Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фолдинг, сборка и стабильность фибритина бактериофага Т4

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лондер, Юрий Яковлевич, Москва

и/ | ч/ / ^ ' ' • /

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ИМ. А Н. БАХА

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. М М. ШЕМЯКИНА

ИЮ.А. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

ЛОНДЕР Юрий Яковлевич

ФОЛДИНГ, СБОРКА И СТАБИЛЬНОСТЬ ФИБРИТИНА БАКТЕРИОФАГА Т4

03.00.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор В.В. Месянжинов

Москва 1999

СОДЕРЖАНИЕ

Благодарности.........................................................................................................................5

Список сокращений................................................................................................................6

I. Введение................................................................................................................................7

Актуальность проблемы............ ....................................................................................... 7

Цели и задачи работы....................................................................................................... 9

Научная новизна и практическая ценность работы...................................................10

II. Литературный обзор. Суперспиральные coiled coil белки: структура,

фолдинг и функции.............................................................................................................. 11

II. 1. Структурные особенности coiled coil....................................................................11

II. 1.1. Основные принципы структуры coiled coil..................................................11

II. 1.2. Олигомерность coiled coil ..............................................................................14

II. 1.3. Ориентация цепей в coiled coil......................................................................18

II. 1.4. Роль заряженных остатков..............................................................................19

II.1.5. Пентамерный coiled coil...................................................................................20

II. 1.6. Нарушения периодичности............................................................................21

II. 1.7. Правая суперспираль...................................................................................... 23

11.2. Предсказание структуры coiled coil.......................................................................24

11.3. Функции coiled coil.................................................................................................. 25

11.3.1. Структурные белки........................................................................................26

11.3.2. Ферменты и факторы транскрипции.............................................................28

11.3.3. Вирусные адгезины..........................................................................................32

11.3.4. Другие функции................................................................................................34

11.4. Механизмы фолдинга и олигомеризации coiled coil...........................................35

11.5. Фибритин бактериофага Т4....................................................................................39

11.6. Заключение................................................................................................................45

III. Материалы и методы.....................................................................................................46

III. 1 Бактериальные штаммы..........................................................................................46

111.2. Среды для выращивания бактерий.....................................................................46

111.3. Плазмиды..................................................................................................................46

111.4. Конструирование рекомбинантных плазмид....................................................47

111.5. Полимеразная цепная реакция............................................................................ 47

111.6. Приготовление компетентных клеток Е. coli и трансформация плазмидной ДНК....................................................................................................................49

111.7. Экспрессия белков и анализ на растворимость..................................____........ ..49

111.8. Анализ периплазматической фракции.................................................................50

111.9. Электрофорез белков..............................................................................................51

III. 10. Выделение и очистка белков..............................................................................51

III. 11. Определение концентрации белка.....................................................................52

III. 12. Ограниченный протеолиз....................................................................................52

III. 13. Спектроскопия кругового дихроизма................................................................52

III. 14. Изучение устойчивости фибритинов к нагреванию........................................52

III. 15. Изучение криорефолдинга..................................................................................53

III. 16. Дифференциальная сканирующая калориметрия.__......... ..............................53

III. 17. Гибридизация фибритинов in vitro.....................................................................53

IV. Результаты исследований..............................................................................................54

IV. 1. Исследование устойчивости фибритина к додецилсульфату натрия.____________54

IV. 1.1. Устойчивость делеционных мутантов фибритина к ДСН__.._........____......54

IV. 1.2 Криорефолдинг фибритинов в присутствии ДСН......................................56

IV. 1.3. Подтверждение роли С-концевого домена для устойчивости к ДСН... 57

IV.2. Изучение устойчивости фибритинов к нагреванию..........................................59

IV.3. Изучение роли петель в структуре фибритина..................................................65

IV.3.1. Дизайн фибритина S1.....................................................................................67

IV.3.2. Экспрессия и свойства фибритина S1.........................................................67

IV.3.3.Очистка фибритина S1...................................................................................70

IV.4. Получение новых мутантов для рентгеноструктурного анализа....................70

IV. 5. Доказательство существования мономерного интермедиата

путем создания секретируемых фибритинов..................... ..........................................74

IV.6. Инженерия пермутантного фибритина с фолдоном HaN-коице____________________75

IV.6.1. Дизайн фибритина Р.......................................................................................76

IV.6.2. Экспрессия и очистка фибритина Р............................................................78

IV.6.3. Спектроскопия кругового дихроизма.........................................................80

IV.6.4. Ограниченный протеолиз..............................................................................80

IV.6.5. Электрофоретические свойства фибритина Р............................................80

IV.6.6. Дифференциальная сканирующая калориметрия. .._________________________________85

IV.7. Гибридизация фибритинов in vitro......................................................................86

IV.7.1. Совместная ренатурация фибритинов В и Р...................... ......_____..........86

IV.7.2. Совместная ренатурация фибритинов В иМ$1_...___________________________________88

V. Обсуждение результатов.................................................................................................91

V.I. Устойчивость фибритина к додецилсульфату натрия......____................___.......___.91

V.l.l. Криорефолдинг фибритинов .,......................___.........___.......____.......___.............91

V.I.2. Роль С-концевого домена в обеспечении устойчивости к ДСН.____........ 92

V.I.3. Доменная организация фибритина.......................................____......____..........93

V.2. Роль петель в структуре фибритина......................................................................96

V.3. Получение новых мутантов для рентгеноструктурного анализа.....................99

V.4. Доказательство существования мономерного интермедиата

путем создания секретируемых фибритинов....................................................____.........100

V.5. Роль С-концевого домена в фолдинге и сборке фибритина

бактериофага Т4.......___......................................_.................................................................101

V.5.I. Белки с полностью делегированным С-концевым доменом

неспособны к правильной сборке.................................................................................... 101

V.5.2. Инженерия пермутантного фибритина с фолдоном на N-конце _____.....101

V.5.3. Гибридизация фибритинов in vitro.................................................____........ 105

VI. Выводы..........................................................................................................................107

VII. Литература...................................................................................................................109

БЛАГОДАРНОСТИ

Я выражаю глубокую признательность моему научному руководителю В.В. Месян-жинову за постоянное внимание и руководство данной работой. Я также выражаю благодарность A.B. Летарову, который причастен ко многим описанным здесь экспериментам.

Я благодарю И.А. Куделину за получение и расчет КД-спектров и В.Н. Орлова за проведение калориметрических измерений и обсуждение полученных данных.

Я благодарю С.П. Будько, В.А. Костюченко и М.А. Пронину за помощь при постановке экспериментов, а также Л.П. Курочкину, H.H. Сыкилинду, К.А. Мирошникова, C.B. Стрелкова, Б.Н. Соболева, М.М. Шнейдера, также как и всех ранее перечисленных, за участие в обсуждении моих данных и критическое прочтение этого ученого труда.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АТФ - аденозинтрифосфат

ГАП - гидроксиапатит

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДСН - додецилсульфат натрия

ДЭ АЭ-целлюлоза - диэтиламиноэтилцеллюлоза

ИПТГ - изопропилтио-Р-О-галактозид

КД - круговой дихроизм

кДа - килодальтон

ПААГ - полиакриламидный гель

пг - продукт гена

п. н. - пара нуклеотидов

ПЦР- полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

УФ - ультрафиолет(овый)

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия

I. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Проблема фолдинга белка - процесса укладки вновь синтезированной полипептидной цепи в ее функционально активную пространственную структуру - является одним из ключевых вопросов современной физико-химической биологии [31, 74]. Фолдинг белка протекает главным образом за счет формирования нековалентных взаимодействий между аминокислотными остатками и, как правило, проходит через ряд промежуточных состояний (интермедиатов). До сих пор неясно, каким образом осуществляется выбор единственно правильной стабильной конформации белка среди громадного числа стерически возможных состояний [2, 31, 74].

Проблема фолдинга белка была впервые поставлена Мирским и Полингом в начале сороковых годов XX в. Около 30 лет назад был сформулирован так называемый парадокс Левинталя: каким образом полипептидная цепь, несмотря на громадное количество возможных конформационных состояний, способна быстро сворачиваться в клетке в натив-ную трехмерную структуру? [2]. В последнее десятилетие усилиями ряда лабораторий удалось прояснить многие детали этого процесса. Первоначально предполагалось, что для правильного фолдинга белковой молекулы достаточно информации, которая содержится в ее аминокислотной последовательности. Однако, по мере накопления экспериментальных данных, и особенно с открытием молекулярных шаперонов, стало ясно, что фолдинг белка в клетке - это сложный процесс, который контролируется на уровнях трансляции и посттрансляционной модификации и часто протекает при участии вспомогательных белков -шаперонов [2, 3, 16]. Однако проблему фолдинга белка, называемую часто "второй половиной генетического кода" [88], до сих пор нельзя назвать окончательно решенной, и механизмы, обеспечивающие формирование пространственной структуры белка, остаются во многом неясными. Выяснение возможного стереохимического кода фолдинга является одной из принципиально важных задач молекулярной биологии.

Знание механизмов фолдинга особенно важно для биотехнологии и развития белковой инженерии при конструировании de novo молекул с заданными свойствами. Попытки экспрессии в гетерологичных системах ряда генов часто приводят к неправильному сворачиванию в клетке вновь синтезированных полипептидов и образованию массивных агрегатов, называемых "телами включения" (inclusion body), что связано с нарушением фолдинга [119, 148]. Поэтому в настоящее время успешный дизайн белков de novo ограничен недостатком знаний о механизмах фолдинга.

Понимание закономерностей фолдинга имеет также большое значение для медицины. Нарушение фолдинга белка в клетке вследствие мутаций является причиной многих наследственных болезней человека. Среди них, например, серповидноклеточная анемия, расстройства зрения при мутациях в родопсине - ретинитный пигментоз и куриная слепота, синдром Ларона при мутациях в рецепторе гормона роста, и даже, по-видимому, болезнь Альцгеймера [2].

Для изучения закономерностей фолдинга особый интерес представляют фибриллярные белки. Фолдинг этих относительно простых и содержащих повторяющиеся структурные мотивы белков может служить моделью для изучения более сложного фолдинга глобулярных белков [4, 14, 27, 154]. Структурный мотив coiled coil - суперспирали из нескольких а-спиралей - является первым примером так называемого стереохимического кода фолдинга - набора правил, позволяющих предсказывать пространственную организацию белка по его первичной структуре [74]. Формирование структуры coiled coil детерминируется гептадной периодичностью аминокислотных остатков в первичной структуре белка. Более или менее протяженные фрагменты coiled coil найдены во многих белках, выполняющих самые разнообразные функции. Мотив coiled coil находит все более широкое применение в белковой инженерии (см. Литературный обзор).

Наша лаборатория на протяжении долгого времени занимается изучением фибритина бактериофага Т4. Фибритин - один из структурных белков, входящих в состав частицы

фага - представляет собой фибриллярный белок с большим содержанием a-спиралей. Так как Escherichia coli является естественным хозяином для бактериофага Т4, то фибритин и его мутантные производные легко получить в виде рекомбинантных белков. Ген фибри-тина был впервые секвенирован в нашей лаборатории. На основе анализа аминокислотной последовательности фибритину была предсказана структура тримерного coiled coil. Это предсказание подтвердилось, когда в лаборатории М. Россмана (Purdue University, США) при участии наших сотрудников были решены с высоким разрешением рентгеновские структуры двух делеционных мутантов фибритина.

Наша лаборатория давно использует фибритин в качестве модели для изучения процессов фолдинга и олигомеризации. Ряд важных результатов по фолдингу и олигомериза-ции фибритина был ранее получен В.В. Месянжиновым, В.П. Ефимовым, М.М Шнейде-ром, а также C.B. Стрелковым (решение структуры). Настоящая работа является продолжением этих исследований.

Цели и задачи работы

Целью настоящей работы являлось подробное изучение фолдинга и олигомеризации фибритина in vivo и in vitro, а также уточнение структурных особенностей молекулы фибритина. Были сформулированы следующие задачи:

1. Изучение феномена устойчивости фибритина к денатурации детергентом додецил-сульфатом натрия

2. Создание новых мутантов фибритина, для которых можно было бы получить кристаллы и определить пространственную структуру.

3. Поиск участков, важных для правильных фолдинга и олигомеризации фибритина.

Научная новизна и практическая ценность работы

В работе получены новые данные о фолдинге и олигомеризации фибритина in vivo и in vitro. Уточнена роль С-концевого домена в процессе фолдинга и олигомеризации фибритина. Впервые описан феномен тримеризации белка в присутствии детергента додецил-сульфата натрия на холоду, а также локализованы области в молекуле фибритина, обеспечивающие устойчивость к этому детергенту. Впервые на основе фибриллярного белка получен пер мутант, т.е. мутант, в котором два фрагмента природной аминокислотной последовательности, соответствующих двум различным доменам, расположены в обратном порядке. Получен мутант фибритин В1, состоящий из 281 аминокислотного остатка, для которого в настоящее время завершается определение структуры. Результаты работы могут служить основой для дальнейшего исследования и понимания процессов фолдинга фибриллярных белков.

II. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

СУПЕРСПИРАЛЬНЫЕ COILED COIL БЕЖИ: СТРУКТУРА, ФОЛДИНГ

И ФУНКЦИИ

Существование суперспиральных coiled coil белков было впервые постулировано в 1953 году Полингом и Кори [136] и независимо от них Криком [32] как главный структурный элемент большого класса фибриллярных белков, таких как кератин, миозин и фибриноген. Однако подробное исследование структурного мотива coiled coil началось после 1988 года, когда были охарактеризованы белки, относящиеся к классу транскрипционных факторов и содержащие так называемый лейциновый зиппер.

ПЛ. Структурные особенности coiled coil

II. 1.1. Основные принципы структуры coiled coil В структурном плане coiled coil представляет собой суперспираль, образованную двумя, тремя или четырьмя спиралями. Известны даже белки coiled coil, содержащие пять спиралей [40]. Спирали могут быть упакованы в одном (параллельный coiled coil) или в противоположных направлениях (антипараллельный coiled coil). Регулярное строение coiled coil требует периодичности в упаковке боковых цепей остатков аминокислот в ядре протяженной структуры. Однако такая регулярность невозможна без искажений канонической а-спирали, где на один оборот приходится 3,6 аминокислотных остатка. В структуре coiled coil а-спираль деформируется таким образом, что число остатков на виток уменьшается до 3,5 и положения боковых цепей повторяются через два оборота. Обычно последовательность аминокислот суперспиральных белков имеет гептадную периодичность. В каждой гептаде в первой и четвертой позициях находятся гидрофобные остатки, боковые группы которых обеспечивают межспиральные взаимодействия и формируют гидрофобное ядро (кор) суперспирали. Если позиции аминокислот в гептаде обозначить

соответственно как (abcdefg)n, то гидрофобные остатки занимают положения а и d, а в положениях Ь, с, е, f, g обычно находятся гидрофильные остатки, образующие экспонированную в растворитель внешнюю поверхность coiled coil (рис. 1). Расстояние полного оборота суперспирали называется шагом, а угол между а-спиралью и осью coiled coil называется шаговым углом. Значения шага для различных структур coiled coil определяются степенью искажения, необходимого для достижения периодичности в 3,5 остатка и меняются с увеличением числа спиралей: в ди-, три- и тетрамерных вариантах лейцинового зиппера GCN4 значения шага составляют 148 А, 175 А и 205 А, соответственно [64, 108].

В гидрофобном коре coiled coi