Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фотофизические процессы в компонентах нуклеиновых кислот и их комплексах с красителями

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Фотофизические процессы в компонентах нуклеиновых кислот и их комплексах с красителями"

РГ6 ОД МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМЕНИ М.В.ЛОМОНОСОВА

~ 5 АПР 1993

На правах рукописи

РАПОПОРТ Виктор Львович

УДК 535.37

ФОТСШЗИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В КОМПОНЕНТАХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И ИХ КОМПЛЕКСАХ С КРАСИТЕЛЯМИ

Специальность 03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

Москва - 1993

Работа выполнена в НИИ Физики СПбГУ.

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор Л.В.Левшин; доктор биологических наук, профессор Э.А.БурштеЯн, доктор физико-математических наук Ю.В.Морозов.

Ведущая организация: Институт химической физики РАН.

Защита состоится " /5"" апреля 1993 г. в — час. на заседании специализированного совета Д 053.05.53 по биофизике при Московском государственном университете иы.М.В.Лоыоносова по адресу: 191899, Ыосква, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет(/7ИК) •

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан '45"" ,ж.аМ"а 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук, профессор

.Т.Е.Кревделева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Облучение живых клеток ультрафиолетовым (УФ) светом вызывает ряд биологических эффектов: фотомутации, канцерогенез, гибель клеток. Первичным актом этих фотобиологических эффектов часто является поглощение света молекулами ДНК. Об этом свидетельствует близость их спектров действия и спектра поглощения ДНК.

После поглощения кванта света в ДНК разворачивается цепочка сначала фотофизических, а затем фотохимических событий, которая заканчивается образованием фотохимического продукта, приводящего к биологическому эффекту. К фотофизическим процессам, кроме поглощения света, относятся люминесценция, миграция энергии возбуждения, перенос заряда, безызлучательные процессы. Образование комплексов ДНК с красителями часто влияет на фотофизические и фотохимические процессы в ней, приводя к появлению новых полос поглощения и сенсибилизации фотоэффекта или, наоборот, к защите ДНК от облучения. Все это определяет актуальность исследования фотофизических процессов в ДНК, ее компонентах и их комплексах с красителями. Тема работы тесно связана с проблемой воздействия ультрафиолетового и видимого излучения на биологические объекты и их защиты от излучений.

Направление работы было сформулировано автором под влиянием идей, работ и чрезвычайно широкого круга научных интересов академика Александра Николаевича Теренина, научного учителя диссертанта.

Несмотря на то, что исследования фотофизических процессов в НК и их комплексах с красителями начались около 30 лет назад, в этой области к началу этой работы (1976 г.) оставалось много важных нерешенных вопросов. Было непонятно: а) почему нуклеиновые кислоты (НК) и их компоненты так слабо люминесцируют в растворах Сквантовые выходы (Ц?) в воде при комнатной температуре

Ю^-КГ5, а при 77 К в твердых стеклах - (Ю"2-10-1|; б) почему спектры возбуждения этой слабой люминесценции часто' сильно отличаются от спектров УФ поглощения тех же растворов (сдвинуты на 3-10 нм в "красную" сторону); в) почему люминесценция одних красителей при адсорбции на НК сильно "тушится" (про-флавин (ПФ) и акрифлавин (АФЗ, а других - нет Сакридиновый оранжевый (А0)3; г) поглощают кванты У§ света практически невзаимо-

действующие (псевдоизолированные) нуклеиновые основания (НО) в НК или достаточно сильно взаимодействующие для спектральнь проявлений этих взаимодействий (спектры УФ поглощения, ЦД и минееценции); д) какова природа "красного" смещения спектрог люминесценции ди- и полинуклеотидов относительно тех же спе! ров мономеров.

Это было связано с двумя обстоятельствами. Во-первых, ; мономерные компоненты ДНК - нуклеиновые основания и нуклеои - трудны для фотофизических исследований из-за наличия мноп таутомерных и ионных форм этих молекул, а также близких по ! гии электронных переходов. Во-вторых, в случае полимеров вс< дополнительно осложнено межмолекулярными взаимодействиями.

Основные исследования, предшествующие этой работе, был) проведены при 77 К, и имелись лишь немногочисленные работы ] люминесценции при комнатной температуре.

Понимание фотофизических процессов в ДНК и ее компонен1 до сих пор значительно отстает от понимания подобных процес в хорошо люминесцирующих белках и хлорофилле.

Целью работы явилось исследование фотофизических проце поглощения света, люминесценции, переноса заряда и безызлуч тельных переходов в простых системах, моделирующих ДНК и ее комплексы с красителями, и изучение влияния на эти процессы межмолекулярных взаимодействий.

Объектами исследования служили нуклеиновые основания, леотиды, гомогенные динуклеотиды, динуклеозидфосфаты и неко рые полинуклеотиды, комплексы НО и нуклеотидов с акридиновы красителями (АК), хинонаыи и иодом, агрегаты АК и фталоциани магния (Фц М^).

В случае моноыерных компонентов НК исследовалось влияк на фотофизические процессы взаимодействия с растворителем к молекулами красителей. Динуклеотиды и полинуклеотиды являш простыми модельными системами для изучения "вертикальных" ( почных") взаимодействий между НО в ДНК и их влияния на фоте зические процессы.

Большая часть исследований проведена в водных растворг при 293 К и в водно-этиленгликолевых (ЭГг^О) стеклах при г, Часть исследований (агрегация красителей) проведена в вакуз условиях.

В работе были поставлены следующие основные задачи« . Для мономзрных компонентов НК;

1) исследование природы различия спектров поглощения и возбуждения люминесценции;

2) исследование.связи между структурой и люминесцентной способностью пуриновых ..компонентов.

Для комплексов-мономерных.компонентов НК с красителями:

1) исследование способности компонентов НК к образованию комплексов с переносом заряда (КПЗ) с электроноакцепторными молекулами и выяснение природы.донорной способности компонентов НК - ила 1а -доноры?);

2) исследование комплексообразования ыономерных компонентов НК и их аналогов с акридиновыми красителями к его влияния на люминесценцию красителей.

Для динуклеотидов и псдинуклеотидов:

1) обнаружение и исследование экситонных эффектов в спектрах поглощения и люминесценции и их сопоставление с аналогичными эффектами в агрегатах красителей;

2) уточнение модели первичных фотопроцессов в немономер-ных компонентах НК (эксимер или экстонное расщепление?).

Основными .методами исследования являлись метод электронного поглощения и люминесцентный..Исследовались спектры флуоресценции и фосфоресценции, их возбуждения, квантовые выходы, в некоторых случаях степень поляризации люминесценции (Р). Было собрано несколько люминесцентных установок,.в том числе высокочувствительная для регистрации спектров испускания, и возбуждения слабой люминесценции .компонентов НК по счету фотонов. Кроме того, в последние годы использовался, высококлассный спектро-флуориметр "Хитачи-850п (Япония) с автоматической коррекцией спектров, снабженный мини-ЭВМ.

Научная новизна работы состоит в том, что впервые проведено комплексное и систематическое исследование основных фотопроцессов в мономерных компонентах НК, их комплексах с красителями, в ди- и полинуклеотидах при изменении в широких пределах условий эксперимента (концентрация. , значения рН, длина волны возбуждения и регистрации). Впервые систематически исследованы спектры возбуждения люминесценции компонентов НК, оказавшиеся очень информативными из-за гетерогенности изученных

растворов и сильной зависимости люминесцентной способности ко понентов НК от небольших изменений в их структуре.

В результате выполнения работы:

1) показано, что различия спектров поглощения и возбужде ния люминесценции мономерных компонентов НК обязаны не наруше нию закона Вавилова, а люминесценции редких форм молекул (тау меры, ионные формы, агрегаты и молекулы в редкой ферме гидрат ции) с относительно высоким квантовым выходом;

2) выявлена определяющая роль водородных связей с раство рителем в тушении флуоресценции основных нейтральных форм ци-тозиновых и адениновых мономерных компонентов НК. Для аденина и его производных предложена модель тушения люминесценции ции лической водородной связью между аминогруппой и атомом Ыу через -ОН группу растворителя, объясняющая зависимость люмине центной способности от структуры молекулы;

3) показано, что ыономерные компоненты НК способны образ вывать КПЗ с электроноакцепторнымк молекулами, выступая в род ^ -доноров электрона;

4) показано, что для некоторых конформеров ди- и полину! леотидов характерны экситонные спектры поглощения с расщеплением --V 3000 см~^, соответствующие "консервативным" спектрам кругового дихроизма. Предложена экситон-эксимерная модель пе£ вичных фотопроцессов в ди- и полинуклеотидах вместо ранее пр* нятой . эксимерной.

Научная и практическая ценность работы состоит в возможности использования ее результатов в таких областях науки, кг биофизика, фотобиология и спектроскопия биологических молеку; Обнаружение эффективного тушения возбужденных состояний компс нентов НК водородными связями с растворителем и, в частности, циклическими водородными связями, позволяет наметить новые щ ти решения проблемы защиты биологических объектов от поражающего действия ультрафиолетового излучения. Обнаружение "экси-тонных конформеров" ди- и полинуклеотидов'уточняет описание I вичных фотопроцессов в НК и дает возможность нового объяснен! различий спектров действия фотобиологических эффектов и спею ров поглощения ДНК.

Апробация результатов и публикации. Результаты диссертации доложены на Симпозиуме стран СЭВ по биофизике нуклеиновш

кислот и нуклеопротеидов (Таллин, 1981), Ш Конгрессе Европейского фотобиологического общества (Будапешт, 1989) и всесоюзных конференциях и совещаниях; по физике жидкого состояния вещества (Самарканд, 1974), по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1974, 1977, 1984, 1987), по люминесценции (Минск, 1977 и Самарканд, 1979), по молекулярной люминесценции и ее применениям (Харьков, 1982), по конформационным изменениям биополимеров в растворах (Телави, 1980), биофизическом съезде (Москва, 1982), "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение" (Рига, 1981, 1983, 1985), сессии секции кристаллохимии по проблеме: "Структурные аспекты биологической активности" (Пущино, 1986), "Биофизика рака" (Черноголовка, 1987), всесоюзной школе-семинаре по биомолекулярному компьютингу (Москва, 1991), всесоюзном семинаре "Фотоника нуклеиновых кислот" (Ленинград, 1978-1988), семинаре оптического отдела им.Г.С.Ландсберга ФИ им.П.Н.Лебедева РАН (1991). Основное содержание диссертации опубликовано в 22 статьях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, шести разделов и заключения, содержит 113 рисунков, б таблиц и список литературы, включающий 256 наименований -всего 313 страниц.

Личный вклад автора. Содержание диссертации отражает личный вклад автора в опубликованные работы. Основная часть работ выполнена в соавторстве с учениками. Автору принадлежит выбор направления исследования, постановка задач, планирование эксперимента, участие в конструировании аппаратуры £ ее сборке и проведении экспериментов, интерпретация результатов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы, сформулирован цель и задачи работы, названы объекты и методы исследования, приведены основные положения, выносимые на защиту, и определ на новизна полученных результатов.

В разделе I (обзор литературы) кратко рассматриваются различные модели описания фотофизических процессов в агрегат и комплексх молекул: I) экситонная, 2) эксимерная, 3) компле сы с переносом заряда, 4) тушение люминесценции в комплексах с водородной связью. Обсуждается применимость этих моделей для описания фотопроцессов в компонентах НК и их комплексах с красителями.

Затем анализируются литературные данные по структуре, спектрам УФ-поглощения и люминесценции мономерных, димерных и полимерных компонентов НК. Показывается, что в них имеется ряд противоречий и необьясненных особенностей» Так, для неко торых мономерных и димерных компонентов спектры поглощения и возбуждения люминесценции различаются, сильно отличаются экспериментальные времена жизни возбужденных сос-

тояний и вычисленные из спектров поглощения и ц> , наблюдается непостоянство Р в полосах люминесценции. Для динук-леотидов и полинуклеотидов практически отсутствовали данные о проявлениях экситонного взаимодействия в спектрах УФ-поглощения и люминесценции, хотя они явно наблюдались в спектрах кругового дихроизма (КД).

Далее рассматриваются литературные данные об образовании КПЗ между нуклеиновыми основаниями и акцепторами электрона. Показывается, что отнесение полос поглощения к КПЗ часто было недостаточно обоснованным, в частности, не проверялась зависимость положения полос комплексов от потенциала ионизации донора электрона^. Рассмотрение литературных данных об образовании комплексов между акридиновыми красителями (АК) и мономерными компонентами НК показывает, что в литературе нет единого мнения о природе таких комплексов (КПЗ или комплекс с Н-связью) и о причинах тушения люминесценции АК в этих комплексах.

Анализ литературных данных показал, что исследования фотофизических процессов в компонентах НК и их комплексах с красителями из-за фрагментарности не раскрыли природу основных процессов. Для мономеров оставался невыясненным механизм чрезвычайно эффективного тушения люминесценции, его зависимости от структуры молекулы и природа различия спектров поглощения и возбуждения. Для ди- и полинуклеотидов вызывала сомнения принятая эксимерная модель люминесценции, которая игнорировала экситонные эффекты. Фотопроцессы в комплексах компонентов НК с красителями оставались малоизученными. Эти выводы литературного обзора позволили сформулировать задачи диссертации.

Раздел 2 посвящен методике и технике эксперимент. Описаны способы приготовления и очистки образцов, растворителей и адсорбентов. Описаны установки и методики измерений спектров электронного поглощения, флуоресценции, фосфоресценции, возбуждения люминесценции, ее квантовых выходов и степени поляризации. Особое внимание уделено описанию корректировки спектров люминесценции и ее возбуждения,

устранения рассеянного света в люминесцентный установках, учету люминесценции фона, что связано с малыми квантовыми выходами люминесценции компонентов НК (10~^-10~^).

Раздел 3 посвящен исследованиям фотофизических процессов (поглощения света, люминесценции и безызлучательных процессов) в мономерных компонентах НК при 77 К в водно-этилен-гликолевых стеклах (1:1, V ). Описаны исследования спектров поглощения, люминесценции, ее возбуждения, квантовых выходов и, иногда, степени поляризации люминесценции цитозина, аде-нина и гуанина, их нуклеозидов и нуклеотидов, а также некоторых других производных в области концентраций (10~^-10~^)М и разных значениях рН (измеренных при 293 К). Основное внимание уделено обсуждению природы различия спектров поглощения и возбуждения люминесценции, зависимости люминесцентной способности пуриновых компонентов от их структуры и механизма тушения люминесценции компонентов НК.

Ранее в литературе обсуждались две возможные причины . различия спектров поглощения и возбуждения компонентов НК: люминесценция редких таутомеров с высоким квантовым выходом и нарушение закона Вавилова из-за быстрой внутренней конверсии с возбужденных колебательных подуровней состояния конкурирующей с колебательной релаксацией (М^оиЯл*/-г^гсЛ^о) .На показано, что закон Вавилова не нарушается, различия спектров поглощения и возбуждения компонентов НК связаны с гетерогенностью их растворов, но различной природы в случае разных молекул. Кроме редких таутомеров, характерных для аде-нина и гуанина, выявлены., 'три новых вида хорошо люминесци-рующих "собственных примесей": протонированные молекулы при рН 7.0 (цитидинмонофосфат), агрегаты (цитозин, аденин и из производные) и молекулы в особой форме гидратации, без тушащих водородных связей с растворителем (цитозин и его производные, аденозин и аденозин монофосфат. Экспериментально гетерогенность растворов проявлялась в различии спектров поглощения и возбуждения и в зависимости спектров люминесценции от длины волны возбуждения.

Показано, что в фотофизике компонентов НК важную роль играет тушение люминесценции водородными связями с раствори-

телем. Для аденина и его производных предложена модель тушения люминесценции циклической водородной связью. Для цито-зина (С^Ь), цитидина (Сцс1), цитидинмонофо сфата (Ср) и ци-тидинового динуклеотида (СрСр) было проведено спектрофото-ыетрическое и люминесцентное титрование при 77 К (ЭГ^О) в сравнении со спектр.офотометрическим титрованием при 293 К (Н20 и ЭГ:Н20). Найденные значения рК представлены в табл.1.

ТАБЛИЦА I.

Значения рК водных и водно-этиленгликолевых'(1:1,V ) растворов цитозина и его биологических производных по данным спектрофотометрического (рКп) и люминесцентных (рК^ и ) титрований при 293 и 77 К

ЭГгНдО 4,3

11,9 12,5 4,1 4,2 5,7 5,9 5,1 5,3

Как видно из таблЛ рКд, рК^ и рК^ везде близки, что говорит, скорее всего, об отсутствии протолитического равновесия в возбужденных состояниях при 77 К. Для 0^4" и СцД переход от 293 К к 77 К не меняет рК. Для Ср и СрСр наблюдается рост рК на 1,6 и 0,9 ед.рН соответственно. Этот эффект ранее не учитывался и предполагалось, что при рН 7.0 все молекулы Ср и СрСр находятся в нейтральной форме. Из наших кривых титрования следует, что 22$ молекул Ср при рН 7.0 находится в протонированной форме. протежированной и нейтральной форм сильно различаются и по нашим данным составляют 17 и 1,8$. Этим определяется близость спектров люминесценции и ее возбуждения Ср при рН 7.0 к спектрам протонированной формы. Спектры нейтральной формы наблюдаются при рН >. 8.0. Различие спектров поглощения и возбуждения и

Вещество

М

Ср СрСр

ркп

эг^о

293 К

4,5 12,3 4,0

4.3

4.4

4,4 12,0 4,1 4,3 4,3

рКп I

77 К,

4,5

И,9 4,2 5,9 5,2

зависимость спектров флуоресценции от длины волны возбуждения, т.е. проявления гетерогенности, остаются для растворов цитозина, аденина и их производных и при значениях pH, далеких от рК, когда в растворе имеются лишь нейтральные молекулы.

Обнаружены и исследованы концентрационные зависимости спектров флуоресценции и ее возбуждения для растворов цитозина и его производных, аденозина и аденозиныонофосфата в области концентраций (5*10"®-5*10~®) М, что привело к выделению полос сильнолюминесцирующих агрегатов, не проявляющихся в спектрах поглощения из-за малой концентрации.

На рис.1 приведена концентрационная зависимость спектров возбуждения цитидина. Для цитидина и цитидинмонофосфата максимум полосы поглощения агрегатов лежит у 298 нм, полосы люминесценции - у 360 нм, для агрегатов цитозина - у 293 и 350 нм соответственно. Длинноволновое расположение полос по лощения агрегатов цитозина и его производных приводит к тому, что концентрационная зависимость спектров люминесценции наблюдается лишь при длинноволновом возбуждении, в области края полосы поглощения мономеров, что ранее не исследовалось. Вклад полос агрегатов в суммарную люминесценцию падает с концентрацией и исчезает при С = 4*10"^ М, ■что объяснено ростом размеров агрегатов и падением при этом квантового выхода люминесценции.

Длинноволновое смещение полосы поглощения при агрегации цитозина и его производных соответствует плоским агрегатам, например, димерам с водородными связями. Такие ди-меры компонентов НК характерны для органических растворителей. В нашем случае это могут быть микрофазы этиленгликоля, наличие которых в водно-этиленгликолевых стеклах состава 1:1, V показано нами в специальных опытах с люминесцентным зондом (салициловая кислота).

Для аденозина и аденозиныонофосфата концентрационные исследования привели к обнаружению агрегатов другого типа с расщепленной полосой поглощения (небольшое коротковолновое смещение максимума и длинноволновое плечо у 260 ни) и полосой люминесценции с максимумом у 330 ны, что близко

к полосам аденилового динуклеотида. Это говорит о расположении молекул в агрегате в виде "стопы", что характерно для водного окружения. Вклад полос агрегатов растет с концентрацией и остается существенным при минимальной доступной " концентрации 5 10 Ы. Обнаруженные нами сильнолюминесцирую-щие агрегаты являются второй существенной причиной различия спектров поглощения и возбуждения люминесценции растворов мономерных компонентов НК при 77 К.

Третьей причиной различия спектров возбуждения и поглощения является люминесценция редких сильнолюминесцирующих таутомеров, что характерно для растворов аденина и гуанина. Наши исследования спектров возбуждения флуоресценции аденина подтвердили точку зрения Каллиса том, что в

этом случае люминесцирует лишь редкий А^-Н таутомер со смещенной к 270 нм полосой поглощения. Дополнительно мы показали, что спектральная зависимость квантового выхода люминесценции определяется вкладом поглощения Д7-Н таутомера в суммарное. Каллис предположил , что в случае гуанина так-

же люминесцирует лишь А^-Н таутомер, однако наши исследования соединений, моделирующих два таутомера гуанина (ацикловир и его Ь/у изомер) показали, что в случае гуанина вклады двух таутомеров в суммарную люминесценцию сравнимы и зависят от длины волны возбуждения.

Ранее в литературе не ставился вопрос о причинах очень сильного в 200 раз) различия квантовых выходов флуоресценции ^с-Н и Nд -Н таутомеров аденина. Наши исследования люминесценции аденозина, описанные ниже, привели к модели тушения люминесценции аденина и его производных, которая объясняет различие люминесцентных свойств таутомеров аденина и различия между адениноы и гуанином.

Четвертой причиной различия спектров возбуждения и поглощения компонентов НК является гетерогенность их растворов в отношении образования водородной связи с растворителем. Для цитизина и его производных она проявляется в условиях, когда агрегаты не дают вклада в люминесценцию (С = 4 10"^ М, рис.1, кр.Г и 4). Гетерогенность растворов цитозина и производных в отношении образования водородных свя -

300 280 260 Хин

/ I

РисП Спектры поглоцения. (I) п возбуждения'флуоресценция

при Лрсг = 340 нм (2-4) СусI в ЭГ:Н20 (1:1, V

рН 7.1, 77 К .

I - И-10~Ц и 4-10"3Ц; 2 - 4-Ю-5 Н; 3 - 4-Ю"4 Ы;' —3

4 Ц-Ю~ ; 5 - разность спектров (2-0; б - разность спектг (3-4) = 0.36-(3-4)

зей с растворителем проявляется в спектрах поглощения: при нагреве водных растворов или переходе от водных к апротонным растворителям наблюдаются длинноволновые сдвиги спектров поглощения. Наличие изобестических точек в спектрах говорит о существовании только двух форм растворенных молекул. Было показано ОсЯпоя \МС. еЬ а1.. ), что длинноволновая форма - не иминный таутомер, как предполагалось ранее, а молекулы без водородной связи с растворителем. Мы показали, что при переходе от водных к водноэтиленгликолевым растворам цитозина и его производных наблюдаются те же дифференциальные спектры поглощения, что и при нагрева водных растворов или переходе к апротонным растворителям, что означает существование тех же двух форм молекул: с водродной связью с растворителем и без нее, причем с ростом доли этиленгликоля растет доля молекул без водородной связи.

Было показано, что разночть между спектрами возбуждения и поглощения совпадает по форме с дифференциальными спектрами поглощения при росте доли этиленгликоля в растворе. При этом спектры возбуждения и поглощения нормировались по изобестической точке спектров поглощения, а не по максимумам, как было принято раньше. Анализ показал, что при такой нормировке разность спектров поглощения и возбуждения пропорциональна разности £ двух форм молекул с разными квантовыми выходами люминесценции. Такую же форму должны иметь и дифференциальные спектры поглощения, если при смене растворителя меняются лишь доли двух форм молекул. Полученное совпадение двух типов разностных спектров означает, что весь эффект различия спектров поглощения и возбуждения объясняется различием квантовых выходов двух форм молекул, и не требует предположения о нарушении закона Вавилова. Были определены квантовые выходы молекул цитидина без водородной связи ( Хк = 293 нм) и с нею (= 265 нм), они составили соответственно 4,4 10"^ и 4,5 10"^. Спектр поглощения молекул без водородной связи, найденный из закона зеркальной симметрии по отношению к спектру флуоресценции при длинноволновом возбуждении (293 нм), имеет максимум при 278 нм, что совпадает со значением максимума в апротонном растворителем диоксане.

Для аденозина и аденозинмонофосфата при С = 5» 10"^ M обнаружено смещение спектра возбуждения на 10 нм относительно спектра поглощения в длинноволновую область, при этом спектр возбуждения, в отличие от спектра поглощения, структурирован Ранее исследовались более концентрированные растворы. Показано, что кроме агрегатов, описанных вше, люминесцирует редкая форма мономеров со структурированными спектрами. Анализ дифференциальных спектров, аналогичный анализу дифференциальных спектров цитозина и его производных, показал, что в люминесце: ции проявляется та же форма мономеров, что и в спектрах погло щения водных растворов при повышенных температурах.

Теоретическое исследование взаимодействия аденозина с од ной молекулой воды (Полтев В.И. и др., 1987) показано, что энергетически наиболее выгодным является образование цикличес кой водородной связи между аминогруппой и атомом Л/7 через -ОН группу воды. Мы предположили, что редкой люыинесцирующей формой гидратации аденозина является форма с разорванной цикл ческой связью (рис.2), а молекулы с циклической водородной связью 'потушены!! 'Тушение* люминесценции в молекулах с цикличес кой водородной связью объяснено изменением ядерной конфигурации при возбуждении, например, за счет синфазного переноса протонов, и сближением потенциальных поверхностей основного и возбужденного состояний (рис.3). Связь тушения с циклической водородной связью подтверждена изучением люминесценции A'é,A/é-диметиладенина, где образование такой связи невозможно, как и в случае Nj -H таутомера аденина. Оказалось, что и в этом случае квантовый выход высок (0,1)? и спектр возбуждения совпа дает со спектром поглощения. Квантовый выход люминесценции аденозина в редкой форме гидратации равен 2*10"^, в основной, с циклической водородной связью 4 2*10~^.

Модель тушения люминесценции в молекулах с циклической водородной связью позволяет с единой точки зрения объяснить сильное различие в квантовых выходах флуоресценции /V7-H и Ng -H таутомеров аденина, влияние метилирования Ыу атома или аминогруппы аденина на люминесцентные свойства и различие спектров возбуждения и поглоцения и малый квантовый выход люминесценции аденозина. Высказано предположение, что

..о—н

Ц И1' I

/V

/ч

ч-

I.

2.

Рис.2 Две формы гидратации аденозина.

1 - основная, с циклической И-связью,

2 - редкая, без нее.

I.

Е

Рис.3 '. Потенциальные кривые ¿о и

состояний аденозина с циклической Н-связью (I) и без нее (2).

образование циклических водородных связей, тушащих люминесценцию, возможно и в случае цитозина и гуанина, но с более длинными цепочками из молекул воды.

Раздел 4 посвящен изучению фотофизических процессов ' в комплексах мономерных компонентов НК с биологически активными соединениями. Изучался перенос заряда (по появлению соответствующих полос поглощения) в комплексах между нуклеиновыми оси ваниями, нуклеозидами и нуклеотидами и электроноакцепторными молекулами (in гбензохинон, хлоранил и иод) в растворах,и туше ние люминесценции акридиновых красителей (профлавин, акрифла-вин и акридиновый оранжевый) при их коыплексообразовании в растворах с нуклеотидами и их аналогами.

Показано, что в смешанных растворах мономерных компонентов НК с электроноакцепторными молекулами сразу после смешения возникают новые полосы поглощения в области (350-450) нм, которые не характерны ни компонентам НК, ни акцепторам. Полосы были зарегистрированы по дифференциальной методике. Показано, что для новых полос выполняются все критерии отнесения к полосам переноса заряда: I) положение их максимума определяется потенциалом ионизации донора электрона Хх> (при одном акцепторе) ; 2) они обладают большой шириной и бесструктурностьк 3) с понижением температуры их интенсивность обратимо возрастает.

Исследование зависимости положения полос КПЗ ^пз от потенциала ионизации донора позволило не только подтвердить донорно-акцепторную природу комплексов, но и решить вопрос, какими донорами: Tf - или V-u-типа являются компоненты НК в таких комплексах. При этом мы опирались на данные Мал-ликена и Пирсона (МаШСКт fezson W.R.I9^)0 различной зависимости RVn3 (Хр) для комплексов ciT- и U, -доноров с иодом. , УХ, -бензохинона и хлотэанила были известны лишь зависимости

Ь»пз (Ть)

для Tf -доноров (ароматические молекулы). Мы получили дополнительно зависимости Мп2> (j^J для комплексов п -бензохинона и хлоранила с Ю, -донорами (алифатические амины и пиридин). В обоих случаях эти зависимости по положению и наклону сильно отличаются от тех же зависимсстей для ТГ-доно-

-Т7 -

ров (рис.4 - Уг-бензохинон). Как видно из рис.4, все данные для полос КПЗ с участием компонентов НК попадают на прямую для ЗГ1 -доноров. Аналогичные данные получены для комплексов с хлоранилом и иодом. Это означает, что в таких комплексах мономерные компоненты НК являются , а не уг -донорами, как предполагалось ранее.

Наличие полос поглощения КПЗ с участием компонентов НК в области (300-500) нм может привлекаться для интерпретации фотобиологических эффектов в этой области спектра, т.к. в живых клетках содержатся электроноакцепторные молекулы типа хинонов.

Исследование тушения люминесценции акридиновых красителей нуклеотидами было предпринято с двумя целями. Во-первых, мы искали объяснение различия во влиянии на люминесценцию разных красителей комплексообразования с ДНК (люминесценция профлавина и акрифлавина тушится, а акридинового оранжевого - нет). Во вторых, это исследование было направлено на подтверждение модели тушения люминесценции пу-риновых нуклеиновых оснований с участием А/^ атома и аминогруппы.

В литературе имелись данные лишь о влиянии нуклеоти-дов на люминесценцию профлавина (при этом было обнаружено тушение в случае гуанозинмонофосфата) и об отсутствии тушения акридинового оранжевого адениловыы, цитидиновым и тими-диновым нуклеотидами. Мы подтвердили эти данные и дополнили их аналогичными результатами для акрифлавина с четырьмя нуклеотидами и акридинового оранжевого с гуанозинмонофосфа-том (табл.2).

ТАБЛИЦА 2.

Влияние нуклеотидов на интенсивность люминесценции акридиновых красителей профлавина Ш, акрифлавина (М) и акридинового оранжевого (АО). 18°С, Н20

Нуклеотид____^ щ________=М===~—=__АО

0,26 0,28 0,95

Ар 1,3 1,5 2,4

Ср 1,0 1,2 1,1

Тр 1,1 1,2 1,0

-18 -

4

7-' ' 8 3

Ркс. 4 Зависимость энергии, соответствующей максимуму"

полосы поглощения КПЗ от потенциала ионизации

* Тг'

донора. Акцептор - п-(5ензохиноц. А - л - доноры, Б 1 п> - доноры; & - гуанозин и его производные, С - кос^еин, ЗМА - 9Метцладеннн, АЛе- аденин и ; его производные, Н ~ гипоксантик.

Уп*.* Л / э /о . "г

с* 8/1 Ас1е Б

• А*

8/

Уо д

о "" | .1

Х0 - интенсивность люминесценции свободного красителя (С = 10"^ М), Хт - то же в присутствии нуклеотида (С = Ю"2 М).

Как видно из табл.2, тушение люминесценции наблюдается лишь в случае профлавина и акрифлавина в смешанных растворах с гуанозинмонофосфатом. При этом было показано, что спектр возбуждения совпадает со спектром поглощения свободного красителя, и тушение падает с ростом температуры. Эти данные показывают, что тушение имеет статический характер, т.е. уже в основном состоянии образуются нелюминесцирующие комплексы. Вычисленный спектр поглощения I® в комплексе с бр оказался близок к спектру П1> в комплексе с ДНК.

Были исследованы кривые тушения профлавина пуриновыыи нуклеотидами и их аналогами, из которых были найдены константы ассоциации для нелюшнесцирующих комплексов, приведенные в табл.3.

ТАБЛИЦА 3.

Константы ассоциации (К&) профлавина с пуриновыыи нуклеотидами и их аналогами по данным тушения люминесценции, С^ = 4-Ю-6 М, 18°С, Н20

Тушитель Ка, М-* Потенциал

ионизации,

__________________ ___===г====^==^_аВ—

230+15 7,77

Ацикловир 170+10

7-изомер ацинловира 210+10

7-метилгуанозин ¿35

бензимидазол 100+5 8,31

имидазол 120+5 8,67

Ар , N -диметиладенин - 8,26

690+20

Данные таблиц 2 и 3 обнаруживают резкую зависимость тушения как от структуры красителя, так и тушителя)и отсутствие корреляции между тушением и потенциалом ионизации. Так, бен-зимидазол и Ар при близких потенциалах ионизации обладают существенно разной тушащей способностью. Это указывает на

образование при тушении не КПЗ, а комплексов со специфической связью, скорее всего, водородной, между активными группами, а именно аминогруппой красителя и А/у атомом пурина. Действительно, метилирование аминогрупп красителя (акридиновый оранжевый) устраняет тушение, как и замещение по /V? атому (7-метилгуанозин). Отсутствие тушения в случае Ар объяснено нами наличием циклической водородной связи между /У? атомом и своей аминогруппой. Разрыв циклической связи в случае - диметиладенина приводит к еще бо-

лее эффективному тушению, чем в случае б-р .

Таким образом?данные о тушении люминесценции акридиновых красителей цуриновыми основаниями подтверждают способность //рг атома пуринов образовывать водородную сеязь с аминогруппой, приводящую к тушению люминесценции. Кроме того, эти данные объясняют различное влияние на люминесценцию акридиновых красителей комплексообразования с ДНК. Тушение происходит только в случае красителей, способных к образованию водородной связи между аминогруппой и А/? атомом пурина.

В разделе 5 описаны исследования экситонных эффектов в агрегатах профлавина, акрифлавина и фталоцианина магния (Шц Мд) в различных экспериментальных условиях (замороженный раствор АО в этаноле, твердые растворы ПЗ и АЗ в поли-винилбутирале и адсорбированное состояние АФ и Фц М^ на микропористом стекле и аэросиле в вакууме). Изучались изменения при агрегации спектров поглощения, флуоресценции и фосфоресценции и их возбуждения. Эти исследования явились опорными для поиска и изучения экситонных эффектов в спектрах поглощения и люминесценции ди- и полинуклеотидов (раздел 6). Интерес к агрегации акридиновых красителей связан кроме того с тем, что они образуют комплексы с ДНК в виде мономеров или агрегатов. Для М и <Бц Ма исследовались также изменения фотохимической и теынорвой реакционной способности по отношению к электроноакцепторным молекулам (кислород и хлоранил). Для изученных красителей показано, что при агрегации наблюдается расщепление (М и Фц М^ ) или смещение (АО) первой полосы поглощения и длинноволновое смещение полосы флуоресценции, что согласуется с экситонной мо-

делыо спектральных свойств огрегатов. Величина экситонного расщепления составляет (1600-5700)см-*.

Для всех красителей обнаружено несколько типов агрегатов. Для АО в этаноле при 77 К по спектрам флуоресценции обнаружено 4 агрегата с Лт>х= 535, 572, 605 и 645 ны. В спектрах поглощения Фц Мд на аэросиле и спектрах флуоресценции АЗ? на азросиле проявляются два типа агрегатов.

Для АО в этаноле впервые обнаружено сильное смещение полосы фосфоресценции болших агрегатов (на 1960 см"*) относительно полосы мономера. Это объяснено близостью экситонного и синглет-триплетного расщеплений, что приводит к смешению возбужденного синглетного и триплетного уровней, расщеплению триплетного уровня и уменьшений запрета интеркомбинации.

Обнаружена повышенная темновая и фотохимическая реакционные способности димеров 3>ц М^ относительно мономеров в реакциях с кислородом (в темноте и на свету) и хлорани-лом (в темноте). Аналогичные результаты получены для димеров АФ в фотохимической реакции с кислородом. В случае §ц Ы^ продуктом реакции является его катион-радикал, что установлено по спектрам поглощения. Повышение реакционной способности красителей при агрегации объяснено снижением потенциала ионизации.

В разделе 6 описаны спектральные проявления экситонного взаимодействия нуклеиновых оснований в гомогенных динуклеозидфосфатах СрС, АрА, брв, ТрТ, динуклеотиде СрСр и полинуклеотидах поли-С и поли-А при 77 К и 293 К (АрА и поли-А). Ранее считалось, что в УФ спектрах поглощения этих молекул проявления экситонного взаимодействия слабы, экситонное расщепление 4 1000 см-*, в то время как в спектрах кругового дихроизма наблюдались экситонные "консервативные" спектры с расщеплением3000 см-*. Считалось, что между УФ и КД спектрами нет соответствия. Люминесценцию ди- и полинуклеотидов, смещенную в длинноволновую сторону относительно мономерной, объясняли образованием эксимеров.

Исследование спектров возбуждения люминесценции СрСр, Ср<?; поли-С, АрА и поли-А привело к обнаружению фракции молекул ("закрытые" конформеры) с экситонным расщеплением

УФ-спектров "3000 см-с'хорошим соответствием УФ и КД спектров. В некоторых случаях экситонную природу У<Б-спект-ров подтверждают поляризационные данные (смена знака Р в пределах расщепленной полосы поглощения). Показано, что люминесценция ди- и полинуклеотидов имеет экситон-эксимер-ную, а не эксимерную природу, причем при 77 К эксимерный вклад в длинноволновое смещение полосы мал.

Обнаружение конформеров с экситонными спектрами У25-поглощения через спектры возбуждения люминесценции обязано относительно высоко^ квантовоьу выходу люминесценции этих ков$ормеров, так что они дают основной вклад в спектры возбуждения и малый - в спектры поглощения из-за относительно малой концентрации. Кроме того, понижение температуры до 77 К увеличивало концентрацию экситонных конформеров.

Впервые экситонные спектры возбуждения были обнаружены нами для СрСр при 77 К (ЭГ^О, V ). Предварительно были изучены спектры поглощения при 297 К и различных рН. Для нейтральных растворов переход от Ср к СрСр не меняет формы спектра поглощения (/\™>.*= 271 нм в 1^0), но взаимодействие нуклеиновых оснований проявляется в гипохромном эффекте (6,5% при 260 нм). При рН 1,5 гипохромного эффекта не наблюдается.

При 77 К было проведено люминесцентное титрование СрСр, которое обнаружило смещение рК при понижении температуры от 4,3 до 5,2 ед.рН, что аналогично Ср, но эффект смещения рК меньше. Только нейтральная форма наблюдается при рН^.7,5, только протонированная - при рН^З,0.

При 77 К спектр поглощения нейтральных молекул СрСр сильнее отличается от спектра Ср, чем при 297 К: максимум сдвинут^ на 3 нм (500 см-*) в коротковолновую сторону, а с длинноволновой стороны появляется плечо (рис. 5а, кр.1 и 2). Эти изменения в спектре поглощения более ярко проявляются в спектре возбуждения флуоресценции (рис.5а, кр.З): смещение максимума достигает 7 нм (1000 см-*) относительно мономера, плечо у 288 нм дополнительно поднято.

Спектр возбуждения нормирован в изобестической точке. Совпадение различных дифференциальных спектров (рис.56) при такой нормировке показывает двукомпонентность системы:

ЧсК 300

ОТНед.

280

260 X,

ни

10-

®

272

I ' 269\

V — •

0,5-

Рис.'5 ■ Спектры поглощения Ср, рн 10.0 (I), СрСр, рН 7.9 (2)

Я. У N

и спектр возбуждения флуоресценции СрСр, рН 8.0,^. :

= 340 нм (3) при 77 К, ПО"*1 М. б) Разностнне спектры 4 - (¿СрСр " ^"^^СрСр? '<1'8; 5- (6Ср- С^срСр); б- (¿ср-^срср)

в растворе имеются конформеры без взаимодействия оснований ("открытые") со спектром поглощения мономера и конформеры с взаимодействием ("закрытые") со спектром поглощения, совпадающим со спектром возбуждения. Спектр поглощения "закрытых" кокфорыеров, близкий к спектру возбуждения, был получен также вычитанием из суммарного спектра поглощения СрСр спектра "открытого" конформера с соответствующим вкладом. '

Показано, что положение максимума и плеча спектра поглощения "закрытого" конформера 265 и 288 нм согласуется с положением максимумов "консервативного" компонента в спектре ИД СрСр (265 и 290 нм). (Спектр НД "консервативного" компонента был получен вычитанием из спектра БД СрСр спектра КД Ср). Это согласие, а также наличие расщепления в спектре поглощения "закрытого" конформера позволяют интерпретировать его как экситонный. Величина расщепления •v3000 см-*, сравнимая с полушириной полосы поглощения мономера (--v4500 см"*), показывает, что экситонное расщепление в этом случае среднее. Ранее для азотистых оснований близкую величину экситонного расщепления (3600 см-*) наблюдали лишь для агрегатов метилированного тимина, полученных фотолизом фотодимеров при 77 К Иогпй1аМ./Есф^г1МВ).

Спектр флуоресценции СрСр смещен относительно спектра Ср на 2850 см-* в длинноволновую сторону (максимумы у 315 и 347 нм), при этом практически не содержат вклада спектра Ср, что объясняется ростом квантового выхода при переходе к СрСр от 1,8% до 12%. Таким образом флуоресценция СрСр при 77 К обязана редкому "закрытому" конформеру с экситонным, расщепленным спектром поглощения. Длинноволновое смещение спектра флуоресценции СрСр относительно Ср обязано, в основном, экситонноыу расщеплению полосы поглощения (нижний экситонный уровень смещен на —2000 сы-* относительно уровня Ср), а не образованию эксимера, как считалось ранее.

Для СрС при 77 К были получены спектры поглощения, люминесценции и ее возбуждения, а также поляризационный спектр в сравнении с теми же спектрами для Ср. Спектры флуоресцен-

ции и ее возбуждения оказались близкими к спектрам для СрСр, но спектр поглощения в случае СрС совпадает со спектром возбуждения, что означает гомогенность системы: имеются лишь "закрытые" конформеры с взаимодействием оснований. Это объясняется увеличением стэкинг-взаимодействия по сравнению с СрСр, где имеется расталкивание двух фосфатных групп. В спектрах поглощения и возбуждения хорошо видно экситонное расщепление ~ 3000 см-* (максимум у 266 и плечо у 288 нм), что близко к расщеплению в спектре 1Щ 3200 сы~*. Флуоресценция СрС полностью деполяризована в отличие от Ср, что также согласуется с экситонным расщеплением полосы поглощения СрС.

Данные для АрА при 77 К качественно близки к данным для СрСр: система гетерогенна, спектр поглощения определяется основным "открытым" конформером, а в спектрах флуоресценции и ее возбуждения проявляется только редкий "закрытый" конформер за счет- относительно высокого квантового выхода. В спектре возбуждения четко видно экситонное расщепление: максимум у 258 нм и плечо у 282 нм. Расщепление ~ 3000 см~* соответствует расщеплению в спектре НД (максимумы у 252 и 272 нм), но полосы в спектре возбуждения сдвинуты в длинноволновую сторону. Поляризационный спектр меняет знак в пределах полосы возбуждения, в отличие от Ар, что также подтверждает экситонное расщепление полосы поглощения АрА. Полоса флуоресценции АрА сдвинута на 2800 см в длинноволновую сторону относительно полосы Ар, что обязано, в основном, экситонноцу расщеплению возбужденного уровня.

Спектры люминесценции и ее возбуждения поли-С и поли-А при 77 К близки к тем же спектрам СрС и АрА. Это означает, что экситонное взаимодействие в этих полимерах ограничено димером.

В 5р & и ТрТ экситонное взаимодействие проявляется относительно слабо, наблюдается лишь небольшое (на 500-600 см~^) длинноволновое смещение полос флуоресценции относительно мономеров и уширение полос возбуждения относительно полос поглощения. Слабое проявление экситонных эффектов в люминесценции G-pß и ТрТ возможно связано с тем, что, в отличие от СрСр, СрС и АрА, при переходе от мономеров к ди-

мерам нет роста квантового выхода, и в люминесценции не подчеркиваются свойства редких "закрытых" конформеров.

При комнатной температуре были изучены спектры флуоресценции, ее возбуждения и поляризации для АрА и поли-А в водных нейтральных растворах. Высокая степень поляризации (до 0,2) в водных растворах вызвана очень низкими квантовыми выходами (-v 10"^) и, соответственно, временами жизни возбужденного состояния (10~^-10~*2) с, что сравнимо с временем релаксации среды. Спектр флуоресценции АрА при 290 К существенно отличается от спектра при 77 К и зависит от Л& . В нем могут быть выделены четыре компонента с Т\т«у = 315, 355, 400 и 435 нм, относящиеся к четырем конформерам: "открытому" (315 нм) и трем "закрытым". Спектр возбуждения "закрытых" конформеров близок к спектру возбуждения при 77 К и имеет экситонный характер: максимум смещен к 255 ны, в длинноволновой области спектр уширен за счет расщепления полосы. Степень поляризации меняет знак в области спектра возбуждения, что также подтверждает экситонный характер спектра.

Спектр флуоресценции поли-А' при 290 К с максимумом при 445 нм имеет более простой вид, чем спектр АрА и не зависит от Àk , Видимо, он обязан лишь одноьу из "закрытых" конформеров АрА. Спектр возбуждения с максимумом у 252 нм и явным плечом у 274 нм - экситонного типа, причем положения максимума и плеча хорошо соответствуют спектру НД АрА (252 и 272 нм), Экситонный характер спектра возбуждения подтверждается и отрицательными значениями степени поляризации в коротковолновой области спектра возбуждения.

Все проявления экситонных полос поглощения СрСр.СрС, поли-С, АрА и поли-А в различных спектрах собраны в табл.4, где большая часть данных по спектрам ИД, а также дифференциальным спектрам взяты из литературы. Данные табл.4 показывают, что наши данные по спектрам возбуждения и поглощения "закрытых"конформеров находятся в удовлетворительном согласии со спектрами ВД.

Обнаружение "закрытых"конформеров с экситонными спектрами поглощения, а также учет различия между спектрами флуоресценции при 77 К и 290 К позволил предложить .

ТАБЛИЦА 4.

Проявление экситонных полос поглощения СрСр, СрС, поли-С, АрА и поли-А в различных спектрах

Вещество, вид спектра, температура А^мах Л мах нм - см

СрСр

Спектр возбуждения, 77 К 265 288 3000

Спектр поглощения, 77 К 266 289 3000

Спектр НД, 293 К 265 290 3200

СрС

Спектр возбуждения, 77 К 266 288 2900

Спектр поглощения, 77 К 266 288 2900

Спектр ВД, 293 К 262 286 3200

261 281 2700

Поли-С

Спектр возбуждения, 77 К 266 292 3300

Спектр поглощения, 77 К 266 292 3300

БД, 0°С, рН 4.0 265 287 2900

Дифференциальные спектры пог-

лощения, 300 К 291-299

АрА

Спектр возбуждения, 77 К 258 282 3300

Спектр поглощения, 77 К 258 282 3300

Спектр КД, Тк 252 272 3000

Поли-А

Спектр возбуждения, 77 К 258 282 3300

Спектр поглощения, 77 К 256 282 3600

Спектр возбуждения, 293 К 252 274 3200

Спектр КД, 293 К 248 262 2300

Дифференциальные спектры пог -

лощения, 300 К 286-290

- 28 -

экситон-эксиыернуга модель первичных фотопроцессов в ди- и полинуклеотидах вместо ранее принятой эксимерной (рис.6). В ней рассматривается два типа центров поглощения света: I) "открытыепконфорыеры без взаимодействия оснований с мономерными спектрами поглощения и люминесценции; 2) "закрытые" конформеры с экситонными спектрами поглощения и эк-ситон-эксимерной флуоресценцией. При этом эксимерный вклад в длинноволновое смещение флуоресценции относительно мономерной мал при 77 К (^ 1000 см-"1-) и велик при 290 К (до 9000 см-*). Различие эксимеров при разных температурах связано с жесткостью среды при 77 К.

Высказано предположение, что спектры действия различных фотофизических, фотохимических и фотобиологических процессов в системах, включающих ДНК и ее компоненты с макси-ыуыаш в области (280-290) нм указывают на участие в этих процессах "экситонных" конформеров ДНК.

- 29

Е1 ~

к

Ркс.6. Экситон-эксимернзя модель фотопроцессов в ди- и полинуклеотидах при 77 К и 290 К

I - эксинер при 77 К, П - зкскмер при 290 К.

I - погловдние, 2 - ломинесценция в открытых

конфориерах,

3,4 - экситояное поглощение в закрытых кон^ормерах.

'5 - окситон-эксимерная ягоминесценцмя при 77 К,

б - эксптон-эксимерная люминесценция прк 290 К.

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В заключение кратко рассмотрим значение полученных результатов для биофизики, молекулярной биологии и молекулярной фотобиологии.

Выявленный нами механизм чрезвычайно эффективного тушения (за время'»/10"^ с) возбужденных состояний нуклеиновых оснований циклическими водородными связями с участием воды (растворителя) открывает пути увеличения квантового выхода люминесценции нуклеиновых кислот и их компонентов через их химическую модификацию, например, метилирование, устраняющую циклические водородные связи. Это позволит широко использовать метод люминесценции для изучения нуклеиновых кислот и их комплексов с биологически активными вещест вами, в том числе и белками. Видимо, механизм тушения возбужденных состояний нуклеиновых оснований водсй является природным механизмом защиты нуклеиновых кислот от действия излучений. В принципе, этот механизм можно использовать и для защиты синтетических полимеров, если ввести в их структуру соответствующие химичзские группы.

Тот же механизм тушения люминесценции водородными связями объяс няет различное влияние на люминесценцию разных акридиновых красите лей комплексообразования с ДНК. Понимание механизма тушения поможет в выборе акридиновых красителей, удобных для решения разнообразных физико-химических задач по исследованию ДНК и их комплексов с белками.

Обнаружение полос переноса заряда комплексов нуклеиновых основа ний и нуклеотидов с электронсакцепторными молекулами, в частности, с хинонаш может быть использовано для интерпретации механизма фотобиологических эффектов в живых клетках в области спектра 300-500нм.

Обнаружение конформеров динуклеотидов с экситонными спектрами УФ поглощения позволяет с новой точки зрения взглянуть на соответствие спектров УФ поглощения, КД и люминесценции нуклеиновых кислот и их немономерных компонентов. Стало ясно, что спектрально сильно различаются два типа конформеров динуклеотидов, или соседних оснований в нуклеиновых кислотах: с достаточно сильным стэкинг взаимодействием (экситонное расщепление УФ спектров ■- ЗОООсм-*) и со слабым стэкинг-взаимодействием. Отсюда следует, что все фотопро цессы в этих двух типах объектов в составе нуклеиновых кислот следует рассматривать отдельно. Уже из полученных результатов видно,

Г - зг--у

что для этих двух случаев сильно различаются квантовые выходы люминесценции, а значит и вероятность безызлучательных 1 процес сов. На примере фталоцианина магния и акрифлавина показано, чт у дцмеров с сильным экситонным расщеплением электронных полос значительно повышается фотохимическая активность по отношению к электроноакцепторным молекулам, что объяснено падением потенциала ионизации.

Полученный экспериментальный материал позволил предложить новую, экситон-эксиыерную схему первичных фотопроцессов в ди-и полинуклеотидах, которая, вероятно, применима и для других видов нуклеиновых кислот.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

Полученные в работе экспериментальные результаты и их анализ позволяют сделать следующие основные выводы.

1. Различия спектров поглощения и возбуждения люминесценции мономерных компонентов НК обязаны не нарушению закона Вавилова, а гетерогенности их растворов и сильной зависимости квантового выхода люминесценции от структуры молекул. При этом основные нейтральные формы молекул люминес-цируют значительно слабее, чем редкие таутомерные и ионные формы, агрегаты и молекулы в редкой форме гидратации, которые, в основном, проявляются в спектрах возбуждения люминесценции, не давая существенного вклада в спектры поглощения за счет малой концентрации.

2. Существенную роль в дезактивации состояния основных форм цитозиновых и адениновых компонентов НК играет образование водородных связей с растворителем. Для аде-нина и его производных предложена модель тушения люминесценции циклической водородной связью между аминогруппой и атомом N7 через -ОН группу растворителя, которая объясняет зависимость люминесцентной способности от структуры мо-

-33 1

ленулы. Высокие квантовые выходы люминесценции (до 0.7 при 77 К) наблюдаются лишь для молекул, структура которых не позволяет образования циклической водородной связи (А^-Н таутомер аденина и молекулы, метилированные по Nj-атому или аминогруппе).

3. Комплексообразование акридиновых красителей (®, А<5 и АО с нуклеотидами приводит к тушению их люминесценции только в случае комплексов Ш> и A3» с &р , что связано с образованием водородной связи между аминогруппой красителя и Nf атомом б-р . Отсутствие тушения в случае Ар связано с участием атома Щ аденина в циклической водородной связи со своей аминогруппой через -ОН группу растворителя. Разрыв циклической водородной связи при метилировании аминогруппы аденина приводит к тушению люминесценции Ш в комплексах с /V//V6 диметиладенином.

4. Мономерные компоненты НК и их аналоги способны образовывать комплексы с переносом заряда с электроноакцептор-ными молекулами (хиноны, иод), выступая в роли <ТГ -доноров электрона. Максимумы полос переноса, заряда, положение которых определяется потенциалом ионизации донора, лежат в области 300-500 ны.

5. Проявления агрегации красителей, способных к коып-лексообразованию с НК (ПЗ, АО, Mg), в спектрах поглощения и люминесценции, а также в ^pV, качественно описываются экситонной моделью. Обнаружено, что димеры Фц М^ и A3?, адсорбированные на микропористом стекле и аэросиле, проявляют повышенную реакционную способность в темно-вой и фотохимической реакции с кислородом. В случае 2ц Mcj продуктом реакции является катион-радикал. Повышение реакционной способности красителей при агрегации объяснено снижением потенциала ионизации.

6. Для некоторых конформеров динуклеотидов СрС, АрА

и СрСр, а также для полинуклеотидов поли-С и поли-А характерны экситонные спектры поглощения с расщеплением ^ 3000 см-*, обнаруженные впервые по спектрам возбуждения флуоресценции. Экситонный характер спектров возбуждения подтвержден их соответствием "консервативным" спектрам кругового

дихроизма и, в некоторых случаях (АрА и поли-А), поляризацион-наш; спектрами, Экситонный участок в полинуклеотидах, судя по спектрам флуоресценции и ее возбуждения, ограничен диыером. Это отличает полянуклеотиды от красителей, для которых характерны экситонные агрегаты с различным числом молекул (ф ц , АФ, АО). Предполагается, что это связано с насыщаемостью взаимодействия между азотистыми основаниями в экситонных ди-мерах за счет специфических, например, водородных связей.

Совместно с И.Я.Скуратовским предложена структурная модель плотноупакованных, сжатых "вертикальными" Н-связями "экситонных" конформеров динуклеотидов с межплоскостным расстоянием ^ 3,0 й, недавно подтвержденная рассчетными данными (РопапМ. а* йД, »992).

7. Предложена экситон-эксимерная модель перивчных фотопроцессов в ди- и полинуклеотидах вместо ранее принятой эк-симерной. Для АрА и поли-А показано, что образование эксиме-ра затруднено при 77 К, но становится более вероятным при комнатной температуре.

»i

- 35 ;

СПИСОК РАБОТ АВТОРА ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Компаниец В.В., Рапопорт В.Л., Жадин В.Л. Спектральное исследование агрегатов молекул фтадоцианинов в адсорбированном состоянии // Оптика и спектроскопия, - 1972.-Т.33, V 4.-C.646-65I.

2. Рапопорт В.Л., Жадин H.H. Изменение фотохимической активности фталоцинина магния в реакции с кислородом при агрегации J J Докл.АН СССР. -I973.-T.2I2, * 5, - C.II55-II58.

3.Безруков 0.$., Букс M.S., Рапопорт В.Л., Шурупова Л.В., Малевский A.A. Люминесценция салициловой кислоты в водных растворах этилового спирта. Проявление структурных особенностей этих растворов J J Сб. Молекулярная физика и биофизика водных систем. -Л., 1974. - Вып.2. - С.85-92.

4. Рапопорт В.Л., Мельцер Л.В., Хрусталев А.З, Пи-до-норный характер цуриновых нуклеозидов и оснований в комплексах с переносом заряда в водных растворах J J Сб. Moле кулярная физика и биофизика водных систем. - Л., 1976. -Вып.З. -C.IOO-114.

5. Белякова В.М., Вукс М.Ф., Рапопорт В.Л. Исследование структуры спирто-водных растворов методом люминесцентного зонда // Ж.структурной химии. -1977.-Т.18, № 2. -С.297-300.

6. Рапопорт В.Л., Хрусталев А.З., Яковлев М.Д. Времена жизни синглетного состояния и спектральные проявления различных агрегатов акридинового оранжевого в этаноле при 77 К. // Оптика и спектроскопия. - I979.-T.47, в.З. - C.496-50I.

7. Бакулев В.М., Рапопорт В.Л. Люминесценция цитидина

и цитозина при 77 К. I. Проявление агрегации. - Деп. в ВИНИТИ от 28.08.80 № 3910-80.

8. Бакулев В.М., Рапопорт В.Л. Люминесценция цитидина и цитозина при 77 К. 2. Причины несовпадения спектров поглощения и возбуждения люминесценции. - Деп. в ВИНИТИ от 08.12.80 9 5164-80.

9. Малевский A.A., Рапопорт В.Л., Третьяков А.Н. Комплексы с переносом заряда азотистых оснований нуклеиновых кислот и их аналогов с бензохиноном. Доказательство ТГ -донор-ного характера // Молек.биология,- I98I.-T.I5, в.2. -С.447-453.

10. Белякова В.М., Вукс М.Ф., Рапопорт В.Л. Изучение водных растворов некоторых неэлектролитов методом люминес-зонда // Ж.структурной химии. - 1981. - Т.22, № 4. -С.84-86.

11. V,/.., Ьакч^ ММ. Софгьпс&опав

ец^иах ¿Сиио^СсЬ. // 'рЬиЫСа (ЬсорЬи^са - -1982г

\/о1. 27, Д/с 2/3.-£ 253-2.5Н. 1 <

12. Рапопорт В.Л., Бакулев В.М. 0 природе различия спектров возбуждения люминесценции и поглощения цитозина и его производных // Оптика и спектроскопия. - I982.-T.52, в.6. - С.1094-1096.

13. Рапопорт В.Л., Бакулев В.М. Природа различия спектров поглощения и возбуждения люминесценции цитидин-ыонофосфата при 77 К // Вестн.ЛГУ. Физ.и химия.-1982. -№ 16. -С.90-93.

14. Мельцер Л.В., Рапопорт В.Л. Проявление агрегации акридиновых красителей в спектрах штарк-эффекта // Вестник ЛГУ. - 1982.-» 10. - С.82-87.

15. Рапопорт В.Л. Современное состояние исследований собственной люминесценции нуклеиновых кислот и их компонентов // Изв.АН СССР. - 1983. - Т.47, в.7. -С.1Э65-1369.

16. Рапопорт В.Л., Банулев В.М. Люминесцентные особенности компонентов нуклеиновых кислот // Сб.Люминесцентный анализ в медико-биологических исследованиях. - Рига, 1983. -С.237-242.

17. Яковлев М.Д., Рапопорт В.Л. Триплетные состояния различных агрегатов акридинового оранжевого // Оптика и спектроскопия. - 1983. -Т.55, в.6. -С.1073-1075.

18. Рапопорт В.Л., Бакулев В.М. Спектральные проявления конфорыационной гетерогенности в цитидиновом динуклео-тиде. Обнаружение фракции с сильным экситонным взаимодействием между основаниями // Молекул.биология. - 1984. -Т.18, № 2. -С.382-389.

19. Ыалевский А.А., Рапопорт В.Л. Специфичность коып-лексообразования профлавина и акрифлавина с гуанозинмоно-фосфатом по данным тушения люминесценции красителей // Молек.биология.- I987.-T.2I, В.-С.442-447.

20. Белякова В.М., Рапопорт В.Л. Проявление Л/7-Н и Ng -Н таутомеров в люминесценции аденина и гуанина J J

Вестник ЛГУ. -1988. -Сер.4, в.З. -C.98-I00.

21. Рапопорт В.Л., Кононов А.И. Люыинесцирующие кон-формеры аденилового динуклеотида с сильным экситонным взаимодействием между азотистыми основаниями // Докл.АН СССР. -1988. -Т.298, Я» I. -C.23I-235.

22. Рапопорт В.Л., фотофизические процессы в компонентах нуклеиновых кислот // Сб.Иеследование воды и водных систем физическими методами. - Л., 1989.

Z3.Ra^,(^ott V., kononoi/PPiök>pfiq<>iccd jDZccexse*, in с&т-

c4- K\x.dUZc aoCds. II ТА ¿-гсГ Ссисz^sS с^-^кг Еигоьса-ъ Sea^ fo pfutbkoicß : Beek:c£ a&sib.-Budapest /983.-^.123.

24. &eluCikc*ja V.M.,RaboMv(r V.L. Lumäiesanze <W bz/oUms 4 ßiwket, 4 adeAosCm.// X PRob=cW pMcol B>: Bto&fo. /тз-^/^ss/. 5. Коиоисл/ ¿7.Z, ßa^ufev ^'v^

25

effecis db-o^d bo^nu^W.//