Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фосфаны - новый класс ингибиторов пиримидинфосфорилаз

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Фосфаны - новый класс ингибиторов пиримидинфосфорилаз"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

ПИРИМИДИНФОСФОРИЛАЗ

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

Москва - 1998

Работа выполнена в лаборатории белковой инженерии Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научный руководитель:

чл.-корр. РАН, профессор ДебабовВ.Г.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Дрыгин Ю.Ф. доктор биологических наук Шакулов P.C.

Ведущая организация - Институт биохимии им. А.Н.Баха

Специализированного совета Д 098.12.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, 1-ый Дорожный проезд, дом. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГосНИИгенетика.

Защита диссертации состоится 24 февраля

часов на заседании

Автореферат разослан января 1998 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

ФОСФАНЫ — НОВЫЙ КЛАСС ИНГИБИТОРОВ ПИРИМИДИНФОСФОРИЛАЗ

Актуальность темы. Пиримидинфосфорилазы - уридинфосфорилаза и тимидинфосфорилаза - широко распространенные в природе ферменты, принимающие участие в реакциях катаболизма ферментов. Эти ферменты катализируют обратимый фосфоролиз уридина и тимидина до рибозо-1 '-фосфата (дезоксирибозо-1 '-фосфата) и урацила (тимина), соответственно.

С медицинской точки зрения эти ферменты привлекают пристальное внимание исследователей вследствие вовлечения их в метаболизм противораковых и противовирусных препаратов - аналогов нуклеозидов. При химиотерапии опухолей уридинфосфорилаза/тимидинфосфорилаза в клетке катализирует превращение 5-фторуридина (FUR) и 5-фтордезоксиуридина (FUdR) в 5-фторурацил (5FU), причем равновесие реакции в физиологических условиях сдвинуто в сторону образования 5FU. В этом случае блокируется их дальнейший метаболизм (в случае FUdR в 5-фторуридинмонофосфат) и противоопухолевое действие (Martin D.S. et al., 1989). В случае подавления активности пиримидинфосфорилаз теоретически стало бы возможным применять в качестве лекарства 5FUdr в концентрациях, много меньших чем приходится применять 5FU, что снимало бы многочисленные побочные эффекты. Известно, что в тканях злокачественных опухолей концентрации уридин- и тимидинфосфорилазы повышены по сравнению с нормальными тканями (ligo M. et al., 1990). Высказано также предположение, что тимидинфосфорилаза играет важную роль в пролиферации и дифференциации лейкоцитов, а также в пролиферации опухолевых клеток (Yoshimura A. et al., 1990).

Недавно было установлено, что тимидинфосфорилаза вовлечена в процесс ангиогенеза и ее функционирование необходимо для прорастания кровеносных сосудов в солидных опухолях (Usuki К. et al., 1992).

В свсте вышесказанного, поиск новых ингибиторов пиримидинфосфорилаз и изучение свойств уже известных ингибиторов является

актуальной задачей, так как это предоставляет новые возможности для изучения механизма действия ферментов, а также имеет практическое применение.

Цель работы.

- изучение взаимодействия нового класса ингибиторов - фосфанов с ферментами фосфорного обмена: уридинфосфорилазой, тимидинфосфорилазой, пирофосфатазой, а также с щелочной фосфатазой;

- определение сайта связывания фосфанов на молекуле уридинфосфорилазы

Научная новизна и практическая ценность. В Институте физиологически активных веществ РАН (лаб. В.И.Фетисова) впервые был синтезирован целый ряд аналогов одного из субстратов реакции образования фосфоангидридной связи - фосфата (Таблица 1). В данной работе впервые изучено действие нового класса соединений, структурных аналогов фосфата, на уридинфосфорилазу и некоторые другие ферменты фосфорного обмена. Влияние одного из этих соединений, 5,5-бис(гидроксимеггил)-2-(1-гексафторизобутирил-амидо-1-трифторометил-2,2,2-трифторэтил)-2-оксо-1,3,2-диоксафосфана (СА-423), на действие ферментов было изучено более подробно.

Таблица 1

Соединение р£о 1^3 '

О

ОН-009 < и

___________________х—о

0

СКу СО ОСII;,

Сд -гис> СМ., е.;цо

С К СОСЩСТ ).

3

ИВ--32 п-с4нво п-с4н9о соосНз ЗЧгСвН5

Все известные к настоящему времени ингибиторы уридинфосфорилазы (тимидинфосфорилазы) являются структурными аналогами нуклеозидов, в то время как исследуемая группа соединений принципиально отличается тем, что представляет собой аналоги второго субстрата - фосфата. Полученные результаты показали, что фосфаны являются ингибиторами этих ферментов. Кроме того, весьма существенным является обнаруженный нами факт необратимой инактивации уридинфосфорилазы под действием СА-423, в то время как широко изучаемые бензилациклоуридины и ангидроуридины обратимо инактивируют данный фермент (Drabikowska А.К., et al., 1987, Veres Z.H., et al., 1985).

Апробация работы. Материалы по теме диссертации опубликованы в 3 статьях и доложены на XII Международном симпозиуме по медицинской химии (Базель, Швейцария, 1992), на 13-м Европейском симпозиуме по химии фтора (Милан, Италия, 1992), на Международной конференции "Современная энзимология: проблемы и направления" (Санкт-Петербург, Россия, 1992), на VII Международной конференции молодых ученых по органической и биологической химии (Варна, Болгария, 1990), на 22-м Симпозиуме FEBS (Стокгольм, Швеция, 1993), а также на семинарах и ежегодных конференциях ГосНИИГенетики.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов работы, экспериментальной части и выводов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Уридинфосфорилазу (УФазу) выделяли из штамма-продуцента E.coli К-12 AM-1906 по известной методике (Михайлов A.M. и др., 1992), соотношение D280/D260 в очищенном ферменте составляло 1,7-1,9; удельная активность была 100-140 МЕ/мг белка. Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорд (Bradford М.М., 1976). Для расчета концентраций растворов уридинфосфорилазы использовали е=0.67 см'1 (Leer J С. et al., 1977) и Mr=27.5 кДа для одной субъединицы белка и Мг=165 для гексамера (Cook W.J. et al., 1987).

Активность УФазы определяли спекгрофотометрически по скорости накопления урацила при 37°С двумя методами (Magni et а'., 1978) и Leer et al., 1977). За единицу ферментативной активности принимали количество уридина, подвергшегося фосфоролизу за одну минуту.

В соответствии с методикой Magui реакционная смесь содержала 50 мМ фосфат натрия и 0.4 мМ урщшн, рН 7.8. Реакцию инициировали добавлением аликвоты фермента (0.36-3 мкМ СЕ). Коэффициент молярной экстинкции полагали равным 1015 М"'-см"'(Vita А., 1986).

По методу Leer аликвоту реакционной смеси, содержащую 50 мМ боратный буфер, рН 7.8 и 20 мМ уридина, инкубировали с ферментом в течение 2 минут при 37°С. Затем к реакционной смеси добавляли 0.5-1 М фосфат натрия, до конечной котщентрации 100 мМ. Аликвоты реакционной смеси добавляли через определенные промежутки времени (0.25-15 мин) к стоп-раствору, содержащему 2.3-кратный объем 0.5 М NaOH. Увеличение количества урацила рассчигьиали по разнице оптических плотностей растворов при 290 нм. Коэффициент молярной экстинкции в этих условиях полагали равным 5410 М ' см"1 (Razzell W.E., Khorana Н., 1958).

Тимидинфосфорилазу (ТФазу) вьщеляли из штамма С-600 E.coli (получен из музея ГНИИГенетики) по методике Schwartz (Schwartz М. et al., 1978), модифицированной нами. Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорд, для одной субъединицы белка полагали М,=45 кДа (Schwartz М. et al., 1978)..

Активность ферме1гга определяли спектрофотометрически методом Leer по скорости накопления тимина. ТФазу (0.1-0.3 нМ СЕ) инкубировали с 5 мМ тимидина в 50 мМ боратном буфере, рН 7.8, содержащем 2 мМ ЭДГА, в течение 2 минут при 37°С. Затем к реакционной смеси добавляли 1 М фосфат натрия, до конечной концентрации 100 мМ. Аликвоты реакционной смеси добавляли через определенные промежутки времени (0.25-15 мин) к стоп-раствору, содержащему 2.3-кратный объем 0.5 М NaOH. Увеличение количества тимина рассчитывали по разнице оптических плотностей растворов при 300 нм. Коэффициент молярной экстинкции в этих условиях полагали равным 3610 М"'-см"' (Razzell W.E., Khorana Н., 1958).

Пирофосфатаза (РРаза) из дрожжей с удельной активностью 400 МЕ/мг была любезно предоставлена д.х.н.А.А.Байковым (НИИ физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского, МГУ). Ферментативную активность пирофосфатазы определяли с помощью автоматического анализатора фосфата (Байков А.А., Аваева С.М., 1981).

Щелочная фосфатаза из Ecoli (АРаза) была получена от фирмы Sigma Chemical Co. (St.Louis, МО). Измерение активности фермента проводили спектрофотометрически (Applebury M L., 1969).

Растворы фосфанов (1.0-50 мМ) готовили в 50 мМ боратном буфере, рН 8.0, содержащем 50% изопропанола.

Все измерения активности ферментов в присутствии фосфанов проводили в растворах, содержащих 10% изопропанола.

Инактивацию уридинфосфорилазы фосфанами проводили следующим образом. Фермент (0.36-10 мкМ СЕ) инкубировали с фосфанами (0.01-500 мкМ) в 50 мМ боратном буфере, рН 7.8, содержащем 10% изопропанола, при 37°С. Контрольный образец инкубировали в тех же условиях без добавления реагента. За ходом инактивации следили, отбирая через определенные промежутки времени (0-15 мин) аликвоту реакционной смеси (20-100 мкл) в систему для определения активности.

Модифицированный белок получали, добавляя к раствору уридинфосфорилазы (20-50 мкМ СЕ) раствор фосфана до конечной его концентрации 100 мкМ. После достижения глубины инактивации 70-90% реакционную смесь наносили на колонку с сефадексом G-50M, уравновешенную 50 мМ боратным буфером, рН 8.0 и элюировали тем же буфером.

Для определения активности фермента в присутствии субстратов или продуктов ферментативной реакции белок инкубировали в течение 30 мин при 37°С в 50 мМ боратном буфере, рН 7.8, содержащем 5 мМ уридин; 5 мМ урацил; 5 мМ уридин и 100 мМ фосфат; или 0-100 мМ фосфат. Затем добавляли фосфан до концентрации 1-500 мкМ. За ходом реакции следили, отбирая через определенные промежутки времени (0-20 мин) аликвоты для определения активности фермента. Контролем служила система, не содержащая уридин или фосфат, соответственно.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Взаимодействие уридиифосфорилазы из КсоИ с СА-423.

При взаимодействии уридиифосфорилазы с СА-423 в диапазоне концентраций от 5 до 500 мкМ наблюдается инактивация фермента, скорость которой увеличивается с возрастанием концентрации реагента (Рис.1).

Активность,%

Время, мин

Рис. 1. Изменение активности уридиифосфорилазы из Е.соИ под действием СА-423; концентрация фермента 0.36 мкМ СЕ, концентрации ингибитора обозначены в мкМ.

Фермент необратимо инактивируется СА-423. Традиционные методы: разбавление, диализ или гель-фильтрация не позволяют реактивировать фермент. Специфичность взаимодействия УФазы с СА-423 подтверждается также отсутствием зависимости скорости и глубины инактивации от концентрации фермента в широком диапазоне концентраций (0.4-10 мкМ) и отсутствием влияния на инактивацию 100-кратного избытка (по сравнению с концентрацией фермента) постороннего белка, бычьего сывороточного альбумина (БСА).

В случае необратимого взаимодействия фермента с ингибитором его эффективность выражается не константой равновесия, а константой скорости,

которая определяет долю фермента, подвергшегося инактивации за данный период времени при определенной концентрации ингибитора (А1сЗпс!§е 1950)

Зависимость кажущейся константы скорости инактивации (к„ж) от концентрации реагента в диапазоне от 5 до 100 мкМ линейна (Рис.2).

1' , мин"' " каж.

(СА-423). мкМ

Рис.2. Зависимость кажущейся константы скорости инактивации уридинфосфорилазы от концентрации СА-423.

Это, по-видимому, свидетельствует о том, что реакция фермента с СА-423 протекает без обратимого образования промежуточного комплекса фермент-ингибитор. Исходя из данного предположения нами была предложена следующая схема взаимодействия УФазы с СА-423

к2

Е +1 -> Е—I,

где Е - уридинфосфорилаза из Е.соИ, 1 - СА-423;

Е-1 - модифицированный фермент, образующийся при присоединении реагента;

к2 - константа скорости инактивации.

s

Значение константы скорости инактивации, определенное из графика зависимости к„ж от концентрации СА-423 (Рис. 2), составляет 9-103 М"'-мин"'.

Специфичность такого взаимодействия подтверждается тем, что один из субстратов - фосфат - защищает фермент от инактивации СА-423. Вероятно, наблюдается конкуренция с фосфатом за связывание с активным центром фермента, а также проявляется большее сродство CA—423 к подцентру связывания фосфата по сравнению с фосфатом.

Проведенное ранее в нашей лаборатории исследование взаимодействия УФазы с флуоресцеин-5'-изотиоцианатом (ФИТЦ) показало существование в молекуле УФазы трех подцентров, в которых происходит связывание урацила, рибозы или фосфата, соответственно (Комиссаров A.A. с соавт., 1994). Было показано, что в уридинфосфорилазе, селективно модифицированной ФИТЦ, остаток флуоресцеина локализован вблизи подцентра связывания уридина, что не позволяет ферменту связывать уридин, в то же время такая модификация не влияет на способность УФазы реагировать с другим субстратом - фосфатом.

В ходе работы была изучена модификация фермента пиридоксаль-5'-фосфатом (PLP), селективно модифицирующего остатки лизина в белках (Карпейский М.Я. с соавт., 1974). Согласно полученным данным, количество PLP, включившегося в фермент, составляет 1 моль на 1 моль субъединиц при остаточной активности 50%, в то время как пиридоксаль включается в количестве 0,5 моля на 1 моль субъединиц при 100% сохраненной активности. Таким образом, в субъединице УФазы из Kcoli под действием PLP модифицируется только один из 10 остатков лизина. Защита УФазы от инактивации PLP только одним из субстратов, фосфатом, позволяет предположить, что пиридоксаль-5'-фосфат связывается с остатком лизина в фосфат-связывающем подцентре фермента (Комиссаров A.A. с соавт., 1987).

Сравнение спектров поглощения нативного фермента; фермента, модифицированного PLP и восстановленного затем боргидридом натрия; а также фермента, модифицированного сначала CA—423, а затем PLP, показало, что СА-423-УФаза не связывает PLP. Это свидетельствует либо о связывании PLP в том же фосфат-связываюшем подцентре, либо о существенных конформационных изменениях Поскольку из данных рентгено-структурного анализа низкого

разрешения (6А) СА-423-УФазы не следует наличие существенных изменений пространственной структуры модифицированной УФазы по сравнению с нативным белком, мы предполагаем, что СА—123 связывается в/рядом с фосфат-связывающим сайтом УФазы.

2. Взаимодействие тимидинфосфорилазы из Е.соП с СЛ^123.

Тимидинфосфорилаза из Е.соП также инактивируется под действием СА-423 в диапазоне концентраций последнего от 5 до 50 мкМ, скорость инактивации возрастает с увеличением концентрации реагента (Рис.3).

Активность %

9

Время, с

Рис 3. Изменение активности тимидинфосфорилазы из Е.соП под действием СА-423, концентрация фермента - 0,14 нМ, концентрации ингибитора обозначены в мкМ.

Тимидинфосфорилаза необратимо связывает СА-423, схема инактивации, по-видимому, сходна с предложенным для УФазы; константа скорости инактивации составила 35.7-Ю3 М '-мин '. Фосфат защищает ТФазу, как и УФазу, от инакгивирующего действия СА-423.

3. Взаимодействие неорганической пирофосфатазы из дрожжей с СЛ—423.

Изучение взаимодействия РРазь! из дрожжей с СА-423 показало, что СА-423 не является сильным ингибитором РРазы в отсутствии субстрата. Скорость инактивации была не слишком велика. При взаимодействии РРазы с СА-423 в диапазоне концентраций последнего от 0.05 до 5 мМ наблюдается инактивация фермента, причем ее скорость и глубина зависят от концентрации ингибитора. Добавление негидролизуемого аналога субстрата пирофосфата кальция (СаРР,) защищает фермент от инактивации.

Специфичность протекания реакции подтверждается слабой зависимостью скорости и глубины инактиьации от концентрации фермента (0.1-20 мкМ) при соблюдении условий псевдопервого порядка и отсутствием влияния на процесс добавления в реакционную смесь десятикратного (по сравнению с РРазой) избытка БСА.

Наиболее эффективно СА-423 действовал в присутствии субстрата пирофосфатазы, пирофосфата магния. При концентрациях СА-423 выше 10 мкМ в присутствии субстрата происходит быстрая инактивация фермента (Рис.4).

[РП, мкМ .

Время( мин

Рис.4. Инактивация РРазы под действием СА-423 в присутствии 1 мМ пирофосфата магния, концентрации СА-423 обозначены в мкМ.

Нами показано, что преинкубация РРазы с СА—123, с ингибитором и металлом-активатором или с ингибитором и пирофосфатом, а также добавление 100-кратного (по сравнению с РРазой) избытка БСА не влияет на процесс инактивации.

Защита от инактивации аналогом субстрата - CaPP¡ - позволяет предположить наличие стадии обратимого связывания СА-423 с активным центром РРазы. Результаты измерений начальных скоростей накопления продукта реакции в диапазоне концентраций субстрата от 10 до 200 мкМ и ингибитора от 0 до 100 мкМ в двойных обратных координатах ложатся на одну прямую (Рис 5).

1/V

Рис.5. Зависимость начальной скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в присутствии 100 мкМ СА-423 (-х-) и в отсутствии СА-423 (-о-).

Полученные данные свидетельствуют о том, что наличие СА—423 в реакционной смеси никак не сказывается на значении начальной скорости гидролиза субстрата, и, следовательно, в этих условиях отсутствует стадия обратимого связывания ингибитора с ферментом (при концентрациях СА-423 10100 мкМ).

Таким образом, скорость инактивации фермента СА-423 в отсутствии субстрата много меньше, нем в условиях протекания ферментативной реакции. Поэтому при анализе результатов, полученных при инактивации РРазы в присутствии субстрата, влиянием скорости инактивации фермента под действием СА-423 в отсутствие субстрата можно пренебречь. Это означает, что присутствие субстрата является необходимым условием для того, чтобы каталитически важные группы оказались доступны для взаимодействия с СА-423. Наблюдаемый в этом случае эффект может быть описан схемой, соответствующей синкаталитической инактивации (когда ингибитор способен реагировать либо с фермент-субстратным комплексом, либо с одним из промежуточных соединений, образующихся при превращении субстрата в продукт):

Е + Б <-> Е* 5->Е + Р +1 4.1с

Е »Б-!,

где Е - неорганическая пирофосфатаза из дрожжей;

5 - субстрат- пирофосфат магния,

Р - продукт реакции - неорганический фосфат;

I - СА-423;

Е»Б - фермент-субстратный комплекс;

Е*5-1 - инактивированный фермент, образующийся при взаимодействии с ингибитором фермент-субстратного комплекса к - константа скорости инактивации фермента.

В случае синкаталитической инактивации зависимость 2УJ [Р| ] от концентрации СА-423 представляет собой прямую линию, тангенс угла наклона которой равен кг (Рис.6). Значение кг, рассчитанное из этой зависимости составило 1.210' М"' мин"'.

Возможная причина такого характера взаимодействия СА-423 с РРазой состоит в том, что РРаза является "полу-центровым" ферментом: когда одна субъединица работает - другая "отдыхает". Вероятно, СА-423 реагирует с "отдыхающей" субъединицей.

ГСЛ-423], mkM

Рис.6. Определение константы скорости для второго порядка синкаталитической инактивации РРазы под действием СА-423.

Эти данные согласуются с синкаталитическим характером ингибирования неорганической пирофосфатазы фторид-ионом (Смирнова И.Н., Банков A.A., 1983). Ион фтора замещает молекулу воды в переходном комплексе фермент-субстрат и инактивирует неорганическую пирофосфатазу. Синкаталитическое ингибирование неорганической пирофосфатазы СА-423 происходит в 100 раз более эффективно, что подтверждается наличием у фермента такой конформации, которая связывает ингибитор прочно и селективно.

4. Взаимодействие щелочной фосфятазы с СА-423.

При изучении взаимодействия щелочной фосфатазы с CA—423 был обнаружен другой механизм ингибирования. Исследование этой реакции показало, что при низких концентрациях субстрата (меньше 0.6 мМ) ингибирование протекает по неконкурентному механизму с К| = 1.8 шМ. При более высоких концентрациях субстрата (>2шМ) ингибирование становится конкурентным с К| = 1.0 mM. В сходных условиях ион ванадата конкурентно ингибирует АРазу при любых концентрациях субстрата (Рис.7).

Можно предположить, что при низких концентрациях субстрата (<0.1шМ) в катализе участвует только один активный центр в расчете на димер щелочной

фосфатазы, а при высоких концентрациях субстрата функционируют оба активных центра. Таким образом, такой тип ингибирования отражает влияние связывания ингибитора с одной субъединицей на поведение другой.

1/У

1/[Э], 1/тМ

Рис.7. Начальные скорости ферментативной реакции щелочной фосфатазы, представленные в координатах Лайнуивера-Берка для нативного фермента (1), для фермента в присутствии 10 мМ СА—423 (2), и в присутствии 50 мкМ ванадата

(3)

5. Взаимодействие уридинфосфорилазы из КсоИ с аналогами СА-423.

Было изучено влияние структурных аналогов фосфата с различными заместителями, синтезированных коллегами из Черноголовки (см. Таблицу 1), на активность уридинфосфорилазы. Приводим полученные для них значения констант скорости инактивации фермента.

Из приведенных данных следует, что наилучшими свойствами необратимого ингибитора, обладает соединение СА-546. Сравнение структуры этого соединения и СА-423 показало, что СА-546 является более гидрофобным соединением.

Аналог к , М'мин"1 СА-423 9.0 10' СА-594 9.2-102 ОВ-609 1.1102 СА-546 1.8-10* ИВ-32 2.2-Ю2

Ранее было показано, что модификация УФазы СА-423 существенно увеличивает гидрофобность активного центра фермента (Komissarov А.А. et al., 1994). Большая эффективность СА-546 как ингибитора по сравнению с СА-423 согласуется с тем фактом, что активный центр этого фермента сформирован в основном гидрофобными группами (Моргунова Е.Ю., 1995). Возможно также, что существенным при проявлении соединением ингибирующих свойств является и меньший размер молекулы.

6. Действие СА-423 in vivo.

В работах, проведенных совместно с коллегами из Института экспериментальной диагностики и терапии опухолей Онкологического научного центра РАМН (лаб.А.М.Козлова), было показано, что обработка мышей с аденокарциномой молочной железы ингибитором СА—423 (5мг/кг, 1 раз в день, в течение 7 дней) более чем в 90% случаев остановливает рост опухолей (Таблица 2). Мышам линии BDF1 с экспериментальной аденокарциномой молочной железы Са-755 имплантировали опухоль подкожно. Внутрибрюшиное введение СА-423 начинали через 48 часов после имплантации и продолжали в течение 7 дней.

Кроме того, обнаружено, что при одновременной обработке 5-фторурацилом и СА-423 мышей с лейкемией Р—388 наблюдается четко выраженное 3-кратное уменьшение противоопухолевой активности 5-фторурацила. При этом терапевтические дозы СЛ^423 не превышают 10-15% от LD50.

Таблица 2

Обработка мышей с аденокарцнномой Са-755 СА-423

Послед, обработки: (мг/кг)/число инъекций/время(ч) Ингибир. роста опухоли *,% дни после имплант. Опух. 7 | 11 | 14 | 17 Увелич. времени жизни, %" Выживаемость

1/7/24 86 37 6 28 21 7/7

5/7/24 94 84 93 38 22 7/7

15/7/24 65 63 22 35 11 6/7

* по сравнению с контрольной группой (не обработанной СА-423).

U среднее время жизни для контрольной группы составило 21,5 дней.

Сравнение констант инактивации для УФазы из E.colt и УФазы из цитоплазмы печени мыши, слизистой кишечника крысы и цитоплазмы печени человека под действием различных аналогов нуклеозидов (ангидро- и ациклоуридины) показало, что эти ингибиторы в 3-10 раз эффективнее действуют на ферменты из млекопитающих по сравнению с ферментом vaKcoli (Veres Z.H., et al., 1985, Drabikowska A.K., et al., 1987, Naguib F.N.M. et al., 1987). Исследователи также отмечают, что УФаза из E.coli и УФазы из млекопитающих инакгивируются одними и теми же бензилациклоуридинами, что позволяет предположить сходство структуры их активных центров (Park K.S. et al., 1986, Naguib F.N.M. et al., 1987), хотя уридин- и тимидинфосфорилазы из E.coü и человека имеют невысокий процент гомологии (для ТФаз он составляет 38%).

Обнаруженный нами факт необратимого связывания СА—423 с уридин- и тимидинфосфорилазой из Exoli, а также его относительно низкая токсичность позволяют рассматривать это вещество как перспективное соединение для химиотерапии. Если СА-423 деградирует в тканях, то в этом случае активность ферментов может быть восстановлена только посредством биосинтеза их de novo.

Кроме того, ингибитор, являющийся структурным аналогом фосфата, может стать удобным инструментом для изучения отдельных стадий катализа.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что органические производные фосфора - фосфаны являются необратимыми ингибиторами уридинфосфорилазы и тимидинфосфорилазы из E.coli. Показано, что фосфан СА-423 связывается в/вблизи с центром связывания фосфата. Определены константы скорости инактивации данных ферментов.

2 Показано влияние СЛ-423 на другие ферменты фосфорного обмена. Обнаружено, что СА-423 инактивпрует неорганическую пирофосфатазу из дрожжей по синкаталитическому механизму: в отсутствии субстрата скорость инктивации оказывается много меньшей, чем в его присутствии.

3. Показано, что для щелочной фосфатазы из E.coli СА-423 является обратимым ингибитором; при низких концентрациях субстрата ингибирование протекает по неконкурентному механизму, при высоких - становится конкурентным.

4. В экспериментах, проведенных совместно с Онкологическим центром РАМН, показано, что один из фосфанов данного класса - СА-423 - малотоксичен, влияет in vivo на метаболизм фторурацила и обладает заметным антиканцерогенным эффектом на индуцированные опухоли мышей.

Основное содержание диссетацни изложено в следующих публикациях:

1. Dmitrieva N.A., Ryazantseva D.V., Komissarov А.А., "Essential amino acids in the active site of uridine phosphorylase from E.coli". VII International Conference of Young Scientists on Organic and Biological Chemistry,Varna, Bulgaria, 1990,p.40-42.

2. Dmitrieva N.A., Ryazantseva D.V., Komissarov A.A., " An essential residue of lysine in the uridine phosphorylase from E.coli." The All-Union Conference "Methods of preparation analysis and using of enzymes." Yurmala, USSR, 1990, p. 14.

3. Komissarov A.A., Dmitrieva N.A., Petrova T.V., Romanova D.V., Sobol E.M., Debabov V.G., Sokolov V.B., Aksinenko A.Yu., Fetisov V.I. "A transition-state analog containing the trigonal bipyramidal phosphorus atom is a potent syncatalytic inhibitor of inorganic pyrophosphatase." The XHth International Symposium on Medicinal Chemistry, Basel, Switzerland, 1992, p.282.

5. Komissarov A.A., Romanova D.V., Dmitrieva N.A., Debabov V.G., "Selective chemical modification of uridine phosphorylase from E.coli" 22-th FEBS Meeting, July 4-9 1993, Stockholm, Sweden, Book of Abstracts, p.90.

6. Sokolov V.B., Aksinenko A.Y., Komissarov A.A., Dmitrieva N.A., Romanova D.V., Sobol E.M., Debabov V.G., Fetisov V.l. "Design, synthesis and antyenzymatic activity of novel water-stable fluorine-containing phosphoranes", J.Fluor.Chem., 1992, v.58, p. 197.

7. Komissarov A.A., Romanova D.V., Dmitrieva N.A., Linkova E.V., Mironov A.S., Debabov V.G. "Selective modification of putative uridine-binding site of uridine phosphorylase from E.coli with fluorescein-5'-isothiocyanate", BBA, 1994, v. 1205, pp.54-58.

8. Молчан O.K., Дмитриева H.A., Романова Д.В., Эррайс Jlonec Л., Дебабов В.Г., Миронов A.C. "Выделение и первичная характеристика уридинфосфорилазы из Salmonella typhimurium" Биохимия, 1998, Т.63, вьш.2, с.91-95.