Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиологические и популяционные основы практического применения целлюлолитических бактерий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Физиологические и популяционные основы практического применения целлюлолитических бактерий"

УДК 576 8; 579.6 631

На правах рукописи

003 16432Б

СМИРНОВА ИРИНА ЭЛЬЕВНА

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И ПОПУЛЯЦИОННЫЕ ОСНОВЫ ПРАКТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Республика Казахстан Алматы 2000

Работа выполнена в Институте микробиологии и вирусологии Министерства образования и науки Республики Казахстан

Научный консультант

доктор биологических наук, профессор Саубенова М. Г.

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Гаврилова Н. Н. доктор биологических наук Мамилов Ш. 3. доктор биологических наук, академик МАН и ВШ и КазАСХН, профессор Кулдыбаев М. М.

Ведущая организация

Казахский Государственный Аграрный Университет

Защита состоится 30 ноября 2000 г в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 53 24 01 при Институте микробиологии и вирусологии МОиН РК по адресу 480100, г Алматы, ул Богенбай батыра, 103

С диссертацией можно ознакомиться микробиологии и вирусологии МОиН РК

в библиотеке Института

Автореферат разослан 28 октября 2000 г

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

ДжусуповаА Б

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Целлюлоза является главной составной частью растительного покрова Земли Синтез ее по своим масштабам превосходит синтез всех других природных соединений, что обуславливает важную роль разлагающих ее микроорганизмов в процессах минерализации и в круговороте углерода Микробиологическая конверсия возобновляемых ресурсов биосферы в различные полезные продукты в настоящее время представляет собой одну из важнейших проблем, чем и определяется неослабевающий интерес к целлюлозоразрушающим микроорганизмам Основная проблема, связанная с утилизацией лигноцеллюлозных отходов, состоит в том, что целлюлоза очень устойчива к различным воздействиям Поэтому ежегодно в различных лабораториях мира исследуются штаммы микроорганизмов с целью изыскания новых, с более высоким уровнем биосинтеза целлюлаз, а также разрабатываются биотехнологические способы использования целлюлозы и, в первую очередь, целлюлозосодержащих отходов растениеводства

Институтом микробиологии и вирусологии МОиН РК внедрен способ получения кормовых продуктов для животноводства из отходов растениеводства Способ предусматривает использование целлюлозоразлагающих бактерий, создающих в ферментируемой массе необходимый сахарный минимум и, вследствие этого, благоприятные условия для развития молочнокислых бактерий и накопления молочной кислоты, что способствует получению корма с 80 - 100%-ной поедаемостью и хорошей сохранностью.

Для создания генофонда взаимозаменяемых организмов продуцентов целлюлаз, отличающихся высоким уровнем практически ценных показателей, была создана коллекция целлюлолитических бактерий, а также изучены бактерии-спутники, в том числе обеспечивающие их азотом за счет его фиксации из атмосферы (Смирнова, 1992) Изучение физиолого-биохимических свойств целлюлолитических бактерий показало способность отдельных представителей этой группы микроорганизмов обогащать среду биологически активными веществами, что может быть положено в основу разработки способов повышения качества получаемых с их участием кормовых продуктов

В настоящее время не подлежит сомнению большая перспективность применения смешанных культур микроорганизмов как природных ассоциаций, так и созданных экспериментатором и сочетающих производственно полезные качества отдельных штаммов Поэтому для более глубокой конверсии различных отходов агропромышленного комплекса, представляющих собой сложные субстраты, необходимо изыскание природных микробных ассоциаций, а также создание смешанных культур, отвечающих этим требованиям

Поскольку целлюлолитические бактерии являются важным звеном в круговороте углерода в природе и существенной частью экосистемы, представляется перспективным исследование возможности их применения в других отраслях биотехнологии

Цель и задача исследований

Целью настоящей работы является разработка научных основ практического применения целлюлолитических бактерий

■ повышение питательной и биологической ценности кормовых продуктов, получаемых путем микробной трансформации возобновляемого сырья путем использования новых штаммов-продуцентов протеина и других биологически активных веществ,

■ более глубокая конверсия отходов растениеводства путем использования природных ассоциаций целлюлолитических бактерий и экспериментально созданных смешанных культур бактерий с более высокой физиоло-го-биохимической активностью,

■ разработка новых способов использования целлюлолитических бактерий в различных областях биотехнологии, в частности, агробиологии и почвоведении.

В задачу исследований входило

1 Поиск новых штаммов бактерий продуцентов целлюлолитических ферментов, биологически активных веществ, а также штаммов, обладающих способностью к фиксации азота атмосферы при росте на целлюлозе и исследование возможности использования их для биоконверсии отходов агропромышленного комплекса в кормовые продукты с повышенной питательностью и биологической ценностью

2 Повышение эффективности процессов биоконверсии различных субстратов путем использования природных ассоциаций и смешанных культур микроорганизмов

3 Поиск новых штаммов целлюлолитических бактерий для использования в агробиологии, а именно для биологической стимуляции всхожести семян и роста растений, а также новых штаммов бактерий для использования в мелиоративно - удобрительных цепях в рисосеянии

4 Разработка новых способов использования целлюлолитических бактерий в различных областях биотехнологии, в частности, агробиологии и почвоведении.

5 Исследование физиолого-биохимических особенностей новых перспективных штаммов целлюлолитических бактерий и их природных ассоциаций с целью управления их ферментативной активностью и продуктивностью

Научная новизна

Выделены и изучены новые штаммы целлюлолитических бактерий рода Вайепит, ВасШив, ВгелаЬайепит и ШауоЬайепит, в том числе способные к фиксации молекулярного азота агморферы и синтезу биологически активных веществ, в частности, Р-каротина

Впервые показана возможность получения кормового продукта для животноводства с повышенными показателями питательности и биологической ценности за счет использования новых штаммов

Показана возможность повышения эффективности переработки лигно-целтолозных субстратов путем использования природных микробных ассоциаций и применения смешанных культур микроорганизмов с предварительной адаптацией их друг к другу на уровне метаболитов и последующей автоселекцией ассоциаций в условиях полунепрерывного культивирования Впервые показана возможность применения целлюлолитических бактерий для повышения, всхожести семян, стимуляции роста и развития растений сельскохозяйственных растений

Впервые показано, что целлюлолитические бактерии, способные к фиксации молекулярного азота атмосферы, могут быть использованы в мелио-ративно-удобрительных целях в рисосеянии для повышения урожая Практическая иенность работы

Использование отселекционированных целлюлолитических бактерий для биоконверсии целлюлозосодержащих отходов растениеводства (пшеничная, рисовая солома, стебли, листья, стержни кукурузы) позволяет получать кормовые продукты с повышенными показателями поедаемости, переваримости и питательности

Разработан способ повышения питательности целлюлозосодержащих отходов растениеводства методом твердофазной ферментации за счет использования целлюлолитических азотфиксирующих бактерий, синтезирующих протеин и биологически активные вещества (витамины группы В и свободные аминокислоты) (Патент Республики Казахстан №4028,1993)

Разработан способ обогащения кормовых продуктов ^-каротином путем твердофазной ферментации отходов растениеводства целлюлолитиче-скими каротинсинтезирующими бактериями (Предварительный патент Республики Казахстан №9314,2000)

Разработан способ использования целлюлолитических бактерий для биологической стимуляции всхожести семян и роста растений агротехнических культур (Патент Республики Казахстан №4900, 1993, Предварительный патент Республики Казахстан №8751,2000)

Разработан способ применения целлюлолитических бактерий в мелио-ративно-удобрительных целях на засоленных почвах под культуру риса (Авторское свидетельство СССР №1740358,1992)

На опытно - промышленной установке Института микробиологии и вирусологии Министерства Образования и Науки Республики Казахстан наработан препарат целлюлолитических каротинсинтезирующих бактерий в виде сухой закваски, который был передан для производственного испытания в Оренбургский Государственный Аграрный Университет Получены результаты о положительном эффекте применения данных целлюлолитических бактерий

Положения, выносимые на защиту

1 Физиолого-биохимические свойства нввых штаммов факультативно-анаэробных ацидотолерантных целлкшмщгических бактерий позволяют использовать их для конверсии различных отходов растениеводства в кормовой продукт с повышенной питательностью и биологической ценностью

2 Использование природных ассоциаций целлюлолитических бактерий и их смешанных культур с молочнокислыми бактериями и дрожжами интенсифицирует процессы биоконверсии различных субстратов в кормовые продукты,, предварительная адаптация микробных ассоциантов друг к другу на уровне метаболитов и последующая автоселекция адаптированных клеток в условиях полунепрерывного культивирования повышает их продуктивность

3 Целлюлолитические бактерии в силу своих биохимических особенностей, а именно сцособности к синтезу гидролаз и биологически активных веществ, являются стимуляторами всхожести семян и роста растений

4 Процессы биодеградации целлюлозы в почве под воздействием внесенных извне целлюлолитических бактерий способствуют благоприятному мелиоративно-удобрительному эффекту при развитии культуры риса Применение новых штаммов целлюлолитических азотфиксирующих бактерий значительно усиливает положительный эффект за счет снабжения растений легкоусваиваемыми формами азота

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на 10-м Международном конгрессе по азотфиксации «Nitrogen fixation fundamentals and applications» (St. Peterburg - Dordrecht, 1995), на съезде микробиологов Узбекистана (Ташкент, 1997), на Международной конференции по проблемам современной микробиологии и биотехнологии (Алматы, 2000), на Международной научно-практической конференции «Спонсируемые биотехнологические разработки и проблемы нераспространения» (Алматы, 2000); на 2-й Международной конференции «Agroeconomics of camelid fanning» (Almaty, 2000)

В завершенном виде работа доложена на заседании секции физиологии микроорганизмов Института микробиологии и вирусологии МОиН PK

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 34 научные работы, получены одно авторское свидетельство СССР, два патента PK и два предварительных патента PK

Структура и объем диссертаиии

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, раздела, включающего описания объектов исследования и методики работ, 4 разделов, содержащих результаты экспериментальных исследований автора, заключения, выводов, списка литературы (463 названия работ) и 5 приложений Материалы диссертации изложены на 296 страницах текста, содержит 64 таблицы и 71 рисунок

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследований

В работе использовали целлюлолитические, молочнокислые бактерии и дрожжи

Целлюлолитические бактерии Bacillus cytaseus 21, Bacillus ohgonitro-philus 128, Brevibactenum erythra 38, Brevibactenum opacum 103, Cellulo-monas biazotea 150, Cellulomonas effusa 60, Flavobactenum aurantiacum 81/3, Pseudomonas fluorescens 56 - выделены автором Отсутствие патогенности и токсичности штаммов целлюлолитических бактерий установлено в Институте питания МОиН PK Штаммы В cytaseus 21, С biazotea 150, С effusa 60 депонированы в Государственную коллекцию промышленных штаммов РНИИ «Генетика» и входят в каталог промышленных пггаммов Российской Федерации, остальные депонированы в коллекцию Института микробиологии и вирусологии МОиН PK

Молочнокислые бактерии Lactobactenum pentoaceöcum В(б)-23 и дрожжи Tnchosporon cutaneum получены из коллекции лаборатории физиологии и селекции микроорганизмов Института микробиологии и вирусологии МОиН PK

Дрожжи Candida tropicalis С-3, Endomycopsis fibuligera С-4 любезно предоставлены сотрудниками МТИИТПП (проф Кантаре В М), Endomycopsis fibuligera 26-14 - сотрудниками Института микробиологии АН Латвии (проф Лука ВТ)

Выделение целлюлолитических бактерий проводили из различных природных источников в Алматинской области (разлагающейся древесины хвойных и лиственных пород, гниющего опада, кишечных трактов и экскрементов насекомых, разрушающих древесину, почвы, силосов хорошего качества, ризосферы корней растений) путем высева на агаризованную среду Гетчинсона с фильтровальной бумагой или натриевой солью карбок-симетилцеллюлозы (Na-КМЦ) Освобождение от сопутствующей микрофлоры проводили методом повторных пересевов на среду с целлюлозой в качестве единственного источника углерода

Для изучения систематического положения целлюлолитических бактерий и сопутствующих им микроорганизмов готовили препараты для мик-роскопирования, которые окрашивали метиленовой синью по Леффлеру, фуксином Пфейфера Одновременно определяли размеры клеток, образование спор, цист, жгутиков, окраску по Граму В живых препаратах определяли подвижность и характер движения. Ультраструктуру целлюлолитических бактерий и характер их жгутикования изучали на электронном микроскопе марки BS-2500 (Чехия)

Для характеристики физиолого - биохимических признаков целлюлолитических бактерий изучали их способность разжижать желатину, гидроли-зовать крахмал, восстанавливать нитраты до нитритов, разрушать агар, об-

разовывать индол, сероводород, катапазу, расти на безазотистых средах и усваивать различные источники углерода и азота Источники углерода добавляли к среде Гетчинсона в количестве 1 %

Для идентификации и описания бактерий использовали определители Берги (Bergey, 1976) и Н А Красильникова (1958)

Целлюлолитические бактерии культивировали на среде Гетчинсона, соломенном и крахмальном агаре, МПА, азотфиксирующие - на модифицированной безазотистой среде Берка

Устойчивость к антибиотикам определяли методом стандартных индикаторных дисков (Ведьмина и др, 1979)

Антимикробный спекгр действия целлюлолитических бактерий определяли методом агаровых блоков с применением стандартных тест-организмов, включающих грамположительные, грамотрицательные бактерии, дрожжевые организмы и плесневые грибы (Егоров, 1980)

Витамины определяли микробиологическими методами, основанными на учете интенсивности роста витаминзависимых культур микроорганизмов вокруг агаровых блоков испытуемых штаммов или по мутности суспензии этих культур с помощью фотоэлектроколориметра (Одинцова, 1957, Толысбаев, Бисенбаев, 1976)

Качественный состав каротиноидов определяли по методу JI С Вечер и А Н Куликовой (1967), а также по методу Н А Лукашик и В А Тащи-лина (1968).

Для количественного определения p-каротина и ликопина использовали спектрофотометрический метод Терешина В М, Меморской А С, ФеофиловойЕ П (1994)

Качественный и количественный анализ свободных аминокислот проводили на аминокислотном анализаторе марки ААА-339 (Чехия) после соответствующей подготовки пробы, включающей очистку культуральной жидкости бактерий от белковых фракций, Сахаров, органических кислот и неорганических ионов (Zumwalt et al, 1970)

Нитрогеназную активность культур определяли по реакции восстановления ацетилена до этилена методом газовой хроматографии (Умаров, 1986)

Определение общего азота проводили методом Къельдаля Продуктивность азотфиксации определяли путем пересчета количества фиксированного азота на 1 г утилизированного субстрата (солома, вата, фильтровальная бумага, Na-КМЦ) Сырой протеин - путем пересчета на соответствующий коэффициент Белок определяли по Лоури

О целлюлазной активности судили по степени гидролиза фильтровальной бумаги и по диаметру зон гидролиза твердой среды с 0,1% Na-КМЦ после ее окрашивания раствором конго-рот (Рабинович и др , 1988) Для количественной оценки использовали метод, основанный на определении восстанавливающих Сахаров, образующихся при действии ферментов цел-

люлазного комплекса на целлюлозосодержащий субстрат (Исмаилова и др, 1975)

Редуцирующие сахара определяли модифицированным методом Шо-моди-Нельсона (Синицин и др , 1990), а также феррицианидным методом при длине волны 490 нм (Chloset et al, 1987) За единицу активности принимали такое количество фермента, которое образует 1 мкмоль редуцирующих Сахаров за 1 мин при действии на субстрат и выражали в ед/мл илиед/г

Общую целлюлолитическую активность определяли методом Ман-дельс-Вебера по гидролизу фильтровальной бумаги Ватман №1 (полоска размером 1x6 см), объем смеси 1,5 мл Гидролиз вели 30 мин при 45°С и pH 4,5 в 0,05М натрий-цитратном буфере (Mandéis, Weber, 1969)

Субстратом для тестирования эндо-1,4-р-глюканазы (КМЦ-аза) служил 1% раствор Na-КМЦ («Serva», Германия) в 0,05М натрий-цитратном буфере Рн 4,5 К 0,5 мл субстрата добавляли 0,5 мл разведенной культуральной жидкости или бесклеточного экстракта и инкубировали 30 мин при 45°С

В качестве субстрата при определении активности целлобиогидролазы использовали обезвощенное хлопковое волокно Реакционная смесь состояла из 50 мг хлопка, 1 мл 0,05М натрий-цитратного буфера, pH 4,5 и 1 мл культуральной жидкости или бесклеточного экстракта, время инкубации - 24 часа

Для определения активности ß-глюкозидазы (целлобиаза) готовили 0,05% раствор целлобиозы («Serva», Германия) в 0,05М натрий-цитратном буфере, pH 5,5. К 0,75 мл субстрата приливали 0,25 мл разведенной культуральной жидкости или бесклеточного экстракта и инкубировали при 45°С в течение 30 мин.

Кинетические характеристики роста микроорганизмов получали при периодическом и полунепрерывном культивировании Периодическое и полунепрерывное культивирование осуществляли на качалках (180 - 200 об/мин) в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 - 200 мл среды При полунепрерывном культивировании проводили замену 9/10 объема культуральной жидкости свежей питательной средой через 18, 20, 24 часов в зависимости от варианта опыта

Биомассу микроорганизмов контролировали нефелометрически на ФЭКе 56М и выражали в единицах оптической плотности (отн ед ОП), или пересчитывали по калибровочной кривой на вес сухой биомассы в 100 мл среды (г/100 мл) и весовым методом после высушивания навески до абсолютно сухого веса О росте судили также по результатам подсчета числа клеток после разведения суспензии микроорганизмов под микроскопом в камере Горяева-Тома и путем подсчета колоний после высева на твердые агаризованные среды

Для изучения удельной скорости роста (йшах) микроорганизмов использовали метод острых опытов (Иерусалимский, Неронова,1965, Сахарова, 1970)

Твердофазную ферментацию отходов растениеводства (пшеничная, рисовая солома, сухие стебли, листья и стержни кукурузы) с использованием целлюлолитических бактерий проводили следующим образом

Культуру целлюлолитических бактерий размножали в жидкой питательной среде в течение 2-х суток при температуре 28 - 30°С Измельченное сырье смачивали водой до конечной влажности 60 - 65% и смешивали с суспензией целлюлолитических бактерий (1х109 клеток в 1 мл) из расчета 10 мл суспензии на 0,7 кг сырья Массу тщательно утрамбовывали, герметично укупоривали и хранили в течение 30 суток и более (Лукашик, Тащи-лин, 1968) О степени деструкции целлюлозы в грубых кормах в процессе биоконверсии судили по изменению содержания целлюлозы (клетчатки), гидролизуемой 80%-ной серной кислотой, и легкогидролизуемых полисахаридов (гемицеллюлоз), гидролизуемых 2%-ной соляной кислотой (Шарков, Куйбина, 1972; Шарков, 1976)

Редуцирующие вещества в силосной вытяжке определяли по методу Бертрана (Дроздов, Матеранская, 1970)

Величину рН замеряли на электронном иономере И-130 Микробиологический анализ силоса проводили путем подсчета численности различных физиологических групп микроорганизмов на специфических средах

Для выявления способности к формированию колоний вторичного роста целлюлолитических бактерий культуры выращивали на элективной среде Гетчинсона с 0,1% глюкозы и на МПА Среды готовили с низким содержанием агара (15 г/л) во избежание пересыхания слоя питательной среды при длительном культивировании С этой же целью разлив среды по чашкам осуществляли более толстым слоем (около 1 см), чем это принято при непродолжительном культивировании микроорганизмов Культуры выдерживали в термостате при 30°С в течение 3-4 недель При периодических просмотрах учитывали сроки появления, частоту образования вторичных колоний, тип, размер и характер распределения на первичных колониях Для просмотра использовали стереоскопический микроскоп MST131 (увеличение 6,3x4)

Способность штаммов целлюлолитических бактерий вырабатывать биологически активные вещества определяли по методу, описанному Н А Красильнюсовым (1966) и Ю М Возняковской (1972) Метод основан на учете ростового эффекта после замачивания семян высших растений в исследуемых растворах стимулирующих или йнгибирующих веществ

Активность различных штаммов целлюлолитических бактерий проверялась при инокуляции семян растений по методу Wacek, Brill (Burns, Slater, 1982) Семена растений погружали на несколько секунд в 70% эта-

нол, переносили в 0,01% раствор HCl, затем многократно промывали стерильной дистиллированной водой и инокулировали суспензией целлюло-литических бактерий (lxlO7 - lxlO8 клеток/мл) Контролем служили семена без инокулята После двухнедельной инкубации замеряли высоту проростков, длину и число корней, вес зеленой массы и корней, сравнивая эти показатели с контрольными вариантами

Полученные цифровые материалы подвергали статистической обработке (Рокицкий, 1967, Удольская, 1976)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Целлюлолитические азотфиксирующие бактерии и применение их для биоконверсии целлюлозосодержащих субстратов

При анализе кормовых продуктов, полученных путем твердофазной ферментации отходов растениеводства, в ряде случаев было отмечено увеличение в них количества протеина (Саубенова, 1991). Процесс твердофазной ферментации проводится по типу силосования в условиях предотвращения доступа кислорода воздуха и поэтому нарастание биомассы бактерий в нем весьма незначительно Было показано, что дополнительно определяемые азотсодержащие компоненты (протеин, аминокислоты) являются продуктами жизнедеятельности азотфиксирующих представителей спонтанной микрофлоры, а именно бактерий-спутников (Смирнова, 1992).

Поскольку способность фиксировать молекулярный азот атмосферы широко распространена среди представителей микрофлоры почвы, а микробиологическая промышленность традиционно предпочитает работать с монокультурами, представлялся перспективным скрининг азотфиксаторов среди целлюлолитических бактерий, обладающих набором признаков, позволяющих использование их для твердофазной ферментации грубых кормов

Из природных источников было выделено и отселекционировано 128 чистых кулыур целлюлолитических азотфиксирующих бактерий, преимущественно относящихся к родам Bacillus, Bactenum и Pseudomonas, которые дополнили ранее созданную лабораторную коллекцию целлюлолитических бактерий

Из них отобраны три наиболее активных факультативно-анаэробных штамма В. cytaseus 21, В ohgomtrophilus 128 и Ps fluorescens 56, характеризующихся следующими свойствами высокой скоростью синтеза микробной массы при росте на среде с целлюлозой в отсутствии источника азота, способностью к росту при низких значениях pH среды, комплексом целлю-лаз с высокой активностью, термостабильностью и прочной адсорбцией на целлюлозе

Целлюлолитические азотфиксирующие бактерии - слабо изученная группа микроорганизмов Поскольку они являются перспективными для

использования в кормопроизводстве, представлялось актуальным изучение их физиолого-биохимических особенностей

Влияние условий культивирования на раст и ферментативную активность целлюлолитических и азотфиксирушцих бактерий Для исследования влияния температуры культивирования и значений pH среды на удельную скорость роста целлюлолитических азотфиксирующих бактерий культуры выращивали на среде Гетчинсона, источником азота служил нитрат натрия Максимальную скорость роста штаммов рода Bazillus (В. cytaseus 21, В oligomtrophilus 128) наблюдали при температуре 30-32°С (iw= 0,449±0,002 ч! и цгаах = 0,412+0,001 ч1 соответственно), у штамма Ps fluorescens 56 максимальную скорость роста отмечали при более высокой температуре - 32-34°С (цтах = 0,381±0,001 ч"1 ) При температуре 43°С и выше бактерии рода Bacillus не росли Температурный предел Ps fluorescens 56 несколько ниже - 40°С При понижении температуры культивирования ниже 25°С скорость роста культур заметно снижается

Исследование зависимости скорости роста бактерий от значения pH среды культивирования показало, что все три штамма растут при pH не выше 8,5 Оптимальное значение pH среды для штаммов рода Bacillus около 7,0 Максимальную скорость роста у штамма В cytaseus 21 наблюдали при pH 6,6-7,2, у штамма В oligomtrophilus 128 - 6,5-7,5, для Ps fluorescens 56 оптимум значения pH среды ниже 6,5, а максимальная скорость роста наблюдалась при pH 6,0-6,7 Скорость роста исследуемых культур значительно снижается при pH выше 8,0 При уменьшении значений pH среды ниже 6,0 для штаммов рода Bacillus и ниже 5,5 для Ps fluorescens 56 скорость их роста снижается

Исследование влияния температуры и значений pH среды на рост и активность ферментов (общая активность целлюлазного комплекса бактерий и нитрогеназы) показало, что наибольшую активность целлюлаз проявляют клетки, растущие при температуре культивирования в пределах 25-40°С, максимальную активность отмечали при 40°С Наибольшую нитрогеназ-ную активность отмечали при температурах 25-35°С с пиком активности для Ps fluorescens 56 при 30°С, а бациллярных штаммов - при 35°С

Исследование влияния pH среды на активность целлюлазного комплекса и нитрогеназы показало, что наибольшая нитрогеназная активность клеток всех исследуемых штаммов проявляется в диапазоне значений pH среды от 6,5 до 7,5 с максимумом для обоих штаммов рода Bacillus при pH 7,0, а для штамма Ps. fluorescens 56 - при pH 6,5 С увеличением pH среды выше 7,5 нитрогеназная активность штаммов снижается и при pH 8,0 составляет около 30% от максимального значения Оптимальный предел значений pH среды для целлюлазного комплекса исследуемых бактерий обнаружен при pH 6,0-7,5 с оптимумом для штамма В cytaseus 21 при pH 6,5, для штаммов В oligomtrophilus 128 и Ps fluorescens 56 - при pH 7,0 Увели-

чение значения рН среды выше 7,0 приводит к заметному падению активности целлюлаз Снижение значения рН среды ниже 6,0 не приводит к резкому уменьшению активности Так, для штамма В су1азеш 21 при рН среды 5,0 и ниже сохраняется 60% активности целлюлазного комплекса бактерий, что крайне важно при практическом использовании штамма

Исследование целлюлазного комплекса азотфиксирующих бактерий

Для исследования качественного и количественного состава целлюлаз штамм В су1азеш 21 выращивали на средах как с чистой целлюлозой, в качестве которой использовали Ыа-КМЦ и фильтровальную бумагу, очищенную от сопутствующих гемицеллюлоз и ксиланов, так и с природной целлюлозой (пшеничная солома, кукурузная солома, пшеничные отруби, свекловичный жом, вата) Показано, что целлюлазный комплекс В су1а8еш 21 состоит из трех ферментов эндо-1,4-Р-глюканазы (К Ф. 3 2 1 4), целло-биогидролазы (К Ф 3 2 1 91) и р-глюкозидазы (К Ф 3 2 1 21)

При исследовании влияния источника углерода и энергии на активность внеклеточных целлюлаз выявлено, что природная целлюлоза стимулирует активность всех ферментов целлюлазного комплекса На средах с ]Яа-КМЦ и очищенной целлюлозой активность целлюлаз была более чем в два раза ниже Полученные данные позволяют заключить, что активность ферментов целлюлазного комплекса зависит от источника гидролизуемой целлюлозы

Поскольку многие микроорганизмы продуцируют как внеклеточные, так и связанные с клетками ферменты, следовало определить активность внеклеточных и суммарную активность внутри- и внеклеточных целлюлаз после разрушения клеток

Как показали исследования, все три типа ферментов целлюлазного комплекса секретируются В с^авеш 21 в культуральную среду, но в среднем до 46% - эндо-1,4-Р-глюканазы, около 50% - целлобиогидролазы и до 47%- р-глюкозидазы находятся в связанном с клетками состоянии.

В свете полученных данных общую схему ферментативного гидролиза целлюлозы штаммом В с^аБеш 21 можно представить в следующем виде

эндоглюканаза и целлобиогидролаза

эНдоглюканаза целлобиогидролаза

Р-глюкозидаза

3-> gn-» g1-> g> где

в - исходный субстрат,

gn - целлоолигосахариды (продукты статистического гидролиза целлюлозы),

gl - целлобиоза, g - глюкоза

В зависимости от физического состояния исходного субстрата целло-олигосахариды могут представлять собой частично деструктуирован-ную нерастворимую целлюлозу с более низкой степенью полимеризации по сравнению с исходным субстратом или набор целлодектринов - растворимых производных целлюлозы, например, таких как карбоксиметилцел-люлоза Далее на целлоолигосахариды воздействует фермент целлобио-гидролаза, который в конечном итоге образует целлобиозу В свою очередь дисахарид целлобиоза под действием р-О-глюкозидглюкогидрола-зы (Р-глюкозидазы) расщепляется до глюкозы Очень часто процесс расщепления идет не до конца и накапливающиеся дексприноподобные продукты способствуют повышению переваримости грубых кормов

Ассимиляция атмосферного и нитратного азота целлюлолитическими бактериями при их выращивании на отходах растениеводства

Процесс фиксации молекулярного азота атмосферы целлюлолитическими бактериями при росте на природных источниках целлюлозы практически не изучен Представлялось актуальным исследование ассимиляции молекулярного азота целлюлолитическими бактериями при их развитии на отходах растениеводства, а также сравнение данного процесса с ассимиляцией других форм азота на этих же субстратах

Культуру В с^аБеш 21 выращивали на среде с пшеничной соломой без азота и с нитратной формой азота (рисунок 1)

Исследование количественного содержания азота в клетках в ходе развития культур показало, что у культуры, использующей молекулярный азот атмосферы, в течение всей лаг-фазы уровень содержания общего азота в клетке остается постоянным Это свидетельствует о том, что в этот период развития культуры азотфиксация не происходит В то же время азот белка несколько убывает Отсутствие азотфиксации и снижение содержания белкового азота дает возможность предположить, что азот белка расходуется на метаболические процессы, протекающие внутри клетки У культуры, выращиваемой на нитратной форме азота, количество общего азота в течение лаг-фазы увеличивается Однако, отмечено, что в первые 34 часа после засева ассимиляция азота крайне низкая После этого периода бактерии начинают усваивать азот среды, расходуя его на синтез белка

Автоселекция целлюлолитических азотфиксирующих бактерий в условиях полунепрерывного культивирования

В целях повышения уровня накопления биомассы и ферментативной активности целлюлолитических бактерий В о^веш 21 провели автоселекцию в условиях полунепрерывного культивирования на безазотистой среде оптимизированного состава в течение 26 суток

Отселекционированную культуру бактерий сравнивали с исходной по накоплению биомассы в периодических условиях культивирования На рисунке 2 видно, что исходная культура бактерий переходит в стационарную фазу роста после 22 часов культивирования, биомасса при этом составляет 0,45 ед ОП Отселекционированная культура переходит в фазу стационарного роста после 30 часов культивирования, при этом плотность популяции в 1,3 раза превышает таковую у исходной культуры и составляет 0,6 ед ОП

При сравнительном исследовании ферментативной активности отсе-лекционированной культуры и исходной установлено, что нитрогеназная активность возросла в 2 раза по сравнению с таковой у исходной культуры, а активность целлюлазного комплекса в 3 раза превысила активность исходной культуры

Твердофазная ферментация отходов растениеводства с

использованием целлюлолитических азотфиксирующих бактерий Способ твердофазной ферментации целлюлозосодержащего сырья по типу силосования предусматривает использование целлюлолитических бактерий, создающих в ферментируемой массе необходимый сахарный минимум и вследствие этого благоприятные условия для развития молочнокислых бактерий и накопления молочной кислоты, что способствует получению корма с хорошей поедаемостыо и сохранностью Однако, биологическая ценность корма в этом случае остается на невысоком уровне, так как развитие целлюлолитических бактерий сопровождается переводом одной формы азота в другую Для усовершенствования способа применяли вновь выделенные и отселекционированные бактерии, которые наряду с синтезом целлюлолитических ферментов обладают способностью фиксировать азот атмосферы и повышать питательность кормового продукта за счет его обогащения протеином Исходным сырьем для приготовления кормового продукта служили пшеничная и рисовая солома, сухие стебли, листья и стержни кукурузы

В таблице 1 приведен сравнительный анализ пшеничной соломы, ферментированной с использованием разных штаммов целлюлолитических азотфиксирующих бактерий, проведенный через 30 суток после закладки опыта Закваску вносили в количестве 10 мл бактериальной суспензии (1x109 клеток/мл) на 0,7 кг сырья В качестве контроля использовали штамм В асккюаИатк 17, внедренный в кормопроизводство

Все образцы ферментированной соломы характеризуются высокими биохимическими и органолептическими показателями, оптимальной кислотностью и размягченной структурой. Отмечено, что во всех вариантах с целлюлолитическими азотфиксирующими бактериями содержание общего азота в ферментированной соломе повышалось в 1,8-2,0 раза по сравнению

Рост целлюлолитических бактерий В с^Беив 21 на нитратной и атмосферной формах азота

Рост исходной и отселекционированной культуры В с^аэеиБ 21 при периодическом культивировании

0,7-,

Ось абсцисс - время, ч,

ось ординат - количество клеток,

млрд/мл

Обозначение кривых 1 - нитратная форма азота, 2 - атмосферный азот

Ось абсцисс - время, ч,

ось ординат - оптическая плотность,

ед

Обозначения кривых 1 - исходная культура, 2 - отселекционированная культура

Рисунок 1

Рисунок 2

с контролем Применение В с^авеив 21/2 способствует большему накоплению молочной кислоты, наиболее полной биодеструкции целлюлозы и гемицеллюлозы Так, при использовании штамма В с^авеш 21/2 утилизация целлюлозы возросла на 17%, а гемицеллюлозы - на 20% по сравнению с контролем Содержание общего азота возросло в 2 раза, а количество сырого протеина увеличилась до 3,75%

При микробиологическом анализе ферментированной соломы во всех вариантах опыта отмечалось заметное увеличение количества молочнокислых бактерий и уменьшение содержания протеолитической и маслянокис-лой микрофлоры, что свидетельствует о правильной направленности процесса ферментации

При ферментации рисовой соломы с исследуемыми штаммами целлюлолитических азотфиксирующих бактерий получены кормовые продукты, характеризующиеся высокими биохимическими и органолепгическими показателями Лучшим был вариант опыта с использованием В сугазеиэ 21/2,

Таблица 1

Биохимические и органолептические показатели

ферментированной пшеничной соломы

Штамм

Показатели Контроль В су1азеш В 011£0Ш|Г0- Ре АиогексепБ

21/2 рЫ1ш 128 56

рН 4,7±0Д 4,4±0,1 4,6±0,1 4,5±0,1

Аммиак,% 0,01+0,001 0,01±0,001 0,01+0,001 0,01+0,001

Свободные

органические

кислоты (%)

молочная 0,78+0,03 0,93±0,02 0,90+0,02 0,87±0,02

уксусная 0,44±0,02 0,24+0,01 0,34±0,01 0,42±0,01

масляная 0,12+0,01 0,07+0,01 0,09±0,01 0,1+0,01

Связанные

органические

кислоты (%)

уксусная 0,48±0,01 0,68+0,02 0,64±0,01 0,66+0,02

масляная 0 0 0 0

Геми-

целлюлозы^ 23,9±1,3 19,2±1,0 20,2±1,2 22,4±1,3

Целлюлоза,% 29,4+1,4 24,4±1,3 26,4±1,3 27,6±1,4

Влажность, % 63,4±2,3 62,5±2,4 63,7±2,2 64,3±2,3

Редуцирующие

вещества, % 0,28+0,02 0,25±0,02 0,21+0,01 0,24+0,02

Азот, % от АСВ

общий 0,32±0,01 0,64±0,02 0,60±0,02 0,58±0,01

Сырой протеин,

% 2,01+0,1 3,75±0,2 3,62±0,2 2,98+0,1

Запах квашеных квашеных квашеных квашеных

овощей овощей овощей овощей

Структура значительно значительно значительно значительно

размягчена размягчена размягчена размягчена

Примечание - содержание целлюлозы в нативной пшеничной соломе - 42,3%

в котором содержание целлюлозы и гемицеллюлоз значительно ниже, чем у контроля Солома при этом характеризуется более размягченной структурой, уровень деградации целлюлозы на 21,0%, а гемицеллюлозы - на 17,8% превышал таковой в контроле. По сравнению с контролем заметно увеличилось содержание молочной кислоты при одновременном снижении масляной как свободной, так и связанной ее фракций Содержание общего азота возросло в 1,7 раза, а количество сырого протеина увеличилось с 4,0 до 6,9%

Применение целлюлолитических азотфиксирующих бактерий для твердофазной ферментации сухих отходов кукурузного сырья также дало по-

ложигельные результаты Содержание азота в вариантах опыта со штаммом В cytaseus 21/2 значительно превышало таковой у контроля Так, количество общего азота возросло в 1,5 -1,8 раз по сравнению с контролем, а уровень сырого протеина увеличился с 4,29 до 7,36%

При детальном исследовании данного штамма на предмет синтеза биологически активных веществ обнаружено, что штамм продуцирует витамины группы В (тиамин Вь пантотеновую кислоту никотиновую кислоту Рр и пиридоксин Вб) Кроме того, штамм В cytaseus 21/2 экскретирует свободные аминокислоты, такие как аспарагиновая кислота, глицин, метио-нин, лейцин, гистидин и аргинин

Штамм В cytaseus 21/2 антагонистически воздействует на гнилостные бактерии, такие как В subtilis, В mycoides, Е cob, а также на ряд бактерий, являющихся моделью возбудителей пневмонии (К pneumonia), стафилококкового сепсиса (Staph aureus), сибирской язвы (В anthracis), а также подавляет рост дрожжей Candida albicans Следует отметить, что данный штамм не угнетает развития молочнокислых бактерий Это обстоятельство представляет особый интерес, поскольку молочнокислые бактерии не только являются представителями полезной микрофлоры желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных, но наряду с целлюло-литическими бактериями могут быть использованы в процессе приготовления кормового продукта для животноводства Кроме того, штамм В су-taseus21/2 подавляет рост акгиномицетов и обладает выраженной способностью к фунгистазису

Применение новых штаммов бактерий, обладающих одновременной способностью деградировать целлюлозу и фиксировать молекулярный азот атмосферы для биоконверсии целлюлозосодержащих субстратов, позволяет получить кормовой продукт с повышенной биологической и питательной ценностью за счет обогащения его протеином, витаминами группы В и свободными аминокислотами, в том числе и незаменимыми

Использование целлюлолитических азотфиксирующих бактерий в

мелиоративно-удобрительных целях

В мелиоративно-удобрительных целях на затопляемых почвах под культуру риса предложено запахивание соломы, обработанной молочнокислыми бактериями (Нелидов, 1988) Было установлено, что эффективность этого приема значительно возрастает за счет ее инокуляции целлю-лолитическими бактериями, которую проводят одновременно с запашкой соломы (Нелидов, 1991, Смирнова, 1992) Результаты работы, проведенной совместно с Институтом почвоведения МОиН РК, показали, что использование целлюлолитических бактерий, способных к азотфиксации, приводит к повышению эффективности приема Кроме того, при применении штамма В cytaseus 21 обнаружен эффект его последействия на второй вегетационный год Применение данного штамма бактерий приводит к усилению минерализации почвенных растворов, что способствует увеличению

транзитного выноса токсичных солей и ионов из пахотного горизонта почвы Как следствие, создаются условия для рассоления почвы Обработка соломы деллюлолшическими азотфиксирующими бактериями также благоприятно сказывается на азотном режиме почвы В первый месяц затопления почвы по фону бактеризованной соломы на 10% увеличивается содержание легкогидролизуемого азота по сравнению с необработанной соломой Все это благоприятно сказывается на выживаемости проростков риса и на формировании урожая Так, в первый год применения соломы, ино-кулираванной целлюлолитическими азотфиксирующими бактериями, прибавка урожая, риса составила 36,0%, во второй вегетационный год - 28% по сравнению с запашкой нативной соломы

Целлюлолитические каротинсинтезирующие бактерии и возможность их применения в кормопроизводстве

При микробиологическом анализе готовой ферментированной соломы часто встречаются бактерии, характеризующиеся яркой красной или оранжевой окраской, свидетельствующей о возможном наличии каротина Этот вид корма используется, главным образом, в зимне-весенний период, когда из-за отсутствия зеленого корма в рационах сельскохозяйственных животных ощущается острый дефицит этого ценного биологически активного вещества Одной из задач работы было выделение целлюлолитических бактерий, обладающих не только способностью разлагать целлюлозу, но и накапливать каротин Выделение каротинсинтезирующих бактерий проводили из различных силосов и ферментированных отходов растениеводства хорошего качества Освобождали от сопутствующей микрофлоры путем повторных пересевов на среду с целлюлозой в качестве единственного источника углеродного питания Выделено 86 штаммов целлюлолитических каротинсинтезирующих бактерий, относящихся преимущественно к родам Вайепшп, ВгеуЛайепит и ИауоЬайепит Клетки бактерий имеют различную форму, в преобладающем большинстве палочковидную, разной величины, часто характеризуются полиморфизмом (с возрастом приобретают кокковидную или иную форму) и снеппинг-делением Подвижные неспороносные грамположительные клетки легко обесцвечиваются Морфология клеток сильно зависит от состава питательной среды, возраста культуры, температуры культивирования Большинство выделенных бактерий - факультативные анаэробы Хорошо растут при температуре от 16°С до 40°С и при нейтральном и кислом значениях рН Все культуры развиваются на минеральных средах, где в качестве единственного источника углерода использована целлюлоза (фильтровальная бумага, Иа-КМЦ, солома), синтезируют р-каротин

Для детального изучения были отобраны три штамма ацидотолерант-ных факультативных анаэробов, обладающих следующими свойствами

высокой скоростью синтеза микробной массы, высокой активностью синтеза ß-каротина, комплексом целлюлаз с высокой активностью, термостабильностью и прочной адгезией на целлюлозе

Два из них относятся к роду Brevibactenum (Brev орасшп 103KCS и Brev erythra 38KCS) и один - к роду Flavobactenum (F aurantiaciim 81/3KCS)

Практическое использование бактерий для получения кормовых продуктов способствует введению их в желудочно-кишечный тракт сельскохозяйственных животных Поэтому важно иметь представление о характере взаимоотношений их как с полезной, так и с патогенной микрофлорой Тест-культурами служили 17 организмов - модели гнилостных и болезнетворных бактерий, дрожжевые организмы, а также актиномицеты и грибы

Показано, что неллюлолитические каротинсинтезирующие бактерии обладают антимикробными свойствами, угнетая рост ряда бактерий и дрожжей Антагонистически действуют на гнилостные бактерии, такие как В mycoides, В subtilis, Е coli, а также на ряд бактерий, являющихся моделью возбудителей пневмонии, стафилококкового сепсиса, сибирской язвы и других заболеваний Антагонистического воздействия на молочнокислые бактерии не выявлено Два штамма бактерий (Brev. erytbra 38, F auran-tiaoum 81/3) обладают антагонистическим действием на дрожжи Candida albicans

Все исследуемые штаммы оказались устойчивыми к тетрациклину, пенициллину, олеандомицину и обладали повышенной чувствительностью к неомицину, стрептомицину и мономицину.

Исследование способности целлюлолитических каротинсинтезирую-щих штаммов к синтезу витаминов группы В и экскреции свободных аминокислот показало, что штаммы рода Brevibactenum (Brev орасшп 103 и JBrev erythra 38) продуцируют тиамин, пантотеновую и никотиновую кислоту Штамм F aurantiacum 81/3 продуцирует пантотеновую кислоту и биотин

Исследуемые штаммы способны экскретировать 15 свободных внеклеточных аминокислот в культуральную жидкость Причем некоторые из них относятся к незаменимым На среде с глюкозой все три штамма экскрети-руют 8 внеклеточных аминокислот Штаммы рода Brevibactenum - аспара-гиновую кислоту, глутаминовую кислоту, аланин, валин, изолейцин, лейцин, тирозин и аргинин Штамм F aurantiacum 81/3 - вместо тирозина и аргинина экскретирует метионин и гистидин При количественном анализе состава аминокислот обнаружено, что превалирующими являются аспара-гиновая кислота, глутаминовая кислота, аланин, лейцин и изолейцин, сумма которых составляет 65% от суммы всех аминокислот Отмечено, что качественный и количественный состав колеблется в зависимости от источника углерода

Изучение целлюлозной активности каротинсинтезирующих бактерий показало, что ее максимум приходится на стационарную фазу роста, то есть после 30 ч культивирования бактерий Максимум активности целлю-лаз проявляется при рН среды 6,0-6,5, однако при значениях рН 4,5 сохраняется до 70% активности целлюлаз у всех исследуемых штаммов Оптимальной температурой проявления наибольшей активности целлюлазного комплекса является 45-50°С для всех трех штаммов каротинсинтезирующих бактерий Дальнейшее повышение температуры приводит к падению активности всего целлюлазного комплекса При температуре 60°С она составляет 55%

Исследование внеклеточной целлюлазной активности в зависимости от источника углерода и азота показало, что наиболее высок этот показатель при выращивании на среде с пшеничной соломой

Лучшим источником азота для исследуемых штаммов является сернокислый аммоний, нитратная форма азота и пептон Максимум целлюлазной активности для обоих штаммов рода ВгехаЬайепшп получен на среде с сернокислым аммонием, у штамма Б аитаШасшп 31/3 - на нитратной форме азота При использовании органических источников азота - пептона и мочевины, активность целлюлазного комплекса была достаточно высокой Хлорид аммония оказывал на нее угнетающее действие

Исследование каротиногенеза целлюлолитических бактерий

При исследовании каротиноидов бактерий выявили, что два штамма рода Вге\аЬас1епиш синтезируют (3-каротин, а штамм Р ашшЬасит 81/3 -Р-каротин и в незначительных количествах - ликопин, являющийся одним из окрашенных предшественников Р-каротина При анализе пигментного состава культур помимо каротиноидов обнаружили их бесцветные предшественники, имеющие максимум поглощения в этиловом спирте при 220250 нм - фитоин и фитофлюин Отмечено, То) эти неокрашенные предшественники присутствуют независимо от возраста, состава среды и окраски бактерий

Исследование динамики накопления каротина показывает, что наиболее активно синтез протекает в интервале от 48 до 72 ч, то есть в конце стационарной фазы роста бактерий В конце экспоненциальной фазы роста наблюдается накопление бесцветных предшественников каротина Содержание же каротина в суточных культурах невелико. Штамм Б аигапйасшп 81/3 отличается от обоих штаммов рода ВгеуЛа&епит тем, что он синтезирует как р-каротин, так и ликопин Динамика накопления р-каротина аналогична такбвой у штаммов рода ВгеуЛайегшт, но содержание ликопи-на с возрастом культуры падает Так, в суточной культуре относительное содержание ликопина составляло 10-12%, к 48 ч культивирования только 6%, а к 72 ч - 2% Это подтверждает предположение о том, что ликопин является одним из предшественников в цепи биосинтеза Р-каротина

Исследование влияния широкого диапазона температур от 10°С до 50°С показало, что оптимум синтеза каротина у исследуемых культур совпадает с температурным оптимумом роста Хотя при 40°С интенсивность синтеза снижалась всего на 10-12%

Источники азота и углерода существенно влияют на синтез каротина целлюлолитическими бактериями

Наиболее активный синтез каротина у всех исследуемых штаммов отмечен на средах с пшеничной соломой В то же время синтез каротина был приблизительно таким же или чуть ниже на среде с глюкозой у штаммов рода ВгемЬа^епит и на среде с лактозой у штамма Р аигапЬасит (таблица 25) Наименьшее накопление каротина отмечали при росте на пентозах -ксилозе и арабинозе, на водорастворимой целлюлозе (КМЦ)

Наиболее благоприятным минеральным источником азота для биосинтеза каротина бактериями является аммонийный азот, несколько хуже -нитратная форма азота Самый низкий выход каротина отмечали на среде с хлоридом аммония

Твердофазная ферментация растительного сырья с использованием целлюлолитических ка ротинсинтезирующих бактерий

С целью восполнения дефицита витамина А в рационе сельскохозяйственных животных был разработан способ твердофазной ферментации различных отходов растениеводства с использованием новых штаммов целлюлолитических каротинсинтезирующих бактерий

В таблице 2 приведен сравнительный анализ пшеничной соломы, ферментированной с использованием разных штаммов целлюлолитических каротинсинтезирующих бактерий, проведенный через 30 суток после закладки опыта

Все образцы ферментированной пшеничной соломы характеризуются высокими органолептаческими показателями запахом квашеных овощей, размягченной структурой и оптимальной кислотностью Наилучшие биохимические показатели отмечены в вариантах с применением штамма Вгеу «уйзга 38, при этом наблюдается более полное расщепление целлюлозы, наибольшее накопление молочной кислоты и редуцирующих веществ, отсутствие масляной кислоты Содержание каротина при этом возросло по сравнению с исходным сырьем более чем в 2 раза

С этими штаммами бактерий была проведена ферментация рисовой соломы (таблица 3) Из данных таблицы 3 видно, что содержание целлюлозы снижается от 38,8% до 25% Солома при этом размягчается, накапливается значительное количество молочной кислоты, что говорит о благоприятной направленности процесса ферментации соломы По органолептическим и биохимическим показателям лучшим был вариант со штаммом Вгеу орасшп 103 Накопление каротина при этом составляло 6,08 мг/кг сухой

Таблица 2

Биохимические и органолептические показатели _ ферментированной пшеничной соломы

Спонтанное Штамм

Показатели брожение Вгеу егуйга Вгеу. орасит Р аигапйасшп

38 103 81/3

рН 5,6+0,2 4,4+0,1 4,6+0,2 4,4±0,1

Свободные

- органические

кислоты (%)

молочная 0,42±0,02 0,93±0,02 0,90+0,03 0,89±0,03

уксусная 0,86+0,03 0,24+0,02 0,28+0,02 0,26+0,02

масляная 0,34±0,01 0 0,1+0,01 0,1±0,Й1

Связанные

органические

кислоты (%)

уксусная 0,62±0,02 0,68±0,02 0,64±0,01 0,66+0,02

масляная 0,41±0,01 0 0,1±0,01 0,17±0,01

Геми-

целлюлозы,% 32,4±2,4 19,2+1,2 20,2+1,1 22,4+1,2

Целлюлоза,% 42,2±2,5 26,8±1,3 28,7+2,2 28,8±2,2

Каротин, мг/кг

сухого веса 3,12±0,02 6,74±0,04 5,82±0,03 5,93±0,03

Влажность,% 60,3±2,3 62,2±2,4 60,5+2,3 61,8+2,4

Редуцирующие

вещества,% 0,01±0,001 0,25±0,02 0,20±0,01 0,23±0,01

Запах резкий квашеных квашеных квашеных

уксусно- овощей овощей овощей

кислый

Структура жесткая значительно значительно значительно

размягчена размягчена размягчена

соломы, что значительно повышает питательную ценность кормового продукта из рисовой соломы

Далее была рассмотрена возможность ферментации стеблей и листьев кукурузы с использованием целлюлолитических каротинсинтезирующих бактерий В этом случае также получены положительные результаты Достаточно высокое содержание органических кислот, значение рН 4,3-4,5 в сочетании с высокими органолептическими показателями соответствуют требованиям к кормовому продукту хорошего качества Лучшие результаты по накоплению каротина в ферментируемой массе получены при использовании штамма Р аигапЬасшп 81/3, однако по показателям утилизации трудногидролизуемых (целлюлоза) и легкогидролизуемых (гемицеллюлоза) полисахаридов значительной разницы со штаммом Вгеу егуЙ1га 38 не обнаружено

Таблица 3

Биохимические и органолептические показатели _ ферментированной рисовой соломы

Показатели Спонтанное брожение Штамм

Вгеу егуйга 38 Вгеу орасит 103 Б аигапйасит 81/3

рН 5,6±0,2 5,2+0,2 4,9+0,2 5,0±0,2

Свободные

органические

кислоты (%)

молочная 0,36±0,02 0,87±0,03 0,89±0,02 0,85±0,03

уксусная 0,68±0,03 0,44±0,02 0,46±0,02 0,48±0,01

масляная 0,34+0,01 0,1±0,01 0 0,1+0,01

Связанные

органические

кислоты (%)

уксусная 0,81±0,03 0,56±0,02 0,62±0,02 0,60±0,02

масляная 0,41+0,01 0,2±0,01 0 0,10+0,0

Геми-

целлюлозы,% 27,6±1,2 17,2±1,1 16,5+1,2 17,4+1,0

Целлюлоза,% 38,8±2,4 25,1±2,0 24,8+1,8 25,6+1,9

Каротин, мг/кг

сухого веса 2,82+0,02 5,84+0,03 6,08+0,03 5,62±0,01

Редуцирующие

веществ а,% 0 0,23+0,02 0,32+0,02 0,18+0,01

Запах резкий квашеных квашеных квашеных

уксусный овощей овощей овощей

Структура жесткая размягчена размягчена размягчена

Таким образом, показана принципиальная возможность применения новых штаммов целлюлолитических каротинсинтезирующих бактерий для твердофазной ферментации различных отходов растениеводства При этом возможно получение кормового продукта, в котором не только гидролизо-вана целлюлоза, но и повышено содержание биологически ценных веществ, таких как каротин, витамины группы В, свободные аминокислоты

Использование вторичного роста целлюлолитических каротинсинтезирующих бактерий для селекции более активных штаммов

При промышленном использовании бактерий крайне важно увеличение биосинтеза каротина при одновременном повышении активности целлю-лазного комплекса Для получения вариантов с такими свойствами впервые применены такие приемы селекции микроорганизмов, как выделение и отбор клеток из вторичных колоний бактерий.

Из вторичных колоний бактерий выделены субкультуры, различающиеся по своим морфологическим характеристикам. В среднем, исследуемые бактерии образуют 2-3 типа вторичных колоний (рисунок 3). Отмечено, что цвет, поверхность и консистенция субкультур сильно варьируют. Некоторые 'морфологические типы вторичных колоний характеризуются интенсивным красно-оранжевым цветом, что говорит о более активном синтезе клетками бактерий каротина.

Колонии вторичного роста на первичных колониях бактерий Вгеу. егуйгга 38 (А) и Вгеу. орасшп 103 (Б)

А Б

Рисунок 3

Сравнительное исследование биосинтеза каротина у вторичных культур, дающих наиболее интенсивно окрашенные колонии при их выращивании на средах с различными источниками углерода и энергии показало, что на биосинтез каротина оказывает существенное влияние источник углерода (рисунок 4). Если для обоих исходных штаммов ВгелаЬайепшп максимальное накопление каротина отмечали на средах с гшокозой, а для штамма Р. аигапйасиго - на среде с лакгозой, то для культур вторичного роста этой закономерности не выявлено. Так, обе субкультуры вторичного роста штамма Вгеу. егуйгга 38 отличались как от исходного штамма, так и друг от друга. Субкультура 1-го морфологического типа характеризовалась повышенным по сравненшо с исходной культурой каротиногенезом на всех исследуемых углеводах. Причем это повышение было весьма значительным: от 28,0% - на глюкозе до 64,1% - на мальтозе. Максимум биосинтеза каротина у субкультуры П-го морфологического типа отмечали на среде, где в качестве источника углерода использовали сахарозу и он превышает таковой у исходной культуры на 44,7%. На среде с глюкозой и

Каротиногенез исходных и вторичных культур на различных источниках углерода Глюкоза Лактоза

I II III

Сахароза

I П Ш Мальтоза

Ось абсцисс - штаммы бактерий: I - Вгеу. ег>4!1га 38; II - Вгеу. орасшп 103; III - Р. аигапйасшп 81/3; ось ординат - содержание каротина, мкг/г АСБ. Обозначение диаграмм: 1 - исходная культура; 2 - вторичная культуры 1-го типа; 3 - вторичная культура П-го типа.

Рисунок 4

мальтозой биосинтез каротина был несколько ниже, чем у исходной культуры. Вторичная культура штамма Вгеу. орасшп 103 характеризуется повышенным каротиногенезом при росте на всех исследуемых источниках углерода кроме глюкозы (в этом случае синтез каротина остается на уровне исходной культуры). Отмечено, что синтез каротина на среде с сахарозой в

качестве источника углерода возрастает на 74,8% по сравнению с исходной культурой Субкультура штамма F aurantiacum на всех исследуемых источниках углерода синтезирует значительно большее количество каротина по сравнению с исходной культурой Максимальный каротиногенез отмечен на среде с глюкозой и он превышает таковой у исходной культуры на 62,9% Отселекционированные субкультуры характеризуются повышенной скоростью роста, которая в 1,4 - 1,7 раза превышает таковую у исходных культур, а также значительным увеличением синтеза ß-каротина, который возрастает до 64,1 - 74,8% у штаммов рода Brevibactermm, а у штамма Flavobactenum aurantiacum 81/3 - до 63% Субкультуры проявляют большую устойчивость к таким неблагоприятным факторам воздействия как соли тяжелых металлов и антибиотики

Отселекционированные субкультуры целлюлолитических каротанобра-зующих бактерий способствуют наиболее полному обогащению кормовых продуктов для животноводства биологически ценными веществами и поэтому являются перспективными для использования в кормопроизводстве

Взаимоотношения целюлолитических бактерий с высшими растениями

В процессе эволюции между растениями и микроорганизмами создались определенные взаимоотношения Микроорганизмы не только используют растения в качестве места обитания, но и получают от них питательные вещества Растения пользуются продуктами метаболизма микроорганизмов, удовлетворяя таким образом потребность в необходимых для нормального роста и развития элементах - азоте, фосфоре, калии, а также в биологически активных веществах - витаминах, аминокислотах, фитогор-монах, которые они сами не всегда в состоянии синтезировать в достаточном количестве Растения также оказывают влияние на микроорганизмы при помощи биологически активных веществ Как известно, зона корней населена бактериями, в первую очередь представителями рода Pseudomonas, Bacillus, Cellulomonas и других Среди них часто встречаются бактерии, обладающие целлюлолитической активностью Влияние представителей этих родов на высшие растения практически не изучено, хотя обнаружение среди них стимуляторов роста растений имеет большое практическое значение

В настоящем разделе работы представлены результаты исследования влияния целлюлолитических бактерий на рост и развитие высших растений. Объектом исследования служили культурные растения, используемые для производства продуктов питания и кормов

Из коллекции целлюлолитических бактерий, включающей более 350 штаммов различной таксономической принадлежности для детального изучения были отобраны три штамма факультативных анаэробов, обла-

дающих высокой скоростью синтеза микробной биомассы и отсутствием фитотоксичносги и фитопатогенности С. biazotea 150, С effusa 60 и В cyta-seus 21

В ранней фазе роста, когда развивается зародыш, прорастает семя и формируется проросток, растение особенно чувствительно к условиям внешней среды Именно в этой фазе легче обнаружить влияние различных факторов на растительный организм Поэтому первым этапом экспериментальных исследований было изучение влияния инокуляции целлюлолити-ческими бактериями на прорастание семян высших растений

С этой целью семена пшеницы сорта «Безостая-2», районированной в Казахстане, обрабатывали суспензией живых клеток, содержащей 1x106 -1x108 клеток в мл в течение 18 ч при комнатной температуре В контроле семена замачивали в стерильной среде По истечении срока замачивания семена высевали Через 7 суток выращивания проводили подсчет проростков растений, . измерение надземной части и корней Полученные данные представлены в таблице 4

Таблица 4

Влияние целлюлолитических бактерий на всхожесть _и развитие проростков пшеницы_

Варианты опыта Средняя длина, см Число корней Всхожесть, %

стебля корня

контроль 15,9±0,3 9,0±0,3 3,1±0,1 62,7

С effusa 60 17,2±0,2 13,2±0,2 4,1±0,1 80,6

С biazotea 150 18,4+0,2 14,6±0,3 4,3+0,2 85,4

В cytaseus 21 17,8±0,2 13,4±0,1 4,8±0,1 82,7

Как видно из результатов, представленных в таблице 4, исследуемые штаммы целлюлолитических бактерий оказывают стимулирующий эффект на всхожесть семян и развитие проростков пшеницы Степень положительного влияния инокуляции зависит от используемого штамма бактерий Так, максимальная всхожесть - 85,4% получена в случае предпосевной инокуляции семян пшеницы штаммом CelMomonas biazotea 150, она превышает таковую у контроля на 36,2% Проростки пшеницы имели большую длину стеблевой части, на 15,7% превышающую этот показатель в контрольном варианте Стебли и листовые пластинки были более ярко окрашенными и развитыми Длина корней и их количество на одно растение соответственно в 1,6 и в 1,4 раза выше , чем у контроля Два других штамма также оказывают стимулирующий эффект на всхожесть семян и развитие проростков, но он несколько ниже, чем в варианте, где использовали штамм С biazotea 150 Так, в варианте со штаммом Bacillus cytaseus всхожесть семян возросла на 32,0% по сравнению с контролем, длина стебля -на 12,0%, а длина корня - в 1,5 раза больше таковой у контрольного вари-

анта Для варианта со штаммом С ейша 60 прослеживалась аналогичная закономерность по всхожести и увеличению роста проростков, но стимулирующий эффект в этом варианте был несколько ниже Отмечено, что стимулирующий эффект целлюлолитических бактерий проявляется на корнях сильнее, чем на наземной части растений, это хорошо согласуется с данными таблицы 4 по увеличению средней длины стебля и возрастанию количества корней на одно растение

Таким образом, впервые показана возможность повышения всхожести семян и дальнейшее положительное влияние на развитие и рост высших растений предпосевной инокуляции семян целлюлолитическими бактериями

Положительное влияние обработки предположительно объясняется тем, что целлюлолитические бактерии частично разрушают твердую оболочку семян, что способствует усилению транспорта воды и растворенных в ней минеральных солей к зародышу семян Факт наличия стимулирующего эффекта на проростки растений и, особенно, на их корнеобразующую способность позволяет предположить, что после первой фазы - частичной деградации твердой оболочки семян, наступает вторая - фаза влияния на уровне вторичных метаболитов, при которой стимуляция развития и роста растений происходит за счет физиологически активных веществ, синтезируемых целлюлолитическими бактериями Поэтому представлялось актуальным изучить способность целлюлолитических бактерий к синтезу биологически активных веществ таких как витамины группы В и аминокислоты

Показано, что целлюлолитические бактерии обладают способностью к синтезу витаминов группы В, таких как тиамин Вь пантотеновая кислота Вз, никотиновая кислота Рр и пиридоксин Вб Причем эти витамины содержатся как в клетках бактерий, так и экскретируются в окружающую среду.

В целом количество витаминов целлюлолитических бактерий, как свободных, так и внутриклеточных, освобождающихся при естественном автолизе бактерий, представляется достаточным для стимуляции роста растений Несмотря на то, что высшие растения способны к синтезу почти всех витаминов группы В, они часто испытывают в них недостаток, который как показали исследования, может быть восполнен за счет деятельности целлюлолитических бактерий

Исследование способности данных штаммов бактерий к экскреции аминокислот показало, что все штаммы бактерий обладают способностью выделять внеклеточные аминокислоты Превалирующими по количеству являются аспарагиновая кислота, треонин, серии, глутаминовая кислота, глицин, аланин и фенилаланин, сумма которых составляет примерно 60% от суммы всех аминокислот Следует отметить, что качественный и количественный состав колеблется в зависимости от видовой принадлежности штаммов целлюлолитических бактерий и от используемого субстрата

В жизнедеятельности растений свободные аминокислоты, выделяемые целлюлолитическими бактериями, играют огромную роль как физиологически активные вещества Они могут непосредственно утилизироваться высшими растениями или выступать в роли компонентов некоторых витаминов (например, Р-аланин, входящий в пантотеновую кислоту), либо метаболических предшественников других физиологически активных веществ (в частности, триптофан, из которого образуется фитогормон - р-индолилуксусная кислота)

Таким образом, впервые показано, что цеашололитические бактерии стимулируют всхожесть семян и рост проростков не только за счет целлю-лазной активности, но и за счет синтеза физиологически активных веществ, таких как витамины группы В и аминокислоты

Адаптация целлюлолитических бактерий к высшим растениям

При исследовании взаимоотношений между целлюлолитическими бактериями и высшими растениями было показано, что спектр влияния бактерий довольно широк и включает как одно-, так и двудольные растения (таблица 5) Отмечено, что это влияние специфично, то есть определенные штаммы целлюлолитических бактерий оказывают наибольший стимулирующий эффект на одни виды растений и менее выраженный на другие Так, из одиннадцати высших растений штамм В су!азеш 21 оказывал максимальный эффект на пять видов (ячмень, овес, кукуруза, перец и томат), а нггамм С е£Еша 60 - на три других вида растений (капуста, огурцы и тыква) Отмечено, что различные виды бактерий, принадлежащие к одному роду, характеризуются избирательностью влияния на высшие растения Угнетающего действия целлюлолитических бактерий на высшие растения не было отмечено ни в одном из опытов, что свидетельствует об отсутствии фитотоксичности у исследуемых штаммов бактерий

Ранее было показано, что не только целлюлолитические бактерии влияют на высшие растения, но и сами растения через выделения корневых волосков оказывают влияние на них, как бы создавая селективные условия Была проведена работа по получению штаммов-адаптантов, характеризующихся повышенной активностю влияния на определенные растения Опыты с направленным изменением свойств целлюлолитических бактерий проводили со штаммом В. с^аяеиз 21, оказывающим стимулирующее действие на большой спектр высших растений Кроме того, он обладает способностью фиксировать азот атмосферы и снабжает растения дополнительным азотом в ту фазу их роста, когда они особенно в нем нуждаются

Семена пшеницы, ячменя и кукурузы обрабатывали штаммом В су1а-Беив 21 и высевали Из ризосферы проростков растений выделяли данный штамм бактерий, готовили накопительную культуру и снова обрабатывали семена растений В результате многократной обработки (каждые 10-12 дней в течение полугода) с последующим выделением были получены

Таблица 5

Влияние целхпололитических бактерий на всхожесть семян и развитие растений

Варианты опыта Контроль С ейиза 60 С Ыагйеа 150 В сугазеиэ 21

Средняя длина стебля, см Средняя длина корня, см Всхожесть, % Средняя длина стебля, см Средняя длина корня, см Всхожесть, % Средняя длина стебля, см Средняя длина корня, см Всхожесть, % Средьяя длина стебля, см Средняя длина корня, см Всхожесть, %

Пшеница 15,9±0,3 9,0±0,3 62,7±1,8 17,2±0,2 13,2±0,2 80,6+2,2 18,4+0,3 14,6±0,1 85,4±2,2 17,8±0,2 13,3+0 2 82 7±2,6

Ячмень 1б,2±0,2 14,8+0,3 67,5+2,0 18,4±0,3 17,5±0,2 86,6±2,6 18,6±0,4 17,8+0,2 87,0±2,4 19,1+0,3 17,9+0,1 88,2±2,4

Овес 15,3±0,3 7,б±0,1 53,0±1,4 17,8±0,1 10,2+0,1 84,2±2,4 17,6+0,2 9,8±0,1 83,б±2,3 18,1+0,1 10,8+0,2 84,6±2,4

Кукуруза 12,710,1 5,6±0,1 63,4±1,6 14,6±0,2 8,4±0,1 76,7±2,4 14,4+0,2 8,7±0,1 78,3±1,8 15,3±0,2 9,6+0, 81,6±2,5

Капуста 12,4±0,1 14,0±0,1 58,4±1,3 16,2±0,1 18,6±0,3 76,9±2,3 15,3±0,1 17,4±0,1 73,2±1,6 15,9±0,1 18,0±0,3 74,3±2,0

Томаты 12,2+0,1 13,9+0,3 б1,7±1,б 14,0±0,3 15,8±0,3 81,8±2,8 14,2±0,3 16,3±0,2 82,6±2,4 15,2±0,1 16,8+0,2 84,4±2,6

Огурцы 9,1+0,2 10,4+0,2 5б,б±1,1 13,4±0,2 14,6±0,2 78,2±2,3 12,2±0,1 13,1±0,1 76,5±1,9 12,0±0,1 13,6±0,2 74,8±1,9

Перец 11,8+0,1 12,3±0,2 61,2±1,3 12,9±0,2 14,8±0,1 69,8±2,1 13,4±0,2 15,1±0,1 73,2±1,8 14,8±0,2 16,3±0,2 75,6±2,1

Дыня 6,3±0,3 8,б±0,1 54,1 ±1,3 7,4±0,1 9,2±0,1 65,8+1,8 8,1 ±0,2 9,4±0,2 68,4±1,3 8,3±0,1 9,3±0Д б7,2±1,4

Тыква 5,8±0,3 6,3x0,1 68,3+2,1 8,9±0,2 10,2±0,1 86,4+2,4 6,7±0,1 8,4±0,1 84,4±2,5 7,2±0,1 8,8±0,2 85,3±2,6

Донник 3,6+0,1 2,3±0,2 58,3+1,4 3,4±0,1 2,7±0,1 68,3±2,1 3,9±0,3 2,7±0,1 80,0±2,4 3,8±0,1 2,7+0,1 70,2+2,1

штаммы-адаптанты, приспособленные к определенному растению, обладающие повышенным стимулирующим эффектом на всхожесть семян, рост проростков и, особенно, на развитие корневой системы растения В таблице 6 представлены данные по влиянию адаптантов штамма В с^аыеиз 2 ], полученных для пшеницы (№32), ячменя (№67) и кукурузы (№18), на всхожесть и развитие их проростков

Таблица 6

Влияние шгаммов-адаптантов целлюлолитических бактерий В су1азето 21 на всхожесть и развитие растений_

Варианты Длина стебля, Длина корня_ Число корней Всхожесть, %

опыта см см

Пшеница

В cytaseus21 17,8±0,2 13,3±0,2 4,9±0,2 100,0

№32 21,2±0,2 16,8+0,1 5,6+0,2 112,6+2,8

№67 17,0±0,4 13,6±0,2 4,8±0,2 103,5±1,6

№18 17,6+0,2 13,4±0,4 4,7±0,1 104,6±1,8

Ячмень

В cytaseus21 18,7+0,3 17,6±0,4 4,3+0,1 100,0

№32 19,0+0,2 18,0±0,3 4,4±0,2 106,312,0

№67 22,4+0,2 22,1 ±0,2 5,8+0,2 114,212,6

№18 18,6±0,1 17,7±0,2 4,6+0,1 102,611,4

Кукуруза

В cytaseus 21 12,3±0,4 9,6+0,1 6,8+0,2 100,0

№32 12,8+0,1 10,2±0,3 6,5+0,1 102,3+1,2

№67 13,0±0,3 10,5±0,1 6,7±0Д 104,411,6

№18 15,4±0,2 12,6±0,3 7,9±0,2 115,418,7

Как видно из таблицы 6, адаптанты увеличивают как всхожесть семян, так и стимулируют развитие проростков Так, адаптант №32 увеличивает всхожесть семян пшеницы на 12,6% по сравнению с исходным штаммом, при этом длина стебля увеличилась на 39,0%, а длина корня - на 26,0% Число корней на одно растение возросло с 4,5 до 5,6 Отмечено, что при бактеризации штаммами, адаптированными к определенному виду растений, семян других растений стимуляция остается на уровне исходного штамма или незначительно повышается

Исследование активности размножения штаммов-адаптантов показало, что количество бактерий было значительно выше на корнях тех растений, к которым они были адаптированы

Штаммы-адаптазегга различались не только по активности размножения на корнях, но и по характеру роста Так, при высеве корней пшеницы на агаризованную среду с 2% глюкозы исходный штамм В с^аэеиз 21 и его

адаптанты №67 и №18 разрастались от корней по всей поверхности чашки, используя в качестве источника питания, в первую очередь, элементы самой среды Штамм №32, адаптированный в ризосфере пшеницы, не распространялся по поверхности среды, а вырастал только вокруг корешков и только с течением времени адапгант разрастался по поверхности чашки. Можно предполагать, что адаптант №32 на агаризованной среде использует в качестве источника питания, в первую очередь, органическое вещество пшеницы, а не среды

Применение целлюлолитических бактерий в полевых условиях

Совместно с лабораторией экологии микроорганизмов Института микробиологии и вирусологии МОиН РК были проведены полевые испытания выделенных штаммов целлюлолитических бактерий в условиях Джана-шарского опытного хозяйства Казахского Государственного Аграрного Университета на лугово-сероземной почве Для инокуляции использовали семена растения донник, потенциально являющегося альтернативной заменой люцерны в рисовых севооборотах, который при использовании в качестве фитомелиоранта мог бы позволить значительно улучшить азотный режим почв Однако, семена донника из-за плотной оболочки имеют низкую полевую всхожесть Метод скарификации достаточно энергоемок, поэтому для решения проблемы исследовали возможность проведения предпосевной обработки семян донника целлюлолитическими бактериями В cytaseus 21 и С biazotea 150 В предварительно проведенных лабораторных исследованиях данные штаммы оказывали наибольший положительный эффект на всхожесть семян донника

Таблица 7

Влияние предпосевной инокуляции целлюлолитическими бактериями _на всхожесть семян донника_

Всхожесть семян, %

Штамм лабораторная полевая

контроль (без инокуляции) 58,3+1,6 52,7+1,4

С biazotea 150 80,2±2,4 81,3±2,6

В cytaseus 21 70,1+2,0 68,8±2,1

Как видно из данных таблицы 7, всхожесть семян донника значительно повышается при их предпосевной инокуляции штаммами целлюлолитических бактерий. Так, в полевых условиях всхожесть семян, инокулирован-ных перед высевом в почву пггаммом С biazotea 150, составляет 81,3%,

всхожесть семян, обработанных штаммом В cytaseus 21, несколько ниже -68,8% В контрольном варианте, где семена высевали без бактеризации, их всхожесть составила только 52,7% Как в лабораторных, так и в полевом опытах отмечена видовая специфичность влияния штаммов целлюлолити-ческих бактерий Так, наиболее благоприятным для инокуляции семян донника оказался штамм С biazotea 150, который повышал всхожесть семян в среднем на 30 - 35% по сравнению с контролем

Таким образом, проведенные полевые испытания штаммов целлюлоли-тических бактерий подтвердили эффективность такого агротехнического приема как предпосевная инокуляция семян высших растений

На базе полученных результатов возможно создание бактериальных удобрений с использованием целлюлолитических бактерий

Естественные и искусственные ассоциации целлюлолитических бактерий

Перспективность использования смешанных культур микроорганизмов для эффективного решения насущных задач прикладных разделов микробиологии не подлежит сомнению В реальной ситуации в природе микроорганизмы существуют в виде сообществ различных популяций, тесно связанных между собой и осуществляющих круговорот веществ в природе Применение как природных микробных ассоциаций, так и создание управляемых совместных культур имеет ряд преимуществ Без существенных изменений в технологическом процессе решается проблема борьбы с инфицированием посторонней микрофлорой, а главное, использование микробных ассоциаций позволяет более эффективно и глубоко утилизировать сложные субстраты, в частности, отходы растениеводства

Из природных источников Алматинской области, таких как разлагающаяся древесина хвойных и лиственных пород, кишечные тракты насекомых, а также силосов хорошего качества, были выделены 76 микробных ассоциаций, обладающих способностью разлагать целлюлозу и фиксировать молекулярный азот атмосферы В результате длительного пассирования на элективной среде, не содержащей азота, с целлюлозой в качестве источника углерода и энергии, были получены стойкие природные ассоциации При этом на каждый вид целлюлолитических бактерий приходится 2-3 бактерии-спутника Сопутствующие бактерии, в основном, представлены бактериальными спорообразующими или неспорообразующими подвижными палочками Из выделенных ассоциаций для детального исследования отобрали те, в которых целлюлолитические бактерии обладали повышенной способностью к фиксации молекулярного азота атмосферы.

Изучение таксономического положения бактерий, входящих в состав природных ассоциаций показало, что они преимущественно относятся к родам Bacillus, Pseudomonas и Bactenum

Установлено, что природные ассоциации целлюлолитических бактерий состоят из 3-4 видов бактерий, симбиоз не является для них облигатным и все монокультуры могут существовать автономно. Как правило, в ассоциации встречается только один ассоциант, способный к деградации целлюлозы и фиксации азота атмосферы Другие ассоцианты могут фиксировать молекулярный азот, но не разлагать целлюлозу Отмечено, что природные ассоциации гораздо интенсивнее деградируют целлюлозу и фиксируют молекулярный азот атмосферы, чем чистые культуры целлюлолитических бактерий, и характеризуются более высокой нитрогеназной и целлюлазной активностью

Из данных таблицы 8 видно, что целлюлазная активность природных ассоциаций превышает таковую у монокультур целлюлолитических бактерий в среднем в 1,4 -1,5 раза, нитрогеназная активность у природных ассоциаций увеличивается на 50 - 60% по сравнению с активностью азотфикси-рующих целлюлолитических бактерий

Таблица 8

Ферментативная активность чистых культур целлюлолитических _бактерий и их природных ассоциаций_

Культура Общая целлюлазная активность Нитрогеназная активность, мкгИ2/мл среды/ч

В су!азеиз 21 4,3±0,01 39,63±2,2

Ассоциация В суТазеиэ 21 6,6±0,03 63,64±2,5

В о11§ошЦор1и1ш 128 3,8±0,01 38,94±2,3

Ассоциация В оЬдошЦорМиз 128 5,2±0,02 58,94±2,4

Рэ ЯиогезсепБ 56 3,6±0,01 38,17±2,0

Ассоциация Ре Аиогезсепэ 56 4,9+0,02 60,08±2,5

При исследовании кинетики роста выделенных природных ассоциаций бактерий отмечено, что удельная скорость их роста значительно выше скорости роста чистых культур Так, удельная скорость роста природной ассоциации составляет ртах = 0,42 ч"1, в то время как у ее чистой культуры В су1азещ 21 - только ртах = 0,29 ч"1 Аналогичная закономерность прослеживается и для других природных ассоциаций бактерий Отмечено, что пик максимума скорости роста для ассоциации с культурами В су^авеиз 21 и В

оЬдопйгорШш 128 приходится на более ранние сроки культивирования по сравнению с чистыми штаммами этих бактерий, что свидетельствует о более активном усвоении данного источника углерода

Одним из показателей роста микроорганизмов является продолжительность лаг - фазы, в процессе которой происходит приспособление клеток к среде и подготовка их к делению Показано, что продолжительность лаг -периода у природных ассоциаций по сравнению с чистыми культурами целлюлолитических бактерий на всех указанных источниках углерода значительно короче Удельная скорость роста природных ассоциаций превышает таковую у чистых культур Отмечено, что это превышение выше на средах с целлюлозой в качестве источника углерода, чем на среде с глюкозой, что говорит о преимуществе использования смешанных культур при утилизации трудных субстратов

Исследование влияния бактерий-спутников природной ассоциации на рост и развитие целлюлолитических бактерий Показано, что природные ассоциации активнее деградируют целлюлозу, чем монокультуры бактерий Однако, бактерии - спутники не обладают целлюлазной активностью Повышенная деградация связана с их стимулирующим влиянием на целлюлолитические бактерии Представлялось интересным рассмотреть возможность стимуляции целлюлолитических бактерий их ассоциантами на средах, не содержащих целлюлозу Для этого чистую культуру бактерий Р&. АиогезсепБ 56, бактерии - спутники и их природную ассоциацию выращивали на среде с лактозой в качестве источника углерода и энергии Предварительно было установлено, что бактерии Рб Яио-геБсепв 56 хорошо развиваются на лактозе, а бактерии - ассоцианты ( В а1-Ыит, В Ш1С11о§дю518) дают невысокий выход биомассы на этом источнике углерода На рисунке 5 представлена динамика накопления биомассы чистой культурой Рэ Аиогезсепз 56, бактериями - спутниками и всей природной ассоциацией Можно видеть, что чистые культуры бактерии дают высокий прирост биомассы (0,36 ед ОП), а бакге рии - спутники характеризуются незначительным накоплением биомассы (0,15 ед ОП) Биомасса природной ассоциации превышает таковую как чистых культур, так и ассо-циангов (0,41 ед ОП)

Таким образом, бактерии - спутники оказывают стимулирующее влияние на целлюлолитические бактерии не только при росте на целлюлозе, но и на других источниках углерода Однако, если сравнить этот стимулирующий эффект со стимуляцией при росте на целлюлозе (рисунок 5), то хорошо видно, что он намного ниже

Динамика изменения биомассы чистой культуры Рз Аиогезсеш 56, бактерий - спутников и ее природной ассоциации в процессе культивирования на среде с лактозой (А) и целлюлозой (Б)

А

Б

0,5 ■

0,4-

0,3-

0,2-

0,1 -

0

0 2 4 6 8 10 02468 10

Ось абсцисс - время, сутки, ось ординат - биомасса, ед, ОП. Обозначение кривых 1 - чистая культура Рэ Аиогезсепв 56, 2 - природная ассоциация, 3 - бактерии - спутники

Получение устойчивой и продуктивной ассоциации микроорганизмов для биоконверсии целлюлозосодержащего сырья

Твердофазная ферментация целлюлозосодержащего сырья основана на гидролизе растительного сырья, в частности, на утилизации труднорастворимых полисахаридов Однако, целлюлолитические бактерии являются слабыми кислотообразователями и, как правило, консервирование кормов осуществляется за счет спонтанной молочнокислой микрофлоры Поэтому для усиления направленности процесса ферментации представлялось перспективным создание смешанной культуры целлюлолитических бактерий и гетероферменгативных пенгозосбраживающих молочнокислых бактерий ЬасЮЬа^еггат регйоасеПсит В(б)-23, ранее предложенных для силосования отходов сельского хозяйства и отличающихся повышенной активностью кислотообразования Предварительные опыты по смешанному культивированию молочнокислых и целлюлолитических бактерий дали положительные результаты (таблица 9)

Рисунок 5

Таблица 9

Moho- и смешанное культивирование целлюлолитических и молочно-_кислых бактерий на различных источниках углерода_

Культура Источник углерода Биомасса, ед ОП Молочная кислота, % Общая целлюлазная активность, ед/мл

В cytaseus21 глюкоза 0,35±0,02 0,40±0,02 1,2+0,01

L pentoaceticum (В)б-23 - 0,39±0,03 0,86±0,04 -

В eyíaseus 21+ L pentoaceücum (В)б-23 0,41 ±0,03 0,94±0,05 1,0±0,01

В cytaseus21 L pentoaceücum (В)б-23 пшеничная солома 0„38±0,03 0,12±0,01 0,36±0,02 0,20±0,01 4,2±0,02

В cytaseus21+ L pentoaceücum (В)б-23 0,52+0,04 0,83+0,04 5,3±0,03

Из таблицы 9 видно, что наибольшее накопление биомассы, а также повышенная активность целлюлаз бактерий, отмечены на среде с пшеничной соломой в качестве источника углерода При совместном культивировании на глюкозе значительного прироста биомассы не обнаружили Однако, отмечен наиболее высокий синтез молочной кислоты По всей видимости, на среде с глюкозой наблюдается конкуренция между целлюлолитиче-скими и, молочнокислыми бактериями за источник углерода и питания

Устойчивость смешанных культур обуславливается положительным влиянием составляющих ее микроорганизмов, которое основано на взаимовыгодном трофическом и метаболическом уровнях обмена Для получения устойчивой и продуктивной ассоциации данных бактерий культивирование в протоке исключается, поскольку оно основано на выводе из системы как продуктов метаболизма, так и продуктов гидролиза целлюлозы, являющихся основным источником питания молочнокислых бактерий Периодическое культивирование не способствует преимущественному размножению клеток с исходными свойствами Поэтому было решено остановиться на полунепрерывном способе выращивания, представляющим собой серию последовательных процессов культивирования

Полунепрерывное культивирование проводили при оптимальном для смешанной культуры значении рН среды - 5,5 до установления устойчивого соотношения клеток тех и других бактерий, которое можно объяснить селекцией адаптированных клеток и повышением использования метаболитов на трофическом уровне

Среду Гетчинсона с 0,5% Ыа-КМЦ инокулировали бактериями В су1а-зеиэ 21 и Ь репйэасейсит В(б)-23 в количестве 1,8 - 2,0х109 клеток/мл на 100 мл среды, инкубировали в течение 18-20 часов при 30°С, после чего 80% суспензии удаляли и заменяли свежей питательной средой до первоначального объема Культивирование воспроизводили в этих же условиях в течение 21 суток Если в момент засева соотношение бактерий равнялось 10 10, то на десятые сутки соотношение целлюлолитических и молочнокислых бактерий уже составляло 15 10 и сохранялось таким до конца опыта (рисунок 6) Максимальная скорость роста в этих условиях составляла 0,18 ч"1, содержание биомассы колебалось от 0,5 до 1,3 г/л, максимальная активность целлюлазного комплекса - 3,6 ед/мл

Динамика изменения соотношения целлюлолитических и молочнокислых бактерий в условиях полунепрерывного культивирования

Ось абсцисс - время, сутки, ось ординат - количество клеток (х 109) в мл среды Обозначения кривых 1 - целлюлолитические бактерии, 2 - молочнокислые бактерии

Рисунок 6

Таким образом, создана смешанная культура целлюлолитических и молочнокислых бактерий, в которой молочнокислые бактерии заняли экологическую нишу природных бактерий - спутников, связанных с целлюлоли-тическими бактериями на трофическом и экзометаболическом уровне Однако, полученная ассоциация бактерий для биоконверсии целлюлозосо-держащего сырья по ряду свойств (накопление биомассы, целлюлазная активность ферментов) уступает природной микробной ассоциации целлюлолитических бактерий

Смешанные культуры целлюлолитических бактерий и дрожжей

для получения кормового белка на отходах растениеводства

В настоящее время на подлежит сомнению, что для более глубокой и эффективной переработки сложных субстратов необходимо использовать смешанные культуры микроорганизмов В связи с этим представлялось интересным рассмотреть возможность использования целшолозосодержащего сырья для производства кормового белка путем его конверсии с помощью смешанной культуры целлюлолитических бактерий и дрожжей.

Использовали два штамма целлюлолитических бактерий - В cytaseus 21 и С effusa 60, а также дрожжи с повышенной гидролитической активностью - Endomycopsis fibuhgera С-4, End fibuligera 26-14, Candida tropicalis C-3, Tnchosporon cutaneum Подбор смешанных культур микроорганизмов проводили на среде Гетчинсона с пшеничной соломой в качестве источника углерода и энергии на качалке в течение семи суток Приведенные в таблице 10 результаты показывают, что наиболее высокие показатели получены при использовании В cytaseus 21 в смешанной культуре с С tropicalis С-3 Накопление биомассы почти в два раза превышает биомассу монокультур, а общая целлюлазная активность возрастает на 60%

Далее была предпринята попытка совместного выращивания этих микроорганизмов в условиях непрерывного культивирования Однако, при всех изучаемых скоростях протока (от 0,05 до 0,25 ч*') имело место вытеснение дрожжей из смешанной культуры, что объясняется конкуренцией за субстрат и нехваткой его для дрожжей в условиях лимитирования процесса источником углерода Поэтому была проведена адаптация микробных компонентов ассоциации в условиях полунепрерывного культивирования Развитие культуры проходило от начала экспоненциальной фазы до стационарной на среде с Na-КМЦ в качестве источника углерода и энергии В момент засева соотношение числа клеток дрожжей и бактерий равнялось 1 10, длительность эксперимента - 14 суток Через 7 суток культивирования в полунепрерывных условиях отмечено значительное вытеснение дрожжей из смешанной культуры, что можно объяснить разностью скоростей роста микроорганизмов Соотношение клеток составило 1 44 и оставалось стабильным в процессе последующего культивирования Накопление биомассы на этом источнике углерода изменялось от 0,28 ед ОП до 0,62 ед ОП, скорость роста увеличилась незначительно - от 0,2 до 0,27 ч'1 (рисунок 7)

Таким образом, в процессе полунепрерывного культивирования получили устойчивую смешанную культуру дрожжей и бактерий, биомасса которой увеличилась более чем в 2 раза Целлюлозосодержащий субстрат утилизируется смешанной культурой более полно Так, при начальной концентрации этого субстрата Зг/л остаточная концентрация Na-КМЦ у исходной смешанной культуры составила 0,5 г/л, тогда как у отселекциони-рованной - только 0,2 г/л

Таблица 10

Moho- и смешанное культивирование целлюлолитических бактерий и _дрожжей на среде с пшеничной соломой_

Культура Биомасса, ед ОП Общая целлюлазная активность, ед/мл

В cytaseus 21 0,68±0,03 4,110,03

В cytaseus 21+Тг cutanenm 0,6710,04 3,810,02

В cytaseus 21+С tropicalis С-3 1,20±0,06 6,510,04

В cytaseus 21 +End fibuhgera С-4 0,6810,03 2,810,02

В cytaseus 21+End fíbuligera 26-14 0,6710,04 2,810,02

С efíusa 60 0,3210,01 3,910,03

С efíusa 60+Tr cutaneum 0,4610,02 2,610,02

С efíusa 60+C tropicalis C-3 0,69±0,03 5,810,04

C. efíusa 60+End fibuhgera C-4 0,3310,01 2,6+0,02

С efíusa 60+End fibuhgera 26-14 0,3810,01 2,710,02

Tr cutaneum 0,3510,01 -

С tropicalis C-3 0,7010,06 4,0+0,02

End fibuhgera C-4 0,2910,01 -

End fibuhgera 26-14 0,24+0,01 -

Динамика изменения численности штамма Candida tropicalis С-3 в смешанной полунепрерывной культуре

Ось абсцисс - время, сутки; оси ординат I - биомасса, ед ОП, П - количество клеток, % Обозначения кривых 1 - изменение биомассы смешанной культуры, 2 - изменение содержания дрожжей Candida tropicalis в смешанной культуре

Рисунок 7 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение физиолого-биохимических особенностей целлюлолитических бактерий позволило предположить большую перспективность использования этой группы микроорганизмов в практике, что потребовало выделения новых штаммов с соответствующими для каждой области применения свойствами

Выделение целлюлолитических бактерий проводили из различных источников Алматинской области разлагающейся древесины хвойных и лиственных пород, кишечных трактов и экскрементов насекомых, разлагающих древесину, силосов хорошего качества, ризосферы корней растений В настоящее время ранее созданная коллекция микроорганизмов значительно расширена и включает более 350 штаммов целлюлолитических бактерий различной таксономической принадлежности, в основном принадлежащих

к родам Cellulomonas, Bacillus, Bacterium, Pseudomonas, Brevibactenum и Fiavobacterium

-Способ твердофазной ферментации целлюлозосодержащего сырья способствует получению корма с хорошей поедаемостыо и сохранностью Однако питательность кормового продукта остается на невысоком уровне С целью повышения питательности кормов выделены, отселекционированы и включены в коллекцию 128 штаммов бактерий, которые наряду с синтезом целлюлолитических ферментов обладают способностью фиксировать молекулярный азот атмосферы и обогащать конечный кормовой продукт для животноводства микробным протеином без дополнительного внесения азотистых веществ Данные штаммы целлюлолитических бактерий преимущественно относятся к родам Bacillus, Pseudomonas и Bacterium

Проведена автоселекция в условиях полунепрерывного культивирования наиболее перспективных для практического использования штаммов Нитрогеназная активность нового варианта возросла в два раза, а активность целлюлазного комплекса - в 3 раза по сравнению с исходной культурой Впервые у данных бактерий изучен состав ферментного комплекса целлюлаз Показано, что он включает в себя три фермента - эндо-1,4-р-глюканазу (К Ф 3 2 1 4), целлобиогидролазу (К Ф 3 2 1 91) и ß-глюкозвдазу (КФ321 21) Применение отселекционированного штамма В cytaseus 21/2 позволило получить кормовой продукт с повышенным в 1,8 - 2,0 раза содержанием общего азота по сравнению с контрольным вариантом Разработан способ твердофазной ферментации и протеинизации целлюлозо-содержащих отходов растениеводства, а штамм защищен Патентом Республики Казахстан.

Известно, что в мелиоративно-удобригельных целях практикуется запашка соломы в почву С целью активации микробиологических процессов в почве и обогащения ее доступными для растений формами азота впервые применили целлюлолитические бактерии, способные фиксировать молекулярный азот атмосферы Результаты исследований, проведенных совместно с Институтом почвоведения, показали, что при использовании этих микроорганизмов происходит интенсификация микробной деструкции соломы, возрастает минерализация почвенного раствора, создаются условия для рассоления пахотного горизонта, благодаря чему снимается щелочной токсикоз растений Происходит обогащение почвы легкодоступными азотсодержащими соединениями Вследствие использования целлюлолитических бактерий отмечается эффект последействия на второй вегетационный год после внесения инокулированной соломы Все это приводит к увеличению выхода зерна в первый год вегетации на 36%, а на второй - на 28% Способ мелиорации засоленных почв под культуру риса защищен авторскими правами

Ферментированные отходы растениеводства в качестве кормов используются в основном в зимне-весенний период, когда из-за отсутствия зеле-

ного корма в рационах сельскохозяйственных животных ощущается острый дефицит каротина Отселекционированы и включены в коллекцию 86 штаммов, относящихся преимущественно к родам Bacterium, Brevibacte-пиш и Flavobacterium, способные синтезировать каротин и каротиноиды при росте на целлюлозе и, тем самым, повышать биологическую ценность кормового продукта Применение штамма Brevibactenum erythra 38 для твердофазной ферментации различных отходов растениеводства (пшеничная и рисовая солома, стебли, листья, кочерыжки кукурузы) позволило увеличить содержание каротина в конечном продукте более чем в два раза при одновременном снижении трудноутилизируемых полисахаридов на 30 - 35%, легкоутилизируемых полисахаридов - на 40 - 45% Полученные кормовые продукты отвечают всем требованиям, предъявляемым к силосам хорошего качества На основании этого разработан способ обогащения ферментируемых отходов каротином Штамм Brevibactenum erythra 38 защищен авторскими правами На опытно-промышленной установке Института микробиологии и вирусологии МОиН PK получены сухие препараты заквасок целлюлолитических каротинсинтезирующих бактерий и переданы для промышленного испытания в Оренбургский Государственный Аграрный Университет (Российская Федерация) Получены положительные результаты

В результате селекгавного отбора получены субкультуры вторичного роста, по своим морфологическим и физиолого-биохимическим свойствам резко отличающиеся от исходных культур и характеризующиеся повышенным синтезом каротина. Так, синтез каротина у субкультур бактерий рода Brevibactenum увеличился на 64 - 75%, а у субкультуры штамма Flavobacte-num aurantiacum 81/3 - на 63% Полученные субкультуры рекомендуются для использования в кормопроизводстве

В процессе эволюции между растениями и микроорганизмами создались определенные взаимоотношения Как известно, зона корней населена бактериями, в первую очередь представителями рода Pseudomonas, Bacillus, Ceüulomonas и других Среди них часто встречаются бактерии, обладающие целлюлолитической активностью Влияние представителей этих родов на высшие растения практически не изучено, хотя обнаружение среди этих бактерий стимуляторов роста растений имеет большое практическое значение

В настоящей работе впервые показана возможность использования целлюлолитических бактерий рода Cellulomonas (С biazotea 150, С effusa 60) и рода Bacillus (В cytaseus 21) для повышения всхожести семян, етиму-ляции роста и развития проростков высших растений Всхожесть семян повышается в среднем на 35 - 37%, число корней увеличивается на 35 - 40%, длина корней - на 45 - 47%, длина стеблей - на 12 - 15% Способ биологической стимуляции всхожести семян и роста растений защищен двумя Патентами Республики Казахстан Совместно с лабораторией экологии микроорганизмов Института микробиологии и вирусологии МО иН PK прове-

дены полевые испытания штаммов целлюлолитических бактерий в Джа-нашарском опытном хозяйстве Казахского Государственного Аграрного университета, полностью подтвердившие эффективность данного агротехнического способа биологической стимуляции всхожести семян и роста растений На основе полученных результатов возможно создание бактериальных удобрений с использованием целлгололитических бактерий

Показано, что природные ассоциации интенсивнее деградируют целлюлозу и фиксируют молекулярный азот атмосферы, чем монокультуры целлюлолитических бактерий Для промышленного применения с целью усиления направленности процесса ферментации в условиях полунепрерывного культивирования создана смешанная культура целлюлолитических и молочнокислых бактерий со стабильным видовым составом Полученная путем автоселекции смешанная культура отличается высокой продуктивностью и устойчивыми связями на трофическом и метаболитном уровнях

Была рассмотрена также возможность получения кормового белка на целлюлозосодержащем сырье без его предварительной обработки за счет создания смешанной культуры целлюлолитических бактерий и дрожжей В результате отобраны целлюлолитические бактерии рода Bacillus и дрожжи рода Candida, при совместном культивировании которых биомасса почти в два раза превышает биомассу монокультур, а целлюлазная активность возрастает на 60% Для адаптации смешанной культуры на уровне метаболитов проведена автоселекция при полунепрерывном культивировании, в результате которой получена смешанная культура целлюлолитических бактерий и дрожжей с устойчивым видовым соотношением, характеризующаяся высокой активностью и продуктивностью

Таким образом, проведенные исследования показали высокую перспективность изучения целлюлолитических бактерий и расширения сферы их использования в промышленной микробиологии Широкое распространение в природе, нетоксичность и непатогенностъ способствуют тому, что основанные на их использовании производства не будут служить источниками загрязнения окружающей среды

ВЫВОДЫ

1 Выделены и изучены новые штаммы бактерий рода Bacillus, Pseudomonas и Bactenum, обладающие способностью деградировать целлюлозу и одновременно фиксировать молекулярный азот атмосферы

2 Разработан способ ферментации целлюлозосодержащих отходов растениеводства штаммом целлюлолитических азотфиксирующих бактерий Bacillus cytaseus 21(2)AS с получением кормового продукта с повышенным содержанием протеина При этом содержание общего азота возрастает в два раза по сравнению с контролем, а количество сырого протеина увели-

чивается до 3,75% (Патент Республики Казахстан №4028, опубл 16 12.96г)

3. Изучен состав ферментов целлюлазного комплекса бактерий Bacillus cytaseus 21(2) AS, обладающих способностью фиксировать молекулярный азот атмосферы Показано, что в целлюлазном комплексе бактерий присутствуют эндо-1,4-р-глгоканаза, целлобиогидролаза и ß-глюкозидаза

4 Впервые для повышения мелиоративно-удобрительного действия соломы, запахиваемой под культуру риса, применили целлюлолитические бактерии, способные фиксировать азот атмосферы Отобран штамм Bacillus cytaseus 21(2)AS, способствующий повышению урожайности риса в первый год вегетации на 36%, а на второй год - на 28%

5 Выделены й изучены новые штаммы целлюлолитических бактерий рода Bactenum, Brevibactenum и Flavobactenum, способные синтезировать каротин при росте на целлюлозосодержащем сырье

6. Разработан способ ферментации отходов растениеводства новыми целлюлолитическими каротинсинтезирующими бактериями Brevibactenum erythra 38KCS, позволяющий увеличивать содержание каротина в кормовом продукте в два раза при одновременном снижении трудногидролизи-руемых (на 30 - 35%) и легкогидролизируемых (на 40 - 45%) полисахаридов исходного сырья (Предварительный патент Республики Казахстан №9314, опубл 15 08 2000г)

7 Впервые для увеличения активности синтеза каротина у целлюлолитических бактерий применен метод селекции клеток из колоний вторичного роста Получены субкультуры, отличающиеся по морфологическим и физиолого-биохимическим свойствам от исходных культур Биосинтез каротина у субкультур бактерий рода Brevibactenum увеличился на 64 - 75%, а у субкультуры Flavobactenum aurantiacum 81/3KCS - на 63% Полученные варианты перспективны для использования на практике

8 Впервые показана возможность использования целлюлолитических бактерий рода Bacillus и Cellulomonas в агробиологической практике в качестве стимуляторов всхожести семян и роста проростков высших растений

9. Разработаны способы биологической стимуляции всхожести семян и роста растений, основанные на предпосевной инокуляции семян целлюлолитическими бактериями Cellulomonas biazotea 150ВА и Bacillus cytaseus 21(2)AS Бактеризация семян высших растений приводит к повышению их всхожести на 35 - 37%, увеличению числа корней на 35 - 40%, длины корней - на 45 - 47%, длины стебля - на 12 - 15% (Патент Республики Казахстан №4900, опубл 15 08 97г, Предварительный патент Республики Казахстан №8751, опубл 14 04 2000г)

10 Путем автоселекции в полунепрерывных условиях получена устойчивая ассоциация адаптированных на уровне метаболитов целлюлолитиче-

ских и молочнокислых бактерий, перспективная для повышения продуктивности твердофазной ферментации различных отходов растениеводства

11 Предложена смешанная культура целлюлолитических бактерий и дрожжей для прямой конверсии отходов растениеводства в кормовой белок, характеризующаяся высокими показателями целлюлазной активности и продуктивностью

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 А С №1740358 СССР Способ мелиорации засоленных почв под культуру риса // Нелидов С Н , Саубенова М Г, Смирнова И Э Опубл 15 06 92

2 Смирнова И Э, Саубенова М Г Исследование активности целлюлаз бактериальных организмов // Известия HAH PK, сер биол - 1993 -№5 -С 42-47

3 Смирнова И Э , Саубенова М Г Внеклеточные аминокислоты целлюлолитических бактерий // Известия HAH PK, сер биол - 1995 - №5 - С 60-64

4 Smimova I Е, Saubenova М G The use of mtrogenfixed bacteria for enriching of feed product with protein // Abs 10th Int. Congress on nitrogen fixation -St Peterburg-Dordrecht, 1995 -P 822

5 Смирнова И Э Влияние минеральных компонентов среды на биосинтез цешполаз бактериальных организмов // Известия МН-НАН PK, сер биол -1996,-№4 -С 59-62

6 Патент Республики Казахстан №4028 Штамм целлюлолитических азот-фиксирующих бактерий Bacillus cytaseus ВКПМ В-4441 для твердофазной ферментации и протеинизации целлюлозосодержащих отходов растениеводства//Смирнова И Э, Саубенова М. Г Опубл 16 12.96

7 Илялетдинов А Н, Курманбаев А, Смирнова И Э и др Оценка эффективности нитрогенизации и бактеризации целлюлолитическими микроорганизмами (ЦЛМ) семян донника на орошаемых почвах юга Казахстана//Поиск -1996 -№4 -С 22-26

8 Патент Республики Казахстан №4900 Способ биологической стимуляции всхожести семян и роста растений пшеницы // Смирнова И Э, Саубенова М Г Опубл 15 08 97

9 Смирнова И. Э„ Саубенова М Г Целлюлолитические азотфиксирующие бактерии для протеинизации грубых кормов // Тез докл I съезда микробиологов Узбекистана - Ташкент, 1997 - С 64

10. Смирнова И Э , Саубенова М Г Целлюлолитические азотфиксирующие бактерии для твердофазной ферментации и протеинизации целлюлозосодержащих отходов растениеводства // Новости науки Казахстана -1998 -Вып. 1 -С 109-111

11 Смирнова И Э, Саубенова M Г. Биологическая стимуляция всхожести семян и роста растений пшеницы // Новости науки Казахстана - 1998 -Вып 2 -С 63-64

12 Смирнова И Э Азотфиксирующая активность природных микробных ассоциаций целлюлолитических бактерий // Известия МНиВО НАН РК, сер биол и мед - 1998 - №5-6 - С 67-71

13 Смирнова И Э Влияние микроэлементов на накопление биомассы и ферментативную активность природной микробной ассоциации целлюлолитических бактерий // Известия МНиВО НАН РК, сер биол и мед -1999 -№1 -С 60-64

14 Смирнова И Э Биологическая стимуляция семян и роста растений пшеницы // Тез докл Междунар научн конф по проблемам микробиологии и биотехнологии - Ташкент, 1999 - С 188

15 Смирнова И Э Влияние целлюлолитических бактерий на образование корней высшими растениями // Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана - 2000 - №2 - С 70-72

16 Смирнова И Э Влияние инокуляции целлюлолитическими бактериями на стерильные и нестерильные семена высших растений // Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана - 2000 - №2 - С 72-73

17 Смирнова И Э Природные микробные ассоциации целлюлолитических бактерий//Доклады АН РК -2000 -№2 -С 47-52

18 Смирнова И Э Целлюлолитические каротинсинтезирующие бактерии для твердофазной ферментации целлюлозосодержащих отходов растениеводства И Новости науки Казахстана. - 2000 - Вып 3 -С 51-53

19 Смирнова И Э Биологическая стимуляция всхожести семян и роста растений агротехнических культур И Новости науки Казахстана - 2000 -Вып 3 -С 54-55

20 ПредпатентРК№8751 Способ биологической стимуляции прорастания семян // Смирнова И Э, Саубенова М. Г Опубл 14 04 2000

21 Смирнова И Э Влияние бактерий-спутников природной ассоциации на рост и развитие целлюлолитических бактерий // Биотехнология Теория и практика -2000 -№1-2 -С 107-109

22 Смирнова И Э Селекция целлюлолитических каротинсинтезирующих бактерий//Биотехнология Теория и практика - 2000 -№1-2 - С 110113

23 Смирнова И Э Нигрогеназная активность целлюлолитических бактерий//Известия МОиНРК, сер биол и мед -2000 -№3 - С 64-66

24 Смирнова И Э Целлюлолитические каротинсинтезирующие бактерии //Известия МОиНРК, сер биол и мед -2000 -№3 - С 78-79

25 Смирнова И Э. Новые аспекты применения целлюлолитических бактерий для твердофазной ферментации грубых отходов растениеводства // Тез докл Респ научв конф. по актуальным вопросам современной биологии и биотехнологии - Алматы, - 2000 - С 68

26 Смирнова И Э Твердофазная ферментация отходов растениеводства с использованием целлюлояитяческих азотфиксирующих бактерий II Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана - 2000 - №4 - С 1922

27 Смирнова И Э Стимулирующее влияние целлюлолитических бактерий на высшие растения // Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана -2000 -№5 - С 12-14

28 Смирнова И Э Твердофазная ферментация отходов растениеводства с использованием целлюлолитических каротинсинтезирующих бактерий // Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана - 2000 - №5 - С 5860

29 Смирнова И Э Биосинтез витаминов группы В целлюлолитическими бактериями, перспективными для использования в агробиологии // Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана. - 2000 - №5 - С 60-61

30 Смирнова И Э., Саубенова M Г Целлюлолитические азотфиксирую-щие бактерии для протеинизации грубых кормов // Прикл биохим и микробиол -2000 -№5. - С 617-620.

31 Смирнова И Э. Коллекция целлюлолитических бактерий, перспективных для использования в биотехнологии // Тез докл Междунар научн -практ конф «Спонсируемые биотехнологические разработки в Казахстане и проблемы нераспространения» - Биотехнология Теория и практика -2000 -№3-4 -С 43-44

32 Смирнова И Э Получение устойчивой и продуктивной ассоциации микроорганизмов для биоконверсии целлюлозосодержащего сырья // Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана - 2000 - №6 - С 6061

33 Смирнова И Э Смешанные культуры целлюлолитических бактерий и дрожжей для получения кормового белка на отходах растениеводства // Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана - 2000 - №6 - С 6263

34 Предпатент Республики Казахстан №9314 Штамм целлюлолитических каротинсинтезирующих бактерий Brevibactenum erythra ИМиВ В-16 для твердофазной ферментации цеялюлозосодержащих отходов растениеводства И Смирнова И Э, Саубенова M Г, Очкасов В А Опубл 15 08 2000

ТУЖЫРЫМ Смирнова Ирина Эльевна Целлюлолитикалык бактерияларды тэжербиеде колданудьщ физиологиялык жэне популяциялык, иепздер!

Целлюлолитикалык бактериялардыц физиологаяльщ-биохимиялык, ерекшешкгерт зерттеу, микроорганизмдердщ бул тобын тэжербиеде колдану мумюндт бары керсетщщ, сондык;тацда колдану саласьша сай келетш касиеттерге ие жаца штаммдарды белш алуды кажет етп Целлюлолитикалык, бактерияларды Алматы облысында эртурлг таралу кездершен къткднды жэне жапыракты агаштардьщ сурегшен, бунакденелшердщ экскрементгер1 мен шектершен, сапалы сурлемнен, есшдис тамырларыньщ ризосфераеынан белшш алынды К,азыргы уак,ытта ертеректе жасалган микроорганизмдер коллекдиясы турл1 таксономиялык, топтарга жататын Cellulomonas, Bacillus, Pseudomonas, Bacterium, Brevibacterium туыстыктарыныц 350 штаммымен кецейтщщ

Лабораторияда дамьггылтан целлюлозасы бар заттарды катты фазалы ферменттеу тэсш азыктыц жугымдылыгы мен сак,талуьш арттырады Азык, корекшпгш артгыру максатында целлюлолитикалык фермееттер тузумен катар атмосферадагы молекулалык, азотгы беютетш жэне азъщка косымша азотты заттарды к,оспай микро&гык, протеиндермен байыту кабылетше ие 128 бактерия штаммдары сурыпгалынып, коллекцияга косылды Целлюлолитикалык, бактериялардьщ аталган штаммдары непзшен Bacillus, Pseudomonas, жене Bacterium туыстыктарына жатады Бул штаммдарды колдану курамында жалпы азоты 2,0 есе жогары азык алуга мумкшдк береда

Топырактагы микробиологиялык, процесстерда арттыруда жене оны ешдштщ тутынуьша жещл азотпен байыту ушш бцшш рет жер айдардьщ алдында сабанды бактеризациялауга целлюлолитикалык; азотбекшаш бактериялар колданылды Осы мелиоративтж-к,унарландыргьш теадщ колдану курил еншш вегетацияныц б1ршш1 жылы 36%, екшш! жылы 28% арттырады.

Bacterium, Brevibacterium жэне Flavibactenum туыстыгына жататын, каротин тузш, азытьщ биологалык кундылыгын жогарылататын 86 целлюлолитикалык; бактерилар белшш алынып, сурыпталып, колекцияга енгашд1 Аталган бактериялармен всшджшаруашылышныц калдыктарын к,атшфазалы ферменттегенде ацтык, еншде каротин мелшерш ею еседен квп арттыруга мумкдак береда

Bipimm рет жогарг сатыдагы всгмдосгердщ дэндершщ енуше, всш-дамуьш арттыру ушш тукым себер алдында оларды целлюлолитикалык, бактериялармен инокуляцилау тишдшт кврсетщд1 Тукымньщ шыгуы орта есегшен 35-37% артады

Тэжербиеде к,олдану ушш жартьшайуздшпз культивация жагыдайында автосурыптау арк.ылы суткзишкыдды жене целлюлолитикалык, бактериялардьщ аралас культуралары жасалынды

Целлюлозасы бар шиызаттан азык,тык, белок алу ушш жогары целлюлозалык, белсендж жене еншдипкпен сипатгалатын целлюлолитикалык, бактериялар мен ашьшдылардын аралас культурасы жасалынды

-SI —

SUMMARY Smirnova Irina Elyevna Physiological and population aspects for the practical using of ceilulolytic bacteria

The physiologo-biochemical propertyes of ceilulolytic bacteria has been proposed the perspective practical using of this group microorganisms. The employ of ceilulolytic bacteria has been required to isolate new strains with necessary abihtyes

New strains this bacteria were isolated from diffirent natural substrates Aimaty's region from decomposing woods, intestines of insects, silages, rhizosphere of plants In that time we have been created a culture collection of ceilulolytic bactena, including more then 350 strains, different taxonomy, beet in order to connect with genera Bacillus, Bacterium, Brevibacterium, Cdlulomonas, Flavobactermm and Pseudomonas

We have developed a method for sohd-state fermentation on cellulosecontainmg wastes (wheat or nee straw, sunflower residue, crop hask and others) to obtain a feed product for animal with good eating Biological value and nourishing of this feed was state on the native substrates In order to increase the value of nutation we isolated some ceilulolytic bactena that can both fix atmospheric nitrogen and use cellulose as their sole carbon source The use of strain Bacillus cytaseus 21/2 for the sohd-state fermentation of wheat straw allows to obtain a feed product with two-fold mcrease m protein contents The ceilulolytic nitrogenfixing bacteria also used to improve soil by feeding on crop residues left in the nee field The mcrease of nee yield on the 36% for the first year and 28% for the second year comparatively with control has been shown The strains facultative-anaerobic, cellulosefeimentmg carotensynthesizing bactena, perspective for feed production have been isolated from silages The vanants with high carotene synthesis genera Brevibacterium and Flavobactermm has been obtained The method of mcrease carotene contents in fennentative crop residues with help bactena having carotenesynthesizing activity is proposed The use of this method allow to twofold mcrease carotene level comparatively with native cellulose-containing crop residues

For the first time we have developed a method for biological stimulation of germination of seeds and growth of plants This method to obtain increase of germination of seeds and growth of plants with the help of bactena genera Cellulomonas and Bacillus The ceilulolytic activity and synthesis biological activity substances of this bactena has been proposed The use of tin's method allows to stimulate the germination of seads by 35-37%, to mcrease the amount of roots - by 35-40%, the average length of roots - 45-47% and that of pedicels - by 12-15%

The stability and productive consortium of microorganisms mcluded ceilulolytic and acidolactic bactena for the effective solid-state fermentation has been creted

Association of ceilulolytic bactena and fodder yeasts for the production protein on the cellulose-containing wastes have been obtained The practical using this association mcrease protein contents and the cellular activity more then two-fold

Подписано в печать 19 10 2000 г Формат 60x84'Аб Бумага офсетная Учет-изд л 2,8 Тираж ЮОэкз Заказ №97

Типография «Комплекс» г Апматы, ул Курмангазы, 29

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Смирнова, Ирина Эльевна

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ,

СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Использование целлюлолишческих бактерий в биотехнологии.

1.2 Взаимоотношения между целлюлолитическими бактериями и высшими растениями.

1.3 Природные микробные ассоциации и смешанные культуры целлюлолитических бактерий.

2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3 ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИЕ АЗОТФИКСИРУЮГЦИЕ БАКТЕРИИ И ПРИМЕНЕНИЕ ИХ ДЛЯ БИОКОНВЕРСИИ ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩИХ СУБСТРАТОВ.

3.1 Влияние условий культивирования на рост и ферментативную активность целлюлолитических и азотфиксирующих бактерий.

3.2 Исследование целлюлазного комплекса азотфиксирующих бактерий.

3.3 Исследование нитрогеназной активности целлюлолитических бактерий.

3.3.1 Ассимиляция атмосферного и нитратного азота целлюлолитическими бактериями при их выращивании на отходах растениеводства.

3.3.2 Влияние дополнительных факторов питания на развитие и азотфиксирующую способность целлюлолитических бактерий.

3.3.3 Влияние микроэлементов на развитие и азотфиксирующую способность целлюлолитических бактерий.

3.4 Автоселекция целлюлолитических азотфиксирующих бактерий в условиях полунепрерывного культивирования.

3.5 Твердофазная ферментация отходов растениеводства с использованием целлюлолитических азотфиксирующих бактерий.

3.6 Использование целлюлолитических азотфиксирующих бактерий в мелиоративно-удобрительных целях.

4 ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИЕ КАРОТИНСИНТЕЗИРУЮЩИЕ БАКТЕРИИ И ВОЗМОЖНОСТЬ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

В КОРМОПРОИЗВОДСТВЕ.

4.1 Кинетические характеристики роста целлюлолитических каротинсинтезирующих бактерий.

4.2 Антимикробные свойства целлюлолитических каротинсинтезирующих бактерий и их чувствительность к антибиотикам.

4.3 Биосинтез витаминов группы В целлюлолитическими каротинсинтезирующими бактериями.

4.4 Экскреция свободных внеклеточных аминокислот целлюлолитическими каротинсинтезирующими бактериями.

4.5 Исследование целлюлазной активности каротинсинтезирующих бактерий.

4.6 Исследование каротиногенеза целлюлолитических бактерий

4.6.1 Влияние длительности и температуры культивирования целлюлолитических бактерий на биосинтез каротина.

4.6.2 Влияние источников углерода и азота на биосинтез каротина целлюлолитическими бактериями.

4.6.3 Зависимость биосинтеза каротина целлюлолитическими бактериями от содержания микроэлементов и витаминов в среде.

4.7 Твердофазная ферментация растительного сырья с использованием целлюлолитических каротинсинтезирующих бактерий.

4.8 Использование вторичного роста целлюлолитических каротинсинтезирующих бактерий для селекции более активных штаммов.

4.8.1 Условия формирования и характеристика вторичных колоний бактерий.

4.8.1.1 Влияние густоты посева и размера первичных колоний у целлюлолитических каротинсинтезирующих бактерий.

4.8.1.2 Характер распределения вторичных колоний на первичных колониях целлюлолитических каротинсинтезирующих бактерий.

4.8.1.3 Влияние температуры культивирования на частоту образования вторичных колоний бактерий.

4.8.1.4 Влияние значений рН среды на частоту возникновения колоний вторичного роста бактерий.

4.8.1.5 Влияние источников углерода на частоту образования вторичных колоний бактерий.

4.8.1.6 Влияние источников азота на частоту формирования вторичных колоний бактерий.

4.8.1.7 Влияние компонентов среды на индукцию вторичного роста бактерий.

4.8.2 Сравнительное исследование исходных и вторичных культур целлюлолитических каротинсинтезирующих бактерий.

4.8.2.1 Влияние антибиотиков на исходные и вторичные культуры бактерий.

4.8.2.2 Кинетические характеристики роста исходных и вторичных культур бактерий.

4.8.2.3 Влияние металлов на исходные и вторичные культуры бактерий.

4.8.2.4 Витаминобразующая способность исходных и вторичных культур бактерий.

4.8.3 Каротиногенез субкультур вторичного роста.

ВЗАИМООТНОШЕНИЕ ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ С ВЫСШИМИ РАСТЕНИЯМИ.

5.1 Выделение и характеристики целлюлолитических бактерий, используемых для инокуляции семян высших растений.

5.2 Влияние целлюлолитических бактерий на всхожесть семян и развитие проростков высших растений.

5.3 Влияние целлюлолитических бактерий на образование корней высшими растениями.

5.4 Влияние длительности инокуляции целлюлолитическими бактериями на всхожесть семян и развитие проростков.

5.5 Влияние инокуляции целлюлолитическими бактериями на стерильные и нестерильные семена высших растений.

5.6 Влияние продуктов метаболизма целлюлолитических бактерий на рост эпифитной микрофлоры семян высших растений.

5.7 Влияние клеток целлюлолитических бактерий и их метаболитов на высшие растения.

5.8 Влияние культуральной жидкости целлюлолитических бактерий на рост и развитие высших растений.

5.9 Биологически активные вещества целлюлолитических бактерий, перспективных для применения в агробиологии.

5.9.1 Биосинтез витаминов группы В целлюлолитическими бактериями.

5.9.1.1 Влияние витаминов группы В и продуктов метаболизма целлюлолитических бактерий на развитие проростков.

5.9.2 Экскреция свободных внеклеточных аминокислот целлюлолитическими бактериями.

5.9.2.1 Ассимиляция свободных внеклеточных аминокислот целлюлолитических бактерий высшими растениями.

5.10 Влияние высших растений на целлюлолитические бактерии .201 5.10.1 Адаптация целлюлолитических бактерий к высшим растениям.

5.11 Применение целлюлолитических бактерий в полевых условиях.

6 ЕСТЕСТВЕННЫЕ И ИСКУССТВЕННЫЕ АССОЦИАЦИИ

ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ.

6.1 Кинетические характеристики роста природных микробных ассоциаций целлюлолитических бактерий.

6.2 Деградация целлюлозы и целлюлазная активность природных микробных ассоциаций целлюлолитических бактерий.

6.3 Исследование влияния бактерий-спутников природной ассоциации на рост и развитие целлюлолитических бактерий.

6.4 Азотфиксирующая активность природных микробных ассоциаций.

6.5 Влияние микроэлементов на накопление биомассы и ферментативную активность природной микробной ассоциации целлюлолитических бактерий.

6.6 Получение устойчивой и продуктивной ассоциации микроорганизмов для биоконверсии целлюлозосодержащего сырья.

6.7 Смешанные культуры целлюлолитических бактерий и дрожжей для получения кормового белка на отходах растениеводства.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Физиологические и популяционные основы практического применения целлюлолитических бактерий"

Актуальность проблемы. Растительный покров Земли составляет 1800 млрд. т сухого вещества. Целлюлоза является главной составной частью растительного материала. Синтез ее по своим масштабам превосходит синтез всех других природных соединений. Такое большое количество целлюлозы в природе обуславливает важную роль разлагающих ее микроорганизмов в процессах минерализации и в круговороте углерода. Микробиологическая конверсия возобновляемых ресурсов биосферы, в огромных количествах попадающих в отбросы, в различные полезные продукты в настоящее время представляет собой одну из важнейших проблем, чем и определяется неослабевающий интерес к целлюлозоразрушающим микроорганизмам. Основная проблема, связанная с утилизацией лигноцеллюлоз-ных отходов, состоит в том, что целлюлоза очень устойчива к различным воздействиям. Поэтому ежегодно в различных лабораториях мира исследуются штаммы микроорганизмов с целью изыскания новых, с более высоким уровнем биосинтеза^ целлюлаз, а также разрабатываются биотехнологические способы использования целлюлозы и, в первую очередь, целлю-лозосодержащих отходов растениеводства.

Институтом микробиологии и вирусологии Министерства Образования и Науки Республики Казахстан предложен и внедрен способ получения кормовых продуктов для животноводства из целлюлозосодержащих отходов растениеводства /1-4/. Этот способ предусматривает использование целлюлозоразлагающих бактерий, создающих в ферментируемой массе необходимый сахарный минимум и, вследствие этого, благоприятные условия для развития молочнокислых бактерий и накопления молочной кислоты, что способствует получению корма с 80 - 100%-ной поедаемостью и хорошей сохранностью. Для создания генофонда взаимозаменяемых организмов-продуцентов целлюлаз, отличающихся высоким уровнем практически ценных показателей, была создана коллекция целлюлолитических бактерий и исследованы их физиолого-биохимические особенности в разных условиях культивирования, а также изучены бактерии-спутники, в том числе обеспечивающие их азотом за счет его фиксации из атмосферы /3/.

В настоящее время не подлежит сомнению большая перспективность применения смешанных культур микроорганизмов как природных ассоциаций, так и созданных экспериментатором и сочетающих производственно полезные качества отдельных штаммов. Поэтому для более глубокой конверсии различных отходов агропромышленного комплекса, представляющих собой сложные субстраты, необходимо изыскание природных микробных ассоциаций, а также создание смешанных культур, отвечающих этим требованиям.

Поскольку целлюлолитические бактерии являются важным звеном в круговороте углерода в природе и существенной частью экосистемы, представляется перспективным исследование возможности их применения в других отраслях биотехнологии.

Цель и задача исследований.

Целью настоящей работы является разработка научных основ практического применения целлюлолитических бактерий: повышение питательной и биологической ценности кормовых продуктов, получаемых путем микробной трансформации возобновляемого сырья путем использования новых штаммов-продуцентов протеина и других биологически активных веществ; более глубокая конверсия отходов растениеводства путем использования природных ассоциаций целлюлолитических бактерий и экспериментально созданных смешанных культур бактерий с более высокой физиоло-го-биохимической активностью; разработка новых способов использования целлюлолитических бактерий в различных областях биотехнологии, в частности, агробиологии и почвоведении.

В задачу исследований входило:

1. Поиск новых штаммов бактерий продуцентов целлюлолитических ферментов, биологически активных веществ, а также штаммов, обладающих способностью к фиксации азота атмосферы при росте на целлюлозе и исследование возможности использования их для биоконверсии отходов агропромышленного комплекса в кормовые продукты с повышенной питательностью и биологической ценностью.

2. Повышение эффективности процессов биоконверсии различных субстратов путем использования природных ассоциаций и смешанных культур микроорганизмов.

3. Поиск новых штаммов целлюлолитических бактерий для использования в агробиологии, а именно для биологической стимуляции всхожести семян и роста растений, а также новых штаммов бактерий для использования в мелиоративно - удобрительных целях в рисосеянии.

4. Разработка новых способов использования целлюлолитических бактерий в различных областях биотехнологии, в частности, агробиологии и почвоведении.

5. Исследование физиолого-биохимических особенностей новых перспективных штаммов целлюлолитических бактерий и их природных ассоциаций с целью управления их ферментативной активностью и продуктивностью.

Научная новизна. Выделены и изучены новые штаммы целлюлолитических бактерий рода Bacterium, Bacillus, Brevibacterium и Flavobacterium, в том числе способные к фиксации молекулярного азота атмосферы и синтезу биологически активных веществ, в частности, р-каротина.

Впервые показана возможность получения кормового продукта для животноводства с повышенными показателями питательности и биологической ценности за счет использования новых штаммов.

Показана возможность повышения эффективности переработки лигно-целлюлозных субстратов путем использования природных микробных ассоциаций и применения смешанных культур микроорганизмов с предварительной адаптацией их друг к другу на уровне метаболитов и последующей автоселекцией ассоциаций в условиях полунепрерывного культивирования.

Впервые показана возможность применения целлюлолитических бактерий для повышения всхожести семян, стимуляции роста и развития растений сельскохозяйственных растений.

Впервые показано, что целлюлолитические бактерии, способные к фиксации молекулярного азота атмосферы, могут быть использованы в мелио-ративно-удобрительных целях в рисосеянии для повышения урожая

Практическая значимость. Использование отселекционированных целлюлолитических бактерий для биоконверсии целлюлозосодержащих отходов растениеводства (пшеничная, рисовая солома, стебли, листья, стержни кукурузы) позволяет получать кормовые продукты с повышенными показателями поедаемости, переваримости и питательности.

Разработан способ повышения питательности целлюлозосодержащих отходов растениеводства методом твердофазной ферментации за счет использования целлюлолитических азотфиксирующих бактерий, синтезирующих протеин и биологически активные вещества (витамины группы В и свободные аминокислоты) (Патент Республики Казахстан №4028,1993).

Разработан способ обогащения кормовых продуктов Р-каротином путем твердофазной ферментации отходов растениеводства целлюлолитиче-скими каротинсинтезирующими бактериями (Предварительный патент Республики Казахстан №9314,2000).

Разработан способ использования целлюлолитических бактерий для биологической стимуляции всхожести семян и роста растений агротехнических культур (Патент Республики Казахстан №4900, 1993; Предварительный патент Республики Казахстан №8751, 2000).

Разработан способ применения целлюлолитических бактерий в мелио-ративно-удобрительных целях на засоленных почвах под культуру риса (Авторское свидетельство СССР №1740358,1992).

На опытно - промышленной установке Института микробиологии и вирусологии Министерства Образования и Науки Республики Казахстан наработан препарат целлюлолитических каротинсинтезирующих бактерий в виде сухой закваски, который был передан для производственного испытания в Оренбургский Государственный Аграрный Университет. Получены результаты о положительном эффекте применения данных целлюлолитических бактерий.

На защиту выносятся положения:

1. Физиолого-биохимические свойства новых штаммов факультативно-анаэробных ацидотолерантных целлюлолитических бактерий позволяют использовать их для конверсии различных отходов растениеводства в кормовой продукт с повышенной питательностью и биологической ценностью.

2. Использование природных ассоциаций целлюлолитических бактерий и их смешанных культур с молочно-кислыми бактериями и дрожжами интенсифицирует процессы биоконверсии различных субстратов в кормовые продукты, предварительная адаптация микробных ассоциантов друг к другу на уровне метаболитов и последующая автоселекция адаптированных клеток в условиях полунепрерывного культивирования повышает их продуктивность.

3. Целлюлолитические бактерии в силу своих биохимических особенностей, а именно способности к синтезу гидролаз и биологически активных веществ, являются стимуляторами всхожести семян и роста растений.

4. Процессы биодеградации целлюлозы в почве под воздействием внесенных извне целлюлолитических бактерий способствуют благоприятному мелиоративно-удобрительному эффекту при развитии культуры риса. Применение новых штаммов целлюлолитических азотфиксирующих бактерий значительно усиливает положительный эффект за счет снабжения растений легкоусваиваемыми формами азота.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, раздела, включающего описания объектов исследования и методики работ, 4 разделов, содержащих результаты экспериментальных исследований автора, заключения, выводов, списка цитированной литературы (463 названия работ) и 5 приложений. Диссертация изложена на 296 страницах текста; содержит 64 таблицы и 71 рисунок.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Смирнова, Ирина Эльевна

ВЫВОДЫ

1. Выделены и изучены новые штаммы бактерий рода Bacillus, Pseudomonas и Bacterium, обладающие способностью деградировать целлюлозу и одновременно фиксировать молекулярный азот атмосферы.

2. Разработан способ ферментации целлюлозосодержащих отходов растениеводства штаммом целлюлолитических азотфиксирующих бактерий Bacillus cytaseus 21(2)AS с получением кормового продукта с повышенным содержанием протеина. При этом содержание общего азота возрастает в два раза по сравнению с контролем, а количество сырого протеина увеличивается до 3,75% (Патент Республики Казахстан №4028, опубл. 16.12.96г).

3. Изучен состав ферментов целлюлазного комплекса бактерий Bacillus cytaseus 21(2) AS, обладающих способностью фиксировать молекулярный азот атмосферы. Показано, что в целлюлазном комплексе бактерий присутствуют эндо-1,4-р-глюканаза, целлобиогидролаза и р-глюкозидаза.

4. Впервые для повышения мелиоративно-удобрительного действия соломы, запахиваемой под культуру риса, применили целлюлолитические бактерии, способные фиксировать азот атмосферы. Отобран штамм Bacillus cytaseus 21(2)AS, способствующий повышению урожайности риса в первый год вегетации на 36%, а на второй год - на 28%.

5. Выделены и изучены новые штаммы целлюлолитических бактерий рода Bacterium, Brevibacterium и Flavobacterium, способные синтезировать каротин при росте на целлюлозосодержащем сырье.

6. Разработан способ ферментации отходов растениеводства новыми целлюлолитическими каротинсинтезирующими бактериями Brevibacterium erythra 38KCS, позволяющий увеличивать содержание каротина в кормовом продукте в два раза при одновременном снижении трудногидролизи-руемых (на 30 - 35%) и легкогидролизируемых (на 40 - 45%) полисахаридов исходного сырья (Предварительный патент Республики Казахстан №9314, опубл. 15.08.2000г).

7. Впервые для увеличения активности синтеза каротина у целлюлолитических бактерий применен метод селекции клеток из колоний вторичного роста. Получены субкультуры, отличающиеся по морфологическим и физиолого-биохимическим свойствам от исходных культур. Биосинтез каротина у субкультур бактерий рода Brevibacterium увеличился на 64 - 75%, а у субкультуры Flavobacterium aurantiacum 81/3KCS - на 63%. Полученные варианты перспективны для использования на практике.

8. Впервые показана возможность использования целлюлолитических бактерий рода Bacillus и Cellulomonas в агробиологической практике в качестве стимуляторов всхожести семян и роста проростков высших растений.

9. Разработаны способы биологической стимуляции всхожести семян и роста растений, основанные на предпосевной инокуляции семян целлюлолитическими бактериями Cellulomonas biazotea 150ВА и Bacillus cytaseus 21(2)AS. Бактеризация семян высших растений приводит к повышению их всхожести на 35 - 37%, увеличению числа корней на 35 - 40%, длины корней - на 45 - 47%, длины стебля - на 12 - 15% (Патент Республики Казахстан №4900, опубл. 15.08.97г; Предварительный патент Республики Казахстан №8751, опубл. 14.04.2000г).

10. Путем автоселекции в полунепрерывных условиях получена устойчивая ассоциация адаптированных на уровне метаболитов целлюлолитических и молочнокислых бактерий, перспективная для повышения продуктивности твердофазной ферментации различных отходов растениеводства.

11. Предложена смешанная культура целлюлолитических бактерий и дрожжей для прямой конверсии отходов растениеводства в кормовой белок, характеризующаяся высокими показателями целлюлазной активности и продуктивностью.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Смирнова, Ирина Эльевна, Алматы

1. А.С. № 1221240 СССР. Штамм бактерий Cellulomonas flavigena 22 продуцент целлюлолитических ферментов С. и Сх, используемый для силосования соломы //Илялетдинов А.Н., Саубенова М.Г., Харитонова Т.А. Опубл. 01.12.85.

2. Саубенова М.Г., Пузыревская О.М. Твердофазная ферментация целлюлозосодержащих субстратов //Тез. докл. Всесоюзн. конф. по микробиологическим и биотехнологическим основам интенсификации растениеводства и кормопроизводства. Алматы,1990.-С.72.

3. Саубенова М.Г. Физиологические и популяционные аспекты повышения устойчивости и продуктивности процессов микробной конверсии возобновляемого сырья: Автореф. дис. докт. Ташкент,1991.-50 с.

4. Смирнова И.Э. Ацидотолерантные, факультативно-анаэробные целлюлолитические бактерии, перспективные для использования в биотехнологии: Автореф. дис. канд. Алматы, 1992. - 25 с.

5. Матвеев В.Е. Микробиологическая технология новое научное направление биотехнологии //Биотехнология. - 1985. - № 1. - С. 614.

6. Бекер М.Е. Трансформация продуктов фотосинтеза. Рига: Зинатне, 1984.-246 с.

7. Бекер М.Е. Новые направления биоконверсии //Микробная конверсия: Фундаментальные и прикладные аспекты. /Сб. научн. тр. -Рига, 1990.-С. 5-13.

8. Олешко B.C., Стахеев И.В., Бабурин Т.Я. Рост дрожжей на отходах переработки растительного сырья. //Биотехнология. 1986. - №3. -С. 24-28.

9. Залашко М.В., Салохина Г.А., Шамгина Г.В., Грушенко М.М. Влияние источников углерода на биосинтетическую активность микроорганизмов. //Микробиология. 1990. -Т. 59, вып. 6. - С. 10101014.

10. Скрябин Т.К. Проблемы биоконверсии растительного сырья. М.: Наука, 1986. - 296 с.

11. Tangnu J.K. Enzymatic hydrolysis of cellulosic substrates //Prac. Biochem. 1982.-Vol. 18.-P. 48-63.

12. Wilson P.N., Brigstocke Т. Re-cycling farm waste for animal feed //Agric. Prog. 1977. - Vol. 52. - P. 49-58.

13. Wilson P.N., Brigstocke T. The commercial straw process //Process Biochem. 1977. - Vol. 12. - P. 17-21.

14. Авров O.E., Мороз З.М. Использование соломы в сельском хозяйстве. -Л.: Колос, 1979. 200 с.

15. Стейнифорд А. Р. Солома злаковых культур. М.: Колос, 1983. -191с.

16. Быков В.А., Манаков М.Н., Панфилов В.И. и др. Производство белковых веществ. М.: Высш. шк., 1987. - 141с.

17. Wilkinson J.M. Possibilities for processing straw for animal feed // Report of Conferens on straw utilization. MAFF /ADAS. Oxfor, 1997. - 646 p.

18. Имшенецкий А.А. Микробиология целлюлозы. M.: AHCCCP, 1953. - С. 24-26.

19. Осадчая А.И., Подгорский B.C., Семенов В.Ф. и др. Биотехнологическое использование отходов растениеводства. -Киев:Наукова думка, 1990. 95 с.

20. Имшенецкий А. А. Микробиология анаэробного разложения целлюлозы //Микробиология. 1939. - Т. 8, вып. 2. - С. 129-141.

21. Фениксова Р.В. Целлюлаза микроорганизмов, ее свойства и практическое применение //Ферментативное расщепление целлюлозы /Сб. научн. тр. М., 1967. - С. 5-15.

22. Наплекова Н.Н. Аэробное разложение целлюлозы микроорганизмами в почвах Западной Сибири. Новосибирск: Наука, 1974. - 250 с.

23. Лобанок А.Г., Бабицкая В.Г. Микробиологический синтез белка на целлюлозе. Минск: Наука и техника, 1976. - 232 с.

24. Лобанок А.Г., Бабицкая В.Г., Богдановская Ж.Н. Переработка целлюлозосодержащих отходов в ценные продукты с помощью микроорганизмов //Обзорная информация. 1981. - Вып. 4. - 43 с.

25. Клесов А.А., Рабинович М.Л. Ферментативный гидролиз целлюлозы //ИНТ АН СССР. Сер. биол. химия. 1978. - Т. 12. - С. 49-91.

26. Билай В.И. Биология целлюлозоразрушающих грибов //Проблемы биоконверсии растительного сырья /Сб. научн. тр. М., 1986. - С. 629.

27. Лаукевиц Я.Я., Алейте Л.Ф., Лейте М.П., Виестур У.Э. Биоконверсия целлюлозолигниновых материалов //Трансформация продуктов фотосинтеза /Сб. научн. тр. Рига, 1984. - С. 116-134.

28. Гернет М.В. Регуляция биосинтеза целлюлолитических ферментов при глубинном и поверхностном способах культивирования микроорганизмов //Биотехнология. 1985. - №4. - С. 27-37.

29. Скрябин Г.К., Головлев Е.Л. Вклад микробиологии в современную биологию. М.: Наука, 1987. - 308 с.

30. Логинова Л.Г. Термостабиольные целлюлазы и термофильные микроорганизмы //ИНТ АН СССР. Сер. Биотехнология. 1988. - Т. 10.-С. 72-96.

31. Логинова Л.Г. Микробиологические аспекты сверхсинтеза ферментов микроорганизмами //Известия АН СССР , сер. биол. -1989.-№5. -С. 682-688.

32. Родионова Н.А. Ферменты микроорганизмов, устойчивые к экстремальным условиям: физико-химические свойства и применение. //ИНТ АН СССР. Сер. Биотехнология. 1989. - Т. 19. -С. 1-195.

33. Halsall D. М., Gibson А.Н. Cellulase complex enzymes by diazotrophic bacteria //J. Gen. Microbiol. 1987. - Vol. 133, №4. - P. 1033-1041.

34. Fkanke F. Uber die biologie und den structuren von celluloseabau durch mikroorganismen //LDA Rasch. - 1989. - №3. - P. 38-42.

35. Gould J.M. Biochemistry of cellulose breakdown by cellulolytic bacteria //Biochem Soc. Trans. 1990. - Vol. 12. - P. 1142-1144.

36. Gilbert H., Harlewood G. Bacterial cellulases and xylanases //J. Microbiol. 1993. - Vol. 139, №2. - P. 187-194.

37. Stallwege L., Cox C. Microbial utilization of a cellulose wasters //Proc. Roy. Soc London B. 1997. - Vol. 264, №1380. - P. 364-368.

38. Birsan C., Joshi M. Enzymatic activity of cellulase by cellulolytic microorganisms on lignocellulosic materials //Enzym. and Microb. Technol. 1998. - Vol. 20, №3. - P. 36-42.

39. Клесов А.А. Современное состояние проблемы ферментативной переработки целлюлозы в сахар и спирт за рубежом //Прикл. биохим. и микробиол. 1985. - Т. 21, вып. 2. - С. 269-283.

40. Hartley R., King N., Swith G. Modified wood waste and straw as potential components of animal feeds //J. Sci. Food Agric. 1974. - Vol. 25. - P. 7433.

41. Бейлин М.И., Ждан А.Б. Производство, сырьевые ресурсы и эффективность использования высокопротеиновых кормов в Укр. СССР //Обзорная информация. 1978. - Вып. 34. - 36 с.

42. Авров О.Е., Мороз З.М. Использование соломы и половы на корм животным. J1.: Колос, 1996. - 78 с.

43. Репка В.П., Бейлин М.И., Ровенский В.Т. и др. Эффективность использования рисовой соломы как источника производства белково-витаминных дрожжей //Вопр. химии и хим. технологии. 1982. -Вып. 67.-С. 12-16.

44. Staniforth A. Cereal straw production and utilization in England. -London: Inderscience, 1993. 98 p.

45. Ровенский В.Т., Сокол Е.И., Дружинина Г.И. Изучение превращений целлюлозы пшеничной соломы в уксусно-кислых растворах серной кислоты //Химия древесины. 1986. - №5. - С. 18-22.

46. Ровенский В.Т., Сокол Е.И., Дружина Г.И и др. Изучение особеннностей процесса гидролиза гемицеллюлозы пшеничной соломы в концентрированных растворах серной кислоты //Вопр. химии и хим. технологии. 1987. - Вып. 83. - С. 83-88.

47. Arayjo A., Ward О.Р. Hemicellulases of Bacillus sp.: preliminary comprative studies on production and properties of manases and galactanases //J. Appl. Bacteriol. 1990. -Vol. 686, №3. - P.253-261.

48. Beguin P., Alzari P, Renekh J. //Utilization of lingocellulosic wastes //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, develop, biol. 1999. - Vol. 96. - P. 86488660.

49. Han J. W., Anderson A. Semisolid fermentation of bagasse and other crop residues //Appl. Microbiol. 1975. - Vol. 30, №6.- P. 683-685.

50. Torre de la M., Campillo C.C. Isolation and characterization of a cellulolytic bacterial from crop recidues //Int J. Syst. Bacteriol. 1984. -Vol. 34, №4.-P. 438-440.

51. Gould J.M. Bacterial treatment of crop residues //Bioprocess Technol. -1990.-Vol. 12, №1.-P. 78.

52. Баринова Н.Г., Де-Милло JI.E., Семушина Т.Н. и др. Использование мелкого волокна целлюлозы в производство биомассы //Кормовые продукты на основе гидролиза древисины /Сб. научн. тр. Л., 1993. -58-63 С.

53. Vlaev S., Djejeva G., Rayhoovska V., Schiigerl К. Cellulose production by Trichoderma sp. grown on corn fibre substrate //Process Biochem. -1997. Vol 32, №7. - P. 561-565.

54. Бекер M.E. Биотехнология микробного синтеза. Рига: Зинатне, 1980.-350 с.

55. Серенко Л.А., Козицкая В.Н., Саневич А.И и др. Использование водорослей для целей биоконверсии, его задачи, перспективы //Биотехнология. 1988. - Т. 4, №6. - С. 781-784.

56. Тен Хак Мун, Кондратьева Л.М., Гаретова Л.А. О возможности использования макрофитов для микробиологического синтеза //Биология моря. 1987. - №6. - С. 56-60.

57. Тен Хак Мун, Кондратьева Л.М., Гаретова Л.А. Штормовые выбросы морских водорослей и трав как сырье для биоконверсии //Биотехнология. 1989. - Т. 5, №1. - С. 78-80.

58. Parekh S.R., Parekh R.S., Wayman М. Ethanolic fermentation of wood-derived cellulose hydrolysates by Zymononas mobilis in a continuous dynamic immobilised biocatalyst bioreactor //Process Biochem. 1989. -Vol. 24, №3. - P.88-91.

59. Скрябин Т.И., Головлева Л.А., Редикульцев Ю.В. и др. Глубинная твердофазная ферментация соломы и опилок //Микробиология. -1986. Т. 55, вып. 6. - С. 976-982.

60. Репях С.М., Левин Э.Д. Комовые добавки из древесной зелени М.: Лесн. пром-сть, 1988. - 96 с.

61. Вяйзенен Г.Н., Догуревич A.M., Лескин В.И. и др. Использование промышленных отходов в животноводстве. Калиниград: Книжное изд-во, 1981.-12 с.

62. Осадчая А.И., Семенова В.Ф., Голивец Г.И. и др. Получение кормовых дрожжей на гидролизатах стеблей и клещевины //Биотехнология. 1988. - №4. - С. 57-61.

63. Gostakowska К., Szwed A., Wyczolkowski A.Proba kompostowania odpadow tytoniowych //Ann. UMCSE. 1996. - №51. - P. 191-199.

64. Yumin D., Dama Z., Lianshung Z. Study of pulping biochemistry of the cellulose by fibre crops //Chem. and Ind. forest Prod. 1998. - Vol. 18, №2. - P. 59-64.

65. Franke P. Celluloseabau dutch Microorganismen //LDF-Rasch. 1989. -№1.-3. 23-25.

66. Градова Н.Б., Касим-Заде И. Э., Винаров А.Ю. Сравнительная оценка эффективности способов биоконверсии гребней винограда //Биотехнология. 1991. - Т. 7, №1. - С. 85-88.

67. Thi Н. P., Tatsuo К., Yusaku F. Utilization of citrus-juice residue by cellulolytic bacteria //Kyushu Univ. 1999. - Vol. 43, №3-4. - P. 425432.

68. Звягинцев Д.Г. Деструкция органического вещества в почве //Тез. докл. Всесоюзн. совещания по микробиологической деструкции органических остатков в биогеонозах. М., 1987. - С. 42-44.

69. Goldman S., Azevedo М. Bioconvertion lignocellulose: potentials and limitations. Toronto: Nature Press, 1992. - 143 c.

70. Klyosov A.A. Trends in biochemistry and enzymology of cellulose degradation //Biochemistry. 1991. - Vol. 29, №47. - C.10577-10585.

71. Мартыненко Л.Ф. Перспективы получения кормов из отходов пищевых и технологических производств //Тез. докл. Междунар. конф. "Рациональные пути использования вторичных ресурсов агропромышленного комплекса". Краснодар, 1997. - С. 34-36.

72. Лаукевиц Я.Я., Апсите А.Ф., Лейте М.П. Лигноцеллюлоза: структура, состав и строение //Трансформация продуктов фотосинтеза /Сб. научн. тр. Рига, 1987. - С. 206-224.

73. Егоров Н.С., Ландау Н. С. Биосинтез биологически активных соединений смешанными культурами микроорганизмов //Прикл. биохим. и микробиол. -1982. Т. 18, вып.6. - С. 835-849.

74. Бекер М.Е., Лиепиньш Г.К., Райпулис Е.П. Биотехнология. М.: Агропромиздат, 1990. - 334 с.

75. Бабъева И.П. Экологическая оценка природных ресурсов для биотехнологии //Тез. докл. на Всесоюзн. конф. "Микроорганизмы в сельском хозяйстве". М., 1986. - С. 15.

76. Gosalbes М. J., Perez-Gonzalez J.A., Gonzalez R., Navarro A. Two p-glucanase genes are clustered in Bacillus polymyxa: Molecular doming,

77. Могутов M.A., Пушкарская T.A., Великодворская Г.А. Генетическая инженерия целлюлаз: современное состояние проблемы //Биотехнология. 1990. - №5 - С. 3-12.

78. Gonzalez A., Roberto A., Gomez J. Molecular cloning, expression of genes encoding Endo-l,4-p-glucanase //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, develop, biol. 1996. - Vol. 93. - P. 6659-6673.

79. Захаров И.Я., Кожина Т.Н. Генетическая инженерия у дрожжей //Молекулярные и клеточные основы биотехнологии /Сб. научн. тр. -Л, 1986.-С. 117-138.

80. Stellweg E.L., Brenchley L.E. Genetic engineering of microorganisms for biotechnology //Microbiol. Ecol. 1986. - №12. - P. 3-13.

81. Печуркин H.C. Брильков A.B., Марченкова T.B. Популяционные аспекты биотехнологии. Новосибирск: Наука, 1990. - 169 с.

82. Reese Е.Т., Maguire A. Increase in cellulase yields by addition of surfactants to cellobiose culture of Trichoderma viride //Dev. Industr. Microbiol. 1972. - №2. - P. 212.

83. Antey K.M., Mecaskey T.A., Litile I. Cellulose degestability of fibrous materials treated with Trichoderma viride cellulase //J. Dairy Sci. 1975. -Vol. 58.-P. 67-71.

84. Лобанок Л.Г., Бабицкая В.Г., Богдановская Ж.Н. Биоконверсия отходов растениеводства с помощью микроорганизмов //Обзорная информация. 1991. - Вып. 2. - 65 с.

85. Henderson A.R., Medonald P. The effect of cellulase preparation on the chemical changes during the ensilage of grass in laboratory sibos //J. Sci Food and Agr. 1977. - Vol. 29. - P. 486-490.

86. Лобанок А.Г., Бабицкая В.Г., Богдановская Ж.Н. Микробный синтез на основе целлюлозы: Белок и другие ценные продукты. Минск: Наука и техника, 1988. - 261 с.

87. Рабинович М.Л. Целлюлазы термофильных анаэробов //ИНТ АН СССР. Сер. Биотехнология. 1988. - Т. 10. - С. 207-219.

88. Ташпулатов Ж., Байбаев Б.Г., Абдуллаев Т. Целлюлозоразрушающая активность грибов, выделенных из почв и растительных остатков //Узб. биол. журн. 1990. -N 2. - С. 13-15.

89. Ташпулатов Ж., Байбаев Б., Мирзарахимова М. и др. Биосинтез целлюлаз и белка при смешанном культивировании Trichoderma harzianum-19 и Sacharomyces cerevisiae //Узб. биол. журн. 1990. - № 4.-С. 10-12.

90. Teeri Т.Т. New insight into the function of cellobiohydrolases //Trends Biotechnol. 1997. - Vol. 15, №5. - P. 160-167.

91. Гордон И.О. Жузе H.H. Координационное совещание по генетической инженерии целлюлаз //Биотехнология. 1986. -Т. 2, №1.-С. 139-141.

92. Билай В.И., Билай Т.И., Мусич Е.Т. Трансформация целлюлозы грибами. Киев: Наукова думка, 1982. - 265 с.

93. Ljungdahl L.G., Erikson К.Е. Ecology of microbial cellulose degradation //Adv. Microbiol. Ecol. 1985. - Vol. 8. - P. 237-299.

94. Квеситадзе Г.И., Квачадзе Н.Ш., Сихарулидзе Н.Ш., Нуцубидзе H.H. Микроорганизмы продуценты целлюлаз //ИНТ АН СССР. Сер. Биотехнология. - 1988. - Т. 11. - С. 150-223.

95. Бабицкая В.Г., Лобанок А.Г. Синтез протеина некоторыми грибами //Микроорганизмы в промышленности и сельском хозяйстве /Сб. научн. тр. -Минск, 1988. С. 33-58.

96. Иванова Т.А., Чернышевский Д.Н., Головлева Л.А. Твердофазная ферментация лигноцеллюлозных субстратов. Некоторые практические рекомендации //Биотехнология вторичных органических субстратов /Сб. научн. тр. Улан-Уде, 1990. - С. 2635.

97. Inigner-Covarrubias G., de la Torre-Mortiner M., Garron-Ibarguengoitia J.A. et al. Fermtntation characteristica of swine waste ensiled with wheat

98. Kudo K., Jakober K.D., Phillippe R.C. et al. Isolation and characterization of cellulolytic anaerobic fungi and associated mycoplasmas from the rumen of a steer fed a roughage diet //Can. J. Microbiol. 1990. Vol. 36, №7-P. 513-516.

99. Singh K., Linden J.C., Johnson D.E., Tengerdy R.R. Bioconversion of wheat straw to animal feed by solid substrate fermentation or ensiling //Indian. J. Microbiol. 1990. - Vol. 30, №2. - P. 201-208.

100. Venkatraman K., Singh K. Bioconversion of wheat straw with Collybia veluzipes // J. Nat. Conserv. 1991. - Vol. 3, №1. - P. 54-84.

101. Juszczakiewicz D, Olejniczak I. Biosynteza enzymow cellulitcycznych przer mutanty czezepy Aspergillus niger A.n. 33 //Pr. Inst, i lab bad przen. spoz. 1996. - Vol. 51. - P. 31-41.

102. Раудонене И., Варнайте P. Биоконверсия растительных отходов озимой ржи посредством микромицетов // Biologija. 1997. - №2. -С. 43-47.

103. Curelli N., Fadano М. В., Rescigno A. et al. Mild alkaline oxidative pretreatment of wheat straw //Prosess Biochem. 1997. - Vol. 32, №7. -C. 665-670.

104. Бабицкая В.Г., Щерба В.В., Осадчая О.В. Антиокислительная активность микро- и макромицетов деструкторов лигноциллюлозных субстратов. //Прикл. биох. и микробиол. - 1997. -Т 33, №5. - С. 559-563.

105. Патент РФ №2092559. Способ получения белковой биомассы //Колесников В.Ф. Опубл. 10.10.97.

106. Demis С. Breakdown of Cellulose by Yeast Species //J. Gen. Microbiol. -1972. Vol. 71, №2. - P. 409-414.

107. Грачева И.М., Ваганова M.C., Саловарова В.П. Образование целлюлаз почвенными дрожжами рода Trichosporon и микроскопическими грибами //Микробиология. 1978. - Т. 47, №2. -С. 226-229.

108. Дреймане М.А., Аспите А.Ф. Отбор быстрорастущих клонов при непрерывном культивировании Endomycopsis fibuligera-313 //Управление микробным синтезом /Сб. научн. тр. Рига, 1977. - С. 71-75.

109. Бекер М.Е. Концепция использования биотехнологии в кормопроизводстве и при переработке отходов ферм //Биотехнология кормопроизводства и переработки отходов /Сб. научн. тр. Рига, 1987.-С. 7-21.

110. Abdullah A.L. Optimization of solid substrate fermentation of wheat straw //Biotech, and Bioeng. 1985. - №1. - P. 20-27.

111. Осадчая А.И., Подгорский B.C., Семенов В.Ф. и др. Использование целллозосодержащих отходов сельского хозяйства и промышленности в биотехнологии. Киев: Наукова думка, 1998. - 53 с.

112. Barta Y. Novejsi poznatky о ziskawani kvasnicnych proteinu //Kwasny prum. 1998. - Vol. 44, №4. - P. 145-148.

113. Бекер М.Е. Биотрансформация целлюлозосодержащих субстратов //Микробная конверсия: Фундаментальные и прикладные аспекты /Сб. научн. тр. Рига, 1990. - С. 24-36.

114. Roberto I.C., Sabo S., de Mancilha I.M. Effect of inoculum level on cellulases and hemicellulases production from rice straw hydrolysate by Candida guilliermondii //J. Ind. Microbiol. 1996. -Vol. 16, №6. - P. 348-350.

115. Борисенко С.И. Научные основы развития животноводства Западной Сибири //Тез. докл. научн.-практ. конф. посвящен. 100 летию со дня рожд. И.И. Ухина. Омск, 1997. - С. 29-30.

116. Быков В.А., Манаков М.Н., Панфилов А.А. и др. Производство белковых веществ //Биотехнология. 1987. - Т. 3, №5. - С. 142-146.

117. Эрнст JI.K. Значение производства кормового микробного белка для сельского хозяйства СССР //Тез. докл. Всесоюзного межотрасл. конф. «Получение и применение кормового микробного белка». М., 1989.-С. 6-14.

118. Mateles R. I., Baznah Y. N., Tannebaum S. R. Growth of thermophilic bacterium on hydrocarbons. A new Source of single-cell protein //Science. 1967. - Vol. 157. - P. 3794 - 3796.

119. Лобанок А.Г., Бабицкая В.Г. Микроскопические грибы -продуценты белка на целлюлозе //Микроорганизмы в промышленности и сельском хозяйстве /Сб. научн. тр. Минск, 1988.-С. 70-76.

120. Бекер М.Е. Интенсификация прямой микробной биоконверсии растительных материалов //Тез. докл. Всесоюзн. симпоз. «Биоконверсия растительного сырья». Рига, 1982. - С. 3-4.

121. Бекер М.Е. Биоконверсия растительного сырья и области ее применения //Трансформация продуктов фотосинтеза /Сб. научн. тр. -Рига, 1984.-С. 11-25.

122. Двойченкова Е.Ю., Кантере В.М. Биоконверсия отходов плодовоовощной продукции //Биотехнология. 1985. - N 5. - С. 5963.

123. Скрябин Г.К. Биоконверсия растительного сырья: Проблемы и перспективы //Микробиология и биохимия разложения растительных материалов /Сб. научн. тр. М., 1988. - С. 5-38.

124. Лобанок А.Г., Бабицкая В.Г. Богдановская Ж.Н. Синтез протеина на целлюлозосодержащих субстратах //Микроорганизмы в промышленности и сельском хозяйстве /Сб. научн. тр. Минск, 1988.-С. 64-67.

125. Patent USA №3987849. Microbiol protein production //Dunlap C.P., Callichan C.D., Han J. W. Publ. 29.03.76.

126. Patent USA №3778349. Production of single-cell Brotein material //Carta G.R. Publ. 11.12.73.

127. Finn R. Utilization of cellulose by mixed culture for biomass production //J. Ferment. Technol. 1982. - Vol. 60, №7. - P. 620-623.

128. Пузыревская O.M., Смирнова И.Э., Галимбаева Р.Ш. Синтез протеина Bacillus sp. и Candida tropicalis при культивировании на соломе //Использование новых микробных препаратов в народном хозяйстве /Сб. научн. тр. Алматы, 1989. - С. 140-143.

129. Борисенко С.В. Производство кормовой белковой биомассы на целлюлозосодержащем растительном сырье //Тез. докл. научн.-практ. конф., посвящ. 100 летаю со дня рожд. И.И. Ухина. Омск, 1997. -С. 31-32.

130. Euriquer A. Growth of bacteria genus Cellulomonas on the alkaline pretreatment of sugarcane bagasse //Ann. Rep. Fermentation Prosesses. -1981.-Vol. 4.-P. 293-298.

131. Han J.W., Srinivassan V.R. Isolation and characterization of a cellulose utilizing bacterium //Appl. Microbiol. 1968. - Vol. 21. - P. 1140-1143.

132. Dunlap C.E., Callihan C.D. Microbial Protein Production from Sugarcane Bagasse //Sugar. J. 1969. - Vol. 32, №2. - P. 13-15.

133. Harkin J.M., Crowford D.L., McCoy S. Bacterial Protein from Pulps and Paper Mill Studge //TAPPI. 1974. - Vol. 57, №3. - P. 131-134.

134. Han J.W. Microbiological fermentation of rice straw nutritive composition and in vitro degestablitity of the fermentation product //Appl. Microbiol. -1982. Vol. 25, №3. - P. 386-390.

135. Rojoka M.I., Malik K.A. Cellulase and hemicellulase production by Cellulomonas flavigena NIAB 441 //Biotechnol. Letters. 1984. - Vol. 6, №9. -P. 597-600.

136. A.C. №981357. СССР.Питательная среда для культивирования целлюлолитических микроорганизмов //Долгов М.С. Опубл. 14.03.88.

137. Schinid S., Bomar М. Le protein sintetich e la fame mondo //Alimenta. -1999.-Vol. 38, №6.-P. 185-189,191-194.

138. Srinivasan V.R. Single-cell protein from cellulose //Proc. of the Fierst Int. congress of IAMS. Tokio, 1975. - Vol. 5. - P. 3.

139. Vladum-Talor M., Kushner D.J. Cellulase production by Cellulomonas uda //Appl. Biochem. and Biotechnol. 1990. - Vol. 24-25. - P. 254-256.

140. Han J.W. Mixed microbial cultures from Cellulomonas sp. and Alcaligenes faecalis //Appl. feed staff. 1983. - P. 28-31.

141. Han J.W., Callihan C.D. Fermentation of wheat straw by mixed microbial culture // Biotechnol. Lett. 1989, Vol. 11, №12. - P. 786-788.

142. Torre de la M., Campillo C.C. Cellulolytic mixed bacterial culture //Indian. J. Microbiolog. 1986. - Vol. 26, №1-2. - P.l 16-118.

143. Halsall D.M., Gibson A.H. Cellulolytic and diazotrophic bacteria on wheat straw //Soil. Biol, and Biochem. 1989. - Vol. 21. - P. 298-304.

144. Dermoun L., Gandin C., Belaich J.P. Effect of end product inhibition of Cellulomonas uda anaerobic growth on cellobiose chemostat culture //Biochem. Soc. Trens. - 1998. - Vol. 26, №2. - P. 156-160.

145. Franke P. Proteinforskningen vid socher bolaget //LDA - Rasch. - 1989. -N5.-P. 49-54.

146. Yumin D., Dama Z. Lianshung Z. Alcalifilic cellulolytic bacteria genus Bacillus //Chem. and Ind. forest Prod. 1998. - Vol. 18, №2. - P. 64-68.

147. Патент РФ N 2103349. Способ обогащения растительного сырья микробным белком //Мурзаков Б.Г., Сычев А.Е., Зобнина В.П. и др. Опубл. 27.01.98.

148. Thi Н. P., Tatsuo К., Yusaku F. Utilization and identification of citrus-juice residue composting bacteria //J. Fac. Agr. 1999. - №4. - P. 812816.

149. Медведев А.В., Зельцер A.M. Использование микроорганизмов естественной популяции для повышения белковой ценности соломы //Актуальные проблемы интеграции животноводства и кормопроизводства в Поволжье /Сб. научн. тр. М., 1988. - С. 128132.

150. Gould J.M. Bioconversion lignocellulosic crop residues //Bioprocess Technol. 1990. - Vol. 12, №1. - P. 4

151. Patent USA №4973559. Cellulolytic N2-fixing bacteria and use thereof //Dexter L.B., Gould J. M. Publ. 27.11.95.

152. Dexter L.B., Gould J.M. Cellulolytic N2-fixing bacteria in mono- and mixed cultures. //Bioprocess Technol. 1998. - Vol. 33, №3. - P. 84.

153. Бекер М.Е. Биоконверсия растительной биомассы смешанными ассоциациями микроорганизмов //Тез. докл. сов.-амер. конф. "Методы и результаты исследования смешанных культур микроорганизмов и новые ферментационные процессы". Рига, 1987.-С. 7-8.

154. Бекер М.Е., Упит А.А., Марауска М.К. Биологическая и зоотехническая оценка продуктов биоконверсии //Микробная конверсия: Фундаментальные и прикладные аспекты /Сб. научн. тр. -Рига, 1990.-С. 184-203.

155. Рабинович М.А. Биоконверсия целлюлозы: микробиология и биохимия //ИНТ АН СССР. Сер. Биотехнология. 1988. - Т. 11. - С. 4-48.

156. Rodriquez H., Volfoa 0. Formation and localization of cellulase in Cellulomonas culture on bagasse //Appl. Microbiol, and Biotechnol. -1984. Vol. 19, №2. - P. 134-138.

157. Thayer D.W., Lowther S.V., Pillips J.G. Cellulolityc activities of strains of the genus Cellulomonas //Int. J. Syst. Bacteriol. 1984. - Vol. 34, №4. -P. 432-438.

158. Vladut-Talor M., Kauri J., Kushner D.J. Kinetics of cellulase production in Cellulomonas sp. NRCC 2406 on cellulose and without //Arch. Microbiol. 1996. - Vol. 143, №3. - P. 196-198.

159. Vladut-Talor M, Kauri J., Kushner D.J. The enzyme production of Cellulomonas sp. //Arch, microbiol. 1996. - Vol.143, №5. p.198-201

160. Dehen S. Cellulomonas cellulasea'de cesitli fizyolojik faktorlerin karbosimetilcelliilaz sentezineetkisi //Eczacilik degr. Marmara Univ. -1997.-Vol. 23, №1.-P. 2733.

161. Hashino E., Kanda T. Variation and mechanism of cellulase activity on different cellulose substances. / J. Appl. Glusosci. 1977. - Vol. 4, №1. -P. 87-104.

162. Teeri T.T. Degradation crystalline cellulose of cellulases by Cellulomonas uda TN 3616 //Trends Biotechnol. 1997. - Vol. 15, №5 - P. 168-170.

163. Rajoka M.I., Malik K.A. Comparison of different strains of Cellulomonas for production of cellulolytic and xylanolytic enzymes from biomass produced on saline lands //Biotechnol Lett. 1986. - Vol. 8, №10. - P. 753-756.

164. Trayer D. W., Lowther S.V., Phillips J.G. Carboxymethylcellulase produced by bacteria Cellulomonas flavigena ATCC 482 //Int. J. Syst. Bacteriol. 1984. - Vol. 34, №4. - P. 439-446.

165. Patent USA №4449656. Process production of cellulase //Hukamura K., Takusaki S., Kitamura K., Yoshioka F. Publ. 11.06.86.

166. Poulsen O.M., Petersen L.W. Purification of two immunolodgicully distinct endoglucanases without affinity for microcrystalline cellulose from Cellulomonas sp. ATCC 21399 //Biotechnol. and Bioeng. 1989. Vol. 34, №1.-P. 65-71.

167. Russo-Marie F. p-Galactosidase activity in single differentiating bacterial cells //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, develop, biol. 1999. - Vol. 96, №17. -P. 8194-8198.

168. Kaori Т., Sarashi M. Takayuki J., Shojiro I. Purfication and characterization of endo -1,4-p-glucanases end exo-a-D-mannasidase from Cellulomonas sp. //Biochem. et biophys. acta. Gen. Subj. 1999. - Vol. 2068, №3,-P. 431-437.

169. Faure E., Belaich A., Bagnara C. et al. Characterization of the cellulolytic system of Clostridium thermocellum //Biomass Engery and Ind. 1987. -P. 717-721.

170. Cavedon K., Leschine S.B., Canale-Parola E. Characterization of the extracellular cellulase from a mesophilic Clostridium (strain CI) //J. Bacteriol. 1990. - Vol. 172, №8. - P. 4231-4237.

171. Halliwell N., Halliwell G. Extracellular -1,4 glucan, glucanohydrolase activities of the anaerobic thermophile Clostridium thermocellum //Biotechnol. and Appl. Biochem. 1989. - Vol. 11, №2. - P. 201-208.

172. Cavedon K., Leschine S.B., Canale-Parola E. Cellulase system of a freeliming mesophilic Clostridium (strain C7) //J. Bacteriol. 1990. - Vol. 172, №8.-P. 4222-4230.

173. Halliwell G. Philips T. Synthesis and activity of cellulase produced by strains of Clostridium thermocellum // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, develop, biol. 1995. - Vol. 92. - P. 9735-9738.

174. Beguin P., Alzari P.M. The cellulosome of Clostridium thermocellum //Biochem. Soc. Trans. 1998. - Vol. 26, №2. - P. 178-184.

175. Fukumori F., Kudo Т., Horikoshi K. Purification and properties of ceellulase from alkalophilic Bacillus sp. N 1139 //J. General Microbiol. -1985.-Vol. 131.-P. 3333-3345.

176. Williams A. Production of cellulases and hemiselulases by Bacillus macerans //Appl. Microb. and Biothech. 1985. - Vol. 22, №5. - P. 318324.

177. Patent USA №4945053. Alcalic cellulase and using microorganisms for their production //Fukumori F., Kudo Т., Horikoshi K. Publ. 31.07.90.

178. Kampfer P., Kench R, Dott W. Glycosidase profiles of Bacillus sp. and their value for species differentiation // Can. J. Microbiol. 1993. - Vol. 39, №8.-P. 808-811.

179. Araujo A., Word O.P. Cellulases and hemicellulases of Bacillus sp.: preliminary comparative studies on production and properties of exo-endocellulases, mannases and galactanases. //Proc. Roy. Soc. London B. -1997. Vol. 264, №1380. - P. 326-329.

180. Mayer F. Cellulolysis: ultrastuctural aspects of bacterial systems //Electron microsc. Rev. 1988. - Vol. 1, №1.- P. 69-85.

181. Mayer F. Cellulolytic bacterial system: ultrastructural particles hydrolysing cellulose. //Electron microsc. Rev. 1996. Vol. 6, №4. - P. 48-63.

182. Stiang M., Linden T.C., Mohaghegli A. et all. Cellulase production by Acidotermys cellulolyticus //Appl. Biochem. and Biotechnol. 1990. -Vol. 24-25.-P. 223-235.

183. Patent Germany №279501. Process for production of cellulase from Arthrobacter //Roos W., Menge L., Donnerhache K. Publ. 06.06.90.

184. Bayer E.A., Keleman J. Thermophilic cellulases by Thermospora sp. ATCC 14864 //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, develop, biol. 1996. - Vol. 93.-P. 10321-10323.

185. Kumakura M. Preparation of immobilized cellulase beads and their application to hudrolysis of cellulosic materials // Process Biochem. -1997. Vol. 32, №7. - P. 555-559.

186. Birsan C., Johnson P., Joshi M. et al. Mechanisms of cellulases and xylanases //Biochem. Soc. Trens. 1998. - Vol. 26, №2. - P. 156-160.

187. Тараканов Б.В. Лавлинский Д.Ю. Активность ферментов целюлозного комплекса и ксиланазы у бактерии рода Ruminococcus //Микробиология. 1999. - Т. 68, вып. 3. - С. 312 - 317.

188. Iudith В, Vatcharapijarn G., Jeffries T.W. Characteristics and adaptability of some new isolates of Clostridium thermocellum //Appl. and Environ. Microbiol. 1985. - Vol. 49, №3. - P. 475-477.

189. Ram S.M., Seenayga G. Ethanol production by Clostridium thermocellum a newly isolated thermophilic bacterium //Biotchnol. Lett. 1989. - Vol. 11, №8.-P. 589-592.

190. Boks B.A., Lien Т.Н., Kleijntjenes R. H., Luyben K. Process design of a thermophilic cellulose fermentation in a tower slurry reactor //Proc. 4 th Eur. congr. biothechnol. Amsterdam, 1987. - Vol.1. - P. 191.

191. Dermoun L., Gandin C., Belaich J.P. Utilization cellulosic wastes by cellulomonas uda ATCC 14868 //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, develop, biol. 1999. - Vol. 96. - P. 9864-9868.

192. Parekh S.R. Wayman M., Parekh R.S. Ethanol fermentation hydrolysates of cellulose by Zymomonas mobilis //Biochem. Soc. Trans. 1998. - Vol. 26, №3.-P. 84-92.

193. Martiner P.F., Nager S., Nagato M. Molecular cloning and expression of ethanol gene from Clostridium thermocellum in Cellulomonas uda //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, develop, biol. 1999. - Vol. 96. -P. 18143-18146.

194. Tanako M., Hiroke N. Molecular cloning, expession and sequence analysis of genes encoding a ethanol production //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, develop, biol. 1999. - Vol. 96. - P. 18147-18149.

195. Filho M.F., Goma G. Thermophilic degradation of cellulose by Clostridium thermocellum //Rev. microbiol. 1988. - Vol. 19, T 3. - P. 271-276.

196. Pape S., Wiegel J., Mayer F. Enzymologische Characterisierung des extracellularen Cellulasekomplexes von Clostridium thermocellum J. W. 20 //Forum Microbiol. 1989. - Vol. 12, №1-2. - P. 71.

197. Premis R.S. A new industrial revolution. London: Orbis Publ. House, 1994.- 192 p.

198. Okihiro 0. Effect of nucleotide components on the ethanol production by cellulose wastes //Bioprocess Technol. 1996. - Vol. 34, №3. - P. 89.

199. Mitsuyokhy K, Mavitura Т., Takishora 0. The using Clostridium thermocellum for the ethanol production by cellulose //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, develop, biol. 1999. - Vol. 141. - P. 18246-18248.

200. Брустовецкая Т.П., Окунева O.H., Шульга A.B. Образование и свойства грибных целлюлаз и ксиланаз в жидкой среде и в условиях твердофазной ферментации //Прикл. биохим. и микробиол. 1991. -Т. 27, вып. 4.-С. 577-583.

201. Скрябин Г.К., Головлева JI.A., Головлев ЕЛ. Твердофазная ферментация соломы //Прикл. биохим. и микробиол. 1988. - Т. 24, N4.-С. 714-720.

202. Скрябин Т.К., Головлев E.JI. Прямая конверсия лигноцеллюлозных субстратов //Микробиология и биохимия разложения растительных материалов /Сб. научн. тр. М., 1988. - С. 48-82.

203. Буряко Л.И., Богдановская Ж.Н., Гребенко В.В. и др. Переработка отходов растениеводства в кормовые продукты для животноводства //Вопросы полноценности кормления сельскохозяйственных

204. Фрейлин Р. Биотехнология новые перспективы для сельского хозяйства. //Агро хй. - 1997. -№1. - С. 14-15.

205. Мартыненко Л.Ф., Иванов С.Е., Москаленко Н.И. Полноценный корм из отходов растениеводства //Тез. докл. Междун. конф. "Рациональные пути использования вторичных ресурсов агропромышленного комплекса". Краснодар, 1997. - С. 37-39.

206. Сивере B.C., Богдан С.Д. Повышение кормовой ценности кукурузных стержней с помощью ферментных препаратов //Животноводство. -1977.-№9.-С. 50-51.

207. Ездаков Н.В. Применение ферментных препаратов в животноводстве. -М.: Колос, 1988.-280 с.

208. Айбазов О.А Ферментативный способ обработки соломы. М.: Россельхозиздат, 1984. - 48 с.

209. Бекер М.Е., Раутыня Д.Я., Гринберг А.П., и др. Микробиологические и биохимические аспекты анаэробной ферментации соломы в процессе силосования //Биотехнология кормопроизводства и переработки отходов /Сб. научн. тр. Рига, 1987. - С. 136-143.

210. Яковлев В.П., Валуйский Т.П., Ташпулатов Д. Т. и др. Рекомендации по применению гриба "Триходерма Лигнорум-19" для ферментативной обработки пшеничной соломы. - Фрунзе.: Илим, 1987.-27с.

211. Singh К. Solid state fermentation of wheat straw with Collybia veluzipes //Indiand J. Microbiol. - 1992. - Vol. 32, №4. - P. 311-314.

212. Раудонене В. Биоконверсия растительных отходов посредством микромицетов //Biologija. 1996 - №4. - С. 28-31.

213. Салаварова В.П., Трифонова Т.М., Степанова Л.М., Зырянова Н.В. / Тез. докл. Междунар. научн.-практ. конф. "Человек Среда -Вселенная". - Иркутск, 1997. - С. 131-132.

214. Патент РФ №2103324. Способ твердофазной ферментации лигноцеллюлозных отходов в белково-углеродный продукт //Бабицкая В.Г., Щерба В.В., Осадчая О.В. Опубл. 04.11.97.

215. Dichtl N. Thermophilic and mesophilic (two-state) anaerolbic digestion //Water and Environ. Manag. 1997. - Vol. 11, №2. - P. 98-104.

216. Linden S., Johnson E. Singh K., Tenderdy R.R. Bioconversion of wheat straw to animal feed by solid-state fermentation //J. Nat. Conserv. 1996. -Vol. 16, №4.-P. 89-92.

217. Gould M. Whitehead A. Bacterial treatment of crops residues //Bioprocess Technol. 1990. - Vol. 12, №1. - P. 78.

218. Бидлстон А. Дж., Грей И. P., Дей K.A. Компостирование и биодеградация соломы. //Экологическая биотехнология /Сб. научн. тр.-Л., 1990.-С. 228-264.

219. Карпова Г.В., Крахалева Т. М. Микробиологическая утилизация отходов зерноперерабатывающих предприятий //Тез. докл. Рос. науч-техн. конф. "Сертификация и управление качеством экосистем на Южном Урале". Оренбург, 1997. - С. 129.

220. Березина Г.О. Пентозосбраживающие молочнокислые бактерии и их роль в повышении продуктивности кормовых дрожжей: Автореф. дис. канд. Алма-Ата, 1973. - 29 с.

221. Рекомендации по применению сухих бактериальных заквасок Казахстана для силосования кормов. Алма-Ата: Кайнар, 1976. - 15 с.

222. Илялетдинов А.Н., Саубенова М.Г., Харитонова Т.А. Изменение полисахаридного комплекса соломы под влиянием анаэробных целлюлолитических бактерий //Тез. докл. Всесоюзн. симпоз. "Биоконверсия растительного сырья". Рига, 1982- С. 71-72.

223. Илялетдинов АН., Саубенова М.Г., Харитонова Т.А. Изучение целлюлозолитических ферментов бактерий Cellulomonas flavigena //Физиолого-биохимические основы устойчивости микроорганизмов /Сб. научн. тр. Алма-Ата, 1984. - С. 71-77.

224. Илялетдинов А.Н., Саубенова М.Г. Использование деятельности микроорганизмов в производстве кормов //Проблемы освоения пустынь. 1985. - №1. - С. 77-80.

225. Саубенова М.Г., Мухамедиева У.С., Хмелевская Л.К. Ферментация отходов переработки плодов //Известия АН КазССР, сер. биол. -1988.-№4.-С. 47-50.

226. Саубенова М.Г., Мухамедиева У.С., Хмелевская Л.К. Микробная конверсия яблочных выжимок в кормовой продукт //Тез. докл Всесоюзн. конф. "Микроорганизмы в сельском хозяйстве". Кишинев, 1988.-С. 191.

227. Саубенова М.Г., Хмелевская Л.К., Мухамедиева У.С., Баймуратова Р.И. Силосование пшеничной соломы с яблочными выжимками с использованием молочнокислых и целлюлолитических бактерий

228. Саубенова М.Г. Биоконверсия отходов агропромышленного комплекса в кормовой белок //Биотехнология вторичных органических субстратов /Сб. научн. тр. Улан-Уде, 1990. - С. 5559.

229. Саубенова М.Г., Пузыревская О.М. Твердофазная ферментация целлюлозосодержащих отходов растениеводства //Биотехнология вторичных органических субстратов /Сб. научн. тр. Улан-Уде, 1990.-С. 60-64.

230. Гаврилова Н.Н., Быстрова И.А., Князева Н.Ю. и др! Новый микробный препарат пробиотического действия //Тез. докл. Всесоюз. конф. «Микробиологические и биотехнологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства». Алматы, 1990.-С. 19.

231. Пузыревская О.М., Галимбаева Р.Ж., Камардинова Б.С. Автоселекция целлюлолитических бактерий //Тез. докл. Всесоюзн. конф. «Микробиологические и биотехнологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства». Алматы, 1990.-С. 62.

232. Предпатент РК №2119. Штамм бактерий Bacillus acidocaldarius, используемый для силосования //Саубенова М.Г., Пузыревская О.М., Галимбаева Р.Ш. и др. Опубл. 01.07.93.

233. Владимирова Е.Г., Саубенова М.Г., Илялетдинов А.Н. и др. Бактериальная конверсия растительных отходов в кормовые продукты //Прикл. биохим. и микробиол. 1995. - Т.31, №4. - С. 430-432.

234. Имшенецкий А.А. Микробиология аэробного разложения целлюлозы //Микробиология. 1954. - Т. 23, №2. - С. 386-400.

235. Мишустин Е.Н., Петров А Н. Образование свободных аминокислот на разрушающейся в почве целлюлозе //Микробиология. 1966. -Т.35, вып. З.-С. 491-495.

236. Тягны-Рядно М.Г. Образование свободных аминокислот в культуральной жидкости и почве //Микробиология. 1966. - Т. 35, вып. 6.-С.1028-1031.

237. Козлова Е.И., Новак М.М. Изучение обмена веществ бактерий рода Flavobacterium выделенных из ризосферы сельскохозяйственных растений // Микробиология. 1966. - Т. 35, вып. 3 - С. 496-502.

238. Хачикян Р.Е. Карапетян О.А. Аминокислоты ризосферных целлюлозоразлагающих микроорганизмов //Докл. АН Армян. ССР.1972.-Т. 53, №6.-С. 35-41.

239. Наплекова Н.Н. Выделение витаминов в среду целлюлозными бактериями //Известия СО АН СССР, сер. биол. наук. 1972. - Вып. 3,№15. -С. 10-14.

240. Наплекова Н.Н. Выделение витаминов в среду микроорганизмами, растущими на клетчатке //Известия СО АН СССР, сер. биол. наук.1973. Вып. 3, №15.- С. 53-56.

241. Наплекова Н.Н., Сафронова Л.Г., Астанов Т. Синтез витаминов целлюлозоразрушающими микроорганизмами на средах с различным источником углерода //Известия СО АН СССР, сер. биол. наук.1974. Вып.З, №15. - С.116-122.

242. Наплекова Н.Н., Сафронова Л.Г., Астанов Т. Влияние источника азота на синтез витаминов целлюлозоразрушающими микроорганизмами //Известия СО АН СССР, сер. биол. наук. -1974.- Вып.5, №15. С.123- 129.

243. Наплекова Н.Н., Сафронова Л.Г. Синтез аминокислот целлюлозоразрушающими бактериями и их спутниками //Микробиология народному хозяйству /Сб. научн. тр. -Новосибирск, 1974.-С. 168-210.

244. Наплекова Н.Н., Смагина М.В. Целлюлозоразрушающие микроорганизмы продуценты аминокислот //Образование физиологически активных веществ микроорганизмами /Сб. научн.тр.- Новосибирск, 1975. С. 7-14.

245. Наплекова Н.Н., Смагина М.В. Разложение растительных остатков и синтез витаминов микроорганизмами //Образование физиологически активных веществ микроорганизмами /Сб. научн. тр. Новосибирск, 1975.-С. 66- 69.

246. Самцевич С.А. Взаимоотношения микроорганизмов почвы и высших растений //Микроорганизмы почвы и растение /Сб. научн. тр. Минск,1972.-С. 3-67.

247. Кондратьева Е.В. О свободных аминокислотах некоторых бацилл почв Каракульского оазиса //Труды ТашГУ, сер. биол. и почвовед.1973.-Вып. 439.-С. 14-17.

248. Карабанов А.Н. Синтез целлюлозоразрушающими бактериями аминокислот и витаминов в связи с наличием в среде микроэлементов //Микроорганизмы продуценты биологически активных веществ /Сб. научн. тр. - Минск, 1973. - С. - 158-160.

249. Кучеренко Л.Ю., Родынюк И.С. Взаимоотношения бактерий из клубеньков осоки безжилковой и их способности продуцировать витамины группы В //Микробиология народному хозяйству /Сб. научн. тр. - Новосибирск, 1974. - С. 145-153.

250. Межераупе В.А. Влияние витаминов группы В на развитие эпифитных бактерий Pseudomonas liquefaciens 399 //Микроорганизмы- стимуляторы роста растений /Сб. научн. тр. Рига, 1974. - С.26-32.

251. Межераупе В.А. Размножение некоторых микроорганизмов -стимуляторов роста растений в питательных средах в зависимости от количества и возраста посевного материала //Микроорганизмы -стимуляторы роста растений /Сб. научн. тр. Рига, 1974. - С. 40-46.

252. Клинцаре А.А. Действие физиологически активных веществ и продуктов метаболизма Pseudobacterium lacticum 392 на развитие проростков ячменя //Микроорганизмы стимуляторы роста растений /Сб. научн.тр. - Рига, 1974. - С. 52-58.

253. Клевенская И.Л. Продуцирование свободных аминокислот олигонитрофильными микроорганизмами //Образование физиологически активных веществ микроорганизмами /Сб. научн. тр.- Новосибирск, 1975. С. 3- 7.

254. Родынюк И.С. Косинова Л.Ю. Влияние симбиотических бактерий осоки безжилковой на некоторые сельскохозяйственные культуры //Образование физиологически активных веществ микроорганизмами /Сб. научн. тр. Новосибирск,!975. - С. 117-122.

255. Родынюк И.С. Косинова Л.Ю. Влияние продуктов метаболизма симбиотических бактерий на семена и рост проростков осоки безжилковой //Образование физиологически активных веществ микроорганизмами. /Сб. научн. тр. Новосибирск, 1975. - С. 113117.

256. Тумаев Н.Р. Распространение микроорганизмов продуцентов свободных аминокислот //Известия Северо-Кавказ. научн. центра, отд. естеств. наук. -1988. -№4. С. 25-29.

257. Клинцаре А.А. Влияние выделений эпифитных бактерий на проростающие семена //Микроорганизмы и растения /Сб. научн. тр. -Рига, 1993.-С. 247-251.

258. Мишков B.C. Продукты метаболизма бактерий Agrobacterium elipsoideum 267 Р. //Микроорганизмы в сельском хозяйстве /Сб. научн. тр. Улан-Уде, 1994. - С. 28-31.

259. Wenk М. Bourguois М, Allen J. et al. Effect of atrazing mineralising microorganisms on weed growth in atrazing treated //J. Agr. and Food Chem . - 1997. - Vol. 45, №1, - P. 4474-4480.

260. Shah-Smith D.A., Burns R.G. Shef-life of a biocontrol Pseudomonas putida applied to sugar beet seeds using commercid coatings //Biocontr. Sci. and Technol. 1997. - Vol. 7, №1. - P. 65-74.

261. Baker В., Zambryski P., Staskawicz et al. Signaling in plant microbe interaction //Science. - 1997. - Vol. 276, №5313. - P. 726-733.

262. Lazarovits G.L.,Conu K.L., Brown A. What is a benificial rhizosphere microorganism? //Phytoparasitica. 1998. - Vol. 26, №3. - P. 257.

263. Lobkov J. T. Of soil phisiological biochemical activity and saprophytic bacteria complex in connection with permament and succession crops //Ann. Symp. "Phys.-chem. basis plant physiology". Absir - Pushtchino,1996.-P. 135.

264. Shishido M., Chanway Ch. Colonization of hybrid spruce seedings by plant growth promoting Bacillus and Pseudomonas str. //Plant Physiol.1997. Vol. 114, №3. - P. 229-230.

265. Дорофеева Л.С. Разнообразие коринеформных бактерий ассоциированных с растениями //Тез. докл. 2-ой гор. научн. конф. молодых ученых по биотехнологии. Пущино,1997. - С. 167-168.

266. Мордолева Л.Г., Москалева Н.А. Разложение целлюлозы на посевах озимой пшеницы // Труды КубаньГАУ. 1997. - №356. - С. 36-38.

267. Печуркин Н.С., Сомосова Л.А., Полонский В.И. и др. Влияние ризосферных бактерий Pseudomonas на рост молодых растений пшеницы в условиях полного минерального питания и при дефиците азота //Микробиология. 1997. - Т. 66, вып. 4. - С. 553-557.

268. Дубенская Г.И. Использование бактериальных штаммов при интрофузии змееголовника молдавского и чабера садового в Ленинградской области //Тез. докл. 2-ой Рос. конф. "Флора и растительность Сибири и Дальнего Востока". Красноярск, 1998. -С. 245-246.

269. Зиновьева Х.Г. К взаимоотношениям между азотобактером и высшими растениями //Получение и применение бактериальных удобрений. /Сб. научн. тр. Киев, 1958. - С. 131-138.

270. Мишустин Е.Н., Петрова А.Н. Антагонистические взаимоотношения микроорганизмов ризосферы и эффективность азотобактерина //Получение и применение бактериальных удобрений. /Сб. научн. тр. -Киев, 1958.-С. 29-37.

271. Kefford N.P. Natural plant growth regulation //Sciense. 1963. - Vol. 142, №4706.-P. 958-962.

272. Якушин A.H., Тарасенко А.А. Влияние эпифитной микрофлоры на темпы роста кукурузы и образование естественных гормонов роста //Биол. науки. 1971. - Т. 74. - С. 38-41.

273. Самосова С.М. Некоторые аспекты изучения взаимоотношений между озимой пшеницей и микрофлорой ризосферы и корней. //Микроорганизмы почвы и их взаимоотношения с высшими растениями /Сб. научн. тр. Казань, 1971. - С. 3-12.

274. Maruzella J., Carner J. Effect of kinetin on bacteria //Plant Physiol. -1974. Vol. 53, №3. - P.503-506.

275. Quinn L. Y., Oates R.P., Beers T. Support of cellulose digestion by Clostridium thermocellum in a kinetic suplemented basal medium // Nature. 1976. - Vol. 261. - P. 245-247.

276. Мишке И.В. О влиянии растительных гормонов на микроорганизмы //Микроорганизмы стимуляторы роста растений /Сб. научн. тр. -Рига, 1974.-С. 78-82.

277. Павлович Д.Я., Межераупе В.А. Влияние продуктов метаболизма актиномицетов на рост эпифитных бактерий //Микроорганизмы -стимуляторы роста растений /Сб. научн. тр. Рига,1974. - С. 83-88.

278. Sabry S.R., Saleh S.A., Batchelor С.A. et al. Endophylic establishment of Azorhizobium caulimodans in wheat //Proc. Roy. Soc. London B. 1997.- Vol. 264, №380. P. 341-346.

279. Глаголева О.Б., Лобаков E.C., Ковальская Н.Ю. и др. Формирование эндосимбиоза между корнями рапса и азотфиксирующими ризосферными бактериями //Докл. РАН. 1998. - Т. 362, №2. - С. 283-285.

280. Шабаев В.П., Олюнина Л. Н. Смолин В.Ю. Функциональная активность корней кукурузы при инокуляции стимулирующих рост растений ризосферными бактериями рода Pseudomonas //Известия РАН, сер. биол. 1999. - №1. - С. 39-46.

281. Kim Sung Han, Hwang Bo Fong, Rim Yong Dai. The effect for using bacterial complex for growth corn and purificution by nutrient elements //Biology. 1996. - №3. - P. 34-36.

282. Eviner V. Т., Chapii F.S. Plant microbial interaction //Nature. - 1997. -Vol. 385,N6611.-P. 26.

283. Галан M.C. Эффективность применения ассоциативных диазотрофов для повышения урожайности злаковых культур в условиях Западной лесостепи Украины //Микробиол. ж. 1997. - Т. 59, №4. - С. 78-83.

284. Шерстобаева Е.В., Дудинова И.А., Крамаренко С.Н. и др. Биопрепараты бактерий: проблемы и перспективы применения //Микробиол. ж. 1997. - Т. 59, №4. - С. 109-117.

285. Скворцов Н.Г., Умаров М.М., Костин Н.В. Влияние инокуляции смешанными культурами Bacillus polymixa Pseudomonas на трансформацию азота в ризосфере небобовых растений //Микробиология. - 1998. - Т. 67, вып. 2. - С. 244-248.

286. Шабая В.П., Сафрина О.С., Мудрис В.А. Влияние ризосферных бактерий и эндомикоризного гриба Glonus mossae на урожай и рост редиса в зависимости от условий минерального питания //Агрохимия.- 1998.-№6.-С. 34-41.

287. Суховиц Л.А., Мохова С.В., Чернецова И.Б. и др. Отбор ризобактерий, перспективных для инокуляции сельскохозяйственных растений //Весщ АН Беларуа, сер. биол. наук. 1998. - №3. - С. 7982.

288. Печуркин Н.С. Смешанные проточные культуры микроорганизмов -новый этап в развитии теоретической и прикладной микробиологии

289. Егоров Н.С., Ландау Н.С. К вопросу о некоторых аспектах симбиотического взаимоотношения целлюлолитических бактерий с бактериями спутниками //Прикл. биохим. и микробиол. 1982. - Т. 18, вып. 4.-С. 636-649.

290. Егоров Н.С., Ландау Н. С. Влияние продуктов метаболизма на характер популяционных взаимодействий в искусственных экосистемах /Экологическая роль микробных метаболитов /Сб. научн. тр-М„ 1986.-С. 178-201.

291. Омелянский В Л. Микроорганизмы как химические реактивы /Избран, труды. М.: АН СССР, 1953. - Т. 2. - 434 с.

292. Бекер М.Е., Межиня Г.Р. Теория и практика получения вторичных продуктов при непрерывном культивировании //ИНТ АН СССР. Сер. Микробиология. 1985. - Т. 14. - С. 52-75.

293. Наплекова Н.Н. Разложение целлюлозы бактериями при разных температурах и различных источниках азота //Известия СО АН СССР, сер. биол. наук. 1965. - Вып. 2, №8. - С. 49-52.

294. Наплекова Н.Н. К вопросу взаимоотношений целлюлозных бактерий и их спутников //Известия СО АН СССР, сер. биол. наук. 1966. -Вып. 3, №12.-С. 43-47.

295. Наплекова Н.Н., Лащинский Н.Н., Ронгинская А.В. Аэробное разложение целлюлозы в почвах и ризосфере дикорастущих растений //Известия СО АН СССР, сер. биол. наук. 1972. - Вып. 3, №15. - С. 10-16.

296. Сафронова Л.Г., Наплекова Н.Н. Спутники целлюлозных бактерий, выделенных из почв Сибири //Известия СО АН СССР, сер. биол. наук. 1972. - Вып. 3, №15. - С. 22-30.

297. Groenewege J. Uber die Bacterienflora des darms. //LDA Rasch.1994,-№4.-P. 28-32.

298. Ильинская С.П., Меренюк Г.В., Потапов А.И., Золоткова Л.И. Структура и функции бактериального целлюлозоразрушающего консорциума //Известия АНР Молдова, сер. биол. и хим. наук.1995.- №5.-С. 41-46.

299. Добровольский Т. Г., Чернов И.Ю., Звягинцев Д.Г. О показателях структуры бактериальных сообществ //Микробиология. 1997. - Т. 66, вып. 3.-С. 408-414.

300. Thi Н.Р., Fucumory Т., Tatsuo К. Cellulolytic symbiotic bacterial association from compost of citrus juice residue //Kaushu Univ. - 1999. -Vol. 43, №5-6.-P. 287-312.

301. Steward J. C., Datherwood J. M. Cellulose decomposition by cellulolytic bacteria Cellulomonas sp. //J. Bacteriol. 1976. - Vol. 128. - P. 609-612.

302. Han J. W., Anderson A. W. Semisolid fermentation of ryegrass straw //Appl. Microbiol. 1975. -Vol. 30, №6. - P. 930-939.

303. Ishaque M., Klixepfel D. Ctllulase complex of mesophilic Streptomyces strain //Can J. Microbiol. 1980. - Vol. 26, №2. - P. 183-189.

304. Khan A.W., Murray W.D. Isolation of a symbiotic culture of two species of bacteria capable of convention cellulose to ethanol and acid //FEMS Microbiol. Lett. 1982. - №13. - P. 377-381.

305. Meshartreei M., Saddler J. N. The nature of inhibitory materials present in pretrated lignocellulosic substrate which inhibit the enzymatic hydrolysis of cellulose //Biotechnol. Lett. 1983. - Vol. 5, №8. - P. 531-536.

306. Euriquer A. Growth of cellulolytic bacteria on sugarcane bagasse // Biothechnol. and Bioeng. 1981. -Vol. 23, №7. - P. 1423-1429.

307. Euriquer A., Montalvo R., Canales M. Variation of bagasse crystallinity and cellulase activity during the fermentation of Cellulomonas bacteria //Biotechnol. and Bioeng. 1981. - Vol. 23, №7. - P.1431-1436.

308. Descharups A. M., Comtat J., Nonvion N., Lebeault J. B. Degradation of purifeed birch-wood xylan and production of xylanase by wood-decaying bacteria //J. Gener. and Appl. Microbiol. 1982. - Vol.28, №3. -P. 275280.

309. Головченко Н.П. , Чувильская H.A., Акименко B.K. Регуляция биосинтеза целлюлолитических ферментов и начальных ферментов катаболизма глюкозы и целлобиозы у Clostridium thermocellum //Микробиология. 1986. -Т. 55, вып. 1. - С. 31-47.

310. Dermoun L., Belaich J.P. Crystalline index change in cellulose during aerobic and anaerobic Cellulomonas uda growth //Appl. Microbiol, and Biotechnol. 1988. - Vol. 27, №4. - P. 399-404.

311. Dermoun L., Belaich J.P., Gandin C., The study growth by Cellulomonas uda in mono and mixed cultures with bacteria - associants //Biotechnol. Adv. - 1997. - Vol. 15, №3. - P. 286-294.

312. Itahano A.K. Arukawo T.Y. Investigation of cellulose degradation by pure culture cellulolytic bacteria and their nature association //Proc. Natl. Acad. Sci USA, develop, biol. 1998. - Vol. 95. - P. 13324-13328.

313. Fukumori R., Kudo S., Toshy K. The positive effect on growth Cellulomonas sp. ATCC 14849 bacteria -associants //Can. J. Microbiol. -1996. Vol. 42, №6. - P. 534-536.

314. Finn R. Single cell protein from straw //Ber. Kernfor- schungsanlage Jiilich. -1980. -№35. -P. 67.

315. Han J.W. Nutritional requirements and growth of a Cellulomonas species on cellulosic substrates //J. Ferment. Technol. 1982. - Vol. 60, №2. - P. 99-104.

316. Han J.W. Callihan G.D. Cellulose Fermentation: Effect of Substrate Pretreatment on Microbial Growth //Appl. Microbiol. 1984. -Vol. 27, №1.- P. 159-165.

317. Симанькова M.B. Разложение целлюлозы бинарной культурой Clostridium thermocellun и CI. thermoacetotrophicum //Тез. докл. республ. конф. мол. ученых по биотехнологии. Баку, 1988. - С. 69.

318. Логинова Л.Г. Термостабильные целлюлазы и термофильные микроорганизмы //ИНТ АН СССР. Сер. Биотехнология. -1988. Т. 10.-С. 72-96.

319. Bondreaux D.P., Sammers R.J., Srimuasan V.R. Effect of zinc and magnese on continuous culture productivity //Develop. Ind. Microbiol. -1979.-Vol.20.-P. 609-615.

320. Tonako R., Hokamura Y.Y. Thermophilic bacteria, degradation cellulose // Kyushu Univ. 1994. - Vol. 38, №2. - P. 246-248.

321. Cansunar E. Effect of simple sugars on filter paper digestion by Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus flavefaciens, Ruminococcus albus //Hacette pe Bull. Natur Sci. and Eng. A, C. 1995. - Vol. 21. - P. 1-8.

322. Swaroopa R., Krishna N. Development xylanace -free cellulase -producing anaerobic consortia for the use of lignocellulosic wastes //Enzym. and Microb. technol. 1996. - Vol. 18, №1. - P. 23-28.

323. Дин-Цзинь. Стимуляция бактерией спутником распада клетчатки, вызываемого актиномицетом //Известия АН СССР, сер.биол. - 1959. - №5. - С.760-764,

324. Султанова И.Г., Щелокова С.С. Целлюлолитическая активность факультативно-анаэробной бактерии в монокультуре и совместно с другими микроорганизмами //Узб. биол. журнал 1971. - №2. - С. 15-18.

325. Сахарова З.В. Торможение роста Bacillus megaterium Н* и ОН' ионами // Микробиология. 1970. - Т. 39, вып. 6. - С. 978-980.

326. Сафронова Л.Г. Витаминообразующая способность целлюлозных бактерий //Известия СО АН СССР, сер. биол. наук. 1972. - Вып. 3. -С. 23-28.

327. Сафронова Л.Г, Взаимоотношение аэробных целлюлозных бактерий с их спутниками на основе синтеза физиологически активных веществ //Образование физиологически активных веществ микроорганизмами /Сб. научн. тр. Новосибирск, 1975. - С. 66-69.

328. Torre de la М., Compillo С.С. Isolation and characterization of a symbiotic cellulolytic mixed bacterial culture //Appl. Microbiol, and Biotechnol. 1984. -Vol.19, №6. - P. 430-434.

329. Saunder S., Chandra T.S. Cellulose degradation by mixed bacterial culture // Syst. and Appl. Microbiol. -1990. Vol. 14, №2. - P.77-82.

330. Хачикян P.E., Карапетян O.A. К вопросу о способности синтезировать аминокислоты целлюлозоразрушающими микроорганизмами //Докл. АН Арм. ССР. 1971. - Т. 52, №2. - С. 90-95.

331. Асеева И.В., Умаров М.М. Свободные аминокислоты почвенных микроорганизмов //Микробные метаболиты /Сб. научн. тр. М., 1979.-С. 102-116.

332. MacKenzie C.R., Bilous D. Location and kinetic properties of the cellulase system of Cellvibrio cellulolyticus and production extracellular aminoacids //Can. J. Microbiol. 1982. - Vol. 28, №10. - P. 1158-1164.

333. West A.W., Ross D.J., Cowling J. C. Changes in microbiol C,N,P and aminoacids contents, numbers and respiration on storage of soil //Soil. Biol. Biochem. 1986. - Vol. 18. - P. 141-148.

334. Балагуров E.B., Мятликов E.A., Ткачева Г.А. Функционирование микробных сообществ в почвах с различным уровнем нитратов //Микробиол. ж. 1988. - Т. 50, №1. - С. 3-7.

335. Андреюк Е.И. Методологические аспекты изучения микробных сообществ почвы // Микробные сообщества и их функционирование в почве /Сб. научн. тр. Киев, 1981. - С.13-23.

336. Андреюк Е.И., Путинская Г.А., Кигель Н.Ф., Иванова Н.И. Микробная деструкция гликополимеров в почве //Микробная деструкция органических остатков в биогеоценозе /Сб. научн. тр. -М., 1987. -С. 3-5.

337. Калининская Т.А. Использование различных источников углерода азотфиксирующими микробными ассоциациями //Микробиология. -1967. -Т. 36, вып.4. С. 619-625.

338. Калининская Т.А. Азотфиксирующие микобактерии и их роль в биологической фиксации азота в почве //Микроорганизмы в сельском хозяйстве / Сб. научн. тр. М., 1970. - С. 203-211.

339. Клевенская И.Л. Олигонитрофильные почвенные бактерии //Микробиологические исследования в Западной Сибири / Сб. научн. тр. Новосибирск, 1989. - С. 134-148.

340. Hal sail D.M, Gibson A.H. Cellulose Accomposition and Associated Nitrogen Fixation by Mixed Cultures of Cellulomonas gelida and Azospirillum Species or Bacillus macerans //Appl. Environ. Microbiol. -1985. Vol. 50, №4. - P.1021-1026.

341. Halsall D. M., Gibson A.H. Nitrogenase activity of a range of diazotrophic bacterian on straw breakdown products and related compauns //Soil. Biol, and Biochem. 1989. - Vol. 21, №2. - P. 291-298.

342. Leschine S.B., Holwel P., Canal-Parola E. Nitrogen fication by anaerobic cellulolitic bacteria //Science. 1988. - Vol. 242. - P. 1157-1159.

343. Cavedon K., Canale-Parola E. Physiological interaction between a mesophylic cellulolytic Clostridium and non-cellulolytic bacterium. //FEMS Micr. Ecol. 1992. - Vol. 86, №3. - P. 237-245.

344. Андриенко О.Ю., Кривонос И.А., Караева M.A. Некоторые данные о целлюлозоразрушающих бактериях и бактериях цикла азота почв Каневского природного заповедника //Заповщш справа в Украш. -1996.-№2.-С. 20-21.

345. Wang N., Lou W., Fan К. Nitrogen symbiotic fixation associated with activityes of hydrogenase, cellulase and nitrogenase in mixed populations of Azorhizobium caulimodans //J. Najing Agr. Univ. 1998. - Vol. 21, №1. - P. 60-65.

346. Егорова Л.А., Храпцова Г.И., Дульцева Л.Г., Логинова Л.Г. Продукты обмена элективной культуры анаэробных термофильных

347. Андреюк Е.И„ Путинская ГЛ., Дульгенова А.Н. Почвенные микроорганизмы и интенсивное землепользование //Микроорганизмы в сельском хозяйстве /Сб. научн. тр. Киев, 1992. -С. 163-185.

348. Молодова Е.А., Карасева Э.В. Целлюлозоразлагающие микроорганизмы буровых растворов //Микробиология. 1990. - Т. 50, вып. 2.-С. 367-369.

349. Балагуров Е.В., Мятликов Е.А., Ткачев Г.К. Микробные сообщества в почвах //Микроорганизмы в сельском хозяйстве /Сб. научн. тр. -Киев, 1992.-С. 146-148.

350. Печуркин Н.С. Популяционная микробиология Новосибирск: Наука, 1978. - 207 с.

351. Печуркин Н.С., Терсков И.А. Автоселекционные процессы в непрерывной культуре микроорганизмов. Новосибирск: Наука, 1973.-64 с.

352. Печуркин Н.С., Терсков И.А. Анализ кинетики роста и эволюции микробных популяций. Новосибирск: Наука, 1975. - 215 с.

353. Дегерменжи А.Г., Печуркин Н.С. Сравнительная устойчивость состава популяций с различными типами взаимодействий //Тез докл. IV Всесоюзн. конф. по проблемам теоретической кибернетики. -Новосибирск, 1977. С. 37-39.

354. Дегерменжи А.Г., Печуркин Н.С., Фуряева А.В. Анализ взаимодействия двух микробных популяций по типу комменсализма в непрерывной культуре //Экология. 1978. -№2. - С. 91-94.

355. Печуркин Н.С., Брильков А.В., Горбань А.Н. и др. Популяционные основы микробной технологии //Тез. докл. III симпоз. соц. стран по биотехнологии Братислава, 1984. - С. 193-211.

356. Han J. W., Dunlap E., Callihan C.D. Biotechnological fermentation of wheat straw to animal feed //Appl. feed staff. 1976. - P. 17-20.

357. Lew-Ute S.P., Hudson J.A., Green R.V. Treatment of straw by mixed cultures cllulolytic bacteria Cellulomonas uda and Chaetomium cellulolyticum //Process Biochem. 1979. - Vol. 13, №9. - P. 18-24.

358. Jhosh C.P., Pamment N. В., Martin W.R. Simultaneus saccharification and fermentation of cellulose: effect of p-D-glucosidase activity and ethanol inhibition of cellulases //Enzyms and Microbial. Technol. 1982. - Vol. 4, №6.-P. 425-430.

359. Симанькова М.В. Целлюлолитические бактерии в анаэробном сообществе : Автореф. дис. канд. М., 1991. - 22 с.

360. Симанькова М.В., Тодорова П.Т., Храпцова Г.И., Логинова Л.Г. Элективная культура термофильных бактерий, разлагающих клетчатку //Прикл. биохим. и микробиол. 1987. - Т. 23, №3. - С. 360-365.

361. Белокопытов Б.Ф., Щербаков В.А., Акименко В.К. Биоконверсия опилок, делигнифицированных методом электролиза с сокультурой бактерий Clostridium thermocellum и CI. thermohydrosulfuricum //Прикл. биохим. и микробиол. 1990. - Т. 26, вып. 2. - С. 195-201.

362. Коновалова Н.А., Ермакова Н.О. Янова О.В., Полякова А.Н. Биоконверсия целлюлозосодержащих отходов в жидкое топливо //Тез. докл. Междун. симп. "Техника и технология экологически чистых химических производств". М., 1996. - С. 16-17.

363. Czarnecki Z., Novak J. Ethanol fermentation of HTST extruded rye grain by bacteria and yeasts //Acta biotechnol. 1997. - Vol. 17, №1. - P. 6371.

364. Пузыревская O.M., Галимбаева Р.Ш. Получение непрерывной смешанной культуры целлюлолитических и молочнокислых бактерий //Тез. докл. Всесоюзн. конф. «Биотехнология и биофизика микробных популяций». Алматы, 1991. - С. 71.

365. А.С. №1695871. СССР. Способ получения корма из растительного сырья //Илялетдинов А.Н., Саубенова М.Г., Владимирова Е.Г. и др. Опубл. 07.12.91.

366. Саубенова М.Г., Владимирова Е.Г., Мухамедиева М. С. и др. Технология получения корма из лузги подсолнечника и шелухи зерновых //Тез. докл. Всесоюзн. конф. «Битехнология и биофизика микробных популяций». Алматы, 1991. - С. 122.

367. А.С. №1043165. СССР. Способ подготовки к скармливанию лигноцеллюлозосодержащего корма //Сивере B.C., Справцев Н.Х., Горобец А.Н. и др. Опубл. 23.09.83.

368. Kudo К., Jakober K.D, Phillippe R.C. et al. Isolation and characterization of cellulolytic anaerobic bacteria and associated mycoplasmas from the rumen of a streer feed a rouyhage deet //Can J. Microbiol. 1990. - Vol. 36, №7.-P. 513-516.

369. A.C. №1671693. СССР. Ассоциация микроорганизмов для скармливания молодняку крупного рогатого скота // Николичева Т.А., Тараканов Б.В., Бравова Г.А. и др. Опубл. 23.08.91.

370. Аманов М.Б., Мамедова Н.М. Микросимбионты пищеварительного тракта курообразных //Доклады АН России. 1992. - Т. 323, №6. - С. 1108-1200.

371. Гаврилова Н.Н., Быстрова И.А., Князева Н.Ю. и др, Препарат целлобактерин стимулятор роста молодняка крупного рогатого скота //Тез. докл. Всесоюзн. конф. "Микроорганизмы - стимуляторы и ингибиторы роста растений и животных". - Ташкент, 1989. - С. 40.

372. Гаврилова Н.Н., Ратникова И.А., Лукашева Л.М. Микробиотики в профилактике и лечении желудочно-кишечных заболеваний //Тез. докл. Всесоюзн. конф. по производству биопрепаратов для сельского хозяйства. Алматы, 1990. - С. 18.

373. А.С. №1684972. СССР. Кормовая добавка //Гаврилова Н.Н., Пятаева М.И. Илялетдинов А.Н. и др. Опубл. 20.01.90.

374. Hatch J., Cadman T.W. Evalution of Escherichia coli and Candida utilis as a model continuous, competitive mixed culture systems //Biothechnol. Bioeng. -1987. Vol. 29, №4. - P. 453-464.

375. Ландау H.C., Милованова И.И., Егоров H.C. Некоторые особенности развития и биосинтетической активности смешанной культуры микроорганизмов //Микробиология. 1985. - Т. 54, вып. 4. - С.529-532.

376. Bergey's manual of Determinative bacteriology 8ed William Willkins Co. -Baltimore: Waverly Press, 1976. Vol. 1-2. - 964 p.

377. Красильников Н А. Определитель бактерий и актиномицетов. М.: АН СССР, 1949. - 832 с.

378. Ведьмина Е.А., Власова И.В. Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. М.: Наука, 1979. - 27 с.

379. Одинцова Е.Н. Микробиологические методы определения витаминов. -М.: АН СССР, 1959.-379 с.

380. Толысбаев Б., Бисенбаев О., Биосинтез уробактериями витаминов группы В //Известия АН КазССР, сер. биол. 1976. - №2. - С. 22-29.

381. Егоров Н.С. Метаболизм микроорганизмов. М.: МГУ, 1980. - 256 с.

382. Вечер А.С., Куликова А.Н. Спектрофотометрическое определение содержания каротиноидов в биосинтезе микроорганизмов //Физиолого-биохимические исследования растений /Сб. научн. тр. Минск, 1967. -С. 46-54.

383. Лукашик Н.А., Тащилин В.А. Зоотехнический анализ кормов. М.: Наука, 1968. - 206 с.

384. Терешина В.М., Меморская А.С., Феофилова Е.П. Экспресс-метод определения ликотина и Р-каротина //Микробиология. 1994. - Т. 63, вып. 6 — С. 1111-1116.

385. Zumwalt R.W., Roach D., Genrike C.W. Analysis of aminoacids in biological substancies //J. Chromatography. 1970. - Vol. 53, №2. - P. 171-194.

386. Умаров M.M. Ассоциативная азотфиксация. M.: МГУ, 1986. -136 с.

387. Lowry О.Н., Rosenbraugh N. J., Farr F.L., Randall R.J. Protein mesurrement with the folin phenol reagent //J. Biol. Chem. 1951. - Vol. 193, №1. - P. 265-275.

388. Рабинович М.Л., Черноглазое B.M., Клесов А.А. Классификация целлюлаз, их распространенность, множественные формы и механизмы действия //ИНТ АН СССР. Сер. Биотехнология. 1988. - Т. 11. - 224 с.

389. Исмаилова Д.Ю., Логинова Л.Г. Влияние некоторых веществ на биосинтез целлюлазы термотолерантного гриба Aspergillus terreus 17 Р //Прикл. биохим. и микробиол. 1975. - Т. 11, вып. 5. - С. 676-681.

390. Синицин А.П., Черноглазов В.М., Гусаков. Методы изучения и свойства целлюлозолитических ферментов //ИНТ АН СССР. Сер. Биотехнология. -1990.-Т. 25.-С. 30-31.

391. Chose Т., Montenecourt B.S, Eveleigh D.E. Measure of cellulase activity (substrates, assays, activities and recomendations) //Preprint of IUP AC Commission on biotechnology, 1981. 898 c.

392. Mandels M., Weber J. The production of cellulases //Advan. Chem. Ser. -1969.-Vol. 95.-P. 391-414.

393. Иерасалимский Н.Д., Неронова H.M. Количественная зависимость между концентрацией продуктов обмена и скоростью роста микроорганизмов // Докл. АН СССР. 1965. - Т. 161, №6. - С. 14371440.

394. Оболенская А.В., Щеголев В.П., Аким Г.Л. и др. Практические работы по химии древисины и целлюлозы. М.: Лесн. пром-сть,1965. - 166 с.

395. Шарков В.И., Куйбина Н.И. Химия гемицеллюлоз. М.: Лесн. пром.-ность, 1972.-61 с.

396. Дроздов Н.С., Матеранская Н.П. Практикум по биологической химии. -М.: Высш. шк., 1970. 256 с.

397. Методы общей бактериологии /Под ред. Ф. Герхарда и др. М.: Мир,1983.-Т.1.-536 с.

398. Методы общей бактериологии /Под ред. Ф. Герхарда и др. М.: Мир, -Т.2.-470 с.

399. Методы общей бактериологии /Под ред. Ф. Герхарда и др. М.: Мир,1984.-Т. 3.-264 с.

400. Красильников Н.А. Методы изучения почвенных микроорганизмов и их метаболитов. М.: МГУ, 1966. -186 с.

401. Возняковская Ю.М. Предпосевная стимуляция семян метаболитами микроорганизмов продуцентов витаминов //Методы микробиологического стимулирования роста и развития растений /Сб. научн. тр. - Рига, 1969. - С. 64-68.

402. Возняковская Ю.М. Влияние полезных почвенных и эпифитных микроорганизмов на урожайные качества семян //Влияние микроорганизмов и протравителей семян. /Сб. научн. тр. М.: Колос, 1972.-С. 77-81.

403. Burns R.G, Slater J.H. Experimental microbial ecology. Oxford: Blachwell sci.publ., 1982.-683 p.

404. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. Минск: Высш. шк., 1967. -328 с.

405. Удольская Н.Л. Введение в биометрию. Алма-Ата: Наука, 1976. - 84 с.

406. Lamed R., Naimerk J., Morgenstern E., Bayer E.A. Snecialized cell surface structure in cellulolytic bacteria /J. Bacteriol. 1987. - Vol. 169, №8. -P.3792-3800.

407. Lansford M.L., Gilkers N.R., Wakarchuk W.W. et al. The Cellulase system of Cellulomonas fimi //Can. J. Microbiol. 1996. - Vol. 42, №8. - P. 687689.

408. Careter L.A., Bernett L.B. Localization cellulosomes of cellulases in Cellvibrio gilvus //Arch. Biochem. Biophys. 1998. - Vol. 248. - P. 292304.

409. Рабинович М.Л., Черноглазое B.M., Клесов A.A. Классификация целлюлаз, их распространенность, множественные формы и механизмы

410. Глаголева О.Б., Злотников А.К., Умаров М.М. Влияние аммония на азотфиксирующую активность смешанных культур ризосферных диазотрофных бактерий //Микробиология. 1995. -Т. 64, вып. 2. - С. 201-204.

411. Арзумян В.Г., Сахаров З.В., Паников Н.С. и др. Рост и азотфиксирующая активность периодической культуры Xanthobacter autotrophicus в условиях регуляции растворенным кислородом //Микробиология. 1997. - Т. 66, вып. 6. - С. 750-754.

412. Рубенчик Л.И. Азотобактер и его применение в сельском хозяйстве. -Киев: АН УкрССР, 1960. 328 с.

413. Ильина Т.К. Влияние кобальта на развитие азотфиксирующих микобактерий при использовании молекулярного и связанного азота //Микробиология. 1967. - Т. 36, вып. 4. - С. 626-631.

414. Цыганкова А.А. Лауринавичене Т.В. Рост и азотфиксация Rhodobacter capsulatus в присутствии молибдена и без него //Микробиология. 1993. -Т. 62, вып5.-С. 855-862.

415. Бирюков В.В. Планирование экспериментов при оптимизации сложных процессов по схемам ортогональных латинских прямоугольников //Химико-фармацевтический журнал. 1968. - №1. - С. 57-62.

416. Саубенова М.Г., Пузыревская О.М., Владимирова Е.Г. Использование целлюлолитических бактерий в кормопроизводстве //Прикл. биохимия и микробиол. 1998. - Т. 34, №1. - С. 91- 94.

417. Харитонова Т.А. Целлюлозолитические бактерии рода Cellulomonas и их использование для подготовки грубых кормов к скармливанию: Автореф. дис. канд. Алма-Ата, 1987. - 21 с.

418. Нелидов С.Н., Васильева Л.В., Мишустин Е.Н. Использование пожнивных остатков для повышения урожайности риса на мелиорируемых щелочных почвах //Известия АН СССР, сер. биол. -1986. -№1. -С. 43-57.

419. Нелидов С.Н., Васильева Л.В. Использование пожнивных остатков риса в качестве органического удобрения //Известия АН СССР, сер. биол. -1988.-N3.~C. 437-449.

420. Клинцаре А.А. Влияние выделений прорастающих семян на развитие эпифитных микроорганизмов //Микроорганизмы стимуляторы роста растений/Сб. научн. тр. - Рига, 1974. -С. 47-51.

421. Злотникова А.К., Глаголева О.Б., Умаров М.М. Взаимосвязь нитрогеназной активности, устойчивости и относительного содержания компонентов смешанных культур диазотрофных бактерий //Микробиология. 1997. - Т. 66, вып. 6. - С. 807-812.

422. Аркадьева З.А., Безбородое И.Н., Блохина И.Н. и др. //Промышленная микробиология. М.: Высш. шк., 1989. - 688 с.

423. Логинова Л.Г., Чужова Э.П., Бурденко Л.Г. Термофильный гриб Sporotrichium thermophillum продуцент биомассы и целлюлолитических ферментов //Тез. докл. Всесоюзн. симп. по .биоконверсии растительного сырья. - Рига, 1982. - Т. 1. - С. 82.

424. Работнова И.Л., Позмогова И.Н. Хемостатное культивирование и ингибирование роста микроорганизмов. М.: Наука, 1979. - 206 с.

425. Нелидов С.Н. Микробиологические аспекты мелиорации щелочных почв под культуру риса: Автореф. дис. докт. Ташкент, 1991. - 47 с.'

426. Мамилов Ш.З. Микробиологическая трансформация азота в почвах Казахстана: Автореф. дис. докт. Алматы, 1993. - 43 с.

427. Каткевич Ю.Ю., Каткевич Р.Г. Методы предварительной обработки соломы злаковых культур //Тез. докл. Всесоюзн. симпоз. по биоконверсии. Рига, 1990. -С. 85.

428. Каткевич Р.Г., Громов Б.С. Щелочной и кислотный гидролиз целлюлозы соломы. Рига: Зинатне, 1995. - 92 с.

429. Partos J., Belaich J.P. Mild alkaline pretreatment of wheat straw and use thereof for growth cellulolytic bacteria //Proc. Natl. Acad. Sci USA, develop, biol. 1998. - Vol. 95. - P. 7786-7789.