Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фотоактивируемые флуоресцентные красители для микроскопии биологических объектов

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Фотоактивируемые флуоресцентные красители для микроскопии биологических объектов"

На правах рукописи

Шапошников Михаил Николаевич

ФОТОАКТИВИРУЕМЫЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ КРАСИТЕЛИ ДЛЯ МИКРОСКОПИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

03.01.04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 о окт гт

00553473°

Москва-2013

; і!

005534756

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» (ФГБОУ ВПО МГАВМиБ)

Научный руководитель: доктор биологических наук,

доктор химических наук, профессор

Зайцев Сергей Юрьевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор, ученый секретарь ФБГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» Букова Наталия Константиновна

доктор биологических наук, профессор Всероссийского научно-исследовательского института животноводства Россельхозакадемии Веротченко Маргарита Александровна

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Казанская государственная

академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»

Защита диссертации состоится « \0 »Ц?2013 г. в ^ часов на заседании диссертационного совета Д 220.042.04 в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» по адресу: 109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23. Тел.: (495) 377-93-83

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина»

Автореферат разослан «Я£» 2013 г. и размещен на сайте http://mgavm.ru

Ученый секретарь диссертационного совета (7

доцент Фомина В.Д.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Одним из перспективных и активно развиваемых направлений современной биохимии и физико-химической биологии является разработка и применение фотоактивируемых флуоресцентных красителей (ФФК), обладающих селективными свойствами окрашивания клеток и субклеточных органелл прокариотических и эукариотических форм живых организмов [Феллинг и сотр., 2007; Хель и сотр., 2008; Белов и сотр., 2010]. ФФК изначально существуют в нефлуоресцентной форме, которая может быть преобразована во флуоресцентную форму путем облучения светом. Изменяя мощность облучающего света и его локализацию, можно варьировать число и пространственное расположение образовавшихся флуоресцентных «зондов» и далее следить за их движением, определять форму и взаимное расположение субклеточных объектов, помеченных ФФК. Эти и другие свойства таких красителей активно используются для разработки и применений новых методов исследования в биологической микроскопии [Хель и сотр., 2008; Белов и сотр., 2010]. Большинство существующих ФФК имеют большой размер «маскирующей» группы, а продукты их фотолиза токсичны для клеток [Банала и сотр, 2011]. Ведущим сотрудником лаборатории бионанофотоники Беловым В.Н. (Макс-Планк-Институт биофизической химии, Гёттинген, ФРГ) и профессором Зайцевым С.Ю. (кафедра химии, ФГБОУ ВПО МГАВМиБ) в ходе многолетней работы по различным направлениям создания и исследования флуоресцентных красителей [Белов, Зайцев, 2010] были смоделированы новые ФФК производные родамина, имеющие компактную «маскирующую» группу, не токсичную для клеток. Эти ФФК являются ценным инструментом для исследователей в биохимии, биомедицине и бионанотехнологиях. Цель работы: комплексное исследование новых фотоактивируемых флуоресцентных красителей — производных родамина, обеспечивающих возможность окрашивания клеток и субклеточных структур.

Исходя из этой цели, были поставлены следующие задачи:

3

1. Получить и исследовать липидные монослои с встроенными молекулами ФФК, определить и охарактеризовать параметры взаимодействия ФФК с липидами мембран.

2. Определить оптимальную концентрацию ФФК для окрашивания клеток, разработать методики активирования ФФК и визуализации с помощью флуоресцентной микроскопии.

3. Получить и исследовать препараты нативных клеток после общей и локальной фотоактивации и определить возможность визуализации клеток в реальном времени, используя ФФК.

4. Получить спектры флуоресценции ФФК в различных средах и выявить зависимость интенсивности флуоресценции от вязкости и рН.

5. Определить локализацию ФФК в препаратах нативных клеткок.

6. Получить конъюгат хитозана с иммобилизованными молекулами ФФК и исследовать его на клеточной культуре.

Научная новизна работы. Впервые получены и детально исследованы смешанные монослои новых ФФК и фосфолипидов, моделирующие взаимодействие ФФК с биологическими мембранами. Определена оптимальная концентрация ФФК для окрашивания клеток, разработаны методики активирования ФФК и визуализации с помощью флуоресцентной микроскопии. Впервые выполнена «прижизненная» микроскопия окрашенного монослоя клеток с помощью ФФК-813. Изучены зависимости спектральных свойств ФФК от параметров среды (вязкости и рН), а также выявлено концентрационное тушение флуоресценции, что позволило объяснить неодинаковую яркость разных субклеточных органелл и отличия окрашивания «фиксированных» и «нативных» клеток. Определена локализация ФФК-813 в нативных клетках эпидермоидной карциномы человека А431 с помощью коммерческих селективных зондов. Впервые синтезирован конъюгат хитозана с ковалентно иммобилизованными молекулами ФФК, и показана его способность проникать внутрь клеток.

Практическая значимость. Полученные результаты позволяют использовать ФФК как клеточные маркеры в коммерческих наборах, а также для конъюгации с различными нефлуоресцирующими БАВ (в том числе лекарствами), которые можно детектировать с помощью локальной фотоактивации красителя в нативных и фиксированных клетках для определения их динамики и локализации. Данные зависимостей спектральных свойств ФФК от параметров среды позволяют оптимизировать параметры флуоресцентной микроскопии с учетом микроокружения красителя. Знания о локализации ФФК-813 в клетке позволят исследовать внутриклеточную динамику конкретных органелл нативных клеток и, возможно, их ультраструктуру в фиксированных клетках с помощью флуоресцентной наноскопии.

Результаты работы внедрены в учебный процесс ФГБОУ ВПО МГАВМиБ для обучения бакалавров и магистров по дисциплинам «Избранные главы биохимии», «Спектральные методы исследования» «Супрамолекулярные биохимические системы в биологии мембран». Данная работа проводилась в рамках гос. контрактов № 02.740.11.5013 и № 02.740.11.0718 по федеральной научно-технической целевой программе Министерства образования и науки РФ «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы», а также по проектам РФФИ (07-03-00588а, 10-03-00711а) и Макс-Планк-Института биофизической химии (г. Гёттинген, ФРГ). Основные положения, выносимые на защиту:

1. Характеристики и свойства монослоев, ФФК и фосфолипидов как моделей биологических мембран.

2. Оптимальные параметры для окрашивания клеток ФФК.

3. Сравнительные данные по микроскопии окрашенного с помощью ФФК монослоя нативных и фиксированных клеток.

4. Зависимости спектральных свойств ФФК от параметров среды и внутриклеточного окружения.

5. Данные по локализации ФФК в препаратах нативных клетках.

6. Способность ФФК вступать в реакцию 1Ч-ацилирования по аминогруппе хитозана с образованием фотоактивируемого конъюгата, производного хитозана.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены на конференциях молодых ученых и семинарах в ФГБОУ ВПО МГАВМиБ (2009-2012); на научно-практической конференции «Кадровое и научное обеспечение инновационного развития отрасли животноводства» (Казань, 2010); во 2-ом и 3-ем туре Всероссийского конкурса на лучшую научную работу среди аспирантов ВУЗов Минсельхоза РФ, в номинации -биологические науки (Брянск, 2011; Краснодар, 2011); на Международном коллоквиуме «Ломоносов и Гумбольдт: научное сотрудничество России и Германии- от истоков до наших дней» (Москва, 2011); на XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011); на третьей Международной научной конференции "Химическая термодинамика и кинетика" (Великий Новгород, 2013); на IV Международной конференции по коллоидной химии и физико-химической механике (Москва, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 12 статей (в том числе 6 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК) и 4 тезиса докладов на международных конференциях.

Личный вклад автора. Все этапы работы, включая разработку методик, проведение эксперимента, обработку и анализ полученных результатов были проведены лично автором или при его непосредственном участии. Обучение работе на лазерном конфокальном микроскопе осуществлялось при поддержке к.б.н. Свирщевской Е.В. (ИБХ РАН). В период стажировки в ФРГ (4 июля - 31 августа 2010 г.) руководство осуществляли профессор Д. Мёбиус и доктор В.Н. Белов, дальнейшие консультации которых были регулярными и ценными.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментов и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложения.

Материалы диссертационной работы изложены на _ страницах

машинописного текста и включают_рисунка,_таблиц и_схемы.

Список литературы содержит_источников.

Собственные исследования Материалы и методы В работе использовали следующие материалы: новые фотоактивируемые флуоресцентные красители для клеточного окрашивания ФФК-813, ФФК-814 и для получения конъюгата «хитозан-ФФК» ФФК-NHS (рис.1.), ФК GM-140, производные родамина, синтезированные в Макс-Планк-Институте биофизической химии, Гёттинген, ФРГ; и ФК - тетраметилродамин (TMP); селективные флуоресцентные зонды - Hoechst 33342 (ядерный синий), MitoTracker® Green FM (митохондриальный зеленый), LysoTracker® Green DND-26 (лизосомальный зеленый).

ФФК-813: R = CH3

ФФК-814: R = II ^ РисуНОК 1 - Структурные \\ формулы ФФК, использу-®®K-NHS:R= n| емых В работе.

Общая схема фотоактивации ФФК представлена на Рис.2.

соон

ROOC'1"

ROOC

ФФК Род

Рисунок 2 - Общая схема светоиндуцированной активации ФФК до

Род

Соответствующие спектры поглощения до и после фотолиза со спектром флуоресценции ФФК-814 приведены на рис. 3.

Максимумы поглощения и флуоресценции ФФК-814 после фотоактивации наблюдаются (Род-814) при 559 и 579 нм. Род-813 имеет аналогичные максимумы при 552 и 575 нм, соответственно.

Для исследований ФФК-813 и ФФК-814 растворяли в диметилформамиде (ДМФА) и диметилсульфоксиде (ДМСО) до конц. 10 мг/мл и 2 мг/мл, соответственно. Затем растворы разводили в воде до конц. 200 мкг/мл и использовали для клеточного окрашивания или исследования спектральных свойств. Клетки культивировали на средах DMEM (СНО, MDCK, НаСаТ, HBL-100) и RPMI (А431, HeLa, лимфоциты) в С02-инкубаторе при 37°С и концентрации СОг = 5%.

Растворы ФФК добавляли в ячейки планшета с предварительно выращенными на покровных стеклах монослоями клеток в объемах, необходимых для получения концентраций растворов в ячейках 5 мкг/мл. Клетки инкубировали с красителями 30 мин. в С02-инкубаторе. В последние 15 мин. добавляли ядерный краситель «Hoechst 33342» (Sigma). После этого клетки фиксировали при помощи 1% параформальдегида в течение 15 мин. и далее отмывали фосфатным буфером. Образцы закрепляли на предметном стекле при помощи «Mowiol 4.88» (Calbiochem., Дармштадт, Германия) и хранили ночь при 4°С для полной полимеризации. Для приготовления окрашенных нефиксированных (нативных) клеточных

Рису! Iок 3 — Спектры поглощения ФФК-814 (1) и Род-814

(2) и флуоресценции Род-814

(3), растворенного в хлороформе

200 300 400 500 600 700 800 Длила волны, нм

препаратов клетки дважды отмывали свежей средой культивирования. Покровные стекла вынимали из ячеек планшета, клали на предметное стекло клетками между стекол и немедленно микроскопировали. Фотосъемку проводили на JICKM «Nikon Eclipse ТЕ2000», используя лазеры: 405 нм - для фотоактивации и ядерного красителя; 488 нм — для митохондриального и лизосомального зондов; 543 нм — для Род-813, Род-814 и TMP. Колоколизацию зондов с Род-813 рассчитывали с помощью программы «ImageJ» и плагина «Colocalization Finder».

Монослои ФФК и фосфолипидов получали и исследовали методами Ленгмюра-Блоджетт и Вильгельми [Бирди, 1989; Зайцев, 2010].

Для получения конъюгата «хитозан-ФФК» использовали хитозан (Sigma) с молекулярной массой 50 ООО и степенью деацетилирования 96%. Спектры поглощения и флуоресценции получали на спектрофото-флуориметре «OceanOptics USB4000» (США). Спектральные данные были обработаны путём подсчёта доверительных интервалов по методике Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

1. Моделирование биологических мембран смешанными монослоями ФФК и фосфолипидов

Для того, чтобы оценить взаимодействия ФФК с клеточными мембранами и их транспорт внутрь клеток и органелл, были приготовлены и исследованы их монослои и двухкомпонентные монослои ФФК и липидов на границе воздух / вода. В отличие от ФФК-814, ФФК-813 образует относительно стабильный монослой с коллапсом при давлении больше 30 мН/м (рис. 4.).

Это может быть следствием наличия в ФФК-814 свободной карбоксильной группы, которая увеличивает гидрофильность молекул по сравнению с метиловым эфиром в ФФК-813.

Рисунок 4 — Изотермы зависимости поверхностного давления (л) (а) и поверхностного потенциала (АУ) (б) от площади (А) приходящейся на молекулу ФФК-813 (кривая 1) и ФФК-814 (кривая 2) в монослое.

Поэтому ФФК были стабилизированы в смеси с синтетическим липидом, димиристоилфосфатидилэтаноламином (ДМФЭ), аналогом природных фосфолипидов мембран. Коллапс смешанных монослоев ФФК-813:ДМФЭ и ФФК-814:ДМФЭ (молярное отношение ФФК: липид = 1:1) происходит при 60-63 мН/м (кривая 1 и 2 на рис.5.а), что практически равно значению для чистого ДМФЭ (кривая 3 на рис.5.а).

*,мН/м

ДУ, мВ 0.6 0.5 0.4 0.30.2 0.1-

0.0-

0.0 0.5 1,0 1.5 20 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

А , им2 А . им2

Рисунок 5 - Изотермы зависимости поверхностного давления (л) (а) и поверхностного потенциала (АУ) (Ь) от площади (А), на молекулу липида в смеси ФФК-813:ДМФЭ =1:1 (кривая 1) или ФФК-814:ДМФЭ =1:1 (кривая 2) и чистого ДМФЭ (кривая 3) в монослое.

Первоначальный рост поверхностного давления при сжатии

характеризует жидкостно-расширенное состояние монослоя, при котором

10

давление фазового перехода равно 5 мН/м (для чистого ДМФЭ), и возрастает приблизительно до 10 мН/м за счет добавления ФФК-814, или до 20 мН/м в присутствии ФФК-813. Второй крутой подъем соответствует жидкостно-конденсированому состоянию монослоя в диапазоне 15-60 мН/м. Присутствие ФФК-814 приводит к увеличению площади на молекулу липида при росте поверхностного давления до 30 мН/м и сдвигу фазового перехода к большей площади. Это доказывает взаимодействие ФФК-814 с ДМФЭ. Разница площади между изотермами (2 и 3 кривая, рис. 5) относится к площади, занимаемой молекулами ФФК-814 в двухкомпонентном монослое, что указывает на большую адсорбцию ФФК-814 на границе воздух-вода за счет «прикрепления» к липиду, по сравнению с чистым ДМФЭ. Наряду с этим, часть красителя может быть частично «потеряна» в водной субфазе или расположена под головками липидов. Изотерма поверхностного давления ФФК-813:ДМФЭ (рис. 5а, кривая 1) смещается в сторону гораздо большей площади по сравнению с ФФК-814: ДМФЭ, что указывает на присутствие ФФК-813 в ДМФЭ в большей степени, чем ФФК-814. Очевидно, что присутствие сложноэфирной группы в молекуле ФФК-813 снижает потенциальные потери красителя в водной субфазе.

Значения поверхностного потенциала (ДУ) для смеси монослоев ФФК-813:ДМФЭ или ФФК-814:ДМФЭ и чистого ДМФЭ на поверхности раздела фаз воздух/вода (рис.5.6) также свидетельствуют о взаимодействии между ФФК-813 и ФФК-814 с липидом. Для того, чтобы изучить оптические свойства этих систем, монослои ФФК-814:ДМФЭ и ФФК-813:ДМФЭ были перенесены на кварцевые пластины методом Ленгмюра-Блоджет при постоянном поверхностном давлении 15 мН/м. С повышением времени облучения монослоя (с 5 до 15 минут) наблюдается рост интенсивности поглощения в диапазоне от 550 до 570 нм (рис. 6.).

Рисунок 6 - Спектры поглощения монослоя ФФК-813:ДМФЭ = 1:1, перенесенного на стеклянную пластинку при 15 мН/м после воздействия света, (продолжительность воздействия: кривые 1, 2, 3, 4, 5 - 0, 5, 15, 30, 60 мин., соответственно)

прямым доказательством переключения нефлуоресцирующей формы во флуоресцентную, что может быть использовано в флуоресцентной микроскопии. Важно подчеркнуть, что максимум перехода в открытый изомер достигнут после 15 минут фотоактивации (рис. 6., кривая 3). Выраженное снижение интенсивности максимума поглощения в диапазоне 550-570 нм при дальнейшем облучении связано с разложением Род-814 (рис.6., кривые 4, 5), которого нужно избегать во многих случаях, но которое необходимо в некоторых приемах и методах микроскопии, например в наноскопии «STORM».

2. Микроскопия препаратов, окрашенных ФФК-813 и ФФК-814 На клеточной линии кератиноцитов человека (НаСаТ) для окрашивания исследован диапазон концентраций ФФК в клеточной среде от 0,02 до 10 мкг/мл. Для фотоактивации использовали фиолетовый лазер (405 нм) в режиме сканирования (1 сек.), при этом детектировали ядра клеток, окрашенные ядерным красителем, необходимым для лучшей визуализации отдельных клеток. Затем использовали лазер (543 нм) и соответствующий канал для детекции флуоресценции (рис.7.). Изучив ряд микрофотографий, полученных микроскопией клеточных препаратов, окрашенных ФФК, выявили оптимальную концентрацию ФФК-813 (5 мкг/мл) и растворитель (ДМФА) для окрашивания монослоя клеток с высокой интенсивностью (рис.7.а).

300

700

400 500 600

Длина волны, нм

Полученные спектры являются

Рисунок 7 - Микрофотографии клеток линии НаСаТ, окрашенных ФФК-813 (а) и ФФК-814 (б), (красная часть) с концентрацией 5 мкг/мл, предварительно растворенных в ДМФА (а) и ДМСО (б), и ядерным красителем Хёхст (синяя часть). Размер изображения 42 на 42 мкм.

По-видимому, окрашиваемыми субклеточными структурами являются мембранные органеллы цитоплазмы, тогда как цитоплазматическая мембрана не окрашена. Невысокая селективность окрашивания фиксированных клеток может быть следствием нескольких факторов: во-первых, до фотоактивации краситель не заряжен и должен легко распределяться по цитоплазме, а после фиксации клеток мембранный потенциал митохондрий понижается таким образом, что активированный краситель (Род-813) будет более свободно распределяться по цитоплазме; во-вторых, при фиксации раствором формальдегида происходит сшивка белковых молекул цитоплазмы, за счет чего возрастает вязкость среды окружения флуорофоров, которая должна повышать интенсивность флуоресценции активированной формы ФФК-813.

Использование ДМСО как растворителя для ФФК-814, по сравнению с ДМФА, дает более интенсивное окрашивание. Следует отметить общую низкую интенсивность окрашивания, что указывает на слабое связывание красителя с клетками (слабую мембранную проницаемость) и подтверждает эксперименты с монослоями, а именно слабое взаимодействие ФФК-814 с липидом (вследствие наличия карбоксильной группы, придающей молекулам ФФК-814 гидрофильность). Это также можно объяснить и тем, что ФФК-814

имеет карбоксильную группу (рис.1.), вследствие чего является анионным красителем, что должно усложнять транспорт через отрицательно заряженную цитоплазматическую мембрану.

Повторив окрашивание с помощью ФФК-814, были получены аналогичные результаты. Но, увеличив время активации и уменьшив скорость сканирования при съемке одной микрофотографии до 10 секунд, получили равномерно распределенное яркое окрашивание цитоплазмы. Для сравнения использовали краситель TMP, который имеет аналогичное строение с фотоактивированной формой ФФК (Род). Получили микрофотографии фиксированных клеток, где TMP полностью окрашивает цитоплазму клеток. Таким образом, ФФК-813 быстро и равномерно подвергается фотолизу внутри клеток, что обеспечивает интенсивное окрашивание клеточных органелл. Напротив, ФФК-814 долго фотоактивируется, и только после длительного сканирования позволяет наблюдать внутриклеточные органеллы и, следовательно, не подходит для исследования клеток.

Рисунок 8 - Микрофотографии фиксированных клеток линий:

A. НВЬ-100; Б. МЛСК;

B. НаСаТ;

Г. Лимфоцитов человека, окрашенных ФФК-813 после общей фотоактивации. Размер кадра 36 на 36 мкм.

Для того, чтобы удостовериться в оптимально выбранной концентрации ФФК-813 при окрашивании, были использованы и другие клеточные линии, в том числе, первичная клеточная культура - лимфоциты человека (Рис.8.). Из данных микрофотографий следует, что ФФК-813 способен проникать и окрашивать клетки разных линий при конц. 5 мкг/мл. 3. Микроскопия «нативных» клеток в реальном времени Одним из методов визуализации и отслеживания путей перемещения макромолекул в «живых» клетках является наблюдение за ними после окрашивании их с помощью ФФК. Используя данный подход, получили микрофотографии нативных клеток после общей и локальной фотоактивации (рис. 9 а и б, соответственно).

Рисунок 9 — Микрофотографии нативных клеток линии А 431, окрашенных ФФК-813 и ядерным красителем, после общей (а) и точечной (б) фотоактивации красителя. Размер кадра 22 на 36 мкм.

На приведенных микрофотографиях видно, что окрашенные нативные клетки ФФК-813 после фотоактивации имеют высокую селективность связывания с некоторыми внутриклеточными органеллами, возможно, митохондриями и лизосомами, что не наблюдалось в фиксированных клеточных препаратах из-за описанных выше эффектов (раздел 2).

Для уточнения селективности окрашивания нативных клеток получены результаты прижизненной микроскопии тех же клеточных линий, которые использовали ранее для микроскопии фиксированных клеток (рис.10).

Рисунок 10 - Микрофотографии нативных клеток линий:

A. НВЬ-100; Б. МЭСК;

B.НаСаТ;

Г. Лимфоцитов человека, окрашенных ФФК-813 после общей фотоактивации. Размер кадра 36 на 36 мкм.

Данный метод позволил осуществить регистрацию динамики биологических процессов в живых клетках при использовании скоростной фотосъемки (одна микрофотография в секунду), и наблюдение распределения внутриклеточных объектов в реальном времени. Этот подход, в сочетании с локальной фотоактивацией (рис.9, б), является перспективным способом решения различных задач клеточной биологии, связанных с внутриклеточным движением, как биологических объектов, так и искусственно введенных субстратов (например, лекарств и средств их доставки).

4. Зависимость спектральных свойств ФФК от параметров среды

Вязкость, полярность среды и рН оказывают огромное влияние на конформации различных биомолекул, силу их взаимодействия и, значит, на биохимические реакции в организме. Важно, что контрастность микрофотографий, полученных при микроскопии клеток (т.е. неодинаковую яркость разных субклеточных органелл) можно объяснить не только различной селективностью связывания красителя, но и с помощью неоднородности параметров внутриклеточной среды. Для красителей

родаминового ряда характерно явление концентрационного тушения, связанное с образованием слабо-флуоресцирующих ассоциатов. Для исследования концентрационного тушения были измерены спектральные свойства Род-813 в растворах убывающих концентраций. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что красителю Род-814 присуще явление концентрационного тушения. Линейная зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации для Род-813 наблюдается вплоть до значений около (3-5)*10~sM (14-25 мкг/мл), далее рост замедляется; наибольшая интенсивность флуоресценции наблюдается при концентрациях около 6,3*10"5М (30 мкг/мл) и затем резко падает. Ясно, что при окрашивании красителем ФФК-813 живых клеток нецелесообразно использовать количества красителя, создающие его конечную концентрацию в окрашиваемом материале более чем 6,3*10"5М (2530 мкг/мл). В областях повышенного скопления красителя в клетках также может наблюдаться концентрационное тушение, что будет причиной слабой флуоресценции, значительного сдвига максимума, либо ее отсутствием.

Влияние вязкости и pH среды на интенсивность флуоресценции красителя Род-813 определяли в растворах глицерина разной концентрации и в слабых растворах соляной кислоты и гидроксида натрия, соответственно. При увеличении вязкости в 1000 раз интенсивность флуоресценции возрастает в 2,5 раза. Данное явление частично способно объяснить более равномерную флуоресценцию внутри клетки фиксированного препарата и темные, «неокрашенные» участки в живых клетках.

pH среды влияет на интенсивность флуоресценции Род-813, которая в 1,5-2 раза больше в кислой (рН=3) среде, чем в нейтральной (рН=7) и щелочной (рН=11).

5. Определение локализации ФФК-813 в культуре клеток с помощью селективных флуоресцентных зондов Растворы ФФК-813 и митохондриальный зонд MitoTracker® Green FM

17

и Hoechst 33342 добавляли к клеткам А431. После инкубации клетки отмывали культуральной средой и микроскопировали. После фотоактивации ФФК-813 в клетках были записаны три канала вместе, с интервалом в одну секунду: синий - ядра (Hoechst 33342), зеленый - митохондрии (MitoTracker® Green FM), красный - Род-813, что представлено на рис.11.

Сохранив зеленый и красный каналы отдельно и удалив все, кроме одной хорошо сфокусированной в центре клетки, получили, соответственно, микрофотографии рис.11, Б и В. При сопоставлении красного и зеленого каналов микрофотографий (рис.11, Б и В), была получена обобщенная фотография с вычисленной областью колокализации (белым), красного (Род-813) и зеленого (MitoTracker® Green FM) красителей (рис.11, Г). Общая колокализация 72,6 % от всей площади, окрашенной красным цветом на рис.11, В. Здесь же видно, что есть красные округлые структуры, которые не совпадают с зеленым красителем, следовательно, они не являются митохондриями, а их размер и форма соответствуют вторичным лизосомам. Поэтому следующим шагом определения локализации ФФК внутри нативных клеток стало окрашивание клеток ФФК-813 и лизосомальным

Рисунок 11 — Микрофотографии клеток А431, окрашенные ФФК-813, MitoTracker® Green FM и Hoechst 33342: А. Общая фотография монослоя клеток; Б. Фотография визуализированных митохондрий в отдельной клетке; В. Микрофотография клеточных структур, окрашенных ФФК-813, в отдельной клетке; Г. Микрофотография с вычисленной областью колокализации митохондриального зонда и ФФК-813 (белым) одной клетки.

После одновременного окрашивания клеток линии А 431 ФФК-813 и LysoTracker® Green DND-26, были получены микрофотографии их красной и

зондом.

зеленой флуоресценции с интервалом в одну секунду. При вычислении области колокализации Род-813 с LysoTracker®) Green DND-26 было получено 9,6% от всей площади занимаемой красным цветом.

Лизосомы, окрашенные ФФК-813, имеют меньшую яркость, чем митохондрии. Это можно объяснить низкой способностью ФФК-813 накапливаться в лизосомах. Также следует отметить, что зеленый лизосомальный зонд (LysoTracker® Green DND-26), согласно руководству, протонируется в кислой среде, защелачивая тем самым лизосомы, а интенсивность флуоресценции Род-813 снижается с повышением pH (раздел 4).

6. Получение конъюгата хитозана с фотоактивнруемым флуоресцентным красителем и его визуализация в клетках

К хитозану, высушенному из раствора уксусной кислоты в виде пленки, в ФСБ (рН=7,5), прибавляли ФФК-NHS, растворенный в ДМСО. Выдержку реакционной массы проводили в течение 2-х часов на шейкере без доступа света, после чего отмывали пленку ДМСО и дистиллированной водой. Для использования конъюгата «хитозан-ФФК» в клеточных экспериментах растворяли его в 0,1 н уксусной кислоте.

Содержание хитозана в конъюгате проверяли с помощью «нингидриновой реакции». Степень замещения в хитозане оценивали путем измерения спектра флуоресценции продукта, получаемого после фотолиза. В клеточных экспериментах конъюгат «хитозан-ФФК» растворяли в 0,1 н уксусной кислоте. В качестве контроля использовали краситель ФФК-813, предварительно растворенный в ДМФА, а затем разбавленный в 0,1 уксусной кислоте до конц. 200 мкг/мл.

Клетки инкубировали с конъюгатом (конц. 2,2 мкг/мл) 60 минут в С02-инкубаторе. После окрашивания клетки отмывали фосфатным буфером и заключали в Mowiol 4.88 на предметных стеклах.

На рис.12, а с помощью ФФК (точнее, активированной формы Род) можно наблюдать распределение хитозана внутри клеток вокруг темных ядер в виде неоднородных скоплений.

Рисунок 12 — Клетки НаСаТ, окрашенные а) конъюгатом «Хитозан-ФФК» (конц. 2,2 мкг/мл) б) ФФК-813 (конц. 5 мкг/мл) с хитозаном (2,2 мкг/мл) в) ФФК-ЫН8 (конц. 5 мкг/мл) с хитозаном (2,2 мкг/мл) после фотоактивации

На рис.12, бив клетки окрашены с помощью ФФК-813 и ФФК-ЫНБ, соответственно, в присутствии хитозана. После фотоактивации видно более однородное распределение красителей, что является следствием их свободного распределения (отдельно от хитозана). Следует отметить, что ФФК-ЫНБ получают из ФФК-813, введением в ФФК активирующей сукцинимидильной группы, которая необходима для конъюгации.

Таким образом, синтезированный конъюгат хитозана с иммобилизованными на нем молекулами ФФК («Хитозан-ФФК»), показал свою пригодность для визуализации хитозана внутри клеток.

Выводы

1. На основании моделирования биологических мембран смешанными монослоями новых ФФК и фосфолипидов показано, что при давлении 10 мНУм ФФК-813 в 3 раза эффективнее встраивается в фосфолипидный слой, чем ФФК-814.

2. Определена оптимальная концентрация ФФК-813 (5 мкг/мл) для окрашивания препаратов клеточных линий животных и человека (СНО, МОСК, НаСаТ, НеЬа, А 431, НОВЬ-100, лимфоцитов человека) методом флуоресцентной микроскопии.

3. Показана способность ФФК-813 визуализировать внутриклеточное движение органелл после общей и локальной фотоактивации, на основании окрашивания и микроскопии нативных клеток в реальном времени.

4. Получены спектры флуоресценции ФФК в различных средах. Установлено, что с ростом вязкости среды от 1 до 1000 мПа*с и понижением рН от 11 до 3 увеличивается интенсивность флуоресценции флуоресцентной формы ФФК в 2,5 и 2 раза, соответственно. Выдвинуто предположение, что избирательное окрашивание клеточных органелл с помощью ФФК можно объяснить селективным связыванием ФФК и неоднородностью параметров внутриклеточной среды.

5. Выявлена локализация ФФК-813 в митохондриях и частично лизосомах в нативных клетках эпидермоидной карциномы человека А431 после окрашивания.

6. Получен конъюгат ФФК с хитозаном, на примере которого показана возможность использования ФФК как флуоресцентной метки для оценки распределения биополимера внутри клетки.

Сведения о практическом использовании и рекомендации по использованию результатов исследования

Полученные данные по новым ФФК перспективны для окрашивания тканей, клеток и субклеточных органелл, пригодны для лазерной и конфокальной микроскопии различных биологических объектов. Основные результаты диссертации используются для обучения студентов 2-5 курсов, бакалавров и магистров ветеринарно-биологического факультета ФГБОУ ВПО МГАВМиБ в учебных курсах «Биохимия», «Спектральные методы исследования» и «Современные методы исследования для бионанотехнологий».

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. * Шапошников, М.Н. Инновационный метод окрашивания клеток новыми фотоактивируемыми флуоресцентными красителями. / Шапошников М.Н., Бартов М.С., Зайцев С.Ю. // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. Т. 201, 2010.-С. 360-365.

2. * Зайцев, С.Ю. Окрашивание клеток новыми фотоактивируемыми флуоресцентными красителями./ Зайцев С.Ю., Шапошников М.Н., Свирщевская Е.В. // Ветеринарная медицина, 2010. №3. - С. 32-34.

3. Шапошников, М.Н., Свирщевская Е.В., Генералов А.А., Зайцев С.Ю. Новые флуоресцентные красители для окрашивания клеток животных// Современная ветеринарная медицина. №1. - 2011. - С. 24-25.

4. Шапошников, М.Н., Генералов А.А., Зайцев С.Ю., Особенности использования фотоактивируемых флуоресцентных красителей для микроскопии биологических объектов // Материалы международной конференции. «Ломоносов и Гумбольдт: Научное сотрудничество России и Германии - от истоков до наших дней», 14-17 ноября 2011 г., Москва, Россия.-С. 184-187

5. Шапошников, М.Н., Свирщевская Е.В., Генералов А.А., Зайцев С.Ю. Локальная активация фотоактивируемого флуоресцентного красителя в клетках животных. // Вопросы физико-химической биологии в ветеринарии: Сборник научных трудов -М: ФГБОУ ВПО МГАВМиБ, 2012. - С.63-66

6. Шапошников, М.Н. Интенсивность флуоресценции нового фотоактивируемого флуоресцентного красителя в живых и фиксированных клетках. / М.Н. Шапошников // Вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии: Сб. науч. тр. мол. уч. ФГБОУ ВПО МГАВМиБ. - М. Вып. 8., 2012. - С.42-45.

7. Чудаков, Д.Б. Влияние параметров микроокружения на спектральные свойства фотоактивируемого флуоресцентного красителя / Д.Б. Чудаков, М.Н. Шапошников // Наука глазами студентов. - М., 2012 -. С.85-89

8. * Шапошников, М.Н. Зависимость флуоресценции нового фотоактивируемого красителя от параметров среды / М.Н. Шапошников, Д.Б. Чудаков, А.А. Генералов, А.А. Савина, С.Ю. Зайцев // Фундаментальные исследования. №9(2) 2012. - С. 322-327.

9. Зайцев, С. Компьютерное моделирование супрамолекулярной системы, состоящей из молекул флуоресцентных красителей, липидов и воды / Зайцев С., Шапошников М., Соловьева Д., Бартов М., Волынский П. // Научная визуализация. 2012. Т. 4. № 3. - С. 1-7.

10. * Шапошников, М.Н. Получение конъюгата хитозана с фотоактивируемым флуоресцентным красителем и его применение в клеточной микроскопии / М.Н. Шапошников, Д.Б. Чудаков, А.А. Генералов, С.Ю. Зайцев // Ветеринарная медицина. 2012. № 3-4. — С. 32-35.

11. * Шапошников, М.Н. Определение локализации нового фотоактивируемого флуоресцентного красителя в культуре клеток А431 с помощью селективных флуоресцентных зондов / М.Н. Шапошников, С.Ю. Зайцев, Д.Б. Чудаков, А.А. Генералов // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. Т. 214, 2013.-С. 483-488.

12. * Zaitsev, S.Yu. Novel Precursors of Fluorescent Dyes. 1. Interaction of the Dyes with Model Phospholipid in Monolayers / S.Yu. Zaitsev, M.N. Shaposhnikov, D.O. Solovyeva, I.S. Zaitsev, D. Mobius / Cell Biochemistry and Biophysics/ V.66 (2) doi:10.1007/s 12013-013-9668-7

* - статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ

Тезисы докладов

1. Generalov A.A., Study of intracellular chitosan traffic using caged rhodamine derivative / A.A. Generalov, M.N. Shaposhnikov, S.Yu. Zaitsev, A.A. Zubareva, V.P. Varlamov, E.V. Svirshchevskaya // 10-th International Conference of the European Chitin Society. EUCHIS' 11-St.Petersburg, May 2011. P.37.

2. Шапошников M.H. Фотоактивируемый флуоресцентный краситель для лазерной конфокальной микроскопии / М.Н. Шапошников, Свиршевская Е.В., Генералов А.А., Зайцев СЮ. // XIX Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. Т. 4 : тез. докл. - Волгоград: ИУНЛ ВолгГТУ, 2011. - С. 436.

3. Шапошников М.Н., Чудаков Д.Б., Зайцев С.Ю., Ризванов A.A. N-ацилирование хитозана фотоактивируемым флуоресцетным красителем производным тетрометилродамина / М.Н. Шапошников, Д.Б. Чудаков, С.Ю. Зайцев, А.А. Ризванов // Третья Международная научная конференция "Химическая термодинамика и кинетика" г. Великий Новгород, 27-31 мая 2013 г. - С.227-229.

4. Shaposhnikov, M.N. Interaction of photoactivated precursor and fluorescent dye with model membranes and cells / M.N. Shaposhnikov, S.Yu. Zaitsev, D.B. Chudakov, A.A. Rizvanov, I.S. Zaitsev, D.Mobius. // IV International Conference on Colloid Chemistry and Physicochemical Mechanics. Moscow, Russia. 30 June - 5 July, 2013. - P. 86-87.

і

Подписано в печать 19.09.2013 г. Формат 60x90 1/16 Печать на ризографе. Тираж 100 экз. Заказ № 20871. Объем: 4,25 усл. п.л.

Отпечатано в типографии ООО "Алфавит 2000", ИНН: 7718532212, г. Москва, ул. Маросейка, д. 6/8, стр. 1, т. 623-08-10, www.alfavit2000.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шапошников, Михаил Николаевич, Москва

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина»

04201362384 На правах рукописи

Шапошников Михаил Николаевич

ФОТОАКТИВИРУЕМЫЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ КРАСИТЕЛИ ДЛЯ МИКРОСКОПИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

03.01.04-биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор биологических наук, доктор химических наук, профессор

Зайцев Сергей Юрьевич

Москва - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ..........................................4

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................................................5

Глава 1. Обзор литературы................................................................................................................10

1.1. Флуоресценция и микроскопия. Теория вопроса и методы 10 изучения..............................................................................................................................................................10

1.1.1. Основы флуоресцентной микроскопии................................................10

1.1.2. Автофлуоресценция..............................................................................................17

1.1.3. Изучение процессов взаимодействия флуоресцентных красителей с мембранами и их транспорта в клетку....................................................19

1.1.4. Применение флуоресцентных красителей в биологии и медицине..............................................................................................................................................................21

1.1.5. Применение ФФК в биологической микроскопии....................28

1.2. Влияние среды окружения на флуоресценцию красителей............................................................................................................................................................29

1.2.1. Вязкость окружения............................................................................................................................29

1.2.2. Фиксаторы..........................................................................................................................30

1.2.3. Влияние рН на интенсивность флуоресценции 34

1.3. Фотоактивация ФФК..........................................................................................................34

1.4. Фотообесцвечивание ФК..............................................................................................36

1.5. Выводы по обзору литературы................................................................................38

Глава 2. Материалы и методы......................................................................................................39

2.1. Перечень используемых реактивов....................................................................39

2.2. Методики применявшиеся в работе....................................................................42

2.2.1. Методика приготовления растворов ФФК......................................42

2.2.2. Методика приготовления растворов ФК..............................................42

2.2.3. Методика приготовления монослоя клеток......................................42

2.2.4. Методика окрашивания клеток и приготовление препаратов для микроскопии..............................................................................................................42

3.3. Методы и приборы............................................................................................................44

3.3.1. Микроскопия препаратов................................................................................44

3.3.2. Методика вычисления колокализации красителя 46

3.3.3. Методика измерения спектров поглощения....................................47

3.3.4. Методика измерения спектров флуоресценции........................48

3.3.5. Статистическая обработка результатов измерения спектров флуоресценции..........................................................................................................................49

3.3.6. Методика построения графиков в "Ог^пРго 8 "............................49

Глава 3. Результаты и их обсуждение....................................................................................51

3.1. Спектральные характеристики ФФК-813 и ФФК-814 в растворе....................................................................................................................................................................51

3.2. Моделирование биологических мембран смешанными монослоями ФФК и фосфолипидов..........................................................................................54

3.3. Микроскопия препаратов, окрашенных ФФК-813 и ФФК-814..................................................................................................................................................................................58

3.4. Локальная активация фотоактивируемого флуоресцентного красителя в клетках....................................................................................................................................64

3.5. Микроскопия «нативных» клеток в реальном времени............67

3.6. Зависимость спектральных свойств ФФК от параметров среды........................................................................................................................................................................71

3.7. Определение локализации ФФК-813 в культуре клеток с помощью селективных флуоресцентных зондов..............................................................80

3.8. Получение конъюгата хитозана с фотоактивируемым флуоресцентным красителем и его визуализация в клетках....................................85

ВЫВОДЫ................................................................................................................................................88

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК........................................................................89

ПРИЛОЖЕНИЕ..............................................................................................................................98

Условные обозначения и сокращения

БСА бычий сывороточный альбумин

БЛМ бислойная липидная мембрана

ДМСО диметилсульфоксид

ДМФА диметилформамид

ДМФЭ димиристоилфосфатидилэтаноламин

мкл микролитры

нм нанометры

мкм микрометры

TMP тетраметилродамин

ФБ фосфатный буфер

ФК флуоресцентные красители

ФСБ фосфатно-солевой буфер

ФФК фотоактивируемые флуоресцентные красители

Ф квантовый выход флуоресценции

А431 клеточная линия эпидермоидной карциномы человека

СНО клеточная линия яичника китайского хомяка

НаСаТ клеточная линия кератиноциты человека

HBL-100 клеточная линия рака молочной железы

HeLa клеточная линия карциномы шейки матки человека

I интенсивность флуоресценции

1/10 относительная интенсивность абсорбции

MDCK клеточная линия эпителий почки собаки

X длина волны света

£ коэффициент молярного поглощения (коэффициент экстинкции)

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Одним из перспективных и активно развиваемых направлений современной биохимии и физико-химической биологии является разработка и применение фотоактивируемых флуоресцентных красителей (ФФК), обладающих селективными свойствами окрашивания клеток и субклеточных органелл прокариотических и эукариотических форм живых организмов [Феллинг и сотр., 2007; Хель и сотр., 2008; Белов и сотр., 2010]. ФФК изначально существуют в нефлуоресцентной форме, которая может быть преобразована во флуоресцентную форму путем облучения светом. Изменяя мощность облучающего света и его локализацию, можно варьировать число и пространственное расположение образовавшихся флуоресцентных «зондов» и далее следить за их движением, определять форму и взаимное расположение субклеточных объектов, помеченных ФФК. Эти и другие свойства таких красителей активно используются для разработки и применений новых методов исследования в биологической микроскопии [Хель и сотр., 2008; Белов и сотр., 2010]. Большинство существующих ФФК имеют большой размер «маскирующей» группы, а продукты их фотолиза токсичны для клеток [Банала и сотр, 2011]. Ведущим сотрудником лаборатории бионанофотоники Беловым В.Н. (Макс-Планк-Институт биофизической химии, Гёттинген, ФРГ) и профессором Зайцевым С.Ю. (кафедра химии, ФГБОУ ВПО МГАВМиБ) в ходе многолетней работы по различным направлениям создания и исследования флуоресцентных красителей [Белов, Зайцев, 2010] были смоделированы новые ФФК, производные родамина, имеющие компактную «маскирующую» группу, не токсичную для клеток. Эти ФФК являются ценным инструментом для исследователей в биохимии, биомедицине и бионанотехнологиях. Цель работы: комплексное исследование новых фотоактивируемых флуоресцентных красителей - производных родамина, обеспечивающих

возможность окрашивания клеток и субклеточных структур.

5

Исходя из этой цели, были поставлены следующие задачи:

1. Получить и исследовать липидные монослои с встроенными молекулами ФФК, определить и охарактеризовать параметры взаимодействия ФФК с липидами мембран.

2. Определить оптимальную концентрацию ФФК для окрашивания клеток, разработать методики активирования ФФК и визуализации с помощью флуоресцентной микроскопии.

3. Получить и исследовать препараты нативных клеток после общей и локальной фотоактивации и определить возможность визуализации клеток в реальном времени, используя ФФК.

4. Получить спектры флуоресценции ФФК в различных средах и выявить зависимость интенсивности флуоресценции от вязкости и рН.

5. Определить локализацию ФФК в препаратах нативных клеткок.

6. Получить конъюгат хитозана с иммобилизованными молекулами ФФК и исследовать его на клеточной культуре.

Научная новизна работы. Впервые получены и детально исследованы смешанные монослои новых ФФК и фосфолипидов, моделирующие взаимодействие ФФК с биологическими мембранами. Определена оптимальная концентрация ФФК для окрашивания клеток, разработаны методики активирования ФФК и визуализации с помощью флуоресцентной микроскопии. Впервые выполнена «прижизненная» микроскопия окрашенного монослоя клеток с помощью ФФК-813. Изучены зависимости спектральных свойств ФФК от параметров среды (вязкости и рН), а также выявлено концентрационное тушение флуоресценции, что позволило объяснить неодинаковую яркость разных субклеточных органелл и отличия окрашивания «фиксированных» и «нативных» клеток. Определена локализация ФФК-813 в нативных клетках эпидермоидной карциномы человека А431 с помощью коммерческих селективных зондов. Впервые синтезирован конъюгат хитозана с ковалентно иммобилизованными

молекулами ФФК, и показана его способность проникать внутрь клеток.

6

Практическая значимость. Полученные результаты позволяют использовать ФФК как клеточные маркеры в коммерческих наборах, а также для конъюгации с различными нефлуоресцирующими БАВ (в том числе лекарствами), которые можно детектировать с помощью локальной фотоактивации красителя в нативных и фиксированных клетках для определения их динамики и локализации. Данные зависимостей спектральных свойств ФФК от параметров среды позволяют оптимизировать параметры флуоресцентной микроскопии с учетом микроокружения красителя. Знания о локализации ФФК-813 в клетке позволят исследовать внутриклеточную динамику конкретных органелл нативных клеток и, возможно, их ультраструктуру в фиксированных клетках с помощью флуоресцентной наноскопии.

Результаты работы внедрены в учебный процесс ФГБОУ ВПО МГАВМиБ для обучения бакалавров и магистров по дисциплинам «Избранные главы биохимии», «Спектральные методы исследования» «Супрамолекулярные биохимические системы в биологии мембран». Данная работа проводилась в рамках гос. контрактов № 02.740.11.5013 и № 02.740.11.0718 по федеральной научно-технической целевой программе Министерства образования и науки РФ «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы», а также по проектам РФФИ (07-03-00588а, 10-03-00711а) и Макс-Планк-Института биофизической химии (г. Гёттинген, ФРГ). Основные положения, выносимые на защиту:

1. Характеристики и свойства монослоев, ФФК и фосфолипидов как моделей биологических мембран.

2. Оптимальные параметры для окрашивания клеток ФФК.

3. Сравнительные данные по микроскопии окрашенного с помощью ФФК монослоя нативных и фиксированных клеток.

4. Зависимости спектральных свойств ФФК от параметров среды и внутриклеточного окружения.

5. Данные по локализации ФФК в препаратах нативных клетках.

6. Способность ФФК вступать в реакцию И-ацилирования по аминогруппе хитозана с образованием фотоактивируемого конъюгата, производного хитозана.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены на конференциях молодых ученых и семинарах в ФГБОУ ВПО МГАВМиБ (2009-2012); на научно-практической конференции «Кадровое и научное обеспечение инновационного развития отрасли животноводства» (Казань, 2010); во 2-ом и 3-ем туре Всероссийского конкурса на лучшую научную работу среди аспирантов ВУЗов Минсельхоза РФ, в номинации -биологические науки (Брянск, 2011; Краснодар, 2011); на Международном коллоквиуме «Ломоносов и Гумбольдт: научное сотрудничество России и Германии- от истоков до наших дней» (Москва, 2011); на XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011); на третьей Международной научной конференции "Химическая термодинамика и кинетика" (Великий Новгород, 2013); на IV Международной конференции по коллоидной химии и физико-химической механике (Москва, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 12 статей (в том числе 6 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК) и 4 тезиса докладов на международных конференциях.

Личный вклад автора. Все этапы работы, включая разработку методик, проведение эксперимента, обработку и анализ полученных результатов были проведены лично автором или при его непосредственном участии. Обучение работе на лазерном конфокальном микроскопе осуществлялось при поддержке к.б.н. Свирщевской Е.В. (ИБХ РАН). В период стажировки в ФРГ (4 июля - 31 августа 2010 г.) руководство осуществляли профессор Д. Мёбиус и доктор В.Н. Белов, дальнейшие консультации которых были регулярными и ценными.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментов и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложения. Материалы диссертационной работы изложены на 98 страницах машинописного текста и включают 44 рисунка, 2 таблицы. Список литературы содержит 77 источников.

глава 1. обзор литературы

1Л. Флуоресценция и микроскопия.

1ЛЛ. Основы флуоресцентной микроскопии.

Флуоресцентная микроскопия представляет собой разновидность световой микроскопии, в которой проблема увеличения контрастности достигается путем использования особых веществ — флуорохромов (или флуорофоров). Такие вещества способны расходовать часть энергии поглощенного света на флуоресценцию (или излучение света определенной длины волны при возвращении из возбужденного состояния в стабильное). При этом испускаемый свет отличается от поглощенного длиной волны и интенсивностью. В соответствии с правилом Стокса, длина волны испускаемого света больше, чем длина поглощаемого, поскольку при поглощении часть энергии рассеивается в виде тепла, а излучение света большей длины волны требует меньше энергии. Каждый флуорохром характеризуется определенным спектром поглощения и испускания, который определяется путем измерения относительной интенсивности флуоресценции при определенной длине волны [13]. Чаще такие вещества называют флуоресцентными красителями (или флуоресцирующими красителями).

Флуоресцирующие красители поглощают свет одной длины волны и излучают свет другой длины волны, более длинной. Если такое вещество облучить светом, длина волны которого совпадает с длиной волны света, поглощаемого красителем, и затем для анализа использовать фильтр, пропускающий свет с длиной волны, соответствующей свету, излучаемому красителем, флуоресцирующую молекулу можно выявить по свечению на темном поле. Высокая интенсивность излучаемого света является характерной особенностью таких молекул [1].

Применение флуоресцирующих красителей для окраски клеток предполагает использование специального флуоресцентного микроскопа.

Такой микроскоп похож на обычный световой микроскоп, но здесь свет от осветителя, излучаемый мощным источником, проходит через два набора фильтров - один для задержания света перед образцом и другой для фильтрации света, полученного от образца. Первый фильтр выбран таким образом, что он пропускает свет длины волны, возбуждающей определенный флуоресцирующий краситель; в то же время второй фильтр блокирует этот падающий свет и пропускает на окуляр свет длины волны, излучаемой красителем при его флуоресценции [1]. Качество изображения во флуоресцентной микроскопии обеспечивается контрастом и яркостью изображения. В первую очередь это достигается за счет подбора флуорохромов и использования узкополосных светофильтров. Значительную роль играет также качество оптики и сведение к минимуму рассеивания как

окуляр

возбуждающего, так и излучаемого света [13].

Рис. 1.1. Устройство флуоресцентного микроскопа с освещением падающим светом. ИС - источник света; ВФ - возбуждающий фильтр; СДЗ -светоделительное зеркало; ЗФ - запирающий фильтр [13].

Основным прибором для исследования флуоресценции двумерных биологических образцов является флуоресцентный микроскоп с освещением падающим светом. В основе его устройства лежит правило Стокса, благодаря которому удается эффективно разделять световые потоки (Рис. 1.2.). Для этого используется светоделительное (или дихроматическое) зеркало. Оно имеет специальное интерференционное покрытие, позволяющее отражать свет, длина волны которого меньше определенного значения и пропускать излучение с большей длиной волны. Узкополосный возбуждающий фильтр подбирают таким образом, чтобы он~ выделял из всего спектра лампы свет той длины волны, которая мак�