Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ КРИОРЕЗИСТЕНТНОСТИ СПЕРМЫ БАРАНОВ И БЫКОВ

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ КРИОРЕЗИСТЕНТНОСТИ СПЕРМЫ БАРАНОВ И БЫКОВ"

Л-309Ы

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА (ВИЖ)

На правах рукописи

ЕРОХИН Анлтодпй Сергеевич

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ КРИОРЕЗИСТЕНТНОСТИ СПЕРМЫ БАРАНОВ И БЫКОВ

л'

Специальность 03.00.13 — физиология человека -^ -и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учепой степени доктора биологических нлук

й, Дубровпцы Московской обл., 1994 Г.

¿?с - Уеыг"

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте племенного дела.

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор В. П. КОНОНОВ

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ю. Д. КЛИНСКШ,

доктор биологических паук, профессор А. Н. УСПЕНСКИЙ,

доктор биологических паук, профессор А. И. ЖУРАВЛЕВ

Ведущее учреждение — Российская академия менеджмента в животноводстве. ^

" диссертаТ^и^-с. ^йЩрся «../яС.*.»^¿ЗЖ&АЖ 1994 года

в 10 часов ""на заседали» специализированного Совета Д 020.16.0^ прп Всероссийском научно-исследовательском институте животноводства.

А,Ч:""*"''142012, Московская обл., Подольский "с" дпсе^^^^^жно ознакомиться в библиотеке инств-Автореферат разослав «..

&.0/..ШЛ 994

года.

Ученый секретарь специализированного совета,

капа-^тат биологических паук И. И. ШМЫГИН

I. ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

■ Актуальность темы. В большинстве экономявеки развитых стран для искусственного о с емене шш ■коров широко нсяольэуется метод криоконсервации спермы.

Несмотря на достаточно высокую эффективность этого метода в скотоводстве» имеется ряд малоизученных вопросов, ответы на которые смогли бы повысить эффективность осеменения коров, В частности» в процессе заыоражиьаиая погибает более половины -сперматозоидов. Изучение причин данного явления и разработка . более совершенных криораэСавителей дня спермы быков, позволило ' ... бы повысить выживаемость сперматозоидов в процессе криообработки и их оплодотворяющую способность. Кроме того, это позволят увеличить запас спермодоз, заготовляемых от высокоценных в племенном отношении производителей.

; Специальными исследованиями доказано, что результативность осеменения коров замороженной.спермой на 20-30$ ниже/ чем от ' свеявполученной.(А.Гордон,1988). В этой связи для дальнейшего 'развитая а совершенствования метода криохонсерваща спермы бы-.вов необходимы более основательные теоретические исследования. V ' В овцеводстве метод глубокого замораживания сперма бара- нов разработан в меньшей степени и пока не нашел широкого при-

иевения в праятнке, хотя значение данного метода для овцеводст-ч. ва актуально не менее, чей в скотоводстве. При этом появилась ; ■ бы возможность широко и о большей нагрузкой использовать высо-_;|коценных племенных баранов, в особенности; проверенных по ка- -4 честву потомства. В настоящее время по России нагрузка на одного барана остается,еще достаточно низков и составляет не более 350 овцематок вабарака. Внедрение метода глубокого замора: кивания спермы барановв практику,позволило бы заготавливать от них- сперму в течение всего года в'значительно увеличить число овцематок, осеменяемых.спермой выдающихся производителей. Недостаточное внедрение в практику данного метода обусловлено ■•■: пониженной ферхняьыосты) криоконсервированвоЙ спермц баранов.

Биологические причины данного явления изучаю*. пока очень слабо и требуют дальнейших всесторонних исследований.

ЦЕНТРАЛЬНАЯ , НАУЧ*-!дл Б'-'оЛИОТЕНА f.tóac, соль:.-о.<оз амадомю«

í 1нс. №

В втой связи особ;» актуальность приобретают сравнительные исследования межвидовых особенностей криоустойчивости половых клеток баранов и быков. Выяснение причин различной крмоустойчи-вости и фертильности оттаянной спермы данных видов животных на более глубоком уровне, чем это делалось до сих пор, необходимо для совершенствования методов повышения крхоустойчивоств сперматозоидов баранов и разработки способов-повышения эффектяв-' но сти использования их криоконсервироваввой спермы. *' .

Яель_работы - совершенствование метода глубокого замораживания спер»ш баранов : *-/и внедрение его в практику, а так- . же повышение эффективности использования криоконсервировакной спермы быков путем улучшения крМозавдтных свойств синтетических разбавителей и разработка метода прогнозирования криоустойчивоо— ти спермы быков.1 .'

5а£ачи_иссл2Дованай: * " :

, I. Выяснить видовые особенности надмолекулярное структуры ; * плазматических мембран в гаметах йарана и быка и влияние на. данный показатель различных факторов. .

2. Изучить влияние криообработхн на систему регуляции нэре-хисного окисления лигшдов в сперме животных. * *

3. Проанализировать особенности криогенных изменений метаболизма некоторых фосфатов в сперме,.

4. Исследовать криозавдтное и антиоксилантвов действие некоторых веществ на половые кпетки барана ж бкка.

5. На базе результатов теоретических исследований разрвдо» . тать более эффективные приемы.защиты гамет барана в процессе ах глубокого замораживания.' . .у'1

6. Изучить влияние некоторых физиологических факторов на результативность осеменения овец криоконсервированной спермой. •

7. Разработать более аффективную синтетическую среду для ~ . замораживания спорый быков. ' • ■ ^ ■ • V. , *

8. Изучить взаямосвязь некоторых фкзжалогичесхжх показате- -лей спермы быков с ее криорезистеятностью* - - : > т' - г

9. разработать более совершенный метод прогнозирования и ^ криоустоачивости спермы быков. \. . '

...... -з - ;

Научная идвизка. Впервые о помощью ЗПР-спектроскопии выявлены особенности надмолекулярной структуры плазматических мембран сперматозоидов барана и бьоса и влияние на нее различных факторов.1 ■

Установлено, что криококсервадая оказывает стимулирующее действие'на пароксилащн лигтдов, особенно в гаметах баранов.

Впервые показано, что криообработка индущгрует утечку внутриклеточного антиоксядактного фермента - су перо ксиддиемутазы из «шрыиев барака и быка. :

С помощью ЯМР-спектроскошл обнаружены особенности криогенных изменений метай слил на некоторых фосфатов сперма животных,

В семенной плазме быков выявлено присутствие криостабильно-го овуляторйогофадтора. Установлены принципиально новые факты криогенных измене&ий имму но модулиру гадах свойств семенной плазмы варана. . ' Л . .

Разработана и внедрена в практику овцеводства новая синтетическая ГЕТК-трко-буферная среда дня замораживают саермы баранов (A.C. * 1408576,1988 Г.).

Впервые выяснено, что сухие яйцепродукты оказывает высокое . криозащитное влияние на сперму животных я могут использоваться в составе криоразбавителеИ спермы {A.c. * 1501333,1989 г.).

Выявлен новый синтетический аятиоксидант, повышающий крио-: устойчивость сперматозоидов барана. •

Показано, чтонекоторые, широко применяемые в практике компоненты синтетических сред, обладает выраженным антиоксидантным действием н могут кнгнбжровать процессы лероксидагщи липидов " В Г*М«в1ЖЖВ0ТКЫХ, ■'■:'.: ■

На осюве комхиексонатов металлов создана новая синтетическая среда дм замораживания.саермы быков. ; '

разработан новый способ прогнозирования криоустойчивостя наткввой спермы быков,' основанный нанзмереюю с помощью ШР--спектроскогоа уровня мжяровязкост* плазматических мембран Гамет (A.c. ÄI8I3424.I992 г.').

Основные положения.' вьшосимые.ва зада ту: видовые особенности кряорезиствятности спермы баранов и быков.обусловлены уровнем микровязкостя плазматических мембран половых хлеток ж различной устойчивостью системы регуляшж, ле-рекисного окисления лиякоов в гаметах пря криоконсервадаи;

- разработка новой синтетической ГЖУК-трис-буферноП среда . для эамораютания сперма баранов и ее практическое приманенив;

, - физиологические приемы повышения результативности искусственного осеменения овец криоконсерввровавной спермой путей использования миорелаясанта и гонадолиберика; ...

- прогкозироваже криоустойтавости спермы .различных быков-■■' -производителей возможно на основе изучения взаимосвязи ряда физиологических характеристик гамет с их устойчивость» к. воздействию низких температур.

Практическое^зцачение,работы. Выяснены некоторые видовые особенности, связанные о неодинаковой криорезистектноотью спермы баранов и быков, которые могут быть полезными при совершен- -ствовании методов криоконсервации спермы других видов животных. Экспериментально обоснована возможность применения некоторых -современных биофизических методов для анализа биологической полноценно сги дативной и крноконсервярованной спермы животных.

■Применение новой ИУК-трис-буферной среды ддя замораживания спермы бараков, позволяет шмфчать удовлетворительные дга прак-\ тики результаты искусственного осеменение овед,

Покаэано( что результативность'осеменения овец криоконсер-. вированной спермой может быть улучшена с помощью некоторых фа— -экологических приемов. ; ■ " . г .. ''

Созданная синтетическая среда для-замораживания-спермы быков, позволяет повысить результативность искусственного осеменения коров. . '

Разработанный способ прогнозирования криоустойчивости сперши быков позволяет увеличить заготовку замороженных сперыодоэ : на одного производителя и.отбирать для пдемпредприятий животных с высокой крноустойчшзостьв спермы. ':'- : > .- У ;

. Реализация результатов „ исследований. Материалы, полученные в экспериментальной работе, использованы цри разработке на- . учно-ыотодаческях я нормативно—технических документов*

■ I. Методические рекомендации ш технологии взятия, глубо-

■ 5 -

кого замораживания к использования спермы бараков-производителей про искусственном осеменении овец. - Москва,1986 г* .

. 2. Нетодические рекомендации по технология кормления,содер-*ания,подготовка шсокоценных баранов-производителей к взятию семена, его глубокому замораживанию и максимальному использованию выдающегося отечественного в зарубежного генофонда. - ДЩОС СССР, 1989 г. ■,.■.*..-'•"•'■"■

3. Наставление по применсшта ГХУК-трис-буферной среды дм разбавления,заморщкшвания.хранения и использования спермы бара-вов-производнтелей. - ВНИИплен,1992 г. Одобрено и рекомендовано в практику Ветеринарным фармакологическим Советом ГУВ Госагро-прсыа СССР 13 дехабря 2988 г, '

■'■."•,■ 4. РазработанналГ2УК-грвс-буферная среда для замораживания сперма бараков используется на плешфедприлтиях 33 областей России и ближнего зарубежья.

Апробация работы.■ Основные положения диссертации долохеш ж одобрены ваг ; 1 '■■.-"

■ - И'Всесоюзной совещании по химии и применению комллексова-тов х комплексоков металлов. - Москва,1933 г.;

■ - Совещаниях-семинарах по искусственному осеменению с.-х. жюотншс. -Москва,ВДЮС СССР (198?г1990 гг.);

— Всесоюзной научной конференции "Использование физических в биологи ческах факторов в ветеринарии и жив отноэ одстве". - Витебск,1991 г.; .>'.■''■'

- Лконференции "Бноантиоксадант"--Москва,1992 г.;

— научных чтениях! посвященных памяти академика-Ыилованова В.К. - ВИХД993 Г.;. ■ "

'."- ежегодных научно-методических конференциях ВНИИшшм (198&-1993 гг.); ' "

- на производственной совещания специалистов ПО "Хакасское"* - Абакан,199Э г.;

- - научно-методической конференции лаборатории биологии воспроизведения с.-х.животных ВНИИ племенного дела,январь,1994 г.

.По иатериалам диссертации опубликовано 26 печатных работ в журналах "Доклады ВАЯНИЛ", "Сельскохозяйственная биология", "Зоотехния", "Овцеводство",! Трудах ВНИИилем.

М-ьем и структура рк^ртацид- ■ Пн^ляртяггия состоит из введения^ обзора литературы, собственных, исследований,' обсуждения

полученных материалов, выводов, предложений производству, списка литературы и приложения. Работа изложена на. ИЧ страница* машинописного текста, содержат .70 таблиц к 7 рисунков. Список литературы включает 477 источников, из них 28& иностранных,

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ .

- Экспериментальные исследования выполнены® лаборатории биологии воспроизведения с.-х.животных ВНИИ племенного дела, на кафедре биофизики МГУ им.Ломоносова,отделб.химической и биологической кинетики Института химической физики РАН.

Научно-производственные опыты в период с 1982 по 1993 хт. бши проведены на базе хозяйств Хакасской х; Калмыцкой респуйлик, а такжо Московской и Тульской областей.-

Объектом исследований' служила сперма баранов различных пород и быков - гшпитнно-фризской породы.: , - -

Для изучения видовых особенностей надмолекулярной структуры плазматических мембран гамет барана и быка'был использован -метод электронного парамагнитного резонанса сливовых зондов • (Л.Богшинер,1979).В качестве сташового зонда использовали 5-док склстсарат. „-,■■■''

Исслодование особенностей пероксвдации липидоввсперыиях барапа и быка приводили с помооы» метода индуцированной ионами железа хеиалшикесценции (Ю. А.Владимиров, М. П.Шерстнев, 1989). Определенно концентрации липидных гидроперекисей в образцах спермы проводили с помощью спектрофотометра СФ-26 но методу ■ В.Б.Гаирилова и М.И.Мишкорудной (1963), а концентрацию малонового длальдегида - по методу К. 5а£о/1(19?8).. * ' . ^ ' Анализ активности су перок сцдгшсму тазы в натхвной я криохов-сервированной сперме животных проводили хемилюминесцеитным микрометолом {.Т.Иии. е.а Д9&4). при атом использовали медицинский ■ хемилюмикометр ХЛМ I ц-01, ФЭУ-130. ..."

Изучение метаболизма некоторое фосфатов в вативной и врио-консервированной сперме животных проводит с* помощью метода -V 31Р-ЯМР высокого разрешения (С. 1976). Спектры >

31р-яда высокого раэрашения образвдв спермы регистрировадп на ЯМР-спектрометре АМ-4Ю ("Брукер",ФГТ). Влияние глубокого замораживайся на иумуносупрессивные свойства семенной плазмы бара-.

- 7 '

нов исследовали с помощью реакция бласттрансформацки аллоген-вмх- лимфоцитов крова в присутствии конканавалина - А и семей-. ной плазмы (Д.^е* ¿«ж* ¿*Д985>. .

: Оптимальное соотношение исследуемых компонентов,при разработке синтетических сред для замораживания спермы баранов х быков, находили методом встречных арифметических рядов о после-дупвдм уточнением биололгчесхжм методом процента подвижных сперматозоидов и их выживаемости в оттаянных образцах спермы ^(В.К.ЫзловавовДЭбг). Изотоническую концентрацию веществ для спермы определяла криоскоплческим и биологический'методами.

Влияние различиях веществ ня хртоустойчавость спермы баранов х быков определяли по подвижности и выживаемости оттаянных образцов сперыы и по результатам искусственного осеменения овец ж коров.

2дя замораживания спермц использовали эякудяты с додриж-,( костью не менее 60^ в концентрацией спермиев - не ыекее 2 млрд/ид для баранов * I илрд/ыл - для быков. Заиоратаваяя сперму обои видов в форме открытых гранул объемом 0,2,мл на пластине сухого ■ льда или фторопластовой пластине. :

- При изучении влияния физиологических факторов яа результативность осеиенеимовец кржокоясервированной спермой испытывали влияние специфического маточного киорелаксайта - утерорелак-- сана, синтетического гояадолиберина - сурфагона х антистрессового вещества— углекислого лития. При этой сперму баранов разбавляли и замораживали и ГХУК-трнс-буферноЙ среде. Оттаивал* . сперму в злектрооттаивателе прц80°С. Овец осеменяли или однократно, сразу после утренней выборка,, или двухкратно: сразу после выборки и повторно, через В часов. Результативность осе-меаенжя учитывали по. ягнению овцематок.

В экспериментах по прогнозированию криоустойчмвости натхв-ной спермы быков опредаляли . жирнокжслотный. состав обпих лилидов ' гамет с помощью газо-гидкостной хроматографии (А.Г.Верещагин ' и др., 1963) и их фосфоллпидкнй состав по » М.&м-

tUf (1982). . - • : *

Механическую резистентность гамет быков к воздействию ультразвука определяли по методу В.Б.Акопяна в др. (1991),

Уровень микровязкости мембран сперматозоидов быков в связи о их криоустоЯчгвостью определяла о помощью метода протонной

- в - " магнитной релаксации (Г.В.Архллова и др.,1990),

Биометрическую обработку получении! данных проводили по Е.К.Меркурьевой (1964). ,'/■

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

9.1. Видовые особенности криорезистенткости спермы барана х быка . '''

3.1.1. Уровень мифопязкости плазматических . мембран гамет

Для совершенствования методов глубокого замораживания спермы Ь.-х. животных необходимо дальнейшее более глубокое изучение причин ее неодинаковой криоустойчивости у разных видов животных.'

Учитывая важную роль плазматических мембран в процессе . криоконсервации клеток, цель» наших исследований било сравнительное изучение параметра увородочвнностн мемйрашшх лжпндов сперматозоидов барана и быка до и после краовоэдействжя,.

Для исследования физического состояния мембран бия использован метод элехтронного парамагнитного резонанса спиновых зондов. В таблице I,представлены данные по определению параметра' упорядоченности спектра ЭПР в мембранах ватных сперматозоидов,

■ Таблица X •'

Параметр упорядоченности ¡зонда в мембранах нативных.

сперматозоидов -■.., -

' { . ! Йодвадао сть спертйараметр уноря-

Вида животных { П. )матозоидои (в {доч^шости зов-,,

•Баран 10 80 0,663*0,006

Бык ; 10 . 80 . " ' 0^703^0,005 ' .

Установлено, что имеются видовые разлачия молекулярной .•' структуры мембранных липидов: параметр'упорядоченности, харак- . теризущий подвижность зонда в мембране, в нативных спермато- ' зондах барана ниже по сравнение с быком (Р<£0,01). Это свиде- ~ тельствует о меньшей иккровязкостк "лишдеоЙ части ыембравыв , сперматозоидах баранов. ■/'- ,.■-.».■■'■':' '.г-: "л" ' V ■ -.■- './'

.:■ '■"■ 9 -

Результаты экспериментов по влиянии криообработки на структурное состояние мембран спермиев животных показали, что под влиянием глубокого замораживания происходят изменения конформа-циоиного состояния их мембраны. Уже в процессе охлаждения до +4°С происходит увеличение параметра упорядоченности мембранных липидов,' вероятно, обусловленное нарушениями белково-лдтщадх, связей в мембране и выходом части фосфолнпидов из мембраны в окружающую среду,: ^

Цроцесс замораживания-оттаивания приводит к дальнейшему нарастанию биоповреждений мембраны, о чем свидетельствует повышение параметра упоредоченности.

''После-замораживания сперматозоидов в среде без желтка, гаметы барана'сохраняли довольно высокую подвижность сразу после оттаивания, а товремя как у быка,, подвижность наблюдалась у единичных сперматозоидов.. Но время сохранения подвижности било р^эко снижено по сравнению с замораживанием в среде с желтком. Вероятно большая разупорядоченаость мембранных липидов у барана и обусловливает повышение выживаемости сперматозоидов при замораживании в среде без желтка. Но с другой стороны, эта особенность их мембраны может быть ответственна за снижение результативности осеме-явная овец криоконсервированной спермой. -

' Синтетические среды для разбавления и замораживания спермы животных содержат различные гидрофильные и гидрофобные компонен-. ты,: оказывающие криозаштное влияние на гаметы./

Механизмы защитного влияния .различных компонентов окоичатель 'но пока на выяснены. -■'■.■- '

В атой связи актуальным представляется изучение влияния раз' личных веществ непосредственно на плазматическую мембрану сперматозоидов. . •.; ;:

Результаты наших экспериментов показали, что добавление желтка в. состав разбавляющей среды приводит к снижению параметра ■ ■ упорядоченности спинового зонда в мембранах сперматозоидов, что свидетель ствует об уменьшении микровязкости лшщдной части ыемб-раий в ответ На добавление желтка, Причем, у быка.отмечается более заметный результат раэупоредуицего действия желтка по сравва-ни» с .гаметами барана (Р<0,01). Возможно, это связано с тем,что ..: мембрана дативных сперматозоидов барана характеризуется. меньшей "макровяэкостью по сравнению с быком.

-10 - !

Разупорядочиваицее действие желтка на мембрану прекращалось. после отмывания гамет в безжелточном буфере. Это свидетельствует о поверхностном взаимодействии фосфолипидов желтка с ллазмати-. ческой мембраной сперматозоидов, в результате чего изменяется ее физивеское состояние. Вероятно, снижение .макровязкости мембраны ■■ под действием желтка каким-то образом и позволяет повысить крио-устойчввость сверматозоидов. '• :; s

Изучение влияния на маыбраку гамет различных гидрофильных компонентов синтетических сред показало, что оии не оказывал* влияние на уровень ее микровязкости,

3.1.2. Особенности перекисяого окисления лхгшдов , в гаметах . ■ * '' :. ■..'

Имеются данные, что ¿фиохонсервацвя может-оказывать стимулирующее воздействие на перохсидащю лигаиев (ПОШ) в сперме некоторых видов животных, что может оказывать отрицательное влияние на ее фертильность (В.Кононов, А.Нарижиый,19в1; В.Наук, А.Гуськов, 1963). В связи с_ этам мы изучали влияние криоконсервааии на уровень пероксидации липидов в гаметах баранов в быкев с помощью метода индуцированной хемнлшинесценции, '.■ .'-■'''■...■■ ..

Результаты предварителышх зкспориментов показали,- что натиа мне'сперматозоиды барана к быка имеют очень слабую спонтанную,хе-милшннесценгшю (ХЛ). При добавлении же в образцам гамет ионов железа, происходила инициация ПОД* сопровождающаяся характерной для каждого вида животных кинетикой ХЛ. ' ;

Причем, на кривой ХЛ сперматозоидов быка удается наблюдать только быструю вспашку свечение после добавления sobos железа, развития ж» медленной вспышки ХЯ ве происходит*. В то время, как.. у барана можно было наблюдать быструю х медленную вспышку XX* ./

Эти результаты свидетельствуют, что в ватжвных гаметах барана ПОЛ инициируется при добавления ионов железа ах&чжтельно сильнее по сравнению с быком. Ывмбраш сперматозоидов быка имеют, вероятно, белее мощные антжокевдитше системы, обеспечивающие устойчивость системы регуляции ПОЛ к инжциирувдвму воздействию: ионов железа. •■,*-.''*-

В следующем опыте изучали влияние криообработки гамет ял кинетику ХЛ (табл.2)*

'-п -

.' . . Таблиц» 2

' Величава амплитуда быстрой (Л) и медленной (Н) .вспышек ХД в суспензии оттаянных сперматозоидов

Группа оти-а j Jt j ' £ыК, " f Баран '

: ■ i * " 1 г д

До замораживания 7 0,58*0,04 0. 0,74*0,07 0,83*0,04

-.Через'Ю* после- ■ . " ■ '.■■.' ' - ' оттаивания 9 0,51*0,П 0,244,08 0,3440,08* 0,96*0,18

Черва 30' после . я . ' * и» *

оттаивания 9 0,47*0,08 0,11*0,02 0,29*0,04** 1.00*0,Г5*

Через 90* после

оттаивает* ' - 9 0,56*0,06 0,19*0,02 0,19*0,0?** 1,10*0,17**

Через 120'послв . *-■ ' . .- „

оттаивания . 9 0,41*0,04 0,04*0,01 0,43*0,14* 1,10*0,15**

• •_• • _ - • ' _____ ..' _~_w 4._ • * - • " . *

*Р^0,05; ** P4 0.0I. . ,

• Из таблицы 2 видно,что процесс криоконсервации сперматозоидов оказал стимулирупдее влияние на пех>сксддадию лили до в. Это характерно даже для более устойчжвах гамет быка. Беля в нативных гаметах бкков не было отмечено развития медленной вспышки ХЛ, то после оттаивания• она била четко выражена, но ее амплитуда снижалась по мере инкубации оттаянных сперматозоидов при 37°С с 0,24 до 0,04 х 1СГ квант/с»4Х. . ,

*'■■ Амшштудя [быстрой вспышки у этого вида животных после оттаивают была практически одинаковой на протяжении всего временя исследования. .Амплитуда надоенной вспышки у быков, поеле-кратковременного подъема сразу шеде оттажваизя, уже через 30 минут хикубацих начихала снижаться,их концу второго часа практически, исчезай, что ¡свидетельствует о возрастании активности аатиокся-ддитнсС системы в гаметах быков в этот период.

: в образцах оттаянных сперматозоидов барана амплитуда свечения быстрой вспышки снижалась сразу после оттаивания ^оставалась практически на одной уровнвв течение периода'* наблюдения. ^

, Амплитуда же медленней встшакж у этого вида животных сраэу^'" поме бттажванжя »»эросяя жа I6J я к концу периода; юЛиюдевжй t - повысилась на 32i (Р<0,05). Это свидетельствует как об интенск---: фвсацхж компонентов ПОЛ, так жёб »одабл вняв функцигантиокск-

' ■ - 12 - - ' ■*'■.'

дантной системы в гаметах баранов, подвергнутых криообработке. -

В следующем опыте мы изучали влияние криовоздействия на скорость спонтанной пероксидавди лшщдов в образцах спермы хн- ' вотных <ТабЛ.З). . V ' . . ' „ . '

л ■ ; ; Таблица з ." Концентрация продуктов ПОЛ-в заморохенно-оттаянных образцах спермы животных

ЙН^ЛЯЖ1^>011вреКИСИ{ МИ. шольА«.. . спермы при 37°С, мин }-1---(—■■-.........i-:—

• j <ggf ¡1S) ¡/ffifr"(.

Нативкая!сперма. 0,80*0,07 0,72*0,01 6¿40*0,I 4,9*0,1

5' после .оттаивания •: 0,70*0,07 0,43*0,01 : 6,2*0,2 5,3*0,1

ЗО'косле оттаивания 0,70*0,05 1,50*0,5* 7,1*0,3^ 4,6*0,3

60'после оттаивания 0,64*0,05 1,10*0,1 \?,7*0,4* 5Д-0,2 •

I20'no<yie оттаивания 0,40*0,04* 0,50*0,06 8,3*0,3* , 5,2*0,4 ,.

* p<o,os. "'"""'....."м";-'*"

Показано, что в образцах спермы быка через 5 минут после V". оттаквакия концентрация липидаых гндролорекисей несколько снизилась. Затем, через 30 минут после инкубашш пра 37°С oica воэрос-ла в 2,1 раза (Р^0,05). После этого их концентрация начинала снижаться и через 2 часа после оттаивания она достигла практически первоначального уровня, ■*•' ■- ■ ■*

Концентрация МДА. в сперме быка после отталвавзя в течение : -2-х .часов оставалась практически на том хе уровне,, что и до за- " мораюгоания, Вероятно, эндогенные антиоксидавтные системы спер-'; ш прерывали повышенный уровень тороксидацкк лшшдов путем икак- -тнвацин повышенной концентрации первичных продуктов Ш1.:

В сперме же барана концентрация МДА через 5 иипут шсле от-. тагваюи была такой же, как а до замораживания (6,4 в 6,2 нмоль/мл соответственно)» Но в процессе даяьнвйшей кнкубацнж оттаявших спермиев при 37°С, происходило нарастание концентрации МДА. Уже через 30 минут досто оттаивание его концентрация, увелжчзиась.ва : *'.г 14¡í, а через 2 часа - превышала'начальный уровень ва 34*. Ко&- ? . центрадая же лжпядных гидрогоэрйкисей' в концу периода инкубации снизилась ^ 495£.,--.":- -Л--.-.■.'■. .'I*-- ■ '-.■■'■.1 ■■■■'"'.■■

, 13 -

; • Полученные результаты свидетельствуют, что кркоконсервацая оказывает стимулирующее влияние ка ПОЛ, особенно в сперме баранов. Это может являться одной из причин снижения фертильностж крхокоясервированяой спермы баранов. , .

3.1.3. Активность супероксиддисмутазы в сперме ' животных ; ■

■'>"".. Известно", что в клетках животшсс спонтанное ПОЛ может ивду-цвроваться суаероксвднш! радикалом { 0¿ >, который является родо-■ начальником всех активных'форм кислорода (И.Б.Афанасьев, 1988;: Ю.А.Владимиров и др.,1991). ;

Большинство аэробных клеток имеет, эндогенные антиоксидант-sue ферменты, ключевым из которых, яьдяатся суиероксвддисмутаза

(СОД). ' ■ . ч

.'■/. В связи с тем, что„сперматозоиды барана более.подвержены пе-роксидаши лшшдов, мы предположили. что это может быть связано с различным уровнем содержания данного фермента в сперме сравниваемых. видов' ЖИВОТНЫХ. -- :.

".В связи с этим, нами били проведены эксперименты по сравнительному изучению концентрации супероксиддисмутазы в нативной и кржоконсервированлой сперме баранов и быков.

Результаты изучения активности СОД в нативной сперме показа-лж^ что в гаметах барана н быка активность фермента была практически одинаковой: 22 И 25 ед.акт/109 кл соответственно. *.

В семенной плазме баранов х быков активность COA соответственно составляла II и 8,7 ёд. акт/мд... * : ' ' Данные о влиянии* процесса ' ка актжв-- кость СОД в половыхклетках представленыв табл.4.-

Результаты этого ахсперамента похазадй, что процесс замора— хиваяия-оттадваяияоказал значительное влияние на потере внутриклеточного фермента половыми хлетхамк,. что сопровождалось его утечкой в.инкубационную среду.; ■>.. '-Л. , ■

. Установлено.также, что имеются определенные межвидовые раз- -' • лжчжяпо скорости утечкн внутриклеточной СОД кэ сиермиев после хх криоснЗработа. Так, скорость выхода фермента ха гамет баранов была заметно выше, чем у быка. Максимальный выход СОД хэ половых клеток барана ваблвдыся уже через 60 пхнут посхе оттаивания, в :

Таблица 4

Влияние криокоясервации из утечку СОД из сперматозоидов в окружающую среду •

Образцы спермы |Баран ( п =10) ] Бык Сп^в) (июсубмшя при, (П0ДШШ£йстыактивность (Еодвияиостыактивность ■ ^ 1гамет(в %) I ' ООД (гамет(в Г ООД

! 1(ед.акт/мл ! . 1(ад.акт/ыя.

-;-:-£---!_СВВДЦ)_I - ■'■' " ■ I СРУДУ^

До замораживания 82*5,7 - £¿2^0,2 80*8,1 2,3*0,1

Через 15' после • ' . ~ '

оттаивания . 41*4,8 6,7*0,4** 40*6,2 5,3*0,3*

Через 60* после ■ - ■' ■ „ * *

оттаивания 32*2,8 *7,5*0,2°' ; 30*4,1 .5,3*0,2*

Через 120' после ' . ■ . • ' ■ . ■

оттаивания. 25*3,4 Л,0*0,3** ; 28*5,0 8,2*0,4®*

* р<о,05; ** р^0,01. > - V;;

то время как у быка - через 2 часа. Хотя снижение подвижности '' ; гамет сразу после оттаивание и в течение инкубации у обоих видов животных было практически одинаковым. Следовательно, в плазматических мембранах сперматозоидов барана после их оггажваиия,быстрее развиваются криодеструктжвшге поврввдеижя.в частности, из— меняется их проницаемость, следствием чето й является более быстрая утечка'супероксидЕисмутаэы из клеток в окружащую.среду. Снижение активности СОИ в сперыиях в результате крисконсервадга ; может способствовать ув&шченн» внутриклеточной ковцевтрвпдо : активных кислородкых радикалов, соособствуяцкх бирдеструкдак и-. инициации пероксидацни литдов в сдерывях, что может снижать фертильность оттаянной спермы животных. ^ "

- 3.1.4. Криогенные изменения метаболизма некоторых фосфатов спермы

С целью выяснения воцроса о ровиожноств изучения криогеияых изменений метаболизма некоторых фосфатов в сперме животных с помощью метода 31Р^Ш'н;пектроск(ишг, были проведены мштв на -■;■-,.; сперме баранов в быков. В результате анализа спектров Р-ЯИР : ; дативных образцов спермы баранов и быков было установлево,что сигналы фосфора вобласти (+0,35) м.д.обусловлеяы фосфатной ■;

группой гдвдеро-З-фосфорилхолкна (ГФХ), а в области (+0,6) -(+1,3) м.д. - неорганическим фосфатом ( Ft ),

Результаты измерений иитенсквностей сигналов ГФХ и P¿ в образцах спермы до и после криоконсерваоти показали', что в натив-ной сперме барана концентрация ГФХ и P¿* была выше по сравнен!» о таковой у быка, на 35 и 4й% соответственно (?> 0,05). Крнооб-работка не оказала влияния на содержание в сперме обоих видов животных глицвро-3-фосфорилхолина.

Более заметной была тенденция изменения концентрации в оттаянной: сперме неорганического фосфата.

Так, в сперме быков концентрация Р; через 2 часа после оттаивания i инкубации.при 37°Сувеличалась на 22$, а в сперме баранов, за тот же период наблюдения, его концентрация возросла на 50? (Р>0,05). Джнамжка содержания изучаемых веществ в сперме после оттяхвакхя практически не коррелировала с подвижностью га-мат. Снижение их подвижности после замераживания-оттаивания било сходным у обоих кедов тавотных. Результаты данных экспериментов свидетельствуют/ что в сперме баранов.имеется более выраженная .тенденция нарастания концентращх неорганического фосфата после заыоражжБавжя-оттгдвания. Не исключено, что пониженная фертядьнесть криоконсервжрованной спермы баранов может быть связана с этим фактом. * ■

' > " ЭЛ.5. Гонадотроояая активность семенной плазмы

животных.

С целью певищевхя результативности осеменения овец криокон-сервжроианиой елврмой актуальным является изучение биоактивных веществ семехаой од&змн и их сохранности в процессе за»оражив«~ нхя-бтхажванпя. Недавно уставовлеЕО, что в семенной плазме вер-блэдо» содержатся вещества, иидуадрусщие овуляцию у сачок этого' вхда ( Я. Citen. ,1985). В этой,связи мы предположили, что и я семенной днаэме баранов и'быков может содержаться подобное вещество, х не хашгаено, что,неодинаковая криостабзиьность данного вещества'может быть связана с фертнльностью оттаянной спер-.

мы этих животных.'

V Для выяснения зтого вопроса бшш проведены эксперименты на

- 16 - ■ * . крольчихах, который вводили внутривлагалюцно натквнуп, ш крио-консервнрованную семенную плазму различных В2довживотшх(табл.5).

■ Таблица 3

Влияние нативной семенной плазмы животных

на овуляцию у крольчих - / г . -

1 "■■' | .1 | ■ ■ ,■■ г 111 -■■'■' '■; ......- -........

Вид {Объем вве—¡Число кро+Число кроль-{-Об наруже но] Количеств о . животных Ценной, {льчих в ¡чих о овулят-келтых тел;желтнх тел ¡плазмц(мл)|опыте |щей , ) (всего) {на самку

Баран 1,2 . 10 - - . ' , -

Бык ■ 1,0 12 б . 45 7.5

Херебец . - 1,0 ' 10. I 3 ■'-.■-'-3 • :

Кролик 1 1,2 .. 9 .:■■■■''-'.

хряк 1д • 13 .'.'"'■■' - V

Из таблицы видно, что семенная плазма быков оказала стимулирующее влияние да овуляцию у крольчих. Овуляция наступила-у. ■505» самок. Это свидетельствует о том, что а семенной плазме быков содержится какое-то вещество, ивдуцируящее овуляцию у кроликов. . ......

Опыты по изучению сохранности биоактивного вещества семенной плазмы быков после кряо- а высокотемпературной обработки показали, что процесс глубокого замораживания семенной швзмы быка не оказал яяактивируицего влияния на активность ее овулятор- . ного фактора. . . . . . ■:

Нагревание же семенной, плазмы до 90°С привело к полной инактивации данного фактора. Представляет несомненный практический. интерес выяснение природа данного фактора я его влияния ва. редро-дуктивную функцию у КРС. . '

З.Х.6. Имму иомодулируццие свойства семенной плазмы

Известно, что в семенной плазме животных содержатся юоаую-депрессалти (В.И.Говалло,1987). ;

В связи с проверкой гипотезы о возможных криогенных ксиене-=* киях иммунорегулируших свойств семенной плазмы баранов мн «со- * ледовалд гмму но супрессивное влияние их ватявноВ я кржоконсервж-рованной плазмы на алло генные лимфоциты крови.

. Результата экспериментов показали, что добавление нативной .саманкой плазмы баранов к культуре клеток крови при разбавлении 1:200 s 1:400 оказало некоторое'супрессивное влияние на бласг- -трансформации лимфоштов, при этом включение ^К-тимвдина в лим-'фоцйти по сравнению с контролем било ниже на 18 я 12% соответственно (Р<0,05). При снижении концентрации семешю 11 плазмы в культурной среде, начиная с разбаЬлеюш 1:800. отмечено ее стлму-лир у вще э действие на включение мо нону кл еарами мечоног.о предшественника. При добавлении же.в среду культивирования плаэш в разведении 1:3200, стимуляция включения %-тимидина составляла 350£ по сравнению с контролем (Р-^0,01). " . „

. Культивирование ыонснуклеаров в присутствии завороженно-оттаянной семенной пла^ыы при всех разбавлениях привело к значите-■ дьной стимуляция включения 3Н-тимщщна. . : ■.'■*■

При.этом.максиыальный уровень включения метки был в куль^у-. pax с разбавлением плазмы 1:800 в 1:1600 и превшал таковой в контроле в 6,1 и 6,2 раза'соответственно (Р^-0,01). Резкое усилениехммуноактпвируюикх свойств семенной.плазмы после кртообра-, ботки, вероятно, может быть связано с понижением фертильности ■ криоконсервированной спермы баранов.

■■".■'= 3.2. Влияние различных веществ на криоустойчивость ' ■ ' спермы барана •

■ 3.2.1. Действие неэлектролитных и электролитных

компонентов среды

В технолога* длительного хранения спермы баранов первосте-.',_.: пенное значение отводится разработке более совершенных криозащитных разбавителей. '."

На основе комбинации различных соотношений ксилита, лакто-' зи, трас-(оксиметил)-ьышоиетана, декстрина, глицерина л желтка куриных яиц, трилона-Б вами была разработана новая синтехичес-,; / '. хая среда для замораживания спермы баранов, названная Г2УК-трис--бу$ерной средой (гдицэрино^елточно-углеводдо-комшгексонатно-трис-буферная среда).

Оптимальная состав данной среды следуншй, г/100 си3 дистиллированной воды: лактоза- 8,4; декстрин кукурузный - 5,0;

- ie - /."'

ксилит - 0,26; трио-{оксиметшО-аыаноыетая - 0,105; традон-Е -- О,133; глицерин - 6,0; желток - 20,0.

Проверка криозащитного влияния различных декстринов, при их введении в состав новой среды;.показала, что лучшими защитными свойствами на спершга барана обладает кукурузный декстрин с растворимость» 67^.

При изучении крнофиддктичесиого действия на сперму барана ■ различных концентраций глицерина в составе ГЖУК-грпс^буферной среды было выяснено, что наивысшие показатели подвижности s выживаемости оттаянных спермиев получены при концентрации глицерина 4-6Í.

Выяснение'о пгкмального срока эквилибрацяи глицерина со . сперматозоидами показало, что различная продолжительность експо-зтцга глицерина с'соловыми клетками барана (5, 15, 30, 60 и 120 ыин до замораживания) ве оказывает значительного влияния ка^* ' их подвижность сразу после оттаивания. Однако, срок выживаеиоо-ти оттаянных сперматозоидов резко снижается при сокращении-вре- . мени их экспозиции с глицерином до 5-15 кинут. Поэтому оптимальный период инкубации спермы барана с глицерином в ГЖУК-трис-бу-фервой среде должен быть ве менее 60 минут.'

После установления оптимальных дозировок различных конго-'; нентов и способов их введения в осстав новой среды; .мы цроанали-, зировали криозалитные свойства новой среды го сравнению с пкмн-арабиковой, которая применяется в практике осеменения овец. ..

Было установлено, что при замораживании спермы баранов в новой среде, подвижность оттаянных сперматозоидов я их выживаемость /была выше, чем в гуюпшрабиковоЯ среде (Р-£0»05).'Это позволяет увеличить степень разбавления* свежеполученяой спермы без сниже-* кия числа биологически полноценных гамет в доге для осеменения.

Одномоментное разбавление спермы в опытной среде не оказа*- 1 до отрицательного влияния на подвижность гамет im сравненно е двухмоментным разбавлением в гуымиарабнкевойсреде. -. ■ -

В еледушем эксперименте изучали результативность искусственного осеменения овец спермой, замороженной s ПУК-тркс-буфер-вой к гуммиарабиковой среде.(табл.6). ■ ■ '''У,'., ** 1

Было установлено, что в опытной группе объягнился такой же. процент маток, как х в контроле, несмотря на уменьшенное число ; сперматозоидов в дозе для осеменения, иногоплодие маток такжа у

• ч -19 - .

не отличалось по группам.

. . ". Таблиц» 6

Эффективность искусственного осеменения овец ■.. спермой,замороженной в различных средах

■ ■-"-■'* . } Степень ¡Концён- !осв-}раэбав-|трашя ¡мене-Состав среды {лекия Iсперма- {но

•спермы !тозоидов;овец . г »в дозе* } | после от| _1_ 'таявания'

УчтвтОб^-!? объяг-|числло

но I ягни|лившихся} ягнят ¡лось} ,на мат-

г I К

I 'I I

I I I

гаук-трио-ву-феркая

Контрольная. (гуммиарабико- - -вая) : 1:2

1:3 60-70. ; 109 101 52 51*4,9 1,4±0,3

80-90 . 103 99 51 52*5,0 1,5±0,2

"■ Преимуществами новой Г1УК-трдс-бу фервой среды для замораживания спермы баранов, по сравнении с гуммиарабиковой, является возможность снижения числа сперматозоидов в дозе для осеменения. При атом можно на 20-25$ увеличить количество заготовленный сверцодоз, получаемых при замораживании спермы от одного барана. Это позволит повысить коэффициент племенного использования особо ценных производителей. Кроме того, использование данной среды более технологично по сравнению с гуммиарабиковой, т.к. допускается одномоментное разбавление спермы.

Данная среда -одобрена и рекомендована а практическому при-мененкю Ветеринарным фармакологическим советом 17В СССР (прото- ' кол * В от 13 декабря 1988 г.).:

3.2.2, Криозадатные свойства сухих яйцопродуктов

В задачу наших исследований входило изучение криозашнтного -■действия еухад яйцапродуктов при замораживании спермы баранов.

.: Бшю установлено, что сухой желток и яичный порошок куринюс яиц оказывает выраженное криозащитное влияние на гаметы барана* Лучше показатели по подвижности к абсолютному показателю ■ выживаемости были получены при использовании сухих яйцепродуктов вконцентрации 43£. Поэтому, именно с этой концентрацией яйце продуктов в составе ПОТС-трис-буферной среды были проведены дальнейшие лабораторные ж производственные испытания, '

- 20 - : . В следу гадом оксперимеяте изучали возможность совместного: хранения сухих яйцепродуктов с другими компонентами синтетической ЛШС-трнс-буферной среды при различных температурах,так- , хе влияние сроков хранения.на их криосротективнне свойства* .т

Изучение возможности совместного хранения сухих яйцепродук-тов с другими компонентами IÎTK-трис-буферной среды при различных температурных режимах показало, что температурный режим хранения оказывает значительное влияние на биологическую полноценность препаратов. Ври температуре 4®С срок хранения сухого порошка и желтка удлиняется^ Совместное хранение яйцепродуктов с другими компонентами синтетической среды неблагоприятно вли— -лот на бнолоппеску» подноцеяность криоконсервировапвой спермы. : Максимальный срок хранения сухого желтка составляет 6-9 месяцев,' а яичного порошка - 3 месяца при температуре 4°С. : \

Затем.били проведены производственные опыты по осеменению овец спермой, замороженной с сухими яйцепродуктами в составе, ПУК-трис-буфоркой среди (табл.7). •

•-.; .. Табляга 7

Результативность осеменения овец спермой, замороженной ; с сухими яйцепродуктами

!кокцаа-|ОсемегВыбш1о!учт9|Обьяг^!? объяг-Лполуче-Группа опыта ¡тракая ,кено ¡из опы|но ¡вилось!вившихся}но яг-¡яяцепромвец ¡та. i f i , }нят на

{дуэтов,} . .{ у } } I ; {оацу ;

Сухой желток 4 72 2 70 33 47±5,9 1,42±0,1" Яичный порошок 4 128 4 ; 124 65 52,4±4,5 1,45*0,3

Контроль .. ' \

натнвный жал- . -

ток) 20 181 - 8- ' 17387 50*3,8 1,45*0,1

Из таблкпы 7 видно, что замораживание спермы баранов о су- ; яга яйцесролуктама не сказало отрицательного влияния на биологическую полноценность сперматозоидов. В опытных группах про- -цент ягнения овец бил практически одинаков с контролем« что сви-" дотольствувг о высоком крхоэащитном влиянии испытанных препара-юв. ■

Экономический эффект от применения сухих яйцосродуктов в ■'.■.'. составе синтетических сред для спермы животных складывается из

сннжеюи себестоимости среди г сокращения расхода куриных яиц для целой искусственного осеменения.

3.2.3; Влияние антибиотиков ' '

Одним нэ федторов, оказывагсдх влияние на результативность осеменения овец является степень 'ее микробной загрязненности.

Использование антибиотиков ври краоконсервацяи спермы баранов сдерживалось тем, что спермин барана более чувствительны х токсическому влиянию антибиотиков по сравнению о быками. В этой связи актуальны поиски менее токсичных антябиотиков-для их спермы. ■ .

В задачу наших исследований входило сравнительно а изучение влияния антибиотика "Спермосан-3" и нового антибиотика "Спер-мосак-ШХ" на биологические показатели крдоконсервировакноа спер^-мы.

Результативность искусственного осеменения овец спермой, замороженной о различными антибиотиками, цредотаалена в табл,8.

- ■:" :■ ■" "•''■■'.; - ; ■ ■ - Таблица в . ,, Влияние антибиотиков ва результативность осеменения

1 . овец криоконсервированноЙ спермой ■-",'■

Mí.tttvtrb4Pmatmft »Дозаантит-Осемене^Объягни};? объягнквтПолучено

Iro "B9Yofib í™** < Г«™*«

JlOO'»«' { ; * f

1 .I I I

Спэриосав-З 25 S3 - 23 43*6,8 . 1,4*0,2

' . ./V 50 . 32 9 28*7,9* 1,3*0,1

Сперыосан-ППХ ' 25 . 56 28 50*6,7 1,4*0,1

50 58 26 45*6,5 I¿5*0,2

- . .100 -.... : 33 .14 42*8,6 1,5*0,1

ан^игаика!3 - : \59 . * 29- 49*6,5 1,5*0,2

■ Испытания доказали, что ври использовании Спзрыосана-З. в дозе 50 тыо.ед. резко снизилась результативность осеменения: 28S объягнившхся овец против 49í в контроле* (Р<<0,05). ' '

- 22 - ■'■'•'■'■■■ Применение же нового антибиотика, даже в повышенных дозах* s« привело ,к резкой? снижению оплодотворяемо ста шаток* Лучшее влияние на результативность осеменения оказал Спермосан-ШК в дозе 25 тыс.од./1СО ил среды. При атом, одлодотворяемость была такой же, как в контроле. Использование данного антибиотика в дозах 25-50 тыс.ед. на 100 ш среды не оказывает отрицатель- . цого влаяяяя на результативность осеменения овец' замороженной '.; оперной, в связи с чем он рекомендован для практики искусственного осеменения овец. ^ . : . ■■ . : ,

'. 3.2.4, Действие различных антхоксидантов '

В данном разделе работы было проверено криозшвдтное влил-те некоторых кжзкомолекулярных тиолов при замораживании спер* мы баранов в простой лактозо-жедточяо-гляцериновой и более сложной - ШК-тряо-йуферной средах. При этом препараты жсполь- . зевалась в оптимальных дозировках для спермы баранов. ' ' ;

Установлено, что при замораживании спермы баранов в цроо-той лактоэо-глицврнно-лелточноА среде C.5Î желтка некоторые тиолы оказали высокое криоэащятмое действие. Ток, подвижность гамет, замороженных в присутствии уштиола; была выше на Iii, с настенном — на 8Î я о глутатиоком — ва 6¡С по сравнении с контрсшем. Абсолютный показатель выживаемости оттаянных спер-. матоэондов при использования'униткола повысился в 5 раз, аа группе с глутатионом в пистонном- в 3 раза по сравнению о контролем (P-CO.0I),

Ори замораживании спермы с 10$ желтка хриоэшцитноа вхкя-кие тиолов выражалось в меньшей степени. Подвижность'половых клеток после оттаивания во всех группах была практически одинаково fl с контролем. Абсолютный показатель выживаемости гамет в группе с глутатионом превшал контроль na 25Î.

. При вовывеша концентрация желтка в ЛГИ-среде до 20?. защитного влияния тиолов на криоустойтквость сперматозоидов от, мечено не было. Вероятно, повывенные концентрации желтка (10--20Î) оказывают положительное влияние на краоустойчивость сперматозоидов, защищая ¿Н-грушш гамет от'окяслеяжя благодаря -, содержанию в нем эндогенных тиосоединений, в частности, серосо-» держащих аминокислот, ■ '

■ -гз - .■..,■■'

- В следующем опыте по замораживанию спермы баранор в более слождой ГЖУК-трис-бу ферной среде бшо установлено/ что защитно-, го влияния тиолы.на половые плетка в данной среде по сравнении с ЛГ®-средой практически не оказали..

. . Это свидетельствует о том,; что использование для замораживания спермы баранов более совершенных синтетических сред, вероятно, оказывает самостоятельное* занятное влияние на сохран- '■-ность ' ^К-груш сперматозоидов, подобно высоким коицентращяц *■ желтка.: '. •• "'■.*.

.'.'■■■В следующей серив экспериментов изучалось влияние новых синтетических воднорастворимых антиохсидантов на криоустойчи--вость спермы баранов. Испытано действие следу шах препаратов: .■ анфена-дотрия,'феноксана, ИХФАН-2 и ИХФАН-3. Все от является фенольвыын адтаоксидантами.. В предварительных опытах были уо-тановлены минимально токсичные дозировки*изучаемых препаратов -для спермы'бараков^ Оказалось, что таковыми являются для анфе-на-натрия - 0,05 мг/ил, феноксона - 0,005, ИХФАН-2 - 0,01 и ИЗДАН-3 - 0,02 мг/ил. _

.Затем было изучено защитное действие этих препаратов па живучесть нативной спермы баранов при добавлении к ней гхзогев-» пых липпдных перекисей. . ■ "... .

Быдоустановлено, что,лучшим защитным влиянием на'живучесть нативной спермы при добавлении к ней переокисдекного раститель-,' ного масла, обладал феноксан. При его добавлении абсолютный показатель выживаемости сперматозоидов был в два роза'выше по' сравнению с контролем (Р< 0,05).

, Испытание криозащитного действия воднорастворимых актиок-сддантов в составе ЮТС-тряс-буферноЙ среды на спермин барапа показало, что ни одна препарат не оказал положительного влияния на подвижность оттаянных сперматозоидов или абсолютный показа- * толь их выживаемости. Вероятно, гидрофильные антиоксиданты не . препятствуют процессам ПОЛ в мембране и внутренних структурах . гамет при их криоконсервадах. • . ■

■ 1 В связи о тем» что в последнее время дня оттаивания спермы баранов применяют повышенные температуры (?5-60°С), которте 'могут ускорять'ПОЛ лри перегреваяш-спермы, било проверено за»-цнтное действие гидрофильных антиоксидантов на сперматозоиды, при;их инкубации при повышенных температурах -(*44°С). - '*./■

.- 24 -

Результаты этого эксперимента показали, что в условиях повышенной температуры феноксан оказал наибольшее защитное воздействие на гаметы. При этом абсолютный показатель выживаемости ' сперматозоидов увеличился на 25% по сравнению о контролем <Р<0,05).

Затем было изучено криозадатков действие на сперму баранов новых жирорастворимых синтетических антиоксидантов фенольного .' рада: ИХФГАИ-1, ШИГАН-2, ИХФГАН-3, ИШН-26. Предварительное . научение различных дозировок препаратов на живучесть сперматозоидов барана показало, что оптимальные нетоксичные дозировки -этих препаратов находятся,в пределах 0,02-0,06 мг/мл среды. "

Результаты изучения хри о защитного действия этих препаратов на сперматозоиды барана, при их замораживают в ГКУК-трис-бу-, ферной среде ш фоне различной концентрации желтка показали, что из всех испытанных препаратов, заметным краозащитным действием обладает только ИХФГАН-3, Причем, его положительное влияние на живучесть оттаянной спермы отмечено при всех концентра- ' цкях желтка в составе среды. Оптимальное защитное действие препарат оказал в концентрации 0,04 иг/мл. Использование препарата в данной дозе при желтка повысило абсолютный показатель живучести оттаянной; спермы на ЗЭ$; при 10£ желтка - на 45$ и ■ при желтка - на 33$ (Р^0,05). Затем баш проведены опыты -по искусственному осеменению овец спермой, замороженной в оптимальной дозой ИХФГАН-3 (табл.9). Овец осеменяли однократно в течение зструса. .

Таблица 9

Влияние ИХФГАН-3 на результаты осеменения овец кртоконсервированной спелой

цКокцентрАцаяЮсеменено i пй«р1млйль '"Юлуче-

Ьамяи* опита • (антиоксидав-! овец I иоъягнилось 1но яг-вариант опита ¡£ j (...<■■ !нят на

(матку

1 I

Среда о ИХФГАН-3 0,004 . 33 13 39*8,5 1,5*0,1 Контроль 0 27 8 30*8,8 1,5*0,1

Результаты эксперимента показали,' что вря использовании .' антиокшданта объягнилось' на больше овец, чем в контроле. ' (Р>0,05).

* ,, - 23'-. ■:.-■;" ■

Следовательно, использование ИХФГАН-З в оптимальных дозах повышает подвижность, выживаемость и оплодотворяющую способ-яостькриоко «сервированной спермы баранов*

' 3.2.5, Антиокислительная активность различных компонентов синтетических сред

Механизмы цротективного действия многих веществ, входшшх в состав различных крнораэбашггелеЙ спермы, окончательно пока не выяснены и требуют дальнейшего изучения. 7 Поэтому в задачу наша исследований входило изучение аягн-<ш!сявтехьно1ч> влияния ш сперматозоиды барана некоторых коыпо-. вентов, широко применяемых в составе различных кркоразбавителей спермы: глюкозы, лактозы, цитрата натрия, хелатона, трнс-(окса-метол)-амикоыетана, ксилита, глицерина в декстрина,

Анткоксидантяое действие веществ изучали хемилюмянесцеит-ныи методом, ори индуцировании перекасного окисления лнпидов . в образце сперматозоидов барана с помощью ионов железа. ; Результаты анализа кривых хешлюшнесцендая в образцах сперматозоидов при добавлении разлкчшсс соединений показали, '.. что они оказывают' существенное влияние ва характер протекания свободно-радикальных окислительных реакций при индуцировании ПОД ионами железа.

- Все исследуемые вещества' снижали амплитуду свечения медленной вспышки. Наиболее, эффективным^ ингибиторами развития' медленной вспышки оказались декстрин и цитрат натрия, В нх присутствии интенсивность свечения данной вспышки снижалась соответственно в 10 и 7,3 раза по сравнению с контролем (Р-£0,01). Глюкоза в лактоза оказали практически одинаковое ингибируицее ;влияние на свечение »той всшшки. ' ' ■ '

^ -На основании полученных результатов можно заметить, что все испытанные в данном опыте вещества, помимо их известных криозащитных механизмов действия на гаметы, обладают также ш-раженшм внтиоксидангным действием. -

Когаговевтн синтетичеашх сред для спермы животных могут . оказывать не только авткокскдантное, но в просксидантвое дейст-вяе. В частвости. ь состав большинства криозащитша сред вхвдат желток куриннх яиц. В зависимости от сроков гранения яиц,'лили-

дн желтка могут подвергаться перекиснем? окислении. При этом продукты реакции ПОД, попадая в состав разбавителей для спермы животных, могут оказывать отрицательное влияние на биологическую полноценность гамет. В связи с этим мы выясняли вопрос о накоплении продуктов пероксидацкн лшщдов в нативном желтке . в зависимости от сроков хранения куриных яиц при температуре -4°с. ■■ .//

Анализ проведенных исследований показал, что. концентрация в желтке липидних гидроперекисей к мало нового диальдегидд увеличивалась в 2 раза после десяти дней хранения яиц црн 4°С. В этой связи, при использовании желтка в составе синтетических сред для спермы животных, желательно использовать куриные яйца, сохраняемые не более 5-10 дней при 4°С.

'\ ■ " ■ < 3.3. Влияние физиологических факторов на результа- -тивность осеменения овец замороженной спермой

3.3.1. Увеличение глубины введения спермы вцерви- ' кальннй канал с помощь» утерореяаксана' . ■

Имеются данные, что глубокоцервякадьное. осеменение овец замороженной спермой повышает результативность их осеменения -(В.К.ЫиловановД984; И.Н.ШаЙдуллин,ХЭ79). . ■

Нами изучалась возможность более глубокого введения спермы в цервихальный. канал овец при использовании специфического шюрелаксанта-утерорелаксана.

В предварительных экспериментах изучали влияние различию, дозировок препарата на глубину введения катетера в цервихальный канал овец* Было установлено, что оптимальной дозой является 3-4 ил препарата на сайку. После введения данной дози утероре-дахсана овцам, удалось в 2*раза увеличить глубину введения катетера в цервхкальный канал {3,5'см против 1,6 см в контроле, При Pi0,05).

Но полностью дройти шейку матка у овец и ввести обычный -катетер внутриматочно, как »то.возможно у коров, таким способом не удалось. * v. "

Влияние глубокоцервюсального: осеменения овец криохонсер- -.■ вированной спермой с применением данного метода представлено '

■ ~ 27 -

в табл.10. ' , - ^ • .

. Л.-. . * -Таблица 10 "

Влияние глубокоцервикального введения спермьс ■ ' ' • ва суягность овец "

~7 . ■ ■■ 1 ' '¡Доза уте- {Осеме[Учте-|обьягни^"обья^ Группа опыта 4 |рорелак- ¡иеяо ¡ко ¡лось ¡нишихся

■ ^ |мд^каовцу} . | { | •

Однократное осеменение: '

експерииентаяьноя 4 . 42 40 16 . 40*7*6

. контрольная . 0 - 46 ' 46 14 30*6,7 ■

Двухкратное осеменение: ■ '.■■; ' .

экспериментальная - 4 36 36 • 18 60*8,4 :

контрольная; 0 45 42 ; 22 52*7,7

Установлено, что при однократном осеменении в опытной груя пе вайвдшлаоь теккевцая.к повышению результативности осеменения: 40% объягнившихся маток против 30^ в контроле(Р>0,05).

■ ' При двухкратном осеменении и. двухкратном введении препарата не отмечено повышения результативности осеменения. Поэтому, наиболее целесообразным является однократное введение релаксанта' "перед осеменением овец. У1/.. * :

3.3.2. Влияние сурфагона ва результаты осеменения *

В связи с пониженной вюшваемостьв заморохенно-оттаянвых сперматозоидов в половых путях овец большой интерес. представляет изучение возможности регуляции овуляции у самок с целы) , осеменения овец вриоковсервированнай спермой в оптимальное по отношению к овуляции время. *

Нами било изучено влияние синтетического гонадслиберика-сурфогона на результативность' осеменения овец криоконсервиро-ванной спермой. "•'./'.'' '. • ' У :

В предварительных .экспериментах была отработана оптимальная дозировка препарата.-При использовании сурфагона а дозе I мхг/па животное, число объягнившихся маток повысилось ла 8%' ■ по сравнении о контролем. Повышение дозы препарата привело к достоверному снижению результативности осеменения. ■ Иногоплодпе

- 28 -

каток было практически одинаковым во всех группах. ■

' В следующем опыте мысравкивали действие однократного введения оптимальной дозы сурфагона при одно- или двухкратном осеменении овен в течение эструса (табл.II).

Таблица II . v Результаты осеменения овец в зависимости от кратности введения замороженной спермы в при- -';■■ -. - менения сурфагона '

{Доза сурк)сомегВыбы|Учтено[Объятии-)^ оОъягпив- ■ . Группа -¡Фагона, {нено !ло j • '¡лось ¡шихся животных :мкг/яа { } , - j {

■- I 1 } } f . ' '.' .

" 1 Однократное .осемен^киэ *'

Опытная ■■ I ■ 35 . " 35 . 10 - . 29*7,6 '

Контрольная. - 42 ;■;■; 2 40 * 12 30*7,2

Двухкратное осеменение ; ■ '

Опытная I 129 5 124 60 49*4,5 •

Контрольная ".«• - 114 2 112 48 43*4,6

Оказалось, что использование сурфагона при однократном осе-мененки овец не оказало положительного влияния на результ&тнв-' ность ягнения.;При двухкратном же осеменении в течение эструса » oramioii группе объягнилось на 6% овец больше, чем Ь контроле

(р>о,о&). /'л-'. >■'-. '•'"'■'■■■'„.

Повышение результативности осеменения матох в опытной группй при двухкратном осеменении можно объяснить тем,' что прж утренней однократной выборке овец в охота, некоторая часть из * них'попадает в начальный период эструса, когда еще\не произошел предовулаторныЗ выброс JHV Введение же им с?р$агона ctmry-} лирует более ранний выброс ДГ, ускоряя тем самым наступление овуляявн, что.благоприятно сказывается на оплодотворяемости

своццтов. " ' .: .; ': ■ ■ , ••' „ ..:■■ '

• Кроме того', У некоторых овец может происходить запаздывание предовуляторного выброса ЛГ, что'увеличивает время до овулящш. В 9том случае сурфагонтакже оказывает положительное влияние." \

3.5. Разработка криоконсехшрувдей среды для , спермы быков

, Учитывая положительное влияние некоторых металлов на крио-устойчивооть спермы животных (В,П.Кононов,1982; В.К.Милованов,. Л.С.Жильцова, 1982; В.А.НаукД982), целью наших исследований . ' 6шео создание, новой синтетической среды для замораживания, спер-ш быков на основе комплексонатов металлов.

В Предвар столь них экспериментах проверяли влияние различных комплексонатов металлов на живучесть нативных спермиев быка. Изучалось действие кальция, цинка а меди, закомплексованных с эт|иендиамкнтетрауксусной, эталектриаминпентауксусной,. ' нитрил отриметилфосфжов ой ис оксиэ танекдафо сфонов о а кислотами.

• Было установлено, что самая высокая живучесть сперматозон- . .- дов быка отмечалась в комплексоватах металлов с этилендламин- * тетрауксусной кислотой. Поэтому в дальнейшем мы работали с про' ¿аратами на основе'данной кислоты.

Результаты кркоустойчивоста сперматозоидов быка при замораживании их в отдельных растворах комшсексонатов показали, что ■ подвижность и жетучесть сдартатозсидов после оттаивания быт лучиими э 5$-ном растворе ".ЭДГА; 5,1$-ном - (¿Ц) .ЭДХА и 5^5$-ном - < ¿д.) ЭДГА. ,'",'гУГ "

Затем в'лабораторных опытах изучали, крнозащигкое действие на сперму быков различные сочетаний трех коыдлексонатов металлов: к&льпвя, цишеа и меда сЭДТА. Было установлено, что лучшая; подвижность я выживаемость*оттаянных сперматозоидов получе- -на при следувдях процентных соотношениях иэотошшшх концентратов кошиексЬ1атов:( .Я*) ЭДТА- 60$; < &U ЭДЕА - 20$; ( ^ ) ЭДЕА - 20$ ши <4с) ЗДХА - 60$; 'CJ5t.) ЩИ - 20$f ЭДТА -.

20$. Переведя процентную концедтравди препаратов в весовые соот-. ношения было получено два оптимальных варианта синтетической среда длязамораживания cnepiiu быков; В состав среды А 1 входили следувдве компоненты/ на, 100. iu дистиллированной воды;( ) ЭДТА - 3 г, (СО ЭД1А - 1,18 г, ( Лс > ЭДЕА - 1,1 г, глицерин -5 ия. келток куриного яйца - 20 мл. Соотвворедц* 2? С дДТА -3,06 Г, {Сл.) ЭД1А - 1,18 Г. ЗДГА - 1,0 г, ,глияе-.

ржн.-бид, жесток - 20 uxi- ' " . •

-30 -

Изучение влияния данных сред на криоустойчивость спермы Оыков показало* что при замораживании спермы в опытных средах подвижность сперматозоидов и абсолютный показатель их вшивав—... мости после оттаивания оили выше, чем в контроле./

' Результаты осеменения коров спермой, замороженной в новых средах, приведены в табл.12. ■ ■ . ■

.'".'■' Таблица 12 Результативность осеменения хоров спермой,замо^ " . рожеплой в компдексонатных средах

Испытуемые' среда - г [осеменено" "!' "Отелилось' оплодотво-,

. - ■ - - ,_1 } коров } - • : . |ряеиости

Опытная I 51 3? 72*5,1 .

Опытная * 2 67 : '39 58*5,3

Контроль, (лактоэная) . 100 . 60 60*4,5

* Анализ результатов показал, что лучшая оплодотворяемость животных была получена при осеменении хоров спермой, замороженной в среде № I, При этом отелилось на 12% хоров больше, чем: в контроле (Р<0,01). Это свидетельствует о перспективности использования новой среды для замораживания спермы быков. :

3.6. Разработка метода прогнозирования криоуЬтой-. чхвости спермы быков.

3.6.1. Взаимосвязь жирнохислоткого к фосфодидид-" . - ного состава лапидов спермы с ее криоус- ,

' .ТОЙЧИВОСТЬ» - „■.'.'

С целы) дальнейшего совершенствования методов прогнозирования устойчивости спермы быков к глубокому замораживанию необходимо изучение физиологических механизмов' данного явления животных с высокой и низкой криоустойчивостьв'гамет. '' .

В данном разделе мы изучали взаимосвязь жирнокислотного * состава общих лвлидов сперматозоидов н семенной плазмы у бы- , ков с различной криоустойчхвостьс спермы^ Бышо/отобрано две ' группы быков: с высокой и низкой устойчивостью гамет к глубокому замораживанию. Результаты исследований содержания жирных кислот в липидях гамет 7 быков различных групп показала, что

■Л .. • - 3i -

. из насыщенных жирных кислот у быков обеих групп основная доля

- приходится на пальмитиновую. В составе ненасыщенных - преобладает докоэагексаецовая кислота.

Было также установлено, что в группе с высокой криоустой-.чивостью спермы в липидах гамет содержалось на 7,1% больше' до-козагексаеновой кислоты: 25,1% против 18,2% в другой группе (P^O.OS). :

В группе быков с низкой криоуотойчивостью в их гаметах

- было повышено содержание пальмитиновой и пектадехаяовой кислот (Р4.0,05).По остальным жирным кислотам существенной разюпш между группами не отмечено. ■ ',

; '' Ври изучении ххрнокислотного состава лишдов семенной плазмы у,быков с высокой в низкой криоуотойчивостью не было выявлено различий как в суммарном содержании кислот, так и по отдельным жирным кислотам. ' V ■" Результаты проведенного исследования свидетельствуют,'что ' повышенное судаарное содержание.ненасыщенных жирных кислот в липшие гамет.оказывает положительное влияние на устойчивость , '' половых клеток быков к.замораживанию.

. Анализ фоофолишдного соотааа общих лщщдов в спермиях двух групп быков показал, что существенных изменений по данному ' показателю между группами, аа исключением фосфатидилсерина, не отмечено. В гаметах с высокой криоустойчивостью содержание фоо-фатвдплсерина было на 45% вше то сравнению с другой группой (Р4.0,05). ' ' - - ■ • ' .

' i ^ 3.6.2. Механлческая резистентность гамет к воз; '- у. -.' .- действию ультразвука

В данном эксперименте изучали параметры ультразвуковой ус-' тойчивостх половых клеток быков о различной криоустойчхвостью (табл.13). .'.' *

. Из "таблицы видно, что между. группами быков имеются определенные различия. Tax, время полного ■ цктолпзиса сперматозоидов в группе с высокой криоусточивостью било на 28% короче по сравнению сдругой группой (Рс0,05). В этой группе также на 19% была выше средняя скорость цитолизиса сперматозоидов: 5,19 х : 4,24 отн.ед. соответственно (Р-с 0,05). Вероятно, различия физи-

■ Табдида 13

Ультразвуковая резистентность сперматозоидов * быков в связи о их криоустьйчивостью . -

' ™ : : ' ¡Число ¡Исследотсредняд 1 {время Гтшпа опыта быков вано -скорость ¡полного

- 1 групЬякуля- вдтолизиса^цнтсши-

рб }тов j отн. ед. цзиса,мин

Высокая криоустойчивость . . ■ '

спермы 5 15 5,2*0,3 1,9=0,2

Низкая криоустойчиьосгь .

спермы 5 15 4,2-0,2 .;2(7=0,3: -

чесхото со от (иякА-ч уиа^агичооюис. ми)лбргш сж>риатэ ¿садов у (5ы—. ков рахмчи^х груш! ответственны за неодинаковую их устойчи- ; в ость х воздействию ультразвука и низких температур.'

3,6.3. Уровень микровлэкоети мембран сперматозои-■ дов в связи с их краоустойчивостью ■

Следуншм этапом, наших исследований было изучение уровня ; мшсро вяз кости мембран сперматозоидов быков в связи оих кряо— устойчивостью. .

Для изучения кикровязкости мембран мы применили метод прото пне3 магнитной релаксации, поскольку ядра *Н составляют большинство в молекулах липидов, которые являются основой клеточной мембраны. ' .

;Иы изучали время спин-спиновой релаксации.(Т^) неводноВ . фракции протоков в сперматозоидах быков с различной краоустойчивостью.- . - :

Величина Т^ является характеристикой молекулярной: подвижности в образце и служит показателем уровня мюеровязкости мембран изучаемых объектов. . "

■ Результаты этого эксперимента представлены в табл.14. 1 : Анализ таблицы показал, что в группе быков с высокой крио-, устойчивостью спермы, .время сшн-сшшовой релаксации бшго на I 1&% болыпе' по сравнению с другой группой: 0,272 мсок против '' 0,233 мсек (Р< 0,01)., Это свидетельствует о меньшей микровяз- ' хости плазматических мембран сперматозоидов о высокой крпоуо-

- зз - ."

тойчивостью, так как большее время Т2 соответствует меньше! микровязкости мембран. ■

■ Таблиц* 14

; . Время про тонной спин-спиновой релаксации в образцах - : сперматозоидов быков в свяэя с их криоустойчивостью '

■ ■ . ¡Число1 ¡Исс-Í Подвижность [Абсолютный ! ! • ¡быков }ледо^сперматозоидов}показатель ¡

Группа опита! в |ваяо{___1 живучести !Т?,- мсек

группе эяку+до за- !ППЛ1ГД ¡оттаянных } ! ля- моражи-1"£^_|сперматозо-!

j {тов {ваная {идов.усл.ед}

Высокая крио- . . . . . _ .

устойчивость 6 36 82*2,5. 48*0,4 20*0,5,. 0,272*0,00?

Низкая кшо— '' ■ ■'■ . ' .■ '

устойчивость. 5 '.38 81*5,1 39*2,1 15,2*0,3 0,233*0,006

" При этом подвижность оттаянных сперматозоидов и абсолютный показатель их живучести в этой группе были достоверно выше (Р<0,01). Следовательно, пониженная мдкровязкость плазматической мембраны сперматозоидов быков обусловливает повышен- . ную их устойчивость;? глубокому замораживанию. •

Наоснове 'определения времени Слив-спиновой релаксации в образцах спорнатозондов . пани разработан способ прогвозирова-кия криоустойчивости спермы быков (А.с. J* 1813424,1991). ■ ~ . Использование данного способа позволяет увеличить количество заготовляемых, сдарыодоэ, получаемых от быков с высокой криоустойчввостью гамет.

■ Данный' метод может иметь также большое значение для отбо-' ра быков- с высокой криоустойчивостью. спермы при комплектовании животвыми пяемцредпртягий и станций по искусственному осемене-шш животных».

Ори этом экспресс—прогноз криоустойчивости сперматозоидов различных производителей можно осуществить на основе предварительных измерений времени протонной спин-спинов ой релаксации в шсколькхх образцах их спермы. ■".

ВЫВОДЫ

\ I. Уровень ыикровяэкостя плазматических мембран сперыато- \ зондов Сарана ниже, чем у быка. В процессе криообработки происходит увеличение микровязкости мембран в гаметах обоих видов животных. Гидрофильные компоненты сред не оказывают влияния на,, данный показатель. Желток куриного яйца снижает уровень икхро-влэкости мембран сперматозоидов, что способствует повышению их крлорезистентноста. '

2. Криоконсервадая оказывает стимулирующее влияние ва не- . роксидацив .лишщов ■ в гаметах барана.

Отличительной чертой сперматозоидов барана является меньшая устойчивость к.инициации перекисного окисления липидов по сравнению с быком. 1

3. Семенная плазма и сперматозоиды баранов н быков содержат практически одинаковую активность антиоксидаятного фермеи-та-супороксидгиемутазы. \

Криоооработка индуцирует значительную утечку внутриклеточной СОД. Одной из особенностей гемет баранов* сопряженных о хряоустойчивостью,' является более высокая проницаемость нх мембран для СОД.' V ■' * ' 4. Специфической особенностью хриоконсервированной сперын барана является более высокая скорость нарастания в* ней после оттаивания концентрации неорганического фосфата по сравнению со спермой быка. Через 2 часа после оттаивания спермы концентрация неорганического фосфата увеличилась на 50 и 22% соответственно.

5. В семенной плазме быков обнаружено присутствие криоста-бильного гонадотропного фактора» способного стимулировать овуляцию у крольчих. В плазме барана, жеребца, хряка и кролика данного фактора но обнаружена.

6. Нативная семенная плазма барана в зависимости от степени ее разбавления, оказывает,кммуносупрессивкое или ишукоакти-вирущее влияние на аллогенные лимфоциты крова вне организма. Глубокое замораживание семенной плазмы резко усиливает ее имму-ноакгавнрупкле свойства. *

7* Разработанная ПйГК-трно-буферная синтетическая среда . для замораживания спермы баранов■повышает криоустойчивость я \ ■ ■ ' ".- ■■ ■ ■ ■

биологическую полноценность оттаянных сперматозоидов ,и позволя-'ет получать результативность осеменения овец на практически . удовлетворительном уровне (40-50$ ягнения).

8. Сухие яйцепродукты обладают высокими крнозаштныма свойствами на сперматозоиды барана и способствуют значительному снижению (более чем в 2 раза) себестоимости синтетических сред ' для спермы животных. . • .

: 9. Замораживание спермы барана со "Спермосаном-ШК",в дозе 25-100 тыс.ед. на 100;смэ среды,не оказывает отрицательного влияния на криоустойчпвость гамет и их оплодотворявду» способность... .'

10. Низкомолекулярные тислы оказывают криозааштное дейст-.-вне на сперматозоиды барана при их замораживают в простых сре-' дах с низкой концентрацией желтка.' Наиболее эффективное зашт- ' .нов,действие проявляют унитиол и воостановленный глутатион.

; Воднорастворимые синтетические фенольпые антвоксидакты но оказали криозащнтного влияния на-сперматозоиды барана. Из жиро« -растворимых синтетических антиоксадантов лучшее криозапктное действие на сперматозоиды барана.оказывает препарат ИХФГАН-З :в концентрации 0,004-0,008^. При его введении в состав ГЕУК--трио-буферной среды оплодотворяемое» овцематок повысилась па

э*. ■ / ..■-.:•-' .

- . II. Отдельные, широко используемые компоненты синтетических :сред, оказывают выраженное антиокислительное влияние на сперматозоиды барана., Наиболее эффективное действие проявляют декстрин н натриевая соль а тилен-диамин-тетрауксу с ной кислоты.

12. В зависимости от сроков и условий хранения куриных яиц, в их желтке может происходить значительное накопление продуктов пероксидаоти ликидов, которые могут попадать в состав разбавителей для спермы н оказывать отрицательное влияние на биологичес-' кус полноценность гамет.'

V. ' Через 20 дней хранения яиц при 4°С концентрация МДА в желтке повышается в два раза* ...' .

' 13. Глубокоцервикальное осеменение овец замороженной спермой при использовании специфического маточного утерорелаксана в дозе - 1 мл препарата на животное, повысило результативность однократного осеменения овец на ,

* 14. Однократное вкутржмдаечнов введение овцам перед о семе-

некиеи синтетического гонадолиберина-сурфагона в дозе I мкг/на животное, повысило результативность их осеменения криоконсерви- . рованной спермой на 6-6?.

. 15. Использование при осеменении овец антистрессового вещества - углекислого лития, не оказало положительного влияния на результаты осеменения. ,

16.' Синтетическая среда для.спермы быков, разработанная на основе комялексонатов металлов, повышает хриоустойчивость спер-матоэоидов и их оплодотворяющую способность на 12% (72% отелив« шихся коров по сравнению с 60£ в контроле). ■

1?. Раздельное замораживание эякулятов быков снижает бахте-риальную контамииаца) оттаянной сперш.,

18, Криорезистентность гамет у.отдельных быков в значительной мере обусловлена жярнокислотным составом их лилидов." Положительное влияние на устойчивость сперматозоидов « глубокому замораживанию, оказывает повышенное содержание в нх-липидах поли-ленасыщенной дохозагексаеновой кислоты, * ■,

19. Предложенный способ оценхи качества спермы быков позволяет отбирать быхов с в ысокойкрио резистентностью спермы ж прогнозировать криоустойчивость хх эякулятов, путем измерения с то-: мощью метода протонной магнитной релаксации михровязхости мембран половых клеток.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ -

I. С целью повышения результативности искусственного осеменения овец кркоконсервировакной спермой рекомендуем ллеыпред-цриятяям для замораживания спермы баранов исполъзоьать ПТК--трис-буфсрдум сантотачоску» среду сладуадвга состаьа.гЛОО см* воды: лактоза - 8,4; декстрин - 5,0; ксклят - 0,26; трис-(окси-метнл)-аминометан- 0,105; трмлон-Б- 0,135; глицерин - 6,0; желток - 20,0; спермосая-ШШ - 50-100 тыс.ед. 1 • •; ' -

• 2. С целью снижения себестоимости синтетических сред для •замораживания спермы баранов, рекомендуем использовать в качестве кряопротектора сухой яичный желток или яичный.порошок в ион- . центрации 4-5#. '

3. Для повшвегои эффективности осеменения, овец замороженной спермой предлагаем вводить сперму глубокоцервикально путём .

у. - 37 - '

использования однократной внутримышечной инъекции овцематкам за 30-60 минут до осеменения'утерорелаксана в дозе 3-4 мл препарата на самку, * * ■ ■ "

4. Для повышения криоустойчивости и оплодотворяющей спо- ' с od ко ст и спермы быков предлагаем комплексонатную синтетическую ' среду для ее завораживания. Состав среды, г/100 см3 воды: -(ЭДТА) - 3,0; Со. (ЭДТА) — 1,10; Си. (ЭДТА) - 1,1; глицерин- 5,0; желток - 20,0. . : < .

5. С целью прогнозирования криоустойчивости спермы быков

: предлагается метод оценки качества спермы, основанный на изме-рекзи времени протонной спин-спияовой релаксации в сперматозоида!. .. : - '...•■■";.■ ■ '

■: ■' Список основных работ, опубликованных по' теме диссертации

; I. Кононов S.U., Ерохин A.C., Нариасный А.Г. Действие многовалентных металлов на воспроизводительную функцию животных //Доклады ВАСПШ. - 1983. - * 5. - С.28-30. 1

2. Хияьцова Л.С.-, Брохзш A.C., Селиверстова И.А*._ Замора-жившае спермы быка, в ередах с комотексояатами металлов //Дой-лады ВАСЮШ. - 1985. - * I. - С.33-34. ' - /'. '

3. Брохия A.C.' Снижение бактериальной загрязненности спермы быков-производителей //Биология воспроизведения я технология искусственного осеменения с.-х.животных. - U.,1986.- - С. 45-49.

4. Платов E.il.,- Деряжеяодв В.И., Ерохиа A.C. и др. Мето-жчесяие рекомедвацин m технология взятия, глубокого заморахи-вания и использования спермы баранов-произврдителей при искусственном осеменении овец, - 1Í.,1986. - IS с.

"" 5. Ерохип A.C. Гдубокоцервитсальаое осеменение овец замо- ' роженной спермой о использованием релаксанта //Селекция с.-х. животных по техиологичеепш признакам. - И. ,1987, - 0.161-164.

• 6. Брохял A.C., Аваяов-В.Я. Замораживание спермы бараков в среде с декстривом //Зоотехния. - 1988. - Л 10. - С. 45-47.

7. Платов S.U., Балашов Н.Г.,' Деряжекцев В.И., Ерохин A.C. ■и др. Синтетическая среда для раэбавлетю я заморажш&ания -спёр-.мй жавотша //Автормюе евздета^ Л 1408576,1968.

8. Ероххн A.C., Платов E.Ii., Тимофеев К.Н., Кондаков E.B. Структурное . состояние мембраны сперматозоидов барана а быка яосяе криовоздействия //Доклады БАСОШ. - 1989. - * 3. - C.30-3I

9. Ерохин A.C., Петрова Т.И., Ткачева 0.П. Исвользовакие . ; "яичного порошка в средах для замораживания спермы //Зоотехния. -

19Ю. - » В. - С. 65-6?. .

10. Ерохин A.C., Сеченова В.Д., Тимофеев К.Н.,'Кондаков Е.В.' О влиянии компонентов синтетических сред на плазматические мембраны сперматозоидов быка и барана //Сельскохозяйственная био- ! ч ЛОГИЯ. - 1969. - * 6. - С.35-38. : ' ■ .

* 4 II. Платов M., Ерохин A.C., Деряженцев В.И. и др.: Среда" ^ для замораживания спермы животных //Авторское свидетельство : 1501333,1969.

! , 12. Ерохин A.C. Криозааатиое-действие сухих яйцепродуктов на сперматозоиды барана э зависимости от условий их хранения , //Биология воспроизведения в биотехкологичесюсе методы разводе* пая с.-х.животных. - U. Д98Э. - С.28-32. ' .

13. Ерохин A.C. Замораживание спермы в среде о сухим желтком //Овцеводство. - 1990. - * I. - С.22-23. ; , ;

14. Брогин A.C., Деряженцев В.И. Использование сурфагона ' при осеменении овец //Овцеводство, - I99Û. - * 4. - С.36-37. :

. 15. Врохин A.C., Кучкина К.Д., Турбин В.ф, Криоустойчи-вость сперматозоидов быка в связи с жирнокислотшш составом их липидов //Доклады ВАСХНИЛ. - 1991. - » 5. - С.45-47.

16. Ерохин A.C. .Черных В.Я. Влияние плазмы спермысельо-кохозяй ств ен кых животных на овуляцшо у кроликов //Доклады ВАСБОД - 1991. - * 6. - с.4&-50. -V ■/.:;•

17. Ерохян A.C., Деряженцев В.И. Перекдсное окисление ли-' пддов в сперме баранов //Овцеводство. - 1991.» 3; - С.17-19.Г

18. Брохия A.C., Деряженцев .В.И. Антибиотики при осеменения замороженной сл0рмой //Овцеводство. , - 1991, - JK 5. - С. 21-22.

19. Ерохин A.C., Деряженцев В.И., Аксотина U.C., Барсель В.А. Изучение перекксного окисления лдщу>а в сперматозоидах барана и быка методом индуцированной хемитошесденцки //Дохла- : ды ВАСХНИЛ. - 1992. - * 1. - С.50-53. ; '-у;/'. ; ' '"-v-'V,-Г.;.''Л'

20. Ерохин A.C., Деряженцев В.И. Защитное действие февох-; сана на сперют барана //Зоотехния. - 1992.. - * 2. - С. 17-19. "

■ . , . 21. Ерохжа A.C., Мурза Л.И., Сергеев А.И. О криоустоячв-вости сперматозоидов быков в связи с иикровязкостью плазматических мембран //Сельсяохозяйствеаная биология. - 1992. - » 2, . - С.56-61.

22. Деряженцев В.И., Ерохив A.C. Наставление по применению ПШС-трис-буферной среда для разбавления, замораживания, хранения и использования сгори бараков-производителей. -. . ВНИИшом. - 1992. - II с. ; .

23. Ерохив A.C., Чернова И.В. Влияние тиолов на криоустой-чавость спермы //Овцеводство. - 1992. - 4. - С,22-23.

24.' Ерохин а:с., Деряженцев В.И., Кучклка К.Д. и,др. Способ оценки качества спермы быков //Авторское свидетельство .

Л 1813424,1992. ■ ; ■

25. Ерохин А. С* Изучение пероксидадаи липидов в компонентах разбавителей спермы животных //Доклады ВАСХНИЛ, - 1992. -

» 6. - С.42-44.

26. Брохин A.C., Никольская Т.А. Изучение иммуносулрес-. снвных свойств семенной плазмы баданов //Доклада Российской академии с.-х.наук,. - 1993. - Л 2. - С.67-71.

Подп. к печ. 17.02.54._ОДъем 2,5 п. л,_Зак. 66._Тир. 100

Типография МП ГУ ныопп В. П. Лешта