Физиолого-биохимические процессы в зерновках ячменя и пшеницы при их хранении, прорастании и переработке

Верхотуров, Василий Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Физиолого-биохимические процессы в зерновках ячменя и пшеницы при их хранении, прорастании и переработке
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Физиолого-биохимические процессы в зерновках ячменя и пшеницы при их хранении, прорастании и переработке"

На правах рукописи

"<Jo<ta4 12S

ВЕРХОТУРОВ Василий Владимирович

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ЗЕРНОВКАХ ЯЧМЕНЯ И ПШЕНИЦЫ ПРИ ИХ ХРАНЕНИИ, ПРОРАСТАНИИ И ПЕРЕРАБОТКЕ

03.00.12 - Физиология и биохимия растений

Автореферат

диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2008 г.

003454129

Работа выполнена в Якутской государственной сельскохозяйственной академии и Иркутском государственном техническом университете

Научный консультант:

доктор биологических наук,

профессор

В. В. Рогожин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор H.H. Новиков

доктор биологических наук, профессор С.Ф. Измайлов

доктор технических наук, профессор Г. П. Карпиленко

Ведущая организация: Институт биохимии н физиологии растений

и микроорганизмов РАН

Защита диссертации состоится getaSUj^ 2008 года в ¡0** часов на заседай

диссертационного совета Д 220.043 .Оапозащите диссертаций на соискание степе доктора биологических наук при ФГОУ ВПО "Российский государственный аграрны университет - МСХА имени К.А. Тимирязева" по адресу: 127550 г. Москва, у Тимирязевская, 49

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО "Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева"

Автореферат разослан " 1 " клл^.и_2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета д.с-х.н., проф.

СЛ. Белоп>хов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Способность семян находиться в состоянии покоя является важным приспособительным механизмом, позволяющим человеку в определенных условиях длительно хранить семена сельскохозяйственных растений (Николаева, 1999). В то же время наличие покоя у семян весьма затрудняет культивирование многих пищевых, кормовых, технических и других полезных растений, а также осложняет работы в ботанических садах по созданию коллекций растений и интродукции перспективных для хозяйства видов и т.д. Изучение механизмов покоя семян привлекло особое внимание в последние десятки лет в связи с необходимостью продления возможности солодоращения в течение года (Ермолаева, 2004). Низкая прорастаемость семян ведет к большим производственным потерям при хранении и переработке зерновых культур (Тихонов, 2006).

Свежеубранные зерновые культуры почти всегда прорастают плохо, поскольку в них велик процент зародышей, неспособных к прорастанию. Наибольшую энергию прорастания зерновки получают в процессе дозревания, которое в зависимости от свойств сорта, условий роста и хранения может длиться многие недели (Трисвятский, 1985). Вся цепь процессов, происходящих в семенах при дозревании, прорастании и превращении их в новое растение постоянно находится в поле зрения физиологов растений (Хавкин, 1982; Николаева, 2001).

Прорастание семян сопровождается активацией генома и различных физиолого-биохимических процессов (Заурапов, Лукаткин, 1997; Обручева и др., 1999). Энергетическое жизнеобеспечение клеток зародыша, выходящего из покоя, поддерживается достаточно сложным комплексом митохондриальных окислительно-восстановительных реакций (Робертси, 1982; Обручева, 2001). С повышением метаболических процессов в клетках прорастающих семян наблюдается образование активных форм кислорода, защита от которых осуществляется за счет использования высокоактивной ангиоксидангаой системы в составе низко- и высокомолекулярных соединений (Кения, Лукаш, 1993). К группе низкомолекулярных ангиоксидантов относятся некоторые аминокислоты, аскорбиновая кислота, фенольные соединения, глутатион и др. В комплекс высокомолекулярной системы антиоксицаштюй защиты входят ферменты: каталаза, супероксиддисмутаза, пероксидаза, глутатионредукгаза и др. Действие компонентов системы ангиоксиданшой защиты в основном сводится к подавлению образования свободных радикалов, поддержанию физиологического уровня свободно-радикальных процессов и перекисного окисления липидов в тканях (Мерзляк, 1989; Веселое и др., 1994).

Активные формы кислорода выполняют в клетках важные сигнальные функции не только при стрессе, но и в обычных условиях произрастания растений (Аверьянов, 1999; Тарчевский, 2000). Стрессовые воздействия (низкая температура, ультрафиолет, химические соединения и др.), применяемые для прерывания покоя и повышения всхожести семян, могут быть инициаторами окислительных процессов, таких как перекисное окисление липидов. В тоже время публикации, отражающие роль анти- и прооксидангаого баланса при прорастании семян встречаются крайне редко. Наконец, остается открытым вопрос о взаимной регуляции анти- и прооксидантной системы, а также перспективы использования данного механизма в сельскохозяйственной практике и перерабатывающей промышленности.

В регуляции покоя и индукции прорастания семян важную роль играют негормональные регуляторы роста - фенольные соединения, которые входят в состав /3-ингибиторного комплекса, обладают антиоксидантной активностью и являются

субстратами пероксидазы (Кефели, 1997). Субстратами пероксидазы могут быть фитогормоны, цитохром с, НАДФН, триозы, аскорбат, флавоноиды и др. (Садвакасова, Кунаева, 1987; Рогожин, Верхотуров, 2004). Поскольку активность пероксидазы и метаболизм гормональных и негормональных соединений тесно взаимосвязаны, то повышение активности фермента должно отражаться в изменении метаболизма его субстратов. Динамика роста научной литературы, посвященной активным формам кислорода, антиоксидантной системы, окислительным реакциям и их участием, говорит о стремительно растущем к ним интересе физиологов и биохимиков.

Цель работы состояла в изучении роли анти- и прооксидангной системы при хранении, прорастании и переработке зерновых культур, установлении закономерностей проявления ее активности на действие физических и химических факторов, а также исследовании перспективы применения ангиоксидангов в сельском хозяйстве и солодовенном производстве. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать окислительные процессы и антиоксидантный статус зерновок злаковых культур при различных условиях хранения.

2. Определить активность и каталитические свойства некоторых оксидоредуктаз при хранении и прорастании зерновок пшеницы.

3. Проследить за изменением активности антиоксидантной системы и интенсивности перекисного окисления липидов при набухании и прорастании зерновок.

4. Изучить влияние химических и физических факторов на окислительные процессы и антиоксидантный статус семян и проростков.

5. Предложить механизм окисления низкомолекулярных ангиоксидангов с участием пероксидазы и исследовать влияние регуляторов на каталитические свойства фермента.

6. Исследовать влияние экзогенных анти- и прооксидангов на прорастание и всхожесть зерновок пшеницы.

7. Исследовать влияние технологического режима проращивания ячменя на антиоксидантный статус и качество светлого пивоваренного солода.

8. Определил, содержание низкомолекулярных ангиоксидангов в отходах солодовенного производства и предложить перспективы их использования при солодоращении ячменя.

Защищаемые положения. Длительное хранение семян, а также их хранение при неблагоприятных условиях, способствует накоплению продуктов ПОЛ и снижению активности антиоксидантной системы. Поэтому показатели состояния про- и антиоксидантной системы могут быть использованы как критерий оценки жизнеспособности семян в условиях хранения и переработки. Низкая активность окислительных процессов и высокое содержание низкомолекулярных ангаоксидангов в зерновках является одним из биохимических механизмов, обеспечивающих жизнеспособность семян при длительном хранения. Перекисное окисление липидов является показателем активации кислородных метаболитов, участвует в запуске программы прорастания семян и активации антиоксидантной системы.

Низкомолекулярные антиоксидашы способны регулировать активность пероксидазы растений в условиях in vitro и in vivo. Взаимное влияние низкомолекулярных ангиоксидангов и высокомолекулярного антиоксидантного фермента - пероксидазы является одним из регуляторных механизмов прорастания семян растений. Низкомолекулярные экзогенные анти- и прооксвданты являются эффективными регуляторами прорастания зерновок злаковых культур. Участие низкомолекулярных

антиоксидантов в механизме покоя семян обусловлено ингибированием фермента ангаоксидангной защиты - пероксидазы, что подтверждается в экспериментах in vitro и in vivo. Понижение активности фермента высокими концентрациями антиоксидантов способствует углублению покоя семян, а активация пероксидазы - ускоренному их выходу из состояния гипобиоза и быстрому прорастанию.

Научная новизна. Показано участие компонентов ангаоксидангной системы в регуляции биохимических процессов при хранении и прорастании семян растений. Установлено, что стресс-факторы (температура, ультрафиолет, химические соединения), способствуют стимуляции прорастания семян, через активацию перекисного окисления липвдов и ангиоксвданпюй системы. Результаты проведенных исследований дают возможность рассматривать ПОЛ как один из пусковых механизмов активации программы прорастания семян. Знания механизмов активации биохимических процессов прорастания семян позволяют разработать новые методы, повышающие всхожесть семян и устойчивость растений к действию неблагоприятных факторов окружающей среды.

Впервые изучены механизмы индивидуального и совместного пероксидазного окисления ншкомолекулярных анпюкеиданшв. Определены каталитические консташы реакций и предложены механизмы взаимной регуляции пероксидазы и ншкомолекулярных ангаокеидангов, реализуемые в биологической системе. Установлено, что в реакциях индивидуального и совместного окисления в действии пероксидазы проявляются сложные регуляторные механизмы, обеспечивающие протекание каталитического процесса Фермент, не проявляющий избирательность по отношению к природе окисляемого субстрата в реакциях индивидуального окисления, приобретает избирательность в реакциях совместного окисления.

Впервые в производственных условиях исследована активность ангаоксидангной системы и интенсивность перекисного окисления липидов в зерновках ячменя при производстве светлого пивоваренного солода Предложено использовать показатели активности ангаоксидангной системы для оценки протекания окислительных процессов при производстве пивоваренного солода

Практическая значимость работы. Диссертационная работа выполнена в рамках тематики НИР кафедры пищевой технологии ИрГТУ 'Техническая биохимия, биотехнология и химия биологически активных веществ" (госбюджетная тема №378). Исследования были поддержаны грантом Министерства образования и науки РФ "Биохимия процессов, протекающих при хранении и переработке растительного сырья" (код ГРНТИ 62.09.37).

Показатель состояния анти- и прооксидантной системы может быть использован как дополнительный критерий оценки качества при хранении и солодоращении зернового сырья. Замачивание семян в растворах ншкомолекулярных антиоксидантов, приводит к повышению всхожести и устойчивости проростка к неблагоприятным факторам среды. Полученные данные позволят предложить наиболее оптимальное время замачивания семян в растворах регуляторов, которое по результатам наших исследований приходится на первые четыре часа набухания. Полученные результаты могут быть рекомендованы для практического использования в сельскохозяйственном производстве для увеличения всхожести и сопротивляемости семян к неблагоприятным факторам.

Результаты, посвященные изучению влияния низкомолекулярных ангаокеидангов на солодоращение пивоваренного ячменя, могут быть использованы при разработке технологии применения этих регуляторов в солодовенном производстве. Исследования, посвященные определению содержания низкомолекулярных антиоксидантов в отходах

пивоваренного и солодовенного производства, могут быть полезны для разработки технологии использования отходов в регуляции биотехнологических процессов при солодоращении зернового сырья.

Материалы используются для проведения занятий по курсам "Физиология и биохимия растений", "Биохимия", "Прикладная этимология", и "Биотехнология переработки растительного сырья" для студентов технологического и сельскохозяйственного профиля, обучающихся в ИрГТУ и ЯГСХА.

Апробация работы. Основные положения диссертации обсуждались на тучно-практической конференции "Физиология, биохимия и экология растений" (Якутск, 1997, 1998); на У-ой Международной конференции "Регуляторы роста и развитая растений" (Москва, 1999); на ежегодных семинарах СИФИБР СО РАН (Иркутск, 1999, 2000); на республиканской научно-практической конференции "Научное сопровождение образовательного процесса агровуза" (Якутск, 2001); на научно-практических конференциях "Региональные проблемы сельскохозяйственного производства" (Якутск, 2001), "Проблемные вопросы Восточно-Сибирского региона" (Иркутск, 2001), "Перспективы развития технологии, экологии и автоматизации пищевых производств" (Иркутск, 2004), "Пищевые технологии, качество и безопасность продуктов питания" (Иркутск, 2006, 2007); на Всероссийской научной конференции "Биологически активные добавки и здоровое питание" (Улан-Уда, 2001); на V съезде общества физиологов растений "Физиология растений - основа фитобиотехнологии" (Пенза, 2003 г); на Международной научно-практической конференции "Прогрессивные технологии развития" (Тамбов, 2004); Всероссийской конференции "Пищевые технологии" (Казань, 2004), на VIII Международной экологической конференции «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем» (Белгород, 2004); на Всероссийской научно-технической конференции "Молодые ученые - Сибири" (Улан-Уда, 2003); на 2-й Международной научно-практической конференции "Составляющие научно-технического прогресса" (Тамбов, 2006); на смотре-конкурсе НИР работа на тему ' 'Ресурсосберегающие технологии в производстве пива" удостоена дипломом (Иркутск, 2006); на У-ой Международной научно-практической конференции "Современные тенденции развития АПК в России" (Красноярск, 2007).

Достоверность и обоснованность научных положений и выводов обеспечены проведенным объемом лабораторных исследований; профессионализмом проведения измерений на современном оборудовании; подтверждены сходимостью расчетных и экспериментально полученных результатов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано более 40 печатная работа, в том числе 17 статей в журналах, рекомендованных ВАК для публикации результатов докторских диссертаций, а также 2 монографии (в соавторстве) и 1 учебное пособие.

Объем и структура работы. Диссертационная работа представляет собой рукопись, изложенную на 360 страницах машинописного текста, включает 44 таблиц, 73 рисунков, а также список цитируемой литературы из 452 наименований. Диссертация состоит из введения, десяти глав, заключения, выводов, рекомендаций производству, списка использованной литературы и приложения.

Личное участие автора. Личный вклад соискателя заключается в постановке и проведении экспериментов, в статистической обработке, интерпретации и публикации полученных результатов.

Благодарность. Автор выражает глубокую благодарность научному консультанту проф. ВВ. Рогожину за профессиональное и доброжелательное руководство; с.н.с. Т.Т.

Курилюк, К.6.Н., Т.В. Рогожиной, В.Ю. Гребенщикову, Г.В. Пинипшой, В.К. Франтенко, О.В. Соколовой — за помощь и ценные советы, высказанные в процессе обсуждения диссертационной работы. Автор искренне благодарит сотрудников ОАО "БПК", ЯГСХА, ИрГТУ, ИГСХА и СИФИБР СО РАН за всестороннюю помощь и поддержку, оказанные при подготовке диссертации.

Список используемых сокращений. АДГ - алкогальдегвдрогеиаза; АО - атиокевдашы; АК -аскорбиновая кислота; АФК - акшвные формы кислорода; ОДН - o-дианизцщш; ГХ - гидрохинон; ПО -пероксвдоа; ПФО - палифедапоксидаза; СГ - стероидные гликозвды; Г6ФДГ - 1жжто-6-фосфатдегилрогеназа; ГР - глугатионрецукгаза; ИУК - индолил-3-уксусная кислота; КАТ - каталаза; МДА - малоновый диальдепед ПОЛ - перекисиое окисление липидов; СОД - супероксидщюмутаза; УФ - ультрафиолет, к<а - каталитическая константа; Кщ-консганга Михалиса; Vm-максимальная скорость ферментативной реакции.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили семена пшеницы сорта Омская 12, Скороспелка, Приленская 19, Якутянка 224 (Республика Саха-Якутия), ячмень сорта Гонар (Кировская и Белгородская обл.), Сигнал, Соболек, Кедр (Алтайский край), Ача, Одесский 100, Одесский 115, Неван, Зазерский 85 (Иркутская обл.), Дворан (Тамбовская и Оренбургская обл.), а также семена дикорастущих растений (Республика Саха-Якутия). Технологические свойства ячменя исследовали по общепринятым методикам: отбор проб - ГОСТ 13586.3-83, запах и ирет - ГОСТ 10967-75, влажность - ГОСТ 13586.5-85, примеси и крупность - ГОСТ 13586.2-81, жизнеспособность - ГОСТ 12039-82, способность прорастать- ГОСТ 10968-88, вредители - ГОСТ 13586.4-83, белок - ГОСТ 10846-74, натура - ГОСТ 10840-64, стекловидность - ГОСТ 10987-76, пленчатосгь - ГОСТ 10843-76, масса 1000 зерен - ГОСТ 10842-89, экстрактивностъ - ГОСТ 12136-77 и др. Технологические свойства светлого солода исследовали, используя классические методы по ГОСТ 5060-86 (Мальцев, 1972; Косминский, 2000). Исследования проводили на базе ЯГСХА, ИрГТУ, ИрГСХА и АО "Байкальская пивоваренная компания".

Количество супероксида определяли спектрофотометрически при 480 нм по окислению адреналина в адренохром (Misra, Fridovich, 1972). Содержание малонового диальдегвда исследовали по реакции с тиобарбитуровой кислотой при X = 532 нм (Владимиров, Арчаков, 1972; Рогожин, 1999). Активность глутатионредуктазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы определяли при 340 нм по начальной скорости изменению абсорбции НАДФН (Smith et al., 1989; Рогожин, 1996); алкоголъдегидрогеназы регистрировали по скорости окисления этанола и образования НАДН при Х= 340 нм е = 6,22 mM"W (Рогожин, 1999); полифенолоксидазы проводили по окислению пирокатехина (Ермаков, 1987); пероксидазы по начальной скорости окисления о-дианизидина перекисью водорода при X = 460 нм е = 30 мМ"'см"' (Лебедева и др., 1977); катал азы по уменьшению поглощения X = 240 нм, е = 42,3 М"' см"1 (Цагарели, Пруидзе, 1990); супероксиддисмутазы по ингибированию окисления адреналина супероксид-радикалом при 347 нм (Сирота, 1999).

Определяли активность амилолитических (Плешков, 1976) и протеолигических ферментов (Ермаков, 1987). Содержание ангиоксидантов определяли по реакции с о-фенентролином (Ермаков, 1987; Рогожин, 1996); аскорбиновой кислоты по восстановлению K3[Fe(CN)6] при X = 700 нм (Ермаков, Максимов, 1978); стероидных гликозидов по реакции с пикриловой кислотой (Ермаков, 1987). Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с учетом критериев Стьюдента и Фишера по методике, описанной в руководстве (Лакин, 1990). Разницу считали достоверной при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Антноксидантная система и окислительные процессы при хранении семян

растений

1.1. Влияние влажностно-температурного стресса на перекисное окисление липидов и антиоксидантную систему зерновок ячменя

Самосогревание - порочный процесс повышения температуры зерновой массы, приводящий к утрате семенных, продовольственных, кормовых и технических достоинств зерна (Трисвятский, 1985). Поэтому изучение физиолого-биохимических механизмов и снижение негативного действия самосогревания является актуальной задачей сельского хозяйства и перерабатывающей промышленности.

Проследили за изменениями ангаоксидантной системы и интенсивности перекисного окисления липидов в семенах ячменя, подвергнутых действию повышенных температур и влажности. Отсутствие контакта семян с водой в жидкой фазе компенсируется повышенной влажностью воздуха, что дает возможность семенам набухать и активировать метаболические процессы. Показано, что уже после трех часов экспозиции наблюдалось снижение всхожести (на 5-8%) и повышение концентрации продуктов перекисного окисления липидов (на 18-20%). Липидпый бислой играет существенную роль в поддержании структурной организации, функциональных свойств и текучести мембран, подвижности и специфических функций мембранных белков, регулирует проницаемость мембран для ионов и др. Свободные радикалы, образующиеся в результате стрессового воздействия, способны повреждать фитогормоны, белки, нуклеиновые кислоты и другие соединения (Барабой, 1981; Мерзляк, 1989; Зенков, Меньшикова, 1993), поэтому продолжительное влажностно-температурное воздействие приводит к существенному накоплению продуктов ПОЛ и полной потере всхожести семян.

Компенсаторная активация АО системы проявлялась в своеобразной динамике и зависела от продолжительности воздействия неблагоприятных факторов. В первые 12 ч экспозиции активируются антиоксвдантные ферменты, что указывает на образование АФК в семенах, подвергнутых влажностно-температурному воздействию.

Активность СОД - фермента, катализирующего превращение супероксида в перекись водорода, колебательно повышалась в течение восьми часов набухания с последующим падением. Максимальная активность КАТ — фермента, катализирующего превращение перекиси водорода в воду, наблюдалась после 12 ч набухания семян. Активность пероксидазы - фермента, катализирующего окисление перекисью водорода различных по структуре соединений, максимально возрастала к 12 ч набухания.

Считается, что одной из причин гибели семян в результате неправильного хранения являются необратимые изменения в молекулярной структуре белков, приводящие к их модификации и последующему протеолизу (Тарчевский, 2000). В ходе исследований установлено, что в результате действия сгрессирующих факторов, отмечается снижение активности антиоксидантной системы, коррелирующей с понижением всхожести зерновок. При этом наблюдается увеличение активности кислых и щелочных протеаз у исследуемых сортов на 6,3 % и 4,7 %, соответственно. Повышение активности протеолигаческих ферментов зерна под воздействием стресса может быть следствием нарушения целостности мембран и выхода протеаз в цитоплазму клетки. Поэтому понижение активности АО ферментов объясняется как снижением метаболических процессов, так и инактивацией молекулы в результате действия свободных радикалов. Обращает на себя внимание тот

факт, что содержание низкомолекулярных АО в результате активации гидролитических процессов в семенах несколько возрастало к восьми часам экспозиции.

Таким образом, самосогревание вызывает в клетке усиление свободно-радикальных процессов и смещение равновесия в сторону активации ПОЛ. Активация ПОЛ представляет собой один из первых неспецифических звеньев в общей стресс-реакции организма и может инициировать включение других механизмов защиты. Длительное воздействие стресс-фактора приводит к снижению активности ангиоксидангаой системы и падению всхожести семян на фоне возрастания окислительных процессов. Поэтому состояние антиоксидантно-прооксидангаого равновесия можно рассматривать как показатель жизнеспособности семян и устойчивости их к условиям окружающей среды.

12. Влияние условий хранения на активность антиоксиданпюн системы и физиолого-

биохимические процессы зерна

Для исследования использовали зерновки ячменя с высокими показателями энергии прорастания и всхожести, но с различной влажностью. Показано, что у семян, заложенных на хранение в естественных условиях с низкой влажностью (до 14 %), сохранялись достаточно высокие показатели качества на фоне небольших колебаний значений активности окислительных и антиоксидантных процессов. У зерновок, заложенных на хранение с высокой влажностью (18-20 %) в 1,3-1,8 раза снижаются посевные качества (рис. 1). Повышенная влажность зерновой массы и температурный стресс способствуют активации окислительных процессов, приводящих к накоплению продуктов ПОЛ. Продолжительное хранение приводит к резкому снижению активности супероксиддисмутазы и каталазы, а также повышению концентрации продуктов ПОЛ. Пероксидаза сохраняет свою активность на протяжении всего времени хранения.

20 10

0 -I-1-1-1-1-1-1-1-1 0 -1-1-1-1-1-1-1-1-1

1 10 1 И 112 1 1 1 2 1 3 1.4 1 5 1 10 1 11 1.12 11 12 13 14 15

Сракихранених

Рис. 1. Интенсивность перекисного окисления липидов (а) и содержание низкомолекулярных антиоксидантов (б) при хранении ячменя сорта Ача с влажностью, %: 1 -14; 2 - 18-20; 3 - 24.

Следует отметить, что зерновки с влажностью 24 % почти полностью утратили посевные качества (энергия прорастания - 8%, всхожесть - 12-16 %). Интересно, что повышение активности ангаоксидантной системы и интенсивности ПОЛ коррелировало с повышением всхожести и энергии прорастания семян после д вухмесячного хранения. Резкое

ПОЛ, нМ/г

АО, мг/г

падение всхожести наблюдалось на фоне понижения активности ангиоксвдантной системы и интенсивности перекисного окисления липидов (табл. 1).

Таблица 1 - Изменение активности антиоксидантных ферментов при хранении ячменя сорта Ача в естественных условиях

Дай Влажность зерна при заклад® на хранение, %

14 18 24

сод КАТ ПО ГР СОД КАТ ПО ГР сод КАТ ПО ГР

1.10 2,7 0,51 3,7 031 33 0,72 7Д озз 53 0,71 143 0,41

1.11 1,5 033 23 0,11 4,2 0,55 4,4 0,24 4,7 0,75 8,11 0,15

1.12 п 0,41 1,1 0,14 1,4 034 1Д 0Д2 2Л 0,41 131 0,12

1.01 1,5 0,12 1Д 0,08 0,7 0,14 1,4 0,18 13 0,12 0,22 0,11

1.02 0,8 0,24 0,7 0,05 03 0,15 1,1 0,14 03 0,22 0,15 0,04

1.03 0,5 0,41 0,8 0,08 0,5 0,11 0,7 0,11 0,7 0,13 030 0,01

Ш 0,7 038 1,1 0,11 ОД ОДЗ 0,5 0,14 ОД 0,41 0,14 0

1.05 1,0 1,0 0,8 0,15 03 031 1,1 0,05 0,1 0,24 0,11 0

Примечание: супероксиддисмутаза (СОД), ед.акг; каталаза (КАТ), мМ/мин г; пероксидаза (ПО), мкМ/мин г; глутатионредуктаза (ГР), мкМ/мин г.

На основании полученных данных можно заключить, что одним из физиолого-биохимических механизмов, определяющих жизнеспособность и сохранность зерна, является активность окислительных и антиоксидатных процессов. Высокая температура и повышенная влажность зерна способствуют активации свободно-радикальных процессов и ПОЛ, приводящих к понижению жизнеспособности и качества семян.

В следующей серии экспериментов изучили влияние температурных условий на физиолош-биохимические показатели семян. Зерновки, хранившиеся при 4-5 и 19-22 °С в течение трех лет, успешно прорастали и формировали морфологически нормальные проростки. Концентрация продуктов ПОЛ несколько повышалась в течение шести месяцев низкотемпературного хранения, что указывает на участие окислительных процессов в послеуборочном дозревании семян. Динамика содержания низкомолекулярных ангаоксидангов имела колебательный характер.

Семена, подвергнутые ускоренному старению при 37 °С, формировали меньшее количество сильных проростков, которые были гегерогенны по морфологическим показателям. Посевные качества, содержание продуктов ПОЛ и активность ангиоксвдантной системы ускоренно состарившихся семян определяли с интервалом в две недели в течение шести месяцев. В течение четырех месяцев хранения при 37 °С наблюдается повышение концентрации продуктов ПОЛ. Длительное пребывание в условиях искусственного старения приводит к снижению концентрации МДА и низкомолекулярных ангаоксидангов. Таким образом, под действием температурного стресса в клетках зародыша происходят необратимые физиолого-биохимические изменения, приводящие к нарушению роста и развития проростка.

Одним из биохимических показателей качества пивоваренного ячменя является активность гидролитических ферментов. В течение четырех месяцев ускоренного старения активность протесшитических ферментов колебательно повышалась во всех исследуемых сортах. Причем возрастание активности протеаз коррелировало со снижением содержания белка и всхожести. После шести месяцев хранения снижается активность протеолитических ферментов в сортах Дворан и Гонар. В остальных исследуемых сортах ячменя активность протеаз снижается незначительно.

Причинойэтих изменений могут быть катаболические процессы, протекающие в семенах при старении, в результате чего происходит нарушение гомсостаза клеток и выход протеаз в свободное состояние. Активность амиполитических ферментов при хранении ячменя характеризовалась повышением в период полуторамесячного ускоренного старения. Снижение активности после двух месяцев хранения при повышенной температуре обусловлено инактивацией ферментов в условиях нарастающего стресса и действием протеолитических ферментов. Полученные данные указывают на существенную взаимосвязь между состоянием антиоксидантной системы и жизнеспособностью семян.

О. Изменение антиоксидантного статуса и окислительные процессы при длительном хранении зерна в естественных условиях

Старение организма - сложный физиолого-биохимический процесс. Одним из возможных путей познания механизмов старения семян является детальное изучение их энергетического обмена. Уровень энергетических процессов определенным образом зависит от состояния окислительно-восстановительных ферментов, в первую очередь дегидрогеназ и оксидаз терминального дыхания (Красноок, 1979; Робертси, Смит, 1982).

Динамика акшвносга ключевых ферментов терминального дыхания -алкогальдегвдрогеназы (спиртовое брожение), глюкозо-6-фосфатдегидрогаты (пенгозофосфатный пуп.), перокевдазы и талифенолокевдазы (аэробное окисление) в процессе хранения ячменя в течение 5 лет в естественных условиях представлена в таблице 2.

Таблица 2 - Изменение физиолого-биохимических показателей при хранении ячменя сорта Гонар в естественных условиях

Срок хранения, годы Жизнеспособность, % Всхожесть, % Активность < зерментов

АДГ, мкМ/мин Г.С.В. Г6ФДГ, мкМ/мин Г.С.В. ПО, мкМ/мин Г.С.В. ПФО, ед. /мин Г.С.В.

1 99±1 97±2 4,57±0,3 1,55±0,1 2,05±0,2 0,17±0,02

3 90±2 84±3 2,06±0,2 1,02±0,1 1,74±0,1 0,08*0,003

5 63±4 44±2 1,21±0,1 0,38±0,1 0,55±0,04 0,02^0,001

ПО и ПФО - ферменты, играющие важную роль в метаболизме и способные выполнять роль оксидаз терминального окисления, несколько снижаются в процессе хранения. АДГ - фермент, катализирующий обратимое окисление этанола в ацетоальдегид. Равновесие реакции в физиологических значениях рН смещено в сторону образования этанола, который участвует в различных физиолого-биохимических процессах устойчивости семян к воздействию неблагоприятных факторов внешней среды. Накопление этанола в клетках зародыша способствует поддержанию жизнеспособности и длительному сохранению всхожести семян.

С биохимической точки зрения ПФП выполняет две основные функции: во-первых, поставляет НАДФН для различных восстановительных и синтетических реакций и, во-вторых,' ■ продуцирует различные промежуточные соединения, которые используются для синтеза нуклеиновых кислот и физиологически активных соединений (Гудвин, Мерсер, 1986). Снижение активности ГбФДГ -

юдачевого фермента ПФП указывает на нарушение функционирования основного метаболического пути, участвующего в поддержании жизнеспособности семян при хранении (Робертси, Смит, 1982). Таким образом, понижение жизнеспособности семян коррелировало с уменьшением активности АДГ и ГбФДГ, а снижение активности ПО и ПФО - с понижением всхожести.

■ Ухудшение качества семян растений разных видов при хранений может быть обусловлено нарушениями в различных процессах и структурах, но чаще всего оно связано с комплексом изменений. В связи с этим представляет интерес выявление таких показателей обмена, которые позволят оценить способность семян к росту и дальнейшей жизнедеятельности. Проблема сохранения жизнеспособности и качества семян приобретает особую актуальность' для зернового хозяйства, поскольку семена испытывают' на себе технологические и физико-химические воздействия в процессе хранения и переработки. Сведения о продолжительности жизни семян й познание механизмов ее регуляции важны в теоретическом и практическом аспектах.

Из таблицы 3 видно, что длительное хранение ячменя в естественных условиях склада приводит к снижению всхожести и активности антиоксидантной системы защиты зерна. Содержание продуктов ПОЛ повышалось в течение 3 лет хранения ячменя в естественных условиях. Понижение концентрации продуктов ПОЛ и низкомолекулярнцх АО коррелировало с резкой потерей жизнеспособности (до 52 %) и всхожести (до 46 %) семян.

Таблица 3 - Изменение активности антиоксидантной системы и интенсивности перекисного окисления липидов при хранении ячменя сорта Кедр

Срок АО, мкг/г СОД, ед.акт КАТ, ГР, мкМ/мин ПОЛ,мкМ/

■ хранения, С.В мМ/мин г.с.в. Г.С.В. Г.С.В.

годы

1 104,1±5 6,4±0,3 0,5±0,02 0,8±0,04 0,075±0,005

3 88,3±4 3,5±0,2 0,3±0,01 0,5±0,02 0,123±0,01

5 64,5±2 3,0±0,2 0,1±0,01 0,1±0,01 0,053±0,004

Наблюдаемая закономерность указывает на то, что по интенсивности протекания ПОЛ в семенах можно оценить неспецифические адаптационные возможности организма, а по активности антиоксидантной системы - его компенсаторный потенциал. Причем эти два показателя обычно взаимосвязаны и взаимозависимы.

Таким образом, .универсальной причиной старения служит образование активных кислородных метаболитов и свободно-радикальное окисление липидов мембран, белков, нуклеиновых кислот. Результатом метаболических изменений при естественном.старении семян является утрата ими жизнеспособности. В качестве основных звеньев, ответственных за сохранение жизнеспособности семян, могут выступать окислительные и- антиоксидантные процессы, от функционирования которых . зависят поддержание гомеостаза, включение механизмов, противодействующих „ старению, концентрации соединений* определяющих прорастание семян.

2. Влияние внешних факторов на антиоксидантную систему и окислительные процессы при прорастании семян растений

В почве семена в течение довольно длительного периода, начиная с посева и кончая появлением всходов, подвергаются влиянию все время меняющихся и часто неблагоприятных условий внешней среды. В период набухания семена чрезвычайно чувствительны к условиям внешней среды, незначительные и неожиданные изменения которых существенно влияют на появление всходов.

2.1. Активность оксидоредукгаз при набухании и прорастании семян

С возрастанием оводненности в семенах активируются основные метаболические процессы, и повышается дыхание до максимального уровня (Обручева, Ангипова, 1997; Головко, 1999; Николаева, 1999). Вопрос об активности ключевых оксидоредукгаз терминального окисления в семенах зерновых культур изучен совершенно недостаточно.

Таблица 4 - Активность оксидоредукгаз при набухании пивоваренного ячменя Гонар (Кировская область)

Время набухания, ч АДГ, мкМ/мин г.с.а Г6ФДГ, мкМ/мин Г.С.В. ПО, мкМ/мин Г.С.В. ПФО, ед. /мин г.с.в.

0 6,3±1,8 0,063±0,003 1,42±0,45 0,16±0,01

12 4,2±0,7 0,18±0,01 5,8±0,75 0,17±0,01

24 5,7±1,3 1,39±0,13 4,7±0,61 0,21±0,02

36 6,6±1,4 0,98±0,07 6,2±1,4 0,20±0,02

48 4,7±1,1 0,82±0,05 6,4±1,4 0,24±0,03

Из таблицы 4 видно, что в первые 12-24 ч набухания, активируются как дегидрогеназы, так и оксидазы. Возможно, это объясняется тем, что выход из состояния покоя, сопровождается активацией биосинтетических процессов, для осуществления которых необходима активация дыхания. Известно, что покой семян могут прерывать различные ингибиторы цитохромоксидазы и катал азы, а также в некоторых случаях подобное действие могут оказывать ингибиторы гликолиза и ЦТК (Робертси, Смит, 1982). Это указывает на то, что именно работа ПФП существенно важна для выхода семян из состояния покоя. Ограничивающим скорость звеньев ПФП является реокисление НАДФН, окисленная форма которого является основным акцептором электронов на этом пути, поэтому соотношение окисленной и восстановленной форм НАДФ может регулировать процессы терминального окисления. Никотинамидные коферменты являются медленно окисляемыми субстратами ПО, в окислении которых важную роль играют свободно-радикальные полуокисленные продукты. Наиболее вероятным механизмом ускоренного окисления НАДФН можно предложить совместное окисление кофермента с другими субстратами (Лебедева, Угарова, 1996).

Снижение на более поздних стадиях замачивания (36-48 ч) активности дегидрогеназ и увеличение на их фоне активности пероксидазы и полифенолоксидазы объясняется преобладанием в семенах аэробных процессов.

Нами изучена активность окислительных ферментов в зародыше, щитке и эндосперме в течение 24 ч набухания ячменя. Выход из покоя семян обусловлен

, интенсивностью биосинтетических процессов, прежде всего, в зародыше и щитке, поэтому наибольшая активность изучаемых нами дегидрогеназ и оксидаз, наблюдается именно в них.

Таблица 5 - Активность оксидоредуктаз при проращивании ячменя Гонар

Проращи- АДГ, • мкМ/мин г с.в. Г6ФДГ, мкМ/мин г с.в. ПО, мкМ/мин г с.в. ПФО, отн.ед.акт7мин

вание, суг. зерно корни - зерно корни зерно корни зерно корни

1 2 3 , 4 5 6 7 8 Ilililll ЗДЫОД 2,7Н02 3 1ЯЗД1 1ДЩ1 lJ&toQl 1ДЛД1 13110,1 0,07±0,01 0,08*0,01 026Ю.02 032$,02 03840,03 0,1210,004 ОЗОН),01 4£2±1,1 539±1,5 23&Д2 2^8*0,2 1,52*0,1 1,84±0,1 231±0Д 13,212,0 13,812,0 23,1±3,2 17,5*3,0 21,7*3,1 17,212,4 17,4±2Д 243*3,1 1933*8,4 2512*12,1 258,7*12Д 247Д*13,1 241,1±12,0 272,4*15Д 281Д*15,4 0,28*0,03 033±0,02 0,26*0,01 0^210,01 0,18*0,02 035*0,03 o,io*a,oi 0,15*0,01 63*1,4 8,4*1,8 16£*2Д 15,1*2,0 16,712,1 17,6*2^

Активность оксид аз ных ферментов - пероксидазы и полифенолоксидазы возрастала в течение всего времени проращивания (табл. 5). Повышение активности пероксидазы свидетельствует о том, что фермент может участвовать в пусковых механизмов прорастания семян, инициируя реакции свободно-радикального окисления, которые через активацию ПОЛ могут способствовать возрастанию дыхательной процессов митохондрий (Рогожин, 2000). Следует отметить, что активность окислительных ферментов в корнях гораздо выше, чем в зерновке.

В процессе прорастания, активность окислительных ферментов проявлялась в своеобразной динамике. Активность АДГ колебательно снижалась в течение всего времени прорастания ячменя, с кратковременным подъемом активности в корнях на 4 сутки. Субстраты и продукты реакций, катализируемых АДГ, выполняют разнообразные физиологические функции в клетках растений (Winter, 1981; Stiborova, , 1989). Снижение активности АДГ при прорастании объясняется ингибированием.фермента молекулами АТФ, концентрация которых повышается за счет активации аэробного биологического окисления (Рогожин, 2000).

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа - ключевой фермент ПФП, катализирующий окисление глюкозо-6-фосфата в присутствии НАДФ и ионов магния. Физиологическая функция этого фермента заключается в обеспечении синтеза липидов НАДФН, а также в снабжении пентозофосфатами и эритрозофосфатами процессов синтеза нуклеиновых кислот и различных физиологически важных соединений (Гудвин, Мерсер, 1986). Активность Г6ФДГ резко возрастала в корнях на 3 сутки, а затем постепенно снижалась.

, Таким образом, при запуске процессов прорастания необходима активация как анаэробных (АДГ и Г6ФДГ), так и аэробных процессов (ПО и ПФО). Путем правильного регулирования условий проращивания можно в определенных пределах управлять процессами переключения дегидрогеназ ных реакций на оксид аз ные.

2.2. Окислительные процессы и активность антиоксидантной системы при набухании и прорастании семян

Прорастание — сложный физиолого-биохимический процесс, который отражает сдвиг в развитии семян от гипометаболшма к оптимальному метаболизму, обеспечивающему рост и развите зародыша. Из таблицы б видно, что в течение всего времени набухания, постепенно повышается содержание в ячмене МДА и низкомолекулярных АО. Возрастание концентрации низкомолекулярных АО в прорастающих зерновках объясняется активацией гидролитических реакций, обеспечивающих зародыш пластичным материалом и энергией. Активность ферментов, утилизирующих перекись водорода, - каталазы и пероксидазы постепенно возрастает в течение всего периода замачивания, что объясняется участием их в окислении энергетических соединений и ингибиторов роста, накопление которых наблюдается во время покоя семян.

Таблица б - Окислительные процессы и антиоксидантный статус ячменя сорта Сигнал (Алтайский край) при замачивании

Время МДА, АО, СОД ПО, ГР,

набухания, мкМ/ мкг/ едлкгУ мкМ/ мкМ/

ч г C.B. ГС.В. гс.в. мин. Г C.B. мин г C.B.

0 0,104±0,01 131,4±5,2 1,0±0,1 11,3±3,4 0,4±0,03

2 0,092±0,01 107,5±4,4 2,1±0,2 13,3±3,0 0,8±0,01

6 0,110±0,01 155,3±5,3 3,4±0,2 12,0±3,0 1,1±0,01

12 0,102±0,01 201,7±5,6 4,4±0,3 17,5±4,1 1,3±0,01

18 0,123 ±0,02 190,5±5,1 8,5±0,4 17,8±4,0 2,0±0,02

24 0,120±0,02 240,2*6,2 8,8±0,4 22,3±5,0 2,1±0,02

Пик активности СОД приходит на 18 ч замачивания с последующим колебательным падением. Снижение активности глугатионредукгазы можно объяснить тем, что для катализа этому фермету необходим коферменг НАДФН, содержание которого снижется при возрастании аэробных процессов. Нами изучена активность антиоксидантных ферментов, содержание низкомолекулярных АО и МДА в зародыше, щитке и эндосперме в течение первых 24 ч набухания ячменя. Активность СОД КАТ и ПО в процессе набухания колебательно возрастает. Причем высокая активность ферментов и содержание АО наблюдается в зародыше и щитке. Пик наибольшей активности приходится на 12-18 ч замачивания. Следует отметить, что активность глутатионредуктазы резко возрастает в первые 18 ч, а затем постепенно идет на снижение.

Физико-химические свойства мембран могут оказывать существенное влияние на протекание метаболических процессов (Владимиров, Арчаков, 1972; Мерзляк, 1989). Хотя поглощение воды и служит сигналом к организации митохондрий, самого по себе поглощения воды для активации окислительных процессов недостаточно. В сухих семенах отсутствует окислительное фосфоршшрование, но существуют митохондрии, для активации работы которых необход имы физико-химические изменения в мембранах (Khan, 1982). Возможно, что абсолютная необходимость АФК и акгаоксидангаой системы для жизнедеятельности семян" объясняются образованием при их реакциях электронно-возбужденных состояний - триггеров всех последующих биоэнергетических процессов. Колебательный режим таких реакций может обусловливать ритмичное протекание

биохимических процессов более высокого уровта. Резкое повышение содержание МДА в зародыше и шитке можно объяснить возрастанием окиегаггелынлх процессов и д ыхания в зерне при достижении необходимой влажности. По-ввдимому, процессы ПОЛ запускают у покоящихся организмов основные процессы жизнедеятельности.

Повышение концентрации- низкомолекулярных АО на 12 ч набухания объясняется выходом." И3г депо низкомолекулярных растворимых соединений,- а также гидролизом белков - и полисахаридов, продукты которых обладают антиоксидантными свойствами (Тарчевский, 2001).

Таблица 1. - Состояние антиоксидантной системы и интенсивность , перекисного окисления липидов в процессе прорастания ячменя сорта Сигнал

МДА,мкМ/г АО.мкгУгсв. СОДедакгЛ- ПО, КАТ.мМЛкин ГР,

па 1С св. СА мхМЛли.г г с!в. ' мкМ'минг

.суп ов. св.

ЭТИ! Кфж ЭфЮ 1ЦМ дю ■чж ЗЕРО ' юрт ЗЧН) ЭфН> цн

1 0.МЗ - 315,2 - 15 13Д 0,15 - -

2 0,048 0,767 274,0 356,7 18 30 23^ 201,6 0,17 036 1Д 23

3 о,т 0,539 255,4 825,1 20 47 17,8 194,5 0,18 038 0,7 М

■ 4 0,074 0,742 199,8 905Д 35 50 21,7 229,8 0Д1 0,60 03 0,4

5 0,033 0,673 186,5 451,2 30 48- 17Д 136,4 0,18 0,47 од 04

6 0,088 0,406 1613 4123 32 64 17,4 184,5 ОДЗ .0,67 0,4 ОД

7 0,091' 0,699 171,6 657,8 31 67 20,4 227,1 0Д4 0,72 ОД 0,1

8 ОД 13 0,603 198,7 610Д 33 70 21,1 265,6 030 0,81 0,1 од

Из результатов видно, что проращивание сопровождается постепенным возрастанием ПОЛ в зерне и корнях (табл. 7). Концентрация низкомолекулярных АО постепенно снижается в зерне в течение всего времени проращивания. Динамика активности СОД в корнях и зерне постепенно повышается в течение четырех суток ращения. Причем более высокие показатели активности ферментов отмечались в корнях. Кагалаза содержится в ячмене в незначительном количестве, но быстро накапливается при проращивании, причем скорость накопления^ явно* зависит от длительности проращивания. Активность КАТ возрастает меньше по сравнению, с активностью ПО, так как сродство фермента к малым концентрациям Н2О2 ниже,чем > у пероксидазы (Саудцерс, 1988). Указанные фермент» принадлежат, к дыхательному. комплексу растений, поэтому повышение их активности з прорастающемячменеобусловлено- также возрастанием д ыхания. Увеличение активности ПО может быть вызвано накоплением соединений, являющихся субстратами фермента, индуцирующих его синтез: Однако высокие концентрации субстратов пероксидазы мотут ингибировать фермент (Рогожин, 2004), способствуя, таким образом, увеличению концентрации Н2О2 в клетках. Возможно, этим и объясняется падение активности фермента на 3 и 6-е супси проращивания. Постепенное снижение активности ГР в зерне и корнях можно объяснить преобладаниемаэробных процессов над анаэробными, в результате чего, снижается концентрация НАДФН в клетке.

Нет сомнений в том, что наряду с участием в подавлении действия свободных радикалов, антаоксиданты как ' соединения, относящиеся к. различным классам химических веществ, могут оказывать физиологическое действие на различные процессы в клетке. Снижение содержания низкомолекулярных АО можно объяснить использованием их не только та акгаоксидантную защиту, но и на физиологические нужды клетки.

Понижение свободно-радикальных процессов в семенах возможно за счет образования большого количества антиоксидантов, концентрация которых при этом возрастает в несколько раз, особенно в зародыше семян ячменя. Выявленные закономерности являются проявлением адаптационных компенсаторных механизмов, использование которых позволяет регулировать физиолого-биохимические процессы в семенах при прорастании.

2.3. Участие пероксидазы и антиоксидантов в прорастании семян пшеницы

Пероксидаза - антиоксидантный фермент, который является чувствительным индикаторам самых различных неблагоприятных воздействий внешней среды (Савич, 1989; Карташова, 2000). Нами показано, что при прорастании семян с появлением корней и побегов активность ПО повышается в надземной части в 1,82,0, в корнях в 12-14, а в зерне в 4-5 раз. Снижение активности ПО коррелирует с понижением всхожести семян. Возрастание активности ПО может свидетельствовать о том, что фермент участвует в активизации пусковых механизмов прорастания семян, инициируя реакции свободно-радикального окисления, которые через активизацию ПОЛ могут способствовать возрастанию дыхательной активности митохондрий.

Следует отметить, что антиоксидантная система выполняет важную роль в поддержании жизнеспособности покоящего организма. При этом компоненты АОС могут не только обеспечивать продолжительность состояния покоя, но и, при создании благоприятных условий, активировать выход из состояния гипобиоза живых организмов.

Таблица 8 - Активность пероксидазы в жизнеспособных прорастающих и находящихся в состоянии покоя семенах пшеницы сорта Скороспелка улучшенная

Семена Время проращивания, Активность ПО,

сут мкМ/мии г с.м.

Воздушно-сухие - 3,0±0,3

(контроль)

Проросшие 2 7,2±0,7

3 8,5±0,8

Непроросшие, 1 2,4±0,2

жизнеспособные 3 3,5±0,2

Для проверки высказанного предположения был проведен следующий эксперимент: семена пшеницы сорта Скороспелка улучшенная (всхожесть - 44%, жизнеспособность - 70%) проращивались в течение трех дней и дифференцировались на проросшие и непроросшие. Из табл. 8 видно, что у непроросших семян активность ПО почти не изменяется, в то время как в прорастающих семенах наблюдается увеличение активности ПО в 2 раза. Эти результаты являются доказательством того, что для прорастания семян необходима не просто активация всех биоэнергетических процессов, а переключение дегидрогеназных реакций на аэробные.

Для подтверждения избирательности действия АО по отношению к ПО, нами было изучено содержание СГ и АК в зародыше и эндосперме семян ячменя Ача и пшеницы сорта Якутянка 224, Показано, что в эндосперме семян ячменя со всхожестью 76% СГ и АК содержится больше на 30 и 37% соответственно, чем в зародыше. Тогда как в эндосперме семян пшеницы с лабораторной всхожестью 28%, но высокой жизнеспособностью (86%) гликозидов содержится на 20%, а АК на 30% меньше, чем в зародыше.

Эта изменения служат подтверждением того,, что содержание и состав функционально активных соединений эндосперма могут оказывать влияние на интенсивность метаболических процессов в зародыше. Понижение концентрации СГ и АК в эндосперме приводит к-замедлению процессов деления и роста клеток зародыша. Это условие реализуется на начальных этапах развития, когда автономность зародыша, отражающая независимость его развития от окружающих тканей и проявляющаяся в способности нормально развиваться вне материнского организма, еще очень слабо выражена и эндогенные функционально активные вещества эндосперма лимитируют дифференциацию и рост клеток (Николаева и др., 1999).

Стероидные гликозиды . и аскорбиновая кислота относятся . к группе антиоксидантов-субстратов пероксидазы, поэтому могут оказывать влияние на активность фермента, чтопроявляется при малых концентрациях в виде повышения всхожести семян, тогда как высокое содержание антиоксидантов понижает всхожесть семян, углубляя их покой.

2.4. Влияние температуры на активность антиоксидантной системы и окислительные процессы

Влияние температурных условий на семена растений - одна из важнейших теоретических проблем физиологии и биохимии растений, тесно связанных с практикой сельского хозяйства. Интересно, что физиологический покой в чистом виде или в комбинации с. другими типами покоя представляет собой довольно лабильное состояние семян.-Для семян, находящихся в неглубоком покое, выход из него достигается температурным воздействием. Выдерживание семян в условиях температурного стресса способствует повышению всхожести (Николаева, 1999).

2.4.1 Активность, каталитические свойства пероксидазы и содержание антиоксидантов при прорастании семян пшеницы

Изучена динамика активности ПО и содержание АО в семенах пшеницы в течение 24 ч набухания при 5 °С-(¡.группа) и 23' °С (II группа). Процесс набухания семян сопровождается колебательным возрастанием активности фермента. Обращает на себя внимание тот факт, что резкое повышение активности фермента в семенах,, подвергнутых температурному стрессу, наблюдается на 8, 18 и 24 ч набухания. Пероксидаза — стрессовый фермент растений, который участвует в метаболических процессах, происходящих во время покоя семян и в период их активного прорастания. Поэтому своеобразные колебательные всплески активности фермента обусловлены проявлением компенсаторных механизмов в условиях низкой положительной температуры.

Для выяснения локализации и участия компонентов антиоксидантной системы в процессах прорастания определено содержание продуктов ПОЛ, низкомолекулярных АО и активность ПО в различных органах семян (табл. 9). Видно, что активность ПО и содержание АО в зародыше у семян I группы было выше в 1,5 раза. У этих же семян в процессе набухания повышается активность пероксидазы в эндосперме и оболочке в 1,5 и 1,8 раза соответственно.

Субстратами ПО могут быть фитогормоны и фенольные ингибиторы роста, поэтому фермент имеет большое значение в регуляции состава биологически активных веществ в клетках растений. Причем вслед за этими процессами в семенах возрастает дыхание, повышается общий уровень метаболизма, что проявляется в ускоренном прорастании семян, активно выходящих из состояния покоя (Рогожин, 2004). Окисление БАВ ферментом способствует активации ростовых процессов в условиях стресса.

В покоящихся семенах дыхание крайне ослаблено, отмечаются изменения в составе жирных кислот и функционально активных веществ мембран мигохондриальной системы (Николаева, 1999; Робертси, Смит, 1982), за счет которых обеспечивается разобщение механизмов окислительного фосфорилирования при сохранении активности окислительных процессов (Скулачев, 1996). При активизации дыхания, поступивший кислород ускоряет пусковые механизмы процессов ПОЛ, поэтому наибольшее содержание продуктов ПОЛ отмечается в активно метаболизирущих органах - зародыше и щитке.

Таблица 9 - Активность антиоксидантной системы и интенсивность перекисного окисления липидов в органах семян пшеницы сорта Омская 12 после 24 ч замачивания зерен при разных температурах

Орган ПО, мкМ/мин г.с.м. ПОЛ, нМ/ г.ом. АО, мкг/г.ам.

Температура, "С

5 23 5 23 5 23

Сухое зерно 3,70*0,21 3.601Д25 25,3*1,8 21,8*1,1 85,2*3,2 883*3,8

Оболочка семени 0,44±0,03 0,25*0,02 23,4*1,5 25,5*1,6 160,7*12,1 176,2*13,4

Эндосперм 0,42±0,03 0,28*0,03 19,6*1,2 20,7*13 133,3*6,5 1243*113

Щиток 222±0,12 21,7*0,11 55,6Ь23 71,6*3,4 256,4±15Д 256,4*18,8

Зародыш 59,3*0,45 39,0*0,32 95,3*5,4 117,4*8,5 398,4*24,7 285,7*21,5

Изучение влияния температуры, кислорода и удаления покровов на прорастание зерновых культур привели к постулату о том, что выход из покоя определяется реакцией окисления, отличной от обычного дыхания (Робертси, Смит, 1982). По-видимому, повышение всхожести при низкотемпературном замачивании семян обусловлено тем, что ведущим звеном этой системы являются процессы ПОЛ, запускающие у покоящихся организмов основные процессы жизнедеятельности. Таким образом, набухание и прорастание семян сопровождается активированием ПОЛ, изменением в концентрации АО и повышением активности ПО.

Поскольку растения ведут прикрепленный образ жизни, важной стратегией существования являются превентивные физиолого-биохимические реакции на стресс. Адаптация растений к температуре среды может осуществляться благодаря ■

изменению некоторых свойств клеточных ферментов. Одной из наиболее общих закономерностей воздействия температуры на ферментативные реакции следует считать влияние на степень сродства фермента к субстрату (Лютова, 1995).

Изучение влияния температуры на кинетические и структурные свойства ферментов позволит понять молекулярную природу приспособления организма к меняющимся факторам окружающей среды.

Таблица 10 - Каталитические' показатели реакций пероксидазного окисления о-дианизидина и аскорбиновой кислоты, катализируемых пероксидазой зерна и 7-ми суточных проростков пшеницы

рН Сухое зерно Проростки пшеницы сорта Омская 12

Надземная часть Корни

ОДН АК ОДН* ОДН АК ОДН* | АК* ОДН АК

1 Кщ, мкМ

5,0 54±2 38±2 62±2 94±3 263±12 22±1 70±2 62±2 . 33±2

5,5 59±3 35±2 137±4 115±3 161±9 67±3 51±2 124±4 27±2

6,0 57±2 30±2 49±2 64±2 33±2 65±2 15±1 67±2 11±1

7,0 39±1 26±1 12±1 36±2 24±1 52±2 18±1 39±2 12±1

Vm, мкМ/мин

5,0 28±2,2 2,9±0,11 43±2,2 40±1,8 55±3,4 129±5,9 50±2,3 87±4,2 25±2,2

5,5 21±2,1 2,0±0,09 57±2,6 47±2,2 28±2,3 154±6,7 36±1,6 103±9,6 21±1,7

6,0 14±1,2 1,7±0,35 25il,8 28±1,3 8±0,4 117±5,7 22±1,0 62±2,8 16±1,2

7,0 4±0,2 1,3±0,04 8±0,5 9±0,4 9±0,3 50±2,5 21±1,1 20±0,8 15±1,0

* зерна пшеницы замачивались при 5 °С

Из таблицы 10 видно, что различия в величинах Кт по о-дианизидину пероксидазы проростков пшеницы (надземная часть и корни), а также Vm проростков пшеницы семян 1(5 °С) и II групп (23 °С) незначительны. Основные изменения наблюдаются у Кй по аскорбиновой кислоте пероксидазы корней пшеницы зерен I и II групп. Величины Кт зерен I группы выше в 1,5-2 раза, по сравнению с зернами II группы. Значения Vm по ОДН и по АК пероксидазы корней пшеницы зерен I группы в 1,5-2 раза выше, чем корней пшеницы зерен II группы. Тогда как Кщ по АК пероксидазы корней пшеницы зерен II группы в 2-7 раз ниже, чем у ПО надземной части проростков этой же группы.

Пероксидаза обладает широкой субстратной специфичностью, поэтому катализ определяется сродством его к субстрату. Разные субстраты конкурируют между собой за фермент, и можно ожидать, что изменение каталитических характеристик приведет к накоплению или быстрому окислению биологически активных веществ. Сродство ПО к различным субстратам может характеризоваться величинами констант Михаэлиса-Ментен и каталитической константой. Чем ниже Кт, тем выше субстратсвязывающая способность фермента.

Таким образом, результаты исследования показали, что изменение не только активности, но и каталитических свойств ПО в семенах является одним из механизмов регуляции процесса прорастания. Наблюдаемое in vivo взаимное влияние между антиоксидантами и пероксидазой. обусловлено тем, что низкомолекулярные антиоксиданты являются субстратами пероксидазы.

2.4.2. Роль пероксндазы и низкомолекулярных антиоксндантов в защите проростков от окислительного стресса

Для набухания и прорастания семян требуются разные температуры, причем температура, при которой происходит набухание семян, оказывает большое влияние на физиологические процессы в проростках. Воздействие пониженными и переменными температурами, ускоряющими выход семян из состояния покоя, нашло практическое применение для стимулирования прорастания семян (Николаева, 1981).

Поскольку ПО и АО входят в единую систему защиты растений от окислительного стресса, изучено их участие в регулировании уровня ПОЛ на 3-5 сутки роста проростков пшеницы. Показано, что в надземной части проростков пшеницы уровень АО понижается на 4-5 сутки в 1,4-1,5 раза, при повышении активности пероксндазы в 1,8 раза. В этот период контроль над уровнем ПОЛ в побегах резко снижается, что проявляется в возрастании содержания МДА в 1,5 раза. В корнях проростков пшеницы на 4-й день прорастания уровень ПОЛ возрастает в 1,5 раза, при этом содержание АО и активность пероксндазы понижаются в 2,4 и 1,2 раза соответственно.

Таким образом, контроль за уровнем ПОЛ в проростках пшеницы осуществляют как низкомолекулярные антиоксидаты, так и пероксидаза. При этом ведущая роль в регулировании ПОЛ в надземной части преимущественно принадлежит низкомолекулярным антиоксидантам, где за счет активного фотосинтеза идет их накопление. В корнях эта функция возложена на пероксидазу, высокая активность которой обеспечивает поддержание определенного уровня ПОЛ.

Активность ПО в проростках пшеницы, семена которых замачивали при 5 °С и 23 °С, проявлялась в своеобразной динамике и зависела от природы исследуемых частей пшеницы. Отмечался линейный рост активности пероксндазы в зерне с небольшим опережением у зерен II группы. Зависимости активности перокснд азы надземной части проростков пшеницы имели вид "качелей" с постепенным снижением в первые 3-4 дня, а затем повышением к 7-му дню прорастания проростков. Причем более высокие показатели активности пероксндазы были у семян П труппы. В корнях семян П группы в первые 2-3 дня понижалась активность пероксндазы и только на 7-ой день отмечался ее рост. Зависимость активности ПО у корней семян I группы принимала вид затухающих колебаний с возрастанием активности на 3-й и 6-й день и понижением к седьмому дню прорастания корней до нормы. Причем активность ПО в корнях семян I группы была 1,5-2^5 раза выше, чем у корней семян П группы. Мотивацией к повышению активности пероксндазы является проявление компенсаторных антиоксидантных механизмов, направленных на предотвращение развития окислительного повреждения тканей, вызванных воздействием низких температур.

Таким образом, ангиоксиданш и пероксидаза входят в единую систему антиоксидантной защиты растений, где выполняют строго специализированные функции. Пероксидаза, являясь окислительно-восстановительным ферментом, контролирует уровень перекиси водорода и антиоксндантов в семенах и проростках пшеницы, а АО накапливаясь в тканях, участвуют в реакциях подавления образования свободных радикалов, кроме этого могут регулировать активность пероксндазы, осуществляя общий контроль за деятельностью системы антиоксидантной защиты.

2.5. Биохимические процессы и антиоксидантный статус при различных

режимах аэрации

Различные стрессовые воздействия стимулируют образование АФК (Scandalios, 1993; Noctor, Foyer, 1998). Наименее изученным в этом отношении оказалось влияние на продукцию АФК гипоксии и аноксий, причем накопленные к настоящему времени данные довольно противоречивы (Чиркова, 2002).

При производстве пивоваренного солода все большей популярностью пользуется анаэробное солодоращение, которое имеет ряд преимуществ: снижается расход питательных веществ на дыхание и рост, сокращается время солодоращения при достаточном накоплении ферментов, резко активируется пуллуланаза, улучшаются технологические свойства солода и др. (Карпенко и др., 2000).

Изменение активности оксидоредуктаз при солодоращении ячменя представлены в таблице И. Активность оксидазных ферментов возрастала в течение всего времени проращивания. Следует отметить, что активность окислительных ферментов в солодовых гусарах гораздо выше, чем в зерне. Наибольший пик ПОЛ наблюдается на 6-7 сутки солодоращения.

Таблица 11 - Изменение антиоксидантного статуса и интенсивности перекисного окисления липидов при аэробном (Аэр) и анаэробном (Ана) солодоращении ячменя сорта Дворан

Про- МДА, АО, СОД, по, ГР,

раста- мкМ/г с.в. мкг/г.с.в. ед.акт./г.с.в мкМ/мин мкМ/мин

ние, г.с.в. г.с.в.

сутки Аэр Ана Аэр Ана Аэр Ана Аэр Ана Аэр Ана

, Зерновка

1 0,064 175,2 - 11,3 - 17,6 - - 0,8 -

2 0,113 - 216,1 - 16,6 - 21,0 - 1,7 -

3 0,144 - 268,5 - 18,1 - 26,2 - 1,0 -

4 0,101 0,180 376,1 275,4 20,0 23,4 23,6 33,2 0,7 1,5

5 0,256 0,311 455,4 544,1 21,3 25,4 35,5 47,6 0,7 1,6

6 0,271 0,404 612,7 503,2 20,1 24,6 46,4 34,5 0,4 1,0

7 0,247 0,370 546,2 550,7 21,3 24,0 57,1 39,3 0,4, 0,6

8 0,277 0,303 410,2 455,3 22,5 21,7 46,7 34,0 0,1 0,2

Солодовые ростки

3 0,173 - 176,1 - 38 - 167,5 - 1,4 -

4 0,177 0,220 153,7 93,2 55 74 194,4 277,4 1,0 2,1

5 0,221 0,404 110,0 44,4 60 70 207,2 303,4 0,7 0,4

6 0,238 0,487 57,2 40,5 57 48 261,3 322,1 0,4 0,1

7 0,260 0,511 54,5 31,1 54 46 240,1 304,6 0,4, 0,2

8 0,301 0,573 51,7 33,4 61 23 237,1 260,6 0,3 0,1

Известно, что из-за нарушения метаболических систем, сахара в анаэробных условиях не могут полноценно использоваться в качестве энергетических соединений (Чиркова, 2002). Возрастание концентрации низкомолекулярных АО в конце солодоращения обусловлено образованием в процессе гидролиза восстанавливающих углеводов, обладающих антиоксидантными свойствами.

Активность ПФО незначительно возрастает в условиях начинающейся гипоксии. В юменении активности пероксидазы наблюдается резкий скачок после первых суток пребывания в гипоксии. Длительное нахождение солода в анаэробных условиях приводит к снижению акпшносга как анпюксидатных ферментов, так и активности терминальных оксидаз на фоне накопления продуктов перекисного окисления липидоа

Активность АДГ колебательно снижалась в течение всего времени прорастания ячменя в аэробных условиях, с кратковременным подъемом активности в солодовых ростках на 4 сутки. Активность Г6ФДГ резко возрастала в гусарах на 3 сутки, а затем постепенно снижалась. Активность дегидрогеназ в течение первых двух суток нахождения в условиях гипоксии постепенно возрастала. Ускорение работы ПФП является неспецифической реакцией на воздействие нарастающей гипоксии. ПФП играет в условиях стресса положительную роль, которая состоит в поставке восстановителей и ингермедиаторов, необходимых для биосинтеза. Однако при возрастающей силе воздействия, происходит изменение соотношения путей в пользу доминирования гликолиза. Равновесие алкотльдегидрогеназной активности в первые двое суток анаэробиоза сдвинуто в сторону образования этанола, который может служить в условиях стресса энергетическим субстратом для клеток, регулировать интенсивность ПОЛ и проницаемость клеточных мембран. Известно, что для поддержания высокой скорости гликолиза необходимо непрерывное реокисление восстанавливающихся в ходе гликолтического процесса коферментов. В условиях гипоксии, когда электрон-транспортная сеть митохондрий отключена, окисление НАДН может происходить в конечных реакциях спиртового брожения. Следовательно, сдвиг равновесия реакции в сторону образования эндогенного этанола является одним из механизмов реактивности системы на стресс.

Следует также отметить, что регуляция активности фермента осуществляется с помощью эндогенных регуляторов - спиртов, альдегидов, углеводов и коферментов, содержание которых изменяется в процессе солодоращения (Нарцисс, 1990). Своеобразная динамика падения активности оксидаз и дегидрогеназ указывает на разобщение метаболических процессов при длительной гипоксии из-за накопления продуктов анаэробного окисления веществ и перекисного окисления липидов.

Ферменты обеспечивают комплексную антиоксидангную защиту клеток от воздействия АФК. Однако при окислительном стрессе ферментаая защита оказывается менее эффективной в сравнении с протекторным действием низкомолекулярных АО. Причины этого - быстрая инактивация пула ферментов свободными радикалами, большая молекулярная масса и значительное время, необходимое для ицпукции их синтеза (Кения, Лукаш, 1994). Этим и объясняется резкий подъем с последующим падением акпшносга аншоксидантных ферментов в первые сутки анаэробного солодоращения. При гипоксии повышается значение низкомолекулярных АО, чья избыточность и относительная свобода миграции в клеточной и тканевой среде выступает на передний план (Мерзляк, 1989). Показано, что в первые сутки анаэробного солодоращения снижение концентрации низкомолекулярных АО сопровождалось накоплением продуктов ПОЛ Максимальное содержание АО наблюдается на 6-7 супси солодоращения.

Очевидно, что низкомолекулярные АО расходуются на подавление свободно-радикальных процессов и выступают донорами водорода в реакциях совместного пероксидазного окисления. Продолжительное анаэробное солодоращение приводит к разобщению окислительных процессов, снижению антиоксидантной активности и накоплению продуктов ПОЛ

2.6. Влияние ультрафиолетового облучения на перекисное окисление липидов и активность антиоксидантной системы

Физиолого-биохимические механизмы прорастания семян, а также влияние разнообразных факторов внешней среды на метаболизм проростка - одно из актуальных направлений современной биологии. В настоящее время для повышения всхожести, регуляции роста и развития растений применяют физические методы воздействия - Ультразвук, у-лучи, электромагнитные поля и др. (Муромцев, 1987; Хорунжина, 1999; Шаповалов, 2003).

В последние года предприняты многочисленные попытки, позволяющие выяснить метаболическую основу покоя семян и выхода из него, в связи с этим был предложен ряд теорий, из которых все большее признание получают те, в которых рассматриваются окислительные процессы, такие, как гликолиз, ЦТК, ПФП. Правда, остается неясным вопрос о природе активации этих процессов, а также о механизмах их блокировки при покое семян (Робертси, Смит, 1982).

Нами показано, что всхожесть семян ячменя зависит не только от продолжительности УФ облучения, ио и от степени набухания семян. Кратковременное облучение ячменя в первые часы набухания приводит к повышению всхожести семян. УФ облучение после 12 ч набухания семян не способствует достоверному повышению всхожести. Обращает на себя внимание тот факт, что длительное облучение после 24 ч замачивания приводит к резкому снижению всхожести семян.

Для объяснения биохимического механизма активации прорастания семян ячменя была изучена активность оксвдоредукгаз в различных частях, принимающих непосредственное участие в биохимических процессах активации метаболизма. Установлено, что малые дозы облучения могут изменять периодичность возрастания активности ферментов со сдвигом экстремумов на более раннее время. Кратковременное облучение семян в течение 15 мин после двухчасового набухания приводит к резкому повышению активности оксвдоредукгаз в зародыше и щитке.

Именно работа анаэробного биохимического окисления важна для выхода семян из состояния покоя. Поэтому активация Г6ФДГ и АДГ в набухающих семенах после кратковременного облучения указывает на то, что УФ провоцирует запуск окислительных процессов на более ранних этапах набухания, способствуя выходу семян из состояния покоя.

Ограничивающим скорость звеном анаэробного дыхания является реокисление НАДФН и НАДН, необходимых для каталитического процесса Г6ФДГ и АДГ. Высокая активность ПО указывает на возможность участия фермента в окислении кофермекгов, способствуя, таким образом, протеканию ферментативного процесса с участием дегидрогеназ (Лебедева, Угарова, 1997).

Следует отметить, что воздействие УФ на более поздних этапах набухания, когда влажность уже достигла необходимого уровня, в результате чего активировались различные классы ферментов, приводит к снижению всхожести из-за инактивации ферментов семян с последующим их протеолгоом (Арчаков, Мохосоев, 1989).

Обычно семена не принято рассматривать в свете воздействия на них стресса, их состояние оценивается, как физиологическое равновесие, которое следует нарушать для того, чтобы они могли прорастать. С другой стороны, использование разнообразных средств и приемов, вызывающих стресс, д ля активации выхода семян из состояния покоя и повышения всхожести, несомненно, указывает на актуальность изучения физиолого-биохимических механизмов, происходящих в семенах в условиях стресса

Нами были отобраны сухие семена, облученные в течение даух и десяти часов. В качестве котродя использовали семена, не подвергавшиеся УФ облучению. Показано, что после УФ облучения в процессе набухания в семенах отмечается резкое возрастание содержание МДА, приводящее к компенсаторному накоплению низкомолекулярных АО. Так, поле двухчасового облучения в набухающих семенах резко повышается концентрация МДА с последующим снижением к 24 ч. Несколько иная динамика ПОЛ наблюдается в семенах, подвергнутых облучению в течение десяти часов. Интересно отметить, что длительное облучение семян приводит к интенсивной перокевдации липидов в период их набухания.

Биохимические исследования стресса показали, что в клетке под действием стрессора протекают ряд взаимосвязанных и каскадных процессов, которые служат пусковым звеном для включения цепи различных обменных реакций, предохраняющих клетку от патологических изменений. При действии УФ особое значение имеет активация ангиоксидантной системы как компенсаторного механизма защиты от повреждающего действия свободных радикалов. Окислительный стресс в семенах, вызванный двухчасовым УФ облучением, подавляется за счет имеющихся ангаоксвдангных ресурсов. Однако длительное воздействие стрессора приводит к резкому снижению активности системы ангиоксидантной защиты, что грозит нарушением регуляторных механизмов и снижением жизнеспособности семян. Кратковременное УФ облучение способствует активации прорастания семян, а также инициации синтеза физиологических регуляторов роста, обладающих аншоксцдангными свойствами.

Далее нами изучена динамика ПОЛ и содержание АО в проростках семян, подвергнутых УФ облучению в течение двух и десяти часов. Показано, что кратковременное облучение семян способствует активации ПОЛ и повышению АО в трехсуточных проростках. На седьмые сутки проращивания, за счет повышения АО, наблюдается снижение концентрации продуктов ПОЛ. В проростках, семена которых подвергались длительному облучению, резкий подъем концентрации АО в след за активацией ПОД сменяется снижением активности системы ангиоксидантной защиты. Длительное облучение семян приводит к нарушению прооксидангно-ангаоксидангного равновесия, приводящего к снижению всхожести и жизнеспособности семян. Кратковременное облучение активирует окислительные процессы на более ранних стадиях набухания, способствуя запуску программы прорастания семян.

3. Низкомолекулярные антиоксиданты - субстраты и регуляторы активности

пероксидазы

3.1. Низкомолекулярные антиоксиданты - субстраты растительных пероксидаз

Пероксидэза - наиболее распространенный фермент растений, выполняющий разнообразные фюиологические функции в клетках живых органшмов (Газарян, 1992, Карташова и др., 2000). Изучение особенностей реакций и механизма пероксидазного окисления биологически акпгвных веществ в условиях in viíro позволит нам разобраться в участии ПО в биохимических процессах и регуляции концентрации эндогенных соединений т vivo. Интерес в исследовании участия ангиоксидантов в пероксидазном катализе продиктован еще и тем, что низко- и высокомолекулярные АО входят в единую систему ангиоксидантной защиты живых организмов, однако об их взаимном влиянии очень мало д анных.

В работе показано, что аскорбиновая кислота является медленно окисляемым субстратом, в стационарных условиях начальная скорость пероксидазного окисления подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен. Интересно, что пероксидазное окисление аскорбиновой кислоты может сопровождаться

активированием ПО при ее концентрации (22-220 мкМ) и ингибированием фермента при концентрации АК (264-352 мкМ). Эффект активирования и ингибирования отмечался при всех изученных значениях рН (4,0-8,0).

Пероксидазное окисление АК зависит от числа молекул субстрата, взаимодействующих с окисленными формами фермента (Е! и Е2). При связывании двух и более молекул АК наблюдается активирование фермента. Однако связывание нескольких (6-9) молекул АК ингибирует пероксидазу. Связывание одной молекулы АК с Е! достаточно прочное, поскольку Кт1 составляет 6,1-11,5 мкМ, что соизмеримо с величинами констант связывания быстро окисляемого субстрата ПО о-дианизидина, у которого Кт при рН 3,7-7,0 составляет 11-20 мкМ. Дополнительное связывание других молекул АК в 40-50 раз хуже. Причем Кт связывания субстрата с окисленными формами фермента мало зависит от рН. Если с ферментом связываются более одной молекулы субстрата, то последующее каталитическое превращение АК улучшается. Количество связавшихся молекул, ингибирующих фермент, зависит от рН.

Следует отметить, что при окислении медленно окисляемых субстратов, таких как аскорбиновая кислота, в пероксидазных реакциях заложен сложный регуляторный механизм, имеющий биологическое значение. При связывании двух молекул АК процесс пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты будет ускоряться, а избыток аскорбиновой кислоты понижает каталитическую активность фермента. По-видимому, данный регуляторный механизм обеспечивает выполнение избирательной антиоксидантной функции пероксидазы в растениях.

Фенольные соединения - регуляторы роста, среди которых особой активностью отличаются гидрохинон, салициловая кислота, кверцетин, рутин, входящие в состав ингибигорнош комплекса Содержание производных фенолов возрастает в период покоя семян в меристематических тканях точек роста и снижается с его окончанием (Кефели, 1974). В зависимости от концентрации фенольные соединения оказывают либо ингибирующее, либо стимулирующее действие на рост и длительность покоя. Однако полностью механизм регуляторного действия данных соединений в покое и на начальных этапах прорастания семян недостаточно изучен.

Нами изучено индивидуальное пероксидазное окисление гидрохинона -классического фенольного ангиоксиданта в широком диапазоне рН и концентраций. Показано, что реакция пероксидазного окисления гидрохинона характеризуется высокими кса, (1220-2225 с"1), что позволяет отнести этот субстрат к группе быстро окисляемых субстратов ПО, таких как ОДН, у которого к^ при рН 3,7-7,0 составляет 6253540 с1. Величина К™ для гидрохинона достаточно низкая и составляет 150-650 мкМ в зависимости от рН, что по величине соизмеримо с константой Михаэлиса для ферроцианида калия. Однако это в 10 раз хуже, чем Кт у ОДН Кц, и к^ пероксидазного окисления гидрохинона мало зависят от рН. Оптимум каталитической активности фермента приходится на рН 4,5-5,5. Связывание 2-3 молекул субстрата с фермент-субстратным комплексом ингибирует ПО. Количество молекул гидрохинона, ингибирующих фермент, зависит от рН, что возможно, вызвано изменениями в протяженности субстратсвязывающего участка активного центра фермента, уменьшающегося в кислых рН. Индивидуальное окисление гидрохинона происходит без образования фермент-субстратного комплекса с полуокисленным субстратом. Данный механизм может наблюдаться в растениях для окисления различных регуляторов роста.

3.2. Совместное окисление антиоксидантов - регуляторный механизм с участием пероксидазы растений

В биологической системе для пероксидазы - фермента, обладающего широкой субстратной специфичностью, предпочтительно протекают реакции совместного окисления субстратов. Поэтому нами изучено совместное окисление двух антиоксидантов в присутствии пероксидазы: аскорбиновой кислоты - медленно окисляемого и гидрохинона - быстро окисляемого субстрата (табл. 12). При совместном окислении АК и ГХ, осуществляется упорядоченный процесс окисления субстратов, который определяет преимущественное окисление медленно окисляемого субстрата. Очередность задается тем, что связывание АК с окисленными формами ПО га два порядка лучше, чал гидрохинона.

Предварительное связывание АК в активном цегаре фермента улучшает в 28-420 раз последующее связывание молекул гидрохинона. Однако, связавшись, гидрохинон не оказывает влияние на связывание второй молекулы АК, что выражается в неконкурентном типе активирования. Присутствие гидрохинона в активном центре фермента способствует ускорению окисления молекул АК в 4-41 раз. Особенно этот эффект проявляется при рН 5,57,0. Оптимум активирования приходится на рН 6-7. Если в реакциях индивидуального окисления АК фермент ингибируеггся при рН 6-7 6-9 молекулами субстрата, то в реакциях совместного окисления АК и ГХ ингибирование ПО возможно двумя молекулами аскорбиновой кислоты.

Таблица 12 - Величины каталитических констант для индивидуального и совместного пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты и гидрохинона

рН Кщ(АК) к* к», Кга(ПО кса.С1 К,_мкМ Р. Р2 п п'

мкМ с1 с1 мкМ

4,0 420±30 - 25,0±2,2 340±20 1220±60 3,7±0,1 - 3,1±0,1 5 8

5,0 340±30 2,1±0,12 18,0±2,5 360±25 2210±210 6,7±0,2 3,2±0,2 9,2±0,5 7 8

5,5 170±15 1,9Н),11 6,8±0,3 340±18 2225±210 7,8±0,2 7,1 ±0,4 23,3±1,2 8 7

6,0 190±20 1,1±0,11 8,0±0,9 300±15 1910±150 10,7±0,3 11,5±0,5 34,8±2,5 2 6

7,0 270±25 1,1±0,1 3,7±0,1 150±10 1740±110 3,5±0,1 15,1±0,6 40,7±3,0 2 9

8,0 170±20 - 2,9±0,1 80±5 1520±100 0,19±0,02 - 3,7±0,2 8 9

Катализ для данного фермента определяется сродством его к субстрату (Chance, 1949), поэтому разные субстраты конкурируют между собой за фермент, и можно ожидать, что изменение каталитических характеристик приведет к накоплению или быстрому окислению биологически активных веществ. Поскольку глубина покоя зависит от концентрации ингибиторов роста и низкомолекулярных ангиоксвдангов, активность ПО оказывает непосредственное влияние на продолжительность этого физиологического состояния. Можно предположить, что в условиях in vivo совместное присутствие различных по структуре биологически активных соединений, играет определенную регуляторную роль.

3.3. Антиоксиданты - регуляторы активности пероксидазы растений

Природные ингибиторы роста, фото гормоны и аягаокеиданш, накапливающиеся в растительных тканях, способны выступать, с одной стороны, как координаторы ростовых процессов, снижающие активность фотогормонов, а с другой - как факторы покоя, подавляющие осенью процессы биологического окисления и роста.

Интерес к механизму действия ПО вызван еще и тем, что значительное накопление фенольных ангиоксидантов в период покоя, а также под действием стрессовых факторов, приводит к активации окисления ИУКс участием ПО и к торможению роста. В процессе оксидазного окисления ИУК образуются супероксид анион-радикал и катион-радикал ИУК, последний в кислой среде декарбоксилируется, превращаясь в радикал скатола (Сатапап & а1,1996; Савицкий и др., 1998). Предложено, что ПО способна одновременно связывать как перекись скатола, так и молекулу ИУК (Савицкий и др., 1998),

Исследование влияния ИУК на реакции пероксидазного окисления АК позволило установить, что ауксин ингибирует фермент по конкурентному типу при связывании в активном центре фермента одной молекулы аскорбиновой кислоты (рис. 2а). В реакциях пероксидазного окисления АК с участием двух и более молекул субстрата ИУК проявляла неконкурентный характер ингибирования (рис. 26). Связывание ИУК с пероксидазой в реакциях конкурентного ингибирования достаточно прочное и составляет

5.4-20,5 мкМ. В реакциях неконкурентного ингибирования ИУК связывается с пероксидазой в 3,2-10,2 раза лучше, чем связывание второй молекулы АК. При этом величины констант ингибирования в реакциях неконкурентного ингибирования при рН

4.5-7,0 для ИУК равны 27,3-34,6 мкМ. Известно, что в области связывания ароматических субстратов могут располагаться аминокислотные остатки: А^ 38, РЬе 142 и 143 (Савицкий и др., 1998). При этом место связывания ИУК может находиться в структуре субдомена ауксин-связывающего участка вблизи Тгр 117, который может принимать участие в связывании ИУК пероксидазами растений (Аммосова и .др., 1997).

1 /V, мин мкМ"1

0.6 т

-ОД -0,1

0,24

Х/АК, мкМ

1/у, мнн мкМ"1

Рис. 2 Зависимости обратных начальных скоростей пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты при рН 5,0 (а) и 7,0 (б) от ее концетрации при различных концентрациях индолил-3-уксусной кислоты: 0 (1), 5 (2), 10(3), 15мкМ(4);

а) пероксвдаза - 99 нМ, аскорбиновая кислота - 3,65-9,12 мкМ; б) пероксвдаза -142 нМ, аскорбиновая 0>04 кислота - 22,8-91,2 мкМ

1/АК, мкМ'

Таким образом, используя ИУК можно предположить, что участком связывания АК является дисгалъная область активного центра. Связывание ИУК в згой области при низких концентрациях субстрата создает конкуренцию за участок связывания, проявляемую в реакциях пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты, когда в активном центре фермента связывается, по крайней мере, одна молекула субстрата. При связывании двух и

-0,02

0,02

более молекул аскорбиновой кислоты с пероксидазой наблюдается ускорение реакции окисления АК, что, вызвано кооперативными взаимодействиями между участками связывания этих двух молекул субстрата.

Изучение реакций совместного пероксидазкого окисления ОДН, гидрохинона и ферроцианида калия в присутствии ИУК позволило установть, что ауксин ингибирует ПО в реакции окисления ОДН по конкурентному топу. В реакциях окисления гидрохинона при кислых значениях рН проявлялся неконкурентный характер ингибирования, переходящий при рН>6,5 в смешанный тип. Присутствие ауксина не влияло на пероксидазное окисление ФК.

Конкурентный тип ингибирования реакции пероксидазного окисления о-дианизидина ИУК позволяет предположить, что ОДН и ИУК связываются в одном и том же месте активного центра фермента. При этом связывание ИУК препятствует как связыванию, так и превращению ОДН, тогда как по отношению к гидрохинону тип ингибирования несколько другой. ИУК и гидрохинон связываются в различных местах активного центра, однако, если ИУК связывалась на поверхности фермента, то дальнейшее превращение гидрохинона становится невозможным.

Физиологический механизм торможения прорастания зародыша связан с высоким содержанием ИУК и ингибиторов роста. ИУК может регулировать пероксидазное окисление медленно окисляемого субстрата, имея специфичный участок связывания в-составе дисгального домена активного центра ПО. По-видимому, избирательность типов ингибирования пероксидазы ИУК обусловлена специализированностью ауксина служить оксидазным субстратом фермента. ИУК может изменять направленность реакций пероксидазы с одного типа на другой, меняя специфичность фермента с пероксидазного на оксидазный, превращая фермент в высокоспецифичную оксигеназу, генерирующую „ свободные радикалы, необходимость в которых может возникать у растений в процессе развития. Ауксин может выполнять роль "триггера" в реакциях окисления, катализируемых пероксидазой. Реализация действия ИУК, возможно, проявляется при выходе семян из состояния вынужденного покоя. В этот период в семенах резко возрастает активность ПО, которая способна активировать процессы прорастания. Возможным механизмом действия фермента в этих процессах может быть его способность к генерированию свободных рад икалов, необходимых для активизации механизмов прорастания.

Рис. 3. Зависимость начальной скорости пероксидазного окисле-ния о-дианизидина от его концентрации при различных концентрациях кверцетина, мкМ: 1 - 0, 2 - 24.8, 3 -49.6,4-74,0.

Концентрации: пероксидаза - 0,26 нМ; перекись водорода - 0,64 мМ; 0,1 М натрий-ацетатный буфер рН 5,5.

2 4 6

10 12

Флавоноид ные соединения интенсивно исследовались в течение послед них десятилетий (Гюкавкина, 1997; Стахова и др., 2001). В последние годы значительно возрос интерес к кверцетину как уникальному ангиоксидашу растительного происхождения. Кверцетин -субстрат пероксидазы, ингибировал фермент в реакции пероксидазного окисления ОДН по смешанному типу (рис. 3). Связываясь в активном центре фермента, кверцетин затруднял последующее связывание и превращение о-дианизидина. Смешанный тип ингибирования вызванконкуренцией двух субстратов ПО, один из которых является медленно окисляемым (кверцетин), а другой быстро окисляемым (о-дианизидин).

В экспериментах подробно был изучен механизм влияния низкомолекулярных регуляторов (салициловой кислоты, витамина К, стероидных ппсозидов) на окисление антиоксидаягов - субстратов пероксидазы. Сложность механизмов пероксидазного окисления субстратов позволяет предположить, что область активного центра фермента разделена на участки, в которых могут упорядочение связываться и превращаться субстраты. Связывание в регуляторном участке оказывает влияние на протекание каталитического процесса Последовательное связывание субстратов в этих участках создает условия дня управления ферментативным процессом, основанном на принципе корпоративного взаимодействия субстратов.

Одним из компонентов механизмов покоя является антиоксидантная система, поддерживающая жизнеспособность организма. Причем между компонентами системы просматривается взаимная зависимость. Низкомолекулярные анггиоксиданты - субстраты и регуляторы активности пероксидазы. В реакциях индивидуального окисления эти соединения чаще всего являются медленно окисляемыми субстратами, однако, при совместном окислении с быстро окисляемым субстратом, скорость их пероксидазного окисления может возрастать в 100 и более раз (Угарова, Лебедева, 1996). Пероксидаза осуществляет контроль над уровнем перекиси, восстанавливая ее до воды и при этом окислять низкомолркулярные антиоксидашы.

До сих пор являются спорными вопросы относительно эффектов активирования всхожести семян низкими концентрациями соединений и механизмы понижения их всхожести при использовании высоких концентраций веществ. На основании полученных данных можем предложить, что фермент является показателем протекания аэробных метаболических процессов в семенах, а его активность увеличивается при их прорастании. Понижение активности ПО служит критерием углубления покоя семян. Поэтому низкомолекулярные АО в высоких концентрациях понижая активность ПО, могут способствовать переключению аэробных метаболических процессов на анаэробные, что будет проявляться в углублении покоя семян и понижении всхожести. Низкие концентрации субстратов ПО при их совместном присутствии способны активировать фермент, увеличивая скорость протекания аэробных метаболических процессов, обеспечивая переход семян из покоя в активное состояние, увеличивая их энергию прорастания и всхожесть.

4. Влияние анти- и прооксидантов на всхожесть и физиолого-биохимические

процессы семян

Всхожесть семян - один из важнейших и надежных показателей их посевных качеств. Регуляторы роста и развитая растений - важный компонент современной технологии производства продукции растениеводства (Муромцев и др., 1987; Мельников, 1999; Прусакова, 1999; Шаповалова и др., 2003). В последние годы значительно возрос интерес к использованию для регуляции роста и развития растений соединений, обладающих

окислительными или антиоксидантными свойствами. Интересно, что АФК и АО как полифункциональные молекулы способны оказывать регуляторное действие на разнообразные процессы, протекающие в растениях.

4.1. Влияние низкомолекулярных антиоксидантов на всхожесть и

физиологические процессы семян пшеницы

Нами изучено влияние на всхожесть семян антиоксидантов различных по строению, являющихся субстратами гемсодержащей пероксвдазы. Обладая разным механизмом действия, они в малых концентрациях активировали прорастание семян, а в больших -понижали их всхожесть. При этом проявлялась индивидуальная чувствительность семян пшеницы к используемым соединениям. Низкие концентрации строфантина, аскорбиновой кислоты, норадреналина, салицилата натрия, хлорпромазина и этанола повышали всхожесть семян пшеницы на 15-20%. Тогда как высокие концентрации исследуемых соединений наоборот понижали их всхожесть.

По величине ингибирующего эффекта исследованные соединения можно расположить в следующем порядке: гидрохинон > хлорпромазин > дигоксин > салицилат натрия > этанол > норадреналин > строфантин > витамин К. На основании полученных результатов можно предложил, использовать семена пшеницы в качестве тест-объектов при исследовании токсичности различных соединений, используемых в сельском хозяйстве и ветеринарной медицине.

В зависимости от строения антиоксиданты могут регулировать протекание метаболических процессов, активировать или ингибировать различные ферменты, влиять на проницаемость мембран клеток. Нет сомнений в том, что наряду с участием в ингибировании действия свободных радикалов, антиоксиданты как соединения, относящиеся к различным классам химических веществ, могут по-разному оказывать существенное влияние на рост и развитие растений.

4.2. Действие аскорбиновой кислоты и гидрохинона на физиолого-

биохимические процессы семян

Для подтверждения этого предположения мы изучили влияние различных концентраций аскорбиновой кислоты и гидрохинона на всхожесть семян пшеницы, определяя в них содержание этих антиоксидантов и активность пероксвдазы. Показано, что набухание семян в течение 24 ч в растворах АК и ГХ различных концентраций приводит к понижению их всхожести при одновременном уменьшении активности пероксидазы, которая коррелирует с возрастанием содержания в семенах пшеницы АК и ГХ.

Установлена положительная корреляция между всхожестью семян и активностью ПО, которая находится в обратной зависимости от содержания АО в семенах пшеницы. Высокие экзогенные концентрации АК и ГХ могут ингибировать пероксидазу семян пшеницы, понижая их всхожесть.

Действие высоких концентраций АК и ГХ выражается в снижении всхожести семян пшеницы на 8-15%. Замачивание семян в 1 М растворе АК приводило к понижению активности пероксидазы в корнях и надземной части на 2-е сутки прорастания до 30 и 23%, на 3-й - 55 и 45%, на 4-е - 55 и 70%, а на 6-е - 62 и 87% соответственно. Набухание семян пшенииы в растворах 50 мМ гидрохинона снижало активность пероксидазы в корнях и надземной части пророспсов на 2-е сутки прорастания до 15 и 10%, на 3-й - 20 и 17%, на 4-е -27 и 19%, а на 6-е - 45 и 42% соответственно. Тогда как набухание семян

пшеницы в растворах низких концентраций АК и ГХ практически не влияло на активность пероксидазы в семенах.

Пероксидаза, алкогольдегидрогеназа и глюкозо-6-фосфатдещдрогеназа играют важную роль в покое и прорастании семян пшеницы. В прорастающих семенах активность пероксидазы возрастает, а активность АДГ снижается. У непроросших семян активность АДГ повышается в 2,5-5,5 раза, при понижении активности пероксидазы в 2,8-3,5 раза по сравнению с прорастающими семенами. Высокая разница в величинах активности ферментов указывает на разную степень их участия в механизмах прорастания семян пшеницы. Показано, что независимо от концентрации используемых антиоксидантов активность АДГ и Г6ФДГ в семенах практически не изменялась после 24 ч замачивания их в растворах АК и ГХ.

Выполненные исследования по изучению эндогенного содержания АК в сухих и набухших семенах подтверждают участие аскорбиновой кислоты в регулировании покоя. Показано, что АК в непроросших семенах пшеницы на протяжении всего срока прорастания сохраняется на высоком уровне, что в 1,5-1,8 раз выше, чем в сухих семенах. Отмечается явная тенденция к понижению содержания АК в проклюнувшихся семенах и в проростках пшеницы по сравнению с уровнем этого антиоксиданта в непроросших семенах. На четвертые сутки прорастания в надземной части и корнях проростков пшеницы уровень АК понижается в 4 раза. Эти изменения в содержании АК могут служить подтверждением участия эндогенных антиоксидантов в формировании механизмов покоя семян пшеницы.

Таким образом, понижение активности пероксидазы высокими концентрациями АО способствует углублению покоя семян, а активирование фермента - ускоренному их выходу из состояния покоя и быстрому прорастанию. Насыщая зерно регуляторами, можно добиваться повышения посевных качеств, а также сопротивляемости семян и растений к экзогенным неблагоприятным факторам. Обработка семян пшеницы биологически активными веществами в течение первых двух часов будет способствовать повышению их всхожести.

4.3. Влияние растительного гликозида на всхожесть и физиологические

процессы семян

Растительные гликозиды относятся к группе соединений, обладающих антиоксидантными свойствами (Кинтя, 1988; Волынец и др., 2003). Стимуляция роста и фитоиммунитета растений гликозидами позволяет рассматривать эти соединения как природные адаптогены (Васильева, Пасешниченко, 1999).

Замачивание и проращивание семян проводили в растворах строфантина 0,025 - 250 мкт/мл. Из опытов следует, что строфантин может избирательно влиять на всхожесть и рост вегетативной массы проростков. Высокие концентрации строфангана оказывают сильное угнетающее действие на всхожесть семян овса и караганы независимо от условий замачивания и проращивания. Тогда как эти же концентрации строфантина на семена ячменя Неван и пшеницы сортов Скороспелка и .Якугянка224 оказывают стимулирующее действие.

Малые дозы строфангана (2,5-0,025 мкг/мл) на семена всех видов оказывали преимущественно стимулирующее действие, повышая всхожесть на 15-30% и увеличивая вегетативную массу проростков. Причем следует отметить, что как ингибирующий, так и активирующий эффекты строфантина проявляются особенно сильно при предварительном замачивании семян в растворе. Для семян овса и караганы при замачивании и прорашивании в

растворе строфантов отмечается ингибируюший эффект, который аддитивно возрастает, если эти даа действия производятся последовательно. Активация всхожести семян малыми дозами профайлов наблюдалась, в основном, если семена проращивались в растворе.

Таким образом, действие строфантина в отношении семян специфично и избирательно в зависимости от вида растения. Накопление СГ в семенах ячменя и пшеницы может активировать скорость протекания метаболических процессов, способствуя выходу их ш состояния гипобиоза. Дня семян овса и караганы такое повышение гликозидов наоборот приводит к снижению уровня метаболизма и углублению покоя.

Следует отметить активирующее действие СГ на семена пшеницы Скороспелка с очень низкой всхожестью. Причем на эти семена как малые, так и высокие дозы строфанта преимущественно оказывают активирующее действие. Выраженность и индивидуальность действия строфантна свидетельствует о том, что он может проникать в с»юв и проростки, актвируя их всхожесть и рост. Однако в структуре СГ содержится агаиконовая часть, гидрофобностъ которой затрудняет проницаемость гликозидов через мембраны. Проницаемость СГ мы изучали на семенах ячменя и пшеницы Якутянка 224, которые замачивали в течение 24 ч в растворах 0,0025 - 0,25 мг/мл строфантина. СГ очень слабо проникает в семена, поэтому действующий эффект можно объяснить за счет наличия на мембранах определенного количества специфичных рецепторов связывание с которыми регулирует интенсивность метаболических процессов в клетках, а это в свою очередь обеспечивает выход из покоя семян или углубление их гипобиотического состояния.

4.4. Участие аскорбиновой кислоты и растительных гликозидов в формировании гипобиотического состояния семян

Состояние гипобиоза семян поддерживается за счет разнообразных регулягорных механизмов, участие в которых принимают различные физиологически активные соединения (Кефели, 1997; Николаева, 1999). Установлено, что содержание СГиАКв семенах различных растений сильно колеблется. Резкое понижение стероидных гликозидов в семе! их зимой, когда наблюдается углубление состояние гипобиоза, при незначительном понижении аскорбиновой кислоты, может свидетельствовать о различной их роли. Аскорбиновая кислота является сырьевым соединением клеток, то есть расходуется во время протекания метаболшеских процессов, сильное понижение ее концентрации в семенах может щжвесга к снижению окислительно-восстановительного потенциала птобиопгической системы, вследствие чего семенам будет трудно выйти из покоя весной и это способствует углублению вынужденного покоя. Гликозиды вместе с фигогормонами служат регушпорными веществами, влияющими на процессы деления и роста клеток. Понижение их концентрации будет способствовать углублению покоя. Действие гликозидов осуществляется через рецепторы клеток, поэтому при выходе из вынужденного покоя семе! им достаточно малых концентраций этих соединений. Значительное понижение концентрации СГ в семенах зимой является необходимым условием поддержания покоя.

Проведенное изучение содержания аскорбиновой кислоты и гликозидов у различных видов растений позволило установить, что содержание аскорбиновой кислоты в различных частях растений распределяется равномерно. Гликозиды, в основном накапливаются в плодах, листьях, цветках и очень незначительно в корневой системе. Неравномерное распределение этих функционально активных соединений в различных органах растений вызвано их несколько различной биологической ролью. По-видимому, стероидные гликозиды преимущественно

выполняют ретуляторную роль, поэтому их накопление происходит, в активно вегетируюшйх частях растения. Аскорбиновая кислота распределяется равномерно, выполняя функций пластического материала.

Таблица.13 - Содержание- аскорбиновой кислоты и гликозидов в семенах, находящихсяв различных физиологических состояниях

Семена Время Всхожесть, Состояние семян Содержание, мг/ЮОг

прорастания,, сут % ;. - АК -СГ

контроль - сухие 15,2*23., , 0Д8±0,01

1, - набухшие. 24,8*3,0 0,28*0,02

: гч " . - 2 73 проросшие 22,4*3,1 0,28*0,02

■ и ' • непроросшие 26,4*2,8 0,18*0,01

£ 3 86 проросшие без ростков 19,2*1,5 0,46*0,03

К. проросшие с ростками 15,2*1,5 0,93*0,03

в; <я • ЕГ *'. К_ корни 3,8*0,5 0,46*0,03

непроросшие 26,8*33 0,20*0,01

я . о . 4 86 проросшие без ростков 8,0*1,6 0,55*0,02

В С -' проросшие с ростками 4,0*0,8 0,65*0,03

корни 3,6±0,4 037*0,01

непроросшие 23,6±3,0 0,21*0,01

контроль - сухие 14,2*0,1 037*0,01

1 . набухшие 12,8*2,0 1,12*0,1

2 - - 58 проросшие 15,2*2,0 2,12*0,2

§ ю и непроросшие 20,8*2,1 0,92*0,1

3 66 проросшие без ростков 25,2*2,2 1,12*0,1

а проросшие с ростками 11,2*1,1 0,65*0,02

я и корни 3,8*03 0,46*0,01

X. а*.. непроросшие 23,2±3,0 1,02*0,1

4' 68 проросшие без ростков 18,4±1,1 0,84*0,02

проросшие с ростками 8,0*1,2 0,84*0,02

корни 10,4±1,1 0,46*0,01

непроросшие 19,2*1,4 0,65*0,02

со контроль 91 сухие1 3,8*0,4 0,20*0,01

а « « а 2 непроросшие 3,2*0,2 1,02*0,1

8 - 10 69 проросшие без ростков 19,2*1,7 130ШД

. 20 - - 86,4 непроросшие 5,6*0,7 0,80*0,03

30 90 непроросшие 2,8*0,2 0,65*0,01

Нами было изучено содержаниеСГ и ДК в набухших и проросших семенах ячменя, пшенипы и красоднева желтого (табл. 13). Замачивание семян в воде в течение суток приводит к возрастанию СГ в 0,5-5,0 раза, а содержание АК наоборот может понижаться. На 3-4 день проращивания в зеленых проростках содержание СГ возрастает в 4 - 5 раз, а в корнях в 2^5-3,0 раза. В непроросших семенах концентрация стероидах гликозидов может колебаться, но в целом всегда имеет тенденцию к понижению. Так, например, у оемян красод нева желтого в первые 10 д ней проращивания в непроросших семенах отмечено возрастам«; содержания СГ * АК в 5,0-6,5 раза. Од нако уже через 30 дней эти показатели у непроросших семян снижаются вд уровня контроля.

Таким образом, - возрастание содержания СГ всегда отмечается при активации ростовых процессов в семенах, а их понижение связано с углублением гипобиотического состояния. Высокое содержание АК в покоящихся семенах обусловлено их низкой метаболической активностью.

4.5. Влияние перекиси водорода на всхожесть и физиолого-биохимические

процессы семян

В настоящее время активно рассматривается представление о том, что АФК и продукты ПОЛ могут выполнять мессенджерную функцию в трансдукции гормонального сигнала, а также оказывать влияние на синтез и метаболизм фитогормонов и регуляторов роста растений (Chen, 1993; Ederli, 1997; Шорнинг и др., 2000; Pei et al., 2000).

Перекись водорода - один из регуляторов, применяемых для обеззараживания и стимуляции прорастания семян высших растений. Будучи слабым окислителем Н202 способна мигрировать через мембраны клетки, а также превращаться в более реакционные формы кислорода (Зенков, Меньшикова, 1993). Сам факт того, что основным местом продукции АФК в семенах являются митохондрии (Мерзляк, 1989), указывает на взаимосвязь свободно-радикальных процессов с процессами дыхания и прорастания семян.

Наибольший процент проросших семян отмечен при 24 ч замачивании в 1%-ном растворе перекиси водорода. Известно, что динамика проникновения воды и растворенных в ней веществ имеет колебательный характер, поэтому мы проследили зависимость всхожести семян от продолжительности замачивания их в 1%-ом растворе перекиси водорода. Наибольший процент проросших семян был отмечен при замачивании их в течение первых шести часов.

Таблица 14 - Изменение антиоксидантно-прооксидантного статуса в зародышах при замачивании семян ячменя сорта Одесский 115 в перекиси водорода

Набуха Супероксид, МДА, АО, сод КАТ, по,

-дае, ч мкМ/г мкМ/г мкг/г еджгк мМ/мин г мкМ/мин г

I П I П I П I П I П I П

2 0,055 0,17 0,035 0,040 85,2 80,4 1Д 1,4 0,22 0,41 24,5 31Д

4 0,064 2,14 0,067 0,077 92,4 88,5 1,5 2Д 0^30 0,48 223 413

6 1,70 3,25 0,071 0,082 98,1 115,3 2,0 3,6 0,32 0,51 47,2 38,1

8 3,44 5,31 0,075 0,083 120,4 165,1 1,8 2,0 0,28 0,57 42^ 35,4

10 3,21 5,52 0,073 0,091 118,1 171,5 1,5 2,7 0,35 ОД) 47,4 463

12 3,57 6,11 0,078 0,084 157,5 173,4 2,8 4,0 0,46 0,61 49,2 51,2

14 4,13 5,72 0,086 0,097 183,4 180,4 3,2 4Д 0,40 0,65 51,0 55,2

16 5,22 6,42 0,084 0,100 180,1 175,7 3,0 5,1 0,57 0,76 573 60,0

18 5,71 6,64 0,095 0,121 187,5 182,7 4,5 5,6 0,72 1,13 60,0 58,1

20 6,00 6,51 0,111 0,120 202,7 201,6 6,2 7,0 1,23 1,61 57,5 62Д

24 6ДЗ 6,72 0,141 0,144 221,4 210,2 8,5 7,7 1,48 230 65,2 60,4

Примечание I - замачивание семян проводили в воде; П-в 1%ом растворе перекиси водорода.

Резкое возрастание количества супероксида в зародыше отмечено в первые 8 ч набухания в растворе перекиси водорода (табл, 14). Затем его содержание повышалось незначительно. Возможно, сдерживающим элементом оказывались низкомолекулярные антиоксид анты, концентрация которых возрастала по мере активации гидролитических

ферментов. Динамика содержания супероксида в первые часы замачивания коррелирует с увеличением концентрации МДА и активацией антиоксидантных ферментов.

По-видимому, усиление генерации АФК и активации ПОЛ - один из механизмов активации метаболических процессов при выходе семян из покоя. Кроме того, АФК обладают способностью изменять проницаемость и фшико-химические свойства мембран, что способствует более эффективному проникновению воды и вымыванию ингибиторов роста. Интересно отметшь, что повышение продукции супероксида коррелирует с достижением необходимой влажности зародыша, когда активируются оксидазные окислительные процессы, выступающие дополнительным источником АФК.

Высокая активность СОД отмечена только после 12 ч набухания, что объясняется недостаточной оводнешюсгью зародыша в первые часы набухания. Повышение активности каталазы в первые часы набухания в растворе перекиси водорода приводило к дополнительному снабжению зародьпна кислородом, образующимся в ходе реакции. Возрастание активности ПО обусловлено ее участием в процессах пероксидазного окисления ингибиторов роста. Возможно, участие перекиси и пероксцдазы в совместном окислении ингибиторов и дыхательных коферменгов - один из механизмов активации биохимических процессов при прорастании семян растений.

При изучении динамики активности основного фермента пештофосфапюго пути - Г6ФДГ, для которого необходим коферменг НАДФ+, оказалось, что замачивание семян в Н2О2 цриводиг к изменению периодичности возрастания его активности в зародыше со сд вигом экстремумов в более раннее время. Колебательное снижение акшвносги Г6ФДГ после 8 ч 1ибухания объясняется повышением аэрации зародыша и активацией мигохоцприальных ферментов.

Традиционно АФК рассматривались как токсичные побочные продукты аэробного метаболизма, приводящие к инактивации биомолекул и нарушению протекания фюиолого-биохимических процессов в клетке. Однако в последние года появились экспериментальные данные, указывающие на положительные функции АФК, в том числе сигнальную роль в контроле апоптоза (Бакиева и др., 2001), а также защитную в условиях биотического и абиотического стресса (Аверьянов, 1991). АФК являются мощным вторичным мессендасером регуляции дифференцировки пластвд и аппарата Гольджи, клеточной дифференцировки, роста и развитая растений (Шорнинг и др., 2000; Минибаева, 2004).

Таким образом, активные формы кислорода, обладающие высокой энергетической способностью и свободно мигрирующие в клетке, принимают непосредственное участие в начальных этапах прорастания семян, находящихся в физиологическом покое. Активации окислительных процессов при набухании семян, приводящих к образованию активных кислородных метаболитов, дает возможность выявить механизм участия анти- и прооксидантной системы при прорастании семян растений.

5. Перспективы применения антиоксидантов в производстве солода 5.1. Антиоксиданты как показатель оценки качества зерна и биохимических процессов при производстве солода

В последнее время среди аналитических методов, используемых для определения качественных показателей пивоваренного ячменя, солода и производимых го них продуктов, все большей популярностью пользуются специальные методы исследования (Вакербауер, Хардг, 1997; Сфижаков, 2006). Нами исследовано содержание нюкомолекулярных ангиоксвдантов и продуктов перекисного окисления липицов в зерновках ячменя, отвечающего требованиям ГОСТ 5060-86, и ячменя с низкой способностью прорастать (табл. 15).

Таблица 15 - Состояние антиоксидантной системы и интенсивность перекисного окисления липидов в ячмене с различной всхожестью Одесский 115

Солодора- Непроросшие Проросшие

щение, МДА, АО, по, МДА, АО, ПО,

сут мкМ/г с.в. мкг/г с.в. мкМ/ми мкМ/г с.в. мкг/г с.в. мкМ/мнн

н г с.в. г с.в.

1 0,057*0,02 227*5,6 0,171*0,01 182,1*8,1 12,8*1,0

2 0,060*0,03 230*5,1 2,4*0,1 0,184*0,02 208,3*10,1 25,4±1Д

3 0,061*0,02 202*6,2 2,1*0,1 0,153*0,01 207,6*10,0 32,4*1,3

4 0,053*0,01 200±3,4 2,5*0,2 0,177*0,01 212,4*9,4 17,0*1,1

5 0,065*0,02 185±ЗД 1,8*0,1 0,164*0,02 201,6*6,7 28,2*2,1

6 0,066*0,02 166±2,8 3,1±03 0,185*0,01 194,1*6,7 32,1*23

7 0,061*0,01 133*3,7 3,340,1 ОД) 1*0,03 154,2*5,6 35,4*3,0

Установлено, что семена непроросшие в течение всего периода солодоращгния, имели низкую активность пероксидазы и высокое содержание низкомолекулярных АО. Небольшое снижение концешрации АО в непроросших семенах можно объяснить их частичным вымыванием и расходованием на окислительные процессы. Содержание МДА в прорастающих семенах значительно выше, чем в непроросшем ячмене. Следует отметить, что непроросшие семена проявляли положительную реакцию при исследовании их на жизнеспособность тегразолево-топографическим методом. В непроросших семенах дыхание крайне ослаблено, отмечались изменения в составе жирных кислот и функционально активных веществ мембран митохоцприальной системы (Соболев, Жданова, 1982), за счет которых обеспечивается разобщение механизмов окислительного фосфор илирования, при сохранении активности окислительных процессов (Скулачев, 1996).

Снижение концентрации нюкомолекулярных АО на начальных этапах набухания указывает на то, что АО используются семенами в качестве запасного пула, позволяющего сдерживать свободно-радикальные процессы на физиологическом уровне. Сравнивая значения ПОЛ и АО в прорастающих семенах ячменя видно, что при активации метаболизма и ростовых процессов повышается уровень продуктов перекисного окисления липидов и нюкомолекулярных акгаокеидантов. Набухание и прорастание семян сопровождается активированием ПОЛ, изменением в составе анпюксидангов и повышением активности пероксидазы. Повышение концентрации низкомолекулярных АО на 2 и 4 сутки щюрасгания объясняется активацией гидролитических процессов, выступающих в качестве поставщиков пластичного материала и соединений-ашиоксвдангов.

В прорастающих семенах происходит переключение дегидрогеназных реакций на аэробные, которые могут осуществляться с помощью эндогенных функционально активных веществ. Следует выделить ряд особенностей в проявлении активности пероксидазы в покоящихся и прорастающих семенах. Так, например, в зерновках, обладающих высокой способностью к прорастанию, выявляется высокая активность ПО, коррелирующая с уровнем их жизнеспособности. Низкая активность фермента свидетельствует о понижении жизнеспособности и всхожести семян.

Среди технологических методов оценки качества сырья и готовой продукции биохимические метода имеют приоритетное значение потому, что они позволяют выявил» изменения до того, как происходят морфологические и даже функциональны нарушения. Таким образом, активность ангаоксцдантной системы может быть использована как дополнительный критерий оценки качества зерна

53. Изменение активности антиоксйдантаой системы и процессов перекисного ' окисления ли пидов при производстве светлого пивоваренного солода ,

Незначительное количество работ посвящено фюиолого-биохимическим процессам семян в производственных условиях, которые имеют свои технологические особенности (Савчук; 2003). Нет никакого сомнения в том, что технологические условия проращивания вызываюгв семенах существенные физиологические и биохимические изменения.

Солод - основной поставщик антиоксидантов в пиво, поэтому исследовали динамику активности антиоксидантной системы и интенсивность ПОЛ в ячмене при производстве светлого пивоваренного солода. Технологические показатели качества ячменя ; (сорта Дворан, Сигнал, Гонар, Ача и Одесский 115) и светлого солода оценивкли согласно ГОСТ 5060-86, ГОСТ 29294-92 и общепринятым методикам

Установлено, что, несмотря' на все многообразие физиологических реакций растительного организма на различные типы стрессовых воздействий, в своей основе они являются достаточно сходными между собой, что позволяет предположить наличие общих принц ипов и механизмов адаптации.

В производственных условиях проводили замачивание зерна в непрерывном потоке воды и воздуха. Следует отметить, что низкая температура замачивания (14 °С), а также снабжение кислородом, приводит к возрастанию окислительных процессов в клетке и образованию продуктов ПОЛ. Содержание МДА при набухании возрастает в первые 24 ч замачивания, а затем постепенно снижается. Пик повышения концентрации низкомолекулярных антиоксидантов в ячмене приходится на 36 часов набухания. Во-первых, это обусловлено растворением фенольных ингибиторов роста; во-вторых, активацией гидролитических процессов, в ходе которых образуются аминокислоты и углеводы, обладающие актиоксидантными свойствами.

Акгавность СОД постепенно повышается в течение всего времени набухания ячменя. Динамика, активности ферментов, утилизирующих перекись водорода, - КАТ и ПО постепенно возрастает в течение всего периода замачивания. Возможно, возрастание акгавносга этих ферментов обусловлено участием в окислении энергетических соед инений и ингибиторов роста, накопление которых наблюдается во время покоя семян. Возрастание активности ГР и последующее постепенное ее снижение в процессе замачивания объясняется тем, что для катализа этому фермешу необходим коферменг НАДФН, содержание которого снижется при возрастании аэробных процессов.

Проращивание ячменя проводили в ящичной солодовне, используя для перемешивания ковшовый ворошитель. При солодоращении ячменя содержание МДА в зерновке резко возрастает на 5-е и 8-е сутки проращивания. С целью снижения потерь на дыхание и ростовые процессы солодоращение ведут при слабом освещении, пониженной температуре и высокой влажности. № этого можно заключить, что гамедленнкй рост й отсутствие освещения не способствует образованию низкомолекулярных АО с участием фотосинтетического аппарата проростка. Поэтому возрастание в зерновке концешрации низкомолекулярных АО на 2-3-е и в гусарах на 4-е сутки с постепенным снижением, объясняется накоплением низкомолекулярных соединений, образующихся в процессе биодеградации белков, полисахаридов и нипидов (Тарчевский, 1992). '

Динамика активности СОД в гусарах и зерновке шсгепенно повышается в первые 4 пня. Причем более высокие показатели активности ферментов отмечались в гусарах. ¡Сатапаза содержится в ячмене в незначительном количестве, но быстро накашшваггтеяпри

проращивании, причем скорость накопления явно зависит от длительности солодоращения. Активность КАТ возрастает меньше по сравнению с активностью пероксидазы, так как сродство фермента к малым концентрациям перекиси водорода ниже, чем у пероксидазы (Андреева, 1988). Постепенное снижение активности ГР в зерновке и гусарах можно объяснить преобладанием аэробных процессов над анаэробными, в процессе чего, снижается концентрация НАДФН в клетке.

Сушка солода - важный технологический этап производства, позволяющий снизить влажность, придать специфический аромат, вкус и цвет солоду (Хорунжина, 1999). Сушку проводили в производственных условиях по режиму JICXA. Показано, что на начальных этапах сушки наблюдается возрастание активности ангаоксидантых ферментов с последующим ее снижением (табл. 16). Следует отметить, что ферменты обладают различной термоустойчивостью. Наибольшая активность при сушке сохраняется у ПО, в молекуле которой находятся два иона кальция, придающие ей стабильность (Угарова, Лебедева, 1996). Инактивация ГР начинается уже при 55 °С. Возможно, это обусловлено тем, что в активном центре данного фермента содержатся SH-группьг, окисление которых приводит к инактивации (Smith, 1989).

Таблица 16 - Активность антиоксидантной системы и содержание продуктов перекисного окисления липидов при сушке солода

Температура,0 СОД КАТ, ПО, ГР, АО, МДА,

С едактУг мМ/минг мкМ/мин.г мкМ/минг мкг/г мкМ/г

18 31±3,2 03&±Д02 45,1±2,1 0,55*0,03 350,4±11 0,19*0,01

55 34±3,0 0,44±0,02 83Д±33 0,07±0,001 410,1±10 0,17±0,01

80 30±3,0 0,18±0,01 72,7±5,1 0 400,8±12 0ДЗ±0,С)2

85 0 0 36,240 0 0Д4±0,02

При сравнении динамики накопления низкомолекулярных АО и МДА обращает на себя внимание тот факт, что при подсушивании наблюдается снижение концентрации МДА на фоне возрастания концентрации ангиоксидантов. Возможно, повышение концентрации ангиоксидантов обусловлено активацией гидролитических ферментов, в результате чего образуются соединения, обладающие антиоксидантной активностью.

Свежий солод, поступающий из сушки, обычно не используется сразу в пивоваренном производстве, так как имеет влажность, недостаточную для эффективного дробления. При хранении солода происходят физические и химические изменения, облегчающие его последующую переработку. Кроме того, часть ферментов еще не восстановилась после тепловой обработки.

Нами установлено, что в первые четыре месяца хранения содержание антиоксидангов возрастает на 12-16 % по сравнению с исходным значением. Повышение концентрации АО при хранении солода обусловлено впитыванием влаги из окружающей среды и небольшой активацией гидролитических ферментов. Хранение солода в течение десяти месяцев не приводило к существенным изменениям концентрации. Достоверное понижение содержания ангиоксидантов на 27-34 % наблюдалось после годичного хранения солода.

Проведенные исследования указывают на то, что анти- и прооксидантное равновесие является биохимическим показателем технологического процесса производства пивоваренного солода.

5.3. Содержание антиоксидантов в отходах солодовенного производства и перспективы их использования

При производстве солода и пива неизбежно образуются отходы, которые благодаря своим технологическим и химическим свойствам широко используются в различных отраслях промышленности и сельском хозяйстве. Эффективное использование сырья и материалов - важнейшее направление промышленной экологии и биотехнологии (Колпакчи, 1986).

Из таблицы 17 видно, что наибольшее содержание антиоксидантов наблюдается в солодовых ростках (225,2 мкг/г) и хмелевой дробине (307,4 мкг/г). Высокое содержание антиоксидантов в ростках объясняется их сложным химическим составом, включающим в себя аминокислоты, фенольные соединения и витамины, которые входят в группу природных антиоксидантов. Следует также отметить, что при проращивании активируются синтетические процессы, приводящие к образованию разнообразных соединений, обладающих антиоксидантной активностью.

Таблица 17 - Содержание низкомолекулярных антиоксидантов в отходах солодовенного и пивоваренного производства

Отходы производства Концентрация антиоксидантов, мкг/г

Зерновые отходы 48,5±2,2

Солодовые ростки 225,2±4,7

Пивная дробина 211,6±4,0

Хмелевая дробина 307,4±10,1

Хмель как источник горьких и ароматических веществ придает пиву специфический вкус и аромат, увеличивает его стойкость при хранении, способствует лучшему осветлению пива и образованию пены. По сравнению с веществами солода полифенолы хмеля обладают высокой восстановительной и антиоксидантной активностью (Мойр, 1997). Низкая концентрация антиоксидантов в зерновых отходах объясняется пониженной метаболической активностью, а также отсутствием гидролиза запасных веществ, приводящего к высвобождению связанных антиоксидантов. Отходы пивоварения - пивная дробина и остаточные пивные дрожжи характеризуются низким содержанием антиоксидантов. Пивная дробина получается на стадии фильтрования осахареиного пивного затора, когда максимально возможное количество экстрактивных веществ-ангиоксидантов, содержащихся в заторе, перешло в пивное сусло.

Известно, что снижение жизнеспособности зерна и старение пива связано с появлением свободных радикалов, обладающих высокой реакционной способностью. Радикалы реагируют с компонентами сусла и пива с образованием окисленных соединений, некоторые из которых влияют на качество конечного продукта. В настоящее время потребность использования АО в пивоварении возросла в связи с увеличением сроков хранения пива в торговой сети, причем не всегда в оптимальных условиях (Щавел и др., 1998). В последние годы встречаются публикации, посвященные применению растительных экстрактов для регуляции прорастания сельскохозяйственных растений и солодоращения зерновых культур (Колпакчи, 1998; Рой, Мухин, 2003).

Результаты эксперимента указывают на то, что замачивание ячменя в течение первых 6-8 ч в экстрактах солодовых ростков приводит к повышению способности прорастать. Проведенные исследования показали, что замачивание зерна в экстрактах в первые 6-8 ч

набухания повышают активность дегидрогеназ в 12, пероксидазу - 1.3 раза по сравнению с контролем. Наблюдаемое повышение всхожести и активности дыхательных ферментов объясняется тем, что биологически активные вещества солодовых ростов активируют метаболические процессы на начальных этапах набухания зерна, выступая в качестве природных стимуляторов роста. Таким образом, использование экстрактов из солодовых ростков позволит снизить производственные потери сухих веществ, а также сократить время проращивания пивоваренного ячменя.

Солодоращение ячменя неизбежно сопровождается повышением дыхания и ростовых процессов, приводящих к потере питательных веществ и снижению качества готовой продукции (Хорунжина, 1999). Нами проведено пререзамачивание в течение двух часов трехсуточного солода в экстрактах хмеля с последующим помещением его в растильную камеру для дальнейшего солодоращения. Установлено, что такая обработка солода приводит к снижению протекания ПОЛ по сравнению с контролем. От качества пивоваренного солода зависит наличие компонентов в пиве (липидов, хинонов), приводящих к старению, или вещесгв-антиоксидантов, защищающих сусло и пиво от окисления (аскорбиновая кислота, полифенолы и др.) (Горячева, 2004). Следует отметить, что фенольные соединения способны оказывать ингибирующее действие на дыхательные и ростовые процессы.

Предложена принципиальная схема использования отходов солодовенного и пивоваренного производства при солодоращении пивоваренного ячменя. Согласно схеме экстракт из солодовых ростков, содержащий эндогенные стимуляторы роста, целесообразнее использовать при замачивании пивоваренного ячменя с целью повышения прорастаемости зерна и сокращения потерь сухих веществ. Экстракт из хмелевой дробины как источник фенольных антиоксидангов эффективнее использовать после трех суток ^ солодоращения для снижения дыхательных и ростовых процессов.

Таким образом, отходы солодовенного и пивоваренного производства могут рассматриваться как перспективный и доступный источник природных АО и БАВ, регулирующих окислительные процессы при производстве солода и пива.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Фгоиолого-биохимические исследования покоя и прорастания семян предоставляют возможность оценил, пластичность метаболизма семян, а также позволяют прогнозировал, жизнеспособность, посевные и технологические качества зерна. Одной из причин гибели семян в результате неправильного хранения являются необратимые изменения в клеточных мембранах, инактивация ферментов и снижение активности антиоксидаягной системы защиты растений Следствием нарушения целостности мембран является повышение активности протеолипяеских ферментов зерна под воздействием стресса.

Сдвиг равновесия в сторону прооксидангов является наиболее информативным показателем для оценки степени влияния различных факторов на организм. В то же время активация ПОЛ представляет собой одно ю первых неспецифических звеньев в общей стресс-реакции организма и может инициировать включение других механизмов защиты. Состояние антиоксидашно-прооксидантнош равновесия можно рассматривал, как показатель жизнеспособности семян и устойчивости их к условиям окружающей среды.

Покой характеризуется низкой метаболической активностью семян. Состояние покоя характеризуется снижением оводненности клеток, накоплением ингибиторов роста и ненасыщенных жирных кислот, которые в период гипобиоза разобщают процессы окислительного

фосфорилирования. Компоненты ангаоксвдангаой системы обеспечивают жизнеспособность семян и продолжительность состояния покоя, а при создании благоприятных условий активируют механизм выхода из состояния пшобиоза.

Прорастание - процесс перехода семян от состояния покоя к интенсивной жизнедеятельности. В условиях ограниченного снабжения кислородом, которое имеет место в первые часы набухания семян, активация ПФП стимулирует выход из покоя. Ограничивающим скорость звеньев ПФП является реокисление НАДФН, окисленная форма которого является основном акцептором электронов на этом пути. Пероксидаза - фермент, активность которого проявляется в первые часы набухания, способный катализировать окисление физиологически активных соединений (НАДФН, НАДН, фитогормоны, ингибитор роста).

Набухание и прорастание семян сопровождается активированием ПОД изменением в составе антиоксидангов и повышением активности пероксидазы. У непроросших семян отмечается повышение содержания антиоксидангов, при пониженном уровне ПОЛ и пероксидазной активности. В прорастающих семенах происходит переключение дегидрогеназных реакций на аэробные, которые могут осуществляться с помощью эндогенных функционально активных веществ.

Для повышения всхожести и стимуляции семян нами использованы разнообразные способы воздействия (низкая температура, ультрафиолет, окислители, аэрация и др.), направленные на изменения физиологического состояния зародыша. Кратковременное воздействие оказывает стимулирующее влияние на окислительные процессы и ангиоксидантный статус зародыша, приводя к запуску программы прорастания семян.

АФК - нормальные метаболиты живых органщмов, принимающие участие в запуске процессов прорастания семян растений. Физиолого-биохимический механизм, запускающий метаболические процессы прорастания, заключается в регуляции окислительных реакций и изменении физико-химических свойств мембран. Окислительный стресс, вызванный действием на семена различных физических или химических факторов, приводит к активации оксидоредукгаз и перекисного окисления липидов мембран.

ПОЛ способствует повышению проницаемости для воды и кислорода, вымыванию фенольных ингибиторов роста, а также запуску активной работы мигохонариалыюго аппарата. Фермент, в свою очередь, создают определенный баланс энергии и эндогенных регуляторов роста, необходимый для прорастания. При длительном и сильном стрессе в избыточных концентрациях АФК приводят к нарушению процессов транспорта, роста и жизнеспособности.

Состояние гипобиоза семян поддерживается за счет разнообразных регулягорных механизмов, участие в которых принимает ангиоксвдантная система. Приведенные данные позволяют предложил, двойную роль низкомолекулярных АО - субстратов и регуляторов пероксидазы. В период покоя семян, АО в больших концентрациях действуют как ингибиторы, а в малых в сочетании с другими субстратами - как стимуляторы прорастания.

Пероксидаза - ангиоксидантный фермент осуществляет контроль над уровнем перекиси, восстанавливая ее до воды, и, при этом, окисляя биологически активные соединения и низкомолекулярные ангиоксиданты. В круг пероксидазных субстратов фермента входят различные биологически активные вещества и ангиоксидашы, которые в реакциях индивидуального окисления чаще всего являются медленно окисляемыми субстратами. При совместном окислении с быстро окисляемым субстратом скорость пероксидазного окисления этих соединений может значительно возрастать. В процессе каталитической реакции могут образовываться свободные радикалы, которые в начальный момент прорастания семян,

способны инициировать реакции свободно-радикального окисления, активируя при этом процессы ПОЛ. Вслед за этими процессами в семенах возрастает дыхание, повышается общий уровень метаболизма, что проявляется в ускоренном грорастании семян, активно выход ящих из состояния покоя.

Технологические условия проращивания вызывают в зерновках существенные физиологические и биохимические изменения. Следует отметить, что путем правильного регулирования влажности, температуры, поступления кислорода и длительности проращивания можно в определенных пределах управлять биологическими процессами.

ВЫВОДЫ

1. Гипобиотическое состояние семян в условиях естественного хранения сопровождается низкой активностью окислительных процессов и антиоксиданпной системы. Длительное хранение семян зерновых культур приводит к снижению жизнеспособности, всхожести и активности оксвдоредуктаз на фоне повышения продуктов перекисного окисления липидов. Естественное старение семян сопровождается снижением активности антиоксидантной системы.

2. Неблагоприятные условия хранения способствуют накоплению продуктов перекисного окисления липидов и активации антиоксидантной системы защиты. Снижение жизнеспособности и всхожести семян коррелирует с понижением активности антиоксидантной системы и накоплением продуктов перекисного окисления липидов.

3. Набухание и прорастание семян зерновых культур сопровождается активацией анаэробных дегидрогеназ и ферментов антиоксидантной системы на фоне накопления продуктов перекисного окисления липидов. Содержание низкомолекулярных антиоксидангов в непроросших семенах на протяжении всего срока прорастания сохранялось на достаточно высоком уровне на фоне низкой активности окислительных процессов. При этом пероксидаза необходима для сохранения жизнеспособности семян и инициирования процессов прорастания. Низкая активность фермента у непроросших семян, остающихся в покое, не изменяется, в то время как в прорастающих семенах наблюдается возрастание активности фермента.

4. Окислительный стресс в процессе замачивания приводит к активации перекисного* окисления липидов и антиоксидантной системы защиты в зародыше и щитке. Кратковременное воздействие стресс-фактора в процессе набухания приводит к повышению всхожести семян зерновых культур.

5. При прорастании контроль над уровнем ПОЛ в надземной части преимущественно выполняют низкомолекулярные антиоксиданты, а в корнях эта функция возложена на ферменты антиоксидантной защиты. Одним из молекулярных механизмов реакции семян и проростков на действие факторов окружающей среды является изменение каталитических характеристик стрессового фермента - пероксидазы.

6. Аскорбиновая кислота является медленно окисляемым субстратом, пероксидазное окисление которой в концентрации 22-220 мкМ сопровождается активированием, а в концентрации 264-352 мкМ ингибированием фермента. Эффект активирования и ингибирования отмечался при всех изученных значениях рН (4,0-8,0). При связывании в активном ценгре двух и более молекул аскорбиновой кислоты активирует фермента, а связывание 6-9 молекул ингибирует пероксидазу. Количество связавшихся молекул, ингибирующих фермент, зависит от рН. Гидрохинон неконкурентно активирует

пероксидазное окисление аскорбиновой кислоты, ускоряя ферментативную реакцию в 4-41 раз. В реакциях совместного пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты и гидрохинона ингибирование пероксидазы возможно двумя молекулами аскорбиновой кислоты. Данный регуляторный механизм обеспечивает выполнение избирательной ангиоксидантной функции пероксидазы в растениях.

7. Гидрохинона является быстро окисляемым субстратом пероксидазы (к,* 1220-2225 с"1). Оптимум каталитической активности фермента приходится на рН 4,5-5,5. Связывание 23 молекул гидрохинона с фермент-субстратным комплексом ингибирует пероксидазу. Количество молекул гидрохинона, ингибирующих фермент, зависит от рН, что обусловлено изменениями в протяженности субстратсвязывающего участка активного центра фермента, уменьшающегося в кислых рН. Данный механизм может наблюдаться в растениях при окислении различных регуляторов роста. Подробно изучен механизм и определены каталитические константы регуляции активности гемсодержащей пероксидазы растений биологически активными веществами. Предложен механизм участия пероксидазного катализа в покое и прорастании семян, а также в условиях окислительного стресса Пероксвдаза контролирует уровень перекиси и антиоксидантов в растениях; антиоксидашы в малых концентрациях способны повышать активность пероксидазы в реакциях совместного окисления, в высоких -снижать активность фермента, связываясь в активном центре.

8. Индолил-З-уксусая кислота регулирует пероксидазное окисление субстратов, имея специфический участок связывания в составе дистального домена активного центра фермента. ИУК способна изменять направленность реакции пероксидазы, превращая фермент в высокоспецифическую оксигеназу, генерирующую свободные радикалы, необходимость которых возникает у растений в процессе развития. Углеводы в концентрациях 0,011-0,88 М снижают активность и термостабильность гемсодержащей пероксидазы растений.

9. Биологически активные вещества в малых концентрациях активировали прорастание семян на 15-20%, а в больших - понижали их всхожесть до 3-11%, при этом проявлялась индивидуальная чувствительность семян зерновых культур к используемым соединениям. Высокие концентрации регуляторов и антиоксидантов могут понижать активность пероксидазы и за счет этого регулировать продолжительность гипобиотического состояния семян зерновых культур.

10. Одним из физиолого-биохимических механизмов повышения всхожести при воздействии на семена физических и химических факторов является активация окислительных процессов на начальных этапах набухания зерновок с последующим повышением реактивности антиоксидантной системы.

11. Технологический режим замачивания и солодоращения ячменя влияет на протекание окислительных процессов и активность антиоксидантной системы. Антиоксидантный статус и интенсивность перекисного окисления липидов могут быть использованы как критерий оценки качества зерна и солода

12. Отхода солодовенного и пивоваренного производства являются перспективным источником природных биологически активных веществ и могут быть использованы в качестве регуляторов биотехнологических процессов при солодоращении. Наибольшее содержание низкомолекулярных антиоксидантов наблюдалось в хмелевом экстракте и солодовых ростках, которые в перспективе можно использовать для снижения окислительных процессов при солодоращении пивоваренного ячменя.

Рекомендации производству

1. Низкомолекулярные ангиоксидашы - эффективные регуляторы прорастания семян, использование которых позволяет повысить всхожесть, а также сопротивляемость семян и проростков к факторам внешней среды. Полученные данные позволяют предложить наиболее оптимальное время замачивания семян в растворах БАВ, которое по результатам наших исследований приходится на первые четыре часа замачивания.

2. Предложена принципиальная схема использования отходов солодовенного и пивоваренного производства как доступного источника биологически активных веществ, применение которых позволит регулировать солодоращение и окислительные процессы при производстве солода.

Основные публикации по теме диссертации

1. Верхотуров В.В. Перекисное окисление липидов и применение антиоксидантов для повышения устойчивости растений к температурному стрессу // Материалы Республиканской научно-практическая конференция. - Якутск: Изд-во ЯГСХА, 2001.-С.70-71.

2. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Аскорбиновая кислота как медленно окисляемый субстрат пероксидазы//Биохимия. -1997. - Т.62. -№12. - С. 1686-1690.

3. Рогожин В.В., Курилюк Т.Т., Верхотуров В.В., Колесова Т.К. Роль пероксидазы и антиоксидантов в формировании механизмов покоя семян // V-ой Международная конференция "Регуляторы роста и развития растений". - М.: Изд-во ТСХА, 1999. - с. 89-90.

4. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Влияние антиоксидантов (дигоксина, кверцетина и аскорбиновой кислоты) на каталитические свойства пероксидазы // Биохимия. - 1998. - Т.63. - № 6. - С. 63-68.

5. Верхотуров В.В., Пинигина Г.В., Соколова О.В. Физиологические проявления действия окислительного стресса у проростков пшеницы // Сборник трудов "Проблемные вопросы Восточно-Сибирского региона". - Иркутск: Изд-во ИрГТУ, 2001,- с. 109-111.

6. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Стационарная кинетика совместного пероксидазного окисления гидрохинона и о-дианизидина в присутствии пероксидазы // Биохимия.-1998.-Т.63.-№ I2.-C.107-112.

7. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Влияние температуры, ультрафиолетового излучения и функционально активных веществ на всхожесть семян пшеницы // Известия TCXA.-I999.-JV« 3.-C.105-I24.

8. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Стационарная кинетика совместного окисления аскорбиновой кислоты и ферроцианида калия перекисью водорода в присутствии пероксидазы//Биоорганическая химия. - 1999.-Т.25.-№ 1.-С.70-73.

9. Верхотуров В.В., Топорищева В.К. Изменение антиоксидантной системы ячменя при анаэробном солодоращении // Доклады Российской академии с/х наук.-2004.-№ 6.-С.53-55.

10. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Механизм совместного окисления аскорбиновой кислоты и гидрохинона в присутствии пероксидазы // Биоорганическая химия,-1999.-Т.25.-№ 5.-С.377-382.

11. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Антиоксидантная система в прорастании семян пшеницы И Известия РАН. Сер. биол.-2001.-№ 2.-С.165-173.

12. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Всхожесть семян мягкой пшеницы под влиянием антиоксидантов // Сельскохозяйственная биология.-2001.-№ 3.-с.73-78.

13. Верхотуров В.В. Антиоксиданты как регуляторы роста растений // Республиканская научно-практическая конференция. - Якутск: Изд-во ЯГСХА. - 2001.-С.72-73.

14. Верхотуров В.В., Рогожин В.В. Особенности механизма действия пероксидазы // Сборник трудов химико-технологического факультета "Проблемные вопросы Восточно-Сибирского региона". - Иркутск: Изд-во ИрГТУ, 2001 .-с.114-117.

15. Верхотуров В.В., Соколова О.В., Пинигина Г.В., Рогожин В.В. Действие низкой температуры на состояние антиоксидантной системы проростков пшеницы // Сборник трудов химико-технологического факультета "Проблемные вопросы Восточно-Сибирского региона ". - Иркутск: Изд-во ИрГТУ, 2001.-С.111-114.

16. Верхотуров В.В., Франтенко В.К. Содержание антиоксидантов в растениях Сибири // Всероссийская научная конференция "Биологически активные добавки и здоровое питание". - Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2001.-c.23.

17. Верхотуров В.В., Пинигина Г.В. Роль низкомолекулярных антиоксидантов и пероксидазы в механизме прорастания семян пшеницы // Сборник научных трудов "Научное сопровождение образовательного процесса агровуза", Якутск: Изд-во ЯГСХА, 2001.-С.42-43.

18. Рогожина Т.В., Верхотуров В.В. Влияние моно- и олигосахаридов на активность и стабильность пероксидазы // Сборник научных трудов "Научное сопровождение образовательного процесса агровуза". - Якутск: Изд-во ЯГСХА, 2001.-c.47.

19. Рогожин В.В., Верхотуров В.В., Рогожина Т.В. Пероксидазный катализ многокомпонентных систем (монография).- Изд-во "Сахаиздат", Якутск, 2003. -166 с.

20. Верхотуров В.В., Топорищева В.К. Состояние антиоксидантной системы ячменя при замачивании и солодоращении // Хранение и переработка сельхозсырья.-2003.-№ 9.-С.26-30.

21. Верхотуров В.В., Топорищева В.К. Изменение антиоксядантного статуса ячменя при производстве пивоваренного солода // Известия ВУЗов. Пищевая технология.-2004.-№ 5-6,-с.30-34.

22. Верхотуров В.В., Топорищева В.К. Активность некоторых оксидоредуктаз при хранении и солодоращении ячменя // Вестник Российской академии с/х наук.-2004.-№ 2.-С.82-84.

23. Верхотуров В.В., Топорищева В.К. Изменение активности оксидоредуктаз при производстве светлого пивоваренного солода И Всероссийская научно-техническая конференция "Молодые ученые - Сибири". - Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ. 2003.-c.21.

24. Верхотуров В.В., Топорищева В.К. Характеристика пивоваренных сортов ячменя, выращенных в Восточной Сибири // Сборник трудов Межрегиональной конференции молодых ученых "Пищевые технологии".- Казань: Изд-во КГТУ. 2004.-е.140-141.

25. Верхотуров В.В., Топорищева В.К. Окислительные процессы и антиоксидантная система при анаэробном солодоращении ячменя // Хранение и переработка сельхозсырья.-2004.-№ 8.-С.9-12.

26. Рогожин В.В., Верхотуров В.В., Рогожина Т.В. Пероксидаза: строение и механизм действия (монография). - Иркутск: Изд-во ИрГТУ, 2004. - 200 с.

27. Верхотуров В.В., Топорищева В.К. Антиоксиданты как критерий оценки качества зерна и солода // Сборник трудов Международной научно-практической конференции "Прогрессивные технологии развития". - Тамбов: Изд-во ТГТУ, 2004.-с. 176-177.

28. Верхотуров В.В., Франтенко В.К. Перекись водорода как регулятор прорастания ячменя // Сборник материалов научно-практической конференции "Перспективы развития технологии, экологии и автоматизации химических и пищевых производств". - Иркутск: Изд-во ИрГТУ, 2006.-С.98-100.

29. Верхотуров В.В., Франтенко В.К. Содержание антиоксидантов в отходах солодовенного и пивоваренного производства // Сборник трудов 2-й Международной научно-практической конференции "Составляющие научно-технического прогресса", Тамбов: Изд-во ТГТУ, 2006.-С.212-215.

30. Верхотуров В.В. Прикладная энзимология (Учебное пособие). - Иркутск: Изд-во ИрГТУ, 2006.-56 с.

31. Верхотуров В.В., Франтенко В.К. Антиоксидантная система и окислительные процессы при хранении и солодоращении пивоваренного ячменя // Сборник материалов научно-практической конференции "Пищевые технологии, качество и безопасность продуктов питания",- Иркутск: Изд-во ИрГТУ,.2006.-с.16-18.

2. Верхотуров В.В., Франтеш.о В.К. Содержание антиоксидантов в отходах солодовенного и пивоваренного производства и перспективы их использования при получении солода // Экология и промышленность России.-2006. -№ 10.- с. 15-17.

3. Верхотуров В.В, Франтенко В.К. Влияние ультрафиолетового облучения на активность оксидоредуктаз ячменя // Зерновые хозяйство. - 2006.-№ 7.-С.22-24.

34. Верхотуров В.В., Франтенко В.К. Использование природных антиоксидантов для продления сроков хранения растительных масел // Сборник материалов научно-практической конференции "Региональные проблемы сельскохозяйственного производства". - Иркутск: Изд-во ИрГТУ, 2001.-С.71-72.

5. Верхотуров В.В. Изменение антиоксидантного статуса и перекисное окисление липидов в зерновках ячменя при хранении // Сборник материалов V международной научно-практической конференции ученых Сибирского федерального округа "Современные тенденции развития АПК в России". -Красноярск: Изд-во КрасГАУ, 2007.-С.375-378.

6. Верхотуров В.В., Франтенко В.К. Влияние искусственного старения на жизнеспособность семян ячменя // Зерновые хозяйство - 2007. - № 1. - с.31-32.

7. Верхотуров В.В. Особенности протекания эколого-биохимических механизмов при хранении зерновых культур // Сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции "Пищевые технологии". - Казань: Изд-во КГТУ, 2007.-с.45-48.

8. Верхотуров В.В., Франтенко В.К. Влияние перекиси водорода на анти- и прооксидантный статус семян ячменя при прорастании // Доклады Российской академии с/х наук.-2008.-№ 1.-е.11-13.

Верхощрив Росший Владимирович

ФШПОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ЗЕРНОВКАХ ЯЧМЕНЯ И ПШЕНИЦЫ ПРИ ИХ ХРАНЕНИИ, ПРОРАСТАНИИ II ПЕРЕРАБОТКЕ

Автореферат

11одписан ь печать 20 09 2008 Формат 60x84/16 Печать офссиая Уч -нздл 3 Тираж 100 экз 664074 г Иркутск, >л Лермонтова, 83 Иркутский государственный технический университет "Деловой ценгр"

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Верхотуров, Василий Владимирович, Москва

Приложение 7 - Средняя декадная температура воздуха и декадное количество осадков 2001-2002 г

Месяц Декады Температура воздуха, °С Количество осадков, мм

2001 2002 2001 2002

Январь 1 -37,3 -12,1 1,6 8,6

2 -29,1 -18,0 1,3 4,9

3 -22,5 -16,2 1,9 4,7

средняя / сумма -29,6 -15,4 5,8 18,2

Февраль 1 -28,4 -14,7 3,6 2,3

2 -18,8 -12,8 2,5 0,2

3 -15,5 -13,6 6,0 00

средняя / сумма -20.9 -13,7 12,1 2,5

Март 1 -12,4 -10,3 3,8 1,9

2 -4,5 -4,3 15,8 3,4

3 -9,8 -3,5 9,1 0,5

средняя / сумма -8,9 -6,0 28,7 5,8

Апрель 1 -0,8 -1,6 4,8 8,6

2 3,2 0,4 2,8 1,6

3 4,0 4,5 7,9 3,0

средняя / сумма 2,1 1,1 15,3 13,2

Май 1 5,7 7,6 7,0 6,3

2 4,7 19,9 22,6 3,0

3 14,8 17,0 00 5,9

средняя / сумма 10,7 12,2 29,6 15,2

Июнь 1 18,3 15,5 13,6 18,9

2 18,4 17,2 34.7 2,3

3 21,2 19,4 14,2 49,9

средняя / сумма 19.3 17,4 62.5 71,1

Июль ] 17.4 19,7 135,8 18,6

-> 19,8 20,3 19,2 30,2

3 17,8 21,4 66,4 16,2

средняя / сумма 18,3 20,5 217,4 65,0

Август ] 29,9 17,6 28,6 16,2

2 16,9 20,6 2,3 0,2

3 16,6 15,1 0,5 32,6

средняя / сумма 16,9 17,8 31,4 49,0

Сентябрь 1 13,0 11,9 14,9 9,4

2 8,1 8,2 15,4 2,3

3 7,5 9,6 6,2 11,5

средняя / сумма 9,5 9,6 36,5 23,2

Октябрь 1 2,4 -3,7 0.7 18,4

2 -0,1 -2,9 8,1 2,8

3 -1,8 -6,0 8,7 10,8

средняя / сумма 0,2 -1,7 17,5 32,0

Ноябрь 1 -3,6 -7,2 2,4 10,3

2 -4,0 -19,7 00 0,5

3 -11,3 -14,2 4,5 4,0

средняя / сумма -6,3 -13,7 6,9 14,8

Декабрь 1 -16,4 -23,2 7,4 0,2

2 -26,0 -21,1 2,4 1,4

3 -17,2 -25,3 4,2 11,5

средняя / сумма -19,9 -23,2 14,0 13,1

Информация о работе

Верхотуров, Василий Владимирович
доктора биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.12

Диссертация

Физиолого-биохимические процессы в зерновках ячменя и пшеницы при их хранении, прорастании и переработке - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы