Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Формирование фонда биогенных аминов и нейроактивных аминокислот в головном мозге крыс при алкогольной интоксикации и отмене этанола

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Формирование фонда биогенных аминов и нейроактивных аминокислот в головном мозге крыс при алкогольной интоксикации и отмене этанола"

л^ч

Р Г Б ОД

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ РАДИОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

ДОРОШЕНКО Евгений Иихейлошп

• eCR-IIPOBAHÏIE ЙСНДА БИОГЕННЫХ АМИНОВ И HEÏÎPOAFCEÎBHLJS АМИНОКИСЛОТ

в головном иозга крыс при ашогольно^ шишсшащи- и с®,ehe

ЗТЛНОЛА

д В ? О Р А Т

us учого:"! стопок!

- 133Л"

*

Работа выполнена в Институте биохимии АН Беларуси. Научный руководитель - канд.мед.наук,

ст.u.c. С.Ю.Островский

Официальны» оппоненты: доктор биологических наук, профессор Н.А.Юсипова кандидат биологических наук, доцент М.В.Шолух

Ведущая организация - Минскт! Государственный медициискиЛ институт

•ю

Защита состоится _ 1234 года в ' * часоп

на заседании специализированного совета Д 006.30.01 в Институте радиобиологии АН Соларуси (220300, г.Минск, ул. Код-.шская, 2).

С диссертацией мо;.;но ознакомиться в библиотека Института радиобиологии АН Беларуси.

г

Автореферат разослан " 2%

Ученый секретарь специалиаироиаикого совета ' кандидат биологических наук

1934г.

СК5ГЩЧ

Г: //

/л//

/ ; '

л ЛЛ .".одосоискс

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблешз.

Исследование закономерностей формирования фонда нейроак-тивньа аминокислот и биогенных аминов в головном мозге представляет большой научный и практический интерес и является частью одной из важных проблем современной биохимии, связанной с целенаправленной регуляцией метаболических процессов биологически активными .природными соединениями [К.С.Раевский, Б.П.Георгиев, 1985? F.E.Bloom, 1984].

Известно, что алкогольная интоксикация и зависимость сопровождаются выраженными нарушениями в функционировании ряда нейротрансмиттерных систем. Существует ряд предпосылок, позволяющих предположить возможные механизмы влияния этанола на нейротрансмиттерньге системы головного мозга: нарушения транспорта аминокислот в мозг, нарушения обмена триптофана при хроническом алкоголизме (дефект пирродазнсго пути), конкурентные взаимоотноиений между ацетальдегидом при алкогольной интоксикации и биогенными альдегидам';? в отнаиеш«', альдегидметабслизирую-них ферментов; образование эндогенных алкалоидов, связыьакие биогенных альдегидов с мембранными структурами. Очевидно, не Ii— ротрансмиттериые системы при алкоголизме функционируют на ином уровне адаптации, чем з норме, и ряд сдвигов в содержании медиаторов , их предыаствэнников и родственных соединений может иметь приспособительный характер.

Ряд исследователей считают ответственной за формирование неврологических расстройств при алкоголизме преимуцественно одну из систем - дофаминовую [И.П.Анохина, Б.М.Коган, 19S4] или серотонииовую [VJ.O.MsBride et al.,1389]. Кроме этого, в последние годы дзлзгатся попытки объяснить некоторые нарушения деятельности мозга при алкоголизма .изменением функциональных и функционально-метаболических •язагяа'оотнояений между различными

Принятие сс::рп~енля: ГБЛ - у-бутиролактсн: ГАМ, gaba -r-аминоыасляная кислота; ГСЙК - r-оксимасляна.ч кислота; Агр -аспарагкновая кислота; Glu - глутзминовая кислота; Gin - глут-смим; Gly - глицин; Таи - таурин; Туг - тирозин; Тгр - триптофан; ИЕ - норадреиалнн; DA -"дофамин; 3-МТ - З-ыетокситирамии; DOPAC - 3,4-дпокскфэкилуксусная кислота; H VA - З-метокси-4-оксифеиилуксусмая (гемованилиновая ) кислота; 5-НТ - '•еротонин; 5-HÎAA - 5-оксииндолукеусная кислота.

a

системами [K.Hellevao, 1990, А.И.Балаклеевский и соавт., 1988]. В целом те взаимосвязи между системами биогенных моноаминов и нейротрансмиттерных аминокислот остаются невыясненными. Это не позволяет корректно объяснить механизмы действия некоторых биологически активных соединений па процессы формирования фонда Hftliреактивных аминокислот и биогенных аминов, а такие вести целенаправленный поиск новых антиалкогольных средств.

Исследование, действия этаноламина, являющегося естественным метаболитом в центральной нервной системе, при алкогольной интоксикации привело к представлению об антагонистических отношениях между этанолом и этаноламином: для этаноламина было продемонстрировано ингкбирующее действие на алкогольметаболиэи-рующие системы [Ю.М.Островский и соавт., 1986]; зтаноламин способен влиять на фармакокинетику этанола [t.L.Bykov et а!., 1S89]| а при синдроме отмены этанола, по полученным нгши в предварительных экспериментах данным, он полностью предотвращал . развитие зудиогенно'-о судорожного синдрома.

Поскольку в патогенезе судорожного синдрома, являющегося одним из проявлений синдрома отмены этанола, существенная роль отводится нарушениям в ГАМК-ергической системе [D.B.Goldstein, 1973, F.Fadda, 1989], и были продемонстрированы эффекты модулирующего активность этой системы ди-п-пропилацетата (вальпроевой 7 кислоты) при этом патологическом состоянии [M.Hillbom, 1989], актуальным является исследование также влияния вальпроата натрия на уровни нейроактивных аминокислот и биогенных аминов.

Известно, что г-бутиролактон - структурный аналог ГАМК -способен угнетать функциональную активность дофаминергических структур мозга [F.Fadda ct al., 1983], что позволяет предположить его модулирующее _ воздействие одновременно на несколько нейротрансмиттерных систем, функционирований которых нарушается при синдроме отмены этанола.

Комплексное изучение этих процессов и их анализ как единого информационного целого позволяет выявить наиболее существенные патогенетические моменты воздействия этанола на нейротранс-миттерные системы, а также обосновать применение при синдроме отмены этанола биологически активных веществ, выявить новые аспекты в механизмах воздействия на нейротрансмиттерныз системы известных и практически применяющихся или исследуемых в экспе-

рименте нейротропных препаратов.

Цель и задачи псслздованпя. Целью исследования было: охарактеризовать изменения а фонде нейроактивных аминокислот, биогенных аминоа и их производных при алкогольной интоксикации и синдроме отмены этанола, а такие при действии на этом фоне некоторых перспективных для лечения алкоголизма препаратоз. Для этого были сформулированы следующие задачи: -разработать адекват^ю методическую основу, обеспечивающую одновременное и корректное определение показателей, наиболее полно характеризующих системы биогенных моноаминов и нейроактивных аминокислот;

-охарактеризовать изменения в содержании исследуемых соединений в отделах головного мозга при острой и хронической алкогольной интоксикации;

-охарактеризовать функционально-метаболические взаимосвязи меиду исследуемыми показателями при введении структурного аналога этилового спирта этаноламина на фоне острой алкогольной интоксикации;

-охарактеризовать формирование фонда нейроактивных аминокислот и биогенных аминов при отмене этанола после хроническс>Ч алкоголизации и введении на этом фоне этаноламина, а также вальпроевой кислоты и бутиролактона - препаратов, влияюцих одновременно на различные нейротрансмиттерные системы и перспективных в качестве антиалкогольных средств;

-исследовать возможность реализации механизма действия этаноламина на исследуемые системы через его метаболические превращения до фосфоэтаноламина и глицина - соединений, обладающих, соответственно, свойствами нейромодулятора и истинного трансмиттера;

-на основании проведенных иссле^дозаний разработать подходы для целенаправленной коррекции ,нарушений в фонде нейроактивных соединений при отмене этанола.. Научная новизна.

Впервые проведена ,комплексная биохимическая оценка широкого круга показателей., составляющих фонд нейроактивных соединений -аминокислот, биогенных аминов и их метаболитов - как единого целого, на основания современных аналитических методов опреде ления указанных соединений и методов математического анализа.

Впервые установлено, что станодамин при острой алкогольной интоксикации способен снижать сккаптический выброс дофамина и повьгаать уровень медиатора в дофаминовой система при отмене этанола.

Впервые установлен характер влиянии этаиоламина на соотношение возбуждающих и тормозных медиаторов при острой алкогольной интоксикации.

Вперьые описаны но-ГАЫК-ергичсские эффекты вальпроата натрия при синдроме отмены этанола: снижение уровня возбуждающего медиатора - аспартата и активация серотонинергическоЯ системы, опосредованная повышением уровней предшественников.

Основные ПОЛО..СШ1Я, вшюкшыо дл.ч защита.

1. Разработаны методы, позволяющие одновременно I! корректно определять в отделах голодного мозга и биологических жидкостях уровни не'.фоактивнш аминокислот, биогенных аминов, их предшественников и метаболитов.

2. Острая и хроническая алкогольная интоксикация приводят к выраженному дисбалансу в фонде нейроактивных аминокислот и биогенных аминов в стриатуме, стволе мозга и гипоталамусе крыс.

3. В исследованных отделах мозга при острой алкогольной интоксикации влияние этанолзмина, но но фосфоэтаноламина, на формирование фонда нейроактивных соединений включает в себя повышение уровней "тормозных" аминокислот-медиаторов и снижение интенсивности синоптического выброса дофамина.

4. Действие вальпроата натрия при отмене этанола Еключает а себя нс-ГАМК-ергические механизмы: снижение уровня аспараги-новой кислоты и активирующее влияние на показателя серотонино-пой системы, опосредованное повышением уровней предаественни-коз.

Научпо-практнчегсгса значение работи.

Результаты, полученные при разработке хроматографических методов определения исследованных соединений, могут быть использованы в экспериментальной и клинической практике.

Обоснована с точки зрения модулирующего влияния на показатели дофаминовой системы и систем нейроактивных аминокислот целесообразность использования этаноламина при острзй алкогольной интоксикации, а такие для купирования проявлений синдроме отмены этанола.

Обоснована рациональность совместного применения зтанол--ииина и вальпроата натрия при синдроме отмены этаисла, исходя • «з их влияний на различны? кеПротрансмиттерные системы.

Установлено, что острая и хроническая алкогольная интокси-пеция, приводящие к неоусениям функционально-метаболических рзаимосвяэей между неЯротранс.миттер.чими системами, характеризуется различной направленностью измеиенкП в исследуемых показателях, в частности, соотношении "возбуждающих" (аспартзт, глутамат) и "тормозных" (глицин, т<зур:;н, ГАМК) трансмиттеров в гипоталамусе. Б обоих случаях действие этанола заключается в изменении уровней "возбуждающих" трансмиттеров. Метаболическая ситуация а исследованиях отделах мозга при отмене этанола отличается от таковой при хронической алкогольноЯ интоксикации.

Показано, что этанолзмин при его введении на фоне острой алкогольной интоксикации способен снижать интенсивность синап-тического выброса дофамина в стриатуме, в то время как при"' отмене этанола его действие включает в себя снижение деградации ГЛМК и повышение уровней дофамина и его основного метаболита -Д,4-диоксифенилуксусноП ккспоты. Как в случае остроП алкогольной интоксикации, так и при отмене этанола эффекты этанола мина !« опосредуются его фосфорилироваиием.

Установлено, что зальпроат натрия при введении на фон* отмены этанола снижает уровень аспартата по всех исследованных отделах мозга, а также оказывает активирующее влияние на серо-тониноргач.зскую систему, опосредованное повышение!.», уровне« предиественников, т.е. действие вальпроата на.рия не исчерпывается известными для него ГАМК-ергическими механизмами. Апробация работы л пуОлш;ацяи.

Результаты диссертационная работы обсуждены на: IV Конференции Итальянского Общества науки о мозге, Палермо, 1950; V Конгрессе Всемирной федерации обществ биологической психиатрии, Флоренция, 1991; IV Научном съезде специалистов по лабораторной клинической диагностик© Республики Беларусь, Гродно, 1Э92; Симпозиуме Международного общества по биомедицинским исследованиям алкоголизма "Генетика и заболевания, связанные с алкоголем", Бордо, 1ЭЭ2; IV Конгрессе Европейского общества по биомедицинским исследованиям алкоголизма, Генуя, 1ЭЭЗ; Конференции "Новые достижения в лечении алкоголизма", Триест, 1ЭЭЗ; 13-Я

6 ' 4 •

Конференции Международной ассоциации судебной медицины, Дюссельдорф, 1993; Международной конференции, посвященной 35-летию Гродненского медицинского института, Гродно, 1393; VI Конгрессе Европейского сообщества нейрофапмакологов, Будапеит, 1993, По материалам диссертации опубликовано 12 работ. Структура И объем работы. Диссертационная работа состоит из езедения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 155 работ. Робота изложена на 133 страницах ыаоинописного текста, содержит 13 рисунков и 18 таблиц.

Экспериментальные иоделн. В опытах использованы белые крысы-самцы массой 140-160 г из питомника АМН СССР "Рапполово", ■ содержавшиеся на стандартном рационе вивария.

При выборе экспериментальных моделей исходили из необходимости обеспечения минимального объема воздействий, способных индуцировать патофизиологические проявления моделируемого состояния, оказывающие влияние на определяемые показатели (например, судорожный синдром при отмонэ этанола) [L.С.Ward, 1987].

Острую алкогольную интоксикацию моделировали однократным внутрибрюшинным введением 3,5 г/кг этанола на 30 мин (для этого срока ранее были продемонстрированы основные противоалкогольные эффекты этаноламина (И.Л.Быков и соавт., 198Э]). На такой же срок вводили этаноламин в дозе 100 мг/кг [M.Krsiak et al., 1971] или фосфозтаноламин в эквимолекулярной дозе 230 мг/кг.

Хроническую алкогольную интоксикацию моделировали путем 3-х месячного потребления ¡«квотными растворов этанола возрастающей концентрации (10-20 %) [L.'C.Ward, 1987] в качестве единственного источника жидкости, после чего отменяли этанол. Срок отмены этанола - 12 ч - характеризуется максимальной выраженностью её патофизиологических проявлений [E.Majchrowicz, W.A.Hunt, 1980]. Этаиоламин, фосфозтаноламин, ГБЛ (250 мг/кг) [F.Fadda, 1983) и вальпроат натрия (400 мг/кг) [F.Crespi et al., 1ЭЧ6] вводили за 30 мин до декапитации; дозы этаноламина И фосфоэтг.ноламииа соответствовали таковым при острой алкогольной интоксикации. В этом эксперименте для контроля неспецифически* факторов (питв:1/.е, стресс) определяли, помимо основных показателей, также уровни амкокислот и метаболитов биогенных аминог

в плазме крови и надпочечниках, а такяе содержание в надпочечниках и плазме крови кортшсоетероидов.

Содержание гидрокортизона и кортикостерона определяли в хлороформных экстрактах методом обращенно-фазной ВЭЖХ с УФ-детектированием (А.М.Хоха, 1ЭЗЭ, в собственной модификации).

Математическую обработку данных (Т-статистика, корреляционный и дискриминантный анализ) проводили на ПЭВМ AT3SG/7 с помощью программ 3d и 7т«из пакета для многомерного статистического анализа BMDPC.

В работе использовали жидкостный хроматограф Waters (Millipore-Waters, США), хроматографические колонки производства МНПП "Элсико" (Россия), хроматографически чистые стандарты аминокислот, биогенных аминов и их производных фирм Sigma, Serva, Fluka, Reanal, другие реактивы, удовлетворяющие требованиям чистоты для жидкостной хроматографии.

ССПОВНЫЗ РЕЗУЛЬТАТ»! II SIX СЗСУ~ДЕШТ2

1. Разработка цетодов определения бпсгощглх еинноз, их предшественников, иетаболптоз и пеЯроаитншых аминокислот.

Разработка аналитической методологии определения содержания биогенных аминов я родственных соединений методом ВЭЖХ включала несколько этапов: выбор типа сорбента для обеспечения максимальной эффективности разделения в ион-парном ре.глме; выбор состава подвигшой фазы, дополнительных параметров разделения и оптимальных условий детектирования; опреде ;ение воспроизводимости и реальной разрешающей способности при работе с пробами биологического материала; контроль аутентичности пиков л определение диапазона линейности. Отработанный метод представляет собой ион-парное разделение аминокислот-предшественников (Туг и Тгр), биогенных аминов (ПЕ, DA, 3-МТ, 5-НТ) и их кислых метаболитов' (DOPAC, 5-HIAA, HVA) в хлорнокислых экстрактах ткани головного мозга с электрохимическим детектированием.

Основные особенности метода; использование двухкомпонент-ного ион-парного реагента, контролируемая температура разделения и оптимизированная величина потенциала обнаружения, при которой обеспечивалось соотношение чувствительности к анализируемым соединениям, таким, кок Туг и Тгр, соответствующее соот-

ношению в мозге их реальных концентрация, т.е. достигалось дополнительное улучшение разрешающей способности на этапе детектирования.

Условия разделения: колонка Сепарон 5GX С1В, 5 мкм, 3x150 мм с предколонкой 3x50 мы; подвижная фаза: 0,1 М КНаР0%, 17 мМ СН2С00Н, рН 3,55, гептилсульфонат натрия 200 мг/л, октилсульфо-нат натрия 200 мг/л, ЭДТА 0,1 мМ, метанол 11,5 об.Я; скорость потока 0/5 мл/мин, температура колонки 30°С. Детектирование амперометрическсе, потенциал рабочего электрода 0,78 В, постоянная времени 1 с. Внутренний стандарт - 3,4-диоксибензиламин.

Разработка метода определения аминокислот была необходима из-за недостаточной чувствительности метода ионообменной хроматографии с нингидриновым детектированием для работы с лимитированным количеством биологического материала. Метод представляет собой обращённсфазное разделение дериватов аминокислот с 2-меркаптоэтанолом и о-фталевым альдегидом с детектированием по флуоресценции. Этапы разработки метода: подбор начальных условий при градиентном элюировании, величины рН начального буфера, оптимального профиля кривой градиентного элюирования, оптимально Я температуры разделения и времени регенерации и кондиционирования колонки для получения воспроизводимых времен удерживания при минимальной длительности анализа; идентификация пиков в пробах биологического материала и контроль воспроизводимости. Условия разделения: колонки Сепарон SGX С1В, 5 мкм; тандем 3x150 + 3x150 мм; колонка-сатуратор - Сепарон SGX С1В, 10 мкм, 4x100 мм; подвижная фаза А: 0,05 М Na3HP0^f 0,05 М СН3С00Ыа, рН 7,15, 2,85 % THF; подвижная фаза В: СН3СН/Н20 = 1/1 (об.). Градиентное элюирование: начальные условия - 10S В; 8 мин - 255 В; 20 мин - 40S Б; 28 мин - 55% В; 34 мин - 10й Б. Скорость потока 0,5 мл/мин; температура колонок - 30°С; детектирование по флуоресценции (338/425 нм ). Внутренний стандарт - норлейцин.

2.Формирование фонда нейроактившх ахгакокисдот ц биогенных аминов в отделах мозга крис при острой алкогольной интоксикации, введении этанолаыина и фосфоэтаноламкна.

Острая алкогольная интоксикация (30 мин, 3,5 г/кг) сопровождалась повышением уровня HVA во всех исследованных отделах мозга и повышением уровня 5-HIAA в стволе мозга; при этом кон-

цеятрации ОА, 3-"ДТ и 5-НТ оставались неизменными (рисЛ). Такой характер взаимосвязей между уровнями СА, 3-МТ и НУА свидетель-

* - р<0,05 по отношению^к контролю

** - р<0,05 по отношению к остро/1 алкогольной интоксикации

Рис.1. Изменения в содержании исследуемых соединений ь отделах мозга крыс при острой алкогольной интоксикации и вьел»-нии этаноламинеР (в 5 к контролю).

ствует о росте синэптического выброса, и, в большей, стеа-.-n.i, деградации дофамина при острой алкогольной интоксикации.

Б гипоталамусе наблюдалось снижение уров«ей нозбух.^акпгл". медиаторов (Asp и filu); в стриэтуме - снижение только уровня Asp (рис.1).

При острой алкогольной интоксикации нарушалась положи гель ная корреляционная связь мезду уровнями этаноламика и фосфоэта-ноломина в гипоталамусе и появились положительные корреляции между уровнями DA и DOPAC в стволе мозга, а тькха DA и 5-ИТ и гипоталамусе.

При введении этаноламина на фоне острой алкогольной ниток- ■ сикации а стриатуме уровень 3-метокситирамина снижа'л-гв ни* ; контрольных цифр, одновременно приходил к контрольным значениям уровень HVA, повышенный при алкогольной интоксикации. В гипоталамусе в этой же ситуации отмечался повышенный уровень DA при неизменном относительно группы острой алкогольной интоксикации

уровне HVA (рис.1». Из эти* двух фактов .следует, что этаноламин при введении на фоно острой алкогольной интоксикации способен сникать интенсивность синоптического выброса Дофамина.

Характер корреляционных сзязеП ыеаду уровнями Тгр, 5-НТ и 5-ШАА в стволе мозга поело сог.гластнсго введения этанола и эганотамина соответствовал набяюдававыуся б контроле, несмотря н.1 то, что достоверных изменений в абсолютных значениях этих моказатепей по отношении к острой алкогольной интоксикации не было, чт-о монет свидетельствовать о иорыйлкзующем до Яствпи этаноламина iifj соотношение процессов синтеза t! распада медиатора в серотокиновой систем о. Этанолами» при его совместном введении с этанолом такте восстанавливал направленность корреляции О А - Б—HT во всех исследоваккбгх отдела?: мозга.

В гипоталамусе и, в меныаой степени, в стриатуые, эганол-. амин' вызывал сдвиг соотношения "возбуждающих" и "тормозных" медиаторов г. сторону "тормозных", как при его введении интвкт-ным животным, так и на фон--; острой алкогольной интоксикации. Сдвиг z этем соотношении при острой алкогольной интоксикации был направлен также а сторону "тормозных" медиаторов, однако этанол снижал уровни "ьозбугздакгщия" медиаторов, тогда как эта-ноламин повывал уровни "тормозных".

При введения фосфоэтаноламина на фона острой алкогольной интоксикации воспроизвести вышеперечисленные эффекты этаноламина не удалось; в стриатумо наблюдалось повышение уровня Glu.

3. С-ормировшшэ фонда нейроактившх аишшхшелот и биогенных аминов в отделах ыозга крча при хронической алкогольной интоксикации, отмене этанола н введении этаиолсишю, фосфоэтЕнолЕаи-на и ГАМК-ергичееких препаратов.

Хроническая алкогольная интоксикация, в отличие от острой, характеризовалась противоположными сдвигами в уровнях возбуждающих медиаторов (Азр и Glu), а также - повышением содержания Тгр, Ь-НТ и 5-HIAA в гипоталамусе (рис.2). В стриатуме наблюдалось появление отсутствовавших в контроле положительных корреляций между уровнями Glu и Gin, Tau и фосфоэтаноламина, нарушение положительной корреляции 5-HT-5-KIAA и появление - Тгр-б-НТ. Кроме этого, в стриатуые появлялись отрицательные корреляции между уровнями NE. с одной стороны, и DA, D0PAC с HVA, с

Il

a

T"

Glu

Trp 5-КГ5-ШЛА гипоталамус

контроль СЗ

5-KHA

ствол мозга ХАИ Е-3

СЛ2А CA С.'А 5-КТ5-ЕМА

стриатум отпена этанола

* - р < 0,05 по отнопенггэ к контроля а» - р < 0,С5 по отношению к ХАИ

le.2. Изменения в содержании исследуемых соединений а отделах мозга крыс при хронической алкогольной интоксикации

(ХАИ) м отмене этанола (в 5 к контроля).

«

>угой. Б гипоталамусе воспроизводились те reo изменения в пор-ляционных взаимосвязях меяду показателя?.?« соротошшоБой скс-мы, что и з стриатуме, однако менее вьтракенныз, а таете попалась положительная корреляция Glu - OAßA.

В целом, наиболее Еыракенные сдвиги при хронической алко-льной интоксикации отмечены s показателях серотонииовой сис-мы; кроме того, как при острой, так и при хронической алко-льной интоксикации наблюдался сдвиг з соотнопении "тормозных " "возбуждающих" аминокислот-трансмиттеров, причем нааразлен-сть этого сдвига в обеих ситуациях была противоположной.

Отмена этанола после 3-месячной хронической алкоголизации сзывала повышение уровня 5-Н1АА в стволе мозга, а а стриатуме повышение уровня HVA по отменен!«» к контролю. При отмене анола в стриатуме отмечались более высокие (р<0,05), чей при оничеспой алкогольной ннт&ссихации, уровни этанолзмина, ГДМК, fil АА и HVA (рис.2).

В гипоталамуса при отмена этанола возникали высокодосто верные положительные корреляции Glu-Cln, Asp-Clu и Gln-GABA Полох;итольные корреляции ОА-З-МГ в стриатуме и DA-HVA в гипота лаыусе свидетельствуют о повышении интенсивности синаптическог выброса дофамина в ранние сроки отмены зтанола.

По данным линеПно-дискриыинантного- анализа, наиболее ин формативными показателями (по значениям F-констант Фивера) пр хронической алкогольной интоксикации и отмене этанола в гипота ламусо были уровни Asp, GABA, DA й HVA, а в стриатуме - урови DA, HVA и Clu.

Таким образом, как остра/., так и хроническая алкогольна интоксикация, о также отмена этанола, характеризуются выражен ньш дисбалансом & фонде нойроактивных соединений в исследован ных отделах головного мозга. -

При введении .втаноламина на фоне отмены этанола отмечало! повышение уровней DA и DÛPAC в гипоталамусе, в меньшей степе» - в стволе мозга (рис.3). При этом имела тенденцию в снижен!1 корреляционная связь Glu-GABA в Гипоталамусе, в стриатуме - и< чозала положительная корреляция Gln-GABA, а в стволе мозга иг рушались обе корроляционныо связи. Таким образом, этанолам! при его введении на фоне отмены этанола, вероятно, замедля метаболизм Г АПК, а такко повышает п гипоталамусе уровень DA его основного метаболита — DQ?AC. й

Введение фосфозтанэламп:ш не воспроизводило .результате полученных при введении этанола;,¡ила на фоне отмены этанол кроме повышения урешя В A а гипоталамусе. Таким образои, как случае острой алкогольной интоксикации, так и при отмене этан ла эффекты этаноламина не были обусловлены его фосфорилироваш ем.

Введение у-бутиралакгекз вызывало синжошю содорггаяил 3-i и HVA в стриатуме (рис.3); уровень DA в стриатуме характериз вался наибольшей величиной Р-константы Фишера (15). г-бутир лактон вызывал такие повышение уровня б-НТ в гипоталамусе и п явление положительных корреляций Trp ~ 5-HT во всех исследова ных отделах мозга. Таким образом, механизм действия г-бутир лактона при отмене этанола хзключает снижение высвобождения до амина, однако Не исчерпывается угнетающим действием на дофам

новую систему. Вероятно, этот .препарат вызывает также активаи

о

*

гипоталамус стриатум

Q отмена этанола. щ} Зтаноламин, 100 мг/кг

ГТ> ГБЛ, 250 мг/кг m вальпроат натрия, 400 ыг/кг

Рис.3. Злияние этаноламина (100 ыг/кг), ГБЛ (250 мг/кг) и валь-проата натрия (400 мг/кг) на уровни нейроактивных аминокислот, биогенных аминов, их предпествекников и метаболитов в отделах мозга крыс при отмене этанола (S к отмене этанола; * - р<0,05 по отношению к отмене этанола).

серотониноаой системы путем усилена синтеза медиатора;

Вальпроат натрия вызывал абсолютно достоверное снижение уровня Asp (по отношению как к контролю, так И к отмене этанола; р<0,0001), а такие повьпзеиие уроанэй предшественников биогенных аминов - Туг и Тгр - ао всех исследованных отделах мозга. Повышение уровня GABA, ожидаемое для этого соединения, исходя из постулируемого для него механизма действия (J.VÍ.Van der Laan at al., 1Э7Э ] зарегистрировано только в гипоталамусе. Кроме этого, в гипоталамусе вальпроат натрия вызывал повыпение уровней 5-НТ и 5-Н1АА, т.е. имела место активация серотонииовой системы (рис.3). Снижение уровня Азр в стриатуме сопровождалось появлением отрицательной корреляции меасду его уровнем и уровнями DA, 5-НТ и их метаболитов.

По данным дискриминантного анализа, после введения этанол-амина отмечалась высокая информативность уровней: этаноламина в стволе мозга и гипоталамусе, фосфоэтаноламина - в гипоталамусе (что совпадало с достоверным ростом значений этих показателей

по отношению к группе отмены этанола); DA и DOPAC - в стриату-ме, что подтверждает преимущественно дофаминергическую направленность эффектов этаноламина в описываемой ситуации. При введении фосфоэтаноламина в стволе мозга и гипоталамусе отмечалась высокая информативность (F>10) уровня этаноламина.

После введения ГБЛ наиболее значимыми показателями, кроме уже упоминавшегося уровня DA, были уровни ГАМК и Gin в стриату-ме, а также NE в стриатуме и гипоталамусе, 5-НТ - в гипоталамусе . Это косвенно подтверждает наличие в механизме действия ГБЛ ряда не-ГАМК-ергических звеньев [Н.В.Шевченко, 1988].

Наиболее информативным показателем после введения вальпро-ата натрия во всех исследованных отделах мозга был уровень Asp, а также: в стволе мозга - уровни ГАМК и аланина, в гипоталамусе - аспарагина, серина и глутамина; в стриатуме - тирозина, триптофана и 5-ШАА.

Во всех исследованных отделах мозга после введения перечисленных * препаратов линейио-дискримкпантный анализ показал

полностью корректную классификацию реализаций; наибольпие зна-р

чения D Махаланобиса отмечались в гипоталамусе после введения этаноламина, фосфоэтаноламина и вальпроата натрия, и в стриату-¿50 - после введения ГБЛ, что указывает на возможную "точку приложения" действия этих соединений.

Повышенно уровней предшественников4' биогенных аминов в отделах мозга после введения вальпроата не сопровождалось аналогичными изменениями уровней этих соединений в плазме крови, где было отмечено снижение концентрации Тгр, достоверное по отношению к контролю и отмене отанола. Это позволяет предположить , что механизм повышения уровня Тгр в мозге под действием вальпроата связан с влиянием препарата на системы транспорта аминокислот в мозг.

К концу трехмесячной алкоголизации наблюдалась тенденция к увеличению массы надпочечников, а также снижение содержания в плазме крови кортикостерона по отношению к контролю, а после отмены йтанола содержание кортикостерона снижалось и в ткани надпочечников, что может свидетельствовать о наличии к концу эксперимента стрессорной реакции в фазе истощения. Введение этаноламина и ГБЛ привело к повышению содержания кортикостерона

в плазме и надпочечниках, а введение фосфоэтаноламина - только

и

в плазме; содержание гидрокортизона в плазме после введения этаноламина было достоверно выше контрольных цифр. Это позволяет говорить об адаптогеннои действии этаноламина при синдроме отмены этанола.

Таким образом, вальпроат натрия при отмене этанола вызывает повышение в мозге уровней Тгр, 5-НТ и 5-HIAA, а также выраженное снижение уровня Азр - основного возбуждающего медиатора, т.е. действие вальпроата не исчерпывается его влиянием ни на ферменты обмена биогенных альдегидов, ни на ферменты деградации ГАМК. Обнаруженные эффекты вальпроата позволяют считать, что в механизме его действия при синдроме отмены этанола существенную роль играют не-ГАМК-ергические механизмы.

Поскольку при синдроме отмены этанола был продемонстрирован противосудорожный эффект вальпроата натрия [M.Hillbom et al., 1Э8Э ]; в наших предварительных экспериментах установлена также высокая эффективность этаноламина в аналогичных условиях, и, как установлено в настоящем исследовании, в основе действия этих соединений лежат различные механизмы, следует считать рациональным совместное применение этаноламина и вальпроата натрия для коррекции нарушений в функционировании нейротранс-миттерных систем при синдроме отмены этанола.

ВЫВОДЫ

1. Острая алкогольная интоксикация сопровождается повыае-нием уровня гомованилиновой кислоты во всех исследованных отделах мозга (стриатум, гипоталамус, ствол) и 5-оксииндолуксусной кислоты - в стволе мозга при неизменных уровнях дофамина и серотонина, а также снижением уровней аспартата и глутамата в гипоталамусе.

2. Хроническая алкогольная интоксикация характеризуется сдвигами в уровнях аспартата и глутамата в гипоталамусе", противоположными наблюдавшшея при острой алкогольной интоксикации, а также повьгиением содержания триптофана, серотонина и 5-вкси-индолуксусноЯ кислоты в гипоталамусе.

3. Этаноламин повыпает уровни "тормозных" (глицин, таурин и ГАМК) аминокислот и снижает интенсивность синэптического выброса дофамина, определяемую по уровню 3-метокситирамина, в стриатуме при острой алкогольной интоксикации.

4. Действие атенолашша на исследуемые неЯротрансмиттерные системы кок при острой алкогольной интоксикации, так и при отмене этанола, но реализуется чароз его фосфорилиропание и дальнейшие метаболические про-арацения.

5. Действие нельпроата натрия при стыс-не этанола включает в себя не-ГАМК-оргические механизмы: снижение уровня аспараги-нопой ' кислоты во веек исследованных отделах мозга, а также активирующее влияние на показателя серотониновой системы (повышение уровней соротонина и 5-оксииндолуксусной кислоты в гипоталамусе), опосредованное повышением содержания предшестоенни-кос (тирозина и триптофана).

Cffiicon рабоч', в коуораз спубяйкошшы оежовше результаты, вкдв-чекнае в досоортзцжо.

1. F.Poidrugo, Y.Doroshenko, S.Ostrovsky and A.Pacenko. The effect of the administration of S-Adcnosylmethionine and ethano«a.;nirse on rat brain neurotransmitters during the alcohol riithdrawa! зупйго«». 4 th Keotlng of the Italian Society of thei Kourocclence. Palermo, Italy, 4-7 December 1SS0 // Neuro3ciensa letters.- 1S90.- Suppi. 39. - P. 5173.

2. y.lioroshenko, A.More, i'.Foldrugo and S.Ostrovsky. Comparative effects of ethanolamina (БА) and S-Adanosyimatliionine (SAMe) in supressing ethane! (S) г.withdrawal seizures in rats // World Federation of Societies of Biological Psychiatry.- 1991.- V.2S, N.IIS.- P.4935, abatr. Ко! p-il-U.

3. E.M. Дорошенко. Оптимизированный метоД определения катехол-амиков в плазме крови с помощью ВЭКХ // Четвертый научный съезд специалистов по клтшчоскоЯ диагностике Республики Беларусь: Гродно, 17-18 сентября 13Э2 г. Тез. докл.- С. 141— 143.

4. Yo.M.Doroshenko. Soma correlations between neurotransmitter levels in brain of rata with genetically different tolerance to ethanol // ISBRA 1992. Satellite Symposium. Genetics and alcohol-related diseases: Abstracts.- Bordeaux - June 18-19, 1992.- P.53.

5. Н.П.Канунн1кава, Г.Г.ВМцк&я, Я.М.Дарашэнка, А.Г.Шалав1на. Уплы? этанолу i б!кукул1ну на колькасць свабодных

. ам!нак1слот i акты?насць ГАМК-метабал1эуючых фермента? у

структурах мозгу пзцукор // Весц1 АН Беларус!. Серыя б1ялаг1чньпг назук.- 1993 - J51.- С,90-95.

5. S.M.Zirnatldn, H.P.Kanunnikova, 7e.M.Doro3henko and A.G.Vinitskaya. Remoto disturbances in metabolism of brain neurotransmitters following alcohol 'withdrawal in rats. 4th Congress of the European Society for Biomedical Research on Alcoholism. Genova, 2-5 June 1333 // Alcohol and Alcoholism.- 1393.- 7.28, H.2.- P.229, abgtr. c2.2S,

7. K.P.Kanunnikova, A.G.Vinitskaya and Y.M.Doroshenko. Influence of Gamma-Butyrolactone and Sodium Valproate on GA3A metabolism in rat brain during alcohol withdrawal. Meeting on How trends in tlia Treatment of alcoholism. Trieste, May 31 - June 1.1S93 // Alcoholism: Journal on Alcoholism and relatc-d addictions.- 1393.- V.23, suppl.l.- P.33.

S. А.Г.Виницкая, H.П.Канунникова, E .M.Дорошенко, С.М.Злматкин. Метаболизм и содержание Г АМН и епредшественников в ба-зальных ганглиях и мозжечке крыс б разные сроки после отмены этанола // Деп. з ВИНИТИ. 23.07.1933, .,'"2120-893.

Э. Ye.H.Doroshsnko, H.P.Kanunnikova, G.M.ZImitfcin. Brain biogenic amines and transmitter amino acids following chronic ethanol consumption and various duration of withdrawal // International Association of Rprsnsic ' Sciences, 13th International Meeting. - Dusseldcrf, 1993,- AST.

10. E.М.Доропенко. Влияние этаноламина и фосфоэтанолэмина на формирование пула биогенных аминов и нейроактивиьга аминокислот при острой алкогольно;! интоксикации // Материалы международной научной конференции ГГМИ.- Гродно, 1393.-ч.И.- С.315.

11. В.М.Дорошенко. Действие некоторых биологически активных соединений на формирование пула биогенных а.чннов и нейроак-тнвных аминокислот з мозге крыс при синдроме отмены этанола. Там же, стр. 316.

12. Ye.M.Doroshenko, A.G.Vinitskaya, H.P.Kanunnikova. Effect of ethanolamine, phosphoethanolamine and ¿xlutamine on GASA and amino acids in rats undergoing alcohol withdrawal. VI Congress of the European College of> Neuropsychophacnacology. Budapest. 10-14 Oct. 19ЭЗ // European Meuropsychopharmaco-Iogy.- 1993.- V.3, H.3.- P.423, abstr. p-4-22.

РЕЗЮМЕ

Б.Ы.Дороаенко. ©армирование фонда биогенных аминов в найрог тлшшх ааинокисдот в головной ыозге крыс при алкогольной шпч сикации и отмене этанола.

Исследовали влияние острой (ОАИ) и хронической (ХАИ) алг гольной интоксикации и отмены этанола (ОЭ) на формирова! фонда нейроактивных аминокислот и биогенных аминов, а та! возможные механизмы действия в этих ситуациях этаноламина (Э, Г-бутиролактона (РБЛ) к вальпроата натрия. Установлено, что ОАИ (3,5 г/кг, 30 мин), так и ХАИ (3 месяца, 10-20% этано, качестве единственного источника жидкости) приводят к дисбал су в фонде указанных соединений в стриатуме, гипоталамус! стволе мозга крыс: ОАИ сопровождалась ростом синаптичесх выброса, и, в больвей степени, деградации дофамина в стриату а также снижением уровней аспартата и глутамата в гипоталам» при ХАИ наблюдалось повышение уровней возбуждающих ашшокис.1 а также триптофана, серотонинЗ и 5-оксииндолуксусноЙ кислот гипоталамусе. Введение ЗА (100 иг/кг, в/ßp) на фоне ОАИ npi дило к снижению интенсивности сииаптического выброса дофамш стриатуме, оцениваемой по уровню З-метокситиратша и повыш< уровней глицина, таурина и ГАМК, а при ОЭ - к замедлению м болизма ГАМК (по коэффициентам корреляции мехеду уровнями П глутамата и глутамина). Введение фосфозтаноламина (230 мг в/ßp) не воспроизводило основных эффектов ЭА в обеих указа ситуациях. После введения ГБЛ (£50 ыг/кг) на фоне ОЭ отмеча снижение синоптического выброса и распада дофамина, а т усиление синтеза серотовина. Вальпроат натрия (400 иг/т этой же ситуации вызывал активацию серотониновой системы, с редованную повышением уровней предшественников, а такие в женное снижение уровня аспартата, причем оба эффекта кappej вали между собой. Таким образом, в основе ранее продемонст! ванного противосудорожного действия ЭА, ГБЛ и вальпроата ш при синдроме отмены этанола лежат различные механизмы, в числе (для вальпроата и ГБЛ) - не связанные с их Г ергическим действием.

Р Э 3 Ю M Э

Я.М.Дарапэнка. Фарн1рававне фонду б1ягенпах auiim? 1 нейраак-•mfwx аи1нак1слот у гало^ша ипзгу пацуко? при алкагольнаЗ 1итакс1гсацы1 i л1язкп1 этанолу.

Вывучал! уплыу вострай (BAI) 1 хран!чнай (XAI) алкагольной ¡нтакс!кацьп 1 лшэння этанолу (ЛЭ) на фарм!раванне фонду нэй-раактыуных амжак1С.ют î б1ягенньгх ам!наУ, а таксама магчымыя мехашзмы дзеяння у гэтых с!туацыях этаноламшу (ЭА), Г-бутыралактону (ГБЛ) i вальпраату натрыя. УстаноУлена, ито як BAI (3,5 г/кг, 30 мш), так i XAI (3 месяцы, 10-20S этанол у якасц! адзшай крыжцы вадкасц! ) вядуць да дисбалансу у фондзе даследаваных зяучэння? у стрыатуме, Нпаталямусе 1 ствале мозгу пацуко?: BAI суправажджалася ростам Ынаптычнага выбрасу, i, у большая ступень дэградацьп дофамшу у стрыатуме, а таксама зшжэннем узроуняу аспа^тату i глутамату У г1паталямусе ; пры XAI наз!ралася павьплэнне узроуняу узбужджальньга амшак!слот, а таксама трьттафану, сератаншу i 5-пдроксНндолвоцатяай кшлаты у ппаталямусе. Увядзенне ЭА (100 мг/кг, унутрыбрушын-на ). на фоне 0А1 прыводз1ла да зн1кзння ¡нтэнс!унасц1 Ынаптычнагэ выбрасу дофамшу у стрыатуме, якая вызначалася па УзроУню 3-метокЫтырам1на, i павыиэнню узроуняу гл!цыну, тауры-ну i ГАМК, а пры ЛЭ - да замядлення метабал'зыу Г ДНК (па каэф!цыентах карэляцьи' памик узроуням! ГАМК, глутамату i глут-aMiny). Увядзенне фосфаэтанолам!ну (230 мг/кг, у/бр) не выкл1кала асноуных зфектаУ ЭА У абедзьвюх указаных ситуациях. Пасля увядзення ГБЛ (250 мг/кг) на фонз ЛЭ каз!ралася зн|жзнне сшаптычнага выбрасу i распаду дофам!ну, а таксама Узмацненне сштэзу сераташну. Зальпраат катрьм (400 мг/кг) у гэтай с!туацьи выкл!кзу актызацьпо сератаншавай Ыстэмы, апасрэдава-ную павыаэннем узроуняу папярэдшкаУ, а таксама 'выразнае зшжзнне узроуня аспартату. Абодва апоан'я зфекты карэл!равал1' naMÎK сабою. ТакЫ чынам, у аснове рзкей прадэманстраванага антыканвульЫунага дзеяння ЭА, ГБЛ i вэльпраата натрыя пры сшдроме л!шэння этанолу ляжаць розныя механ!эмы, у тым л!ку (для вальпраату i ГБЛ) - не ЗЕяэаныя з ix ГАМК-эрпчиьш дзеян-нем.

SUMMARY

Ye.M.DoroBhenko. Formation of biogenic amines and neuroactivi amino acifiB pool In rat brain during alcohol intoxication cjic withdrawal.

The influence of acute (AAI), chronic (ChAI) alcohol intoxication and ethanol withdrawal (AW) on tha formation oi neuroactive amino acids and biogenic monoamines pool as well a: possible mechanisms of action of ethanolamine (EA), r-butyroiactone (GBL) and sodium valproate (V) in above situations have been studied. It was shown that both AAI (3,5 g/kg, 30 rain) and ChAI (3 months, 10-205 ethanol as the single sourcc of drinking) led to an imbalance in the pool of the above compounds in rat striatum, hypothalamus and brain stem. AAI v;a: characterized with a rise of dopamine synaptic release and, ir more extent, its degradation in the striatum as well as decrease of aspartate and glutarnate levels in the hypothalamus. Ir turn, the increased levels of ©excitatory amino acids, tryptophan , serotonin and 5~hydroxyindoleacetic acid were observed ir the hypothalamus during ChAI. EA administration (100 mg/kg, i.p.) during AAI led to depression of the dopamine release ir the striatum as evaluated from 3-methofrytyramine level and tc increase of glycine, taurine and GABA l&vels; in AW EA slowe down the GABA metabolism (as concluded from the correlation, between the concentrations of GABA, glutamine and glutarnate), The administration of phosphoethanolamine did not reproduce th above EA effects in both the situations studied. After GB1 injection (250 rag/Kg) during AY/ the decrease of dopamine reiea sc and degradation as well as the increase of serotonin synthe sis wars observed. V (400 mg/kg) in AV/ produced an activatioi of the serotoninargic system which was mediated through the increase of precursors levels and also decreased the aspartate level. The last two effoctc we re in a positive correlation Thus, the anti-convulsant affects of EA, GBL and V which wer demonstrated earlier, seemed to .be based on the different me chanisms, including (especially for V and GBL) a number o non-GABA-ergic ones.

o