживать перенос электронов при подавлении ФС II диуроном. Это проявляется по снижению [ГМФД+] при освещении. Устойчивые к диурону изменения ¡ТМФД+] наблюдаются и при действии ДКС (?.> 700 нм), поглощаемого только ФС I.

Обработка тилакоидов импульсами злектрополя не оказывала влияния на фотоиндуцированные Л[ТМФД+] в отсутствие диурона, но подавляла их в присутствии диурона (эффект электропорации). Очевидно, в присутствии диурона и ТМФД функционирует циклический транспорт электронов, сопряженный с переносом ТМФД+ в люмен. Существование циклического

Рис. 8. Схема взаимодействий редокс медиаторов (ТМФД, ФМС) с тилакоидной мембраной. М+0 и — окисленная форма медиатора снаружи и внутри тилакоидов; Мт — восстановленная (липофильная) форма. Схема отражает альтернативные пути переноса электрона между ФС II и ФС I (нативный путь с пластохиноном и перенос при участии редокс медиатора), накопление М+ в люмене, а также диффузию М+ из тштакоида в среду (к4).

я, я,

Рис. 9. (а) Фототоки ТМ, возбуждаемые короткой (10 мкс) вспышкой при напряжениях фиксации У^ЗО мВ (1), О мВ (2) и -30 мВ (3). Сдвиг вниз соответствует входящему току; в среде присутствует 20 нМ нигерицин;; (б) схема измерительной конфигурации; (в) эквивалентная электрическая схема ТМ при измерениях фототока. Объяснения в тексте.

транспорта, катализируемого ТМФД в присутствии диурона, обнаружено также при анализе флуоресценции хлорофилла (Braun et al., 1992).

Обнаруженная стимуляция циклического потока электронов после подавления нециклического потока диуроном соответствует аналогичным закономерностям дня ферредоксин-зависимого циклического транспорта и циклического фотофосфорилирования (Hosler, Yokum, 1987).

На схеме взаимодействий медиатора с ТМ (Рис. 8) показаны стадии восстановления ТМФД в области ФС II и ФС I (константы скорости kj\ik3, соответственно), окисление ТМФД фотосистемой I (к2), а также утечка катиона из люмена (к4). Реакция переноса электронов к ФС I (к2) способна замещать окисление пластохинона лишь при подавлении восстановления пластохинона диуроном или торможении окисления пластохинона градиентом pH.

4. Изучение проводимости мембран хлоропласта методом пэтч-кламп

Сведения о ионпроводящих системах мембран оболочки и ТМ хлоропласта долгое время оставались скудными. Попытки реконструкции проводящих систем ТМ и оболочки пластид в модельных мембранах (Schwartz et al., 1994), выявили существование К+-каналов в TM (Tester, Blatt, 1989; Fang et al., 1995) и во внутренней мембране оболочки (Mi, Berkowitz, 1995). Вместе с тем, полный анализ невозможен без исследования интактных систем. В этом отношении перспективен метод локальной регистрации ионных токов, примененный для изучения проводимости фотосинтешческих и поверхностных мембран хлоропластов (Bulychev et al., 1992; Pottosin 1992). 4.1. Потенциалзависимая проводимость мембран оболочки

Мембраны оболочки составляют лишь малую часть (<1%) в общей массе мембран хлоропласта. Они легко разрушаются при осмотическом набухании пластид и под действием электрического поля (раздел 2.2). В отличие от ТМ, мембраны оболочки не проявляют спектральных изменений электрохромной природы. Их проводящие свойства представляют интерес в связи с уникальным липидным составом оболочки, наличием особых транспортных систем во внутренней и внешней мембранах, а также в связи с импортом белков из цитоплазмы.

При контакте пипетки с внешней мембраной хлоропласта (конфигурация "хлоропласт прикреплен") гигаомные контакты наблюдали в -10% отведений; чаще R контакта составляло 40-200 МОм. Освещение не оказывало прямого влияния на мембранный ток, что подтверждает контакт лишь с мембранами оболочки. Вольт-амперная характеристика (ВАХ) оболочки в интервале напряжений фиксации Vj, ±75 мВ имела вогнутую форму, что свидетельствует о потенциалозависимых свойствах оболочки.

Сходные результаты получены на изолировшшом (inside-out) фрагменте оболочки и при измерим«х R на переменном токе.

При измерениях ВАХ в режиме сканирования Vjj с периодом 10 с выявлен гистерезис токовых кривых, который обусловлен относительно медленными (~1 с) переходами между состояниями с разной проводимостью. Кинетика переходов прослежена при ступенчатых сдвигах Vh_

Дополнительный импульс низкого давления приводил к 3-5-кратному снижению R объекта и изменению ВАХ от вогнутой к выпуклой форме. Очевидно, изменение формы ВАХ вызвано разрывом мембраны в торце пипетки и переходом к конфигурации "целый хлоропласт". Флуоресцентный зонд люциферовый желтый, который не проникает из пипетки в неповрежденный хлоропласт, начинал окрашивать его после импульса давления.

Форма ВАХ в разных конфигурациях указывает на низкую проводимость мембранной оболочки при положительном потенциале стромы и возрастание проводимости в отрицательной области. Потенциалзависимое повышение проводимости может играть функциональную роль, т.к. открывание катиошшх каналов при отрицательных потенциалах может обеспечить накопление Са^+ в сгроме хлоропласта при освещении (Kreimer et al., 1985) и понижение активности Са^4" в цитоплазме (Miller, Sanders, 1987).

4.2. Проводимость оболочки хлоропласта при импорте белков

Около 90% хлоропластных белков синтезируется в цитоплазме в виде белков-предшественников, которые транспортируются внутрь при участии АТР-зависимых стадий связывания и транслокации (De Boer, Weisbeek, 1991). В сортировке и транслокации белков важную роль играет N-концевой сегмент белка-предшественника (транзитный пептид). Предполагают, что проникновение белка через оболочку связано с открыванием особых пор, что может приводить к изменениям проводимости оболочки.

Мы измеряли R оболочки в конфигурации "целый хлоропласт" при добавлении в среду предшественника ферредоксина (pFd), мутантного pFd, лишенного 7 аминокислот в транзитной последовательности (A7-pFd), а также транзитного пептида. Препараты белков и транзитного пептида были получены в Центре исследования биомембран и знзимологии липидов Утрехтского университета (Pilon, 1992). Известно, что A7-pFd, в отличие от pFd, не проникает в хлоропласты.

Добавление в среду pFd (0,75 мкг/мл) вызывало уменьшение R на 3540% в течение 15 мин после непродолжительной лаг-фазы, а внесение в среду мутантного предшественника (A7-pFd) не оказывало заметного влияния.

Эти опыты говорят о специфичности эффекта рИё и необходимости полной транзитной последовательности для повышения проводимости мембран оболочки. Добавление транзитного пептида, который, включаясь в механизм транслокации белков, связывается с мембранами, по не поступает в строму, также вызывало повышение проводимости, несколько меньшее чем при действии рРс1. На наш взгляд, повышение проводимости отражает движение ионов через структуры, участвующие в транслокации бедка. Считая, что число мест транслокации и транслокационных пор в расчете на хлоропласт составляет -1000 (Кее^га, 1989), находим, что проводимость одиночной поры составляет около 10 пСм.

4.3. Фотоиндуцированные ионные токи тияакоидных мембран

Фотоиндуцированные токн ТМ изучали в конфигурации "целый тилакоид". В этом случае пипетка контактирует с ТМ (в кончик втягивается часть ламедлярной системы), а при действии света регистрируется быстрый входящий ток с амплитудой около 300 пА. После индукционного пика ток спадает к стационарному уровню =50 пА. При переходе из режима фиксации напряжения к фиксации тока регистрируются фотопотенциалы, аналогичные ответам, измеряемым микроэлектродами. Следовательно, кончик пипетки в данной конфигурации контактирует с тилакоидным объемом, что позволяет измерять токн, протекающие через ТМ. На рис. 9а (кривая 2) показан фототек вызываемый вспышкой. Эквивалентная схема

Схема конфигурации показана на рис. 96, в. Мембрана, затягиваемая в пипетку, вследствие деформации разрывается или повышает проводимость, что обеспечивает доступ к внутреннему объему тилакоидов. Схема включает сопротивление и емкость (С'м) ТМ, сопротивления электрода и утечки (ЯТ и Л^, а также сопротивление доступа Их (сопротивление латерального пути протекания тока в системе связанных тилакоидов). Цепочка сопротивлений Км, Я1 и Лх образует делитель, в результате чего измеряемый фотопотенциал меньше чем напряжение на обкладках конденсатора См.

Параметры схемы могут быть рассчитаны по экспериментам трех типов: (а) измерения падений напряжения на Л пипетки с хлоропластом и без него при пропускании импульсов тока; (б) кинетика релаксации потенциала после вспышки; (в) кинетика релаксации сигнала АА515 после вспышки. Площадь тшакоидной мембраны

Стационарный уровень фототока позволяет рассчитать площадь ТМ, с которой происходит сбор тока. Если плотность расположения ЭТЦ в ТМ равна 10 13 моль Р700 см-2, а константа скорости переноса электронов между ФС II и ФС I составляет 50 с1, то прн стехиометрии Н+ / е- = 2, расчетная

плотность тока составит I мкА/см2. Из сравнения с измеряемым уровнем тока (50 пА) следует, что площадь тилакоида составляет -5-10~5 см2.

Площадь ГМ можно оценить и по интегралу тока, вызываемого короткой вспышкой. Согласно рабочей модели, смещение заряда при вспышке составляет 2-10~& Кл/см2. По данным опыта смещенный заряд <3 равен {)« т-/гаах, где -с - время релаксации тока, а /тах - пиковое значение тока. При х >10 мс и 1тах = 100 пА, смещенный заряд составит >Ш"12 Кл. Сравнивая расчет с опытом, находим площадь ТМ (£5-10~5 см2). Так как найденная обоими способами площадь ТМ намного превышает размеры одиночных тидакоидов, следует заключить, что в нативном хлоропласте тилакоиды объединены в общую мембранную сеть.

4.4. Влияние потенциала на фототек; фэтоиндуцированные изменения сопротивления хлоропласта

Сдвиги напряжения фиксации обычно оказывают слабое влияние на фототок, вызываемый вспышками и длительным освещением, но это влияние усиливается в присутствии 10-100 нМ нигерицина. Кинетические кривые тока (Рис. 9) можно представить в виде суммы двух компонент, одна из которых слабо зависит от МП, а вторая (медленная) меняет знак при У^ г 0 мВ. Медленный компонент можно легко найти методом вычитания фототоков, измеренных при У^-О и

В эквивалентной схеме присутствуют два источника тока: командное напряжение У^ и заряжаемая при вспышке емкость ТМ. Темновой ток, создаваемый зависит от суммарного Я объекта и должен меняться при изменении Я. Из опытов следует, что медленный компонент тока с потенциалом реверсии «0 мВ обусловлен возрастанием Л при действии света.

Вляние света на сопротивление хлоропласта

Измерения на переменном токе показали, что освещение хлоропласта в присутствии 10-100 нМ нигерицина действительно приводит к возрастанию Я на 20-85%. Эффект обратим и проявляется при разных Уь, в том числе при нуле, когда медленная компонента в токовых кривых не видна. При вспышке Я возрастает на 0,5-3%. Фотоиндуцированные изменения Я (проводимости), усиливаются нигерицином и подавляются валиномицином.

Вычитание фототоков, измеряемых при разных У},, позволяет следить за динамикой проводимости (#) хлоропласта. Разностная кривая, полученная методом вычитания токов, совпадает в первом приближении с изменениями g, измеряемыми на переменном токе селективным усилителем. Метод вычитания токов обеспечивает лучшее временное разрешение, но он основан на ряде допущений, которые строго выполняются лишь при малых ДУь-

Поскольку светозависимые изменения R чувствительны к действию ионофоров, они вероятно отражают изменения в мембранной системе

Так как RKf под действием света уменьшается (Graber et al., 1981), то повышение R при освещении вызвано скорее всего возрастанием Rx в связи с индукцией на свету К+/Н+ обмена, который понижает уровень К+ в межталакоидных зазорах. Валиномицин устраняет изменения R, т.к. при совместном действии обоих ионофоров перераспределения К+ под действием света не происходит.

4.5. Явление активации фототока

Для проверки роли АрН в светозависимых изменениях R использовали NH4CI, который, подобно нигерицину, препятствует образованию АрН и накоплению Н+ в люмене, но отличается по механизму действия. В присутствии NH4+ и акцепторов при вместо обычного спада фототока в период освещения, происходит увеличение фототока до высокого стационарного уровня (Рис. 10а). Нарастание фототока не сопровождалось повышением Я хлоропласта. Очевидно, что светозависимые изменения R в присутствии нигеринина не связаны напрямую с подавлением ДрН.

Присутствие NH^ меняет зависимость фототока от предварительного освещения. Повторное освещение вызывает ответ большей, а не меньшей амплитуды, т.е. количество зарядов, переносимых за единицу времени, возрастает. Это связано не с возрастанием частоты электрогенных процессов, а с повышением эдекгрогенцой эффективности однократного возбуждения РЦ. Как видно из Рис. 106, в присутствии ЫН44" предварительное освещение усиливает ответы на вспышку и сокращает время релаксации тока т. Время т снижалось после 1-е предосвещения примерно вдвое, что свидетельствует об уменьшении сопротивления, через которое разряжается емкость Ст.

Обработка аммонием не оказывает сходного действия на ДА515 (Peters et al., 1984). По-видимому, оптический и микроэлектродный методы регистрации электрических процессов в хлоропласте различаются по чувствительности к изменениям латерального сопротивления Ry-

"Фотоактивация тока" объясняется тем, что в присутствии NH4+ па свету уменьшается Ry в связи с фотоиндуцированным набуханием тилакоидов. По аналогии с изменениями кабельных свойств узкой мембранной трубки, в освещенном хлоропласте при снижении R% возрастает площадь мембранной поверхности, с которой происходит стекание тока в пипетку. Набухание связано с накоплением в люмене NIl4+ и подтверждается данными электронной микроскопии.

С другой стороны, не исключено, что в ТМ существуют латентные РЦ, которые мобилизуются при освещении и других воздействиях (Thomas et

нА 0.1 0.0 -0.1 -0.2 -0.3 -0.4 -0.5 -0.6 -0.7

3 с

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 с

Рис. 10. Фотоакгивация тока ТМ. (а) Фототоки, вызываемые двумя световыми импульсами в контроле с 50 мМ КС1 (1) и в присутствии 50 мМ ЫН4С1 (2); (б) стимуляция токового ответа на вспышку после 1-е освещения хлоропласта в присутствии 50 мМ ЫН4С1.

Ю 15 20 1,0

ТМ оболочка (разобщителю Л ппазмалеыыа I понижают [АТР^ц \

АТР.« ДВР

АТР,

[ нстилвнологен: I повышает [АТТ^ц

АОР^У

н'

Рис. П. Запускаемые светом изменения мембранного потенциала клеток АпЖосегоя при общем освещении препарата (1) и освещении одной клетки (2); стрелки отмечают начало и конец освещения.

Рис. 12. Схема процессов лежащих в основе триггерных электрических ответов клетки на действие света (объяснения в тексте).

al., 1986; Chow et al., 1991;). Вопрос о роли структурных перестроек и латентных РЦ в фотоактивации ионных токов требует дальнейшего изучения.

5.Связь фотопроцессов в хлоропласте с изменениями МП и транспортом ионов в целых клетках

5.1. Влияние света па мембранный потенциал клеток растений

Фотоперенос электронов по ЭТЦ, генерация Л<р и ЛрН на ТМ приводят через промежуточные этапы к изменениям МП плазмалеммы и тонопласта. В действии фотосинтетически активного света на МП растительных клеток выделяют две стадии разной природы. В клетках харовых водорослей деполяризация развивается в течение ~1 мин после включения света. Эта стадия связана с подкислением вакуолярного сока при электрогешюм транспорте Н+ через тонопласт (Андрианов и др., 1971). Подкисленне вакуолей при освещении, выявленное нами с помощью рН-микроэлектродов, детектируется и рН-чувствптелъным флуоресцентным зондом на клетках С3 растений (Yin et al, 1990; 1996). Деполяризация клеток связана с повышением рН цитоплазмы (Юрин и др., 1991) и возрастанием проводимости плазмалеммы. Для развития гиперполяризации требуется длительное освещение ~0,5 ч, активирующее Н+-насос плазмалеммы (Vredenberg, 1974; Бобров и др., 1979; Волков, 1981). Фотоиндуцированные изменения МП не проявляются в ризоидных клетках Nitella, лишенных хлоропластов.

Измерения МП клеток P. metallica при действии света показали, что в клетках высшего растения фотоиндуцированные изменения МП сходны с ответной реакцией харовых водорослей. О связи индуцированной деполяризации с фотосинтезом свидетельствуют ее подавление диуроном и охлаждением, а также неаддитивное стимулирующее действие двух спектрально различных световых лучей (640 и 715 нм).

Влияние света на обмен протонов между хлоропластами и цитоплазмой Микроэлектродные измерения рН у поверхности одиночного хлоропласта P. metallica выявили начальное повышение рН среды при освещении и последующее его снижение. Это указывает на временное повышение рН цитоплазмы (рНц) и роль изменений рНц в фоторегуляции транспортных систем плазмалеммы. Стадии роста и снижения рН отличаются по чувствительности к ингибиторам. Светозависимое повышение рНц выявлено на клетках Nitella с помощью микроэлектродов (Юрин и соавт., 1991), а также на листьях высших растений методом флуоресцентных зондов (Yin et al., 1990). Наряду с изменениями рНц, у Nitella отмечено понижение активности Са2+" при освещении (Miller, Sanders, 1987), но изменения в уровне Са2+ запаздывают по сравнению с изменениями МП.

Предполагают, что уровень pH цитозоля регулирует активность Н+-насоса плазмалеммы, а изменение уровня управляет состоянием ее К+ каналов (Vanselow, Hansen, 1989). Повышение уровня Са^+ в цитоплазме активирует С1~ каналы плазмалеммы (Lunevsky et ab, 1983).

5.Z Светозависимый транспорт Н* и изменения МП в капле протоплазмы

Удобным модельным объектом для исследования взаимодействий между хлоропластами, цитоплазмой и клеточной мембраной при действии света служит капля протоплазмы харовых водорослей (Свинтицких и др., 1985). В таких каплях размером до 300 мкм примерно половина объема занята интактными хлоропластами. По сравнению с клетками капля обладает рядом преимуществ: (1) отсутствие клеточной стенки, (2) возможность вводить в цитоплазму несколько микроэлектродов, в том числе ионспецифичные, (3) близкая к сферической форма капель, (4) возможность микроинъекции.

Мембранный потенциал капель в растворе, подобном вакуолярному соку, варьирует от -10 до -60 мВ и меняется при действии света. При pH 7-9 свет вызывает начальную деполяризацию и последующую реполяризацию мембраны. Светозависимые изменения МП подавлялись диуроном и восстанавливались при добавлении ФМС. Таким образом, на капле моделируется связанный с фотосинтезом механизм воздействия света на трансмембранный потенциал поверхностной мембраны.

Величина рНц в капле составила около 7,7, как и в клетках харовых водорослей (Mimura, Kirino, 1984). Освещение сопровождалось понижением pH у поверхности капли и в цитоплазме на 0,05-0,2 ед. Кислотный сдвиг рНц при освещении зависел от целостности капли и хлоропластов: после повреждения капли светозависимое понижение рНц сменялось обратимым возрастанием pH, типичным для препаратов ТМ.

Как показано в разделе 3.2, катион ФМС+ транспортируется при энершзации ТМ в люмен по механизму, сходному с Н+ насосом. Опыты на капле выявили дальнейшую аналогию в перераспределении Н+ и ФМС+ в препаратах целых и разрушенных хлоропластов. При освещении капель в присутствии ФМС концентрация ФМС+ в среде и цитоплазме возрастала, а после повреждения капель (путем интенсивного перемешивания суспензии) освещение приводило к убыли [ФМС+] в среде.

Аналогия в перераспределении Н+ и ФМС+ между компартментами капли и внешней средой позволяет предположить, что снижение рНц на свету при одновременном поглощении Н+ тилакоидами объясняется особой структурной организацией хлоропласта, а именно, наличием ограниченных контактов между тилакоидами и внешним окружением пластид (Heber, Heidt, 1981). Такие регулируемые контакты могут защищать ТМ от чрезмерной

энергизации. В соответствии с этой схемой, устранение ДрН на ТМ аммонием или протонофорами действительно подавляло светозависимое снижение рНц, а понижение Н*" проводимости ТМ под действием диэтилстилбестрола или ДЦКД усиливало изменешм рН в микрослоях среды у поверхности капли.

Полученные результаты говорят о том, что интактные хлоропласты, в отличие от разрушенных, способны понижать рН окружающей среды при освещении. На одиночных пластидах Ререготы при освещении также регистрируется стадия понижения рН, которая подавляется протонофором КХФ и ионами ЫН4+ и нечувствительна к действию ДЦКД.

Исследования на модельной системе (капля с хлоропластами) выявили тесную связь фотоиндуцированных изменений МП с транспортом Н+ между хлоропластами и цитоплазмой и переносом Н*1" через плазматические мембраны. Это позволяет обсуждать природу светозависимых изменений МП, роль Н+-АТРазы плазмалеммы, а также изменений рН цитоплазмы и Непроводимости плазмалеммы в электрогенезе.

5.3. Запускаемые светом триггерные электрические ответы

Исследования фоторегуляции МП у растений разных систематических групп (пресноводные и морские водоросли, мхи и высшие растения) показали, что наряду с градуальными изменениями МП, поглощение света хлоропластами вызывает у некоторых видов быстрые регенеративные изменения, сходные с потенциалами действия (Рис. 11). Освещение АмИосегоз индуцирует быструю деполяризацию клеток, амплитуда которой возрастает с длительностью стимула в интервале от 0,1 до 3 с и слабо меняется в интервале >3 с. Деполяризации предшествует латентный период длительностью ~2 с, причем изменения МП развиваются практически одинаково как на свету, так и в темноте после инициирующего фотостимула.

Экспериментальное разделение сигналов клетки и хлоропласта

При измерениях МП в сложной системе необходимо разделять ответы хлоропласта и кпетан. При локализации электрода в хлоропласте и общем освещении слоевища измеряется сигнал Дф, в котором суммируются фотоответ хлоропласта и задержанная во времени ответная реакция клеток, объединенных межклеточными контактами. Сужение площади освещения до размера одной клетки не влияет на изменения МП хлоропласта, но полностью снимает ответную реакцию электрически связанных клеток. При этом регистрируется только фотоответ хлоропласта. Наконец, при локализации микроэлектрода в прозрачной части клетки и общем освещении препарата измеряются только изменения потенциала клеточных мембран.

Стимуляция триггсрпых ответов ионофорами

В отличие от градуальных фотоиндуцированных изменений МП, триггерные электрические ответы (ТЭО) не подавляются, а усиливаются под действием разобщителей (нигерицин, моненсин). После внесения этих протонофоров амплитуда ТЭО, вызываемых 2,5-с снеговыми импульсами, возрастала от 15-25 мВ до 70-150 мВ. Устранение ДрН на ТМ путем добавления 1 мМ NH4CI также приводило к усилению ТЭО клетки.

Моненсин оказывал стимулирующее влияние на ТЭО при различных уровнях Na+ в наружной среде (1-50 мМ). Слабая зависимость уровня деполяризации от движущей силы Н+-катионного обмена на плазмалемме говорит о том, что обмен Н+/К+ и H+/Na+, индуцируемый ионофорами на плазмалемме, не был причиной усиления ТЭО. Очевидно, стимуляция была вызвана К+/Н"'"обменом через ТМ и деэнергизацией мембран хлоропласта.

Влияние ионофоров на индукционные кривые флуоресценции

Одновременные измерения индукционных кривых флуоресценции и МП показали, что ионофоры деэнергизуют ТМ in situ. В контрольных условиях фотошодуцированная деполяризация развивалась синхронно с энергозависимым тушеним флуоресценции хлорофилла, которое связано с формированием ДрН на ТМ. После внесения нигерицина, амплитуда ТЭО возрастала, а стадия ДрН-зависимого тушения флуоресценции исчезала. Таким образом, триггерная деполяризация усиливается при деэнергизации ТМ Очевидно, что фотоиндуцированный поток Н+ на уровне ТМ и повышение рНц не играют решающей роли в запускаемых светом ТЭО.

Связь деполяризации с активностью Н+-А ТРазы

Изменения МП подавлялись ингибиторами Н+-АТРаз — ДЦКД и ДЭС (0,1 мМ). При этом действие ДЭС специфично для плазмалеммы. Результаты показывают, что вспышки секундной длительности вызывают у Anthoceros временное подавление электрогенного Н+ насоса плазмалеммы. Метиявиологен, который вызывает избыточную энергизацию ТМ и повышает содержание АТР в освещенных клетках и хлоропластах (Saivucci et al„ 1987), подавлял ТЭО, а промывание препарата восстанавливало ТЭО.

Связь деполяризации с транспортом протонов

Для проверки связи ТЭО с функцией Н+-АТРазы плазмалеммы измеряли рН у поверхности клетки (рН0). Активное выведение Н+ из цитоплазмы поддерживает локально низкий рН в неперемешиваемом слое по сравнению с объемом раствора. Установлено, что ТЭО сопровождаются временным и обратимым возрастанием рН0. Оба сигнала (ТЭО и увеличение

рН0) возрастали под действием нигерицинз и монснсина. Корреляция изменений МП и рН0 по амплитуде и временной шкале подтверждает тесную связь сдвига МП с трансмембранным потоком Н+. Очевидно, деполяризация и подщелачивание среды вызваны временным подавлением электрогенного Н+- насоса плазмалеммы.

Предполагаемая схема подавления Н-насоса плазмалеммы

Полученные данные выявляют сложный механизм генерации ТЭО клетки. Влияние освещения на плазмалемму не связано с повышением рНц, т.к. этот сдвиг, обусловленный Н+ насосом ТМ, устраняется протонофорами. О подавлении ДрН на ТМ под действием нигерицина свидетельствует исчезновение стадии тушения флуоресценции хлорофилла. Хлоропласты поглощают на свету Са2+, но убыль [Са2+]ц вряд ли лежит в основе ТЭО, т. к. возбуждение клеток связано с повышением [Са2+]ц (Lunevsky et al., 1983).

Среди возможных механизмов временного подавления Н+ насоса, регуляция на уровне доступного субстрата (АТР) представляется наиболее вероятной (Рис. 12). Известно, что хлоропласты осуществляют гидролиз АТР в начале освещения и при действии нескольких вспышек. При этом происходит отток АТР из цитоплазмы, т. к. локализованный в оболочке транслокатор АТР обеспечивает преимущественное поступление АТР внутрь пластид (Douce, Joyard, 1990). Гидролиз АТР в хлоропластах вероятно преобладает в течение первых 3 с освещения (Van Kooten, 1988), поскольку в этот период Н+-АТРаза активирована кратковременной фотогенерацией МП, а уровень Лци+ еще не достаточен для фосфорилирования. При более длительном освещении Дцц+ достигает порогового уровня и преобладающей реакцией становится синтез АТР.

Кратковременное понижение [АТР] в цитоплазме подавляет Н+-насос плазмалеммы, если уровень [АТР] не является насыщающим. Регуляция электрогенного насоса и МП растительной клетки посредством уровня АТР в цитоплазме показана в работах Mimura et al. (1983, 1984).

После обработки клеток разобщителями энергосопряжения уровень [АТР] в цитоплазме снижается (Rebeille, Gans, 1988) вследствие подавления окисилительного и фотофосфорилирования. При снижении фонового уровня АТР в цитоплазме АТР-зависимая регуляция Н+-насоса и МП становится более эффективной (Mimura et al., 1984), что объясняет усиление ТЭО, вызываемых освещением. Напротив, избыточная энергизация хлоропластов и повышение внутриклеточного уровня АТР при освещении клеток в присутствии метилвиологена сопровождается исчезновением ТЭО клетки.

Таким образом, хлоропласты и Н+-насос плазмалеммы по-видимому конкурируют за использование АТР в первые моменты освещения, причем

конкурентные отношения выявляются особенно сильно в условиях ограниченной доступности субстрата после деэнергизации клеток.

Временное подавление Н+-насоса и соответствующий сдвиг МП вероятно приводят к активации потенциалозависимых Са^+ каналов и Са2+-зависимых С1~ каналов плазмалеммы (Lunevsky et al., 1983). В пользу этого свидетельствуют высокий уровень пиковой деполяризации (до 35 мВ), а также подавление фотоиндуцировашшх изменений МП ионами La3+.

Градуальные и трштерные фотоиндуцированные изменения МП, проявляющиеся в норме у разных видов растений, могут наблюдаться и на клетках одного вида при изменении внешних условий. Можно предполагать, что светозависимые электрические ответы триггерного типа проявляются в условиях недостатка внутриклеточного АТР и при нарушениях системы энергетического сопряжения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленные данные показывают, что фотосинтетическая активность хлоропластов связана с электрохимическими процессами на ГМ, обменом ионов и метаболитов через мембраны оболочки, а также с изменениями потенциала плазмалеммы. Разработанные методы и проведенное исследование составляют оригинальный подход к проблеме мембранного преобразования световой энергии, к выяснению роли и механизмов генерации потенциала на ТМ и изменений проводимости мембранных систем хлоропласта.

Зондирование свойств оболочки хлоропласта с помощью метода пэтч-кламп и рН-микроэлектродов выявило потенциалозависимую проводимость мембран оболочки и характерные изменения рН в строме хлоропластов и в наружных примембранных слоях при фотосинтезе. Изменения рНц, а также вероятные изменения концентрации Са^+ и АТР при переходе клетки от темнового метаболизма к фотосинтезу оказывают влияние на активность ионтранспортных систем плазмалеммы, что проявляется в изменениях МП клетки. В зависимости от вида растений, физиологического состояния и внешних условий фотоиндуцированные изменения МП могут проявляться в виде градуальных ответов или регенеративных изменений типа ПД.

Одновременная регистрация изменений МП, протекающих на ТМ и поверхностной мембране клетки, служит подходом к исследованию сопряжения этих пространственно разделенных электрических процессов в живой растительной клетке. Анализ изменений МП клеток при варьировании площади освещения несет информацию о межклеточных электрических связях в нативной системе.

выводы

1. Разработаны прямые методы регистрации электрических процессов в фотосинтетических мембранах, позволяющие исследовать кинетику МП и трансмембранные токи при импульсном и длительном освещении на изолированных хлоропластах и пластидах внутри клетки в различных экспериментальных условиях.

2. Определены параметры генерации МП при однократном разделении зарядов в фотосинтетических РЦ (МП г 40 мВ, наличие двух компонент генерации МП и однокомпонентный спад с постоянной времени ~50 мс), а также характеристики индукционной кривой МП на непрерывном свету (наличие индукционного пика до 100 мВ и снижение МП к стационарному уровню ~20 мВ). Понижение МП связано с фотосинтетическим контролем транспорта электронов и устраняется при снятии ЛрН.

3. Кинетика спада МП при импульсном освещении служит показателем проводимости ТМ. В темноте основной вклад в проводимость вносит К.+, а на свету возникает дополнительно Н+ проводимость. Светозависимая проводимость, чувствительная к действию ингибитора Н+-АТРазы, составляет -20 мкСм/см^, что соответствует усредненной по времени Н+-проводимости сопрягающего фактора ~1 фСм.

4. Световой уровень МП определяется двумя компонентами. Электрогенная составляющая пропорциональна скорости фотопереноса электронов и сопротивлению ТМ; она максимальна в присутствии индукторов электронейтрального катион-протонного обмена (нигерицин) и снижается с ростом проводимости мембран (валиномицин). Диффузионный потенциал выявляется в момент выключения света и в зависимости от условий имеет разную полярность; в нативных хлоропластах он отрицателен и определяется диффузией Н+ из люмена в строму хлоропласта.

5. При действии вспышек вклад ФС 1 в генерацию МП больше, чем у ФСII. На длительном свету разная электрогенная эффективность фотосистем проявляется в разной скорости генерации МП. Разный электрогенный эффект и отсутствие колебаний МП при смене S-состояний О2 -выделяющей системы указывает на наличие в ФС II Н+-связывающих доменов, не обменивающихся протонами с тилакоидным объемом. Генерация МП in vivo обусловлена участием обеих фотосистем.

6. Индукционная кривая МП после темновой адаптации включает два пика потенциала, которые у хлоропласта Anthoceros достигаются через 20 и 500 мс после начала освещения. Второй пик исчезает, смещаясь в область коротких времен, после 1-е светового импульса. Развитие второго пика МП совпадает по времени с временным снижением флуоресценции хлорофилла PS[. Задержанная генерация МП и параллельное тушение флуоресценции

обусловлены общей причиной - активацией электрогешюго транспорта элеюронов в области ФСI.

7. Смещение МП тилакоидов в положительную область усиливает флуоресценцию ФС II, а отрицательный сдвиг ослабляет свечение. Чувствительность флуоресценции к сдвигам МП меняется в зависимости от состояния акцептора Q: максимальная чувствительность к положительным и отрицательным сдвигам МП достигается при окислении и восстановлении Q, соответственно. Предложена модель влияния электрического поля на флуоресценцию хлорофилла. Фотоиндушгровашый МП относится к числу факторов, определяющих ход индукционных кривых флуоресценции.

8. Циклический транспорт электронов, катализируемый редокс медиаторами (ФМС, ТМФД), сопровождается поступлением катионов ФМС+ и ТМФД4" в тилакоиды и образованием на ТМ электрохимического градиента редокс-активных катионов, сходного по знаку и величине с Механизм транспорта основан на трансмембранном разделении стадий окисления и восстановления медиатора в связи с различной липофильноегью его окисленной и восстановленной форм. Одновременное функционирование двух светозависимых ионных насосов (транспорт Н+ и экзогенного иона) вызывает их взаимодействие из-за наличия общих участков в путях переноса электронов.

9. Методом пэтч-кламп выявлены потенциалозависимые свойства мембран оболочки и ТМ хлоропласта. Проводимость мембран оболочки минимальна при потенциале стромы около +30 мВ и переходит на высокий уровень за время ~1 с при сдвиге потенциала в отрицательную область. Влияние электрического потенциала на фототоки ТМ обусловлено возрастанием сопротивления ламеляярной системы при освещении. Изменения сопротивления после вспышки кинетически отличаются от изменений МП, проявляют высокую чувствительность к действию ионофоров и отражают изменения в профилях латерального распространения тока по внутри- и межтилакоидным зазорам.

10. Фотогенерация МП на ТМ, изменение ионного состава стромы и обмен ионов между хлоропластом и цитоплазмой приводят к деполяризации клеток, которая у разных видов происходит градуально в период освещения или же имеет вид потенциала действия, запускаемого световым стимулом. По сдвигам рН в примембранных слоях среды показана тесная связь запускаемых светом изменений МП с потоками Н+ через плазмалемму. Предложена схема, согласно которой хлоропласты и электрогенный Н+-насос плазмалеммы конкурируют за использование АТР в первые моменты освещения, что приводит к временному подавлению Н+-насоса плазмалеммы, особенно сильному после деэнергизацин клеток разобщителями фосфорилирования.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Андрианов В.К., Булычев А.А., Курелла Г.А., Литвин Ф.Ф. О связи фотоиндуцированных изменений потенциала покоя с наличием хлоропластов в клетках Nitella. Биофишка, 1970, т. 15, 190-191.

2. Булычев А.А., Андрианов В.К., Курелла Г.А., Литвин Ф.Ф. Трансмембранный потенциал хлоропласта и его фотоипдуцированные изменения. Доклады АН СССР, 1971, т. 197, 473-477.

3. Булычев А.А., Андрианов В.К., Курелла Г.А., Литвин Ф.Ф. Трансмембранный потенциал клетки и хлоропласта высшего наземного растения. Физиология растений, 1971, т. 18, 248-256.

4. Андрианов В.К., Булычев А.А., Курелла ГА., Литвин Ф.Ф. Влияние света на потенциал покоя и активность катионов К+, Н+, Na+ в вакуолярном соке клеток Nitella. Биофизика, 1971, т. 16, 1031-1036.

5. Булычев А.А., Андрианов В.К., Курелла Г.А., Литвин Ф.Ф. Участие двух пигментных систем фотосинтеза в генерации фотоэлектрической реакции клеток листьев Peperomia metallica. Физиология растений, 1972, т. 19, N2,449-451.

6. Bulychev А.А., Andrianov V.K., Kurella G.A., Litvin F.F. Microelcctrode measurements of the transmembrane potential of chloroplast and its photoinduced changes. Nature, 1972, v. 236, N 5343, 175-177.

7. Булычев A.A. Спектр действия быстрых фотоиндуцированных изменений трансмембрашюго потенциала хлоропласта. Вестник Моск. Университета: Биология, почвоведение, 1973, N 1,98-99.

8. Bulychev А.А., Vredenberg W.J. The effect of cations and membrane permeability modifying agents on the dark kinetics of the photoelectric response in isolated chloroplasts. Biochim. Biophys. Acta, 1976, v. 423, N 3,548-556.

9. Bulychev A.A., Andrianov V.K., Kurella G.A., Litvin F.F. Photoinduction kinetics of electrical potential in a single chloroplast as studied with micro-electrode technique. Biochim. Biophys. Acta, 1976, v. 430, N 2, 336-351.

10. Vredenberg W.J., Bulychev A.A. Changes in the electrical potential across the thylakoid membranes of illuminated intact chloroplast in the presence of membrane-modifying agents. Plant Science Lett., 1976, v. 7, N 2, 101-107.

11. Bulychev A.A., Vredenberg W.J. Effect of ionophores A23187 and nigericin on the light-induced redistribution of Mg2+, K+ and H+ across the thylakoid membrane. Biochim. Biophys. Acta, 1976, v. 449, N 1,48-58.

12. Денеш M., Андрианов B.K., Булычев A.A., Курелла Г.А. Действие разобщителя карбонилцианидфенилгидразона на мембранные потенциалы и величину рН вакуолярного сока клеток Nitella. Косвенное определение рН цитоплазмы. Физиология растений, 1977, т. 24, 528-533.

13. Gyenes M., Andrianov V.K., Bulychev A.A., Kurella G.A. Light-induced H+ accumulation in the vaculole of Nitellopsis obtusa. J. Exp. Bot., 1978, v. 29, N112, 1185-1195.

14. Денеш M., Андрианов B.K., Булычев A.A., Курелла Г.А. Влия1ше дициклогексишсарбодиимида на фотоиндуцированный транспорт Н+ в клетках и изолированных хлоропяастах Nitellopsis obtusa. Физиология растений, 1978, т. 25, 1163-1167.

15. Булычев А.А., Курелла Г.А., Пучкова Т.В., Уразманов Р.И. Фотоиндуцированное поглощение феназинметосульфата тилакоидами изолированных хлоропластов. Физиология растений, 1979, т. 26, 20-27.

16. Денеш М., Андрианов В.К., Булычев АА., Курелла ГА. Фотоиндуцированный транспорт Н+ в клетках Nitellopsis obtusa. Биофизика, 1979, т. 24, 657-662.

17. Булычев А.А., Курелла Г.А., Уразманов Р.И. Энергозависимое поглощение феназинметосульфата в изолированных хлоропдастах. Биохимия, 1979, т. 44, 1460-1467.

18. Bulychev А.А., Andrianov V.K., Kurella G.A., Effect of dicyclohexylcarbodiimide on the proton conductance of thylakoid membranes in intact chloroplast. Biochim. Biophys. Acta, 1980, v. 590, 300-308.

19. Булычев A.A., Гришанова Н.П., Кононенко АА., Курелла Г.А. Поглощение экзогенного кофактора в хлоропласт ах растений и хроматофорах бактерий при циклическом транспорте электронов. Доклады АН СССР, 1980, т. 255,215-219.

20. Булычев А.А. Ионный и энергетический обмен в хлоропластах. Итоги науки и техники. Физиол.раст., т. 4, Москва: ВИНИТИ, 1980,126-174.

21. Булычев АА., Гришанова Н.П., Карагулян А.К., Кононенко АА., Курелла Г.А. Фотоокисление и фотоиндуцированный транспорт феназинметосульфата в хроматофорах пурпурных бактерий. Биохимия, 1981, т. 46, 1057-1066.

22. Ремиш Д., Булычев А.А. Изменения мембранного потенциала хлоропласта при раздельном функционировании двух фотосистем. Физиология растений, 1981, т. 28, 711-717.

23. Remish D., Bulychev А.А., Kurella G.A., Light-induced changes of the electrical potential in chloroplasts associated with the activity of photosystem I and photosystem II. J. Exp. Bot., 1981, v. 32, N 130,979-987.

24. Ремиш Д., Булычев A.A. Электрические процессы на фотосинтетической мембране при освещении хлоропласта серией коротких вспышек. Доклады АН СССР, 1981, т. 260, N 1,224-227.

25. Ремиш Д., Булычев Л.А., Соколов З.Н., Рубил А.Б. Фотогенерация мембранного потенциала в интактных хлоропластах, помещенных в среды с Н20 и D20. Биохимия, 1981, т. 46, 2092-2099.

26. Gyenes М., Bulychev А.А., Kurella G.A., Perez-Alvarez P. Light-activated H+ transport in the vacuole of Valonia ventricosa. J. Exp. Bot., 1981, v. 32, N 131, 1273-1277.

27. Перес Альварес П., Булычев АА„ Денеш М., Курелла Г.А. Светозависимые электрические реакции в клетках морских зеленых сифоновых водорослей. Биологические науки, 1982, N 7, 39-44.

28. Булычев А.А., Курелла Г.А., Лукашев Е.П. Изучение взаимодействий Ы,Ы,Ы',Ы'-тетраметш1-п-фенилендиамина с мембранами хлоропластов при действии света. Биохимия, 1983, т. 48, N 4,658-663.

29. Булычев А.А., Ниязова М.М., Туровецкий В.Б. Влияние дейтерирования на чувствительность элекгронотранспортных реакций в хлоропластах к действию грамицидина. Биохимия, 1983, т. 48, N 5,857-860.

30. Булычев А.А., Абраменко Ю., Андрианов В.К, Курелла Г.А. Использование мембранного электрода для изучения взаимодействия феназинметосульфата с мембранами фотосинтетического аппарата. Биологические науки, 1983, N 3, 20-25.

31. Bulychev А.А., Remish D., Kurella G.A. Comparative efficiencies of photosystems I and II as generators of electrical potential across the chloroplast thylakoid membranes. Plant Science Letters, 1983, v. 29, N 1, 73-79.

32. Булычев A.A., Лукашев Е.П., Курелла Г.А. Особенности функционирования заряженного редокс-медиатора в хроматофорах пурпурных бактерий. Биофизика, 1983, т. 28, N 4,612-615.

33. Bulychev А.А., Turovetsky V.B. Light-triggered changes of membrane potential of Anthoceros punctatus and their relation to activation of chloroplast ATPase. J. Exp. Bot., 1983, v. 34, N 146,1181-1188.

34. Булычев A.A., Курелла Г.А., Туровецкий В.Б. Изменения мембранного потенциала растительной клетки, обусловленные световой активацией АТФазы хлоропластов. Доклады АН СССР, 1983, т. 271, N 5, 1277-1280.

35. Bulychev АЛ. Photoinduction of membrane potential in single chloroplast as affected by preillumination and inhibitor of H4"-ATPase. Membrane Transport in Plants. Cram W.J. et al.,Eds. Praha: Academia, 1984, 255-260.

36. Булычев A.A., Туровецкий В.Б. Влияние трансмембранной разности электрических потенциалов на флуоресценцию хлорофилла в одиночном интактном хлоропласте. Доклады АН СССР, 1984, т. 279, N 2, 495498.

37. Bulychev A.A., Dahse I. Light-induced electric potentials of intact Anthoceros chloroplast and their modifications in the presence of the energy transfer inhibitor tentoxin. Biochem. Physiol. Pflanzen, 1984, v. 179,685-692.

38. Bulychev A.A. Different kinetics of membrane potential formation in dark-adapted and preilluminated chloroplasts. Biochim Biohys. Acta, 1984, v. 766, N 3, 647-652.

39. Булычев A.A., Денеш M. Интерпретация индукционной кривой флуоресценции с учетом потенциалозависимой стадии переноса электронов в фотосистеме II. Биофизика, 1985, т. 30, N 2,244-248.

40. Свинтицких В.А., Андрианов В.К., Булычев А.А. Структурно-функциональные характеристики поверхностной мембраны капель протоплазмы, полученных из клеток харовых водорослей. VI. Фотоиндуцированный транспорт Н+ в капле протоплазмы, содержащей хлоропласты. Физиология растений, 1985, т. 32, N 2,213-222,

41. Bulychev А.А., Niyazova М.М., Turovetsky V.B. Evidence for delayed photoactivation of electrogenic electron transport in chloroplast membranes. Biochim. Biophys. Acta, 1985, v. 808, N 1,186-191.

42. Svintitskikh V.A., Andrianov V.K., Bulychev A.A. Photoinduced II+ transport between chloroplasts and the cytoplasm in. a protoplasmic droplet of Characeae. J. Exp. Bot., 1985, v. 36, N 170, 1414-1429.

43. Dahse I., Bulychev A.A., Kurella G.A., Libermarm B. Weak tentoxin effect on the electrical light response of isolated chloroplasts of Peperomia metallica. Physiol. Plant., 1985, v. 65, N 4,446-450.

44. Ремиш Д., Булычев A.A., Курелда Г.А. Влияние хлористого аммония па трансмембранный электрический потенциал и градиент рН в одиночных хлоропластах. Физиология растений, 1986, т. 33, N 2, 319-326.

45. Булычев А.А., Ниязова М.М., Рубин А.Б., Туровецкий В.Б. Индукция флуоресценции хлорофилла и изменения электрического потенциала на мембранах хлоропласта. Доклады АН СССР, 1986, т. 286, N 1, 253-256.

46. Bulychev А.А., Niyazova М.М., Turovetsky V.B. Electro-induced changes of chlorophyll fluorescence in individual intact chloroplasts. Biochim. Biophys. Acta, 1986, v. 850, N 2, 218-225.

47. Remis D., Bulychev AA., Kurella G.A. The electrical and chemical components of the protonmotive force in chloroplast as measured with capillary and pH-sensitive microelectrodes. Biochim. Biophys. Acta, 1986, v. 852, N 1,68-73.

48. Булычев A.A., Ниязова M.M., Рубин А.Б. Изменения флуоресценции хлоропластов при сдвигах мембранного потенциала и их зависимость от окислительно-восстановительного состояния акцептора фотосистемы II. Биологические мембраны, 1987, т. 4, N 3, 262-269.

49. Булычев A.A., Андрианов B.K. Использование мембранного электрода для изучения взаимодействий N,N,N',N'-TeTpaMeTHn-ïi-фенилендиамина с мембранами фотосинтетического аппарата. Физиология растений, 1987, т. 34, N6, 1062-1067.

50. Remis D., Bulychev A.A., Kurella GA. Photo-induced pH changes in the vicinity of isolated Peperomia raetallica chloroplasts. J. Exp. Bot., 1988, v. 39, N202,633-640.

51. Булычев A.A., Верхотуров B.H., Гуляев Б.А. и соавт. Современные методы биофизических исследований (Рубин А.Б., ред.), Москва: Высшая школа, 1988.

52. Булычев A.A., Ниязова М.М. Модель потенциалозависимых изменений флуоресценции хлорофилла фотосистемы II. Биофизика, 1989, т. 34, N 1,63-67.

53. Ниязова М.М., Булычев A.A. Обратимое снижение выхода флуоресценции хлорофилла а при генерации потенциала действия в клетках мха Anthoceros. Биофизика, 1989, т. 34, N 2,272-274.

54. Ремиш Д., Булычев A.A. Влияние освещения на pH среды у поверхности одиночного изолированного хлоропласта. Биофизика, 1989, т. 34, N 3, 445-449.

55. Булычев A.A. Изменения электрического потенциала на фотосинтетической и клеточной мембранах Anthoceros при действии света. Физиология растений, 1989, т. 36, N 3, 479-486.

56. Булычев A.A. Индукционные изменения мембранного потенциала и флуоресценции клеток Anthoceros после вспышек секундной длительности. Физиология растений, 1989, т. 36, N 5,939-947.

57. Булычев A.A. Изменения флуоресценции одиночных изолированных хлоропластов при разрушении мембран оболочки под действием внешнего электрического поля. Биологические науки, 1990, N 1, (313), 29-36.

58. Ремиш Д., Булычев A.A., Рубин А.Б. Электроиндуцируемое нарушение барьерных свойств мембранной оболочки изолированных хлоропластов. Биологические мембраны, 1990, т. 7, N 4, 382-389.

59. Булычев A.A., Ремиш Д. Временное подавление Н+-насоса плазмалеммы Anthoceros после световых вспышек секундной длительности. Физиология растений, 1991, т. 38, N 3,499-506.

60. Antonenko Y.N., Bulychev A.A. Measurements of local pH changes near biiayer lipid membrane by means of a pH microelectrode and a protonophore-dependent membrane potential. Comparison of the methods. Biochim. Biophys. Acta, 1991, v. 1070, N 1, 279-282.

61. Antonenko У .К., Bulychev A.A. Effect of phloretin on the carrier-mediated electrically silent ion fluxes through the bilayer lipid membrane: measurement of pH shifts near the membrane by pH microelectrode. Biochim Biophys. Acta, 1991, v. 1070, N 2,474-480.

62. Bulychev A.A., Antonov V.F., Shevchenko E.V. Patch-clamp studies of light-induced currents across the thylakoid membrane of isolated chloroplasts. Biochim. Biophys. Acta, 1992, v. 1099, N 1,16-24.

63. Булычев A.A., Цымбалюк E.C., Лукашев Е.П. Использование необратимой электропорации и осмотических эффектов для доказательства светоиндуцированного накопления метилфеназония во внутреннем объеме талакоидов. Биологические мембраны, 1993, т. 10, N 6, 587-597.

64. Orlov V.N., Antonenko Y.N., Bulychev A.A., Yaguzhinsky L.S. Combination of the electrogenic ionophores valinomycin and СССР can lead to non-electrogenic K+/H+ exchange on bilayer lipid membranes. FEBS Lett., 1994, v. 345, N 1, 104-106.

65. Bulychev A., Pilon M., Dassen H., van't Hoff R., Vredenberg W., de Kruijff B. Precursor-mediated opening of translocation pores in chloroplast envelopes. FEBS Lett., 1994, v. 356, 204-206.

66. Bulychev A.A., Vredenberg WJ. Enhancement of the light-triggered electrical response in plant cells following their de-energization with uncouplers. Physiol. Plant., 1995, v. 94, N 1.64-70.

67. Vredenberg W., Bulychev A., Dassen H., Snel J., Voorthuysen T.

A patch-clamp method for determining single turnover charge separations in the chloroplast membrane. Biochim. Biophys. Acta, 1995,1230, N 1, 77-80.

68. Vredenberg W.J., Bulychev A.A., Voorthuysen Т., Snel J.F.H. The electrical properties of the thylakoid membrane and its partitions in relations to energy supply. In: Photosynthesis: From light to biosphere. Mathis P., Ed., Kluwer, 1995, vol. 3, pp. 269-272.

69. Voorthuysen Т., Bulychev A.A., Dassen H., Snel J.F., Vredenberg W.J., Photosystem П dependent suppression of flash-induced electrogenesis caused by proton pumping in chloroplasts. Physiol. Plant., 1996,98,156-164.

70. Bulychev A.A., Voorthuysen Т., Vredenberg WJ., Transmembrane movements of artificial redox mediators in relation to electron transport and ionic currents in chloroplasts. Physiol. Plantarwn, 1996, vol. 98, 605-611.

71. Voorthuysen Т., Bulychev A.A., Dassen H., Snel J., Vredenberg W.J., Flash-induced conductance changes in chloroplast thylakoid lamellae. A patch-clamp study. Bioelectrochem. Bioenerg., 1997 (in press).

Информация о работе

Булычев, Александр Александрович
доктора биологических наук
Москва, 1997
ВАК 03.00.02

Автореферат

Похожие работы