Физиологическое состояние культур зеленых микроводорослей и накопление внеклеточных органических веществ

Чалаева, Салимат Алиловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Физиологическое состояние культур зеленых микроводорослей и накопление внеклеточных органических веществ
ВАК РФ 03.00.18, Гидробиология

Автореферат диссертации по теме "Физиологическое состояние культур зеленых микроводорослей и накопление внеклеточных органических веществ"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

на правах рукописи УДК 577.475:582.263

Чапаева Салимат Алиловна

ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ КУЛЬТУР ЗЕЛЕНЫХ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ И НАКОПЛЕНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ

03.00.18 - гидробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2004

Работа выполнена на кафедре гидробиологии биологического факультета Московского государственного университета им. MB. Ломоносова и на кафедре ихтиологии биологического факультета Дагестанского государственного университета в 1998-2004 г.г.

Научный руководитель: доктор биологических наук СЕ. Плеханов

Официальные оппо ненты:

доктор биологических наук А.П. Садчиков

доктор биологических наук Ю.Ф. Перов

Ведущее учреждение - Казанский государственный педагогический университет

Защита состоится "20 мая" 2004 г. в 15 ч 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.55 в Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет, ауд. 389

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан " 20 апреля" 2004 г.

Уче:тй секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Общая характеристика работы.

Актуальность. Органические вещества клеток водорослей и органические вещества, выделяемые ими в среду - основа функционирования трофической цепи, трансформации вещества и энергии в водных экосистемах (Федоров, 1979). В настоящее время признано, что внеклеточные органические вещества (ВОВ) являются важным связующим звеном в трофической цепи между водорослями, бактериями, зоопланктоном (Садчиков, 1997). Разнообразие состава ВОВ, биологическая Активность отдельных компонентов позволили выдвинуть гипотезу об активном участии внеклеточных продуктов в экологическом метаболизме водоемов, которая интенсивно разрабатывается (Fogg et al., L965; Хайлов, 1971; Федоров, Кафар Заде, 1978; Сиренко, Козицкая, 1988; Тамбиев, 1991; Наша et al., 1992; Paulsen et al, 1998).

Изучение физиологической активности внеклеточных метаболитов актуально для углубления современных представлений о механизмах взаимной регуляции в популяцях микроводорослей, в альгобактериальных ассоциациях (Дзержинская, 1993), что существенно для прогнозирования изменений в сообществе и поиска путей управления этими изменениями для оценки роли метаболитов в процессах трансформации загрязняющих веществ (Lombardi, Vieira, 1999) и поэтому представляет интерес как для теоретических вопросов гидробиологии, так и для практических задач биотехнологии. В современных условиях повышен интерес к получению ценных продуктов естественного происхождения. В связи с этим, для управления биотехнологическими циклами с использованием микроводорослей крайне важна разработка чувствительных методов и критериев определения функциональной активности клеток.

изученных является вопрос о

определяющих происхождение ВОВ и процессы их накопления во внешней среде микроводорослей. Дело осложняется трудностями методического характера, а также неоднородностью популяций клеток водорослей по физиологическому состоянию. В результате сложно определить, какая доля ВОВ является результатом прижизненных выделений, а какая образовалась в процессе размножения клеток или их автолиза.

Наличие в составе ВОВ физиологически активных соединений липидной, фенольной природы и продуктов их ферментативной или неферментативной трансформации позволяет предполагать их участие в формировании качества водной среды как среды обитания (Грановская и др., 1992), а также в регуляции роста и развития водорослей (Таутс, 1983; Наша et я1., 1992) и микроорганизмов (Сидорова, Максимова, 1986). Несмотря на длительную историю исследования ВОВ микроскопических водорослей, на современном этапе наименее изученными являются вопросы взаимосвязи процессов выделения ВОВ с функциональной активностью клеток, состоянием внешнего мембранного комплекса, а также физиологической активности внеклеточных продуктов и их участия в регуляции развития культур водорослей.

Настоящая работа является продолжением исследований ВОВ микроскопических водорослей, проводимых на кафедре гидробиологии и кафедре микробиологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Цель и задачи исследования - Основная цель заключалась в изучении процессов накопления внеклеточных органических веществ в культурах хлорококковых водорослей в связи с физиологическим состоянием клеток и их гетерогенностью по функциональному состоянию, а также в определении возможных путей регуляции развития культур с участием внеклеточных метаболитов. В связи с этим были сформулированы следующие задачи:

1. исследовать процессы накопления ВОВ в накопительной культуре СЫотсНа рупяогйояа 5-39 з связи с фотссиктгтичесхсй гхткгностью г жизнеспособностью клеток;

2. установить возможности применения данных электроспектроскопии накопительной культуры С. руггио1^8й S-39 в процессе развития в оптимальных условиях для определения функциональной активности клеток водоросли;

3. оценить альгицидную и бактерицидную активность внеклеточных метаболитов зеленых микроводорослей;

4. определить возможные направления действия механизмов регуляции роста и развития культур микроводорослей внеклеточными метаболитами путем изучения их влияния на фотосинтетическую активность.

Научная новизна. - Установлено, что накопление внеклеточных органических веществ в среде культуры С. руггио1^8й S-39 зависит от фотосинтетической активности и жизнеспособности клеток Значительная часть ВОВ во всех фазах развития культуры выделяется функционально мертвыми клетками с нарушенной проницаемостью, а накопление ВОВ прижизненного характера крайне незначительно;

- показано, что внеклеточные метаболиты липидной природы (НЖК) водоросли С. руггио1^8й подавляют рост водорослей и обладают антибактериальной активностью;

- экспериментально установлено, что внеклеточные продукты водоросли (НЖК и очевидно, фенольные соединения) могут участвовать в регуляции роста и развития культур. Судя по кинетике параметров флуоресценции клеток, возможный механизм регуляции связан с воздействием на фотосинтетическую активность через изменения соотношения а- и Р-реакциошгых центров ФС 2, эффективность функционирования электронтранспортной цепи ФС 2.

Практическая значимость. Определение максимальной функциональной активности и жизнеспособности клеток в культурах хлорококковых водорослей по параметрам электропроводности и фотосинтетическим характеристикам может быть использовано при регулировании биотехнологических циклов как для получения ценных продуктов из биомассы и внеклеточных метаболитов, так и при выращивании микроводорослей как живых кормов в рыбном хозяйстве;

- практичекое значение имеют результаты по антибактериальным свойствам внеклеточных органических веществ, в частности,

антистафилококковая активность, что может быть использовано в санитарно-гигиенических целях;

- результаты по методам изучения функционального состояния культур микроводорослей при росте и развитии, примененные в работе, могут быть использованы в учебных курсах студентов Вузов, обучающихся на кафедрах гидробиологического (экологического) профиля.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на научной конференции "Водные экосистемы и организмы-3" (Москва, 2001); Второй научной конференции "Актуальные проблемы биотехнологии" (Москва, 2001); международной конференции "New Technologies in Protecting Biodiversity in aquatic ecosystems" (Москва, 2002); международной конференции "Биотехнология в охране и реабилитации окружающей среды" (Москва,. 2003); представлены на Второй международной научной конференции "Биотехнология - охране окружающей среды" (Москва, 2004); совместных научных семинарах лаб. физико-химии биомембран, каф. гидробиологии и Биотехнологического центра МГУ им. М.В. Ломоносова (Москва, 2002,2003).

Публикации. По теме диссертации обубликовано 7 работ.

Структура диссертации традиционна: введение, обзор литературы, объекты и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы. Объем работы 137 стр., 21 рисунок, 13 таблиц, библиография 225 источников.

Объекты и методы исследования.

В качестве объектов исследования использовали аксеничные культуры водорослей CMorellapyrenoidosa Chick. S-39 и Scenedesmus quadricauda (Turp.) Breb. из коллекции кафедры микробиологии МГУ. Культуры выращивали накопительным методом в оптимальных для роста условиях по освещенности и температуре на среде Тамия и Бенеке. В качестве тест-объектов использовали культуры микроорганизмов кз той же холлехцки: Staphylococcus aureus, Bacillus

subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli (выращивали на чашках Петри наМПА).

Численность клеток определяли прямым счетом в камере Горяева Мертвые клетки учитывали окрашиванием метиленовым синим (Пименова, Максимова, 1966). ВОВ и биомассу клеток определяли после сжигания с бихроматом калия колориметрически при 630 нм (Максимова и др., 1984). Фотосинтетическую активность определяли по параметрам быстрой флуоресценции хлорофилла суспензии клеток водоросли (D=0,2 при 664 нм) с помощью импульсного флуориметра (Лядский и др., 1987). Измеряли интенсивность начальной и максимальной флуоресценции.

Относительный выход переменной флуоресценции рассчитывали как где

F» = F„, - F0 Электроспектроскопию культуры водоросли Chlorella pyrenoidosa проводили с. помощью моста переменного тока в стеклянной ячейке с (с чернением) электродами (1 см2). Пробы трехкратно центрифугировали 15 мин при 5500 g. до плотной упаковки. Влияние ионного состава среды на величины устраняли путем переносением проб в раствор холинхлорида (после первого центрифугирования) эквимолярный среде;. Измеряли в диапазоне 1 кГц - 10 МГц,, вычисляли коэффициент поляризации (жизнеспособности) клеток Кп как отношение величин R, на частоте 10 кГц, к R, на 10 МГц. Долю живых клеток рассчитывали по формулам (Fricke, 1963; Davey et al., 1992), исходя из измеренной на частоте 1 кГц проводимости суспензий до и после температурной инактивации (в параллельной пробе клетки прогревали на водяной бане 30 мин., 60°С).

Для испытания физиологической активности метаболитов использовали экстракты среды водоросли С. pyrenoidosa с конца экспоненциальной фазы роста (7 сут.), N клеток приводили к 500 млн/мл колориметрически. Экстракцию проводили растворителями различной полярности (Тамбиев и др., 1981). Воздействие экстрактов на водоросли С. pyrenoidosa S-39 и S. quadricauda оценивали по численности клеток через 7 сут. Антибактериальную активность зхстргктоз определяли методом дисков на чашках Петри. Тонкослойную хроматографию липидов проводили в соответствии с (Кейтс, 1975; Липидный практикум, 1980). Состав ЖК определяли методом газо-жидкостной хроматографии (Юськович, 1985). Концентрацию перекисных продуктов

определяли по малоновому диальдегиду (МДА) (Ланкин и др., 1975). Результаты воздействия метаболитов на водоросль С. pyrenoidosa изучали по росту и фотосинтетическим характеристикам при выращивании на 3-14 сут фильтратах сред той же культуры. Контроль за обеднением сред проводили по азоту (Поляков, 1950). Экзогенные ЖК применяли в виде солей аммония.

Эксперименты проводились в 3-5 повторностях. Данные представлены с определением ошибки репрезентативности выборочной средней для малых выборок при 5% уровня значимости (Максимов, 1980). На некоторых графиках и копиях кинетических кривых представлены типичные для опытов зависимости. При обработке данных использовали программу "Microsoft ЕхеГ.

Результаты и обсуждение.

1. Накопление внеклеточных органических веществ и характеристики функционального состояния культуры С. pyrenoidosa S-39.

Рост культуры С. pyrenoidosa характеризовался короткой лаг-фазой, быстро проходила фаза ускорения роста. В течение экспоненциальной фазы (3-7 сут.) численность клеток увеличивалась со 170 до 500 млн/мл. По мере роста численности в культуральной среде накапливались ВОВ, хотя прямой пропорциональности не наблюдали. К концу наблюдений (14 сут., начало фазы отмирания) количество ВОВ достигало 580-620 мг/л. С развитием культуры происходило увеличение количества мертвых клеток (метиленовый синийХ которое составило к концу опыта 30%.

Относительный выход переменной флуоресценции (F,/Fm), который отражает активность ФС 2, скорость выделения кислорода были максимальны на 3-5 сут. развития культуры и после 7 сут. снижались. В экспоненциальной и линейной фазе увеличение содержания ВОВ соответствовало росту численности и фотосинтетической активности. Ускорение накопления ВОВ в культуральной среде после 7 сут. развития при наблюдении за кривой роста 14 сут. сопровождалось увеличением хсличестза мертвых клеток и быстрым снижением

фотосинтетической активности (табл. 1).

В начале кривой роста, на временном интервале 1-5 сут. содержание мертвых клеток не превышало 3-5% (метиленовый синий). Можно допустить,

что источником ВОВ в это время являются живые клетки водорослей, поскольку процент мертвых клеток не превышал 3-5%, культура находилась в состоянии высокого уровня скорости роста, фотосинтеза и жизнеспособности. Оценка прироста ВОВ по отношению к приросту биомассы в этот период показала, что величина прижизненных выделений ВОВ клетками культуры невелика и составляет 3,9-5,1% или 4-5 мг на 1 г биомассы живых клеток, что не противоречит ранее высказанным предположениям о большом вкладе в накопление ВОВ процессов автолиза клеток (Пименова, Максимова, 1966; Плеханов, Максимова, 1996). Если считать, что основным источником внеклеточных органических веществ являются продукты автолиза, тогда на протяжении всего опыта должно наблюдаться соответствие между накоплением мертвых клеток и органического вещества среды, чего не наблюдалось. Очевидно, что прижизненный и постлетальный характер происхождения ВОВ не полностью объясняют процесс накопления в средах органических веществ, что указывает на более сложную связь накопления ВОВ с гетерогенностью структуры популяции клеток по физиологическому состоянию, с соотношением живых и мертвых клеток, зависящим в свою очередь от выбора критериев определения таковых.

Скорее всего, в начале кривой роста внеклеточные ВОВ накапливаются за счет остатков материнских клеток при выходе апланоспор и прижизненных выделений в условиях избытка продуктов фотосинтеза. Постепенно в накоплении ВОВ увеличивается роль пассивной диффузии, которая в фазу стационарного роста становится определяющей в связи с увеличением доли ослабленных, мертвых клеток и снижением фотосинтетической активности. В конце стационарной фазы и фазе отмирания очевидно, в связи со снижением жизнеспособности клеток водорослей в культуральной среде в составе ВОВ растет доля продуктов автолиза клеток. Очевидно, что накопление ВОВ в культуральных средах водорослей, тесно сзязано с уровнем функциональной активности клеток.

В условиях накопительной культуры Chlorella pyrenoidosa S-39 были измерены электрические параметры суспензии клеток микроводорослей в

диапазоне частот 1 кГц-10 МГц наЗ;5;7;11и14 сутки культивирования. При этом измеряли сопротивление И, и емкость С, супензии клеток водорослей, определяли показателя, связанные с функциональным состоянием клеток. Табл. 1. Состояние культуры С ругеп^сЪэа и накопление внеклеточных продуктов в 14-сут. опытах. Приведены средние значения. Число опытов - 3. В каждом опыте - усредненная проба из 3 сосудов

Время, Активность % живых клеток, % живых клеток ВОВ,

сутки ФС 2, отн.ед. (окрашивание) (электропроводность) мг/л

3 0,89 98,5 73,6 75,0

5 0,75 95,0 67,5 160,0

7 0,70 91,0 51 270,0

11 0,25 80,0 37,7 520,0

14 0,20 70,0 34 600,0

Обработка и анализ полученных результатов показал, что наиболее

объективными показателями, отражающими динамику изменения функционального состояния клеток водорослей С. руггио1^8й в диапзоне частот 1 кГц - 10 МГц является зависимость от частоты активного сопротивления коэффициент поляризации Кп. Исходя из характера изменений как показателя проницаемости внешних мембран клеток для диапазона р-дисперсии на низких и высоких частотах следует считать, что наиболее активными в функциональном отношении являются клетки на 3-7 сут. культивирования. Величина коэффициента поляризации, которая изменялась в процессе развития культуры от 6 до 2,2 также свидетельствует о высоком уровне функциональной активности и жизнеспособности клеток в экспоненциальной фазе.

Отчетливо выраженная в период 3-7 сут. роста дисперсия ' электропроводности (зависимость от частоты), свойственная живым клеткам, постепенно нивелируется и в стареющей культуре к 14 сут. исчезает. На 11-14 сут. роста величина К, на низких частотах заметно меньше, чем в 3-7 сут.(рис. I). Сопротивление на низких частотах отражает степень непроницаемости клеток, т.е. способность поддерживать определенный градиент ионов на внешних мембранах. Такие данные указывают на увеличение проницаемости мембран

клеток после 7 сут. роста. Динамика изменений классического коэффициента поляризации, или жизнеспособности (рис. 2), функционально связанного с крутизной дисперсии, указывает на увеличение жизнеспособности культуры водоросли от начала кривой роста вплоть до 7 сут. и затем ее снижение по мере старения культуры (у погибшей культуры величина стремится к 1). Максимум на 7 сут. (рис.2) запаздывает во времени по отношению к максимуму фотосинтетической активности культуры на 3-5 сут, (табл. 1, 2), очевидно в связи с тем, что в начале кривой роста фотосинтез направлен на синтетические процессы - рост клеток, а энергообеспеченность мембран клеток в значительной степени связана с темновым метаболизмом, в связи с чем, по всей видимости максимум наблюдается позднее.

В связи с неоднородностью структуры популяции водоросли по функциональному состоянию трудно учесть органические вещества, выделяемые ослабленными клетками, клетками живыми, но с нарушенной проницаемостью внешних мембран. Но именно в связи с этим, в накоплениии ВОВ возрастает роль пассивной диффузии органического вещества из клеток во внешнюю среду.

В 1-3 сут. % мертвых клеток минимален, активность фотосинтеза (скорость выделения кислорода и активность ФС 2) растет, выделение органики происходит в основном прижизненно, то есть, живыми клетками, вклад погибших клеток мал и им можно пренебречь. К 3-5 сут. развития достигалась максимальная активность фотосинтеза, накопление в среде органики продолжалось, мертвых клеток мало (по окрашиванию). Однако, уже на 3 сут. процент живых клеток, определенный при помощи метода электропроводности составлял лишь 75 % (табл. 1) , что означает наличие в суспензии клеток, функционально ослабленных, с нарушенной проницаемостью, но не мертвых. В период 5-7 сут. (конец фазы экспоненциального роста) продолжался рост численности клетох к накопление органики в среде. Количество мертвых клеток по методу окрашивания - около 9%. Активность фотосинтеза снизилась, но она достаточна для поддержания роста культуры. По электрическим параметрам число функционально живых существенно уменьшилось, очевидно, за счет

Частота, кГц

Рис. 1. Частотная зависимость активного сопротивления (R,) суспензии клеток водоросли Chlorellapyrenoidosa S-39 в процессе развития культуры..

6л

3 5 7 11 14

сутки

Рис. 2. Динамика коэффициента поляризации (К„) культуры водоросли СМотеПа ругепыЖка Б-39 в процессе развития культуры.

уменьшения доли клеток, способных к активному транспорту и возрастания доли клеток, функционально менее активных, с нарушенной проницаемостью. Такие клетки в первую очередь гибнут, но на данный момент времени их нельзя считать мертвыми. К 11 сут. 38%, а к 14 сутлишь 34% клеток можно считать функционально живыми, тогда как по методу окрашивания метиленовым синим в культуре до 70% живых клеток (табл. 1).

Электроспектроскопический метод измерения % содержания, живых клеток в их суспензии основан на следующем принципе. Любую клетку можно представить как структуру, внутри которой находится проводящая жидкость (внутриклеточное содержимое) и в свою очередь окруженную проводящей жидкостью (междуклеточной средой). Таким образом, получается система из двух проводящих жидкостей (внутри- и внеклеточной), разделенных изолятором - мембраной. На низких частотах (от единиц Гц до 1 кГц) суспензия клеток водорослей в проводящей жидкости представляет собой суспензию непроводящих шарообразных включений, которые увеличивают электрическое сопротивление, Я, суспензии пропорционально их концентрации (Fгicke, 1953; Davey, 1992). Определенный по электрической проводимости относительный объём клеток в. суспензии отражает объемную концентрацию клеток с той ионная проницаемостью, которая характерна для живых клеток. В процессе отмирания ионная проницаемость клеток нарушается, что приводит к снижению величины объемного индекса или процента функционально живых клеток, хотя морофологическая целостность клетки может и сохраняться, следствием чего является расхождение в определении с таковым с использованием красителей.

Рост и развитие клеток водорослей сопровождается изменением как активных, так и пассивных транспортных процессов через мембрану клеток, причем в определенные сутки культивирования активный перенос ионов преобладает над пассивной проницаемостью. Так происходит на 5-7 сут, тогда как на 11-14 сут уровень функционирования активных транспортных процессов минимален. Это свидетельствует о максимуме числа жизнеспособных клеток в культуре на 5-7 сут, что подтверждается максимальными значениями в эти сроки коэффициента поляризации (жизнеспособности) К„(рис. 2).

В период 7-11 сут. роста число функционально мертвых клеток (с возросшей пассивной проницаемостью) увеличивалось как и мертвых клеток, определяемых методом окрашивания (табл. 1). С 14 сут. - начала фазы отмирания, когда все функциональные параметры достигают своих минимальных значении (активность ФС 2 и Кп (табл. 2), накопление ВОВ происходит, в основном, за счет автолиза клеток и пассивной проницаемости функционально мертвых клеток.

Табл. 2. Изменения основных параметров, определяющие функциональное состояние культуры С. pyrerwidosa в процессе развития (14-сут. кривая роста).

Время, сут. Активность ФС 2, % Кп, % ВОВ, % кГц), %

3 56 48 12,5 60

5 100 70 32 100

7 83 100 45 73

11 78 59 87 55

14 30 43 100 26

Определение % живых клеток по данным электроспектроскопии показало существеные отличия от данных, полученных методом окрашивания (табл. 1). Это свидетельствует в пользу более сложного характера гетерогенности структуры популяции водоросли С. pyrenoidosa, который определяется в значительной степени функциональным состоянием клеток, в частности, барьерными свойствами внешних мембран клеток. С ростом культуры усредненная жизнеспособность клеток снижается, растет количество мертвых и функционально мертвых клеток. Следует отметить, что не наблюдалось соответствия между изменениями фотосинтетической активности и изменениями количества мертвых клеток (независимо от способа определения) в процессе развития культуры. Особенно заметно несоответствие между этими показателями в начале и конце кривой роста (1-3 и 11-14 сут.). В период 5-11 сут. снижение активности ФС 2 сопровождалось уменьшением числа живых клеток независимо от способа определения. Накопление ВОВ за счет выделений функционально мертвыми клетками (по электропроводности) в начале кривой

роста и далее существенно, судя по высокому содержанию таких клеток в культуре. Простое суммирование ВОВ, сформированного мертвыми клетками, определяемыми разными способами неуместно, однако полученные данные свидетельствуют, что доля истинно прижизненных выделений ВОВ ниже, чем определяемое с учетом мертвых клеток рутинным способом. Следовательно, при учете ВОВ необходимо принимать. во внимание функциональное состояние клеток, что позволит надежнее и точнее оценивать внеклеточную продукцию водорослей, а также регулировать биотехнологические циклы с использованием' культур микроводорослей.

2. Бактерицидные и альгицидные свойства внеклеточных продуктов водоросли Chlorella pyrenoidosa S-39.

Наиболее распространенными типами отношений между водорослями и бактериями являются синергизм и антагонизм. Антагонизм характеризуется резким уменьшением численности бактерий, вплоть. до полного их исчезновения, в периоды интенсивного развития фитопланктона. В сильно загрязненных органическими стоками водах при обильном развитии гетеротрофных микроорганизмов * может происходить подавление развития фототрофных организмов (Максимова, Сидорова, 1986) Поэтому способность водорослей подавлять развитие бактерий открывает возможность регулировать этот процесс, что имеет важное практическое значение при культивировании водорослей в нестерильных условиях для целей биотехнологии или аквакультуры. В данной работе представлены данные по бактерицидным и альгицидным свойствам компонентов внеклеточных соединений аксеничной культуры водоросли С. pyrenoidosa с конца экспоненциальной фазы (7 сут., 500 млн/мл) по активности экстрактов среды, полученных с применением растворителей различной полярности

Экперименты по определению антибактериальной активности хлороформ-метанольного экстракта культуральной среды по отношению к бактериям Staphilococcus aureus методом дисков показали, что размер зон угнетения бактерий (метод дисков) возрастал с увеличением освещенности, но не менялся после достижения освещенности 16-24 Вт/м2. При наличии

антибактериального эффекта, он проявляется при времени освещения не менее 1 ч, а максимальный эффект проявляется через 24 ч освещения.

Испытанные экстракты (ацетоновый, гексановый, бензольный, . этилацетатный, хлороформ-метанольный) подавляли на свету рост на плотных средах грамположительных бактерий Slaphylococcus aureus и Bacillus subtilis и не оказывали угнетающего действия на грамотрицательные Pseudomonas aerugmosa, Eschenchia coll, возможно, в связи со спецификой микроорганизмов, проявляющих устойчивость к антибактериальным веществам, содержащимся в экстрактах. Размер зон угнетения составил соответственно для Staphylococcus aureus и Bacillus subtilis 0 и 2,0; 2,4 и 3,7; 3,4 и 3,5; 1,2 и 1,0; 5,5 и 4,1 (мм). При хроматографировании в тонком слое хлороформных экстрактов в системе для неполярных липидов были выявлены стерины (Rf 0,20). СЖК (Rf 0,29), триацилглицертны (Rf 0,48), эфиры стеринов (Rf 0,79), углеводороды (Rf 0,98). Угнетение роста бактерий происходило лишь вокруг пятна СЖК. Содержание липидов в составе ВОВ С. pyrenoidosa по мере роста культуры изменялось с 6 до 45 мг/л, СЖК - с 0.24 до 2,4 мг/л. В экспоненциальную фазу содержание СЖК в средах было невелико и составляло 0,2-0,4 мг/л. Резкое увеличение содержания СЖК наблюдали в стационарную фазу - с 1,8-2,4 мг/л.

Близкие результаты по антибактериальной активности были получены для экстрактов клеток морской водоросли Westella botryoides (Максимова, Сидорова 1986) и липидных экстрактов сред диатомовой Nitzsschia ovalis (Максимова и др., 1984). Очевидно, высокая антибактериальная активность на свету гексанового, бензольного, хлороформ-метанольного экстрактов связана именно с ЖК. Этилацетатный экстракт, содержащий, в основном вещества фенольной природы, также вызывал подавление роста бактерий. Это может быть обусловлено как способностью фенольных соединений легко проникать в клетки и подавлять энергетику, так и со способностью фенолов образовывать-высокотоксичные хиноны (Стом и др., 1974; Плеханов, 1998).

Методом-газо-жидкостной хроматографии i показало, что в средах С. pyrenoidosa содержатся насыщенные и ненасыщенные ЖК с числом углеродных атомов от 14 до 18. Преобладающими можно считать пальмитиновую,

стеариновую, линолевую линоленовая кислоты. В целом качественный состав ЖК среды близок к составу внеклеточных ЖК описанным ранее для сред Chlamidomonas reinhardtii, Scenedesmus obliquus, Chlorella vulgaris и других зеленых водорослей (Wood, 1974; Антонян и др., 1986). В конце кривой роста наблюдали и возрастание концентрации МДА, что свидетельствует об усилении процессов окисления ЖК с образованием токсичных продуктов гидроперекисей, альдегидов, кетонов.

Для определения влияния антибактериальной активности СЖК на примере бактерий aureus были испытаны химически чистые препараты арахидоновой (20:4), линоленовой (18:3), олеиновой (18:1), стеариновой (18:0) и пальмитиновой (16:0) ЖК. Оказалось, что при концентрации 10 мкг/мл в темноте только НЖК обладали антибактериальной активностью. Степень подавления роста бактерий действием ЖК была тем значительней, чем больше двойных связей содержала ЖК. Ряд по активности НЖК был следующим (по убыванию): арахидоновая кислота, линоленовая, линолевая, олеиновая. Очевидно, наличие в составе метаболитов, НЖК сенсибилизаторов пигментной природы способствует образованию синглетного кислорода, что может инициировать процессы перекисного окисления и развития окислительного повреждения организма. Это свидетельствует в пользу тесной связи действия на свету антимикробных веществ пигментной и липидной природы Спектр антимикробного действия этих соединений сходен: они подавляли на свету рост на плотных средах грамположительных бактерий и не влияли или влияли слабо на рост грамотрицательных бактерий (возможно, в связи со спецификой их мембран и клеточной стенки).

Альгицидную активность культуральной среды и экстрактов из нее изучали, используя в качестве тест-объектов культуру водоросли-продуцента -Chlorella pyrenoidosa Chick. S-39 и Scenedesmus quadricauda (Turp.) Kutz. Было обнаружено, что ацетоновый экстракт почти не действовал на рост водорослей,

но заметное угнетение роста обеих культур наблюдали при инкубировании с гексановым, хлороформ-метанольным, бензольным экстрактами водоросли и лишь этилацетатный экстракт и 10-кратно сконцентрированная среда оказали

стимулирующее действие. Можно предположить, что метаболиты липиднй природы ингибируют рост водорослей, а фенолыюй оказывают стимулирующее действие. Ранее было показано, что в составе внеклеточных продуктов водоросли Chlorella sp. присутствуют соединения фенольной природы -флавоноиды, кверцитин, соединения пирогалловой, пирокатехиновой природы (Таутс, 1978). Однако автор полагает, что в средах в связи с лабильностью фенольных соединений накапливаются в основном продукты окисления, высокая тохсичность которых известна.

3. Изучение воздействия внеклеточных органических веществ С pyrenoidosa на фотосинтетические характеристики водорослей Влияние экстрактов культуральных сред водоросли С. pyrenoidosa на рост водоросли-продуцента в условиях подращивания культуры и данные литературы свидетельствует в пользу предположения, что ВОВ должны участвовать в регуляции функционирования клеток и развития культур. Поскольку прямых данных о путях такой регуляции практически нет, в данном разделе представлены материалы, которые, возможно, будут полезны при обсуждении регуляторных функций внеклеточных метаболитов.

В первой серии экспериментов было исследовано влияние фильтратов культуры С. pyrenoidosa на фотосинтетическую активность стандартных проб той же культуры плотностью 5 млн/мл. К суспензии водоросли добавляли фильтраты 1-14 сут. культуры в соотношении 1:1 и после 3-мин темновой инкубации проводили измерения параметров флуоресценции. Затем через 24 ч вновь определяли активность ФС 2. В условиях краткосрочного опыта, т.е. при непосредственном воздействии сред культуры различного возраста эффективность функционирования ФС 2 менялась незначительно, а после 24 ч инкубирования наблюдали снижение от величины 0,85 до 0,75. Снижение

происходило в основном за счет снижения интенсивности флуоресценции ка урезке Fm. При отсм наблюдали измгнгнхя з хгргхгерг кидухциоккск хризой

нарастания которое выражалось в частичном подавлении медленной фазы нарастания.

Далее были проведены опыты, в которых свежий посевной материал вносили в фильтраты сред от культуры С. pyrenoidosa разного возраста - от 1 до 14 сут. и наблюдали за развитием культуры. На протяжении всей кривой роста культуры, выращиваемой на 7-сут. фильтрате, относительный выход переменной флуоресценции, отражающий активность ФС 2, был несколько ниже, чем в контроле, а к 14 сут. развития разница была уже существенной - величина Р,/Рш в контроле 0,35 против 0,21 в опыте. Максимальное подавление активности ФС 2 по всей кривой роста происходило при росте культуры на 14-сут. фильтрате, когда максимальные значения на 2-4 сут. роста не превышали величины

0,26-0,28 против 0,75-0,85 в контроле (рис. 3). При росте культуры на 3-сут. фильтрате наблюдали стимуляцию активности ФС 2, но только в начале кривой роста. После 2 сут. роста начиналось подавление активности ФС 2 клеток и к 7-8 сут и до конца опыта величина Ту/¥т была равной таковой, наблюдаемой для культуры, выращиваемой на 7 сут. среде, но выше, чем для культивируемой на 14 сут. среде. Инактивация ФС 2, наблюдаемая при росте культуры на 14-сут. среде (уменьшение Р,/Рга) происходило при снижениии к а ^пГ а к Й"<й т о указывает на нарушения на акцепторной стороне ФС 2, на деструктивные процессы в фотосинтетическом аппарате клеток.

Индукционная кривые нарастания клеток культур водоросли,

выращиваемых на фильтратах культуральных сред существенно отличались от контрольных. В контроле наблюдали близкое к линейному уменьшение медленной фазы нарастания по мере старения культуры, что отражалось на уменьшении отношения амплитуды медленной фазы нарастания к быстрой (рис. 4). В опыте подавление медленной фазы выражено ярко и к концу опыта у культур, растущих на 7 и 14-сут. среде медленная фаза нарастания Рш была практически элиминирована. У культуры, растущей на 3-сут. среде в период 2-6 сут. наблюдали увеличение отношения амплитуды медленной фазы к быстрой, ко до урозня, существенно ниже контрольного с последующим быстрым снижением.

Две фазы индукционной кривой нарастания флуоресценции в присутствии диурона указывают на существование двух видов РЦ ФС 2, отличающихся

1 -i

Ч 15

Время, сут.

Рис. 3. Динамика относительного выхода переменной флуоресценции (F,/Fm) хлорофилла суспензии клеток водоросли С. pyrenoidosa S-39 при росте на фильтратах сред культуры С. pyrenoidosa разного возраста. 1 - контроль, 2 - при росте на фильтрате 7-сут. культуры, 3 - 3-суточной культуры, 4 - 14-сут культуры. Выращивание культуры вели в оптимальных условиях.

величиной квантового выхода восстановления Qa. (Lazar, 1999). Быструю, сигмоидную часть, связывают с функционированием а-центров, медленную экспоненциальную - ß-центров (Anderson, Melis, 1983;.Dau, 1994). Между а-и ß-центрами возможны взаимопревращения и существует предположение, что РЦ ФС 2-ß являются предшественниками РЦ ФС 2-а, лишенными ряда хлорофилл а/Ь содержащих белков (Kyle et al., 1983; Маторин, Венедиктов, 1990). В последнее принято полагать, что медленная фаза в кинетике нарастания отражает функционирование комплексов ФС 2 с дестабилизированным первичным хиноном, что может быть результатом модификации основных белков D1 и D2 ФС 2 (Чемерис и др., 2004). При действии ингибитора электронного транспорта о-фенантролина медленная фаза нарастания переменной флуоресценции отсутствовала, а сохранялась только быстрая фаза, равная по амплитуде быстрой фазе нарастания у клеток, обработанных только диуроном. Чем больше содержание комплексов ФС 2 со слабо связанным

хиноном, тем ниже фотосинтетическая активность. Природа процессов, приводящих к увеличению содержания неактивных комплексов ФС 2 с дестабилизированным (^д, не ясна, но можно полагать, что накопление таких комплексов может быть результатом влияния условий культивирования и видимо, отражает действие регуляторного механизма, изменяющего соотношение активных и неактивных комплексов ФС 2 в зависимости от условий роста водоросли (Чемерис и др., 2004).

Обнаруженное в наших экспериментах подавление медленной фазы нарастания максимальной флуоресценции вполне укладывается в изложенные представления. В составе внеклеточных, метаболитов, волне могут присутствовать ингибиторы электронного транспорта, действующие сходным образом с о-фенантролином, что и вызывает снижение эффективности работы ФС 2 в присутствии фильтратов культур разного возраста и может быть следствием адаптивной реакции, направленной на переживание неблагоприятных условий среды. В этом случае возможность взаимопревращений а- и (3 РЦ ФС 2 реализуется в пользу а-центров, у которых скорость формирования восстановленного хинона в 2-3 раза выше, чем у центров, что целесообразно для сохранения жизнеспособности культуры. Результаты свидетельствуют в пользу существования механизма регуляции развития культур водорослей путем изменения гетерогенности РЦ ФС 2.

Помимо этого, изменение параметров быстрой флуоресценции, а именно снижение выхода флуоресценции на уровне Fm дает основания предполагать, что при действии метаболитов фильтратов 3- и 7-сут. культур наблюдается регуляция фотосинтетической активности, заключающаяся в возрастании безизлучательных потерь энергии возбуждения, направленных на снижение перевосстановления ЭТЦ, что могло бы вызвать фотодеструкцию фотосинтетического аппарата.

| 0,6

О 5 10 15

Время, сут.

Рис. 4. Характер изменений отношения амплитуд медленной фазы к быстрой кинетической кривой нарастания выхода максимальной флуоресценции (Fm) суспензии клеток водоросли С. pyrenoidosa S-39 при росте на фильтратах сред культуры.С. pyrenoidosa разного возраста. 1 - на фильтрате 3-суточной культуры, 2 - контроль, 3 - 7-сут. культуры, 4 - 14-сут культуры. Выращивание культуры вели в оптимальных условиях.

Совершенно логично при этом выглядит снижение роста численности клеток водоросли, наблюдавшееся нами в экспериментах. Изучение фотосинтетической активности, параметров флуоресценции хлорофилла клеток, ростьа численности показало, что к 14 сут. роста в культуральных средах накапливаются физиологически активные метаболиты в концентрациях, практически полностью подавляющих фотосинтетическую активность и рост водорослей. Наблюдавшаяся стимуляция фотосинтетической активности и роста численности клеток при росте культуры С. pyrenoidosa на 3-сут. среде можно обьсянить данными литературы, где показано, что в средах зеленых водорослей могут накапливаться вещества индольной природы, например, индолилуксусная кислота (ИУК), концентрация которой в среде водоросли Chlorella достигала 110 мкМ. (Таутс, Семененко, 1971) Существует также предположение, что

ауксина из

триптофана, другие - ингибировать ИУК-оксидазу и тем самым стимулировать рост (Барабой, 1976). Однако, стимуляцию роста и фотосинтетической активности при культивировании на фильтратах 3-сут. среды наблюдали лишь в

начале кривой роста, в дальнейшем она сменялась ингибированием наблюдаемых показателей, причем более интенсивным, чем таковое для 7- и 14-сут. фильтратов культуральных сред. Это связано, скорее всего с деструкцией исходных метаболитов и накоплением высокотоксичных для водоросли продуктов - хинонов, гидроперекисей, альдегидов, кетонов и других.

Следовательно, внеклеточные метаболиты сред активно участвуют в-регуляции роста и развития культур зеленых микроводорослей, а накопление метаболитов в старых культурах может приводить к подавлению физиологической активности клеток вплоть до прекращения роста культур.

Изучение содержания СЖК в культуральных средах водоросли С. pyrenoidosa показало, что в процессе роста численности клеток происходило увеличение содержания в среде СЖК, концентрация которых в экспоненциальную фазу роста составляла 0,42 мг/л, а в фазу отмирания - 2,5 мг/л (10"5-10'6 М). В связи с этим, было исследовано действие экзогенных ЖК (20 мкМ) на эффективность функционирования ФС 2 клеток водоросли С pyrenoidosa. Сравнительный анализ токсичности ЖК показал, что различия в. действии на относительный выход переменной флуоресценции наблюдали лишь в начале инкубирования суспензий клеток со стеариновой (18:0), олеиновой (18:1), линолевой (18:2), линоленовой (18:3) жирными кислотами. При этом степень инактивации ФС 2 в начале инкубирования была тем больше, чем более ненасыщенной была ЖК. После 12 ч инкубирования степень подавления становилась одинаковой для всех НЖК, независимо от степени ненасыщенности (рис. 5). Насыщенная стеариновая кислота оказывала слабое воздействие на активность ФС 2. Сходные по характеру эффекты были получены при исследовании действия, экзогенной олеиновой, кислоты (ОК) в разных концентрациях на клеток водоросли. Конечная (к 24 ч инкубирования)

степень инактивации ФС 2 практически не зависела от исходного содержания-Однако, схорость инактивации ФС 2 возрастала с увеличением содержания ОК.

При действии ЖК на клетки Chlorella уменьшение за счет снижения интенсивности при неизменном уровне внешне похоже на изменения этих

параметров при фотоингибировании (Demmig, Bjoгkman, 1987, Kiгilovsky et 1990), которое связано с повреждением белковой структуры РЦ ФС 2 (MaIkin,

0,9-1

0 4-1-1-1-1

0 6 12 18 24 Время, ч

Рис.5. Влияния экзогенных ЖК (20 мкМ) на относительный выход переменной флуоресценции (¥/Рт) хлорофилла клеток водоросли С. рутепо\йона Б-39 при инкубировании водоросли с ЖК в течение 24 ч. 1 - контроль, 2 -стеариновая кислота (18:0), 3 - олеиновая (18:1), линолевая (18:2), линоленовая (18:3). Инкубирование клеток водоросли с ЖК проводили в оптимальных условиях.

Sideгeг, 1974). Однако, инактивация ФС 2 клеток хлореллы при действии ЖК, в отличие от фотоингибирования, происходила значительно медленнее. Экзогенные НЖК не вызывали подавления медленной фазы нарастания Рш„ что отличает их действие от влияния фильтратов сред культур разного возраста.

Таким образом, результаты опытов позволяют полагать, что регуляция активности ФС 2 и регуляция развития культур микроводорослей происходит с активным участием внеклеточных физиологически активных метаболитов. Очевидно, внеклеточные метаболиты в природных условиях даже в невысоких концентрациях способны влиять на процессы поглощения и транспорта энергии возбуждения в световых реакциях фотосинтеза в клетках зеленых планктонных водорослей, что может быть основой регуляции их фотосинтетической активности.

Выводы.

1. Накопление внеклеточных органических веществ в культуре С. pyrenoidosa Б-39 определяется физиологическим состоянием клеток. В экспоненциальную фазу динамика накопления ВОВ соответствует динамике изменений фотосинтетической активности и жизнеспособности клеток водоросли. В стационарную фазе ВОВ накапливаются с ускорением в связи с резким снижением фотосинтетической активности и увеличением проницаемости клеток, судя по данным электроспектроскопии культуры.

2. Сопоставление доли мертвых клеток по по электрической проводимости на низких частотах и таковой по методу окрашивания показало, что в экспоненциальную фазу функционально мертвые клетки сосоставляют 25-30% и 2,5-5%, а в стационарную фазу 50-60% и 20-25% соответственно. Выбор критерия оценки доли живых и мертвых клеток имеет важное значение при определении происхождения ВОВ.

3. Экстракты сред культуры С. pyrenoidosa Б-39 при ее максимальной функциональной активности подавляли на свету рост грамположительных бактерий, микроводорослей и не оказывали угнетающего действия на грам-отрицательные бактерии. Наличие в составе метаболитов НЖК, сенсибилизаторов пигментной природы очевидно, способствует образованию синглетного кислорода, что инициирует процессы перекисного окисления и развития окислительного повреждения клеток. Это свидетельствует в пользу тесной связи альгицидного и антимикробного действия на свету веществ липидной и пигментной природы.

4. Физиологически активные метаболиты фильтратов сред культуры С. pyrenoidosa Б-39 приводят к инактивации ФС 2 клеток водоросли. При этом происходит подавление медленной фазы индукционной кривой нарастания максимальной флуоресценции. Очевидно, внеклеточные метаболиты способны влиять на гетерогеность РЦ ФС 2 - уменьшение количества (медленно восстанавливающих первичный хинон) в пользу более эффективных

что биологически целесообразно для сохранения жизнеспособности культуры. Наблюдаемое снижение активности ФС 2 сопровождается снижением роста

численности, что может быть следствием адаптивной реакции, направленной на переживание неблагоприятных условий среды.

5. При инкубировании клеток водоросли с экзогенными ЖК, происходит инактивация ФС 2 внешне (по характеру изменений характеристик флуоресценции) сходно с таковой при фотоингибировании. Скорость инактивации ФС 2 тем выше, чем более ненасыщенной является ЖК, но после 12 ч инкубирования степень инактивации ФС 2 не зависит от степени ненасыщенности ЖК.

Полученные в работе данные позволяют полагать, что в естественных условиях накопление ВОВ, нередко обладающих высокой биологической активностью, создает возможности как для их использования в энергетическом обмене микроорганизмов и водорослей, так и для участия ВОВ в регуляции развития самих водорослей

Список публикаций по теме диссертации.

1. Плеханов С.Е., Чалаева СЛ., Братковская Л.Б., Максимова И.В., Элиас В.В. Жизнеспособность культур зеленых микроводорослей и накопление в средах внеклеточных органических веществ // Мат. науч. конф. "Водные экосистемы и организмы-3". Москва, МГУ, 15-18 июня 2001 г. М. МАКС Пресс. 2001. С. 87.

2. Чалаева СА., Макаров А.А., Максимова И.В., Прохоцкая В.Ю., Плеханов СЕ. Накопление метаболитов в культурах микроводорослей в зависимости от их функционального состояния // Тез. Второй науч. конф. "Акуальные проблемы биотехнологии". Москва, Междунар. Биотехнол. Центр МГУ им. М.В. Ломоносова, 27-29 сентября 2001 г. М. МАКС Пресс. 2001. С. 20.

3. Максимова И.В., Чалаева С.А., Светлова Е.Н., Элиас В.В., Плеханов СЕ. Накопление физиологически активных соединений в культурах зеленых микроскопических водорослей // Тез. Второй науч. конф. "Акуальные проблемы биотехнологии". Москва, Междунар. Биотехнол. Центр МГУ им. М.В. Ломоносова, 27-29 сентября 2001 г. М. МАКС Пресс. 2001. С. 21.

4. Plekhanov S.E., Chemeris Yu.K., Maximova I.V., Chalaeva S.A., Sidorova O.A. Ecotoxicological effects of extracellular fatty acids of green microalgae // Mat of

Inter. Conf. "New Technologies in Protecting Biodiversity in aquatic ecosystems". Moscow, May 27-29,2002. M. MAX Press. 2002. P. 48.

5. Максимова И.В., Чалаева СА., Братковская Л.Б., Плеханов СЕ. Полисахариды в составе внеклеточных органических веществ водоросли Chlorella pyrenoidosa Chick. S-39 // Труды Биотехнологического центра МГУ. Сб. "Биотехнология в охране и реабилитации окружающей среды". М. ФИАН. 2003. С. 123-129.

6. Чалаева С.А., Максимова И.В., Братковская Л.Б., Сидорова О.А., Плеханов СЕ. Бактерицидные и альгицидные свойства внеклеточных продуктов водоросли Chlorella pyrenoidosa Chick. S-39 // Мат. Второй межд. науч. конф. "Биотехнология - охране окружающей среды". Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, 25-27 мая 2004 г. М. Спорт и Культура. 2004. С.

7. Плеханов С.Е., Чалаева С.А., Озерова Е.С., Кобзак СБ., Братковская Л.Б. Электрические свойства культуры водоросли Chlorella pyrenoidosa Chick. S-39 и накопление внеклеточных органических веществ // Мат. Второй межд. науч. конф. "Биотехнология - охране окружающей среды". Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, 25-27 мая 2004 г. М. Спорт и Культура. 2004. С.

ООП МГУ. Заказ 56-100-04

1-95 8 2

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чалаева, Салимат Алиловна

1. Введение 1 1.1 .Основная цель диссертационной работы и задачи

2. Обзор литературы

2.1. Внеклеточные органические вещества водорослей - общие положения

2.2. Химическая природа внеклеточных органических веществ

2.3. Процессы выделения клетками водорослей органических веществ

2.4. Электроспектроскопия в оценке функционального состояния клеток и культур микроводорослей

2.5. Принципы функционирования фотосинтетического аппарата зеленых водорослей.

2.6. Флуоресценция хлорофилла и ее использование для определения функционального состояния водорослей

2.7. Физиологическая активность внеклеточных метаболитов

2.8. Антибактериальная активность внеклеточных метаболитов микроводорослей.

2.9. Активность внеклеточных метаболитов водорослей по отношению к водорослям - их продуцентам

3. Объекты и методы исследования

3.1. Объекты исследования

3.2. Методы исследования.

4. Результаты и обсуждение 50 4.1. Накопление внеклеточных органических веществ в культуре микроводорослей

4.2. Определение электрофизиологических ических характеристик микроводорослей Chlorella pyrenoidosa S-39 в условиях накопительной культуры

4.3. Состояние культуры водоросли С. pyrenoidosa по результатам электроспектроскопии и процессы выделения внеклеточных органических веществ

4.4. Бактерицидные и альгицидные свойства внеклеточных продуктов водоросли Chlorella pyrenoidosa S

4.5. Изучение воздействия внеклеточных органических веществ

С. pyrenoidosa на фотосинтетические характеристики водорослей

4.6. Влияние экзогенных жирных кислот на фотосинтетическую активность водоросли С. pyrenoidosa.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Физиологическое состояние культур зеленых микроводорослей и накопление внеклеточных органических веществ"

Основными первичными продуцентами в водоемах являются планктонные водоросли, которые за счет фотосинтеза осуществляют процесс новообразования органического вещества. Органические вещества клеток водорослей и органические вещества, выделяемые ими в среду - основа функционирования трофической цепи и, следовательно трансформации вещества и энергии в водных экосистемах (Федоров, 1979). Внеклеточные органические вещества (ВОВ) являются связующим звеном в трофической цепи между водорослями, бактериями, зоопланктоном, а также внутри сообщества фитопланктона. Выделение органических веществ водорослями во внешнюю среду - естественный процесс, отражающий жизнедеятельность клеток водорослей. Разнообразие состава ВОВ, биологическая активность отдельных компонентов позволили выдвинуть гипотезу об активном участии внеклеточных продуктов в экологическом метаболизме водоемов (Fogg et al., 1965; Хайлов, 1971; Федоров, Кафар Заде, 1978; Сиренко, Козицкая, 1988; Тамбиев, 1991; Наша et al., 1992).

Изучение взаимодействия водорослей и бактерий с участием внеклеточных метаболитов, в частности, антагонизма, важно для понимания механизмов взаимной регуляции популяций клеток в альгобактериальных ассоциациях, что существенно для прогнозирования изменений в сообществе и поиска путей управления этим взаимодействием и представляет интерес как для теоретических вопросов гидробиологии (Дзержинская, 1993; Садчиков, 1997), так и для практических задач биотехнологии.

В настоящее время достаточно хорошо изучен химический состав ВОВ микроводорослей, в основном с использованием лабораторных культур (Максимова, Горская, 1980; Сиренко, Козицкая, 1988). Однако, до сих пор существуют противоречия в оценке возможных объемов прижизненных выделений, что чрезвычайно важно для правильной оценки первичной продукции (Бульон, 1977; Sharp, 1977; Bjornsen, 1988). Одним из наименее изученных является вопрос о механизмах выделения ВОВ, собственно определяющий происхождение ВОВ и процессы их накопления во внешней среде микроводорослей. Дело осложняется трудностями методического характера, а также неоднородностью популяций клеток водорослей по физиологическому состоянию, что присуще природным популяциям и накопительным культурам. В результате сложно определить, какая доля ВОВ является результатом прижизненных выделений, а какая образовалась в процессе размножения клеток или их автолиза. Такое положение является следствием отсутствия данных по изучению процессов накопления ВОВ в связи с функциональным состоянием культур и клеток микроскопических водорослей, определяемых в основном активностью фотосинтеза и барьерными свойствами внешних мембран.

Наличие в составе ВОВ физиологически активных соединений липидной, фенольной природы и продуктов их ферментативной или неферментативной трансформации позволяет полагать их участие в формировании качества водной среды как среды обитания (Грановская и др., 1992), а также в регуляции роста и развития водорослей (Таутс, 1983; Наша et al., 1992; Paulsen et al., 1998) и микроорганизмов (Сидорова, Максимова, 1986). Несмотря на длительную историю исследования ВОВ микроскопических водорослей, на современном этапе наименее изученными являются вопросы, связанные с процессами прижизненного выделения ВОВ, физиологической активности отдельных компонентов внеклеточных продуктов и участия их в регуляции роста и развития водорослей.

Настоящая работа является продолжением исследований ВОВ микроскопических водорослей, проводимых в течение ряда лет на кафедре гидробиологии и кафедре микробиологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

1.1. Основная цель диссертационной работы - исследование процессов накопления внеклеточных органических веществ в культурах хлорококковых водорослей в связи с физиологическим состоянием клеток, а также изучение возможных путей регуляции развития культур с участием внеклеточных метаболитов. В связи с этим были сформулированы следующие задачи:

1. исследовать процессы накопления ВОВ в культурах хлорококковых водорослей в связи с фотосинтетической активностью и жизнеспособностью клеток;

2. установить возможности применения данных электроспектроскопии накопительной культуры Chlorella pyrenoidosa S-39 в процессе развития в оптимальных условиях для определения функциональной активности клеток водоросли;

3. оценить альгицидную и бактерицидную активность внеклеточных метаболитов зеленых микроводорослей;

Заключение Диссертация по теме "Гидробиология", Чалаева, Салимат Алиловна

6. выводы.

1. Выделение внеклеточных органических веществ в культуре С. ругепо1с1о$а 8-39 в процессе развития культуры определяется физиологическим состоянием клеток. В экспоненциальную фазу динамика накопления ВОВ соответствует динамике изменений фотосинтетической активности и жизнеспособности клеток водоросли. В стационарную фазе ВОВ накапливаются с ускорением в связи с резким снижением фотосинтетической активности и увеличением проницаемости клеток, судя по данным электроспектроскопии культуры.

2. Сопоставление доли мертвых клеток по по электрической проводимости на низких частотах и таковой по методу окрашивания показало, что в экспоненциальную фазу функционально мертвые клетки сосоставляют 2530% и 2,5-5%, а в стационарную фазу 50-60% и 20-25% соответственно. Выбор критерия оценки доли живых и мертвых клеток имеет важное значение при определении происхождения ВОВ.

3. Экстракты сред культуры С. ругепо1с1о$а Б-39 подавляли на свету рост грамположительных бактерий, микроводорослей и не оказывали угнетающего действия на грам-отрицательные бактерии. Наличие в составе метаболитов НЖК, сенсибилизаторов пигментной природы очевидно, способствует образованию синглетного кислорода, что инициирует процессы перекисного окисления и развития окислительного повреждения клеток. Это свидетельствует в пользу тесной связи альгицидного и антимикробного действия на свету веществ липидной и пигментной природы.

4. Физиологически активные метаболиты фильтратов сред культуры С. ругепо'к1о$а Б-39 приводят к инактивации ФС 2 клеток водоросли. При этом происходит подавление медленной фазы индукционной кривой нарастания максимальной флуоресценции. Очевидно, метаболиты влияют на гетерогеность РЦ ФС 2 вызывая уменьшение количества Р-центров (медленно восстанавливающих первичный хинон) в пользу более эффективных а-центров, что биологически целесообразно для сохранения жизнеспособности культуры. Наблюдаемое снижение активности ФС 2 сопровождается снижением роста численности, что может быть следствием адаптивной реакции, направленной на переживание неблагоприятных условий среды.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Проведенные в работе исследования показали, что в процессе развития накопительной культуры С. ругепо1йоБа выделение органических веществ на разных стадиях роста происходит неравномерно и тесно связано с функциональным состоянием клеток, соотношением процессов прижизненного и постлетального выделения. В связи с неоднородностью структуры популяции водоросли по функциональному состоянию, трудно учесть ВОВ, выделяемое клетками живыми, но с нарушенной проницаемостью внешних мембран, в накоплениии ВОВ возрастает роль пассивной диффузии органических веществ. Накопление ВОВ в культуральной среде водорослей сопровождалось значительными изменениями фотосинтетической активности культуры С. ругепо'^оза 8-39. В экспоненциальной фазе максимальная фотосинтетическая активность культуры водоросли, величина коэффициента поляризации, отражающего проницаемость и а-параметра, зависящего от уровня метаболизма клеток совпадала со скоростью роста и скоростью накопления ВОВ. Накопление ВОВ на фоне снижения фотосинтетической активности и Кп в линейную и в начале стационарной фазы развития культуры объясняется увеличением увеличением доли клеток с низкой функциональной активностью -функционально мертвых (по электрической проводимости на низких частотах.). В это время в процессе выделения ВОВ увеличивается роль пассивной диффузии в связи с увеличением проницаемости мембран клеток, судя по по электропроводности. На стационарной фазе резко снижается жизнеспособность клеток водоросли и в составе ВОВ значительно возрастает доля продуктов автолиза клеток. Доля мертвых клеток по данным электропроводности выше, чем по методу окрашивания для всей кривой роста. Это свидетельствует в пользу сложного характера гетерогенности структуры популяции водоросли С. /тугело/с/оуя по функциональному состояниею. В накоплении ВОВ увеличивается роль выделений функционально мертвыми клетками (по низкочастотной проводимости). Следовательно, при учете ВОВ необходимо принимать во внимание функциональное состояние клеток, что позволит точнее оценивать внеклеточную продукцию водорослей, а также регулировать биотехнологические циклы с использованием культур микроводорослей.

Экстракты сред, с применением растворителей различной полярности подавляли на свету рост на плотных средах грамположительных бактерий Staphylococcus aureus и Bacillus subtilis, не оказывали угнетающего действия на грамотрицательные Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, а в темноте не действовали и на грамположительные бактерии. Имеются основания полагать, что наличие НЖК в составе метаболитов, сенсибилизаторов пигментной природы создает условия для появления синглетного кислорода, что может инициировать процессы перекисного окисления и развития окислительного повреждения. Вышесказанное свидетельствует в пользу тесной связи антимикробного действия на свету метаболитов липидной и пигментной природы.

Изучение характеристик флуоресценции у культур, выращиваемых на фильтратах сред разного возраста свидетельствуют, что физиологически активные метаболиты, накопившиеся в составе ВОВ водоросли приводят к инактивации ФС 2 водоросли С. pyrenoidosa. Подавление выхода флуоресценции на уровне гт при неизменном уровне го> внешне сходно с изменениями этих параметров при фотоингибировании, однако происходящими медленнее. В контроле наблюдали близкое к линейному уменьшение медленной фазы нарастания Fm по мере старения культуры. В опыте подавление медленной фазы выражено ярко и к концу 14-сут. эксперимента у культур, растущих на 3, 7 и 14-сут. среде медленная фаза нарастания Fm практически отсутствовала. Известно, что две фазы индукционной кривой нарастания флуоресценции в присутствии диурона указывают на функционирование двух различных фракций РЦ ФС 2 (а-и р-центров), отличающихся по скорости формирования восстановленного хинонного акцептора СЫ Можно предположить, что фильтраты сред содержат внеклеточные метаболиты, способные воздействовать на фотосинтетический аппарат клеток, смещая гетерогеность структуры РЦ ФС 2 (а-и Р-центров) в сторону уменьшения количества Р-центров, или медленно восстанавливающих (^д центров. Снижение фотосинтетической активности клеток водоросли в присутствии фильтратов культур разного возраста может быть следствием адаптивной реакции, направленной на переживание неблагоприятных условий среды В этом случае возможность взаимопревращений а- и Р РЦ, возможно, реализуется в пользу а-центров, у которых скорость формирования восстановленного хинона в 2-3 раза выше, чем у Р-центров, что может быть биологически целесообразно для сохранения жизнеспособности культуры. Полученные результаты свидетельствуют о возможности существования механизма регуляции развития культур водорослей путем воздействия метаболитов, скорее всего, фенольной природы на функционирование фотосинтетического аппарата клеток.

Совершенно логично при этом выглядит снижение роста численности клеток водоросли, наблюдавшееся нами в экспериментах. Стимуляция фотосинтетической активности и роста численности клеток при росте культуры С. ругепо1с1о5а на фильтрате 3-сут. культуры можно объяснить быстрым накоплением в ВОВ фенольных соединений из группы флавоноидов Однако, стимуляция быстро сменялась ингибированием наблюдаемых параметров, причем более интенсивным, чем таковые для 7-сут. фильтратов культуры. Это связано, скорее всего с деструкцией исходных метаболитов и накоплением высокотоксичных для водоросли продуктов -хинонов, гидроперекисей, альдегидов, кетонов и других. Рост культур на 14-сут. фильтратах подавлялся практически полностью.

При развитии культур зеленых микроводорослей появляется возможность токсического действия НЖК из состава ВОВ. Сравнительный анализ токсичности стеариновой (18:0), олеиновой (18:1), линолевой (18:2), линоленовой (18:3) ЖК показал, что при инкубировании клеток водоросли с экзогенными ЖК, скорость инактивации была тем выше, чем более ненасыщенной была ЖК После 12 ч инкубирования степень подавления Ру/Рт становилась одинаковой для всех НЖК, независимо от степени ненасыщенности. Существенным на наш взгляд является сходство в кинетике изменений параметров флуоресценции при действии экзогенных ЖК и фильтратов сред водоросли разного возраста. В обеих вариантах экспериментов наблюдали подавление выхода флуоресценции на уровне Рт, однако, при действии ЖК не происходило элиминирования медленной фазы нарастания Рт. Следовательно, внеклеточные метаболиты активно участвуют в регуляции роста и развития культур зеленых микроводорослей путем воздействия на фотосинтетическую активность, а накопление метаболитов в старых культурах может приводить к подавлению физиологической активности клеток вплоть до прекращения роста культур.

Очевидно, в естественных условиях накопление ВОВ, нередко обладающих высокой биологической активностью, создает возможности как для их использования в энергетическом обмене микроорганизмов и водорослей, так и для участия ВОВ в регуляции развития самих водорослей

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чалаева, Салимат Алиловна, Москва

1. Альварес П.П., Булычев A.A., Денеш М., Курелла Г.А. Светозависимые электрические реакции в клетках морских зеленых сифоновых водорослей // Научн. докл. Высш. школы. Биол.науки. 1982.№ 7. С.39-44.

2. Антонян A.A., Мелешко Г.И., Пепеляев Ю.В., Найдина В.П., Сухова Н.И. Сравнительная характеристика жирнокислотного состава липидов различных водорослей //Прикл. биохим. и микробиол. 1986. Т. 22. В. 4. С. 570-575.

3. Барабой В.А. Биологическое действие растительных фенольных соединений. Киев: Наукова думка. 1976.260с.

4. Биосенсоры: основы и приложения. Ред.:Тёрнер Э., Карубе И., Уилсон Дж. М.: Мир. 1992.614 с.

5. Бульон В.В. Внеклеточная продукция фитопланктона // Усп. совр. биологии. 1977. Т. 84. N 5. С. 294-298.

6. Бульон В.В. Первичная продукция планктона внутренних водоемов. Л.: Наука. 1983.150 с.

7. Верещагин А.Г., Клячко-Гурвич Г.А. Строение и количественный состав жирных кислот липидов водоросли Chlorella// Биохимия. 1965. Т. 30. В. 3. С. 543-550.

8. Веселова Т.В., Веселовский В.А., Чернавский Д.С. Стресс у растений (Биофизический подход). М.: Изд-во Моск.ун-та. 1993. 144 с.

9. Веселовский В.А., Веселова Т.В. Люминесценция растений. Теоретические и практические аспекты. М.: Наука. 1990.200 с.

10. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука. 1972. 252 с.

11. Воробьёв Л.Н., Мусаев H.A. Электрические характеристики клеточной оболочки и плазмалеммы клеток Nitellopsis obtusa. Низкочастотный импеданс // Физиол. растений. 1979. Т. 26, В. 4. С. 711-720.

12. Гладышев М.И., Сущик H.H., Калачева Г.С. Внеклеточные свободные жирные кислоты в периодической культуре Spirulina platensis при пониженной и повышенной температуре // Докл. АН. 1996. Т. 347. № 6. С. 834-836.

13. Горбунова М.П. Альгология. М.: Высш.школа. 1991. 256 с.

14. Горская Н.В. Выделение в среду органических веществ синхронной культурой Chlorella pyrenoidosa штамм S-39. // Автореф. канд. дис. М. 1978. 24 с.

15. Горюнова C.B. Прижизненные выделения водорослей, их физиологическая роль и влияние на общий режим водоемов //Гидробиол. журн. 1966. Т. 2. № 4. С. 80-88.

16. Грановская Л.А., Телитченко Л.А. Некоторые особенности переокисления растворенного органического вещества, экскретируемого Chlorella pyrenoidosa Chick. S-39 на свету и в темноте // Гидробиол. ж. 1978. Т. 14. № 4. С. 71-76.

17. Грановская Л.А., Телитченко Л.А., Широкова Е.Л., Светлова E.H. Роль фитопланктона в формировании биологической полноценности воды в условиях интенсивного УФ-облучения // Гидробиол. ж. 1992. Т. 28. № 2. С. 71-76

18. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. М.: Мир, 1986. Т. 1. 392 с.

19. Дзержинская И.С. Альго-бактериальные аспекты интенсификации биогеохимического круговорота в техногенных экосистемах // Автореф. дис. докт. биол. наук. М.: МГУ. 1993.48с.

20. Денисова А.И. О подходе к изучению элементов круговорота биогенных и органических веществ в водоемах замедленного стока // Органическое вещество и биогенные элементы во внутренних водах. Таллин.: АН ЭССР. 1978. Т. 1. С. 29-31.

21. Дрейпер Н., Смит Г. Прикладной регрессионный анализ.- М.: Статистика. 1973. 392с.

22. Жуков Ю.А. Исключение электродной поляризации при измерении ёмкости биологических объектов на частотах 1-150 кГц // Биофизика. 1969. Т. 14, вып. 1. С.192-193.

23. Жуков Ю.А., Тарусов Б.Н. Высокочастотная электродная поляризация и её влияние на измерение ёмкости биологических материалов // Биофизика. 1967. Т.12, В. 6. С.1106-1107.

24. Запрометов М.Н. Основы биохимии фенольных соединений. М.: Высш. шк. 1974.214 с.

25. Иост X. Физиология клетки. М: Мир, 1975. 864 с.

26. Калачева Г.С., Сущик H.H. Состав жирных кислот Spirulina platensis в зависимости от возраста и минерального питания культуры // Физиол. раст. 1994. Т. 41. № 2. С. 275282.

27. Каляев Р.К., Кочубей С.М., Гродзинский Д.М. Связь между флуоресценцией хлорофилла in vivo и продуктивность сине-зеленой водоросли Anabaena variabilis // Гидробиол. ж. 1983. Т. 19. № 6. С. 36-39.

28. Карапетян Н.В., Бухов Н.Г. Переменная флуоресценция хлорофилла как показатель физиологического состояния растений//Физиол. раст. 1986. Т. 33. N 5. С. 1012-1026.

29. Карауш Г.А., Федоров В.Д. Прижизненные выделения сине-зеленых водорослей Anacystis nidulans и Synechocystis aquatilis в moho- и смешанной культуре // Физиол. раст. 1975. Т. 22. В. 3. С.607-614.

30. Кафаров P.C., Шендерова Л.В., Маторин Д.Н., Венедиктов П.С. Ингибирование фотосинтеза, накопление перекисей липидов и гибель клеток хлореллы при интенсивном освещении//Физиол. растений. 1989. Т. 35. № 3. С. 458-463.

31. Келл Д.Б. Принципы и возможности спектроскопии электрического адмиттаиса // Биосенсоры. Ред. Э.Тернер, И.Карубе, Дж. Уилсон. М.: Мир. 1992. С. 344-374.

32. Кейтс М. Техника липидологии. М.: Мир. 1975. 324 с.

33. Кирилова B.C. Изучение липидного комплекса некоторых представителей азотфиксирующих синезеленых водорослей и хлореллы // Автореф. дис. канд.биол.наук. Киев. 1969.25с.

34. Клейтон Р. Фотосинтез. Физические механизмы и химические модели. М.: Мир. 1984.350 с.

35. Козицкая В.Н. Внеклеточные продукты фенольной природы некоторых синезеленых водорослей // Физиол. раст. 1974. Т.21. N 2. С. 296-300.

36. Козицкая В.Н. Ингибируюшие вещества, продуцируемые некоторыми синезелеными водорослями // Гидробиол. журн. 1984. Т. 20. № 2.С. 51-55.

37. Кренделева Т.Е. Фосфорилирование белков хлоропластов и регуляция первичных процессов фотосинтеза//Вестник Моск. ун-та. Сер. 16. Биология. 1988. № 2. С. 3-14.

38. Кукушкин А.К., Тихонов А.Н. Лекции по биофизике фотосинтеза растений. М.: МГУ. 1988.320с.

39. Культивировние коллекционных штаммов водорослей. Ред. Б.В.Громов. JL: ЛГУ. 1983. 150 с.

40. Ланкин В.В., Гуревич С.М., Бурлакова Е.Б. Изучение аскорбат-зависимого переокисления липидов тканей с помощью теста с 2-тиобарбитуровой кислотой // Биоантиокислители. М.: Наука. 1975. С. 73-78.

41. Липидный практикум. М.: МГУ. 1980.

42. Лукас С. Экологическое значение метаболитов, выделяемых во внешнюю среду // Механизмы биологической конкуренции. М.: Мир. 1964. С. 242-262.

43. Лядский В.В., Горбунов М.Ю., Венедиктов П.С. Импульсный флуориметр для исследования первичных реакций фотосинтеза у зеленых растений // Научн. докл. Высш. школы. Биол. науки. 1987. № 12. С. 96-102.

44. Лядский В.В., Васильев С.С., Венедиктов П.С. Изменения выхода флуоресценции хлорофилла в изолированных хлоропластах под действием олеиновой кислоты // Физиол. раст. 1991. Т.38. Вып.2. С. 235-241.

45. Лядский В.В., Горбунов М.Ю., Венедиктов П.С. Импульсный флуориметр для исследования первичных реакций фотосинтеза у зеленых растений//Биологические науки. 1987. № 12. С. 96-101.

46. Лядский В.В., Плеханов С.Е. Действие олеиновой кислоты на хлоропласты шпината: обратимое и необратимое ингибирование активности фотосистемы II // Известия РАН. Сер. биол. 1999. №2. С. 167-171.

47. Максимов В.Н. Многофакторный эксперимент в биологии. М.: МГУ. 1980.279 с.

48. Максимова И.В. Интенсивность фотосинтеза и образование внеклеточных продуктов Nitzshia ovalis arh. при разных концентрациях кислорода // Биол. науки. 1979. № 1.С. 78-84.

49. Максимова И.В., Торопова Е.Г., Пименова М.Н. Накопление органического вещества в растущих культурах водорослей // Микробиология. 1965. 34. № 3. С.483-490.

50. Максимова И.В., Корженко В.П. Выделение азотсодержащих веществ Chlorella pyrenoidosa шт. S-39.// Биол. науки. 1972. № 8. С. 106-111.

51. Максимова И.В., Пименова М.Н. Выделение органических кислот зелеными одноклеточными водорослями // Микробиология. 1969. 38. № 8. С.77-86.

52. Максимова И.В., Пименова М.Н. Внеклеточные продукты зеленых водорослей. В кн.: Физиологически активные соединения биогенного происхождения. М.: МГУ. 1971. С.30-31.

53. Максимова И.В., Горская Н.В. Внеклеточные органические продукты микроводорослей // Научн. докл. высшей школы. Биол.науки. 1980. № 6. С. 5-21.

54. Максимова И.В., Горская Н.В., Пименова М.Н. Выделение органических веществ Chlorella pyrenoidosa в процессе роста и деления клеток // Микробиология. 1972. Т. 41. № 1.С. 59-63.

55. Максимова И.В., Даль Е.С. Выделение гликолевой кислоты клетками Clorella pyrenoidosa // Микробиология. 1975. Т. 44. В. 6. С. 1057-1063.

56. Максимова И.В., Малаховская О.О., Прядильщикова Е.Г. Антибактериальная активность диатомовых водорослей. I. Липиды Nitrzschia ovalis и их антибактериальная активность.// Физиол. раст. 1984. Т. 31. В. 5. С. 944-950.

57. Максимова И.В., Сидорова O.A. Светозависимый антибактериальный эффект водорослей и его экологическое значение // Гидробиол. ж. 1986. Т. 22. № 6. С. 3-11.

58. Максимова И.В., Плеханов С.Е., Светлова E.H. Жирные кислоты культуры водорослей Westella botryoides // Известия РАН. Сер. биол. 1995. №6. С. 669-673.

59. Маторин Д.Н. Воздействие природных факторов среды и антропогенных загрязнений на первичные процессы фотосинтеза микроводорослей // Автореф. дис.докт.биол.наук. М.: МГУ. 1993.45 с.

60. Маторин Д.Н., Венедиктов П.С. Люминесценция хлорофилла в культурах микроводорослей и природных популяциях фитопланктона // Итоги науки и техн. Биофизика. 1990. Т. 40. ВИНИТИ. С. 49-100.

61. Мерзляк М.Н. Активированный кислород и окислительные процессы в мембранах растительной клетки //Итоги науки и техники. Сер. Физиология растений. ВИНИТИ 1989. Т. 6. 168 с.

62. Молотковский Ю.Г. Гидролиз фосфолипидов и образование свободных жирных кислот в изолированных хлоропластах // Биохимия. 1968. Т. 33. В. 5. С. 961-968.

63. Муой Jle Тхи, Стом Д.И., Кефели В.И., Турецкая Р.Х., Тимофеева С.С., Власов П.В. Хиноны как промежуточные продукты окисления некоторых фенольных ингибиторов роста//Физиол. раст. 1974. Т.21. Вып. 1. С. 164-168.

64. Остроумов С.А. Введение в биохимическую экологию. М.: МГУ. 1986.176 с. Перов Ю.Ф. Широкополосный мост для измерения проводимостей биологических объектов И Матер. XVII научн. конф. физиол. Юга РСФСР. Ставрополь/ 1969. Т.Н. С. 195196.

65. Пименова М.Н., Максимова И.В. Накопление органического вещества в автотрофных культурах водорослей// Биология автотрофных микроорганизмов. М.: МГУ. 1966. С. 126-138.

66. Плеханов С.Е., Максимова И.В. Влияние изменений физико-химических показателей среды на развитие Scenedesmus quadricauda // Микробиол. ж. 1981.Т.43. № 2. С. 229-234.

67. Плеханов С.Е., Максимова И.В. Функциональное состояние культур хлорококковыхводорослей и накопление внеклеточных органических веществ // Физиол. раст. 1996. Т. 43. №1. С. 116-123.

68. Плеханов С.Е., Максимова И.В. Внеклеточное органическое вещество водоросли CHLORELLA : количественные аспекты // Вестник Моек ун-та. Сер. 16. Биол. 1997. №2. С. 25-28.

69. Плеханов С.Е. Первичные функциональные реакции пресноводных зеленых водорослей на химическое загрязнение. // Автореф. Дис. докт. Биол. наук. 1999. М.: МГУ. 50с.

70. Полынов В.А. Оценка физиологического состояния байкальского фитопланктона. Проблемы экологии. Т. 2. 1995. Новосибирск.: Наука. С. 54-57.

71. Поляков Г.Д. Пособие по гидрохимии для рыбоводов. М. 1950 Романенко В.И., Ейрис М., Перес, Пубиенес М.А. Потери органического вещества планктонными водорослями в водохранилищах Кубы // Биол. внутр. вод. Информ. бюлл. 1981. №75. С. 7-10.

72. Рубин А.Б. Биофизика.М.: Высшая школа. 1987. Т. 1.319 с. Рубин А.Б. Биофизика.М.: Высшая школа. 1987. Т. 2.307 с. Рубин А.Б. Лекции по биофизике. М.: МГУ. 1994. 160 с.

73. Садчиков А.П. Продуцирование и трансформация органического вещества размерными группами фито- и бактериопланктона (на примере водоемов Подмосковья) // Автореф. дис докт.биол. наук. М.: МГУ. 1997. 53 с.

74. Садчиков А.П., Френкель O.A., Скобеева Т.Н. Ферментативная и гетеротрофная активность водорослей и бактерий // Гидробиол. журн. 1992. Т. 28. № 6. С. 51-55.

75. Сакевич А.И. Экзометаболиты пресноводных водорослей. Киев: Наук, думка. 1985.200 с.

76. Саут Р., Уиттник А. Основы альгологии. М.: Мир. 1990. 595 с. Сидорова O.A., Максимова И.В. Липиды зеленой водоросли Westella botryoides и их светозависимая антибактериальная активность // Физиол. раст. 1986. Т. 32. В. 3. С. 465472.

77. Сидорова O.A., Максимова И.В. Причины антибактериальной активности хлорофилл идо в при их освещении // Вестник Моск. ун-та. Сер. 16. Биол. 1989. № 3. С. 3135.

78. Сиренко JI.A., Козицкая В.Н. Биологически активные вещества водорослей и качество воды. Киев: Наукова думка. 1988. 256 с.

79. Стойнов З.Б., Графов Б.М., Савова-Стойнова Б.С., Елкин В.В. Электрохимический импеданс. М.: Наука. 1991. 336 с.

80. Стом Д.И., Бобовская Л.П., Тимофеева С.С. Влияние фенолов и продуктов их окисления на водные растения и содержание в них сульфгидрильных групп // Докл. АН СССР. 1974. Т. 216. №3. С. 698-701.

81. Тамбиев А.Х. Реакционная способность экзометаболитов растений. М.: МГУ . 1984. 72 с.

82. Тамбиев А.Х. Динамика экскреции органических соединений микроводорослями и цианобактериями //Дисс. докт. биол.наук. М.: МГУ. 1991. 69 с.

83. Тамбиев А.Х., Шелястина H.H., Болдырева Л.С. Изучение биологической активности экзометаболитов одноклеточных морских водорослей // Физиол. раст. 1981. Т. 28. №3. С. 31-35.

84. Тамбиев А.Х., Кирикова H.H. Выделение органического вещества у морских водорослей //Успехи совр. биол. 1981. Т.92. Вып. 1(4). С. 100-114.

85. Тамбиев А.Х., Кирикова H.H., Шелястина H.H. Выделение органических соединений морскими водорослями // Вестн. Моек ун-та. Сер. 16. Биол. 1983. №1. С. 5255.

86. Тарусов Б.Н. Электропроводность как метод определения жизнеспособности тканей //Арх. биол. наук. 1938. Т.52, вып. 2. С.178-181.

87. Таутс М.И. Внеклеточные жирные кислоты хлореллы // Мат.VIII Всес. раб. совещ. по вопросу круговорота веществ в замкнутой системе на основе жизнедеятельности низших организмов. Киев.: Наукова думка. 1974. С. 83-85.

88. Таутс М.И. Фенольные соединения культуральной среды бактериально чистой культуры Chlorella // Физиол.раст. 1978. Т. 25. № 2. С. 401-404.

89. Таутс М.И. Фенольные соединения бактериальной культуры хлореллы и некоторая их характеристика//Физиол. раст. 1983. Т. 30. № 2. С. 332-340.

90. Таутс М.И., Семененко В.Е. Выделение и идентификация физиологически активных веществ индольной природы во внеклеточных метаболитах хлореллы // Докл. АН СССР. 1971. Т. 198. № 4. С.970-973.

91. Телитченко М.М. Гипотетические альготоксины и перикисное окисление растворенных органических веществ // Гидробиол. журн. 1974. Т. 10. № 9. С. 97-107.

92. Телитченко М.М., Шестерин И.С., Иванов Э.В. Изучение антиокислительной и биологической активности внеклеточных метаболитов зеленых водорослей в процессе их роста // Биол. науки. 1972. № 8. С. 26-27.

93. Телитченко М.М., Шестерин И.С., Иванов Э.В., Гельфанд Е.С. Изучение антиокислительной и биологической активности внеклеточных метаболитов зеленых протококковых водорослей в процессе их роста // Биол. науки. 1972. № 8. С. 55-59.

94. Тихонов А.Н. Трансформация энергии в хлоропластах энергопреобразующих органеллах растительной клетки // Соросовский образоват. журн. 1996. № 4. С. 24-32.

95. Трунова О.Н. Биологические факторы самоочищения водоемов и сточных вод. Л: Наука. 1979. 112 с.

96. Фёдоров В.Д. О методах изучения фитопланктона и его активности. М.: МГУ. 1979. 168 с.

97. Фёдоров В.Д., Корсак М.Н. О фотосиитетическом коэффициенте и прижизненных выделениях синезеленой водоросли Anacystis nidulans // Вестн. Моск.ун-та Сер. Биол., Почвов. 1975. № 2. С. 68-73.

98. Фёдоров В.Д., Кафар Заде J1. Исследование регулярного действия метаболитов (фильтратов) водорослей на природный планктон // Человек и биосфера. 1978. № 2. С. 172-198.

99. Хайлов К.М. Экологический метаболизм в море. Киев: Наукова думка. 1971. 252 с.

100. Хайлов К.М. Система углерода // Биохимическая трофодинамика морских прибрежных экосистем. Киев.: Наук, думка. 1974. С. 94-95.

101. Царенко В.М. Особенности внеклеточного накопления органических кислот у некоторых видов водорослей // Гидробиол. ж. 1984. Т. 19. № 1. С. 88-92.

102. Чемерис Ю.К., Корольков Н.С., Сейфуллина Н.Х., Рубин А.Б. Комплексы ФС II с дестабилизированным первичным хинонным акцептором электронов у адаптированной к темноте Chlorella // Физиол. раст. 2004. Т.51. №.1. С. 1-7.

103. Шаповалов А.А. Выделение органических веществ из клеток растений в связи с функциональным состоянием плазматических мембран // Успехи совр. биол. 1973. Т. 76. В. 1(4) С. 82-95.

104. Шван Г. Спектроскопия биологическтих веществ в поле переменного тока. В кн.: Электроника и кибернетика в биологии и медицине. М.: ИЛ. 1963. С. 71-108.

105. Шестерин И.С. Изучение причинных связей, определяющих взаимоотношения зеленых протококковых водорослей на уровне метаболитов//Автореф. дис. канд. биол. наук. М.: МГУ. 1972.24 с.

106. Шувалов В.А. Первичное преобразование световой энергии при фотосинтезе. М.: Наука. 1990.207 с.

107. Юськович А.К. Экстракция неэтерифицированных жирных кислот из плазмы крови //Лаб.дело. 1985. № 8. С. 488-489.

108. Яглова Л.Г. Электропроводимость биологических систем В кн.: Биофизика, (ред. Б.Н.Тарусов, О.Р.Кольс). М.: Высш. шк. 1968. С. 186-215.

109. Allen М.В. Excretion of organic compounds by Chlamidomonas // Arch. Microbiol. 1956. V. 24. P. 163-168.

110. Anderson J.M., Melis a. Localization of different photosystems in separate regions of chloroplast membranes//Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1983. V. 80. P.745-749.

111. Anderson J.M. Cytochrome b/f complex: Dynamic molecular organization, function and acclimation. // Photosynth. Res. 1992. V. 34. P. 341-357.

112. Barber J., Anderson B. Too much of a good thing: light can be bad for photosynthesis// Trends Biochem. Sci. 1992. V. 17. P. 61-66.

113. Begum F., Syrett P.J. Fermentation of glucose by Chlorella // Arch. Mikrobiol. V. 72. P. 344-352.

114. Benett J. Protein phosphorylation in green plant chloroplasts // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1991. V. 42. P. 281-311.

115. Berman Thomas. Release of dissolved organic matter by photosynthesising algae in Lake Kinneret, Israel // Freshwater Biol. 1976. N 1. P. 13-18.

116. Bernhardt J., Pauly H. Dielectric measurements of Nitellopsis obtusa cells with intracellular electrodes // Radiat. Environm. Biophys. 1974. V.l 1. N 1. P.91-100.

117. Blinks L.R. The direct current resistance of Nitella // J. Gen. Physiol. 1930. Vol.13, N 4. P. 495-508.

118. Bjornsen P. K. Phytoplankton exudation of organic matter: Why do healthy cells do it? // Limnol. and Oceanogr. 1988. V. 33. N 1. P. 151-154.

119. Billmire E., Aaronson S. The secretion of lipids by the freshwater phytoflagellate Ochromonas danica// Limnol. and Oceanogr. 1976. V.21. N I. P. 138-140.

120. Bordi F., Cametti C., di Biasie A. Passive electrical properties of biological cell membranes determined from Maxwell-Wagner conductivity dispersion measurements // Bioelectrochem. Bioenerg. 1989. V. 22. N 2. P. 135-144.

121. Chitnis P.R., Thornber J.P. The major light-harvesting complex of photosystem II; aspects of its molecular and cell biology. // Photlsynth. Res. 1988. V. 16. P. 41-63.

122. Chrost R.J., Siuda W. Some factors affecting the heterotriophic activity of bacteria in lake//Acta Microbiol. Polon., 1978. V.4(2). N 3. P. 129-138.

123. Clayton R.K. Characteristics of prompt and delayed fluorescence from spinach chloroplasts// Biophys. J. 1969. V. 9. P. 60-77.

124. Cole K.S. Membranes, Ions and Impulses. Berkely and Los Angeles : Univ. of California Press, 1968.258 p.

125. Curtis H.J., Cole K.S. Transverse electric impedance ofNitella// Ibid. 1938. V.21. P.198201.

126. Czeczuga B. Gradski F. Relationship between extracellular and cellular production in the sulphuric green bacterium Chlorobium limicola Nads (Chlorobacteriaceae) as compared to primary production of phytoplankton // Hydrobiologia. 1973. V.42. N 1. P. 85.

127. Davey C.L., Davey H.M., Kell D.B. On the dielectric properties of cell suspensions at high volume fractions // Bioelectrochem. Bioenerg. 1992. V. 28. N 1/2. P. 319-340.

128. Dau H. Short-term adaptation of plants to changing light intensities and its relation to photosystem II photochemistry and fluorescence emmission. // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 1994a. V. 26. P. 3-27.

129. Dau H. Molecular Mechanisms and Quantitative Models of Variable Photosystem II Fluorescence//Photochem. Photobiol. 1994b. V. 60. P. 1-23.

130. Demmig B., Bjorkman O. Comparison of the effect of excessive light on chlorophyll fluorescence (77 K) and photonyield of O2 evolution in leaves of higher plants // Planta. 1989. V. 171. N. 2. P. 171-184.

131. Ellis J.R. Chloroplast proteins: synthesis transport and assembley // Ann. Rev. Plant Physiol. 1981. V. 32. P. 111-117.

132. Falkowski P.G., Kiefer A. Chlorophyll a fluorescence in phytoplankton: relationship to photosynthesis and biomass//J. Plankton Res. 1985. V. 7. N 5. P. 715-731.

133. Feuillade M., Dufour Ph., Feuillade J., Peletier I.P. Excretion de carbone organique par le phytoplankton Iemanique // Schweiz. Z. Hydrol., 1986. V. 48. N 1. P. 18-33.

134. Firstenberg-Eden R., Eden G. Impedance Microbiology Research Studies Press: Letchworth. 1984. 170 p.

135. Firstenberg-Eden R., Zindulis J. Elecrtochemical changes in media due to microbial growth //J. Microbiol. Methods. 1984. V. 2. P.103-115.

136. Fogg G.E. The production of extracellular nitrogenous substances by blue-green alga// Proc. Roy. Soc. 1952. V. 139. P. 372-397.

137. Fogg G.E. Extracellular products. // Phisiology and Biochemistry of Algae. Acad. Press. London. 1972.475 p.

138. Fogg G.E. Extracellular products of algae in fresh water // Arch. Hydrobiol. 1971. V.5. P.

139. Fogg G.E. The ecological significance extracellular products of phytoplankton photosynthesis // Bot. Mar. 1983. V. 26. N 1. P. 3-14.

140. Fogg G.E., Nalewaiko C., Watt W. Extracellular products of phytoplankton photosynthesis // Proc. Roy. Soc. London. Ser. b. 1965. V. 162. P. 517-534.

141. Fork D.C., Herbert S.K. Electron transport and photophospholation by photosystem I in vivo in plants and cyanobacteria // Photosynth. Res. 1993. V. 36. P. 149-168.

142. Fricke H. The electric capacity of suspensions with special reference to blood // J. Gen. Physiol. 1925. Vol.8. N .P.137-152.

143. Fricke H. Relation of the permittivity of biological cell suspensions to fractional cell volume //Nature. 1953. V.172. N 438. P.731-732.

144. Friedman A.L., Alberte R.S. A diatom light-harvesting comole. Purification and characterization // Plant. Physiol. 1984. V. 76 (2). P. 483-489.

145. Gladyshev M.I., Gribovskaya I.V., Adamovich V.V. Dissapearance of phenol in water samples taken from the Yenisei river and the Krasnoyarsk reservoir // Water Research. 1993. V. 27. P. 1063-1070.

146. Gladyshev M.I., Kalachova G.S., Sushchik N.N. Free fatty acids of surface film of water in the Sydinsky bay of the Krasnoyarsk reservoir // Internacionale Revue der gesament Hydrobiologia. 1993. V. 78. P. 575-587.

147. Golbeck J.H., Martin I.F., Fowler C.E. Mechanism of linolenic acid-induced inhibition of photosynthetic electron transport// Plant Physiol. 1980. V.65. P. 707-713.

148. Golbeck J.H., Warden J.T., Interection of linolenic acid with bound quinone molecules in photosystem II // Biochim. Biophis. Acta. 1984. V. 767(2). P. 263-271.

149. Govindjee O.D., Amesz J., Fock D. Light emission by plants and bacter // Orlando. Acad. Press. 1986. 650 p.

150. Hama T. Production and turnover rates of fatty acids in marine particulate matter trought phytoplankton photosynthesis//Mar. Chem. 1991. V. 33. P. 213-227.

151. Hama T., Matsunaga K., Handa N. and Takahashi M. Fatty acids composition in photosynthetic products of natural phytoplanctonpopulation in Lake Biwa, Japan //J. of Plankton Res. 1992. V. 14. N 8. P. 1055-1065.

152. Hansen J.A. Antibiotic activity of the chrisophyte Ochromonas malhamensis // Physiol. Plantarum. 1973. V.29. N 2. P. 234-238

153. Harris C.M., Kell D.B. On the dielectrically observable consequences of the diffusional motions of lipids and proteins in membranes. 2. Experiments with microbial cells, protoplasts and membrane vesicles// Eur. Biophys. J. 1985. Vol.13 N 1. P.l 1-24.

154. Harris C.M., Todd R.W., Bungard S.J. Dielectric permittivity of microbial suspensions at radio frequencies: a novel method for the real-time estimation of microbial biomass // Enzyme and Microbial Technology. 1987. V.9. N 3. P.l81-186.

155. Hause L.L., Komorowski R.A., Gayon F. Elecrtode and electrolyte impedance in the detection of bacterial growth // IEEE Trans. Biomed. Eng. 1981. V.28. N 5. P.403-410.

156. Hellebust J.A. Extracellular of some organic compounds by marine phytoplankton // Limnol. Oceanogr. 1965. V. 10. N 2. P. 192-206.

157. Hellebust J.A. Extracellular Products // Algae Physiol, and Biochem. Ed. W.D.P. Stewart. Botanic Monographs. Oxford: Blackwell Sci. Publ. 1974. V.10. P. 838-863.

158. Kaplan A., Berry J.A. Glicolate Excretion and the Oxygen to Carbon Dioxide Net Exchange Ratio during Photosynthesis in Chlamydomonas reinhardtii // Plant Physiol. 1981. V. 67. P. 229-232.

159. Kirilovsky D.L., Vernotte C., Etienne A.L. Protection from photoinhibition by low temperature in Synechocystis 6714 and in Chlamydomonas reinhardtii: detection of an intermediary state. //Biochem. 1990. V.29. P.8100-8106.

160. Klimov V.V., Klevanik A.V., Shuvalov V.A., Krasnovsky A.A. Reduction of pheophytin in the primary light reaction of photosystem II // FEBS Lett. 1977. V. 82. P. 183-186.

161. Krall J.P. and Edwards G.E. Relationship between photosystem II activity and CO2 fixation in leaves//Physiol. Plantarum. 86. 1992. Copenhagen. P. 180-187.

162. Kramer W.A., Furbacher P.N., Szszepaniak A., Tae G.S. Electron transport between Photosystem II and Photisysten I // Curr. Topics bioenerg. 1991. V. 16. P. 179-222.

163. Kroes H.W. Extracellular products from Chlorococcum ellipsoideum and Chlamydomonas globosa// Arch. Microbiol. 1972. 84. N 3. P.270-274.

164. Krogmann D.W., Jagendorf A.T.Inzhibition of the Hill reaction by fatty acids and metall chelating agents //Arch. Biochem. Biophys. 1978. V. 80. P. 421-430.

165. Kulandaivelu G., Senger H. Changes in the reactivity of the photosynthetic apparatus in heterophic ageing cultures of Scenedesmus obliquus// Physiol. Plant. 1976. V. 36. P. 157-164.

166. Kulandaivelu G., Daniell H. Dichlorophenyl dimetylurea (DCMU) induced increase of chlorofill a fluorescence intensity.- An index of photosynthetic oxygen evolution in leaves, chloroplasts algae // Physiol. Plant. 1980. V. 48. P. 385-388.

167. Mackey B.M., Derrick C.M. Conductance measurements of the lag phase of injured Salmonellatyphimurium//J. Appl. Bact. 1984. V. 57. № 2. P.299-308.

168. Malkin S., Siderer Y. The Effect of Salt Concentration on the Fluorescence Parameters of Isolated Chloroplast // Biochim. Biophis. Acta. 1974. V. 368. N 3. P. 422-431.

169. Maque T.H.,Friberg E., Hughes D.J., Morris J. Extracellular release of carbon by marine phytiplankton: a physiological approach // Limnol. and Oceanogr. 1980. V. 25. N2. P.262.

170. Marder J.B., Barber J. The molecular anatomy and function of thilakoid proteins // Plant Cell and Environment. 1989. V.12. P.595-616.

171. Markx G.H., Davey C.L. The dielectric properties of biological cells at radiofrequencies: applications in biotechnology//Enz. Microb. Technol. 1999. V. 25. N 3-5. P.161-171.

172. Melis A., Anderson J.M. Structural and functional organization of the photosystems in spinach chloroplasts. Antenna sise, relative electron transport capacity and chlorophill composition // Biochi.Biophys. Acta. 1983. V. 724. P. 473-484.

173. Nalewajko C., Schindler D.W. Primery production, extracellular release and heterotrophy in two lakes tn the ELA, north-western Ontario //J. Fish. Res. Board Can. 1976. N 2. P. 219-226.

174. Nalewajko C. Photosynthesis and excretion in various planktonic algae // Limnol. and Oceanogr. 1966. 11. N 1. P.l-10.

175. Oquist G., Hardstrom A., Aim P., Samuelson G., Richardson K. Chlorophyll a fluorescence as an alternative method for estimating primary production // Mar. Biol. 1982. V. 68. N 1. P. 71-75.

176. Osterhout W.J.V. Injury, Recovery and Death, in Relation to Conductivity and Permeability. J.B.Lippincott: Philadelphia and London. 1922.

177. Pethig R., Kell D.B. The passive electrical properties of biological systems; their role in physiology, biophysics and biotechnology// Phys. Med. Biol. 1987. V.32. N 8. P.933-970.

178. Powles S.B. Photoinhibition of photosynthethesis by visible light // Annu. Rev. Plant Phytsiol. 1984. V. 35. P. 15-44.

179. Reemtsma T., Haake B., Ittekkot V., Nair R.R., Brockmann U.H. Downward Flux of Particular Fatty Acids in the Central Arabian Sea // Marine Chemistry. 1990. V. 29. P. 183-202.

180. Ronney E.K., East J.M., Jones O.T., McWhriter J., Simmonds A.C. and Lee A.G. Interaction of fatty acids with lipid bilaycrs // Biochim. Biophys. Acta. 1983. V.728. P.159-170.

181. Samson G., Morissette J-C., Popovic R. Copper quenching of the variable fluorescence in Dunaliella tcrtiolecta. new evidence for a copper inhibition effect on PSII photochemistry // Photochemistry and Photobiology. 1988. V. 48. N 3. P. 329-332.

182. Samuelson G., Oquist G.A. A method for studying photosynthetic capacities of unicellular algae based on in vivo chlorophyll fluorescence // Physiol.Plant. 1977. V. 40. P.315-319.

183. Samuelson G., Oquist G.A. and Halldal P. The variable chlorofill a fluorescence as a measure of photosynthetic capacity in algae // Mitt. int. Ver. Limnol. 1978. V. 21. P. 207-215.

184. Santarius K.A. Membrane lipids in heat injury of spinach chloroplasts // Physiol. Plant. 1980. V. 49. P. 1-6.

185. Sharp J.H. Excretion of organic matter by marine phytoplankton: Do healthy cell do it? // Limnol. oceanogr. Univ. California. 1977. V. 22. N 3. P. 381-399.

186. Sieburth J. McN. The influence of algal antibiosis on the ecology of marine microorganisms// Adv. microbiol. 1968. V. 1. P. 63-94.

187. Sieburth J. McN. Studies on algal substances in the sea. III. The production of extracellular organic matter by littoral marine algae // J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 1969. V. 3. P. 290-309.

188. Siegenthaler P.A. Chloroplast Aging in vitro and Relationships to Fatty Acids and Polyphenoloxidase Activity// Experientia. 1970. V. 26. P. 1308-1310.

189. Siegenthaler P.A. Aging of the photosynthetic apparatus. IV. Similarity between the effects of aging and unsaturated fattyacids on isolated spinach chloroplasts as expressed by volume changes // Biochim. Biophys. Acta. 1972. V. 275. P. 182-191.

190. Siegenthaler P.A. Inhibition of photosystem 11 electron transport in chloroplasts and restoration of its activity by Mn2+// FEBS Lett. 1974. V. 39. N 2. P. 337-342.

191. Spanswick R.M. Evidence for an electrogenic ion pump in Nitella translucens. I. The effect of pH, K+, Na+, light and temperature on the membrane potential and resistance // Biochim. Biophys. Acta. 1972. V. 288. N 1. P. 73-89.

192. Stadelmann E.J. Permeability of the plant cell. // Ann. Rev. Plant Physiol. 1969. V. 20. P. 585-606.

193. Storch Th.A., Saunders G.W. Estimating dayly rates of extracellular dissolved organic carbon release by phytoplankton populations // Verh. Int. Ver. theoret. und angrew Limnol. 1975. Bd. 19.(2). P.952-956.

194. Velick S., Gorin M. The electrical conductance of ellipsoids and its relation to the study of avian eritrocytes // J. Gen. Physiol. 1940. V. 23. P. 753-771.

195. Venediktov P.S., Krivosheeva A.A. The mechanism of fatty acid inhibition of electron transport in chloroplasts // Planta. 1983. V. 159. N 3. P. 411-418.

196. Vermaas W. Molecular-biological approaches to analyze photosystem II structure and function // Annu. Rev. Plant physiol. Plant Mol. Biol. 1993. V. 44. P. 457-481.

197. Vincent W. F. Fluorescence properties of the freshwater phytoplankton: Three algal classes compared. 1983. // Br. Phycol. J. V. 18. P. 5-21.

198. Watt W.D., Fogg Y.E. The kinetics of extracellular glicollate production by Chlorella pyrenoidosa // J. Exp. Bot. 1966. 17. 117-134.

199. Whatley W.G., Dauwalder M., Kephart J.E. Golgi apparatus: Influence on cell surfaces // Science. 1972. N.Y. V. 175. P. 596-599.

200. Wiebe W.J., Smith D.F. C14-Labeling of the compounds excreted by phytoplankton for employment as a realistic tracer in secondary productiviti measurements // Microb.Ecol. 1977. N l.P. 1-8.

201. Wilhelm C. The biochemistry and physiology of light-harvesting processes in chlorophyll b and chlorophyll c containing algae // Plant. Physiol. Biochem. 1990. V. 28 (2). P. 293-306.

202. Witt H.T. Functional mechanism of water splitting photosynthesis // Photosynth. Res. 1991. V. 29. P. 55-77.

203. Wood B.J.B. Fatty acids and saponifiable lipids // Algal physiol. and biochemistry. 1974. Oxford: Blackwell Sci. Publ. V. 10. P. 236-265.

Информация о работе

Чалаева, Салимат Алиловна
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.18

Диссертация

Физиологическое состояние культур зеленых микроводорослей и накопление внеклеточных органических веществ - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы