Физиолого-биохимические основы формирования белкового комплекса клейковины пшеницы

Труфанов, Виталий Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Физиолого-биохимические основы формирования белкового комплекса клейковины пшеницы
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Физиолого-биохимические основы формирования белкового комплекса клейковины пшеницы"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ * I б Сиб^кий институт физиологии и биохимии растений

^ и С,',"5

Яа правах рукописи УЛК 663.11:531.192+577.1

ТРУФАНОВ Виталий Александрович

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ФОРМИРОВАНИЯ БЕЛКОВОГО КОМПЛЕКСА КЛЕЙКОВИНЫ ПШЕНИЦЫ

03.00.12 - физиология растений

Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

Иркутск - 1999

Работа выполнена в Сибирском институте физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН, г. Иркутск.

Научный консультант: член-корреспондент РАН,

доктор биологических наук, профессор Р. К. Саляев.

Официальные оппоненты: академик АА.0, профессор,

доктор биологических наук Н.Э. Илли;

доктор биологических наук Ю. И. Константинов; доктор биологических наук Л. А.Першина.

Ведущее учреждение: Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН, г. Москва.

Защита состоится " $ " ^ехаЪ/гл. 1999 г. в 9 ~ часов на заседании Специализированного совета (Д,003.25.01) по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук в Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, г. Иркутск, Лермонтова, 132.

С диссертацией (научным докладом) можно ознакомиться в библиотеке Института.

Диссертация в виде научного доклада разослана " 3, 6 " ОК.-пЛ&ГЪЛ- 1999 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

Г. П. Акимова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Запасные белки пшеницы имеют важное значение прежде всего как структурная основа клейковины, определяющая реологические характеристики теста и в целом хлебопекарные качества муки. Вследствие этого изучение физиолого-биохимических процессов биосинтеза запасных белков и формирования белкового комплекса эндосперма имеет не только теоретическое, но и важное практическое значение.

К настоящему времени накоплен довольно обширный материал по различным аспектам проблемы качества клейковины. Во многих лабораториях мира ведутся интенсивные исследования запасных белков различных генотипов пшеницы [Кретович, 1973, 1991; Конарев, 1980, 1983; Созинов. 1985, 1988; Kasarda, 1980; Payne etal., 1984; Galili et al. , 1996; Shewry et al. ,1997; Egorov et al. ,1998; May-strenko, Pshenichnikova et al., 1998]. Получено большое количество данных по составу и свойствам запасных белков, сделаны важные наблюдения по генетическому контролю синтеза глиадина и глютенина и их функциям. Все эти исследования направлены в конечном счете на выяснение путей и возможностей улучшения физических свойств клейковины.

Хотя в последние годы достигнуты значительные успехи в развитии представлений о структурно-функциональной организации запасных белков пшеницы, ряд важных в теоретическом и практическом отношении вопросов, связанных с физиолого-биохимическими аспектами формирования белкового комплекса клейковины, остаются предметом дальнейших исследований. К их числу относятся;

- процессы биосинтеза запасных белков на последовательных этапах развития зерновок, закономерности накопления функционально значимых фракций, отдельных компонентов глиадина и структурных субъединиц глютенина;

- механизмы формирования белковых ассоциатов в созревающих зерновках, особенности пространственной организации запасных белков и природа факторов и сил, определяющих макроструктуру белкового комплекса клейковины;

- функциональная роль системы ферментов тиол-дисульфидного обмена в создании и регуляции SH/S-S-статуса запасных белков и в образовании белковых ассоциатов эндосперма in vivo.

В этой связи при планировании и выполнении настоящей работы

основное внимание было сосредоточено на комплексных физиолого-биохимических исследованиях проблемы формирования белковых ассо-циатов клейковины яровой мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.).

Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы заключалась в исследовании физиолого-биохимических процессов биосинтеза запасных белков на последовательных этапах онтогенеза зерновок пшеницы, механизмов формирования белковых комплексов эндосперма и природы факторов, определяющих структурно-функциональную организацию клейковины. В задачи исследований входило:

1) изучить динамику биосинтеза и накопления запасных белков в развивающихся зерновках пшеницы, установить основные закономерности образования функционально важных белковых фракций, а также особенности синтеза индивидуальных компонентов глиадина и субъединиц глютенина;

2) изучить процессы формирования белковых ассоциатов эндосперма и особенности пространственной организации глиадиновых и глотениновых белков на разных стадиях спелости зерновок;

3) исследовать функциональную роль ферментов, катализирующих реакции тиол-дисульфидного обмена в запасных белках, сопоставить динамику специфических активностей с динамикой образования S-S-связей и SH-групп на последовательных этапах раззития зерновок;

Í) изучить генотипическую вариабельность и модификационную изменчивость активности ферментов SH/S-S-метаболизма, определить роль отдельных пар хромосом в генетическом контроле ферментативной активности; изучить действие ферментов на реологические характеристики теста и клейковины in vitro;

5) установить природу сил и факторов, определяющих способность запасных балков различных видов злаков к межмолекулярной ассоциации и стабилизирующих белковый комплекс_ клейковины;__

6) изучить состав и биохимические свойства компонентов глиадина и субъединиц глютенина; идентифицировать группы (блоки) генетически сцепленных компонентов и установить их сопряженность с признаками качества у генотипически различных форм пшеницы;

7) на основании данных о закономерностях синтеза белков, биохимических механизмах и факторах, индуцирующих образование белковых комплексов in vivo и in vitro, установить возможности направленного изменения физических свойств клейковины пшеницы.

Научная новизна результатов исследований. Проведено комплексное физиолого-биохи.мическое исследование запасных белков пшеницы. Получены новые данные о закономерностях синтеза, и накопления основных белковых фракций в созревающих зерновках и особенностях биосинтеза отдельных компонентов глиадина и субъединиц глютенина. Сделано заключение о координированном характере функционирования белоксинтезируацей системы в генеративную фазу онтогенеза растений. Впервые выявлены группы синхронно синтезирующихся полипептидов, контролируемых хромосомами 3-й и 6-й гомеологических групп.

Изучены особенности пространственной организации глиадина и глютенина в ходе налива и созревания зерновок. Впервые обнаружена разобщенность во времени процессов синтеза запасных белков с процессами формирования in vivo макромолекулярных структур глютенина, характерных для клейковины физиологически зрелого зерна.

Установлена роль различных по природе сил (ионно-солевые и 'гидрофобные взаимодействия, водородные и дисульфидные связи) в формировании и стабилизации белковых комплексов клейковины у разных видов злаков - пшеницы, ржи и ячменя.

Впервые в зерновках пшеницы обнаружена активность кислород-зависимой тиол:кислород оксидоредуктазы (КФ 1.8.3.2) и глутатион-зависимой тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазы (КФ 1.8.4.2), катализирующих соответственно образование и расщепление дисульфид-нь.'х связей. Получены новые данные о физиологической функции этих ферментов в создании и регуляции SH/S-S-статуса запасных белков развивающихся зерновок.

Сформулировано представление о ключевой роли S-S-связей и SH-групп в формировании белкового комплекса эндосперма in vivo, при этом фолдинг глиадиновых компонентов происходит в основном в процессе трансляции, а межмолекулярная ассоциация различных по биохимической природе субъединиц глютенина - в посттрачсляциокный период. Сделан вывод, что сложные по белковому составу ассоциаты глютенина, образующиеся в эндосперме, являются основными структурными предшественниками клейковины зерна полной спелости.

Приведенные в работе экспериментальные данные, выводы и положения в значительной степени развивают существующие представления о физиолого-биохшических процессах и механизмах, лежащих в основе формирования макробелковых комплексов клейковины.

Теоретическая и практическая ценность. Разработана общая стратегия комплексного изучения клейковинных белков пшеницы с использованием физиолого-биохимических, биофизических и генетических методов, в том числе хромосомной инженерии.

Полученные сведения о закономерностях биосинтеза и накопления запасных белков, особенностях образования отдельных компонентов глиадина и субъединиц глютенина, процессах формирования пространственной структуры белкоз в ходе налива и созревания зерновок являются ценным вкладом в развитие представлений о белковом комплексе эндосперма кач динамичной биологической системе, формирующейся в генеративной фазе онтогенеза растений.

Выдвинута и экспериментально обоснована концепция ферментативного характера формирования в эндосперме белковых ассоциатов как основы структурного матрикса клейковины, согласно которой в фолдинге запасных белков in vivo участвует система ферментов тиол-дисульфидного обмена, регулирующих оксидоредуктазные SH/S-S-прев-ращения в белковой системе.

Обнаруженное сходство в динамике биосинтеза определенных групп компонентов глиадина является независимым экспериментальным подтверждением существующих представлений о генетически сцепленных аллельных вариантах групп (блоков) компонентов глиадина CSfte-pherd, 1968], как белковых маркеров отдельных признаков растений [Созинов, 1995]. Белковые маркеры глиадина, контролируемые хромосомами 1-й и 6-й гомеологических групп и сопряженные с селекционными признаками растений, в том числе с качеством клейковины, используются нами для оценки и отбора перспективных гибридных форм растений в селекции пшениц (Иркутская ГСХА и Тюменская ГСХА).

Предложен способ улучшения физических свойств клейковины из муки слабых сортов пшеницы с помощью ферментных препаратов растительного происхождения, регулирующих соотношение S-S-связей и SH-групп в запасных белках, вместо применяемых в хлебопечении химических улучаштелей.

Обнаруженная наш связь тиолоксидазной и дисульфидредуктазной активности с рядом технологических показателей • у разнокачественных генотипов пшеницы явилась основной предпосылкой для использования ферментов тиол-дисульфидкого обмена в качестве биохимического теста в селекции пшеницы на качество клейковины.

На примере линий с межсортовым замещением хромосом у разнокачественных сортов установлены достоверные различия в активности ферментов SH/S-S-метаболизма, свидетельствующие о возможности создания новых форм пшеницы методами хромосомной инженерии.

В результате проведенных исследований развито ва»ное в теоретическом и практическом отношениях направление, связанное с выяснением путей и возможностей направленной регуляции признаков качества клейковины.'

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на: USSR - FRG Symposium on Chemistry of Peptides and Proteins (Dushanbe, 1974); Всесоюзной конференции "Физиолого-биохимические и экологические аспекты устойчивости растений к неблагоприятным факторам внешней среды" (Иркутск, 1976); Всесоюзном симпозиуме "Азотный и белковый обмен растений" (Тбилиси, 1978); IV и V Всесоюзных биохимических съездах (Москва, 1979, 1985); III, V и VI Всесоюзных симпозиумах "Химия и физика белков и пептидов" (Киев, 1374; Баку, 1980; Рига, 1983); V Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессоз" (Москва, 1983); Всесоюзной конференции "Устойчивость к неблагоприятным факторам среды и продуктивность растений"(Иркутск, 1984); III Всесоюзной конференции по физиологии растительной клетки (Петрозаводск, 1988); Всесоюзной конференции "Онтогенетика высших растений" (Кишинев, 1939); II и III зональных конференциях "Пути повышения эффективности с.-х. производства Восточной Сибири" (Красноярск, 1987, 1989); II, III и IV съездах Общества физиологов растений РАН (Минск, 1990; Санкт-Петербург, 1993; Москва, 1999); Научно-практической конференции "Научное обеспечение в реализации продовольственной программы АПК"(Иркутск, 1990); Всесоюзной конференции "Электрофо-рез-90" (Рига, 1990); Симпозиуме "Physical-chemical basis of plant physiology" (Penza, 1996); регулярных научных сессиях СИФИЕР СО РАН.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа основана на результатах исследований, проведенных.соискателем в течение более 20 лет лично или совместно с другими исследователями под его руководством. Диссертанту принадлежит разработка общего направления, программы и планов исследований, организация и проведение полевых и лабораторных опытов, анализ и обобщение результатов. В

дисссртйцию БКЛыЧспЫ нбсбходимыэ для обобщзния результатов 5 ЦЭ-ЛОМ отдельные положения из монографии автора "Клейковина пшеницы: проблемы качества" (1994) и некоторые дачные из кандидатской диссертации С. В. Кичатиновой "Ферменты тиол-дисульфидного обмена и их роль в формировании белкового комплекса зерновки пшеницы" (1998), выполненной под его руководством.

Положения, выносимые на защиту. Основной защищаемый тезис -экспериментальное и теоретическое обоснование концепции формирования белкового комплекса клейковины пшеницы, основанной на регу-ляторной функции ферментов тиол-дисульфидного обмена в образовании белковых ассоциатов, особенностях синтеза и фолдинга запасных белков и принципах их структурной организации, в том числе:

а) положение о дифференциальном характере функционирования белоксинтезирующей системы на разных фазах развития зерновок, приводящем к количественным изменениям, в содержании основных фун-циональных фракций запасного белка, а также отдельных групп полипептидов, обладающих общностью генетического контроля;

б) положение об особенностях образования вторичной структуры глиадиновых и глютениновых белков в процессе формирования белкового комплекса эндосперма in vivo;

в) положение о ключевой роли ферментов тиол-дисульфидного обмена в создании и регуляции SH/S-S-стагуса запасных белков;

г) положение о кооперативное™ действия различных по природе ковалентных и невалентных сил в межмолекулярной ассоциации запасных белков с образованием белковых комплексов клейковины.

Структура работы. Диссертация изложена в форме научного доклада, включающего шесть экспериментальных разделов, 16 таблиц и 17 рисунков, заключение, практические рекомендации, выводы и список основных публикаций.

Публикации. Всего автором опубликовано около 150 работ, из них по теме диссертации более 60 работ, в том числе монография "Клейковина пшеницы: проблемы качества". Новосибирск:Наука, 1994.167 с.

Объекты и метода исследований. Основными объектам исследований служили различные по происхождению сорта яровой мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.), выращенные в разные годы в условиях Иркутской области (опытные поля СИФиЕР СО РАН, Иркутского НИИСХ, Иркутской ГСХА) и Краснодарского края (Краснодарский НИИСХ им. П. П. Лукъяненко).

Динамку биосинтеза балков изучали радиоизотопным методом [R.Morton et al., 1964] путем инкубации свежесрезанных колосьев (с длиной соломины 20 см) разных стадий развития на растворах меченых предшественников ([14С]-лейцин и [35S]-сульфат аммония). Колосья срезали с интервалом 6-7 дней, начиная с 8-10-го дня после цветения, то есть с конца фазы формирования зерновок при их влажности около 70% и до конца налива (влажность около 40%).

Радиоактивность измеряли с помощью жидкостного сцинтилляцион-ного счетчика Wallak 8100 (LKB, Швеция). 0 биосинтезе отдельных компонентов глиадина и субъединиц глютенина судили по интенсивности включения в них радиоактивных меток после электрофоретичес-кого разделения в крахмальном геле [Созинов, Попереля, 1978]. Результаты выражали в процентах от суммарного содержания метки во всех зонах спектра.

Для исследования сил и факторов, определяющих способность запасных белков к межмолекулярной ассоциации, использовали метод агрегации белков в среде фосфатного буфера EArakawa et al., 1976] в нашей модификации [Труфанов, 1994].

Электрофоретические исследования состава компонентов глиади-на вели по [Bushuk, Ziliman, 1978], а субъединиц восстановленного глютенина - по [Laeramli, 1970].

Активность S-S-редуктазы (тиол:прогеиндисульфид оксидоредук-таза, КФ 1.8.4.2) определяли по [Givol et al., 1965], SH-оксидазы (тиол:кислород оксидоредуктаза, КФ 1.8.3.2) - по [Lash, Jones, 1986], дисульфидизомеразы (тиол:протеиндисульфид изомераза, КФ 5.3.4.1) - по ГНi 11 son et al., 1984], липоксигеназы (линолеат: кислород оксидоредуктаза, КФ 1.13.11.12) - по [Будницкая, 1980]; содержание SH-групп определяли по [Ellman, 1959].

Пространственную структуру белков изучали методами кругового дихроизма [Kasarda, 19803 и ЯК-спектроскопии [Byler, Susi, 1986]. Спектры КД регистрировали на дихрографе Mark-III (Jobin-Yvon, Франция). Расчет количества as-спиралей и e-структур вели по методике [Greenfield, Fasntan, 1969]. Кинетику водородно-дейтериевого обмена изучали методом "сухих пленок" на оптических пластинках KRS-5 (TIJ-TBr) с помо1цью ИК-спектрофотометра IR-75 (Carl Zeiss, Германия). Изотопное замещение проводили путем насыщения белковых пленок в кювете с парами тяжелой воды. Учитывали изменения в со-

отношении ингенсивностей спектральных полос Амид П/Амид I, характеризующему скорость замещения атомов водорода на дейтерий.

Идентификацию аллельнкх вариантов блоков компонентов глиадина и изучение их сопряженности с изменчивостью количественных селекционных признаков проводили по методике ССозинов, 1985]. Использовали гибриды разных поколений, полученные от различных комбинаций скрещивания сортов яровой мягкой пшеницы отечественной (Скала, Ангара 86, Тулунская 32, Тюменская 1, Омская 12, Иргина, Целинная 20 и др.) и иностранной (Rollo, Drott, Raso, Rang) селекции. Гибриды были получены селекционерами Тюменской ГСХА (Ю.П.Логинов) и Иркутской ГСХА (М.С.Наумова).

Для изучения хромосомной локализации генов, контролирующих синтез и/или активность ферментов SH/S-S-метаболизма, использовали генетические линии с межсортовым замещением отдельных пар хромосом, созданные в Институте цитологии и генетики СО РАН (О.И. Майстренко, Т. А.Пшеничникова).

Показатели качества муки, теста, клейковины и хлеба определяли общепринятыми методами [Оценка качества зерна: справочник. М.: Агропромиздат, 1987].

Статистическая обработка результатов включала расчет средних значений показателей (х), стандартных ошибок средних (S*), коэффициентов корреляции (г) и вариации (V, %). Достоверность разности средних оценивали по критериям Стыодента (t) и Фишера (F).

Представленные в работе данные являются средними из 2-3-х биологических и 3-х аналитических повторностей.

С0ДЕР1АНИЕ РАБОТЫ

1. Биосинтез и накопление запасных белков в созревающих зерновках пшеницы (Tritlcum aestirara L.)

[4, 7, 8, И, 12, 15, 24, 25, 31, 36, 47, 49, 54]

Интерес к выяснению особенностей биосинтеза запасных белков пшеницы обусловлен их непосредственным участием в формировании белкового комплекса эндосперма, определяющего в конечном счете физические свойства клейковины и реологические характеристики теста. В целом эти исследования были направлены на установление

времени, последовательности и интенсивности образования . белков в процессе развития зерновок. С этой целью были проведены 3-летние исследования динамики биосинтеза запасных белков с помощью различных предшественников: 4G]-лейцина, сравнительно равномерно распределенного, во фракциях запасного белка, и 5S]-сульфата аммония - предшественника SH-групп и S-S-связей полуцистина.

1.1. Биосинтез и накопление белковых фракций. Из данных табл. 1 можно видеть, что основная масса альбуминов, глобулинов и глю-тенинов синтезировалась на самых ранних этапах развития зерновок (при их влажности около 70%). В процессе нааива и созревания абсолютное содержание этих фракций изменялось незначительно.

Таблица 1

Включение С14 С] -лейцина (имп./иин-мг белка) в белковые фракции развивающихся зерновок пшеницы сорта Ската

1 1 Фракции 1 белков i i ¡ Стадии развития зерновок | i i

i ¡ранняя молочная i молочная i ! | поздняя молочная |

j Альбумины i 1 16.3Ü ,0 7,3+0, 4 1 3,9+0,4 1

| Глобулины ¡ 2, 8+0,2 I 4, 6±0, 6 2,9+0,1 3,8+0, 5 ! 2,7+0,2 ( 1 2,0+0,5 |

| Глиадины | l.OtO.l 1 16, 5±0,8 1,1+0,2 11,5+0, 8 1 0,9+0,2 | | 7,2+0,7 !

j Глютенины ¡ 2,2+0,1 1 12, 3±0,6 4,4+0,2 7, 6+0, 4 1 5,2+0,2 | 1 ÍL9+QJ3 [

| Суммарный | 4, 6±0,2 ! 49, 7±2,2 4,9+0,1 30,2+1,2 I 5,0+0,2 | 1 20,0+1,9 I

j белок 1 [ 10,610,2 i 13,2+0,2 1 13,8+0,2 | i i

Примечание. Числитель - содержание метки, знаменатель -содержание белков (в % от суммы по каждой фазе развития).

В отличие от этих белков содержание суммарного глиадина существенно увеличивалось в фазе молочной спелости (влажность зерновок 50-55%) и продолжало возрастать в период созревания зерновок. За счет интенсивного синтеза глиадина увеличивалось содержание

суммарных белков, хотя скорость включения в них меченых предшественников в конце налива резко снижалась в связи с общим замедлением биосинтетических процессов в ходе дегидратации зерновок.

Основной результат этой серии экспериментов заключается в том, что при общем сходстве в направленности биосинтетических процессов существуют особенности в синтезе и накоплении функционально различных белковых фракций, причем дифференциальный характер функционирования белоксинтезирующей системы в целом сохранялся независимо от условий выращивания растений.

На основании полученных дачных общую картину биосинтеза и накопления белков в развивающихся зерновках можно представить следующим образом. Преобладающая часть цитоплазматических белков, непосредственно участвующих в метаболических процессах формирующейся зерновки, а также глютенина синтезировалась на самых ранних этапах развития эндосперма. В'процессе налива зерновок глиа-дмнозые белки образовывались более высокими темпами. Различия в скоростях накопления глиадина и глютенина приводили практически к 2-кратному изменению их соотношения в период от конца формирования зерновок до начала восковой спелости. Очевидно, что перераспределения в относительном содержании основных белковых фракций являются следствием дифференциапьного функционирования белоксин-тезирующей системы в репродуктивную фазу онтогенеза растений.

1.2. Биосинтез и накопление суб^ракций глиадина и глютенина. Высокая биохимическая гетерогенность глиадина и глютенина позволяла предполагать существование различий в характере образования отдельных субфракций этих белкоз. В табл. 2 представлены данные по динамике накопления электрофоретических групп компонентов глиадина в развивающихся зерновках пшеницы. Белки экстрагировали непосредственно из муки 7(Ж-ны.м этанолом и фракционировали с помощью электрофореза в крахмальном геле. Белковые зоны окрашивали водорастворимым нигрозином, денситометрировапи, затем экстрагировали 70%-ным раствором зтиленхлоргидрина и измеряли интенсивность окраски спектрофотометрически.

Независимо от фазы развития зерновок основная часть глиадино-вых белков представлена р-фрачцией и меньшая - ш-фрачцией. На самых ранних этапах налива зерновок (влажность около 70%) на долю р-глиадина приходилось около 40% от общего содержания спирторас-

Таблица 2

Динамика содержания субфракций глиадина в развивающихся зерновках пшеницы сорта Скала (% от суммы по фазам развития)

1 1 1 Субфрак-| ции | глиадина 1 1 Стадии развития зерновок

. ранняя молочная молочная поздняя молочная восковая 1 полная |

1 |с(-Глиадин | р-Глиадин |^-Глиадин | ш-Глиадин 1 19,3+1,1 40, 7+1, 5 28, 0±1,1 12, ОЮ, 8 21,2+1,4 38, 541,9 26, 3±0.7 14, 1+0,5 26,3+1,4 33,841,6 24,7+0,6 15, 240,5 27,7+1,5 33, 6+1,8 23, 4 ±0.7 15, 3+0,7 26,9+1,3 | 33,6+1,2 | 23,0+0,5 | 16,5+0,6 | |

творимых белков, а на долю ©-глиадина - лишь 12%. Содержание <*-и й-глиадинов в этот период составляло соответственно 19 и 28%. Хотя в ходе налива и созревания зерновок общее содержание глиадина закономерно возрастало (см. табл. 1), однако темпы образования его отдельных субфракций были неодинаковыми. Быстрее накапливались с(-глиадины, содержание которых в процессе развития зерновок увеличилось почти в 4 раза. Количество У- и ш-глиадинов возросло примерно в 3 раза, а е-глиадина - более чем в 2 раза. Различия в тешах образования отдельных фракций приводили к изменению их соотношения в суммарном глиадине. К концу стадии налива (влажность зерновок около 4.0%) относительное содержание в- и й-глиадинов заметно снижалось, а содержание а- и о>-глиадинов - возрастало. В дальнейшем в ходе созревания зерновок количественные соотношения отдельных субфракций глиадиновых белков практически не изменялись.

О закономерностях накопления основных субфракций глютенина, различающихся по растворимости, можно судить по данным табл. 3. Субфракции глютенина экстрагировали из остатков муки (после удаления альбуминов, глобулинов и глиадинов) последовательно 0,1 н. уксусной кислотой (глютенин-1), затем 6 М мочевиной (глютенин-2) и, наконец, раствором 6 М мочевины, содержащим \% 2-меркалтоэта-нола (глютенин-3).

Таблица 3

Динамика содержания субфракций глютенина в развивающихся зерновках пшеницы сорта Скала

Субфракции глютенина (экстрагент)

Стадии развития зерновок

ранняя молочная

молочная

поздняя молочная

полная

Глютенин-1 (О, 1н. СН3С00Н)

Глотенин-2 (6М мочевина) Глютенин-3 (6М мочевина+МЭ)

48.5 11.310,9

24.6 12.410,8

26,9

24, 8И, 3

50,6 11,410,9

23,3 12,811,0 26,1

22,711.1

45,4 12, 5Ю.8

25,0 14,811,1 29,6

21.1И. 2

40, 6 13, 5Ю.9 26,0 17.4И.З 33,4

Примечание. В числителе - содержание белка (мг/г муки), в знаменателе - % от суммы белков па каждой фазе развития зерновок.

Независимо от стадии спелости зерновок содержание уксусно-растворимого глютенина (глютенин-1) было значительно выше в сравнении с другими глютениновыми субфракциями. В ходе налива и созревания содержание глютенина-1 снижалось, в то время как количество глютенина-2 и особенно глютенина-3, для извлечения которых необходимо разрушение соответственно водородных и Б-Б-связей, возрастало. Как и в случае глиадиновых белков, неравномерное накопление отдельных субфракций глютенина приводило к изменению их соотношения в белковом комплексе эндосперма.

Как будет показано в разделе 3, в ходе развития зерновок формирование труднорастворимых комплексов глютенина-2 и глютенина-3 по времени совпадало с интенсивным образованием в запасных белках Б-Б-связей. Результаты позволили постулировать, что изменения в соотношении субфракций глютенина являются следствием посттрансляционных преобразований полипептидных цепей с ' превращением части легкорастворимого глютенина-3 в белковые макроструктуры за счет межмолекулярных Б-Б-связей. Эти преобразования, связанные непосредственно с формированием белкового комплекса эндосперма, могут,

как оказалась, регулироваться системой ферментов тиол-дисульфид-ного обмена, катализирующих образование, диссоциацию и/или перегруппировку (изомеризацию) S-S-связей в белках зерновки в постсинтетический период.

1.3. Биосинтез отдельных компонентов глиадина. О дифференциальном характере функционирования белоксинтезирующей системы в развивающихся зерновках свидетельствуют также данные по динамике синтеза и накопления электрофоретически индивидуальных компонентов глиадина. В фазе формирования зерновок наибольшее количество [иС]-лейцина включалось в компоненты рЗ, р5, р7, ИЪ и У7, преобладающее содержание которых сохранялось до конца созревания. Про-тивополояская картина наблюдалась в случае <х-глиадиновых компонентов, скорость образования которых была весьма низкой в фазе формирования зерновок и заметно возрастала в ходе налива.

Характер включения [35S]-сульфата аммония в аналогичные ком- : поненты глиадина в большинстве случаев оказался однотипным орга-' ническому метаболиту С14 С]-лейцин, за исключением, как и следовало ожидать, ю-глиадиновых компонентов, практически не содержащих остатков цистеина и цистина [Danno et al., 1976; Труфанов, 1994].

Данные по динамике включения меченых предшественников в гли-адиновые белки позволили выявить группы компонентов со сходным характером биосинтеза. Оказалось, что синхронно синтезирующиеся полипептиды составляют группы (блоки) генетически сцепленных компонентов (табл. 4). Идентификацию блоков проводили путем сопоставления электрофоретических спектров глиадина исследуемых пшениц со спектрами сортов Безостая 1 и Новосибирская 67, руководствуясь при этом рекомендациями и каталогом известных аллельных вариантов блоков глиадина [Созинов, 1985; Metakovsky, 1991].

Из табл. 4 можно видеть, что в процессе развития зерновок скорости включения меченых предшественников в различные блоки компонентов глиадина и их количественное содержание изменялись неодинаково. В фазах формирования и налива скорости синтеза компонентов, контролируемых хромосомами 6В и 6D (блоки глиадина 6ВЗ и 6D1), были заметно выше в сравнении с компонентами, контролируемыми хромосомами 1А и 6А (блоки 1А5 и 6А18). В ходе развития зерновок относительное содержание блоков глиадина 1В1 и 6А18 возрастало, а блоков 1А5, 1D3, 6ВЗ и 6D1 - снижалось.

Таблица 4

Включение [14И-лейцина (А) и [35Б]-сульфата аммония (В) в блоки компонентов глиадина и их содержание (С) у пшеницы сорта Скала

1 Блоки сцепленных | компонентов ¡глиадина (состав)

Стадия развития зерновок

ранняя молочная| молочная

—i-1-1-i-]-

А I В I С I А I В I С

_I_1_1_' '_

поздняя молочная

—I-1-

А | В | С

_1_I_

11А5 (&3*6) |1В1 (Ш7и1,5) 11D3 (&8Ш1.В.9) |6А18 (öl, 2, 3, 4) |6B3(ß3, 5, 7, 8*2,4) |6D1 (ü5, 7ß3,5, 6)

8,5 6,1 6,5 I 7,3 4,6 6,1 13,4 14,8 14,1 114.4 15,8 16,3 10,7 7,0 18,1 |12.3 7,6 19,1 9,5 19,7 10,1 115,7 23,3 11,7 34,3 22,0 31. i 127,3 19,3 28,2 23,6 30,4 20,1 [23,0 29,4 18,9

6,9 4,6 5,1

11.0 13,7 18,4

11.1 6,7 15,7 17,6 25,4 15,8 27, 5 39,2 25,9 25,9 30,4 19,1

Примечание. Данные по включению радиоактивных меток (имл./мин-мг белка) и содержанию белка в блоках приведены в % от их суммы по фазам развития зерновок с учетом неоднородности белковых зон спектра, содержащих компоненты глиадина 33,5,8 и У6 [Созинав, 1985].

Наблюдались также различия в характере включения использованных нами предшественников в отдельные компоненты глиадина, связанные, очевидно, с различиями в содержании лейцина и полуцисти-на. В глиадиновые блоки, содержащие ct-компоненты, включение [3 5 S1 -предшественника было заметно выше, чем С14 С]-лейцина, что косвенно подтверждает высокув склонность этих псшипептидов к формированию микрофибриллярных структур так называемого А-глиадина [Kasarda, 1980] посредством межмолекулярных S-S-связей.

1.4. Биосинтез и некоторые свойства субъединиц глютенина. На-тивный глютенин представляет собой сложный комплекс полипептидов с мол. массой от 10 до 130-140 кДа [Bietz, Wall, 1972; Lawrence, Shepherd, 1980], соединенных различными силами межмолекулярных взаимодействий. Однако сведения о времени, последовательности и интенсивности образования отдельных структурных элементов глютенина в созревающих зерновках пшеницы крайне ограничены.

Из полученных нами данных (табл.5) следует, что основной состав субъединиц глютенина формируется на начальных этапах развития зерновок. Наибольшее количество радиоактивной метки в этот период вкючалось в субъединицы А5, В2 и С2 с мол. массами 41, 58 и 111 кДа соответственно. Относительно низкое содержание [иС]-лейцина обнаруживалось в субъедикицах .13, В1, ВЗ и С1 с мол. массами 31,

Таблица 5

Включение [14С]-лейцина (имп. /мин-иг белка) в субъединицы глютенина развивающихся зерновок пшеницы сорта Скала

1 | Субъе- . _ i |Молеку- 1 ...... 1 .........1 | Стадия развития зерновок |

| диницы ОЗП лярная

[ I 1

| глюте- | масса. | ранняя | молочная поздняя I

¡ С4 0,38 | 130 I 1 | 6,8±0,3 | 7,940,3 8.140,4 |

| СЗ 0,42 | 118 | 7, 5±0. 4 | 8, 6±0,4 9,240,5 |

| С2 0, 47 1 111 1 12, 940,6 ( 12.2±0. 7 11,2+0,6 |

| С1 0. 49 | 107 | 4,040,1 | 2,9+0,02 2,8+0,02 |

| * В8 0, 55 | 96 1 "" 1 1,2+0,01 1,2+0,01 |

| В7 0,56 | 94 | 7,240, 2 | 8, 5+0,30 9,0+0,41 |

| В6 0,59 | 90 1 ~ 1 1,0+0,01 1,1+0,01 |

| В5 0, 65 | 79 1 ' 1 1,5+0,02 1,6+0,02 |

| В4 0,68 f 76 1 ~ 1 1,5+0,01 1.7+0,01 |

| ВЗ 0,74 | 64 | 4,840, 2 | 2,9+0,01 2.0+0,02 |

| В2 0,77 | 58 [ 20,741.1 | 18, 341,2 11,840,9 |

| В1 0,79 | 55 I 4.5*0.3 | 2,7¿0, 3 1,9+0,03 |

| А5 0,87 1 | 11.0±0, 4 | 10,140,5 11,940,4 |

¡ А4 ' 0.90 | 36 | 5,740,2 | 6,040,4 7,840,5 |

| АЗ 0,93 1 31 I 3, 6±0,2 | 3,540, 3 4,940,2 |

¡ А2 0,97 1 24 I 5.1 ±0.3 | 5,0+0,4 6,1+0,3 |

1 м i 1,00 j 20 i | 6, 2+0,3 | 1 1 6,2±0, 4 7.740,4 | 1

Примечание. Содержание радиоактивной метки - в % от суммы для каждой стадии развития зерновок. ОЗП - относительная электрофо-ретическая подвижность в ПААГ по [ЬаешП, 19703.

55, 64 и 107 кДа,соответственно. Четыре минорные субъединицы В-зоны электрофоретического спектра отсутствовали на ранних фазах развития зерновок и обнаруживались на стадии налива.

В целом картина биосинтеза глютениновых субъединиц выглядит следующим образом. На самых ранних этапах развития зерновок образуется около двух третей структурных элементов глютенина, причем с наибольшей скоростью синтезируются субъединицы с мол. массой 43, 58 и 111 кДа. В ходе налива появляются дополнительные компоненты с мол. массой в интервале 76-96 кДа. Именно в этот период формируется генотипически специфичный состав глютенина. В процессе налива зерновок скорость образования большинства субъединиц не остается постоянной. Различия в интенсивности синтеза отдельных субъединиц приводят к изменению их относительного содержания в функциональном глютенине.

Рассматривая результаты исследований процессов биосинтеза и накопления запасных белков в целом, можно прийти к заключению, что образование белковых макроассоциатов in vivo связано главным образом с преобразованиями полипептидов в посттрансляционный период. Отложению белков в запасающих органеллах предшествует образование белковых комплексов или, вероятно, эти процессы идут одновременно. В любом случае в формировании таких комплексов участвуют различные по биохимической природе полипептиды, образующие сложные по составу ассоциаты посредством межмолекулярных ковален-тных (преимущественно дисульфидных) связей и за счет различных сил невалентных взаимодействий. Эффекты этих взаимодействий могут определяться физиологическим состоянием внутриклеточной среды -редокс потенциалом, рН, концентрацией солевых ионов, а также биохимической природой полипептидов, преаде всего их аминокислотным составом, первичной структурой и другими факторами, определяющими способность белковых молекул к агрегации (см. разделы 4 и 5).

2. Формирование пространственной структуры запасных белков [5, 9, 13, 17, 18, 41, 47]

Уникальные физические свойства белкового комплекса клейковины, состоящего из множества структурных элементов, различающихся молекулярной массой, аминокислотным составом, поверхностным зарядом

молекул, способностью к ассоциации, позволяли постулировать существование сложных механизмов самоорганизации запасных белков при формировании in vivo функционально важных белковых ассоциатов эндосперма, определяющих в итоге физические свойства клейковины.

2.1. Вторичная структура глиадина и глютенина. Из приведенных на рис. 1, А типичных экспериментальных кривых спектроскопии кругового дихроизма (КД) глиадина, глютенина и клейковины видно, что их спектры имеют много общих черт. Близкими являются расположение положительных и отрицательных максимумов спектральных кривых, точек нулевого перехода и характерного плеча в области 222-225 нм. Основные отличия заключаются в абсолютной величине уровня эллиптичности. Содержание ö-спиралей, рассчитанное по [Greenfield, Fasman, 1969], составляло в глиадине около 40%, а в глютеиине и суммарной клейковине на долю ск-спиралей приходилось соответственно 20 и 30%. Об относительно высоком содержании cí-спиральных сегментов s глиадине сообщалось ранее [Hasarda et al., 1968, 1980].

Весьма близкими оказались спектры КД а~. ß-, Í- и w-глиадинов (рис. 1, Б). Сходство конформационной структуры суммарного глиадина и его субфракций свидетельствует о том, что ни одна из субфракций не оказывает доминирующего влияния на пространственную организацию белкового комплекса клейковины. Очевидно также, что межмолекулярные взаимодействия глиадиновых компонентов при совместном их присутствии не сопровождаются конформационными перестройками молекул. Эти факты согласуются с представлениями о преимущественном содержании в глиадиновых полипептидах внутрицепочечных S-S-связей (Wall, Beckwith, 1S69).

Сопоставление спектров КД запасных белков зерновок разных фаз спелости показало, что «информационное состояние глиадинов не зависит от стадии развития эндосперма (рис.'1,В), в то время как пространственная организация глютенина претерпевает существенные изменения (рис. 1,Г). В конце формирования зерновок глютенины характеризовались полностью неупорядоченной структурой. В Ходе налива содержание регулярных структур возрастало и к началу восковой спелости достигало 20-21%, оставаясь стабильным в процессе созревания. Следовательно, в случае"глютенина существует более сложный механизм упаковки (фолдинга) полипептидов, чем процесс самопроизвольного сворачивания, характерный для компонентов глиадина.

Рис. 1. Типичные спектры кругового дихроизма запасных белков пшеницы (сорт Скала): А - глиадин (1), клейковина(2), глютекин(З); Б - ос-глиадин (1), и ¡¿-глиадины (2) и оо-глиадин (3); В -глиадин из зерновок молочной (3) и полной (2) спелости; Г - уксуснораство-римый глютенин из зерновок разных стадий спелости: влажность зерновок 68-70% (3); 53-55% (2); 39-40% (3); 29-3055 (4)-; 18-20% (5).

2.2. Конформация запасных белков по данным ИК-спектроскопии.

0 различиях в пространственной организации глиадина и глютенина свидетельствуют также дачные по кинетике дейтерообмена пептидных

----г

Рис. 2. Кинетика водородно-дейтериевого обмена глиадина (1), клейковины (2) и глга-тенина (3).

Кинетику ^-^Н-обмена изучали по методу "сухих пленок", полученных из растворов белков в 0,3 н. уксусной кислоте.

атомов водорода, скорость замещения которых на дейтерий является, как известно (Byler, Susi, 1986), функцией информационного состояния полипептидных цепей, обусловленного соотношением регулярных и неупорядоченных структурных форм.

Сопоставление кинетических кривых ^^Н-обмена в запасных белках зерновок полной спелости в зависимости от времени экспозиции белковых пленок в атмосфере D20 показало, что в течение первых 10 мин процесса в глиадине, суммарной клейковине и глютенине замещается соответственно 30. 12 и 50% Н-атомов (рис. 2). В дальнейшем скорость обмена снижалась и через 30 мин количество обменявшихся водородов составляло 55, 65 и 70%, а через 70 мин замещения - 67, 75 и 80% соответственно.

Таким образом, количество труднодоступных и необыенивающихся Н-атомов в более упорядоченных молекулах глиадина выше, чем в клейковине и особенно в глютенине. Очевидно, что более свободный доступ дейтерия к пептидным группам глютенина характеризует меньшую плотность его пространственной упаковки. Как и следовало ожидать, параметры дейтерирования белков суммарной клейковины имели промежуточное значение.

2.3. Пространственная структура проламинов злаков. При сравнении кинетики водородно-дейтериевого обмена у проламинов злаков с заведомо разнокачественной клейковиной было установлено (рис.3), что у глиадина пшеницы по сравнению с гордеином ячменя и секали-ном ржи содержание труднодоступных Н-атомов выше соответственно на 10 и 15%; следовательно, при практически одинаковом количестве неупорядоченных структур глиадины пшеницы лучше спирапизованы.

Рис. 3. Характеристические участки ИК-спек-тров глиадина сорта Скала (А), секалина ржи ; сорта Чулпан (Б) и гор! деина ячменя сорта Тоо-I мае (В).

Пунктирные и сплошные линии спектров соответствуют ИК-поглощению до и после дейтерообмена; штрихи - смещение максимума полосы Амид I (1645 - 1660 см"1); полоса Амид II проявляется в области спектра 1540-1545 см"1.

Рис. 4. Разложение спектрального контура Амид I глиадина пшеницы сорта Скала на основные составляющие полосы.

Использовали методику (Byler, Susi, 1986).

1550

1600

Разложение спектральных контуров Амид I на составляющие полосы показало, что в ИК-спектрах дейтерированных проламинов разных видов злаков одновременно с неупорядоченными структурами и d-спи-ралями проявляются полосы, соответствующие . р-складчатому слою, антипараллельному в-слою, а также структурам типа ^-изгибов и р-поворотов, причем фазы спелости зерновок на содержание этих структурных форм не оказывают существенного влияния (рис. 4).

В целом результаты исследований конформационной структуры запасных белков позволяют считать, что процессы формирования белкового комплекса эндосперма in vivo связаны не только с изменением соотношения глиадина, глютенина, их субфракций и отдельных компонентов (си. раздел 1), но и с посттрансляционными преобразованиями белков, особенно заметными в случае глютенина (см.' рис. 1, Г).

Независимо от стадии спелости зерновок содержание с(-спиралей в глиадине пшеницы гораздо выше, чем в глютенине, а также в гор-деине ячменя и секалине ржи. В ходе развития зерновок количество спиральных участков в суммарном глиадине и ct-, p-, Í- и со-субфракциях не изменялось, в то время как в растворимом глютенине содержание регулярных структурных форм существенно возрастало.

Совпадение по времени процессов образования в зерновках высо-коагрегированных форм глютенина (см. раздел 1.2) с интенсивным накоплением в белках S-S-связей (см. раздел 3.1), позволило постулировать, что формирование глютениновых комплексов in vivo происходит за счет межмолекулярных S-S-связей. Отсюда следует, что процессы синтеза структурных элементов глютенина разобщены во времени с процессами формирования белковых макроассоциатов, характерных для клейковины зрелых зерновок.

Скорее всего, фолдинг глиадиновых белков имеет котрансляцион-ный характер, а укладка различных по биохимической природе субъединиц глютенина происходит в посттрансляционный период. Очевидно, что, макроструктурная организация клейковины предопределяется в большей мере структурой глютенина, образующегося в ходе формирования in vivo белкового комплекса эндосперма как предшественника структурного матрикса клейковины. Участие в ассоциации субъединиц глютенина межмолекулярных S-S-связей позволяло предполагать, что этот процесс регулируется ферментами тиол-дисульфидного обмена.

3. Роль ферментов тиол-дисульфидного обмена в формировании белкового комплекса клейковины пшеницы [14, 26, 29, 30, 37, 41-48, 53, 55, 56, 59] С позиций развиваемых в настоящей работе представлений о фи-зиолого-биохимических механизмах формирования белкового комплекса эндосперма в развивающихся зерновках представлялось важным выяс-снить роль в этих процессах активности ферментов, участвующих в реакциях тиол-дисульфидного обмена. В этом отношении наибольший интерес представляли БН-оксид аза, Б-Б-редуктаза и дисульфидизоме-раза, катализирующие соответственно образование, диссоциацию и перегруппировку Б-Б-связей. Обнаруженное нами совместное присутствие активности этих ферментов в развивающихся зерновках косвенно свидетельствовало об их участии в создании и регуляции сбалансированного Б-Б/БН-равновесия в динамичной нативной белковой системе эндосперма.

3.1. Динамика Б-Б-редуктазной и БН-оксидазнсш активностей в развивающихся зерновках пшеницы. Активность ферментов изучали параллельно с определением содержания Б-Б-связей и БН-групп (рис.5). Можно видеть, что в ходе развития зерновок проявлялось два максимума БН-оксидазной активности - в начале и конце налива (при влажности соответственно 65-70 и 40-45%) и один максимум Б-Б-редук-тазной активности (влажность около 55%).

Аналогичные по характеру изменения были отмечены при изучении динамики активности ферментов у группы сортов яровой мягкой пшеницы (см. табл. 6, 7, 13). выращенных в разные годы в контрастных почвенно-климатических зонах (Иркутск - Краснодар). У сортов с различной продолжительностью периода вегетации проявление максимумов и минимумов ферментативной активности, а также изменения в содержании Б-Б-связей и БН-групп оказались сходными и наблюдались при близких значениях влажности зерновок.

Обнаруженная синхронность в изменениях отношений в активностях тиолоксидаза/дисульфидредуктаза и в содержании Б-Б/БН-групп (рис. 6) послужила одним из доказательств существования -зависимости баланса этих групп от активности ферментов/ участвующих в ок-сидоредуктазных БН/Б-Б-превращениях. Во всех экспериментах на ранних этапах развития зерновок баланс складывался в пользу БН-оксидазы, в период молочной спелости - в пользу Б-Б-редуктазы, а

затем вновь БН-оксидазы. При этом характер изменений дисульфидре-дуктазной активности был сходным с изменениями протеиндисульфид-изомеразной и глутагионредуктазной активностей.

70-75 б5-70 55-60 40-45 30-35 15-20 Влажность зерна,%

Рис. 5. Динамика содержания S-S-связей (1), SH-грулл (2), дисульфидредуктазной (3) и ти-олоксидазной (4) активности в развивающихся зерновках пшеницы сорта Скала.

1,8 1,2 0,6

0 L 1_1_|_t_i_

1,8г 1,2 -0,5 -

о L 1—I—1-1-l.

70-75 65-70 50-55 40-45 30-35 15-20 Влажность зерна, %

Рис. 6. Соотношения активности БН-оксидаза/Б-Б-редук-таза (1) и содержания S-S/SH-групп (2) в развивающихся зерновках: А - сорт Скала; Б - среднее по группе сортов.

Сопоставление уровня активности указанных ферментов с содержанием в зерновках низкомолекулярных небелковых тиоловых соединений (рис. 7), выполняющих функцию доноров водорода при ферментативном восстановлении Б-Б-связей, показало сильную зависимость дисульфидредуктазной активности от содержания эндогенных глутати-она и/или цистеина. Ферментативное восстановление окисленных форм этих тиоловых кофакторов осуществляется, как известно [Проскуряков, Зуева, 1964; Кретовин, 1991], с участием НАДФН-зависимых соответственно глутатионредуктазы и цистинредуктазы.

Рис. 7. Точечные графики и теоретические линии регрессии при корреляции между содержанием небелковых SH-групп и активностью дисульфидредук-тазы (1) и тиолоксидазы (2) в процессе развития зерновок пшеницы (среднее для 4-х сортов: Ангара 86, Скала, Лютесценс 656Н5 и Эритроспермум 674Н27.

Судя по коэффициенту детерминации (d), около 60% S-S-редук-тазной активности (рис. 7, линия 1) обусловлено регуляторной функцией небелковых тиоловых кофакторов и примерно 40£ изменений связано с другими факторами. Как и следовало ожидать, на активность кислород-зависимой тиолоксидазы низкомолекулярные тиоловые соединения не влияли (рис. 7, линия 2).

3.2. Действие ферментов на запасные белки пшеницы. Об участии изученных нами ферментов в SH/S-S-метаболизме запасных белков и их широкой субстратной специфичности можно судить также по результатам опытов in vitro.

В экспериментах с различными белковыми субстратами (инсулин, ЕСА или альбумин пшеницы) ферментный экстракт в присутствии восстановленного глутатиона (FSH) или цистеина вызывал ферментативное расщепление. S-S-связей, а в отсутствие этих небелковых тиоловых кофакторов происходило окисление свободных SH-rpynn.

Аналогичным образом, в инкубационной среде, содержащей только растворимые белки отмытой клейковины (рис. 8, вариант К), количество SH-групп не изменялось, как и в присутствии восстановленного глутатиона (вариант Б). Действие ферментного экстракта непосредственно на белки клейковины приводило в аналогичных условиях инкубации к окислению SH-групп, содержание которых снижалось в среднем на 21% (вариант А), тогда как при совместном присутствии ферментного экстракта и ГБН в качестве кофактора дисульфиредуктазы (вариант В) содержание SH-групп увеличивалось (в среднем на 40%), то есть происходило ферментативное восстановление S-S-связей.

Рис.8. Действие ферментного экстракта из зерновок молочной спелости на содержание SH-групп в запасных белках пшеницы. К - контроль (белки клейковины); А - белки + ферменты; Б - белки + TSH; В - белки + ферменты + TSH; i, 2, 3 - варианты опыта с продолжительностью инкубации соответственно 0, 30 и 60 мин. Содержание SH-групп скорректировано относительно нулевого времени инкубации, принятого за 100 %.

Таким образом, один и тот не ферментный экстракт из развивающихся зерновок пшеницы обладает оксидоредуктазной SH/S-S-функцией как по отношению к стандартным субстратам, так и по отношению к запасным белкам пшеницы. Полученные результаты подтверждают высказанное выше предположение, что и в условиях in vivo эти ферменты

2.0«

О L L

2.01

1.0

Рис.9. Распределение БН-оксидазной (1) и 5-Э-редуктазной (2) активности и общего белка (3) при центрифугировании гомогенатов зерновок разных стадий спелости в градиенте плотности сахарозы. За 100% принята суммарная активность во фракциях градиента. А - влажность зерновок 70%; Б -55%.

1.10 1.15 1.20

Плотность сахарозы, г>см~3

могут оказывать влияние на процессы тисш-дисульфидного обмена в многокомпонентной белковой системе эндосперма.

В дальнейшем это предположение косвенно подтвердилось при изучении внутриклеточной локализации ферментов методами дифференциального центрифугирования и центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. При использовании гомогенатов зерновок разных фаз спелости нами было установлено существование двух форм ферментов - свободной (цитоллазматической) и связанной с различными клеточными структурами, в том числе с мембранами эндоплазматичес-кого ретикулума (ЭПР) и белковыми телами (рис. 9).

Полученные результаты свидетельствуют о довольно широком распространении ферментов 5Н/Б-Б-метаболизма в клетке. Обе активности возрастали в период интенсивных биосинтетических процессов, связанных с наливом зерновки. При этом свободная форма, очевидно, регулирует процессы тиол-дисульфидного обмена в цитоплазме, а связанная катализирует аналогичные реакции в соответствии со специфической функцией органелл. Присутствие Б-Б-редуктазной и БН-оксидазной активности во фракциях градиента, соответствующих мембранам ЭПР и белковым телам, обусловлено, скорее всего, их функциональным предназначением в растительной клетке, а именно с синтезом запасных белков и отложением их в запасающих органеллах.

3.3. Взаимосвязь ЗН-оксидазной и Б-Б-редуктазной активности и показателей качества клейковины. В этой серии экспериментов было проанализировано около 80 образцов зерна различных по происхождению сортов яровой мягкой пшеницы, выращенных в разные годы в условиях Краснодарского края и Иркутской области. Отдельно анализировали выборки пшениц для каждой зоны по годам репродукции и общую выборку независимо от условий произрастания.

Удельная активность БН-оксидазы варьировала в пределах от 3,9 ед. (Свободар) до 8,3-9,6 ед. (Спектр, Скала), активность Б-Б-ре-дуктазы - от 1,6-2,0 ед. (Пиротрикс 28/14, Зритроспермум 674Н27, Лютесценс 616Н5) до 4,4 ед. (Спектр). Фенотипическая изменчивость была незначительной по содержанию общего белка и клейковины и относительно высокой - по показателям качества теста и удельной активности ферментов. У разных сортов соотношение активности БН-оксидаза/Б-Б-редуктаза колебалось от 1,4-2,0 (Свободар, Спектр) до 4,0-4,4 (Пиротрикс 28/14, Лютесценс 616Н5).

Обнаруженные сортовые особенности в уровне активности ферментов и проявлении отдельных признаков качества пшениц позволяли предположить, что между этими показателями существует определенная связь, проявляющаяся независимо от условий внешней среды.

Таблица 6

Достоверность различий между активностью ферментов и некоторыми признаками качества у пшениц в зависимости от условий среды

1 1 | Показатели 1 .. Краснодарский НИИСХ (п-18) ) Иркутский НИИСХ( (п-20) | 1 1;-кри- ( терий |

1 |5Н-оксидаза 7,4+0,8 5,3+1,2 | 1.43 |

(Б-Э-редуктаза 2, 3+0, 4 2,9Ю,8 | 146 (

[БН-окс./Б-З-ред. 3, 9+0, 5 2.0+0,4 | 2,94** |

(Белок, % 36,2+0,3 13,6+0,2 | 7,2*** |

¡Клейковина, % 31,0+0,5 28,8+0,7 | 2,56* |

(Устойчивость,мин 20,0+3, 4 9,5+0, 7 | 3,0** |

[Релаксация, е. ф. 56,0*11,5 123+11,6 | 4,1*** |

| Вапориметр, е. ф. 1 88,0+5, 3 70,0+2,8 ( I 2,89** ( 1

Примечание. *,** и *** - достоверно на 5, 1 и 0,1%-ном уровне значимости соответственно; п - объем выборки.

В сравнительно благоприятных климатических условиях Краснодарского края наблюдалась тенденция к повышению тиолоксидазнон и снижению дисульфидредукгазной активности, но эти различия в изученных выборках пшениц не были статистически значимыми (табл. 6). Достоверными оказались различия в величине отношения активностей БН-оксидаза/Б-З-редуктаза, а также по ряду основных показателей качества клейковины и теста.

Отсутствие значимых корреляционных связей между активностью ферментов и содержанием белка предполагает независимый синтез в зерновках ферментов системы тиол-дисульфидного обмена и запасных белков (табл. 7). Отрицательная связь содержания клейковины с 5Н-оксидазной активностью и отсутствие связи с активностью Б-Б-ре-дуктазы свидетельствуют, по нашему мнению, о том, что эти фермен-

ТЫ, уЧаСТБуЯ Б ПрОцбССЗл фОрмприЗЗКЯЯ исЛКОБЫл аССОЦИаТОБ, ИМ6ВТ, вероятно, лишь косвенное отношение к накоплению запасных белков эндосперма. Отрицательные, в ряде случаев достоверные, связи БН-оксидазной активности с такими показателями качества, как водо-поглотительнач способность (ВПС), упругость (ИДК-1М) и расплыва-емость теста, и положительные связи с силой муки, устойчивостью и валориметрической оценкой теста вполне логичны и соответствуют сформулированному в настоящей работе постулату об участии Б-Б-связей в стабилизации белкового комплекса клейковины.

Таблица 7

Корреляционные связи (г) между удельной активностью ферментов и некоторыми показателями качества (п - объем выборки)

Г 1 | Показатели | БН-оксидаза Б-Б-редуктаза 1 БН-окс./Б-Б-ред.|

| качества | (п=32)| 1 (п=20) (п=12) | 1 (п=20) (п=12) |(п=20)| | 1

|Белок (общий) | -0,09 -0,21 -0,34 -0,13 0,14 0,10 I

¡Клейковина муки] -0, 58* -0,78*** 0,16 -0,12 -0, 58* -0,59** I

|Сила муки | 0, 53 0,51* 0, 42 0,05 0, 64* 0, 56** |

|ВПС муки | -0,41 -0,69** 0,25 0,24 -0, 62* -0, 60** |

|ИДК-1М теста | -0, 25 -0,64** 0,16 0,04 -0, 58* -0,59**|

|Растяжимость | 0, 75** 0,49* -0, 07 0, и 0, 76** 0,31 |

|Устойчивость | 0, 60* 0, 35 -0, 56 -0,18 0, 92** *0, 58* |

|Расплываемость | -0, 51 -0,05 0,31 -0,04 -0, 67* -0,20 |

| Вапориметр, оц. | 0, 59* 0, 23 -0, 39 -0,10 0,77** 0,42 |

|Расплывч. хлеба | - -0, 37 - 0,34 - -0,46* |

|Цвет мякиша | 1. . I - -0, 27 0, 34 -0,49* | 1

Примечание. *, ** и *** - достоверно на 5, 1 и 0,1%-ном уровне значимости соответственно. ВПС - водопоглотительная способность.

Установленные тесные корреляционные связи между отношением БН-оксидаза/Б-Б-редуктаза, определяющим в конечном счете величину оксидоредуктазного Б-Б/БН-показателя запасных белков, и большинством основных признаков качества муки, теста, клейковины и хлеба делают этот показатель наиболее технологически значимым и перспективным для использования в практической селекции пшениц.

d. Природа сил внутри- и меяиолекулярных взаимодействий запасных белков разнокачественных видов злаков [8, 21, 23, 47]

Для установления общих закономерностей образования белковых ассоциатов и вклада в этот процесс различных по природе сил внутри- и межмолекулярных взаимодействий у злаков с заведомо разнокачественной клейковиной (пшеница, рожь, ячмень) был использован модифицированный нами метод оценки агрегирующей способности запасных белков, предложенный впервые японскими исследователями [Arakatsa et al., 1976] для ранжирования пшениц по качеству клейковины. Этот метод предусматривает проведение агрегации белков в 0,2 М фосфатном буферном растворе, рН 5,6, содержащим 2 М NaCI. Основными характеристиками процесса агрегации служат коэффициент начального этапа агрегации (Кагр.) и показатель агрегации (tlO/C), отражающий отношение степени помутнения раствора белка за 10 мин процесса к его концентрации в реакционной среде.

Мы провели дегааькое исследование способности запасных белков различных видов злаков к образованию агрегированных форм, характерных для белкового комплекса клейковины. Путем изменения условий процесса (рН, ионная сила и состав среды агрегации) были установлены основные факторы и силы белок-белковых взаимодействий и их вклад в общую ассоциацию: ионно-солевые и гидрофобные взаимодействия, водородные и дисульфидные связи.

4.1. Ионно-солевые взаимодействия. Для выяснения роли ионно-солевых взаимодействий в образовании белковых макроассоциатов была проведена серия экспериментов по агрегации запасных белков пшеницы, ржи и ячменя в фосфатном буферном растворе с моделированием условий процесса путем изменений рН среды агрегации и концентрации нейтральной соли.

При изменении рН среды в интервале от 5,55 до 9,10 агрегирующая способность запасных белков возрастала во всех случаях (табл. 8), причем наибольшее увеличение показателей агрегации наблюдалось при рН 6,0-7,5. Очевидно, что при рН ниже изоэлектрической точки белков, когда CQQH-группы остатков дикарбоновых аминокислот и С-концевые группы полипептидных цепей находятся в недиссоцииро-вачном состоянии и белки несут одноименный (положительный) заряд за счет протонировачия аминогрупп боковых остатков диаминомоно-

КЗриОНОБЫХ КИСЛОТ И £ЛЬф£-амИКОГруПП, ОираЗОЕЗНИе исЛКОБЫХ З.ССО-циатов в отсутствие ионов нейтральной соли не происходило.

Таблица 8

Агрегирующая способность запасных белков пшеницы и ржи в зависимости от рН среды и концентрации нейтральной соли

Концентрация NaCI в среде агрегации

Белки пшеницы

Клейковина

Белки ржи

-i-i---j-1-Г—

5, 551 6, 451 9,10(5,55! 6, 45j 9,10|5, 5516, 45)9,10 _i_i_| , i_i_i i_i_

Контроль 8, 3 мМ 24, 9 mM 66,4 mM

17+2 62i5 120+8110+2 22+2 41±3 76+5 122+9(16+2 33+3 70+6 90+9 124+8|28+3 48+5 102+8 110+8 124+9|55±5 53+6 _i_

60+5)16+2 36+3 70+6 66±5'25±2 42+3 72+5

66±4|45+4 55+4 73+6

66±6|59±6 60+4 73±7

Примечание. Приведены средние значения показателя tlO/C в О, 02 М Иа-фосфатном буфере при разных значениях рН (5, 55, 6, 45 и 9,10) среды агрегации. Контроль - без NaCI.

Внесение в реакционную среду NaCI приводило к увеличению показателей агрегации при кислых значениях рН и практически не влияло в слабощелочной области рН. С повышением концентрации нейтральной соли наибольший эффект наблюдался в кислой среде в случае натизных запасных белков, выделенных непосредственно из пшеничной муки. В сравнении с суммарными белками муки пшеницы агрегирующая способность белков ржи и ячменя, а также отмытой клейковины была в 1,5-2,0 раза ниже независимо от условий процесса.

Таким образом, преобладание в белковых молекулах одноименно заряженных групп при кислых значениях рН препятствует их межмолекулярной ассоциации. С повышением рН среды происходит диссоциация СООН-групп, а количество ионизированных аминогрупп снижается. Вследствие компенсации разноименных зарядов стабильность белков в растворе утрачивается. В присутствии NaCI происходит блокирование положительных и отрицательных зарядов противоионачи соли, в результате чего нарушается равновесное состояние белков. В слабощелочной области рН, в результате уравновешивания противоположно заряженных групп, влияние солевых ионов на параметры агрегации белков снижается. •

Полученные результаты отражают существенную роль поверхностного заряда белковых молекул в формировании иакроагрегированных форм. Очевидно, что способность запасных белков разнокачественных злаков стабильно сохранять в растворах равновесное состояние определяется особенностями их аминокислотного состава.

4.2. Гидрофобные взаимодействия. Сравнительные исследования действия анионных, катионных и иеионных детергентов, влияющих прежде всего на гидрофобность белковых глобул, показало, что характер их действия на агрегацию запасных белков неодинаков при различных значениях рН среды.

Таблица 9

Влияние анионного детергента (ДЦС-Ка) на агрегацию запасных белков злаков при разных значениях рН среды

,РН раствора

Пшеница j Рожь

Ячмень

-1-1-!-1-1-i—

К 1 23|550 | К | 23(550 1 К _!-1-!-1-

23 ¡550

Клейковина

К | 23|5501

4,45 6,45 9,10

t I I г г

12+2) 94|101 |12±2( 59] 49 ]10+2 59+4|113| 77 |40i4| 70| 41 ¡37+4 120+9|126J 59 |68+6) 77j 35 |66±7 _| | г t ' |

42 | 45 57 | 31 75 i 27

6+21 52| 45| 29+3| 69[ 29j 61+5| 71| 24|

Примечание. Приведены средние значения показателя гЮ/С для концентраций 23 и 550 мкМ ДДС-Na; К - контроль (без детергента).

В присутствии ДЩНУа, алифатический остов которого заряжен отрицательно, наибольший эффект проявлялся в кислой области рН, при которой белковые молекулы несут преимущественна положительный заряд (табл. 9). Внесение в реакционную среду с рН 4,45 23 мкМ детергента приводило к значительному увеличению параметров агрегации. При значениях рН, близких к нейтральным, наблюдалось при этой концентрации детергента 2-кратное усиление агрегации, а в слабощелочной области эффект рН нивелировался. С повышением концентрации до 100-200 мкМ ДДС-Ма показатели агрегации увеличивались, стабилизировались в интервале концентраций 250-350 мкМ, соответствующих, очевидно, потенциально возможному уровню агрегации запасных белков, а затем снижались, особенно резко в щелочной об-

пгмчжи ПГМ> т^тлплЛ >мгЛп«ц1п>м11т мл плчч ипл т ги лллпплг Лп п« ^пт»

лиыя рл, Пуп пиш^ии йлрсшпоацпл ишшшслвпал оар.чдио иеллиаил

молекул противоионачи анионного детергента не была необходимой.

Сходство в характере процессов агрегации запасных белков пшеницы, ржи и ячменя при различных значениях рН среды в присутствии ДЦС-Иа свидетельствует об однотипности механизмов образования белковых ассоциатов у злаков с различным качеством клейковины. Обнаруживаемые при этом различия в абсолютных величинах показателей агрегации обусловлены физико-химическими свойствами запасных белков, прежде всего различиями в содержании способных к ионизации боковых аминокислотных остатков.

Таблица 10

Влияние катионного (ЦТМАБ) и неиокного (Тритон Х-100) детергентов на агрегацию запасных белков злаков при разных значениях рН среды

I-1-(-1-1

I РН I-1-1-1-,-,-1-,-,-1

¡среды! К ¡1,8 мМ ¡9.0 мМ| К |1, 8 мМ|9,0 мМ| К 11,8 мМ|9, ОмМ |

|-1-1-1-1-1-(-1-1-1-1

| 4,45 | 12±2| '3/13 | 22/16|12±2| 2/8 | 22/7 |10±2| 4/8 |20/8 | | 6,45 | 59±5| 6/55 | 24/50|40±4| 8/29 [26/27 |37±4) 6/26 \22/25\ 1 9,10 |120±9|25/110|34/108168±6[13/56 |32/50 |66±7|17/54 |26/48|

I_1_I_1_' I_1_I . . I_1_I

Примечание. Приведены средние значения показателя Х30/с для двух концентраций ЦТМАБ (числитель) и Тритона Х-100 (знаменатель); К - контроль (без детергентов).

Как и следовало ожидать, действие на процессы агрегации запасных белков катионного детергента цетилтриметиламмоний бромида (ЦТМАБ), алифатический остов которого, в отличие от ДЦС^а, несет положительный заряд, оказалось противоположным (табл. 10).

При концентрации 1,8 мМ ЦТМАБ наблюдалось резкое снижение показателей агрегации в сравнении с контролем во всех вариантах опыта, причем одни и те же количества детергента вызывали у белков разных злаков однонаправленные эффекты. С повышением рН среды и концентрации ЦТМАБ агрегирующая способность несколько возрастала, но оставалась значительно ниже, чем в контроле. По-видимому, вызываемый этим детергентом эффект связан со стабилизирую-

прл влиянием его гидрофобного остова на равновесное состояние белковых молекул.

Это предположение подтверждается действием неионного детергента Тритона Х-100, аналогичным анионному по характеру, но более слабым. Запасные белки пшеницы, ржи и ячменя неодинаково отзывчивы на воздействие этого детергента. С повышением его концентрации агрегативная устойчивость белков при изменении рН среды в целом сохранялась, хотя абсолютные значения показателей агрегации при разных рН заметно отличались.

Таким образом, присутствие в среде агрегации различных детергентов, оказывающих влияние на поверхностный заряд белковых молекул или их гидрофобность, приводит к изменению способности запасных белков формировать макроагрегнрованные формы.

4.3. Водородные и дисудьфидные связи. В определении способности белков к ассоциации, помимо очевидных ионных и гидрофобных взаимодействий, важная роль принадлежит водородным связям, относящимся к одному из основных типов невалентных сил [см. например, Брандтс, 1973; Кушнер, 1977]. В присутствии мочевины или гуачи-дингидрохлорида, разрушающих водородные связи, наблюдаюсь снижение показателей агрегации запасных белков злаков (табл. 11). Следовательно, введение в среду агрегации денатурирующих реагентов вызывает определенный стабилизизирующик эффект, причем с повышением их концентрации агрегативная устойчивость белковых молекул возрастала независимо от рН среды.

Таким образом, наблюдаемое в эксперименте повышение устойчивости белков к образованию агрегированных форм в присутствии денатурирующих реагентов является прежде всего следствием специфического их действия на водородные связи. Уменьшение числа этих связей сопряжено с раскручиванием полипептидных цепочек, изменением их гидрофобности и, следовательно, состояния гидратной оболочки. В результате снижается способность белков к межмолекулярной ассоциации, хотя изменений в величине поверхностного заряда белковых молекул при этом не происходит. Характер изменений параметров агрегации запасных белков злаков с разнокачественной клейковиной в присутствии денатурирующих реагентов совпадал, ко различался по абсолютным значениям. Наиболее" чувствительными к этим агентам оказались запасные белки пшеницы.

Таблица 11

Влияние денатурирующих реагентов на агрегацию запасных белков злаков при разных значениях рН среды

1 I ! рн 1 среды t i i | Пшеница j Рожь I ! i Ячмень ! i

1 1 1 III j К 12QÖM.41550 мМ j К |200.мМ|550 мМ i 1 ! Iii i ¡ I К ¡200 мМ j 550 мМ j ! 1 1

! 4,45 I 6,45 i 9,10 i. iil lit | 32±2j 7/26! 6/25 |12±2| 9/21j 8/20 | 59+5¡34/36¡24/30 j40±4 J29/25¡20/25 1120+9192/95 j65/80 168+6158/40141/40 i......i . i...... i _ i. .1, 1 i 1 10+2| 6/21 | 4/20 | 37+4¡26/24 ¡38/21 | 66+7)39/40 ¡39/30 j i . i i

Примечание. Приведены средние значения показателя тЗО/С для двух концентраций мочевины (числитель) и гуанидингидрохлорида (знаменатель). К - контроль (без реагентов).

Значения показателей агрегации у глиадина и суммарных запас- : ных белков кз муки пшеницы значительно выше, чем у белков отмытой клейковины и глютенина (рис. 10). Очевидно, в процессе гидратации белков муки происходят необратимые преобразования в структурном состоянии составляющих клейковину белковых фракций глиадина и глютенина. Немаловажную роль в этих превращениях играют межмоле- • кулярные S-S-связи, стабилизирующие информационное состояние белковых комплексов. Эта функция S-S-cвязей отчетливо проявляется в том, что препараты предварительно восстановленных глютенина и клейковины имеют более высокие показатели агрегации в сравнении с их нативными формами. К аналогичному в сущности выводу можно : прийти при анализе данных, полученных другими исследователями i [Bernardin, 1975; Arakawa et ai., 19763.

4.4. Агрегирущая способность отдельных фракций запасных белков злаков. Многокомпонентноеть состава запасных белков, различающихся рядом биофизических свойств (молекулярная масса, величина поверхностного заряда, аминокислотный состав, первичная структура), позволяла предполагать существование количественных различий в способности отдельных белковых фракций к образованию агрегированных форм.

2 4 6

Врем.« агрегации, ы

Рис. 30. Типичные кривые агрегации запасных белков злаков в зависимости от времени. 1 и 2 - глиадин и суммарные белки пшеницы сорта Скала соответственно; 3 - запасные белки ржи сорта Чул-пач; 4 - запасные белки ячменя сорта Тоомас; 5 и 6 - белки отмытой клейковины и глютенин пшеницы. Здесь и на рис. 12 условия агрегации:- 0,2 Я Ма-фосфатный буфер с рН 5,6, содержащий 2 М ИаС1 (Агакача еЬ а!., 3976).

Изучение динамики агрегации запасных белков пшеницы, ржи и ячменя, а также белков отмытой клейковины и глютенина показало, что при общем сходстве этого процесса во времени существует зависимость параметров агрегации от биохимической природы белков и их происхождения (рис.10). Наиболее высокой способностью к агрегации обладали глиадин и суммарные белки пшеницы, наименьшей - запасные белки ячменя. Запасные белки ржи по этому показателю занимали промежуточное положение. Весьма низкой агрегирующей способностью обладали уксуснорастворимые белки отмытой клейковины и глютенина. Следовательно, гидратация запасных белков в процессе отмывания клейковины сопровождается частичной и, видимо, необратимой их денатурацией с образованием промежуточных ассоциатов за счет невалентных взаимодействий.

Представляло интерес сопоставить показатели агрегации у на-тивных субфракций проламинов с различной молекулярной массой, выделенных из муки злаков с заведомо разнокачественной клейковиной: пшеницы, ржи и ячменя. С этой целью были использован®; сорбенты типа Тоуореаг1 НИ, позволяющие проводить достаточно эффективное фракционирование непосредственно в среде выделения проламинов (водные растворы этанола). 0 составе различающихся по молекулярной массе групп компонентов судили по данным ПААГ-электрофореза. Из рис. 33 видно, что независимо от происхождения проламинов пер-

выми элюируются компоненты с относительно высокой молекулярной массой и низкой электрофоретической подвижностью в кислой среде.

Рис. И. Гель-хроматография глиадинов пшеницы сорта Скала (А) и секалинов ржи сорта Чулпан (Б) и схемы компонентного состава фракций элюатов.

1-8 - фракции элюатов и их состав при ПААГ-электрофорезе в А1-лактатном буфере, рН 3,1, по [ВигЬик, 2П1шап, 1978]; А - суммарные спектры проламинов. Условия фракционирования: сорбент Тоуоре-аг1 Н¥-50, колонка 60x1,2 см, элюирование 55%-ным этанолом.

Сопоставление агрегирующей способности выделенных групп компонентов глиадина пшеницы, секалина ржи и гордеина ячменя показало, что наибольшей склонностью к межмолекулярной ассоциации обладают компоненты с относительно высокой величиной поверхностного заряда, прежде всего й-глиадины (рис. 12). Медленно мигрирующие при электрофорезе а-глиадины, а также соответствующие им по подвижности компоненты проламинов ржи и ячменя имели сравнительно низкие показатели агрегации.

Считается, что относительно высокомолекулярные компоненты, прежде всего медленно мигрирующие ш-глиадины, ' не содержащие остатков полуцистина, придают клейковине эластичность [Вакар, 1975; Колпакова, 1976], а быстроподвижные при электрофорезе с(-глиадино-вые компоненты с меньшей молекулярной массой, но содержащие Б-Б-

соязи, обеспечивают образование характерных для клейковины микрофибриллярных белковых структур [Каэагба е! а1., 1976; 1980].

Рис. 32. Агрегирующая способность отдельных групп проламиновкх компонентов пшеницы, ржи и ячменя. 3, 2, 5 и 6 - фракции, содержащие преимущественно «-, И-, в- и «-компоненты глиадина пиеницыгсоответст-венно; 3 и 4 - компоненты секалина ржи со средней и низкой подвижностью при ПААГ-электрофорезе (см. рис. И); 7 - слабоподвижные компоненты ячменя. Условия агрегации см.рис. 10.

По нашим дачным, электрофоретическая подвижность проламиновых компонентов, обусловленная величиной их заряда в кислой среде, не всегда коррелирует с их молекулярной массой, однако тенденция к усилению межмолекулярных взаимодействий у проламинов с более высоким поверхностным зарядом сохраняется независимо от вида злака.

5. Факторы, определяющие способность запасных белков к межнолекулярной ассоциации [8, 21, 23, 47]

В предыдущем разделе было показано, что в основе процессов формирования белкового комплекса клейковины лежат многочисленные взаимодействия. Сильная зависимость способности запасных белков формировать надмолекулярные ассоциаты в меняющихся условиях среды вызывала интерес к выяснению вклада различных по природе сил в образование единой белковой системы клейковины.

По аналогии с белками животного происхождения (Птицын и др., 1983) можно предположить, что в нативном состоянии запасные белки имеют глобулярную структуру. Переход из нативной конформации в иное термодинамическое состояние связан с развертыванием глобул и, следовательно, с перераспределением вклада действующих сил. Чрезвычайно высокая биохимическая гетерогенность запасных белков

Время агрегации, мим

ПреДП0Л2ГЗ.еТ СУцсСТБОВапиЕ СЛОЖНОГО мЭХЗлИЗмй, ЛелЗЩЭГО В ОСНиВе образования многокомпонентного комплекса клейковины.

Равновесное состояние запасных белков в растворах устойчиво сохраняется лишь при определенных значениях рН, ионной силы и состава среды. Действие конкретных факторов или их экспериментальное сочетание приводит к неодинаковым результатам. Следовательно, нативное состояние запасных белков определяется совокупностью действия различных типов ковалентных и невалентных сил.

Для запасных белков злаков характерны пороговые значения рН, при которых белковые молекулы теряют свои нативные свойства необратимо, причем это происходит в условиях, предотвращающих нарушение пептидных, дисульфидных и других ковалентных связей. Пороговый характер изменений в агрегирующей способности при определенных значениях рН среды позволил сделать заключение, что в стабилизации равновесного состояния белковых молекул важную роль играют ионно-электростатические взаимодействия. При значениях рН ниже рК диссоциации СООН-групп суммарный положительный заряд полипептидов создается ионизированными аминогруппами. Наличие одноименно заряженных боковых остатков аминокислот вызывает эффекты электростатического отталкивания, препятствующего межмолекулярной ассоциации белков.

—х-

Условия агрегации: 0,02 М Ма-фосфат-нкй буфер' с указанными значениями рН. 4, 5 и 6 - агрегация запасных белков пшеницы в этом же буфере в присутствии соответственно 8,3, 41,5 и 66,4 мМ ИаС1.

Рис. 13. Зависимость агрегирующей способности запасных белков пшеницы сорта Скала (3), ржи сорта Чулпан (2) и ячменя сорта Тоомас (3) от рН и ионной силы среды.

& 8 рН раствора

В области значений рН, близких к нейтральным, суммарный заряд молекул и его знак определяются разностью суммы катионных остатков основных аминокислот и суммы анионных остатков дикарбоновых аминокислот. При рН около 9,0 и выше, в связи с практически полной деионизацией аминогрупп и диссоциацией карбоксильных, сульф-гидрильных и фенольных групп, белковые молекулы приобретают отрицательный заряд, величина которого будет соответствовать суммарному содержанию в белках кислых аминокислот, цистеина и тирозина.

140 г

Рис. 14. Агрегирующая способность запасных белков пшеницы в зависимости от природы и концентрации детергентов при разных значениях рН среды. К - контроль (0,02М Иа-фосфатный буфер); 1, 2, 3 и 4 - агрегация в этом же буферном растворе в присутствии 20, 40, 500 и 700 мкМ ДДС-Ша; 5 и 6 - в присутствии 9 и 3 мМ ЦТМАБ; 7 - в присутствии 5 мМ Тритона Х-100.

5 6 7 8 9 рН среды агрегации

Зависимость параметров агрегации запасных белков от ионной силы среды особенно четко проявляется в кислой области рН. Внесение в среду агрегации МаС1 приводит к экранированию поверхностного заряда белковых молекул противоионами нейтральной соли (рис. 13). Аналогичный эффект в кислой области рН вызывает анионный детергент ДДС-На (рис. 14), в присутствии которого происходит резкое ослабление электростатических сил отталкивания одноименно (положительно) заряженных остатков основных аминокислот. Но в отличие от нейтральной соли с увеличением концентрации ДЦС-Иа возрастает устойчивость белков к агрегации вследствие замены положительного заряда молекул на противоположный. Следовательно, при

концентрациях анионного детергента выше или ниже тех, которые эквивалентны числу заряженных групп, возникают эффекты ионно-элект-ростатической стабилизации равновесного состояния молекул белков.

Как и следовало ожидать, катионньй детергент ЦТМ.АБ, блокирующий отрицательно заряженные группы белков, вызывал эффекты, противоположные анионному ДДСНЧа (см. рис. 14, кривые 5 и 6). В кислой области рН внесение катионного детергента не оказывало существенного влияния на равновесное состояние запасных белков. С увеличением числа отрицательно заряженных групп (при смещении рН среды агрегации в щелочную область) действие детергента усиливалось, но не достигало эффекта, вызываемого ионно-солевыми взаимодействиями.

Аналогичное по характеру, хотя и менее сильное, влияние на устойчивость белкового равновесия, оказывал неионный детергент Тритон Х-100 (см. рис. 14, кривая 7). Следовательно, для сохранения нативного состояния белков необходимы не только избыток одноименно заряженных групп, но и действие других невалентных сил, в частности гидрофобных взаимодействий и водородных связей.

В сохранении устойчивости запасных белков к меямолекулярной ассоциации, кроме ионно-электростатических и гидрофобных взаимодействий, важная роль принадлежит водородным связям, составляющим значительную долю невалентных сил.. Изменение числа эффективных водородных связей действием мочевины или гуанидингидрохлорида приводит к нарушению нативного состояния белковых молекул, изменению их гидратной оболочки и, как следствие, к снижению способности образовывать агрегированные формы.

Прямые доказательства непосредственного участия .водородных связей в образовании белкового комплекса были получены ранее при изучении дейтерированных белков клейковины [Вакар, 1975; Кретович, 1991].

Различия в способности отдельных фракций запасных белков формировать макромолекулярные ассоциаты тесно связаны с особенностями их аминокислотного состава (табл. 12). Глиадиновые белки по сравнению с глютениновыми обогащены дикарбоновыми аминокислотами, особенно глутаминовой кислотой (глутамином), но содержат значительно меньше основных аминокислот. Боковые остатки этих аминокислот определяют.величину поверхностного заряда полипептидных

цепочек, элиминация которого приводит к ассоциации белковых молекул за счет невалентных взаимодействий (гидрофобные контакты, водородные связи), обусловленных остатками нейтральных аминокислот.

Таблица 12

Содержание групп аминокислот в банковых фракциях пшеницы, мол. %

г |Аминокислоты Альбу- 1 " ¡Глобу- 1 Глиа-1 1 Глюте- Глюте- 1 | Глюте- 1 Глюте-|

] (группы) 1 мины лины 1 дины нин-1 нин-2 ¡нин-З 1 нин-4 |

1 |Кислые 32,3 1 23,1 43,2 34,5 32,3 1 | 29,5 23,5 |

|Основные 9,0 1 И,2 5,5 9,5 6,4 1 11,0 14,6 |

¡Нейтральные 58,7 1 65,7 53.3 56,0 61,3 ( 59,5 61,9 |

i Кислые/ 1 1

)основные | 3, 59 | 2,06 1 7,86 i 1 3, 63 5,05 1 2,68 1 1.61 | 1

Примечание. Представлены средние дачные по 12 сибирским сортам пшеницы. Глотенин-З, -Z и -3 - фракции клейковины, растворимые соответственно в 0,1 н. СН3С00Н, 6М мочевине и 6М мочевине + 1% 2-меркаптоэтанапа (см. табл.3); глютенин-4 - остаточный белок.

Из табл. 12 видно, что для глиадиновых белков, обладающих повышенной способностью к агрегации (см. рис. 10), характерно наиболее высокое соотношение суммарного содержания группы кислых и основных аминокислот, придающих белковым молекулам соответственно отрицательный и положительный заряды, определяющие ионные взаимодействия. Кроме этого, большое количество кислых аминокислот (особенно глутаминовой) в клейковинных белках находится преимущественно в виде высокополярных амидов (глутамина, аспарагина), способных к образованию многочисленных водородных связей, которые в совокупности с гидрофобными остатками неполярных аминокислот (глицин, лейцин, изолейцин, аланин, валин, фенилаланин, пролин, триптофан, метионин) создают условия для межмолекулярных взаимодействий [Wall, Beckwith, 1969; Кретович, 1991].

Из анализа этих результатов можно заключить, что наиболее высокая способность глиадина к агрегации определяется не только абсолютным содержанием, но и близким к оптимальному соотношением

многочисленных функциональных групп аминокислот в составляющих его белковых компонентах. Для труднорастворимых субфракций глюте-нина, особенно для остаточного глютенине-4, характерно самое низкое соотношение кислых и основных аминокислот, близкое к глобулинам, и весьма слабая способность к межмолекулярной ассоциации.

Для образования белковых макрокомплексов глвтенина как структурной основы клейковины немаловажное значение имеет, очевидно, биохимическая природа входящих в его состав субъединиц (см. табл. 5). По результатам аминокислотного анализа субъединицы А1-А4 с мол. массой в пределах 20-30 кДа, а также субъединицу В2 с мол. массой около 60 кДа можно отнести к типичным альбуминам. Эти субъединицы обогащены остатками полуцистина, способными участвовать в реакциях тиол-дисульфидного обмена. Субъединица А5 с мол. массой около 40 кДа, отличающаяся низким содержанием лизина при высоком содержании глутаминовой кислоты (глутамина) и пролина, относится к глиадиноподобным белкам.

Близкие по свойствам субъединицы были обнаружены ранее в ДСН-нерастворимой фракции клейковины других сортов пшеницы [Danno et al., 1976]. По содержанию трех аминокислот (лизина, глутаминовой кислоты и пролина), количественное соотношение которых отражает биохимическую природу белковых фракций пшеницы [Конарев, 1980; Чернов и др., 19853, высокомолекулярные субъединицы С1-С4 можно рассматривать как истинные глютенины, контролируемые длинным плечом хромосом 1-й гомеологической группы [Preston et al., 1975], а ряд субъединиц со средней молекулярной массой - как полипептиды альбумино-глобулиновой природы, обогащенные S-S-связями.

Таким образом, в образовании макроструктурных форм глютенина in vivo участвуют различные по биохимической природе полипептиды, способные к межмолекулярной ассоциации как за счет ковалентных, прежде всего S-S-связей, так и всех основных типов невалентных взаимодействий. Хотя каждый вид невалентных сил в сравнении с S-S-связями является весьма слабым, однако в совокупности они могут оказывать сильное воздействие на конфирмационную стабильность и свойства многокомпонентных белковых комплексов клейковины.

Существование зависимости параметров агрегации от условий среды и связанными с этим переходами белковых молекул от нативно-го состояния в агрегированное, заставляет по-новому взглянуть на

проблему образования в эндосперме белковых комплексов, характерных для клейковины зрелого зерна. По-видимому, переход белковых молекул из полностью развернутого состояния на ранних фазах налива зерновок в ассоциированное в конце этой фазы является необходимым условием для формирования типичных для клейковины структур. Даже незначительного изменения условий среды агрегации достаточно для резкого изменения структурного состояния белковых молекул.

Отсюда следует, что под влиянием различных воздействий, в том числе рН среды и малых концентраций солевых ионов, запасные белки in vitro переходят в стабильное агрегированное состояние, характерное для белкового комплекса клейковины. Можно полагать, что при аналогичных или сходных физиологических условиях в клеточных структурах зерновок in vivo процессы постсинтетичеких преобразований белков также связаны с образованием из развернутых форм полипептидов сложных мзкроассоциатов глютенина.

6. Возможности улучшения физических свойств клейковины

пшеницы

Изучение физиолого-биохииических основ биосинтеза и накопления запасных белков, процессов формирования белковых структур в развивающемся эндосперме, принципов структурно-функциональной организации запасных белков, а также природы сил, участвующих в образовании сложных белковых комплексов клейковины, направлено в конечном счете на поиск путей и способов сознательной регуляции физических свойств клейковины и реологических характеристик теста.

6.Í. Факторы внешен среды и условия минерального питания [6, 30, 16, 20, 22, 33-35, 38, 573. Известно, что полигенные признаки качества клейковины определяются генотипом пшеницы и в значительной мере зависят от действия различных факторов среды в разные фазы онтогенеза растений [например, Кумаков, 1980, 1988].

На первом этапе наших исследований при оценке генотипической вариабельности и кодификационной изменчивости показателей качества клейковины в меняющихся условиях внешней среды были сопоставлены эти показатели у большого набора сортов яровой мягкой пшеницы, выращенных в контрастных почвенно-климатических зонах страны.

л о

1аилица до

Проявление признаков качества различных сортов яровой пшеницы в зависимости от условий внешней среды

Масса |Клейко-|ИДК-1, | Устой-1 Разжи- |Валори-

Сорт 1000 вина. усл. |чивость| жение ¡метрич.

зерен, | % ед. I теста, 1 теста, (оценка.

г [ мин | I 1 е.ф. 1 е.ф. 1

Скала* 34,4 35,5 80 8,0 60 71

Скала** 32,8 42,0 90 7,0 140 63

Скала*** 33,8 37,7 85 7,5 90 68

Ангара 86** 29,0 28,5 ' 65 8,0 310 68

Ангара 86*** 31,0 27,3 90 5,4 73 48

Светояр* 36,2 34,4 100 4,5 90 55

Светояр** 28,1 34,6 80 5,0 150 52

Спектр* 40,2 35,0 80 6,0 75 60

Спектр** 39,2 36,2 50 9,0 110 71

Лютесценс 636Н5* 32,0 35,0 55 18,0 20 94

Лютесценс 616Н5** 34,7 38,9 80 9,5 160 53

* - Средние значения по сортам, выращенным в Краснодарском крае (1986 г.);** - Иркутской области (1988 г.),**" - то «е (3991 г.).

Из табл. 13 можно видеть, что показатели качества клейковины подвераены под влияниям факторов среды неравнозначным изменениям. Одни сорта (Скала, Светояр) в целом сохраняли характерные признаки качества, другие сорта (Ангара 86, Спектр, Лютесценс 636Н5) проявляли сильную реакцию на условия выращивания. Генотипическая вариабельность и паратипическая изменчивость особенно заметны для тех свойств теста и клейковины, которые могут определяться процессами формирования белковых комплексов в ходе развития зерновок.

К аналогичному в целом заключению можно прийти и на основании результатов, полученных в экспериментах по оптимизации условий минерального питания растений, обеспечивающих реализацию потен-цапьных возможностей генотипа. Проведенные нами 3-летние опыты с различными сортами яровой пшеницы показали сильную зависимость

основных показателей качества о? состава, дозы, способов внесения минеральных удобрений, азотных подкормок, сеникации и других элементов региональных интенсивных технологии.

Таблица 14

Влияние азотного питания на показатели качества пшеницы Скала

Показатели

I-1_

| Клейковина, % |

| ИДК-1, усл. ед. |

| Сила муки, е. а. |

| Упругость теста |

| Устойчивость, мин |

| Разжижение, е. ф. |

| Вапориметр, е. в. | | Хлеб, см3/100 г муки|

| Расплывчатость, ед. |

} Оценка хлеба, баллы |

Контроль | Опыт | 1 1 г

29, 4±0, 7 1 1 I 34,311,2 | 3, 52**

81,010,8 | 86, ОЮ, 7 | 4,72**"

186, 018,9 } 210,016,9 | 2, 3 7*

99, 0±2, 0 | 90, 812, 6 | 2, 73*

2, 9 Ю, 1 . | 3, 810, 2 1 3, 38**

И2.0ИЗ, 2 | 78,014,0 | 2, 86*

47,511, 9 | 55,8±1,5 ( 3, 47**

661±6, 5 | 77317,6 | 7,20***

0, 41Ю,02 | 0,3910,02 | 0,73

4,6+0,04 | 4.6Ю.06 1 -

_1_

Примечание. Контроль - Рео^о- 0ПЬ1Т " КбоРбоКбо + (некорневые подкормки 20%-ным раствором мочевины),' *, ** и *** — достоверно на 5, 1 и 0,уровне значимости соответственно.

Из табл. 14 можно видеть, что усиленное азотное питание, включая некорневые подкормки в фазах кущения и/или колошения, оказывает существенное влияние на содержание клейковины, качество муки, теста и хлеба. Известно, что возможности регулирования признаков качества условиями минерального питания зависят от геноти-пических особенностей пшениц, в том числе отзывчивости сорта на удобрения [Павлов, 1984; Кумаказ, 1988; Назарова и др., 1990].

Установленная нами зависимость ряда показателей качества от факторов среды связана, по-видимому, не только с функционированием белоксинтезирувщэй системы зерновки в целом, но и с особенностями накопления функционально важных фракций запасных белков и их компонентов, способных к формированию за счет Б-Б-сзязей ассоциатов, определяющих основные показатели качества клейковины. Полученные результаты согласуются с концепцией о важной физиологической роли

ферментов, участвующих в БН/8-8-метаболиэме запасных белков.

6.2. Белковые маркеры признаков в селекции сибирских сортов яровой пшеницы на качество [19, 27, 28, 32, 39, 40, 50-52, 58]. Большие возможности в улучшении технологических и хлебопекарных свойств пшеницы на уровне сорта заключены б использовании в селекции белковых маркеров хозяйственно-полезных признаков растений [Созинов, 1985]. Теоретической основой этого метода является существование сопряженности генов, кодирующих определенные компоненты глиадина или их группы, с генетическими системами, контролирующими отдельные селекционные признаки растений или их совокупность. Это обстоятельство обусловливает реальность выявления аллельных вариантов блоков глиадиновых компонентов, которые могут служить белковыми маркерами ценных признаков в селекции пшеницы.

О 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Í5¡¿¡gtotail^ ksá W¿ fcjá

1 2 3

>co

Рис. 15, Злект-рофореграммы компонентов глиадина яровых мягких пшениц Rollo (R) и Drott (D). 4 и 5 -гибриды Fj; !1, 2 и 3 - гибрид-• ные формы из гетерозиготной популяции F2;

6-8 - константные линии последующих поколений гибридов.

Многолетние исследования электрофоретических спектров глиадина у большого числа сибирских сортов пщеницы, несущих гены устойчивости к экстремальным факторам среды, и пшениц иностранной селекции, обладающих относительно высокими хлебопекарными свойствами, а также у гибридов от различных комбинаций' скрещивания этих пшениц, позволило идентифицировать предположительные блоки совместно наследуемых и, вероятно, генетически сцепленных компонентов глиадина и установить их информативную ценность для селекции.

Таблица 15

Аллелькые варианты блоков компонентов глиадина некоторых сортов и гибридов яровой мягкой пшеницы

1 1 Сорт, Глиадинкодирующие хромосомы i t |Генотипические|

1 гибрид i i i i 1 формулы 1

ЗА j IB i ID 1 i 6A 1 t 6B i i 6D (Созинов, 1985)1

¡Новосибирская 67* 1 A3 1B4 1D3 6.A16 6B2 6D16 3.4.3.16.2. 36|

[Безостая 1* 1 A4 3B1 1D1 6A1 6B1 6D1 4.1.1.1.1.1 ¡

1 Скапа 1A5 1B3 1D10 6A15 6B3 6D9 5.3.10.15.3.91

1Орхон 1A2 1B13 1D5 6A19 6B3 6D8 2. 13.5. 19.3.81

1Тюменская 1 1A1 1B1 1D5 6A14 6B1 6D10 1.1.5.14.3.10J

¡Rollo, Р 1A2 1B2 1D3 6A4 6B20 6D7 2.2.3.4.20.7 1

¡Drott, Р i Al 1B1 1D1 6A15 6B3 6D9 1.1.1.15.3.9 1

1 Rol lo X Drott - 1 1A2 1B2 1D1 6 A 3 5 6B3 6D7 2.2.1.15.3.7 ¡

¡Rollo X Drott - 2 1 Al 1B1 1D3 6A35 6B3 6D7 1.1.3.15.3.7 ¡

[RoîJo X Drott - 3 1A2 1B2 1D1 6A4 6B3 6D9 2.2.1.4.3.9 1

¡Rollo X Drott - 4 1A2 1B2 1D3 6A15 6B20 6D9 2.2. 3.15.20.91

1 Rollo X Drott i - 5 1A2 ... 1B2 1D3 6A15 6B20 6D7 2.2. 3.15. 20.71 ! I

* - Стандартные сорта с известными вариантами аллельных блоков глиадина по каталогам [Созинов, 3 985; Metakovsky, 1991].

Из приведенных в табл. 15 блоков компонентов глиадина и гено-типических формул, отражающих сортовые особенности пшениц, интерес представляют гибридные линии от скрещивания сортов Rollo и Drott (RxD), различающихся всеми аплельными вариантами глиадинко-дирующих локусов. Можно видеть, что гибридная линия RxD-1 имеет в своем составе три блока, унаследованные от сорта Rollo (1А2, 1В2 и 6D7), и три блока - от сорта Drott (1D1, 6А15 и 6ВЗ). Гибрид RxD-2 отличается от сорта Drott двумя блоками (1D3 и 6D7), принадлежащими пшенице Rollo. В гибриде RxD-З обнаружены три блока (1А2, 1В2 и 6А4) от сорта Rollo и три (1D1, 6ВЗ и 6D9) - от сорта Drott. В RxD-4 блоки 6Al5 и 6D9 принадлежат сорту Drott, а четыре других - сорту Rollo. Гибридная линия RxD-5 и родительский сорт Rollo различаются всего одной парой аллельных блоков - 6А4 и

6А15, а линии НхО-4 и ИхО-5 - блоками 609 и 607, то есть в этих случаях проявление признаков будет происходить на одинаковом по компонентному составу глиадина фоне, характерном для этих линий.

Таблица 16

Роль аллельных вариантов блоков глиадина в определении генетически обусловленного уровня количественных признаков линий Р3-Р6

Сравниваемые блоки глиадина

Признаки

6А4 и 6А15

607 и 609, ^критерий

Высота растений, см| 83,1 ¿2. 1 78,0±1, 5 | 1,97* +5. 6**

Размер колоса, см | 9, 6±0, 3 10, 4±0, 4 1 1,60 +0,7

Число колосков, шт. | 15, 6±0, 3 15,0±0, 3 I 3,42 +0,2

Число зерен, шт. | 47, 1+1,1 43,111,6 | 2,06* +2,1*

Зерно гл. колоса, г| 1,8±0, 05 1, 6+0,06 | 2,56** -0,1

Масса 1000 зерен, г| 38, 2И,1 38, 4Ю, 8 1 0,14 +2, 9*

Коэф. агрегации, К [ í, 2Ю,1 3, 7Ю, 2 | 2,22* +5, 7***

Показатель хЮ/С | 81, 4*3, 3 73, 812, 3 | 1,99* +5,1***

Седимент. муки, мл | 42^2,5 2911,5 | 4,45*** -6,0**

Устойч. теста, мин | 5, 6±1,1 3, 0Ю, 5 | 3,34* +2,2*

Вапориметр, е. а. | 80+5,0 4015,0 ' | 5,70*** +30**

Примечание. , и - достоверно на 5, 1 и 0,1% уровнях значимости соответственно.

В поколениях РЗ-Рб растения с идентичными типами спектров глиадина объединяли в выборки и анализировали основные селекционные признаки и показатели качества. Сопоставление количественных признаков у линий, различающихся всего одной парой аллельных блоков, показало (табл. 16), что наличие блока 6А4,. в сравнении с блоком 6А15, достоверно сопряжено с высотой растений, количеством и массой зерен в главном колосе, способностью запасных белков к агрегации и рядом других показателей качества муки и клейковины.

Аналогичным образом, в выборках растений, содержащих аллель-ные блоки 6D7 и 6D9, наблюдались устойчивые различия по отдельным селекционным признакам: наличие блока 6D7 связано с крупно-зерностью и меньшей высотой растений, а блока 6D9 - с повышенной озерненностью главного колоса, лучшими агрегирующими свойствами запасных белков и некоторыми другими показателями.

Для сибирских сортов яровой мягкой пшеницы наиболее характерны аллельные варианты блоков глиадина, кодируемые хромосомами 1-й и 6-й гомеологических групп: 1А3, 1А5, 1В1, 1D3, 6А4, 6ВЗ и 6D9. Наличие этих белковых маркеров наиболее тесно сопряжено с важными в хозяйственном отношении признаками растений независимо от присутствия в генотипах иных глиадиновых блоков, что представляет селекционный интерес (рис.16).

Рис. 16. Схемы электрофоретических спектров глиадина разных сортов яровой мягкой пшеницы.

1 - Бирюсинка; 2 - Иркутская 49; 3 - Саратовская 29; 4 - Онохой-скач 4; 5 - Скала; 6 - Читинская 1; 7 - Бурятская 34; 8 - Лютес-ценс 758; 9 - Монакинка; 10 - Дальневосточная; 11 - Амурская 74; 12 - Амурская 71; 13 - Селенгинская; 14 - Мильтурум 553; 15 -Стрела; 16 - Нарымская 246; 17 - Цезиум 31; 18 - Новосибирская 67.

Идентификация аллельных вариантов блоков глиадина, устойчиво маркирующих отдельные признаки растений или их совокупность, позволяет уже на ранних этапах селекционного процесса выявлять перспективные генотипы и вести направленный их отбор при создании новых сортов пшеницы для почвенно-кпиматических условий Сибири.

6.3. Биотехнологические подходы к улучшению качества клейковины. Известно, что высокачественная клейковина пшеницы содержит больше Б-Б-связей [Кретович, 1958, 1973, 1991; Касгконзк!, 1974]. Консистенция теста улучшается при интенсивном его замесе на воздухе или внесении неорганических окислителей (например, солей бромата или иодата). Клейковина с повышенным содержанием Б-Б-связей более устойчива к эндогенным протеазам муки, действие которых вызывает релаксацию теста.

Поскольку главными структурными элементами клейковины являются глиадин и глютенин, содержащие значительное (особенно у слабых сортов пшеницы) количество свободных БН-групп, снижающих стабильность теста во время его приготовления, было естественным предположить, что для создания оптимальной макроструктуры клейковины необходимо стабилизировать ее каркас путем образования дополнительных межмолекулярных Б-Б-связей.

Установленная нами связь между основными показателями качества клейковины и удельной активностью ферментов тиол-дисульфидного обмена у различных сортов пшеницы (см. табл. 6 и 7), а также их действие на содержание в запасных белках Б-Б-связей (см. рис. 8) явились основными предпосылками для выяснения путей и возможностей ферментативной регуляции реологических свойств теста в технологических процессах его приготовления.

В специальной серии экспериментов нами было изучено действие на содержание Б-Б-связей в клейковинных белках частично очищенных [Кичатинова, 3997] ферментных препаратов, обладающих БН-оксидаз-ной активностью (см. рис. 8). В качестве источников ферментов использовали зерно разных стадий спелости, муку пшеницы и сои, отруби и другие растительные источники. Некоторые результаты опытов по действию ферментных экстрактов из созревающих зерновок пшеницы на растворимые белки отмытой изложены в разделе 3.2.

На рис. 17 представлены данные применительно к липоксигеназе (линолеат: кислород оксидоредуктаза, КФ 1.33.13.12), способной катализировать окисление БН-групп в белках опосредованно путем образования перекисных и гидроперекисных радикалов у полиненасыщенных жирных кислот [ВиНгоБе, 1963; Кретович, 1991]. В этих экспериментах использовали стандартную липоксигеназу фирмы "Sigma" и экстракты муки сои, обладающие липоксигеназной активностью.

Можно видеть, что при внесении в тесто линолеата Na (вариант 1) как субстрата для эндогенной липокснгеназы пшеничной муки значения показателя H/D, характеризующего формоудерживащую способность теста в процессе его приготовления, в сравнении с контролем (вариант К) увеличиваются за счет образования новых S-S-связей при окислении -SH-групп запасных белков перекисными радикалами, образующимися при действии фермента на двойные связи палиеновых жирных кислот муки.

Рис. 17. Формоудерживающач способность пшеничного теста (H/D) при внесении линолеата Na (1), экстракта липоксигеназы из муки сои (2) и при их совместном действии (3). К - контроль (без указанных добавок). H/D - отношение высоты шарика теста к его диаметру в процессе его расс-тойки в стандартных условиях [Оценка качества зерна: справочник. М.:Агро-промиздат, 1987].

Внесение в тесто только липоксигеназы или экстракта муки сои (вариант 2) частично устраняет дефицит в пшеничной муке SH-окси-дазной активности, что также приводит к определенному увеличению показателя H/D за счет окислительного действия экзогенного фермента на эндогенные, субстраты - ненасыщенные жирные кислоты муки.

И наконец, при совместном внесении фермента и субстрата (вариант 3) достигается наибольший эффект в повышении формоудержива-ющей способности теста, то есть в снижении его распльваемости за счет окислительного превращения оксигенированными продуктами свободных SH-групп остатков цистеина запасных белков муки в S-S-связи, стабилизирующие структурный остов белкового комплекса клейковины. В результате этого увеличивается- объемный выход хлеба, улучшаются его внешний вид и другие показатели качества.

Аналогичные в сущности результаты были получены при изучении действия на консистенцию теста ферментных экстрактов из пшеничной муки грубого помола, отрубей пшеницы и других источников.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе впервые детально изучены процессы биосинтеза и на-' копления запасных белков в развивающихся зерновках яровой мягкой пшеницы. Наиболее характерной чертой биосинтетических процессов является неравномерность в интенсивности синтеза отдельных белков.

На самых ранних этапах развития зерновок интенсивнее синтезируются белки глютениновой фракции, а в фазе налива - глиадиновые белки, особенно а-глиадины (см. табл. 1 и 2). В составе глиадина выявлены группы синхронно синтезирующихся полипептидов (см. табл. 4), представляющих собой аллельные варианты блоков генетически сцепленных компонентов, кодируемых, как известно [Созинов, 1985], гомологичными локусами хромосом 1-й и 6-й гомеологических групп.

Следовательно, несмотря на различия в количественном содержании отдельных компонентов глиадина, регуляция их синтеза осуществляется скоординированными механизмами функционирования белоксин-тезирующей системы зерновки. Аналогичным образом, в составе глю-тенина обнаружены группы субъединиц со сходным характером биосинтеза (см. табл. 5). Известно, что высокомолекулярные субъединицы Функционального глютенина контролируются генами, локализованными в длинном плече хромосом 3-й гомеологической группы [Bietz, Wall, 1975], однако относительно генетического контроля других субъединиц глютенина имеется крайне маю сведений [Morris, 1998].

Совпадение по времени периода интенсивного накопления в созревающих зерновках высокоагрегированных белковых ассоциатов функционального глютенина (см. табл. 3) с периодами максимального образования в запасных белках S-S-связей (см. рис. 5, А) и с максимумом активности тиолоксидазы, катализирующей реакции окисления SH-групп в полипептидах, при относительно низкой при этом активности дисульфидредуктазы, расщепляющей S-S-связи (см. рис. 5, Б), свидетельствует о взаимозависимости этих показателей in vivo.

p g п с р с к и с и ь; х радикалов полиненасыщенных жирных кислот [ But t tosg, 1963; Кретович, 1991], и активность глутатконредуктазы, регенерирующей восстановленные формы глутатиона - кофактора протеинди-сульфидредуктазы и, вероятно, протеиндисульфидизомеразы. Характер изменения дисульфидредуктазной, дисульфидизомеразной и глутатион-редуктазной активности в процессе развития зерновок совпадал.

Одновременное функционирование в развивающихся зерновках специфических ферментативных активностей позволило выдвинуть гипотезу о системе ферментов, катализирующих оксидоредуктазные S-S/SH-превращения в динамичной системе запасных белков в котрансляцион-ный и/или посттрансляционный периоды.

С учетом этих результатов, а также данных по прямому действию SH-оксидазы и S-S-редуктазы на запасные белки in vitro (см. рис. 8), выдвинута и экспериментально обоснована концепция ферментативного характера формирования в эндосперме белковых ассоциатов как структурных предшественников белкового комплекса клейковины физи— ологичеки зрелого зерна пшеницы.

Более полное представление о роли S-S-связей и SH-грулп в процессах образования белковых мачроассоциатов в созревающих зерновках было получено при изучении особенностей пространственной организации запасных белков методами спектроскопии кругового дихроизма и дейтерообмена аммдных атомов водорода полипептидных цепей. Оказалась, что в репродуктивной фазе онтогенеза вторичная структура суммарного глиадкна и его основных субфрачций не зависит от стадии развития зерновок (см. рис. 1, Б и В), в то время как конформационнач структура глютениновых белков претерпевает существенные изменения (см. рис. 1, Г). Как и следовало ожидать, структурное состояние белков суммарной клейковины занимает промежуточное положение между глиадиновыми и глютениновьши белками (см. рис. 1, А и рис. 2).

Пространственная организация проламинов злаков с заведомо разнокачественной клейковиной - пшеницы, ржи и ячменя, не имеет принципиальных различий, однако для глиадина пшеницы '.характерно сравнительно более высокое содержание й-спирачьных участков (см. рис. 3 и 4). Результаты позволили постулировать, что различия в физических свойствах клейкозины этих злаков в большей степени связаны со структурой их глютелиновых белков.

Дальнейшие исследования были направлены на изучение факторов и природы сил внутри^- и межмолекулярных взаимодействий и их вклада в белок-белковую агрегацию как процесса, определяющего в конечном счете формирование клейкозинного комплекса.

Поскольку способность запасных белков к образованию ассоциа-тов in vitro сильно зависит от рН, ионной силы и состава среды, для получения исходной информации о роли этих факторов в физиологических условиях in vivo необходимо было смоделировать условия, имитирующие внутриклеточные. Экспериментально были определены минимальные концентрации нейтральных солевых ионов в среде агрегации и другие условия, при которых параметры агрегации белков в опыте достоверно отличались от контроля (см. табл. 8-11).

Интерпретируя величину показателя ti О/С (отношение содержания агрегированных форм белка к его концентрации в среде агрегации за 10 мин процесса) в качестве биофизического критерия способности белков к межмолекулярной ассоциации и сопоставляя его значения в контроле и опыте в меняющихся условиях, была дана оценка вклада в белок-белковые взаимодействия ионно-солевых, гидрофобных, водородных и дисульфидных -связей.

Результаты этой серии экспериментов позволили прийти к важному выводу, что независимо от факторов среды процесс агрегации может быть представлен в виде интегральной суммы множества временных состояний взаимодействующих белковых молекул, но в любом случае агрегация запасных белков носит кооперативный характер и является результатом совместного действия различных по природе сил. По нашему мнению, в этом заключается многофакторный характер формирования многокомпонентной макроструктуры клейковины.

Описанный подход к трактовке экспериментальных данных позволил приблизиться к пониманию механизмов самоорганизации белковых молекул in vivo. Существование в нативном эндосперме характерного для клейковины белкового матрикса [Попов, 1979; Батыгина, 1987; Shewry et al., 1997] косвенно подтверждает наше предположение о том, что образование белковых ассоциатов в развивающемся эндосперме осуществляется с участием сил, обнаруживаемых нами в экспериментах in vitro.

Результаты исследований процессов синтеза запасных белков, формирования их вторичной структуры in vivo и агрегированных бел-

новых форм in vitro, позволили постулировать, что процесс самоорганизации запасных белков в развивающихся зерновках состоит по крайней мере из трех стадий. На самых ранних этапах развития зерновок вновь синтезированные полипептиды находятся главным образом в виде неупорядоченного клубка. В ходе интенсивных биосинтетических процессов, связаных с наливом зерновок, эти полипептиды претерпевают посттрансляционные преобразования, формируя элементы регулярной вторичной структуры глютенина, в стабилизации которых участвуют в основном водородные связи и гидрофобные взаимодействия неполярных аминокислотных групп полипептидных цепочек.

В дальнейшем, в конце налива - начале созревания, из субъединиц различной биохимической природы (в том числе альбумино-глобулиновых и глиадиновых) происходит интенсивное формирование промежуточных, но достаточно компактных белковых структур натив-ного глютенина, стабилизируемых межцепочечными S-S-связями, образование которых регулируется ферментами SH/S-5-метаболизма.

Поскольку пространственная структура глиадина и его основных субфракций остается при этом неизменной (см. рис.1), следовательно, именно сложные по компонентному составу белковые ассоциаты глютенина определяют в конечном счете структурный остов клейковины физиологически зрелого зерна пшеницы.

И наконец, в процессе гидратации запасных белков, в частности при отмывании клейковины или приготовлении теста, глютениновые ассоциаты путем тонкой подстройки молекул глиадина превращаются в уникальную надмолекулярную белковую структуру, стабилизированную всеми силами специфических взаимодействий, включая дисульфидные, водородные и ионно-солевые связи, а также гидрофобные контакты.

Выращивание одной и той же группы сортов пшеницы в разные годы в экологически контрастных зонах страны (Краснодарский край и Иркутская область) позволило определить генотипическую вариабельность и - паратипическую изменчивость основных признаков качества клейковины и удельной активности ферментов тиол-дисульфидного обмена. Реакция различных генотипов пшеницы на действие факторов внешней среды оказалась неоднозначной. Независимо от сорта особенно сильные изменения отмечались по устойчивости теста к релаксации, то есть показателю, который в наибольшей степени может определяться S-S/SH-соотношением в белках клейковины,- определяющим плотность ее пространственной упаковки (см. табл. 6, 7 и 13).

Аналогичные по сути результата были получены при изучении

влияния на качество • зерна условий минерального питания растений. Основные элементы интенсивной технологии (различные соотношения NPR, способы внесения удобрений, азотные подкормки в разные фазы онтогенеза растений, сеникация и т.д.) в условиях Иркутской области вызывали сходные по характеру, но не равноценные изменения.

Наиболее зачетный эффект был получен при выращивании растений на высоком фоне минеральных удобрений (N60P60K60), внесенных в рядки при посеве, с последующими некорневыми подкормками в фазах кущения и/или колошения 20%-ным раствором мочевины из расчета 20-30 кг/га (см. табл. 14). В сравнении с контрольными вариантами опыта эти условия приводили к статистически значимому увеличению содержания клейковины и к улучшению ряда показателей качества.

С точки зрения развиваемых в настоящей работе представлений можно.полагать, что действие благоприятных факторов среды на признаки качества клейковины связано не только с созданием оптимальных условий для сбалансированного функционирования белоксинтези-рующей системы в репродуктивный период онтогенеза, но и необходимых условий для образования белковых ассоциатов эндосперма, прежде всего глютенина как структурной основы клейковины.

Выдвинутая концепция ферментативного характера формирования белкового комплекса клейковины основывается на следующих экспериментальных данных: а) на сходстве изменений в соотношениях активности БН-оксидаза/Б-Б-редуктаза и содержания Б-Б/БН-групп в ходе развития зерновок (см. рис. 6); б) на совпадении по времени максимума тиолоксидазной активности с интенсивным образованием в созревающих зерновках белковых комплексов глютенина (см. рис.1, Г и рис. 5); в) на результатах экспериментов in vitro по прямому действию ферментов на белковые субстраты клейковины (см. рис. 8); г) на различиях в уровнях удельной активности ферментов у разнокачественных сортов пшеницы (см. раздел 3.3); д) на данных по зависимости специфических активностей от факторов внешней среды (см. табл. 6); е) на существовании тесных связей между активностью ферментов и основными показателями качества пшеницы (см.табл. 7); ж) на данных по локализации ферментов в клеточных органел-лах (ЭПР, белковые тельца), имеющих непосредственное отношение к синтезу и запасанию белков (см. рис.9).

Вполне вероятно, что высокэя генотипическая вариабельность и весьма сильная кодификационная изменчивость признаков качества клейковины обусловлены особенностями функционирования в меняющихся условиях среды лабильной системы ферментов, регулирующих SH/ S-S-статус запасных белков пшеницы.

В пользу этого представления свидетельствуют также данные о сложной системе регуляции ферментативной активности в развивающихся зерновках с помощью небелковых тиоловых кофакторов (восстановленный глутатион и цистеин). На самых ранних фазах баланс ферментов складывался в пользу SH-оксидазы при относительно низком содержании небелковых тиолов. В период налива S-S-редуктазная активность возрастала более высокими темпами параллельно с интенсивным образованием небелковых SH-групп. К. началу фазы восковой спелости содержание этих групп снижалось, а баланс активностей вновь складывался в пользу SH-оксидазы; при этом S-S/SH-равнове-сие смещалось за счет усиленного образования дисульфидных связей. Изменения в содержании восстановленного глутатиона и цистеина связано, скорее всего, с их участием в реакциях ферментативного расщепления S-S-связей i п. vivo в качестве кофакторов, окисленные формы которых затем восстанавливаются с НАДФН-зависимыми соответственно глутатионредуктазой и цистинредуктазой. Тесная взаимосвязь между дисульфидредуктазной активностью и содержанием в зерновках небелковых SH-групп (см. рис. 7) позволяет предположить их важную регуляторную функцию в тмол-дисульфидном обмене.

Сходство динамики дисульфидредуктазной и протеиндисульфидизо-меразной активности позволяет предположить, что эти тиолы могут участвоать и в реакциях ферментативной изомеризациии S-S-связей.

По всей вероятности, тиолоксидаза, дисульфидредуктаза, ди-сульфидизомераза, цистин- и глутатионредуктазы функционируют в клетке в едином (совмещенном) тесте, координирование регулируя не только работу белоксинтезирующей системы в целом, в том числе активность ключевых ферментов транскрипции и трансляции, . но и SH/ S-S-метаболизм запасных белков и, еидимо, их фолдинг irvvivo.

Высказанное представление является основополагающим в развиваемой концепции ферментативного характера формирования в эндосперме белковых макроассоциатоз как структурных предшественников клейковины физиологически зрелого зерна пшеницы.

Описанные в разделе 3. 2 результаты по прямому действию ферментного экстракта на клейковинные белки iv vitro позволяли постулировать, что белковая матрица теста, представляющая собой комплекс глиадина и глютенина, нонет быть укреплена с помощью ферментов, способных изменять S-S/SH-соотношение в клейковинных белках в процессе приготовления теста. Проведенные нами исследования показали реальность использования этих ферментов в качестве биологических улучшителей физических свойств клейковины и консистенции теста вместо применяемых химических окислителей (см. рис. 17).

Изучение активности ферментов SH/S-S-метаболизма в зерновках линий с межсортовым замещением отдельных пар хромосом 1-й и 6-й гомеологических групп Ш, 1 В, ID, 6.4, 6В или 6D), несущих, как известно, гены запасных белков в гексаплоидных пшеницах, у высокобелкового, но сравнительно низкокачественного сорта-реципиента Диамант 1, на гомологичные хромосомы от высококачественного сорта-донора Новосибирская 67, показало, что замещение хромосом 1А и 6D оказывает статистически достоверное влияние на изменение липокси-геназной и дисульфкдредуктазной активности. Полученные результаты свидетельствуют о важной роли этих хромосом в синтезе и/или регуляции активности ферментов тиол-дисульфидного обмена и, следовательно, в определении структуры белкового матрикса клейковины.

В целом эти исследования направлены на выяснение путей и возможностей направленного конструирования перспективных геномов яровой мягкой пшеницы методами хромосомной инженерии.

Научно-практические разработки и рекомендации

1. Способ повышения хлебопекарных качеств клейковины из муки слабых сортов яровой мягкой пшеницы с помощью ферментных препаратов растительного происхождения вместо химических улучшителей.

2. Способ оценки и отбора из гибридных популяций рачних поколений перспективных генотипов при селекции пшеницы на качество по составу запасных белков, параметрам их агрегации и величине отношения активности 8Н-оксидаза/3-5-редуктаза.

3. Способ улучшения качества клейковины сибирских сортов яровой мягкой пшеницы путем повышения оксидоредуктазного S-S/SH-no-казателя оптимизацией условий минерального питания растений.

выводы

1. Выдвинута и экспериментально обоснована концепция ферментативного характера формирования белкового комплекса клейковины пшеницы (Triticum aestivum L.), согласно которой фолдинг и стабилизация макроструктурных форм запасных белков эндосперма in vivo регулируются системой ферментов тиол-дисульфидного обмена, катализирующих образование, распад и изомеризацию S-S-связей.

2. Установлены особенности биосинтеза и накопления белков на последовательных этапах репродуктивной фазы онтогенеза, отражающие скоординированкость функционирования белоксинтезируклцей системы зерновок. Альбумины, глобулины и глютенины интенсивно синтезируются на самых ранних стадиях развития зерновок, а биосинтез глиадиновых белков происходит в основном в фазе налива.

3. В составе глиадина обнаружены полипептиды со сходной динамикой биосинтеза и накопления, представляющие собой блоки генетически сцепленных компонентов. Генотипически специфичный состав глютенина формируется в процессе налива зерновок, при этом интенсивность синтеза и накопления субъединиц с мол. массой 41, 58 и 113 кДа заметно выше независимо от фазы развития зерновок.

а) содержание регулярных структурных форм, в частности «-спиралей и e-структур, в глиадине значительно выше, чем в глютенине; пространственная структура функционально важных субфракций глиадина стабильна независимо от фазы спелости зерновок;

б) содержание регулярных белковых структур в глютенине закономерно возрастает в ходе налива и созревания зерновок; процессы синтеза субъединиц глютенина и их посттрансляционная модификация и укладка разобщены во времени;

в) формирование и стабилизация глютенина как основы структурного матрикса клейковины совпадают по времени с интенсивным накоплением в запасных белках внутри- и межмолекулярных S-S-связей.

зей, действие которых носит кооперативный характер и существенно зависит от условий среды и биохимической природы полипептидов.

6. В развивающихся зерновках пшеницы координиоовачно функционирует специализированная система ферментов, катализирующих образование (тиол: кислород оксидоредуктаза, КФ 1.8.3.2, линолеат: кислород оксидоредуктаза, КФ 1.13.11.12), диссоциацию (тиол:протеин-дисульфид оксидоредуктаза, КФ 1.8.4.2) и перегруппировку (тиол: протеиндисульфидизомераза, КФ 5.3.4.1) S-S-связей в белках:

а) динамика тиолоксидазной и дисульфидредуктазной активности тесно коррелирует с содержанием в запасных белках S-S-связей и •SH-групп. Характер изменения активности дисульфидредуктазы сходен с динамикой активности дисульфидизомеразы и глутатионредуктазы и коррелирует с содержанием в зерновках небелковых тиолов (восстановленный глутаткон, цистеин) - кофакторов ферментативного расщепления дисульфидных связей.

б) достоверные изменения S-S/SH-соотнощения в клейковинных белках при действии ферментов тиол-дисульфидного обмена in vitro служат независимым экспериментальным подтверждением, концепции ферментативной регуляции SH/S-S-статуса запасных белков in vivo.

в) ферменты SH/S-S-метаболизма не имеют узкой локачизации в клетке; наличие этих ферментов во фракциях мембран эндоплазмати-ческого ретикулума и белковых тел может быть связано с их участием в фолдинге запасных белков с образованием в эндосперме натиз-ных белковых структур как предшественников клейковины физиологически зрелого зерна.

7. Активность ферментов тиол-дисульфидного обмена является генотипически специфичным признаком, зависящим от факторов внешней среды, в том числе от уровня минерального питания растений. Весьма вероятно, что лабильная ферментная система, регулирующая

5-S/SH-равновесие в запасных белках, имеет отношение к изменчивости показататей качества клейковины в меняющихся условиях среды.

8. Активность протеиндисульфидредуктазы и липоксигеназы у линий пшеницы с межсортовым замещением отдельных пар хромосом 1-й и

6-к гомеологических групп от разнокачественных' сортов Диамант 1 и Новосибирская 67 достоверно связана с хромосомами 1А и 6D, в которых, видимо, локализованы структурные и/или регуляторные гены, контролирующие синтез и/или активность этих ферментов.

9. ИДсНТифицИрОБЗНЬ! ПрсДПОЛОЕМТЗЛЬНЫЗ ЗЛЛбЛЬНЫс Б£рИ£Н7Ы 5ЛО-ксв компонентов глиадина, контролируемых хромосомами 3-й и 6-й гомоологических групп. Маркерные блоки 1AI, ЗА5, ЗВЗ, 1D3, 6А4, 6ВЗ и 6D9 сопряжены с показателями качества клейковины, зерновой продуктивностью и некоторыми другими селекционно важными признаками сибирских пшениц.

10. Полученные в настоящей работе результаты изучения функциональной роли ферментов тиол-дисульфидного обмена в формировании структурных ассоциатоз запасных белков явились теоретической ос-нозой для разработки новых подходов селекционного и биотехнологического улучшения хлебопекарных свойств пшеницы с использованием для этих целей интегрального оксидоредуктазного S-S/SH-показателя при оценке и отборе перспективных генотипов и направленной регуляции физических свойств клейковины и теста.

11. Разработана общач стратегия комплексных исследований проблемы качества клейковины с использованием фмзиолого-биохимических, биофизических и генетических методов, . в том числе методов хромосомной инженерии для создания новых генотипов пшеницы с оптимальным сочетанием хозяйственно-полезных признаков.

Основные публикации по теме диссертации:

3. Kostka V., Morayek L., Trufanov V. A., Keil В. and Sorra F. K-Terminal Fragment of Hog Pepsin // Abstr. FEBS meet., 5th, Prague, 1968, p. 224.

2. Trufanov V. A., Kostka V., Keil В. and Sorm F. N-Terminal Fragment of Hog Pepsin // Europ. J. Biochem. 1969, N7. P. 544-548.

3. Kostka V., Moravek L., Trufanov V. A., Keil В. and Sorm F. Sequence Studies on Hog Pepsin // Enzyraes and Isoenzymes Structure, Properties and Function / London and Mew York: Acad. Press. 3970, V. 38. P. 93-300.

4. Труфачов В.А., Кузина Г.С., Чернов А.Б. Сравнительное изучение глиадинов и глютенинов двух сортов яровой пшеницы // Физиология роста и развития растений / Иркутск: СИФИБР СО АН СССР, 1974, N 32. С. 333-134.

5. Макаренко С. П., Мохарозский М. С., Труфанов В. А., Чернов А.В.// Исследование вторичной структуры глиадина и глютенина пше-

ницы сорта Скала методом ИК-спектроскапии // Физиология роста и развития растений / Иркутск: СИФИБР СО АН СССР, 1976. С.24-25.

6. Чернов А. Б., Березовская Е. В., Левина Н.В., Олехова Г. Н., Кондратов В.В., Труфанов В. А. Сравнительная характеристика глиа-дина пшеницы в связи с условиями выращивания // Физиолого-биохи-мические и экологические аспекты устойчивости растений к неблагоприятный факторам внешней среды /Отв. ред. Р. К.С-аляев. Иркутск: СИФИБР СО АН СССР, 1977. С. 66-70.

7. Чернов А. Б. .Левина Н. В., Труфанов В. А. Динамика биосинтеза отдельных компонентов глиадина и глвтенина в созревающем зерне пшеницы //.Азотный и белковый обмен растений / Материалы Всесоюзн. симпозиума. Тбилиси, 3978. G. 70-71.

8. Труфанов В. А., Каашонкина Н. Е., Фартыиева Н. В., Чернов А. Б. Субъединичный состав глютенинов различных сортов пшеницы // Физиология и биохимия роста и развития растений / Иркутск: СИ0И5Р СО АН СССР, 1979. С. 29-30.

9. Макаренко С. П., Труфачов В. А. Дейтерообмен глиадиновых белков клейковины пшеницы // Физиология и биохимия роста и развития растений / Иркутск: СИФИБР СО АН СССР, 1979. С.45-47.

30. Труфачов В. А., Чернов А.Б. Клейковинные банки пшеницы в зависимости от азотного питания и фазы спелости зерновки // 1У Всесоюзный биохимический съезд / Тез. науч. сообщ. М.: Наука, 1979. Т. 3. С. 190.

13. Чернов .4.Б., Левина Н. В., Труфачов В. А. Интенсивность включения 14 С- и °58-метаболитов в различные компоненты глиадина и глютенина в зависимости от фазы развития зерновки // Физиология роста и развития растений в условиях Сибири / Иркутск: СИФИБР СО АН СССР, 1980. С. 58-60.

32. Труфанов В. А.,Чернов А.Б. Разобщенность биосинтеза глюте-ниновых белков с процессом формирования надмолекулярных структур клейковины // Физиология роста и развития растений в условиях Сибири / Иркутск: СИФИБР СО АН СССР. 1980. С. 55-56.

13. Труфачов В. А., Чернов А. Б., Макаренко С. П., Куделина И. А., Дешко Т.Н. Изучение вторичной структуры белков клейковины пшеницы // Химия и физика белков и пептидов / Тез. научн. сообщ. V Всесоюзного симпозиума. Баку, 3980. С. 125.

34. Кузнецов А.H., Труфанов В. А. Тиол:протеиндисульфид оксидо-редуктазнач активность созревающих семян пшеницы // Известия СО СССР. Сер. биол. наук. 1981. Т. 3. С. 85-89.

15. Безносов М. В., Корытов М. В., Козаренко Т.Д., Труфанов В. А. Электрофорез белков в цилиндрическом блоке полиачриламидного геля // Злектрофоретические .методы анализа белков / Новосибирск: Наука, 1983. С. 314-117.

16. Труфанов В. А., Левина Н. В., Кондратов В. В., Глянько А.К. Влияние осеннего заморозка и форм азота на фракционный и аминокислотный состав глиадиновых белков пшеницы // Агрохимия. 1982, N 8. С. 24-27.

17. Чернов А.Б., Труфанов В.А., Березовская Е.В. Формирование вторичной структуры запасных белков в созревающей зерновке пшеницы // Физиология роста и развития растений в условиях Сибири /Иркутск: СИФИБР СО АН СССР, 1982. С. 23-27.

18. Чернов А.Б., Труфанов В.А., Макаренко С.П. Пространственная структура запасных белков семян // Химия белков и пептидов / Тез. научн. сообщений VI Всесоюзн. симпозиума. Рига, 1983. С. 222-223.

19. Труфанов В. А., Чернов А. Б., Березовская Е. В. Состав запасных белков сибирских сортов пшеницы и их селекционных форм // Молекулярные механизмы генетических процессов / Тез. научн. сообщений V Всесоюзн. симпозиума. Москва, 1983.

20. Труфанов В.А., Глянько А.К. Фракционный и аминокислотный состав глиадиновых белков з зерне пшеницы при действии осеннего заморозка и в зависимости от формы азота // Устойчивость к неблагоприятным факторам среды и продуктивность растений / Тез. научн. сообщ. Всесоюзн. конф. Иркутск: СИФИБР СО АН СССР, 1984. С. 33-34.

21. Чернов А.Б., Труфанов В. А. Влияние различных способов выделения на определяемый состав глиадиновых и глютениновых белков пшеницы // Прикладная биохимия и микробиология. 1985. Т.21, N 5. С. 665-670.

22. Труфанов В. А. Аминокислотный состав глиадинов в зависимости от условий выращивания и фазы спелости зерна //Условия среды и продуктивность растений. Иркутск: СИФИБР СО АН СССР, 1985. С.97-104.

23. Труфанов В. А. 0 химической природе белковых фракций клейковины пшеницы // Физиология роста и развития растений в условиях Сибири / Иркутск: СИФИБР СО АН СССР. 3985. С.48-53. .

24. Труфанов В. А., Чернов А. Б. Особенности биосинтеза отдельных компонентов запасного белка пшеницы // Физиология роста и развития растений в условиях Сибири / Иркутск: СИФИБР СО АН СССР, 1985. С. 51-54.

25. Труфанов В. А., Чернов А.Б. Биосинтез запасных белков пшеницы в зависимости от условий выращивания // V Всесоюзный биохим. съезд. Тез. научн. сообщений / М.: Наука, 1985. Т. 3. С. 231-232.

26. Кичатинова С. В., Труфанов В. А., Трофимова И. Н. Ферменты тиол-дисульфидного обмена белков пшеницы // V Всесоюзн. биохим. съезд. Тез. науч. сообщений / М.: Наука, 1935. С. 206-207.

27. Труфанов В. А., Березовская-Е.В., Логинов Ю. П. Компонентный состав глиадина и селекционная ценность гибридов яровой пшеницы // Физиология роста и развития растений в условиях Сибири / Иркутск: СИФИБР СО АН СССР, 1985. С. 29-32.

28. Березовская Е. В., Даниловцева Т. Н., Труфанов В. А. Оценка селекционных признаков пшеницы по компонентному составу запасных белков // Пути повышения эффективности с. -х. производства Восточной Сибири / Красноярск: Агропром, 1987. С. 5-6.

29. Кичатинова С. В., Труфанов В. А. К вопросу о субклеточной локализации ферментов тиол-дисульфидного обмена в белках пшеницы // Физиология роста и развития растений в условиях Сибири / Иркутск: СИФИБР СО АН СССР, 1987. С. 54-56.

30. Труфанов В. А., Кичатинова С. В. Дисульфидредуктазнач и тиол-оксидазная активности созревающих семян пшеницы // Прикл. биохимия и микробиология. 1989. Т. 25, N 3. С. 361-367.

31. Труфанов В. А., Хвостова Г.И. 0 характере биосинтеза компонентов глиадина и глютенина в созревающем зерне яровой пшеницы // Онтогенетика высших растений / Материалы Всесоюзн. научной конференции. Кишинев: Штиинца, 1989. С. 65-66.

32. Березовская Е. В., Труфанов В. А.', Даниловцева Т. Н., Логинов Ю.П. Изучение адаптационной вариабельности признаков у гибридов яровой пшеницы // Онтогенетика высших растений / Материалы Всесоюзн. научной конференции. Кишинев: Штиинца, 1989. С. 117.

33. Назарова Г. Д., Труфанов В. А., Аникеева М. Д., Казарцева А. Т., Бурдун A.M. Биохимические и технологические признаки качества зерна у яровой пшеницы в зависимости от условий среды и генотипа // Онтогенетика высших растений / Материалы Всесоюзн. научн. кон-

ференцми. К.чкипеэ: Штиикца, 1989. С. 194.

34. Аникеева М. Д., Хвостова Г. И., Казарцева А. Т. Лруфачоз В. А. Изменчивость качества зерна гТшеницы в зависимости от условий среды и сорта // Пути повышения эффективности с.-х. производства Восточной Сибири. Красноярск: Агропром, 1989. С.24-25.

35. Дихтярева И. А., Назарова Г. Д., Останин В. А., Труфанов В. А. Урожай, технологические и биохимические свойства зерна яровой пшеницы в зависимости от условий минерального питания // Пути повышения эффективности с.-х. производства в Восточной Сибири. Красноярск: Агропром, 3989. С. 25-27.

36. Труфанов В.А. О характере экспрессии генов в развивающемся зерне пшеницы // II съезд Всесоюзного общества физиологов растений / Тез. докл. Минск, 1990.

37. Труфанов В. А., Кичатинова С. В., Шатилов В. Р., Кретович В. Л. Ферменты тиол-дисульфидного обмена белков (обзор) // Прикл. биохимия и микробиология. 1990. Т. 26, N 1. С. 3-10.

38. Назарова Г. Д., Труфанов В. А., Останин В. А., Казарцева А. Т. Урожай и технологические свойства зерна яровой пшеницы в зависимости от условий минерального питания // Сибирский вестник с.-х. науки. 1990. N 4. С. 37-42.

39. Труфанов В. А. Возможности электрофоретического анализа в изучении полиморфизма запасных белков // Материалы Всесоюзной конференции "Электрофорез-90" / Рига: Наука, 1990. С.13-15.

40. Труфанов В. А., Березовская Е. В., Даниловцева Т.Н. Возможности направленного отбора мутантов яровой пшеницы на зерновую продуктивность // Сиб. вестник с.-х. науки. 1995. N 6. С. 36-40.

41. Труфанов В.-А. Физиолого-биохимические аспекты формирования белкового комплекса пшеницы // III съезд Всероссийского общества физиологов растений / Санкт-Петербург: Наука, 1993. Т. 2. С. 220.

42. Кичатинова С. В., Труфанов В. А., Пермяков А. В. Активность ферментов тиол-дисульфидного обмена в клеточных органеллах развивающихся семян пшеницы //III съезд Всероссийского общества физиологов растений / Санкт-Петербург: Наука, 1993. Т. 2. С: 127.

43. Кичатинова С.В., Труфанов В.А., Пермяков А.В. Тиолоксидаз-ная и дисульфидредуктазнач активность клеточных органелл пшеницы // Прикл. биохимия и микробиология. 1993. Т. 29, N 3. С. 412-417.

44. Kichatinova S. V., Trufanov У. A., Perayakov A. V. Thiol oxidase and disulfide reductase activities of wheat cell organelles // Appl. Biochem. and Microbiol./Р1епша Pub!. Corp., 1993. P. 333316. (Translated (431).

45. Труфаноз В. A., Пермяков А. В., Кичатинова С. В. Дисульфидре-дуктазная и тиолоксидазная активности в зависимости от содержания низкомолекулярных тиолов в созревающей зерновке яровой пшеницы // Прикл. биохимия и микробиология. 1993. Т. 29, N 5. С. 728-733.

46. Trufanov У.А., Permyakoy А. V., Kichatinova S.V. Disulfide reductase and thiol oxidase activity as function of low-molecu-larmass thiol content in developing spring wheat seeds // Apll. Biochem. and Microbiol. / Plenum Pub 1. Corp., 3994. P. 542-546. (Translated [45]).

47. Труфаноз В. А. Клейковина пшеницы: проблемы качества. Новосибирск: Наука, 1994. 167 с.

48. Trufanov V. А., Kichatinova S.V., Permyakov A.V. The functional role of the enzymes of thiol-disulphide interchange in the formation of the wheat protein complex // Annual Symp."Physical-chemical basis of plant physiology"/ Penza, 1996. P.143-144.

49. Trufanov V. A. The expression of genes controlling storade protein syntesis in the developing wheat grain // Annual Бушр. "Physikal-cheaikal basis of plant physiology" /Penza, 1996. P. 17.

50. Диденко С. Л., Корякина 0. В., Наумова M. С., Труфанов В. A. Продуктивность и качество белка гибридных линий яровой пшеницы от скрещивания сортов Ангара 86 и Целинная 20 //Вестник ИГСХА: Сборник научных трудов / Отв. ред. Ю. В. Богородский. Иркутск, 1997. М 7. С. 14-17.

51. Труфанов В. А., Березовская Е. В., Вершинина Г. Г., Пермякова М.Д. Генетический контроль признаков качества пшеницы // Вестник ИГСХА: Сборник научных трудов / Отв. ред. Ю. В. Богородский. Иркутск, 1997. N 6. С. 7-9.

52. Давыдов В. А., Труфанов В. А., Березовская Е. В. Взаимосвязь физиологических и морфологических показателей у различных сортов и линии яровой пшеницы // Физиология и биохимия культурных растений. 1998. Т. 30, N 4. С. 332-317.

53. Труфанов Е. А., Кичатинова С. В., Пермяков А. В. Ферменты ти-ол-дисульфидного обмена и их действие на белки клейковины //

Прикл. биохимия и микробиол. 19S9. Т. 35, N 2. С. 219-222.

54. Глянько А.К., Труфзнов В. А. Накопление азота и содержание белка в зерне растений яровой пшеницы под влиянием осеннего заморозка 11 Сельскохозяйственная биология. 1999, N 5.

55. Труфачов В. А., Кичзтинова С. В., Пермяков A.B. ,Диденко С. Л., Пермякова М.Д. Ферменты тиол-дисульфидного обмена в метаболизме белков пшеницы Tnlticuni aestivurn. L. // IV съезд Общества физиологов растений России / М.: ИФР РАН, 1999. Тез. докл. Т. 2. С. 715.

56. Диденко С.Л., Пермяков A.B., Труфанов В. А. Липоксигеназа мягкой яровой пшеницы; молекулярные формы, возможная физиологическая роль // IV съезд Общества физиологов растений России / М.■ ИФР РАН, 1999. Тез. докл. Т. 2. С. 567-568.

57. Труфанов В. А., Митрофанова Т. Н., Дихтярева И. А. Влияние факторов среды на метаболизм запасных белков пшеницы Triticum aestivurn L. // IV съезд Общества физиологов растений России / М.: ИФР РАН, 3999. Тез. докл. Т. 2. G. 762.

58. Кичатиксва С. В., Пермякова И. Д., Пшеничникова Т. А., Труфанов В. А., Майстренко 0. И. Эффекты з&мэщэния хромосом у пшениц Triticum aestivuin L. по активности ферментов SH/S-S-метаболизма // IV съезд Общества физиологов растений России / М. ; ИФР РАН, 1999. Т.2, G.T65.

59. Труфанов В. А., Кичатинова С. В., Казарцева А. Т., Пермяков А. В. Тиолоксидазная и дисульфидредуктазная активности зерновки пшениц Triticum aestivurn L. и их технологические свойства // Прикл. биохимия и микробиол. 2000. Т,36, N 1. Принята в печать.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Труфанов, Виталий Александрович

выводы

1. Выдвинута и экспериментально обоснована концепция ферментативного характера формирования белкового комплекса клейковины пшеницы (Trit i cum aestivua L.), согласно которой фолдинг и стабилизация макроструктурных форм запасных белков эндосперма in vivo ч регулируются системой ферментов тиол-дисульфидного обмена, ката-\црирующих образование, распад и изомеризацию S-S-связей.

2. Установлены особенности биосинтеза и накопления белков на последовательных этапах репродуктивной фазы онтогенеза, отражаю-'щие^скоордини^ системы зерновок. Альбумины, глобулины и глютенины интенсивно синтезируются на самых ранних стадиях развития зерновок, а биосинтез глиадиновых белков происходит в основном в фазе напива.

3. В составе глиадина обнаружены полипептиды со сходной динамикой биосинтеза и накопления, представляющие собой блоки генетически сцепленных компонентов, Генотипически специфичный состав глютенина формируется в процессе налива зерновок, при этом интенсивность синтеза и накопления субъединиц с мол. массой 41, 58 и 111 кДа заметно выше независимо от фазы развития зерновок.

4. Процессы формирования в развивающихся зерновках белковых комплексов, типичных для клейковины семян полной спелости, сопряжены с особенностями пространственной организации запасных белков: а) содержание" регулярных структурных форм, в частности «(-спиралей и р-структур, в глиадине значительно выше, чем в глютенине; пространственная структура функционально важных субфракций глиадина стабильна независимо от фазы спелости зерновок; / б) содержание регулярных белковых структур в глютенине зако-/ номерно возрастает в ходе налива и созревания зерновок; процессы i синтеза субъединиц глютенина и их посттрансляционная модификация \и укладка разобщены во времени; в) формирование и стабилизация глютенина как основы структур-/ного матрикса клейковины совпадают по времени с интенсивным нако-\плением в запасных белках внутри- и межмолекулярных S-S-связей.

5. Формирование макромолекулярных комплексов запасных белков происходит с участием различных стабилизирующих сил: ионно-соле-вых и гидрофобных взаимодействий, водородных и дисульфидных связей, действие которых носит кооперативный характер и существенно зависит от условий среды и биохимической природы полипептидов.

6. В развивающихся зерновках пшеницы координирование функционирует специализированная система ферментов, катализирующих образование (тиол: кислород оксидоредуктаза, КФ 1.8.3.2, линолеат: кислород оксидоредуктаза, КФ 1.13.11.12), диссоциацию (тиол:протеин-дисульфид оксидоредуктаза, КФ 1.8.4.2) и перегруппировку (тиол: протеиндисульфидизомераза, КФ 5.3.4.1) S-S-связей в белках: а) динамика тиолоксидазной и дисульфидредуктазной активности тесно .дордвлщщ^т с содержанием в запасных белках S-S-связеи и БН^групп. Характер изменения активности дисульфидредуктазы сходен с динамикой активности дисульфидизомеразы и глутатионредуктазы и коррелирует с содержанием в зерровках небелковых тиолов (восстановленный глутатион, цистеин) - кофакторов ферментативного расщепления дисульфидных связей. достоверные изменения S-S/SH-соотношения в клейковинных белках при действии ферментов тиол-дисульфидного обмена in vitro служат независимым экспериментальным подтверждением концепции ферментативной регуляции SH/S-S-статуса запасных белков in vivo. в) ферменты SH/S-S-метаболизма не имеют узкой локачизации в клетке; напичие этих ферментов во фракциях мембран эндоплазмати-ческого ретикулума и белковых тел может быть связано с их участием в фолдинге запасных белков с образованием в эндосперме натив-ных белковых структур как предшественников клейковины физиологически зрелого зерна.

7. Активность ферментов тиол-дисульфидного обмена является генотипически специфичным признаком, завися1Дим~~дт~~фактороз"~~ внешней среды, в том числе от уровня минерального питания растений. Весьма вероятно, что лабильная ферментная система, регулирующая

5-S/SH-равновесие в запасных белках, имеет отношение к изменчивости показателей качества клейковины в меняющихся условиях среды.

8. Активность протеиндисульфидредуктазы и липоксигеназы у линий пшеницы с межсортовым замещением отдельных пар хромосом 3-й и

6-й гомеологических групп от разнокачественных сортов Диамант 1 и Новосибирская 67 достоверно связана с хромосомами 1А и 6D, в которых, видимо, локализованы структурные и/или регуляторные гены, контролирующие синтез и/или активность этих ферментов. ницы сорта Скала методом ИК-спектроскопии // Физиология роста и развития растений / Иркутск: С-ИФИБР СО АН СССР, 1976. С. 24-25.

6. Чернов А. Б., Березовская Е. В., Левина Н. В., Олехова Г. Н., Кондрашов В.В., Труфачов В. А. Сравнительная характеристика глиадина пшеницы в связи с условиями выращивания // Физиолого-биохи-мические и экологические аспекты устойчивости растений к неблагоприятным факторам внешней среды /Отв. ред. Р. К. Саляев. Иркутск: СИФИБР СО АН СССР, 1977. С. 66-70.

7. Чернов А. Б. .Левина Н. В., Труфачов В. А. Динамика биосинтеза отдельных компонентов глиадина и глютенина в созревающем зерне пшеницы //Азотный и белковый обмен растений / Материалы Всесоюзн. симпозиума. Тбилиси, 1978. С. 70-71.

8. Труфанов В. А., Квашонкина Н. Б., Фартышева Н. В., Чернов А. Б. Субъединичный состав глютенинов различных сортов пшеницы // Физиология и биохимия роста и развития растений / Иркутск: СЙФИВР СО АН СССР, 1979. С. 29-30.

9. Макаренко С. П., Труфанов В. А. Дейтерообмен глиадиновых банков клейковины пшеницы // Физиология и биохимия роста и развития растений / Иркутск: СИФИБР СО АН СССР, 1979. С.45-47.

10. Труфанов В.А., Чернов А.Б. Клейковинные белки пшеницы в зависимости от азотного питания и фазы спелости зерновки // IV Всесоюзный биохимический съезд / Тез. науч. сообщ. М.: Наука, 1979. Т. 3. С. 190.

И. Чернов А.Б.,Левина Н. В., Труфачов В.А. Интенсивность включения 14 С- и Зэ5-метаболитов в различные компоненты глиадина и глютенина в зависимости от фазы развития зерновки // Физиология роста и развития растений в условиях Сибири / Иркутск: СИФИБР СО АН СССР, 1980. С. 58-60.

12. Труфанов В.А.,Чернов А. Б. Разобщенность биосинтеза глюте-ниновых белков с процессом формирования надмолекулярных структур клейковины // Физиология роста и развития растений в условиях Сибири / Иркутск: СИФИБР СО АН СССР, 1980. С. 55-56.

13. Труфачов В. А., Чернов А. Б., Макаренко С. П., Куделина H.A., Дешко Т.Н. Изучение вторичной структуры белков клейковины пшеницы '// Химия и физика белков и пептидов / Тез. научн. сообщ. V Всесоюзного симпозиума. Баку,. 1980. С. 125.

14. Кузнецов А.Н., Труфанов В. А. Тиол:протеиндисульфид оксидо-редуктазная активность созревающих семян пшеницы // Известия СО СССР. Сер. биол. наук. 1981. Т.З. С. 86-89.'

15. Безносов М. В., Корытов М. В., Козаренко Т.Д., Труфанов В. А. Электрофорез белков в^ цилиндрическом блоке полиакриламидного геля // Электрофоретические методы анализа белков / Новосибирск: Наука, 1981. С. 114-117.

16. Труфанов В. А., Левина Н. В., Кондратов В. В., Глянько А. К. Влияние осеннего заморозка и форм азота на фракционный и аминокислотный состав глиадиновых белков пшеницы // Агрохимия. 1982, N 8. С. 24-27.

17. Чернов А. Б., Труфанов В. А., Березовская Е.В. Формирование вторичной структуры запасных бачков в созревающей зерновке пшеницы // Физиология роста и развития растений в условиях Сибири /Иркутск: СИФИБР СО АН СССР, 1982. С. 23-27.

18. Чернов А. Б., Труфанов В. А., Макаренко С. П. Пространственная структура запасных белков семян // Химия белков и пептидов / Тез. научн. сообщений VI Всесоюзн. симпозиума. Рига, 1983. С. 222-223.

19. Труфанов В. А., Чернов А. Б., Березовская Е.В. Состав запасных белков сибирских сортов пшеницы и их селекционных форм // Молекулярные механизмы генетических процессов / Тез. научн. сообщений V Всесоюзн. симпозиума. Москва, 1983.

20. Труфанов В. А., Глянько А. К. Фракционный и аминокислотный состав глиадиновых белков в зерне пшеницы при действии осеннего заморозка и в зависимости от формы азота // Устойчивость к неблагоприятным факторам среды и продуктивность растений / Тез. научн. сообщ. Всесоюзн. конф. Иркутск: СИФИБР СО АН СССР, 1984. С. 33-34.

21. Чернов А.Б., Труфанов В.А. Влияние различных способов выделения на определяемый состав глиадиновых и глютениновых белков пшеницы // Прикладная биохимия и микробиология. 1985. Т.21, N 5. С. 665-670.

23. Труфанов В.А. 0 химической природе белковых фракций клейковины пшеницы // Физиология роста и развития растений в условиях Сибири / Иркутск: СИФИБР СО АН СССР, 1985. С. 48-51.

24. Труфанов В.А., Чернов А. Б. Особенности биосинтеза отдельных компонентов запасного белка пшеницы // Физиология роста и развития растений в условиях Сибири / Иркутск: СИФИБР СО АН СССР, 1985. С. 51-54.

25. Труфачов В. А., Чернов А. Б. Биосинтез запасных белков пшеницы в зависимости от условий выращивания // V Всесоюзный биохим. съезд. Тез. научн. сообщений / М.: Наука, 1985. Т. 3. С. 231-232.

26. Кичатинова С. В., Труфачов В. А., Трофимова И. Н. Ферменты тиол-дисульфидного обмена белков пшеницы // У Всесоюзн. биохим. съезд. Тез. науч. сообщений / М.: Наука, 1985. С. 206-207.

27. Труфачов В. А., Березовская -Е. В., Логинов Ю. П. Компонентный состав глиадина и селекционная ценность гибридов яровой пшеницы // Физиология роста и развития растений в условиях Сибири / Иркутск: СИФИБР СО АН СССР, 1985. С. 29-32.

23. Березовская Е. В., Дачиловцева Т.Н., Труфанов В. А. Оценка селекционных признаков пшеницы по компонентному составу запасных белков // Пути повышения эффективности с.-х. производства Восточной Сибири / Красноярск: Агропром, 1987. С. 5-6.

29. Кичатинова С. В., Труфачов В. А. К вопросу о субклеточной локализации ферментов тиол-дисульфидного обмена в белках пшеницы // Физиология роста и развития растений в условиях Сибири / Иркутск: СИФИБР СО АН СССР, 1987. С. 54-56.

30. Труфанов В. А., Кичатинова С. В. Дисульфидредуктазная и тиол-оксидазная активности созревающих семян пшеницы // Прикл. биохимия и микробиология. 1989. Т. 25, N 3. С. 361-367.

31. Труфанов В. А., Хвостова Г. И. 0 характере биосинтеза компонентов глиадина и глютенина в созревающем зерне яровой пшеницы // Онтогенетика высших растений / Материалы Всесоюзн. научной конференции. Кишинев: Штиинца, 1989. С. 65-66.

32. Березовская Е. В., Труфанов В. А.", Даниловцева Т. Н., Логинов Ю.П. Изучение адаптационной вариабельности признаков у гибридов яровой пшеницы // Онтогенетика высших растений / Материалы Всесоюзн. научной конференции. Кишинев: Штиинца, 1989. С. 117.

33. Назарова Г.Д., Труфанов В. А., Аникеева М.Д.,Казарцева А.Т., Бурдун A.M. Биохимические и технологические признаки качества зерна у яровой пшеницы в.зависимости от условий среды и генотипа // Онтогенетика высших растений / Материалы Всесоюзн. научн. конференции. Кишинев: Штиинца, 1989. С. 194.

34. Аникеева М. Д., Хвостова Г. И., Казарцева А. Т., Труфаноз В. А. Изменчивость качества зерна гТшеницы в зависимости от условий среды и сорта // Пути повышения эффективности с.-х. производства Восточной Сибири. Красноярск: Агропром, 1989. С. 24-25.

35. Дихтярева И. .4., Назарова Г. Д., Останин В, А., Труфанов В. .4. Урожай, технологические и биохимические свойства зерна яровой пшеницы в зависимости от условий минерального питания // Пути повышения эффективности с.-х. производства в Восточной Сибири. Красноярск: Агропром, 1989. С. 25-27.

36. Труфанов В. А. О характере экспрессии генов в развивающемся зерне пшеницы // II съезд Всесоюзного общества физиологов растений / Тез. докл. Минск, 1990.

3?. Труфанов В. А., КичатиноЕа С. В., Шатилов В. Р., Кретович В. Л. Ферменты тиол-дисульфидного обмена белков (обзор) // Прикл. биохимия и микробиология. 1990. Т. 26, N 1. С. 3-10.

39. Труфанов В. А. Возможности электрофоретического анализа в изучении полиморфизма запасных белков // Материалы Всесоюзной конференций "Электрофорез-90" / Рига: Наука, 1990. С. 13-15.

40. Труфанов В. А., Березовская Е. В., Даииловцева Т.Н. Возможности направленного отбора мутантов яровой пшеницы на зерновую продуктивность // Сиб. вестник с.-х. науки. 1991. N 6. С.36-40.

41. Труфанов В. А. Физиолого-биохимические аспекты формирования белкового комплекса пшеницы // III съезд Всероссийского общества физиологов растений / Санкт-Петербург: Наука, 1993. Т.2. С. 220.

42. Кичатинова С. В., Труфанов В. А., Пермяков А. В. Активность ферментов тиол-дисульфидного обмена в клеточных органеллах развивающихся семян пшеницы // III съезд Всероссийского общества физиологов растений / Санкт-Петербург: Наука, 1993. Т. 2. С: 127.

43. Кичатинова С. В., Труфанов В. А., Пермяков A.B. Тиолоксидаз-ная и дисульфидредуктазная активность клеточных органелл пшеницы // Прикл. биохимия и микробиология. 1993. Т. 29, N 3. С. 412-417. ciase and disulfide reductase activities of wheat cell organelles // Appl. Biocheffl. and Microbiol. /Plenum Publ. Corp., 1993, P. 333336. (Translated [43]).

45. Труфаков В. A., Пермяков А. В., Кичатинова С. В. Дисульфидре-дуктазная и тиолоксидазная активности в зависимости от содержания низкомолекулярных тиолов в созревающей зерновке яровой пшеницы // Прикл. биохимия и микробиология. 3993. Т. 29, К 5. С. 728-733.

46. Trufanov У. А., Permyakov А. У., Kichatinova S. У. Disulfide reductase and thiol oxidase activity as function of low-molecu-larmass thiol content in developing spring wheat seeds // Apll. Biocheffl. and Microbiol. / Plenum Publ. Corp., 1994. P.542-546. (Translated [45]).

47. Труфанов В.А. Клейковина пшеницы: проблемы качества. Новосибирск: Наука, 1994. 367 с.

48. Trufanov У. А., Kichatinova S. У., Permyakov А. УГ~ The functional role of the enzymes of thiol-disulphide interchange in the formation of the wheat protein complex // Annual Symp. "Physical-chemical basis of plant physiology"/ Penza, 3996. P.143-344.

49. Trufanov У.A. The expression of genes controlling storade protein syntesis in the developing wheat grain // Annual -Вушр. "Physikal-chemikai basis of plant physiology" /Penza, 1996. P.37.

50. Диденко С.Л., Корякина 0. В., Наумова М. С., Труфанов В. А. Продуктивность и качество белка гибридных линий яровой пшеницы от скрещивания сортов Ангара 86 и Целинная 20 //Вестник ИГСХА: Сборник научных трудов / Отв. ред. Ю. В. Богородский. Иркутск, 3997. N 7. С. 34-37.

51. Труфанов В. А., Березовская Е. В., Вершинина Г. Г., Пермякова М. Д. Генетический контроль признаков качества пшеницы // Вестник ИГСХА: Сборник научных трудов / Отв. ред. Ю.В. Богородский. Иркутск, 3997. N 6. С. 7-9.

52. Давыдов В. А., Труфанов В. А., Березовская Е. В. Взаимосвязь физиологических и морфологических показателей у различных сортов и линий яровой пшеницы // Физиология и биохимия культурных растений. 3998. Т. 30, N 4. С. 332-317.

53. Труфачов В. А., Кичатинова С. В., Пермяков А. В. Ферменты ти-ол-дисульфидного обмена и их действие на белки клейковины // мягкой яровой пшеницы: молекулярные формы, возможная физиологическая роль // IV съезд Общества физиологов растений России / М. : ИФР РАН, 1999. Тез. докл. Т. 2.' С. 567-568.

57. Труфанов В. А., Митрофанова Т. Н., Дихтярева И. А. Влияние факторов среды на метаболизм запасных белков пшеницы Triticum aestivum L. // IV съезд Общества физиологов растений России / М.: ИФР РАН, 1999. Тез. докл. Т. 2. С. 762.

58. Кичатинова 0. В., Пермякова М. Д., Пшеничникова Т. А., Труфанов В. А., Майстренко 0.И. Эффекты замещения хромосом у пшениц Triticum aestivum L. по активности ферментов SH/S-S-метаболизма // IV съезд Общества физиологов растений России / М. : ИФР РАН, 1999. Т. 2. С. 765.

59. Труфанов В. А., Кичатинова С. В., Казарцева А. Т. ,• Пермяков A.B. Тиолоксидазная и дисульфидредуктазная активности зерновки пшениц Triticum aestivum L. и их технологические свойства // Прикл. биохимия и микробиол. 2000. Т. 36, M 3. Принята в печать.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе впервые детально изучены процессы биосинтеза и накопления запасных белков в развивающихся зерновках яровой мягкой пшеницы. Наиболее характерной чертой биосинтетических процессов является неравномерность в интенсивности синтеза отдельных белков.

На самых ранних этапах развития зерновок интенсивнее синтезируются белки глютениновой фракции, а в фазе налива - глиадиновые белки, особенно с£-глиадины (см. табл. 1 и 2). В составе глиадина выявлены группы синхронно синтезирующихся полипептидов (см. табл. 4), представляющих собой аллельные варианты блоков генетически сцепленных компонентов, кодируемых, как известно [Созинов, 1985], гомологичными локусами хромосом 1-й и 6-й гомеологических групп.

Следовательно, несмотря на различия в количественном содержании отдельных компонентов глиадина, регуляция их синтеза осуществляется скоординированными механизмами функционирования белоксин-тезирующей системы зерновки. Аналогичным образом, в составе глю-тенина обнаружены группы субъединиц со сходным характером биосинтеза (см. табл. 5). Известно, что высокомолекулярные субъединицы функционального глютенина контролируются генами, локализованными в длинном плече хромосом 1-й гомеологической группы [Bietz, Wall, 1975], однако относительно генетического контроля других субъединиц глютенина имеется крайне мата сведений [Morris, 1998].

Кроме указанных активностей, в развивающихся зерновках нами обнаружены также активность протеиндисульфидизомеразы, катализирующей, как известно [Wang, 1998], реакции ферментативной изомеризации термодинамически напряженных S-S-связей в белковых молекулах, активность липоксигеназы, способной окислять SH-группы остатков цистеина опосредованно через образование перекисных и гидроперекисных радикалов полиненасыщенных жирных кислот [Buttrose, 1963; Кретович, 1991], и активность глутатионредуктазы, регенерирующей восстановленные формы глутатиона - кофактора протеинди-сульфидредуктазы и, вероятно, протеиндисульфидизомеразы. Характер изменения дисульфидредуктазной, дисульфидизомеразной и глутатион-редуктазной активности в процессе развития зерновок совпадал.

С учетом этих результатов, а также данных по прямому действию SH-оксидазы и S-S-редуктазы на запасные белки in vitro (см. рис. 8), выдвинута и экспериментально обоснована концепция ферментативного характера формирования в эндосперме белковых ассоциатов как структурных предшественников белкового комплекса клейковины физи-ологичеки зрелого зерна пшеницы.

Более полное представление о роли -S-S-связек и SH-групп в процессах образования белковых макроассоциатов в созревающих зерновках было получено при изучении особенностей пространственной организации запасных белков методами спектроскопии кругового дихроизма и дейтерообмена амидных атомов водорода полипептидных цепей. Оказалось, что в репродуктивной фазе онтогенеза вторичная структура суммарного глиадина и его основных субфракций не зависит от стадии развития зерновок (см. рис. 1, Б и В), в то время как конформационная структура глютениновых белков претерпевает существенные изменения (см. рис. 1, Г). Как и следовато ожидать, структурное состояние белков суммарной клейковины занимает промежуточное положение между глиадиновыми и глютениновыми белками (см. рис. 3, А и рис. 2).

Пространственная организация проламинов злаков с заведомо разнокачественной клейковиной - пшеницы, ржи и ячменя, не имеет принципиальных различий, однако для глиадина пшеницы "характерно сравнительно более высокое содержание d-спирапьных участков (см. рис. 3 и 4). Результаты позволили постулировать, что различия в физических свойствах клейковины этих злаков в большей степени связаны со структурой их глютелиновых белков.

Дальнейшие исследования были направлены на изучение факторов и природы сил внутри- и межмолекулярных взаимодействий и их вклада в белок-белковую агрегацию как процесса, определяющего в конечном счете формирование клейковинного комплекса.

Интерпретируя величину показателя tlO/C (отношение содержания агрегированных форм белка к его концентрации в среде агрегации за 10 мин процесса) в качестве биофизического критерия способности белков к межмолекулярной ассоциации и сопоставляя его значения в контроле к опыте в меняющихся условиях, была дана оценка вклада в белок-белковые взаимодействия ионно-солевых, гидрофобных, водородных и дисульфидных -связей.

Описанный подход к трактовке экспериментальных данных позволил приблизиться к пониманию механизмов самоорганизации белковых молекул in vivo. Существование в нативном эндосперме характерного для клейковины белкового матрикса [Попов, 1979; Батыгина, 1987; Shewry et ai., 1997] косвенно подтверждает наше предположение о том, что, образование белковых ассоциатов в развивающемся эндосперме осуществляется с участием сил, обнаруживаемых нами в экспериментах in vitro.

Результаты исследований процессов синтеза запасных белков, формирования их вторичной структуры in vivo и агрегированных белновых форм in vitro, позволили постулировать, что процесс самоорганизации запасных белков в развивающихся зерновках состоит по крайней мере из трех стадий. На самых ранних этапах развития зерновок вновь синтезированные полипептиды находятся главным образом в виде неупорядоченного клубка. В ходе интенсивных биосинтетических процессов, связаных с наливом зерновок, эти полипептиды претерпевают посттрансляционные преобразования, формируя элементы регулярной вторичной структуры глютенина, в стабилизации которых участвуют в основном водородные связи и гидрофобные взаимодействия неполярных аминокислотных групп полипептидных цепочек.

В дальнейшем, в конце нааива - начале созревания, из субъединиц различной биохимической природы (в том числе альбумино-глобулиновых и глиадиновых) происходит интенсивное формирование промежуточных, но достаточно компактных белковых структур натив-ного глютенина, стабилизируемых межцепочечными S-S-связями, образование которых регулируется ферментами SH/S-S-метаболизма.

Выращивание одной и той же группы сортов пшеницы в разные годы в экологически контрастных зонах страны (Краснодарский край и Иркутская область) позволило определить генотипическую вариабельность и - паратипическую изменчивость основных признаков качества клейковины и удельной активности ферментов тиол-дисульфидного обмена. Реакция различных генотипов пшеницы на действие факторов внешней среды оказалась неоднозначной. Независимо от сорта особенно сильные изменения отмечались по устойчивости теста к релаксации, то есть показателю, который в наибольшей степени может определяться S-S/SH-соотношением в белках клейковины, определяющим плотность ее пространственной упаковки (см. табл. 6, 7 и 13).

Аналогичные по сути результаты были получены при изучении влияния на качество- зерна условий минерального питания растений. Основные элементы интенсивной технологии (различные соотношения NPK, способы внесения удобрений, азотные подкормки в разные фазы онтогенеза растений, сеникация и т.д.) в условиях Иркутской области вызывали сходные по характеру, но не равноценные изменения.

Наиболее заметный эффект был получен при выращивании растений на высоком фоне минеральных удобрений Ш60Р60К60), внесенных в рядки при посеве, с последующими некорневыми подкормками в фазах кущения и/или колошения 20%-ным раствором мочевины из расчета 20-30 кг/га (см. табл. 14). В сравнении с контрольными вариантами опыта эти условия приводили к статистически значимому увеличению содержания клейковины и к улучшению ряда показателей качества.

G точки зрения развиваемых в настоящей работе представлений можно.полагать, что действие благоприятных факторов среды на признаки качества клейковины связано не только с созданием оптимальных условий для сбалансированного функционирования белоксинтези-рующей системы в репродуктивный период онтогенеза, но и необходимых условий для образования белковых ассоциатов эндосперма, прежде всего глютенина как структурной основы клейковины.

Выдвинутая концепция ферментативного характера формирования белкового комплекса клейковины основывается на следующих экспериментальных данных: а) на сходстве изменений в соотношениях активности 5Н-оксидаза/5-5-редуктаза и содержания S-S/SH-групп в ходе развития зерновок (см. рис. 6); б) на совпадении по времени максимума тиолоксидазной активности с интенсивным образованием в созревающих зерновках белковых комплексов глютенина (см. рис.1, Г и рис. 5); в) на результатах экспериментов in vitro по прямому действию ферментов на белковые субстраты клейковины (см. рис. 8): г) на различиях в уровнях удельной активности ферментов у разнокачественных сортов пшеницы (см. раздел 3.3); д) на данных по зависимости специфических активностей от факторов внешней среды (см. табл. 6); е) на существовании тесных связей между активностью ферментов и основными показателями качества пшеницы (см. табл. 7); ж) на данных по локализации ферментов в клеточных органел-лах (ЭПР, белковые тельца), имеющих непосредственное отношение к синтезу и запасанию белков (см. рис.9).

Вполне вероятно, что высокая генотипическач вариабельность и весьма сильная модификационнач изменчивость признаков качества клейковины обусловлены особенностями функционирования в меняющихся условиях среды лабильной системы ферментов, регулирующих SH/ S-S-статус запасных белков пшеницы.

В пользу этого представления свидетельствуют также данные о сложной системе регуляции ферментативной активности в развивающихся зерновках с помощью небапковых тиоловых кофакторов (восстановленный глутатион и цистеин). На самых ранних фазах баланс ферментов складывайся в пользу -SH-оксидазы при относительно низком содержании небелковых тиолов. В период налива S-S-редуктазная активность возрастала более высокими темпами параллельно с интенсивным образованием небелковых SH-групп. К началу фазы восковой спелости содержание этих групп снижаюсь, а банане активностей вновь складывайся в пользу SH-оксидазы; при этом S-S/SH-равновесие смещаюсь за счет усиленного образования дисульфидных связей. Изменения в содержании восстановленного глутатиона и цистеина связано, скорее всего, с их участием в реакциях ферментативного расщепления S-S-связей in vivo в качестзе кофакторов, окисленные формы которых затем восстанавливаются с НАДФН-зависимыми соответственно глутатионредуктазой и цистинредуктазой. Тесная взаимосвязь между дисульфидредуктазной активностью и содержанием в зерновках небелковых SH-групп (см. рис. 7) позволяет предположить их важную регуляторную функцию в тиол-дисульфидном обмене.

Высказанное представление является основополагающим в развиваемой концепции ферментативного характера формирования в эндосперме белковых макроассоциатов как структурных предшественников клейковины физиологически зрелого зерна пшеницы.

Описанные в разделе 3.2 результаты по прямому действию ферментного экстракта на клейковинные белки iv vitro позволяли постулировать, что белковая матрица теста, представляющая собой комплекс глкадина и глютенина, может быть укреплена с помощью ферментов, способных изменять S-S/SH-соотношение в клейковинных белках в процессе приготовления теста. Проведенные нами исследования показали реальность использования этих ферментов в качестве биологических улучшителей физических свойств клейковины и консистенции теста вместо применяемых химических окислителей (см. рис.17).

Изучение активности ферментов SH/S-S-метаболизма в зерновках линий с межсортовым замещением отдельных пар хромосом 1-й и 6-й гомеологических групп (1 A, IB, ID, 6А, 6В или 6D), несущих, как известно, гены запасных белков в гексаплоидных пшеницах, у высокобелкового, но сравнительно низкокачественного сорта-реципиента Диамант 1, на гомологичные хромосомы от высококачественного сорта-донора Новосибирская 67, показало, что замещение хромосом 1А и 6D оказывает статистически достоверное влияние на изменение липокси-геназной и дисульфидредуктазной активности. Полученные результаты свидетельствуют о важной роли этих хромосом в синтезе и/или регуляции активности ферментов тиол-дисульфидного обмена и, следовательно, в определении структуры белкового матрикса клейковины.

Научно-практические разработки и рекомендации

2. Способ оценки и отбора из гибридных популяций ранних поколений перспективных генотипов при селекции пшеницы на качество по составу запасных белков, параметрам их агрегации и величине отношения активности 5Н-оксидаза/8-5-редуктаза.

Информация о работе

Труфанов, Виталий Александрович
доктора биологических наук
Иркутск, 1999
ВАК 03.00.12

Диссертация

Физиолого-биохимические основы формирования белкового комплекса клейковины пшеницы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы