Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Филогенетические связи представителей класса Zygnematophyceae (Streptophyta)

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Филогенетические связи представителей класса Zygnematophyceae (Streptophyta)"

На правах рукописи

Гончаров Андрей Анатольевич

ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЕ СВЯЗИ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ КЛАССА ZYGNEMATOPHYCEAE (STREPTOPHYTA)

03.00.05 - ботаника 03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Владивосток - 2005

Работа выполнена в лаборатории низших растений Биолого-почвенного института ДВО РАН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Потенко Владимир Владимирович

доктор биологических наук, профессор Михайлов Валерий Викторович

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Селиванова Ольга Николаевна

Ведущая организация

Ботанический институт им. В.Л.Комарова РАН

Защита состоится 9 июня 2005 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.003.02 при Биолого-почвенном институте ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, пр. 100 лет Владивостоку, 159.

Факс:(4232)310-193

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ДВО РАН

Автореферат разослан 4 апреля 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, д.б.н. ^? В. Ю. Баркалов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Зеленые конъюгирующие водоросли являются неотъемлемым компонентом пресноводных экосистем, где они играют существенную роль в трофических цепях. Эта группа объединяет коккоидные, нитчатые и колониальные водоросли, характеризующиеся особым типом полового размножения, конъюгацией, при котором происходит слияние не имеющих жгутиков гамет. Отсутствие не только жгутиковых стадий, но и любых следов жгутикового аппарата на протяжении всего жизненного цикла - еще одна отличительная черта ее представителей. Эти признаки не имеют аналогов у других автотрофных организмов, что обусловливает обособленное положение конъюгат среди растений. До сих пор не существует удовлетворительного объяснения, почему и как произошла утрата жгутикового аппарата и возникла конъюгация. Обсуждаются две гипотезы — происхождение конъюгат в результате редукции подвижных стадий (Голлербах, Полянский, 1951; Скабичевский, 1960; Fott, 1959; Fritsch, 1944; Nakahara, Ichimura, 1992; Pascher, 1914) или от организмов, никогда их не имевших (Топачевський, 1952; 1954).

В настоящее время конъюгаты рассматриваются в ранге самостоятельного класса Zygnematophyceae в составе отдела Streptophyta (Bremer, 1985; Bremer et al., 1987; van Hoek et al., 1995). Класс характеризуется исключительным видовым разнообразием (около 4000 видов; Gerrath, 1993; Hoshaw, McCourt, 1988).

Существует несколько классификационных схем Zygnematophyceae, которые выделяют в составе класса от двух до четырех порядков. Мы следовали классификации, основанной на признаках ультраструктуры клеточной стенки и признающей в составе класса два порядка - Zygnematales с двумя семействами, и Desmidiales - с четырьмя (Mix, 1972). Данная система носит явно выраженный эволюционный характер, как на уровне порядков, так и на уровне семейств.

Все семейства, а также большая часть из более чем 50 родов конъюгат были описаны более 100 лет назад, и с тех пор их концепции практически не претерпели изменений. В то же время, едва ли не с момента описания многие роды считались искусственными, и предпринимались многочисленные попытки преодолеть эту искусственность путем разделения их на более мелкие морфологически однородные группы таксонов. Исключительная вариабельность небольшого числа морфологических признаков в пределах каждого рода не позволяет провести четкую границу между ними и препятствует созданию более или менее естественной таксономической системы конъюгат. Эти же причины затрудняют эволюционный анализ признаков в группе.

Появление новых методов филогенетических исследований, существенно расширяющих число признаков, доступных для сравнительного анализа, позволяет с новых позиций подойти к решению давних эволюционных проблем и зачастую успешно с ними справляться. Одним из таких подходов, интенсивно развивающихся в последнее десятилетие, является метод молекулярно-филогенетических исследований, основанный на сравнении нуклеотидных и аминокислотных последовательностей различных участков генома организмов. Новые массивы данных позволяют, с одной стороны, провести тестирование существующих эволюционных гипотез, а с другой, соотнести темпы и направление эволюции различных признаков в отдельно взятой группе организмов. Учитывая, что более чем 150-летняя история изучения зеленых конъюгирующих водорослей оставила много неразрешенных таксономических и эволюционных проблем, нами была предпринята попытка использовать для их решения комплекс имеющихся данных о морфологии, биологии, биохимии и генетике конъюгат.

Целью настоящей работы было определение филогенетической структуры класса Zygnematophyceae с помощью молекулярно-филогенетических методов и анализ про-

цесса эволюционной дифференциации в нем, выделение монофилетических составляющих крупнейших родов с тем, чтобы в дальнейшем разработать естественную концепцию этих родов и создать таксономическую систему класса, основанную на филогенетическом родстве организмов.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1) получить последовательности кодирующих (18S рДНК) и некодирующих (1506 интрон I группы, внутренний транскрибируемый спейсер 1 и 2 [Internal Transcribed Spacer, далее ITS]) участков ядерной рибосомальной ДНК и протеин-кодирующей ДНК хлоропластов (rbcL) представительных видов класса Zygnematophyceae,

2) на основе молекулярно-филогенетических анализов нуклеотидных последовательностей построить филогенетическое дерево конъюгат,

3) сравнить полученные результаты с существующими филогенетическими и таксономическими схемами, основанными на фенотипических признаках,

4) провести сравнительный анализ филогений, полученных с использованием различных молекулярных маркеров.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Класс Zygnematophyceae является монофилетической группой в составе стреп-тофитных зеленых водорослей и хорошо отграничен от них как фенотипическими (отсутствие жгутиков, половой процесс в виде конъюгации), так и генетическими (уникальные замены в транскрипте 18S рРНК) синапоморфиями.

2. Род Spirotaenia является первой (базовой) дивергенцией в классе, и его представители предположительно сохраняют плезиоморфное состояние нескольких признаков (особенности процесса конъюгации, отсутствие 1506 интрона I группы в 18S рДНК).

3. Порядок Zygnematales, выделяемый на основе плезиоморфоного состояния признака (простая несегментированная клеточная стенка без пор), является пара-филетическим, и его таксономическая структура требует пересмотра с учетом генетических и фенотипических признаков.

4. Своеобразное сочетание признаков ультраструктуры клеточной стенки и особенности положения на филогенетическом дереве рода Phymatodocis указывают на необходимость выделения его в новое семейство в составе порядка Desmidiales.

5. Большинство исследованных родов конъюгат является немонофилетически-ми и их концепции нуждаются в ревизии.

Научная новизна, теоретическое и практическое значение работы. На основе мо-лекулярно-филогенетических анализов установлены эволюционные связи между представителями класса Zygnematophyceae. Показано, что морфологические признаки, используемые для целей классификации в классе (особенности ультраструктуры клеточной стенки, тип организации таллома, особенности морфологии клетки и др.) не всегда адекватно отражают родство таксонов, а общепринятая система конъюгат требует пересмотра.

Обнаружена ранняя дивергенция рода Spirotaenia от основного ствола конъюгат. Высказано предположение, что этот род заслуживает выделения в новый подкласс в составе Zygnematophyceae.

Впервые проведено сравнительное изучение эволюционной динамики двух генов из разных геномов клетки на примере конкретной группы организмов.

Разработана оригинальная методика поиска молекулярных синапоморфий, с ее помощью обнаружены новые признаки, характеризующие как весь класс Zygnematophyceae, так и его отдельные клады.

Разработаны модели вторичной структуры транскриптов ITS1 и ITS2 рДНК конъюгат, на основе этих структурных данных проведен поиск гомологичных признаков и анализ филогенетических взаимоотношений между представителями не-

скольких родов десмидиевых водорослей. Установлено монофилетическое ядро рода Staurastrum, длительное время считавшегося искусственным.

Работа послужит фундаментальной основой для дальнейших исследований в области систематики и филогении отдела Streptophyta, в особенности класса Zygnematophyceae, на разных таксономических уровнях.

За время исследования была создана обширная коллекция штаммов зеленых конъ-югирующих водорослей, многие из которых не представлены в мировых коллекциях.

Определены и депонированы в международные базы данных более 200 новых нуклеотидных последовательностей генов, интронов и спейсерных участков ДНК,

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на 2 Всероссийском совещании альгологов (С-Пб., 2002), 5-7 International Phycological Congresses, Qingdao, China (1994), Leiden, The Netherlands (1997), Thessaloniki, Greece (2000); IV International Symposium "Biology and taxonomy of green algae" Smolenice, Slovakia (2002), 12th International Association ofPhyt oplankton Taxonomy and Ecology Workshop, Winnipeg, Canada (1999), Annual Meetings of Japanese Phycological Society, Shimoda (1998), Yamagata,(1999), научных семинарах Botanisches Institut der Universitat zu Koln (20002003), Institut fur Allgemeine Botanik der Universitat Hamburg (2001), Института биологии внутренних вод (п. Борок, 2000, 2003) и Биолого-почзенного института ДВО РАН (2000-2005), Владивостокского Общества развития генетики (2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 27 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (Глава 1), объектов и методов (Глава 2), результатов и обсуждения (Главы 36), заключения, выводов и приложения. Материалы диссертации изложены на 216 страницах и проиллюстрированы 32 рисунками и 9 таблицами. Список литературы включает 304 источника.

Место проведения работы. Работа выполнена в лаборатории низших растений БПИ ДВО РАН в рамках тем «Изучение биоразнообразия грибов, водорослей и мохообразных Российского Дальнего Востока» (1996-2000) и «Микобиота и криптогамная флора Дальнего Востока России» (2001-2005). Частично молекулярно-филогенетические исследования проводились в Национальном институте экологических исследований (г. Цукуба, Япония) и Кёльнском Университете (г. Кёльн, Германия).

Научные достижения диссертации и выводы основываются на собственных исследованиях автора, принимавшего непосредственное участие в выделении штаммов водорослей, их изучении и идентификации, планировании и постановке экспериментов и анализе данных.

Елагодарносга. Исследования были поддержаны грантами Научно-технического Агентства (Япония) и Фонда Гумбольта (Германия) IV-1C68058 и V-RKS-1068058. Автор выражает искреннюю признательность Prof. M. Melkonian (г. Кёльн, Германия) за неоценимую помощь при выполнении исследования и обсуждение результатов.

2. Объекты и методы исследования.

Источники культур водорослей. Материалом для настоящего исследования послужили 121 штамм конъюгат, полученные из различных коллекций, и выделенные самостоятельно из природных популяций. Культивирование водорослей проводилось в стандартных условиях при 20 °С, интенсивности освещения 40 цшо1 m'2 s"1 и световом цикле 14 часов освещения на 10 часов темноты. Вьщеление, амплифи-цирование и секвенирование ДНК. Для выделения и счистка ДНК использовали QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit (QiAGEN, Hilden, Germany). Амплифицирование кодирующих и некодирующих участков рибосомального оперона, а также проте-ин-кодирующего rbcL-гена проводили с помощью полимеразной цепной реакции (Polymerase Chain Reactions, далее ПЦР) согласно протоколу (Marin et al., 1998).

ПЦР продукты очищали с помощью Dynabeads M-280 (Dynal Biotech, Oslo, Norway) и использовали для приготовления реакций секвенирования (протокол Hoef-Emden et al., 2002). Определение последовательности ДНК продуктов проводили на секве-наторе Li-Cor IR2. Выравнивание последовательностей и построение филогенетических деревьев. Вновь полученные нуклеотидные последовательности и взятые из базы данных GenBank выравнивали вручную с использованием программы SeaVew (Galtier et al., 1996). При выравнивании участков рибосомального оперона следовали консервативным элементам первичной и вторичной структуры ДНК (Wuyts et al., 2000, 2001). Из-за низкой консервативности первичной структуры ITS последовательностей поиск гомологичных позиций для сравнения был невозможен без привлечения данных о вторичной структуре их транскрипта. Для создании его моделей был использован интерактивный сервер MFOLD 3.1 (http://www.bioinfo.rpi.edu/ applications/mfold/old/rna/forml-2.3.cgi; Zuker, 2003), конструирующий различные варианты вторичной структуры РНК и оптимизированный на поиск их минимальной термодинамической энергии.

Филогенетические деревья строили методами максимального правдоподобия (Maximum Likelihood, далее ML), объединения соседей (Neighborhood-Joining, далее NJ) и максимальной парсимонии (Maximum Parsimony, далее МР) в филогенетической программе PAUP 4.0b10(Swofford, 1998), атакже методом Бейеса (Bayesian Inference, далее BI), используя программу MrBayes v3.0b3 (Huelsenbeck, Ronquist, 2001). Эволюционные модели для ML и NJ анализов выбирали в программе Modeltest 3.04 (Posada,Crandall, 1998), используя результаты теста отношений правдоподобия (likelihood ratio test, LRT), оценивающего соответствие моделей эволюции нуклео-тидных последовательностей наблюдаемым данным. Дистанции для NJ анализа рассчитывали через ML оптимизацию. Для ML и МР анализов использовали эвристический поиск оптимальной топологии с алгоритмом обмена ветвей и реассоциаци-ей деревьев (branch-swapping, tree bisection-reconnection; TBR). При BI анализе создавали 1 или 2 млн генераций цепей Маркова, отбирая пробы каждые 100 генераций, т.е. 10000 или 20000 проб. Первые 500-3000 проб (до выхода значений -lnL на плато) исключали из анализа как «burn-in». Устойчивость полученных филогенетических деревьев оценивали методом бутстрепа (Bootstrap Percentage, далее ВР; Felsenstein, 1985), используя 1000 (NJ и МР) или 100 (ML) бутстреп-реплик, атакже методом апостериорных вероятностей (Posterior Probabilities, далее РР) в BI. В МР анализе опция пошагового добавления (stepwise addition; 10 эвристических поисков оптимальной топологии со случайным порядком добавления таксонов) использовалась для каждой реплики бутстреп-анализа. При ML бутстреп-анализе использовали один эвристический поиск оптимальной топологии на реплику. Начальное дерево получали при последовательном добавлении таксонов. Совместный анализ генов. Для совместного анализа генов 18S рРНК и rbcL их последовательности были объединены в одну матрицу как «суперген» и проанализированы с использованием единой эволюционной модели с усредненными параметрами эволюции нуклеотид-ных последовательностей. Кроме этого, проводили совместный анализ генов методом суммирования -lnL (Yang, 1996) по методике Bapteste et al. (2002). 1000 «лучших» ML топологий 18S рДНК-, rbcL- и их комбинированного наборов данных ("3000 топологий) были объединены в один файл и значения -lnL рассчитывались отдельно для наборов последовательностей 18S рДНК(с 18S рДНКмоделью) и rbcL (с rbcL моделью). Сумма обоих значений, рассчитанная для каждой топологии, служила критерием ее оптимальности. Создание и проверка альтернативных топологий. Для проверки филогенетических гипотез требуемые топологии создавались модификацией файла, содержащего информацию об «оптимальном дереве», в програм-

ме TreeVew 1.6.2 (Page, 1996). Для их сравнения в программе PAUP рассчитывали -lnL каждой позиции сравниваемых деревьев и использовали полученные значения в качестве вводных данных для программы CONSEL (Shimodaira, Hasegawa, 2001). CONSEL рассчитывал вероятностные значения этих топологий согласно методам Кишино-Хасегава (далее КН; Kishino, Hasegawa, 1989), Шимодайра-Хасегава (далее SH; Shimodaira, Hasegawa, 1999; оба взвешенные [w] и не взвешенные) и approximately unbiased test (AU) по многошкальной технике бутстрепа (Shimodaira, 2002). Поиск молекулярных синапоморфий. Для поиска молекулярных синапомор-фий, характеризующих установленные клады, последовательности и соответствующий файл, содержащий информацию о топологии дерева (treefile), помещались в программу PAUP, где после выбора МР оптимизации проводили описание дерева (опции describe trees и labeled internal nodes) и получали список синапоморфий (list ofsynapomorphies) для всех ветвей. Затем, анализировали эволюцию каждого сина-поморфоного признака, используя опцию "show reconstructions".

3. Результаты филогенетических анализов нуклеотидных последовательностей

С целью выяснения филогенетической структуры класса Zygnematophyceae, была создана матрица, включающая 103 вида водорослей из отделов Streptophyta и Chlorophyta. Zygnematophyceae был представлен 84 таксонами из 28 родов (около 50% от общего числа) и 6 семейств, признаваемых нами в классе. Другие группы стрептофитных водорослей - 13 видами, а празинофитные (Chlorophyta), взятые в качестве внешней группы, - 6 видами.

Наличие 1506 интрона I группы в кодирующем регионе 18S рДНК конъюгат. ПЦР продукты, полученные в результате амплификации 18S рДНК у 78 из 84 исследованных видов конъюгат, были примерно 2200 нт длинной из-за присутствия в них 1506 интрона I группы в непосредственной близости от 3' конца кодирующего региона. Продукты, полученные от 3 штаммов Spirogyra sp. (SVCK 253,261 и М 2157) и 3 штаммов Spirotaenia, имели стандартную для большинства эукариот длину (около 1800 нт), а их секвенирование не обнаружило обычного для конъюгат (Besendahl, Bhattacharya 1999; Bhattacharya et al., 1994, 1996) интрона.

Анализ 18 S рДНК 103 таксонов Streptophyta и Chlorophyta. Филогенетическое дерево, показанное на рис. 1, было получено методом ML с использованием TrN+I+Г модели эволюции нуклеотидных последовательностей. Большая часть представителей Zygnematophyceae (81 из 84) объединена в умеренно поддержанную (71% ВР в NJ анализе, 1.00 РР) кладу. Род Spirotaenia (100 % ВР и 1.00 РР) располагается за пределами этой клады среди стрептофитных зеленых водорослей и имеет род Chlorokybus (Chlorokybophyceae) в качестве сестринского таксона (>74% ВР поддержки, 1.00 РР). Эта группировка, в СВОЮ очередь, является сестринской для клады Zygnematophyceae. Водоросли, традиционно относимые к пор. Zygnematales (сем. Mesotaeniaceae и Zygnemataceae), образуют несколько парафилетических групп в основании клады класса. Это - не имеющий статистической поддержки кластер "Zygnemataceae s. str.", Spirogyra, две ветви Netrium и клада Roya. Мезотениевые Netrium interruptum и Roya - сестринские таксоны для Desmidiales. В составе Zygnematales родовые клады Mougeotia, Zygnema, Roya (две идентичные последовательности) и Spirogyra получили высокую статистическую значимость (99-100% ВР; 1.00 РР), а три рода: Netrium, Mesotaenium и Cylindrocystis - напротив, выявлены как немонофилетичные.

Порядок Desmidiales является терминальным кластером дерева. Его монофи-литичность поддержана умеренными величинами бутстрепа (NJ: 85%; МР: 51%), но высоким значением РР (1.00). Семейства Gonatozygaceae (5 видов) и Closteriaceae (11 видов) устойчивы во всех анализах (100% ВР, 1.00 РР) и являются базовыми груп-

s

Рис. 1. Филогенетическое дерево, основанное на сравнении 1726 нуклеотидов 18S рДНК 84 видов Zygnematophyceae, 13 видов других зеленых стрептофитных водорослей и 6 празинофи-товых (Mamiellales и Pyramimonadales, Chlorophyta), взятых в качестве внешней группы. Величины бутстреп-поддержки (NJ(ML)/MP) >50% и апостериорных вероятностей (BI) >0.90 указаны для всех ветвей за исключением внутренних в кладах Closteriaceae и Desmidiaceae (100=100/100/1.00). Последовательности ШрДНК, полученные автором, вьделены жирным шрифтом. Родовые названия, указываемые в скобках, соответствуют используемым в каталогах коллекций,но не признаваемых нами. Вид, обозначаемый как[Mesotaeniumendlicherianum] скорее всего не является таковым. Длинные ветви Closteriaceae и Spirogyra графически уменьшены до 70 и 35% от исходной длины.

пами в порядке, но последовательность их ветвления не определена. Представители семейств Desmidiaceae и Peniaceae формируют статистически значимый (92% NJ и 77% МР, 0,97 РР) вершинный кластер дерева. При этом род Penium распадается на две клады: образованную крупноклеточными видами P. margaritaceum и Р. spirostriolatum (68-95% ВР), атакже более мелкими P. exiguum и P. cylindrus (100% ВР, 1.00 РР). Представитель семей ствадесмидиевых Phymatodocisnordstedtiana располагается между этими кладами (60-57% ВР, 1.00 РР).

Анализ филогенетических взаимоотношений в сем. Desmidiaceae. Чтобы выяснить эволюционные взаимоотношения в самом многовидовом семействе класса Desmidiaceae была создана и проанализирована матрица данных, включавшая 51 таксондесмидиевых, а также Penium margaritaceum, представляющий сем. Peniaceae как близкородственное Desmidiaceae по результатам предыдущих анализов.

Нами установлена устойчивая ассоциация двух видов рода Cosmocladium, для которого свойственно формирование колоний (98-100% ВР: рис. 2), и трех видов нитчатыхдесмидиевых(Spondylosiumplanum, S. secedens иTeШngiagranulata; Teilingia-клада нарис. 2; >90% ВР). Представители еще 6 родов (7 видов) нитчатых - Desmidium, Bambusina, Onychonema, Groenbladia, Hyalotheca (H. dissiliens) и Spondylosium (S. pulchrum), также группированы в единый кластер (ВР<50%), условно названный Desmidium-кластер. В ее составе выделились три устойчивые пары таксонов, порядок ветвления которых установить не удалось. Семь из 9 проанализированных нами видов Staurastrum образовывали 2 слабо поддержанные клады (Staurastrum-I и -II; 57-75 % ВР). Эти клады и S. pingue, не вошедший ни в одну из них, группировались в кластер, не получивший статистической поддержки. Еще один вид этого же рода - S. tumidum, был сестринским таксоном (59-67% ВР) для двух видов Xanthidium, X. brebissonii иХ. antilopaeum. Высокую статистическую поддержку получила ассоциация Staurodesmus convergens и Cosmarium contractum (81-94% ВР). Кроме этого, были установлены еще две родовые клады: Pleurotaenium и Euastrum (99- 100%BP).

Положение рода Spirotaenia среди стрептофитных водорослей. Учитывая пр оти -воречие между результатами нашего анализа 18S рДНК (рис. 1) и данными исследования McCourt et al. (2000), постулирующего монофилетичность конъюгат и филогенетическую близость родов Spirotaenia и Spirogyra, было проведено более детальное исследование проблемы филогенетического положения рода Spirotaenia среди стрептофитных водорослей. Помимо Spirotaenia, в матрицу данных были включены представители всех групп стрептофитных водорослей и наземные растения, а также 21 вид конъюгат, представляющий все порядки и семейства класса.

Сравнение кодирующих регионов 18S рДНК. В бескорневом ML анализе 36 стрептофитных таксонов распределились между семью основными кладами. Некоторые из них согласуются с принятой нами таксономической структурой отдела Streptophyta и соответствуют его классам Coleochaetophyceae, Charophyceae и Mesostigmatophyceae. Зеленые конъюгирующие водоросли были сгруппированы на дереве в две клады - одна (19 таксонов, 66% ML ВР и 0.95 РР) включает большин-

ство анализируемых видов конъюгат, в то время как вторая объединяет три вида Spirotaenia, имеющих СЫогокуЬт аШорНуИсш как сестринский таксон (87% ВР в МЬ, 77-79% в N1 и МР и 1.00 РР для их общей ветви). Внутренняя структура клады

Рис. 2. Дерево, отображающее филогенетические взаимоотношения представительных видов сем. Ретасеае и БевтсЦасеае. Топология основана на сравнении 188 рДНК последовательностей (1739 нт) методом МЦТ^+1+Г); величины бутстреп-поддержки >50% приведены для МЬ, N1 (Т^+1+Г) и МР анализов. 188 рДНК последовательности, полученные автором, выделены жирным шрифтом.

/у£пеша1орЬусеае была близка к установленной в предыдущем анализе (рис. 1). Роды Spirotaenia и Spirogyra находятся в противоположныхчастяхдерева и не показывают признаков родства. Среди представителей Spirogyra ШТАММ М 2157, последовательность 188 рДНК которого не имеет 1506 интрона I группы, достоверно включен в родовую кладу. Сравнение нескольких альтернативных топологий показало, что дерево, на котором Spirotaenia/Chlorokybus является сестринской группой для клады /у§пета1:орЬусеае или даже для рода Spirogyra, незначительно отличается от «оптимального». Однако топологии,разрушающие ассоциацию Spirotaenia/Chlorokybus и помещающие только Spirotaenia в основании клады Zygnematophyceae или как сестринский таксон для Spirogyra, были отвергнуты всеми тестами.

Анализ последовательностей гЬеЬ. Чтобы проверить гипотезу филогенетических взаимоотношений в классе Zygnematophyceae, основанную на результатах анализа 188 рДНК, был создан набор данных rbcL, включающий 50 представителей отдела 8treptophyta. Анализ этой матрицы данных показал, что наши штаммы Spirotaenia 8рр. вновь формируют устойчивую кладу, помещаемую среди стрептофитных водорослей и не проявляющую родства с остальными представителями класса (рис. 3). В зависимости от метода анализа и набора анализируемых данных, Spirogyra 8р. М

Рис. 3. Бескорневое филогенетическое дерево, показывающее взаимоотношения между представителями Zygneшatophyceae и другими стрептофитными водорослями, основанное на МЬ (вТЯ+1+Г модель) сравнении последовательностей гЬоЬ (1352 нуклеотидов). МЬ/Ш/МР ВР значения >50% и РР >0.90 (В1) указаны для всех ветвей, но опущены в кластере Desmidiaceae. Новые последовательности, полученные при выполнении данного исследования, выделены жирным шрифтом. Две независимых клады конъюгат (Zygneшatophyceae s. str. и три вида Spirotaenia) взяты в рамки. Последовательность и38700, приписываемая Spirotaenia condensata (ЛЯЬ 1300), но не принадлежащая этэму виду, помещена в скобки.

2157 располагается до или сразу после последовательности U38700, представленной в GeneBank как [Spirotaenia condensata], в составе статистически хорошо поддержанной клады видов рода Spirogyra.

Исключение из анализа дегенерированной и предположительно гомопластич-ной третьей позиции кодона rbcL снизило информативность анализа и устойчивость многих клад, однако не изменило их состав и общую топологию дерева. Три штамма Spirotaenia по-прежнему формировали устойчивую кладу, ассоциированную с Chlorokybus и Mesostigma или же Charophyceae в зависимости от метода анализа, и не проявляли родства с Zygnematophyceae.

Тестирование альтернативных rbcL топологий показало, что сестринские отношения между Spirotaenia и Zygnematophyceae могут быть искусственно созданы только в том случае, когда и Mesostigma, и Chlorokybus исключены из анализа, а возможность родства между Spirotaenia и Spirogyra была отвергнута при всех наборах видов и в большинстве методов.

4. Сравнение результатов индивидуальных и комбинированных анализов последовательностей 18S рДНК и rbcL в классе Zygnematophyceae.

Для изучения взаимоотношений между результатами индивидуальных и комбинированного анализов генов методами их объединения и суммирования -lnL, процентами бут-стрепа (ML, NJ, МР) и апостериорных вероятностей (BI) на примере конкретной группы организмов, мы создали матрицуданных, включающую нуклеотидные последовательности ядерного 18S рРНК и хлоропластного протеин-кодирующего rbcL генов 43 таксонов (клональных культур) конъюгирующих зеленых водорослей.

Выбор анализированныхвидов. Немонофилетичныероды Mesotaenium, Cylindrocystis, Netrium и Penium (Gontcharov et al.,2003) были представлены 3-5 штаммами, в то время как для «хороших» родов Spirogyra, Mougeotia, Zygnema и Gonatozygon использовали 2 или 3 представителя (как правило, имеющие наименее сходные последовательности 18S р Д НК). Для того чтобы представить разнообразие эволюционно продвинутого семейства Desmidiaceae, были отобраны 10 родов (по одному штамму на каждый), в том числе и Phymatodocis nordstedtiana, базовый для семейства в филогении 18S рДНК (Gontcharov et al., 2003).

18S рДНК филогения. В ML филогении, основанной на TrN+I+Г модели эволюции последовательностей, виды были сгруппированы в два кластера, соответствующих порядкам Zygnematales и Desmidiales. Эти кластеры разделены самой длинной (20 ступеней) и статистически хорошо поддержанной в большинстве методов анализа внутренней ветвью. В пор. Desmidiales две устойчивых субклады/семейства с длинными индивидуальными ветвями - Gonatozygaceae (GON) и Closteriaceae (CL), предваряют терминальную группу (DESM), объединяющую сем. Desmidiaceae и 2 из 3 видов Peniaceae (P. spirostriolatum помещен в качестве сестринского для DESM таксона; 51-88% ВР, 0.94 РР).

В составе Zygnematales родовые клады Mougeotia, Zygnema, Roya (две идентичные последовательности) и Spirogyra (SPI) имеют высокую устойчивость. Zygnema и Zygogonium образуют умеренно поддержанную кладу (ZYG). Данная топология представляет три рода зигнемовых: Netrium, Mesotaenium и Cylindrocystis - как немонофи-летичные. Помимо этого, получена устойчивая группа из 4 таксонов/штаммов, относящихся к 3 родам (Mesotaenium kramstai, Zygnemopsis sp., Zygnemopsis minutum и Cylindrocystissp. штамм UTEX 1926), обозначенная как MZC, характеризующаяся почти идентичными (различия в 1-4 нуклеотида) последовательностями. Порядок внутреннего ветвления в кластере Zygnematales не имеет статистической значимости.

RbcL филогения. В отличие от анализа 18S рДНК, монофилия порядков конъю-гат не была установлена. В топологиях rbcL два представителя пор. Zygnematales (Roya и Netrium oblongum SVCK 255) были помещены среди видов Desmidiales. Kpo-

ме монофилии порядков, ген rbcL выделил те же группировки таксонов, что и 18S рДНК - DESM, DESM/Penium spirostriolatum, ZYG и MCZ, но придал им большую (> 90% ВР в ML) достоверность. Еще две клады, MOUG и "Zygnemataceae s. str.", установленные ранее только топологически, стали устойчивы в анализе rbcL.

Ассоциация Roya и кластера GON не получила значимой статистической поддержки ни в одном из методов, что противоречит результатам анализа rbcL, где вид Я. anglica (штамм UTEX 93; 4U38694) был помещен в качестве сестринской ветви для Gonatozygon/Genicularia-клады с 100% поддержкой (McCourt et al., 2000). Повторное определение нуклеотидной последовательности rbcL этого штамма обнаружило 155 различий с данными из GenBank. Когда последовательность U38694 была включена в наш анализ, она была с высокой досто верностью помещена между Gonatozygon kinahanii и остальными видами рода Gonatczygon, не проявляя сходства с Roya. Это позволяет сделать вывод, что последовательность U38694 на самом деле была получена из неизвестного штамма Gonatozygon sp.

В филогениях rbcL, в противоположность 18S рДНК анализам, Mesotaenium endlicherianum, М.caldariorum и Netrium oblongum SVCK255 отличаются повышенным уровнем мутабильности и имеют длинные ветви (> 125 апоморфных признаков). SPI-клада (длинная ветвь в 18S рДНК), напротив, не отличатся по этому показателю в анализе rbcL. Если у Mesotaenium caldariorum на первую и вторую позиции кодона приходится только 10 из 128 аутапоморфических признаков, то для М. endlicherianum и Netrium oblongum это число существенно выше - 34 из 166 и 24 из 154 нт соответственно, что отражает дивергентный аминокислотный состав RUBISCO у последних видов.

Особенности индивидуальных наборов данных и их анализов. Эволюционная динамика рибосомального (18S рРНК) и хлоропластного (rbcL) генов, исследованных на примере представителей класса Zygnematophyceae, существенно различаются, что отражается в различных параметрах моделей эволюции их нуклеотидных последовательностей (пропорции типов за решений нуклеотидов, Г-параметр и процентный состав нуклеотидов). В обоих генах частота замещений С>>Т значительно выше, чем замещений другихтипов. В 18S рДНК это может быть связано с необходимостью поддержания комплементарных водородных связей (G-C>>G-U) на уровне транскрипта (рРНК), в то время как в rbcL гене (с еще более высокой частотой С!Т замещений), вероятно, обусловлено асимметричным использованием кодонов (Morton, 1994). Величина гамма-параметра в наборе данных 18S рДНК была примерно в три раза ниже, чем в rbcL, что отражает более равномерное распределение замещений по длине rbcL и согласуется с регулярной структурой кодона протеин-кодирующего гена. В классе Zygnematophyceae > 80% замещений нуклеотидов в rbcL приходится на третью позицию кодона, которая наиболее информативна филогенетически.

Сравнение индивидуальных филогенетическихдеревьев показывает, что они имеют высокое сходство, выделяют одни и те же клады или индивидуальные ветви и характеризуют их сравнимыми величинами ВР и РР поддержки. Однако обнаруживаются и несколько конфликтов между топологиями, которые обусловлены реальными различиями между генами и их историями. Наиболее очевидным противоречием яв -ляется разграничение пор. Zygnematales и Desmidiales, поддерживаемое 18S рДНК, но не rbcL. Но даже это несоответствие относится к внутренним ветвям, не имеющим значимой бутстреп-поддержки в анализе rbcL, и поэтому оно не указывает на наличие серьезных противоречий между филогениями. В качестве примера конгруэнтности можно указать полифилиюродовMesotaenium, Cylindrocystis и Netrium, убедительно продемонстрированную индивидуальными наборами данных.

Комбинированный анализ генов (18S рДНК+rbcL). Анализ единой матрицы данных, объединяющей последовательности 18S рДНК и rbcL (3075 нт) с усредненной эволюционной моделью, позволил получить статистическую поддержку практически для всех внутренних ветвей, разделяющих группировки зигнемофициевых водорослей разного ранга (рис. 4). Топологически это дерево сходно с таковым из анализа 18S рДНК, но его внутренние ветви существенно длиннее и имеют большую устойчивость. Ветвь, разделяющая порядки Zygnematales и Desmidiales, вновь установлена и получила значимую поддержку в ML и BI методах. Roya и две из трех ветвей Netrium расположены как сестринские таксоны для Desmidiales.

Наименьшая сумма -lnL (LS-метод) характеризовала дерево практически не отличающееся от топологии, полученной с применением усредненной модели эволюции нуклеотидных последовательностей (рис. 4).

При объединении индивидуальных наборов данных в один «суперген» результирующая топология превосходила индивидуальные анализы в отношении статистической поддержки внутренних ветвей. Объединенные гены достоверно (ВР и РР) разрешили основной конфликт между rbcL и 18S рДНК деревьями (разграничение пор. Desmidiales и Zygnematales) в пользу 18S рДНК филогении. Устойчивость некоторых других внутренних ветвей (особенно базовых в Zygnematales), если и имевших, то только слабую поддержку в индивидуальных анализах, возросла в комби-

Рис. 4. Филогенетическое дерево, основанное на комбинированном анализе последовательностей Ж рДНК и rbcL 43 видов Zygnematophyceae с использованием усредненной ML моде-ли(ОТК+1+Г). Для ветвей указаны соответствующие ВР и РР значения: МЬ/Ш/МР/В1 (100=100/100/100/1.00). Длинная ветвь Spirogyra графически (||) уменьшена на 50%. Вид, определяемый как[Mesotaenium endlicherianum], вероятно, не являетсятаковым.

нированном анализе. В анализе двух генов филогенетический сигнал 18S рДНК определял топологию дерева, в то время как rbcL обеспечил вариабельность, необходимую для получения статистической достоверности клад и общей топологии.

Комбинированный анализ и проблема длинных ветвей. Многие наборы данных, анализируемые методами молекулярной филогении, включают таксоны, существенно отличающиеся своей эволюционнойдинамикой от остальных, и, как правило, имеющие длинные ветви на филогенегических деревьях. При наличии в матрице данных нескольких таких ветвей происходит их взаимное притяжение (LBA), а длинные ветви часто помещаются в качестве базовых на дереве вне зависимости от родства образующих их организмов. Частично проблема длинных ветвей решается использованием комплексных моделей эволюции нуклеотидных последовательностей и/или медленно эволюционирующих генов (Gribaldo, Philippe, 2002; Philippe, 2000), однако полностью устранить LBA пока не удается. Все таксоны, имевшие длинные ветви в наших анализах (рис. 4), характеризовались повышенной эволюционной скоростью в генах rbcL (M. endlicherianum и N. oblongum SVCK255) или в 18S рРНК (Spirogyra), но не в обоих наборах данных. Результаты данного исследования показывают, что сочетание быстро и медленно эволюционирующих генов в одном наборе данных также помогает определить филогенетическую позицию LB вида или клады.

Примером длинной ветви является клада Spirogyra на 18S рДНК деревьях (рис. 1, 4). Ранее этот же маркер помещал Spirogyra в качестве сестринской группы для всех остальных представителей Zygnematophyceae (Besendahl, Bhattacharya, 1999) или как базовую кладу класса (Gontcharov et al., 2003). Существует вероятность того, что базовое положение было обусловлено LBA. В rbcL филогении Spirogyra не является LB-кладой, а ее положение на дереве rbcL согласуется с таковым на укорененном (Gontcharov et al., 2003) и бескорневом (данное исследование) 18S рДНКдеревьях. Маловероятно, что на положение Spirogyra, определенное анализами 18S рДНК,. оказало влияние взаимное притяжение длинных ветвей.

Основываясь на полученных результатах, можно заключить, что филогения класса Zygnematophyceae, базирующаяся на консервативном 18S рРНК гене, на высоких таксономических уровнях лучше согласуется с морфологическими данными и менее чувствительна к различным артефактам по сравнению с анализом, использующим гомопластический и насыщенный мутациями протеин-кодирующий ген rbcL. Однако последний более информативен на низких таксономических уровнях, где разрешающая сила 18S рДНК мала.

Анализ молекулярных синапоморфий. Для поиска замен в первичной и вторичной структурах изученных генов (молекулярных синапоморфий), характеризующих членов клад и унаследованных ими от общего предка, все признаки, определяющие кладу и принимаемые кладистикой как синапоморфные, были проанализированы на: 1) отсутствие конвергентной эволюции за пределами клады (параллельная эволюция, ведущая к идентичному состоянию признака и 2) строгую консервативность в пределах клады, исключающую дальнейшие изменения или реверсии. Анализировались две матрицы данных -18S рРНК и rbcL. Первая включала 147 последовательностей 18S рРНК представителей Zygnematophyceae и более 100 последовательностей других стрептофитных водорослей, наземных растений и Chlorophyta s. 1. В набор данных rbcL (250 таксонов) объединили все известные для конъюгат последовательности, а также репрезентативные для стрептофитных водорослей, наземных растений и Chlorophyta s. 1.

Синапоморфные признаки в 18S рРНК представителей Zygnematophyceae. Большинство замен, характеризующих клады высшего ранга, располагаются в районах повышенной консервативности структуры 18S рРНК. В одном из таких участков (3 пара шпильки 33) была обнаружена компенсаторная замена, отличающая предста-

вителей /у£;пета1:орЬусеае (и-А пара) от 81гер1орЬу1а и СЬ1огорЬу1а (А-и, реже Св). Эта замена присутствует и в последовательностях 188 рРНК трех штаммов Spirotaenia, не входивших в наших анализах в состав клады класса. В то же время, 188 рРНК Chlorokybus - сестринский таксон для Spirotaenia (рис. 1, 3), имеет типичную для большинства 81гер1орЬу1а последовательность стебля 33 (А-И пару). Таким образом, эта двойная мутация может рассматриваться как молекулярная синапо-морфия для класса Zygnematophyceae.

Были обнаружены два признака, характеризующие эволюционно продвинутый пор. Ве8т1Ша1е8 - пятый нт в петле между стеблями 25 и 26 (И>>А) и седьмая пара

Рис. 5. Примеры молекулярных синапоморфий в генах 188 рРНКи гЬсЬ, характеризующие порядки и семейства Zygnematophyceae. Представительные виды клад выделены жирным шрифтом.

стебля 45 (G-U>>G-C; рис. 5). Хотя поиск синапоморфий для парафилетичного в наших анализах пор. Zygnematales был безрезультатным, была обнаружена замена, характеризующая крупную клад/, входящую в его состав - "Zygnemataceae s. str." (рис. 1, 4). У большинства ее членов на 26 позиции стебля 49 располагается U-A пара, тогда как у остальных видов класса здесь находится G-U пара. Строго говоря, эту замену нельзя рассматривать как негомопластичную, поскольку она имеет, по крайней мере, два аутапоморфных исключения — у Mesotaenium cf chlamydosporum (C-G) и Mougeotia sp. M 417 (U-G; рис. 5).

Среди семейств конъюгат, только для Gonatozygaceae и Closteriaceae нам удалось обнаружить ряд признаков, отвечающих установленным нами требованиям. В случае Gonatozygaceae это две трансверсии во внутренних петлях вариабельных участков транскрипта 18S рРНК - A>>U замена во внутренней петле стебля Е10_1 и С >>Азамена на позиции 1 спейсерного элемента между шпильками Е23_9 и Е23_11. Сем. Closteriaceae характеризуется большим числом синапоморфных замен, некоторые из них вызвали небольшие структурные перестройки транскрипта. Это замены и вставки в шпилечной петле 6, вызвавшие удлинение на 3 пары дистальной части стебля у всех видов Closterium (Denboh et al., 2001). Еще две замены, не нарушающие структуру стебля, обнаружены на позиции 4 элемента Е23_12 (G-C>>G-U) и на позиции 5 элемента 24 (G-U>>G-C).

Из 16 апоморфных признаков, характеризующихкладу DESM/Penium spirostriolatum (рис. 3), только один не является гомопластичным - нт 2 (дистальный) в обратной нити второй внутренней петли стебля E10_l (и»С;рис. 5).

Синапоморфии в гене rbcL. Поиск признаков, характгризующих клады порядков и семейств на аминокислотном уровне, обнаружил только одну замену, отражающую две замены на нуклеотидном уровне. В кодоне 192 (al петля), плезиоморфный цистеин (кодон TGY) был заменен на валин (кодон GTN) у всех членов "Zygnemataceae s. str." (рис. 5).

5. Филогенетическая структура класса Zygnematophyceae

Монофилия класса в связи с положением рода Spirotaenia. Результаты молекуляр-но-филогенетических анализов класса в значительной степени согласуются с ранними исследованиям, в которых использовались меньшие наборы данных (Besendahl, Bhattacharya 1999; Bhattacharya et al. 1994; Denboh et al. 2001; McCourt et al. 1995, 2000; Surek et al. 1994). В то же время, они установили неожиданное положение рода Spirotaenia среди стрептофитных водорослей (рис. 1,3), предполагающее полифилетичность класса Zygnematophyceae. Этот результат противоречит выводам о филогенетической близости Spirogyra и Spirotaenia, согласующимся с традиционными взглядами на взаимоотношение этих родов (McCourt et al., 1995, 2000). Однако наши исследования установили, что rbcL последовательность U38700, приписанная S. condensata, и на анализе которой основаны заключения McCourt et al., вероятно, была получена из неизвестного штамма Spirogyra.

Отсутствие 1506 интрона группы I в 18S рДНК последовательностях видов Spirotaenia подтверждает обособленность рода (Gontcharov, Melkonian, 2004). Для представителей Zygnematophyceae наличие этого интрона является одним из признаков, отличающих их от других членов Streptophyta на молекулярном уровне (Bhattacharya et al., 1994; Gontcharov et al., 2003). Вторичная же потеря интрона подтверждена только у трех близкородственных штаммов Spirogyra из более чем 100 исследованных видов конъюгат (Gontcharov et al. 2003). Полностью нельзя исключать возможную потерю интрона и для Spirotaenia, однако положение рода на дереве среди стрептофитных водорослей делает данное предположение маловероятным.

Наличие конъюгации у Spirotaenia (наблюдавшееся только у 4 из 25 видов) позволяет предположить, что род отделился от основного ствола конъюгат уже после возникновения этого способа полового размножения, а встраивание интрона в 18S рДНК, произошедшее, по мнению Bhattacharya et al. (1994) 350-400 млн. лет назад, и его дальнейшее вертикальное наследование уже не затронуло предка Spirotaenia. Вероятно, что эволюционная линия Spirotaenia существует в качестве самостоятельной столько же времени как минимум. Результаты наших анализов совершенно определенно отрицают сестринские отношения между Spirotaenia и Spirogyra, предполагавшиеся долгое время на основании сходства морфологии их хлоропластов (рис. 7: 1-3). Этот признак является гомопластическим (спиральные хлоропласты характерны и для некоторых родов Chlorophyta s. 1.; у Spirotaenia и Spirogyra они различаются по направлению вращения), а конъюгация Spirotaenia имеет ряд особенностей (формирование двух гамет и полное ослизнение клеточных стенок), отличающих этот род от остальных зигнемофициевых. Лизис клеточной стенки у Spirotaenia при конъюгации предполагает очень низкое содержание, или полное отсутствие в ней целлюлозы, которая является одним из основных компонентов клеточной стенки у остальных представителей класса.

Таким образом, наше исследование показало, что род Spirotaenia характеризуется необычным сочетанием генетических и фенотипических признаков, которые в настоящее время невозможно истолковать однозначно. Мы полагаем, что этот род является сестринской группой для всех остальных конъюгат. Если данное предположение будет подтверждено дальнейшими исследованиями, то тогда станет очевидной необходимость разделения класса на два подкласса - один монородовой (Spirotaenia) и второй - соответствующий Zygnematophyceae s. str. в наших анализах. Что касается близости Spirotaenia и Chlorokybus (Chlorokybophyceae),TO нельзя исключать гомопластическое притяжение их нуклеотидных последовательностей. Однако полное сходство в этом отношении результатов анализов двух генов (18S рДНК и rbcL; Gontcharov, Melkonian, 2004), находящихся в разных геномах клетки и испытывающих различное давление естественного отбора, заставляет с осторожностью относиться к такому предположению и заслуживает дальнейшего изучения.

Порядок Zygnematales. Молекулярно - филогенетические анализы помещают этот порядок в основание дерева конъюгат, что подтверждает примитивность зигнемо-вых и эволюционную продвинутость десмидиевых.

В системе конъюгат (Mix, 1969, 1972), в целом принимаемой нами, пор. Zygnematales слагается двумя семействами — Mesotaeniaceae с одноклеточными формами и Zygnemataceae - с нитчатыми. Наличие в порядке двух типов организации возвращает нас к вопросу о том, какая водоросль, нитчатая (West, 1904, 1914) или одноклеточная (Голлербах, Полянский, 1951; Курсанов, 1954; Fritsch, 1935, 1956; Oltmans, 1904, 1922; Prescott et al., 1972), была в основании эволюционного дерева зигнемовых и, соответственно, всех конъюгат. Молекулярные данные помещают одноклеточные формы в качестве базовых практически для всех клад зигнемовых ("Zygnemataceae s. str.", MZC и MOUG; рис. 1, 4), указывая на то, что именно они могли быть предковыми для этих групп и, вероятно, для всего класса. Принимая род Spirotaenia в качестве первой ветви дерева конъюгат, логично будет предположить, что коккоидный таллом его представителей сохраняет плезиоморфоное состояние признаков предковой формы Zygnematophyceae. Таким образом, в целом находит подтверждение гипотеза (Oltmans, 1904) о том, что развитие исходных кок-коидных форм конъюгат проходило по двум направлениям: одна ветвь дала начало нитчатым зигнемовым, а другая привела к появлению десмидиевых водорослей. В то же время, у нас есть основания полагать, что процесс эволюции морфологических признаков был более сложным и не столь однозначным, как это предполага-

лось ранее. Скорее всего, многоклеточность возникала несколько раз независимо в разных эволюционных линиях зигнемовых (Spirogyra, Zygnema/Zygogonium, Mougeotia, MZC-клада), и нельзя исключать вероятность вторичного упрощения нитчатых форм до одноклеточных (MZC-клада).

Морфология хлоропластов является еще одним общим признаком для видов, располагающихся в основании дерева конъюгат. Помимо Spirotaenia p. р. пристенные хлоропласты характерныдля Mesotaenium endlicherianum (рис. 7:5) - первой ветви клады Zygnematophyceae s. str. и следующего за ним М. cf. chlamydosporum (рис. 7:4). Необходимо отметить, что все группы стрептофитных ьодорослей, как предваряющие Zygnematophyceae на филогенетическом дереве отдела, так и ответвляющиеся позднее, также имеют пристенные хлоропласты (McCourt et al., 2004). Логично предположить, что базовые ветви класса сохранили хлоропласты плезиоморфной морфологии, свойственной их общему предку. Вопрос о том, являются ли спиральные или осевые хлоропласты Spirotaenia s. 1. исходным типом для остальных конъюгат или же более поздней аутапоморфией рода, остается открытым. Mesotaenium endlicherianum и М. cf. chlamydosporum характеризуются пристенными корытовид-ными хлоропластами, имеющими крупные пиреноиды, и хлоропласты подобной морфологии не известны у других представителей Zygnematophyceae. Осевые звездчатые хлоропласты появились у представителей класса позднее, и, вероятнее всего, этот признак возник и развивался независимо в двух эволюционных линиях конъюгат: Cylindrocystis brebissonii — Zygnema — MZC клада и Netrium — Desmidiales. В целом, данная теория согласуется с гипотезой эволюции морфологии хлоропластов в классе Zygnematophyceae (Telling, 1950, 1952), однако в качестве исходного типа она помещает пристенные хлоропласты.

Во всех молекулярно-филогенетических анализах, использовавших разные наборы данных и маркеры (Gontcharov et al., 2003, 2004; McCourt et al., 2000), порядок , Zygnematales был представлен в виде парафилетичной группы, образованной несколькими кладами и отдельными таксонами, занимающей базовое положение в классе. Можно считать твердо установленным, что традиционный порядок слагается по крайней мере 7 ветвями — кладами Roya, N, SPI, "Zygnematales s. str." и тремя отдельными таксонами (Mesotaenium endlicherianum, Netrium interruptum и N. oblongum SVCK 255). При строгом кладистическом подходе к систематике, все эти ветви должны рассматриваться как таксоны одного урозня, предположительно порядки, однако на данном этапе мы воздерживаемся от каких-либо преобразований, считая их преждевременными.

Таким образом, ни одна из классификационных схем, когда-либо предложенных для зигнемовых, не получила поддержки в молекулярно-филогенетических анализах, указывая на искусственность традиционного порядка Zygnematales. Очевидно, что эволюционная история базовых (примитивных) зигнемовых была более сложной, чем это предполагалось ранее, и в настоящее время практически ничего не известно о признаках, по которым происходила дивергенция в этой группе. Соответственно, пока остается не ясным статус большинства из обнаруженных нами клад и ветвей. В некоторых случаях морфологические признаки, использовавшиеся ранее для целей классификации в порядке, хорошо очерчивают обнаруженные нами группы разного таксономического уровня, однако они не универсальны и не отражают родство в других кладах. Наши анализы подтвердили близость видов в родах Spirogyra, Mougeotia, Zygnema и некоторых надродовых клад (MOUG и ZYG; рис. 1, 3, 4), предполагавшееся на основе близости морфологии слагающих их видов. В то же время устойчивая клада MZC является ярким примером того, что морфологически различающиеся виды (классифицируемые в разных родах, семействах или даже порядках) на самом деле могут являться близкородственными.

Наличие большого числа независимых клад и ветвей в составе Zygnematales не могло не затронуть монофилии и слагающих его семейств. Впервые этот вывод был сделан авторами, предложившими реорганизовать таксономическую структуру порядка, упразднив сем. Mesotaeniaceae в пользу имеющего приоритет Zygnemataceae (McCourt et al., 2000). Однако их механическое объединение не решает проблемы естественности и филогенетической целостности как укрупненного семейства, так и порядка, поскольку они не являются монофилетичными таксонами. Мы полагаем, что клада "Zygnemataceae s. str.", объединяющая представителей большинства проанализированных родов зигнемовых (в первую очередь, типовой род семейства и порядка Zygnema), может рассматриваться как сем. Zygnemataceae в составе пор. Zygnematales, объем которого еще предстоит уточнить. Распределение на филогенетическом дереве видов Mesotaeniaceae отражает высокую степень его полифиле-тичности и не оставляет шансов на то, что это семейство может быть сохранено в каком-либо виде. Вне всякого сомнения, диагноз Zygnemataceae требует изменения для включения в него как нитчатых, так и одноклеточных форм, а кроме этого, для выделения из состава семейства родов Sp irogyra, Netrium, Roya, Sp irotaen ia и, ве -роятно, некоторых видов Mesotaenium. В настоящге время практически невозможно назвать какой-либо фенотипический признак или признаки (синапоморфии), объединяющие представителей данной клады (семейства) и отграничивающие их от других таксонов. Хотя клада "Zygnemataceae s. str." и не находит статистической поддержки в анализе 18S рДНК (рис. 1), rbcL и комбинированный анализ двух генов устанавливает ее с высокой степенью достоверности (рис. 4), а молекулярные синапоморфии (рис. 5) подтверждают общность происхождения ее членов.

Очевиден тот факт, что разнообразие пор. Zygnematales на родовом уровне было сильно недооценено традиционной таксономией, поскольку важность таких признаков как тип организации (одноклеточность или нитчатость) и тип хлоропластов (осевые лентовидные, звездчатые или спиральные) была переоценена. В то же время, у нас есть все основания полагать, что традиционные представления о «близости» видов базируются лишь на поверхностном внешнем сходстве формы хлоропластов и отсутствии информации об их тонкой структуре. Так, почти все монографические обработки указывают, что виды рода Mesotenium имеют центральные, очень редко пристенные хлоропласта. Вместе с тем, наблюдения показали, что только у одного из 4 исследованных нами представителей этого рода (M. kramstai) хлоропласта на самом деле центральные (рис. 7: 4-7). Положение и форма хлоропластов, в свою очередь, определяют положение ядра в клетке и характер его поведения при делении. Знакомство со столь существенными отличиями видов по этим признакам позволяет в ином свете взглянуть на достоверно установленную полифилию Mesoteniutn (рис. 1,4). Мы полагаем, что различия в строении и морфологии хлоропластов (рис. 7:8-10) будут характеризовать и воды еще одного полифилетично-го рода зигнемовых — Cylindrocystis (Gontcharov et al., 2003; 2004).

Пример общности происхождения при налички существенных различий в морфологии и биологии демонстрируют не только представители MZC клады, но члены Spirogyra/Sirogonium клады. Молекулярные данные достоверно помещают Sirogoniumsticticum, типовой вид рода, среди представителей Spirogyra, отрицая самостоятельность Sirogonium. Хотя эти роды и отличаются рядом фенотипических признаков, эти различия не находят отражения в филогенетических дистанциях. Поэтому мы включаем Sirogonium sticticum в состав Spirogyra как S. stictica, следуя предложению Wille (1884). Можно предположить, что таксономическая принадлежность остальных 15 видов Sirogonium также должна быть изменена, однако для этого требуются дополнительные исследования.

Полифилия родов Mesotenium и Cylindrocystisчастично объясняет отсутствие предполагаемого родства между ними и родами нитчатых зигнемовых: Mougeotia и Zygnema. Теория о филогенетической близости нитчатых и коккоидных форм, имеющих один тип хлоропласта, была первой, протестированной с помощью молекулярных методов в классе Zygnematophyceae (McCourt et al., 1995; 2000; Park et al., 1996). Согласно результатам этих авторов, водоросли с пристенными спиралевидными хлоропластами (Spirogyra—Spirotaenia) и центральными лентовидными (Mougeotia—Mesotenium) имеют общее происхождение, однако звездчатые хлоропласты могли возникнуть несколько раз независимо в группе (Zygnema - Zygogonium и Cylindrocystis - Zygnemopsis). Наши исследования показали ошибочность этого мнения в отношении Spirogyra и Spirvtaenia (Gontcharov, Melkonian, 2004). Вместе с тем, полностью отрицать возможность родства междуMougeotia и некоторыми Mesotenium каки между Cylindrocystis иZygnemopsis представляется нам преждевременным, поскольку Mesotenium caldarioum является сестринским таксоном для рода Mougeotia, а некоторые виды Cylindrocystis формируют устойчивую кладу с Zygnemopsis (рис. 1, 4). Однако вопрос о том, какие признаки объединяют эти таксоны, остается открытым.

Роды Netrium и Roya. Молекулярные данные выделяют эти роды из состава кластера зигнемовых и помещают в качестве сестринских для Desmidiales. Подобное положение на эволюционном дереве с высокой степенью вероятности позволяет утверждать, что формы, предковые для современных представителей этих родов, могли являться исходной группой, давшей начало порядку десмидиевых. Вполне вероятно, что это были водоросли с омнирадиальной, удлиненной клеткой и крупным осевым хлоропластом (как у современных Netrium и Roya). Примерно такую морфологию сохранили представители сем. Gonatozygaceae и Closteriaceae, образующие базовые ветви Desmidiales. В настоящее время неизвестно, какие структурные признаки отличают роды Netrium и Roya от других членов Zygnematales, и существуют ли синапоморфии, объединяющие Netrium, Roya и Desmidiales.

Нами установлена сборная природа рода Netrium, четыре проанализированных вида которого с высокой достоверностью образуют три независимые ветви (рис. 4). Анализ морфологических признаков этих видов показал, что каждая ветвь отличается числом хлоропластов в клетке. Так, клада N объединяет штаммы с двумя хлоропластами (рис. 7:13), Netrium interruptum имеет 4 хлоропласта (рис. 7:11,12), а N. oblongum (SVCK 255) - один (рис. 7:14). Учитывая,.что форма и число хлоропластов обуславливают у видов Netrium различия в положении ядра в клетке и его поведении в процессе цитокинеза (Pickett-Heaps, 1975; Jarman, Pickett-Heaps, 1990), становится вполне объяснимой столь глубокая их дивергенция.

Таким образом, наше исследование показало, что молекулярные данные характеризуют порядок Zygnematales и оба его семейства как немонофилетические образования и отвергают все когда-либо предлагавшиеся таксономические системы порядка. Характер филогенетических взаимоотношений (рис. 1, 4) и наличие молекулярных синапоморфий в 18S рРНК и rbcL-генах (рис. 5) позволяют рассматривать кладу "Zygnemataceae s. str", включающую типовой род Zygnema, как семейство Zygnemataceae, объединяющее большую часть нитчатых и коккоидных форм, ранее классифицировавшихся в двух семействах.

Порядок Desmidiales. В отличие от парафилетичного Zygnematales, пор. Desmidiales был определен в нашем исследовании как устойчивая вершинная группа класса Zygnematophyceae, состоящая из трех клад, две из которых соответствуют общепризнанным семействам. Наиболее значимую статистическую поддержку порядку обеспечил более консервативный 18S pPHK ген, хорошо разграничивающий Zygnematales и Desmidiales (рис. 1). Более вариабельный и предположительно го-мопластичный ген rbcL не разделяет эти таксоны, однако сомнений в их достовер-

Рис. 7.1 - Spirogyra sp.; 2 - Spirotaenia condensata; 3 - S. alpina; 4 - M. cf. chlamydosporum; 5 -Mesotaenium endlicherianum; 6 - M. kramstai; 7—M. caldariorum; 8 - Cylindrocystisbrebissonii; 9 — C. crassa; 10 - C.cf.cushleckae; 11,12-Netrium interruptum; 13-N.oblongum штамм ASW07201; 14-N. oblongum штамм SVCK 255.

ности у нас не возникает. Порядок Desmidiales очень убедительно поддержан структурной (наличие пор в клеточной стенке) и молекулярными (см. гл. 4.8.1) синапо-морфиями, и, как показали наши исследования, все предположения о возможном родстве некоторых мезотениевых и десмидиевых водорослей (McCourt et al., 2004) основываются на ошибочных результатах.

Согласно данным молекулярно-фологенетических анализов клады Gonatozygaceae и Closteriaceae, характеризующиеся длинными устойчивыми ветвями, являются независимыми группами в составе Desmidiales, в то время как род Penium (Peniaceae) и очень крупное семейство Desmidiaceae образуют единый кластер. Данная топология отвергает подразделение Desmidiales на две группы, основанное на признаках ультраструктуры клеточной стенки - "Archidesmidiineae" (подпор. Closteriineae; Ruzicka, 1977), и характеризующееся простыми порами, проникающими только через наружный слой клеточной стенки, и орнаментацией, образованной этим слоем, и "Desmidiineae" (подпор. Desmidiineae), имеющие поры, пронизывающие клеточную стенку, и орнаментацию, образованную вторичной клеточной стенкой (Mix 1972). Два молекулярных маркера, 18S рДНК и rbcL, характеризуют "Archidesmidiineae", слагаемое семействами Clo5.teriaceae, Gonatozygaceae и Peniaceae, как парафилетическую группу и определяют признаки, характеризующие ее, как плезиоморфные для порядка Desmidiales. Как и в случае с порядком Zygnematales, классифицировавшимся традиционной таксономией на основе пле-зиоморфного состояния признака (отсутствие пор), выделяемое по тому же принципу "Archidesmidiineae" не является монофилетическим образованием.

Семейство Gonatozygaceae. Молекулярная филогения помещает эту группу в качестве первой ветви порядка Desmidiales (рис. 1,4), однако статистическая достоверность такой топологии невелика, и хлоропластный ген rbcL предлагает семейство Closteriaceae как базовое в порядке. В любом случае можно утверждать, что дивергенция этих семейств была ранней, произошла на коротком отрезке времени, и дальнейшая их эволюция проходила по разным признакам. Наиболее очевидной морфологической синапоморфией гонатозиговых, подкрепленной данными молекулярных анализов, является способность формировать хрупкие нити. Вероятно, этот признак является приспособлением к преимущественно планктонному образу жизни, свойственному членам семейства. Нити образуются за счет неполного расхождения делящихся клеток, скрепленных аморфным веществ ом, отлагающимся на их концах (Mix, 1980). Такой способ существенно отличается от типичного для большинства истинно нитчатых форм и не имеет аналогов среди остальных конъюгат.

Результаты молекулярно-филогенетических анализов отвергают правомерность выделения рода Genicularia из состава Gonatozygon (de Bary, 1856), основанного на признаках морфологии хлоропластов — осевых у Gonatozygon и постенных у Genicularia. Во всех филогениях Geniculariaspirotaenia, типовой вид рода, достоверно включался в состав Gonatozygon. Мы предлагаем рассматривать Genicularia spirotaenia как Gonatozygonspirotaenium, вернув ему оригинальное имя, данное de Вагу (1856) при описании.

Внутриродовая классификация Gonatozygon основана на признаках морфологии клетки (форма концов) и орнаментации клеточной стенки (гладкая/гранулированная/шиповатая). Один вид рода (G. kinahanii) характеризуется совершенно гладкой клеточной стенкой, что рассматривалось многими исследователями как примитивный признак, внешне сближающий его с видами рода Mougeotia (Ruzicka, 1977). Наши данные помещают этот вид в основание родовой клады, подтверждая предположение о том, что эволюция в роде была сопряжена с развитием скульпту-рированности клеточной стенки. Еще одной отличительной особенностью G. kinahanii является анизогамия (Rino, 1979). Подобный тип полового размножения

не является редким у зигнемовых водорослей, однако нельзя утверждать, что у G. kinahanii сохранилось плезиоморфное состояние этого признака. Анизогамия известна во всех семействах десмидиевых, что делает подобный эволюционный сценарий маловероятным. В пределах семейства дифференциация гамет характерна и для Gonatozygonspirotaenia, эволюционно более продвинутого в роде, что указывает на гомоплазию этого признака.

Семейство Closteriaceae. Семейство Closteriaceae - второе по числу видов в пор. Desmidiales, оно насчитывает около 150 видов в 2 родах. Члены семейства отличаются высоким полиморфизмом, который отражается в большом числе внутривидовых таксонов (около 1000). Помимо этого, в составе некоторых морфологических видов выделяются генетически изолированные биологические группы или биологические виды (Coesel, 1988a, b; Ichimura, 1981, 1982; Watanabe, Ichimura, 1982), находящиеся в сложных взаимоотношениях между собой, что придает еще большую неясность таксономии семейства.

Closteriaceae является одним из старейших семейств конъюгат, и его концепция практически не изменилась с момента описания. Отличительными признаками таксона являются форма клетки (согнутые и суживающиеся к концам), наличие вакуолей с кристалликами гипса, сегментированная, пронизанная порами и часто орнаментированная (штриховатая или пунктированная) клеточная оболочка.

Несмотря на то, что морфологически сем. Closteriaceae очень хорошо обособлено и считается одной из наиболее четко очерченных таксонов конъюгат, его самостоятельность была поставлена под сомнение ранними молекулярно-филогенети-ческими исследованиями (Besendal, Bhattacharya, 1999; McCourt et al., 2000). Однако в дальнейшем было показано, что эти результаты основывались на ложных данных, а монофилию семейства можно считать полностью подтвержденной молекулярными данными (Denboh et al., 2001; Gontcharov et al., 2003, 2004).

Анализ показал, что только некоторые нуклеотидные замены, обеспечивающие высокую обособленность клады Closteriaceae на дереве 18S рДНК, не являются го-мопластичными, присутствуют у всех исследованных видов и, вероятно, были унаследованы от их общего предка. Структурные особенности транскрипта 18S рРНК могут рассматриваться как молекулярные синапоморфии сем. Closteriaceae, и на их основе возможно создание специфичных праймеров или проб, селективных для его представителей. Характер внутренней структуры клады семейства предполагает наличие большого числа аутапоморфных признаков, обеспечивающих длинные индивидуальные ветви таксонов и, предположительно, отражает их быструю дивергенцию. Невысокая информативность 18S рДНК в кладе может указывать на слабую пригодность этого маркера для изучения взаимоотношений в семействе Closteriaceae. Учитывая это, мы с осторожностью относимся к предположению о несостоятельности рода Spinoclosterium, следующему из результатов наших анализов. Для этого монотипичного рода известны как синапоморфные признаки (морфология вегетативных клеток, тип их деления, процесс прорастания зигоспор и ход мейоза), объединяющие его с видами Closterium, так и аутапоморфные (ани-зогамный половый процесс), отличающие от них.

Семейство Peniaceae, наряду с Gonatozygaceae и Closteriaceae традиционно относимое к группе "Archidesmidiineae", отличается морфологией клетки и типом орнаментации ее стенки. Результаты наших анализов отвергли объединение семейств Peniaceae и Gonatozygaceae, предложенное на основании сходства тонкого строения клеточной стенки (Kouwets, Coesel, 1984), и продемонстрировали искусственность "Archidesmidiineae". Молекулярные данные показали, что род Peni не проявляет сходства с остальными членами этой примитивной группы, а является сестринским таксоном для эволюционно продвинутого сем. Desmidiaceae (рис. 1, 4). Хотя сест-

ринские отношения хорошо поддержаны статистически двумя филогенетическими маркерами, их трудно обосновать какими-либо фенотипическими признаками. Глубокие различия в строении клеточной стенки у представителей двух семейств подробно описаны (Mix, 1967, 1972), и их важность не подвергается нами сомнению. Следует отметить, что нитчатая десмидиевая водоросль Phymatodocis nordstedtiana имеет разделенную на полуклетки, как у всех Desmidiaceae, клеточную стенку, но простые поры как у видов Penium (Engels, Lorch, 1981), т.е. является переходной формой между Peniaceae и Desmidiaceae. Наши исследования полностью подтвердили его переходный статус, помещая P. nordstedtiana в основании клады сем. Desmidiaceae среди представителей Penium и представляя этот род как парафи-летический, слагаемый двумя кладами (рис. 1,4). При этом филогенетическая дистанция между кладами Penium достоверна во всех анализах, а ветвь между ними гораздо лучше выражена и поддержана чем ветвь между P. exiguum, P. cylindrus и ядром семейства Desmidiaceae.

Ограниченность данных о биологии, биохимии и генетике представителей Penium не позволяют убедительно объяснить столь неожиданную картину взаимоотношений в роде, а также его близость к десмидиевым водорослями. Следует отметить, что у P. exiguum, P. cylindrus изучался только тип порового аппарата (Mix, 1967), и детали строения синуса неизвестны. На наш взгляд, близость P. exiguum, P. cylindrus и Phymatodocis указывает на наличие у них обших признаков, и нельзя исключать вероятность того, что эти виды могут иметь клеточную стенку, разделенную на полуклетки, как и у Phymatodocis, тем более, что центральная перетяжка достаточно хорошо выражена у P. exiguum.

Таким образом, род Penium и семейство Peniaceae требует дальнейшего изучения для установления его таксономической структуры и разграничения с сем. Desmidiaceae. Собственно говоря, не до конца выясненным является только родство и таксономическая принадлежность мелкоклеточных видов рода. Самостоятельность и обособленность его базовой ветви не вызывает никакого сомнения, а присутствие в составе базовой клады P. margaritaceum (типового вида рода) однозначно сохраняет за ней родовое название. Эта же клада может рассматриваться и как самостоятельное семейство Peniaceae, являющееся сестринской группой по отношению к Desmidiaceae.

Семейство Desmidiaceae. Клеточная оболочка, разделенная надве полуклетки, и наличие сложного порового аппарата - основные диакритические признаки семейства. Чрезвычайное морфологическое разнообразие его представителей затрудняет однозначную характеристику Desmidiaceae, однако наличие у большинства видов перетяжки (синуса) между полуклетками делает их легко узнаваемыми. В настоящее время в составе семейства выделяют от 30 до 40 родов, объединяющих около 2500 видов.

С момента установления различий в тонком строении клеточной стенки семейств конъюгат признаки, характеризующие Desmidiaceae, рассматривались как апомор-фные, а само семейство — как эволюционно продвинутое (Паламарь-Мордвинце-ва, 1982; Lutkemuller, 1902; Mix, 1972;Ruzicka, 1977).Молекулярно-филогенетичес-кие исследования полностью подтверждают такой статус сем. Desmidiaceae в классе Zygnematophyceae и порядке Desmidiales, располагая его в качестве вершинной клады дерева конъюгат. Однако близость Peniaceae и Desmidiaceae, парафилия сем. Peniaceae и положение Phymatodocis nordstedtiana на филогенетическом дереве, установленные в наших анализах, практически полностью размывают границы между этими семействами в традиционном понимании (Gontcharov et al., 2004). Анализируя распределение признаков строения клеточной стенки по вектору Peniaceae — Desmidiaceae, мы наблюдаем постепенный переход между ними, точнее, различные комбинаций двух признаков — разделения стенки на полуклетки и типа строе-

ния пор. На наш взгляд, их сочетание у Phymatodocis выделяет этот род как еще одно семейство, характеризуемое наличием простых пор и вторичной клеточной стенкой, разделенной на полуклетки.

Независимо от статуса и таксономической принадлежности Phymatodocis, его положение на филогенетическом дереве позволяет уточнить последовательность изменений ультраструктуры клеточной стенки у предковой формы сем. Desmidiaceae, предположительно, имевшей много общих черт с видами Penium. Нам представляется наиболее вероятным, что формирование настоящих пор произошло в последнюю очередь, после того, как сформировались полуклетки, и первичная клеточная стенка стала отделяться от вторичной (признаки Phymatodocis). Примечательно, что эти сложные структурные преобразования слабо отразились на генетических дистанциях между Phymatodocis и Desmidiaceae. Длина ветвей дерева, разграничивающих эти таксоны, мала, а их статистическая поддержка не всегда значима. Возможным объяснением подобного феномена можно считать быстроту эволюционных изменений в строении клеточной стенки у десмидиевых, однако его механизм и движущая сила остаются неизвестными.

Достаточно высокая дивергенция последовательностей 18S рДНК Desmidiaceae обусловила низкую устойчивость клады семейства и невысокую достоверность ее внутренней топологии. Взаимоотношения между родами остались не выясненными, что не позволило детально сравнить полученную филогению с существующими схемами эволюции морфологических признаков в семействе, прежде всего формы клетки (Teiling, 1950) и типов хлоропластов (Teiling, 1952). Все же отдельные детали этих схем находят подтверждение в результатах наших анализов. Прежде всего, это касается особенностей морфологии предковых форм сем. Desmidiaceae и всего пор. Desmidiales. Омнирадиальные организмы со звездчатыми хлоропласта-ми считались наиболее примитивными (Teiling, 1950, 1952), поэтому предполагали, что они дали начало всему разнообразию десмидиевых. Именно такой морфологией характеризуются Netrium и Roya, предваряющие кладу Desmidiales, и род Penium, располагающийся в основании Desmidiaceae. Очевидно, что эволюция на этом отрезке не способствовала появлению разнообразия форм, поскольку члены всех примитивных семейств пор. Desmidiales сохраняют омнирадиальность и звездчатые хлоропласты, что позволяет рассматривать эти признаки как плезиоморфные. Однако предположение о том, что подобная морфология представителей некоторых родов Desmidiaceae также указывает на их примитивность, не находит подтверждения. Уже Phymatodocis, занимающий переходное положение между Desmidiaceae и Peniaceae и предваряющий многие роды десмидиевых близкой к Penium морфологии, имеет 4-радиальные клетки с фуркоидными хлоропластами, что характеризует его как морфологически продвинутый род (Teiling, 1950, 1952).

Филогенетический статус некоторых родов десмидиевых. Использование в нашем исследовании более одного представителя для 20 из 32 проанализированных родов конъюгат позволило оценить монофилию этих таксонов и выявило искусственную природу (поли-филию), по крайней мере, половины из них.

Два рода - Cosmarium и Staurastrum, традиционно занимают особое положение в классе. Они отличаются исключительным фенотипическим разнообразием представителей и насчитывают около 2000 видов (примерно 50% разнообразия Zygnematophyceae). Граница между этими родами размыта за счет большого числа «переходных таксонов», затрудняющих их разграничение с представителями родов Xanthidium, Staurodesmus, Euastrum и некоторых других. Многочисленные попытки выделить морфологически однородные и предположительно естественные таксоны из состава этих родов не получили широкого признания (Croasdale et al., 1994; Prescottetal., 1982).

Топология нашего филогенетического дерева (рис. 2) отвергает монофилию Staurastrum и Cosmarium, однако "немонофилия" этих родов проявляется различно и, вероятно, имеет разную природу. Так, 6 проанализированных штаммов Cosmarium образовали несколько независимых вегвей, в то время как 8 из 9 исследованных видов Staurastrum были объединены в один морфологически гетерогенный кластер. Можно предположить, что в случае рода Cosmarium достоверно отличающиеся скорости накопления мутаций у его представителей препятствовали их объединению в родовую кладу, тогда как только отсутствие статистической значимости у кластера видов Staurastrum не позволяет говорить о его достоверной монофилии. Единственный вид, достоверно не вошедший в этот кластер - S. tumidum, морфологически существенно отличается от остальных представителей рода, а особенности поведения ядра при цитокинезе сближают его с Xanthidium armatum (Hoftberger, Meindl, 1993; Meindl, 1986). В наших анализах Staurastrum tumidum проявляет родство с двумя видами Xanthidium; однако принадлежность X. armatum к этой кладе достоверно не доказана (рис. 2).

Примечательно, что большинство (6 из 9) видов сем. Desmidiaceae, являющихся длинными ветвями (показатель число мутаций) дерева, имеют пристенные хлороп-ласты. Можно предположить, что переход от обычных для десмидиевых осевых к париетальным хлоропластам сопровождается увеличением мутабельности их 18S рДНК. Очевидно и то, что данный тип хлоропластов независимо возник в нескольких родах, а, в целом, в классе признаки морфологии хлоропластов отличаются высокой гомоплазией и только в редких случаях отражают эволюционное родство таксонов.

Вопрос о статусе рода Staurodesmus остался неразрешенным. Два из четырех изученных видов рода были независимы, a S. convergens и S. dickieiформировали устойчивые клады с представителями других родов - Cosmarium contractum и Micrasteriascrux-melitensis соответственно (рис. 2). В обоих случаях различия в морфологии членов этих клад очевидны, и, вероятно, здесь можно говорить о гомоплазии морфологических либо молекулярных признаков.

Роды, объединяющие нитчатые формы десмидиевых: Spondylosium (5 штаммов), Desmidium (2 штамма) и Hyalotheca (2 штамма), - также не были монофилетичны. Нами установлена группировка образующих колонии видов Cosmocladium и нитчатых Spondylosium planum, S.secedensи Teilingia granulata(Teilingia-клада;рис. 2), члены которой напоминают мелкоклеточные формы Cosmarium. Среди многоклеточных форм морфологическое сходство с Cosmarium не ограничивается упомянутыми выше видами, однако у остальных таксонов оно не нашло отражения в их филогенетической близости. Так, нитчатая водоросль Onychonema laeve, отличающаяся наличием двух коротких отростков на верхушках полуклеток, достоверно не входит в состав Teilingia-клйды, а колониальная Heimasiapusilla не проявляет близости к роду Cosmocladium, из состава которого она была выведена недавно (Coesel, 1993). В обоих случаях отсутствие родства можно объяснить принципиально иными механизмами формирования нитей и колоний соответственно (Coesel, 1993; Gerrath, 1970; Kirk et al., 1976; Krupp, Lang, 1976).

В ходе данного исследования были установлены еще три клады нитчатых десми-диевых, перекрывающие границы между родами - De&midium swartzii/Spondylosium pulchrum, Desmidiumgrevillii/Bambusina и Groenbladia/Hyalotheca dissiliens. С одной стороны, высокая устойчивость этих пар (рис. 2) не оставляет сомнения в филогенетической близости образующих их таксонов, а с другой - эта близость труднообъяснима, учитывая существенные различия морфологий их клеток и хлоропластов, а также особенности биологии некоторых видов. Суммируя, можно сказать, что в семействе Desmidiaceae нитчатые формы могли независимо появиться, по крайней мере, четы-

ре раза (группы, упомянутые выше, Spondylosium [Cosmarium] panduriforme и S. pulchellum; prn.2).

6. Концепции родов Staurastrum, Staurodesmus и Cosmarium

Сравнение нуклеотидных последовательностей генов (главы 3,4) не позволило достоверно установить филогенетические взаимоотношения между представителями сем. Desmidiaceae, а в случаях, когда анализировались несколько представителей рода, не удалось установить и их родовые клады (рис. 2). Как уже было отмечено, в отношении некоторых родов этот результат мог быть обусловлен как сборной природой этихтаксонов, так и ограниченной информативностью анализов, использующих кодирующие последовательности генов. Поэтому нами был проведен анализ нескольких более вариабельных и, предположительно, более информативных участков рибосомального оперона (1506 интрона I группы, ITS 1 и ITS2) представительных видов из многовидовых родов десмидиевых с тем, чтобы протестировать гипотезы, следующие из результатов предыдущих анализов.

Первичная и вторичная структуры 1506 интрона I группы. Длина нуклеотидных последовательностей интрона варьировала от 363 нт у Cosmarium depressum до 467 нт у Staurodesmus mucronatus при средней 413±24 нт и содержании GC оснований 55,3+0,05%. Модель вторичной структуры 1506 интрона, созданная нами для представителей сем. Desmidiaceae, была близка предложенной ранее для более примитивных членов пор. Desmidiales - Gonatozygon (Genicularia)spirotaenium (Bhattacharya et al., 1996) и Closterium (Denboh et al., 2003). В целом, в классе Zygematophyceae 1506 интрон характеризуется значительной консервативностью нуклеотидных последовательностей структурных элементов каталитического ядра (элементы Р, Q, R И S; Cech, 1988; Michel, Westhof, 1990). Новые нуклеотидные последовательности интро-нов Desmidiaceae подтвердили предположение о том, что виды семейства утратили короткий Р2* стебель, типичный для всех остальных членов класса Zygnematophyceae (Bhattacharya et al., 1996). В то же время, мы обнаружили, что потеря этого структурного элемента сопровождалась утратой GAAA мотива в шпилечной петле стебля L5B не во всех видах, как это предполагалось ранее (Bhattacharya et al., 1996).

Первичная и вторичная структуры ITS1. Внутренний транскрибируемый спей-сер 1десмидиевыхварьировал от 329 нту Staurodesmusomeariiдо 415 нтуXanthidium armatum при средней длине 370±17,3 нт с типичным для большинства эукариот содержанием GC оснований (50-60%).

Первичные нуклеотидные последовательности ITS1 существенно варьировали у представителей сем. Desmidiaceae, и только 62 нт были инвариантны у 38 исследованных нами таксонов (рис. 8а). При столь высокой дивергенции поиск гомоло-гий для анализа был практически невозможен без учета вторичной структуры транскрипта ITS1, поэтому нами была построена модель для каждого вида. У десмидие-вых ITS1 характеризуется наличием 6 стеблей (названных I.1, I.2 и т.д.), для образования которых около 50% нуклеотидов формируют Ватсон-Криковские пары. Длинные одноцепочечные участки разделяют стебли 1 и 2, а также 5 и 6. Стебель 2 наиболее консервативен по длине (8 пар нуклеотидов) и первичной структуре, а его шпилечная петля имеет инвариантную GGAA последовательность, соответствующую GNRA мотиву, типичному для РНК молекул (Woese et al., 1990). Еще один регион высокой консервативности первичной и вторичной структур ITS1 десмидие-вых располагается в основании стебля 5 (его первые 9 пар нуклеотидов) и охватывает фланкирующие спейсерные участки. Длинные стебли 3 и особенно 4 наиболее вариабельны, однако сохраняют общую для всех видов вторичную структуру с характерными боковыми петлями (рис. 8а).

Рис. 8. Модель вторичной структуры транскрипта ITS1 (а) и ITS2 (b) Staurastrum lunatum, созданная на основе алгоритмов, рассчитывающих термодинамически устойчивые структуры РНК (Mathews et al., 1999). Жирным шрифтом отмечены позиции, инвариантные у 21 вида Staurastrum, образующих родовую кладу (STAUR+SEB). Нуклеотиды, консервативные у 90% из 39 проанализированных последовательностей десмидиевых, выделены серым фоном

Относительная сложность предлагаемой модели и высокий процент нуклеотидов, вовлеченных в формирование стеблевых структур, отличают ее от известных моделей ITS1, разработанных для зеленых водорослей (Coleman et al., 1998), наземных растений (Goertzen et al., 2003) и дрожжей (van Nues et al., 1994). CA насыщенный одноце-почечный участок - единственный элемент ITS1, гомология которого вполне вероятна у широкого спектра организмов, включая и десмидиевые водоросли. Функциональное значение этого региона для эффективного процессинга ITS1 (van Nuess et al., 1994) объясняет его глубокую эволюционную консервативность.

Первичная и вторичная структуры ITS2. Самый короткий ITS2 был обнаружен у Cosmarium depressum (252 нт), имевшего и один из самых коротких ITS1 (344 нт). Взаимосвязь длин спейсеров наблюдалась и у Staurastrum tumidum, имевшем самый длинный ITS2 (352 нт) и второй по длине ITS1 (415 нт). В целом, у исследованных видов ITS2 характеризуется меньшей, чем ITS 1 длиной, ее большим разбросом (307 ± 24 нт) и меньшей консервативностью (только 26 нт были инвариантны в 39 последовательностях) .

Разработанная нами была модель транскрипта ITS2 Desmidiaceae имеет типичную для эукариот архитектуру и состоит из 4 стеблевых структур (II.1-4), расположенных вокруг центральной петли (рис. 8b). Стебель II.3 является самым длинным (имеет дополнительное ответвление у большинства видов), а стебель II.4 - наиболее вари-

абельным по длине. Консервативные мотивы неравномерно распределены между структурными элементами ITS2 и находятся как на стеблях, так и на спейсерных петлях между ними. Стебель II.2 характеризуется наличием специфической пиримиди-новой С-С пары, свойственной многим группам организмов (Coleman, Vacquier, 2002; Goertzen et al., 2003; Joseph et al., 1999; Mai, Coleman, 1997). В стебле II.3 консервативность первичной структуры возрастает по направлению кдистальному концу, где располагается типичный для всех зеленыхрастений UGG мотив (Coleman, 2003; Goertzen et al., 2003). Область наибольшей дивергенции последовательностей включает стебель II.4 и следующий за ней короткий терминальный спейсер.

Несмотря на меньшую чем в ITS 1 консервативность первичной структуры, транскрипт ITS2 десмидиевых (рис. 8b) характеризуется наличием большего числа общих для других хлорофилл b содержащих организмов признаков, что согласуется с общепринятым мнением о большей функциональной роли ITS2 в генезисе рибосом. Так, число стеблей, установленных нами для этого спейсера у представителей сем. Desmidiaceae, типично для большинства эвкариот, а эти домены сохранили некоторые структурные особенности, характерные для большого числа растительных организмов (Coleman, 2003; Hershkovitz, Lewis, 1996; Mai, Coleman, 1997).

Вполне закономерно то, что транскрипты ITS2 у Desmidiaceae (настоящее исследование) и Closteriaceae (Denboh et al., 2003), членов одного порядка Desmidiales, обнаруживают наибольшее сходство вторичной структуры и некоторых элементов первичной структуры. Однако наличие обширных инделей в стеблях существенно меняет длину этих элементов в каждом семействе. Несмотря на эти различия, основания первых двух стеблевых доменов и фланкирующие их спейсерные участки очень близки по первичным последовательностям в двух семействах.

Филогенетический анализ последовательностей 18S рДНК. TrN+I + Г модель эволюции нуклеотидных последовательностей была предложена ModelTest для этого набора данных. В ML анализе большая часть из 39 таксонов была включена в состав 5 установленных клад. Три маловидовые клады (STD 1, STD 2 и ARTHR) имели высокую статистическую значимость (>95% во всех методах анализа), а у двух клад (STAUR и St. tumidum/Xanthidium armatum) она была низкой или умеренной (5075%). Клада STAUR - самая крупная и объединяет 20 из 24 изученных нами представителей рода Staurastrum. S. sebaldi - ее сестринский таксон, однако это родство не поддержано статистически. Три вида Staurastrum достоверно не были включены в родовую кладу. S. brachiatum имел дивергентную 18S рДНК. последовательность и являлся независимой ветвью дерева, тогда как S. tumidum позиционирован в качестве сестры Xanthidium armatum (50-65% ВР, 0.95 РР), a S. orbiculareвместе с представителями рода Staurodesmus вошел в кладу STD 2 (99-100% ВР, 1.00 РР).

Виды Staurodesmus были сгруппированы в три устойчивые клады: STD1, STD2 И ARTHR - каждая из которых характеризовалась длинной ветвью. Эти клады не проявляли филогенетической близости. Еще дватаксона этого же рода: Std. mamillatusи Std. bulnheimii- образовывали отдельные ветви. Две клады: STD2 и ARTHR - включали представителей других родов, Stauarstrum и Cosmarium соответственно. В STD 2 базовое по отношению кдругим видам положение Std. mucronatusтвердоустановлено (94-97% ВР, 1.00 РР), в то время как в кладе ARTHR порядок ветвления таксонов имеет невысокую достоверность.

Анализ некодирующих участков рибосомального оперона. Различия в эволюционной динамике последовательностей 1506 интрона I группы, ITS 1 и ITS2 обусловили выбор разных эволюционных моделей и их параметров для каждого из этих наборов данных. Поскольку некодирующие участки рДНК характеризовались большей, чем 18S рДНК вариабельностью, пропорция инвариантных позиций (I) не учитывалась в отобранных моделях. Относительно невысокие величины гамма параметра (Г), определенные для интрона и спейсеров (от 0.3886 до 0.6174), отражают неравномер-

ность распределения нуклеотидных замен в этих наборах данных. Предложенные модели существенно отличаются матрицами частот нуклеотидных замен разного типа. Повышенные частоты субституций С>>Т и C>>G были свойственны для всех трех наборов данных, однако в каждом из них они имели специфические черты.

Индивидуальные филогении некодирующих участков рДНК сходным образом отражали взаимоотношения между анализируемыми таксонами и были близки к топологии, полученной с 18S рРНК геном. Анализ ITS2 придавал наименьшую статистическую значимость родовой кладе Staurastrum (<50% ВР и <0,90 РР), тогда как клады STD 1, STD 2 и особенно ARTHR имели умеренную до высокой значимость (>70%ВР). В филогении, основанной на сравнении последовательностей интрона, STAUR также не имела поддержки. Этот набор данных вновь придавал высокую значимость трем независимым кладам, образованным представителями рода Staurodesmus. Хотя длина матрицы данных ITS 1 была примерно равна таковой интрона, она имела существенно большее число информативных позиций (168 против 128), что обеспечило высокую статистическую значимость ее дереву. Именно это набор данных придавал высокую достоверность родовой кладе Staurastrum и относил к ней St. sebaldii (STAUR+SEB; >95% ВР), ранее ассоциированный с кладой STAURтолько топологически. Большинство внутренних ветвей клады STAUR+SEB в ITS1 анализе имели умеренную до высокой ВР и РР поддержку. Во всех этих анализах клады STD 1, STD 2 и ARTHR (77-100% ВР), а также индивидуальные ветви видов Staurodesmus, не проявляли близости друг к другу.

Комбинированный анализ кодирующих и некодирующих последовательностей рДНК. Для ML анализа объединенной матрицы данных (2633 нт) была выбрана TrN + I + Г эволюционная модель. Параметры модели усредняли таковые для кодирующего (18S рДНК) и некодирующих (1:506 интрон I группы, ITS1 и ITS2) участков рДНК в отношении частот замены С>>Т и A>>G. Топология дерева была близка к основанной на последовательностях 18S рДНК и устанавливала те же группировки таксонов, что и раньше, со сравнимой или более высокой статистической значимостью (рис. 9). Кластер видов Staurastrum (STAUR+SEB-клада) был очень хорошо отграничен во всех методах анализа (95-100% ВР, 1.00 РР), и большинство его внутренних ветвей были статистически достоверны. Три вида этого же рода: St. tumidum, St. orbiculare и St. brachiatum - по-прежнему достоверно не входили в ее состав. Род Cosmarium не перестал быть парафилетичным, адва его морфологически сходных вида: С. depressum и С. contractum - не проявляли филогенетической близости.

В составе STAUR+SEB клады наблюдались две статистически хорошо поддержанные группы видов (ST 1 и ST 2). Морфологически гетерогенная субклада ST 1 объединяла 11 штаммов (10 видов) представляющих 5 секций рода (West, West, 1912). St. brachycerum, St. ophiura и St. margaritaceum располагались в ее основании (63-100% ВР, 1.00 РР), а еще 8 последовательностей, отличавшиеся высоким сходством, формировали ее вершинный комплекс (рис. 9). Следует отметить, что эти виды хорошо отличаются друг от друга морфологически, однако эти отличия не нашли отражение в генетических дистанциях между таксонами. Субклада St 2 (9 видов) была лучше структурирована, и практически все ее внутренние ветви имели высокую статистическую поддержку. Одна из этих групп слагалась 4 из 5 проанализированных представителей секции Е (West, West, 1912), и поэтому мы использовали это неформальное имя для ее обозначения (рис. 9).

Помимо высокой статистической достоверности клад ST 1 и ST 2, их индивидуальность подчеркивалась и различиями в длине некодирующих участков рДНК, атакже в процентном содержании GC в них. Так, для членов клады ST 1 характерен более низкий процент GC оснований, последовательности их 1506 интронов и ITS2 короче

Рис. 9. Бескорневое дерево, отражающее филогенетические взаимоотношения между представителями родов Staurastrum, Staurodesm us и Cosmarium, основанное на сравнении нуклео-тидных последовательностей кодирующих (18S рДНК) и некодирующих (1506 интрон I группы, ITS1 и ITS2) участков рибосомального оперона 39 штаммов (38 видов). Для ветвей указаны проценты бутстрепа (>50%) и бейесовы апостериорные вероятности (>0.9): ML/NJ (TrN+I+F)/MP/BL Для видов, формируюшихродовую кладу Staurastrum (STAUR+SEB),жирным шрифтом указана секционная принадлежность согласно West, West (1912).

(400+2,32 нт и 311±2,68 нт соответственно), a ITS1 длиннее (374±1,9 йт) чем в кладе ST2, где интрон, ITS1 и ITS2 - 428±9,6, 368±0,6 И 328+2,3 нт, соответственно.

Филогенетическая структура рода Staurastrum. Несмотря на предполагаемую искусственность рода Staurastrum (Паламарь-Мордвинцева, 1976, 1982; Prescott et al., 1982; West, West, 1912), наша молекулярная филогения достоверно установила его монофилетическое ядро (клада STAUR; рис. 9). Уже первый анализ нескольких представителей рода показал, что полифилия Staurastrum (Brook, 1981; Gerrath, 1993; West, West, 1912) не столь очевидна, как это ожидалось (Gontcharov et al., 2003). В результате расширения состава изучаемых видов и числа сравниваемых признаков (несколько молекулярных маркеров) нами была установлена устойчивая родовая клада Staurastrum, которая включает 20 из 23 проанализированных видов. Морфология членов клады очень разнообразна, и, помимо видов Staurastrum s. str. она включает виды, рассматривавшиеся в составе родов Cylindriastrum, Cosmoastrumи Raphidiastrum, выделяемых из Staurastrum (Паламарь-Мордвинцева, 1976, 1982). Наш анализ опровергает самостоятельность этих родов и возвращает Staurastrum его исходную концепцию (Ralfs, 1848; Teiling, 1948; West, West, 1912). Небольшое число видов, не вошедших в родовую кладу, позволяет предположить, что не более 10-15% из 700 ви-

дов Staurastrum (Gerrath, 1993) может не принадлежать к этому роду. Маловероятным выглядит и то, что он может быть пополнен за счет представителей других родов десмидиевых, поскольку они не проявляли близости к Staurastrum.

Традиционно полирадиальность (наличие более 2-х вертикальных плоскостей симметрии) и/или наличие отростков считались ОСНОВНЫМИ признаками, отличающими род Staurastrum. Однако очень быстро морфологическое разнообразие новых видов, относимых к роду, размыло его границы. Было описано большое число 3- и более радиальных таксонов, не имеющих отростки, и наоборот, бирадиальных форм с отростками. Поскольку полирадиальность характерна для многих родов (Brook, 1981), а отростки на углах полуклеток имеются у некоторых нитчатых форм десмидиевых, то признаки, использовавшиеся для дифференциации Staurastrum, являются гомопластичными на уровне рода и не позволяют безошибочно отличать его членов. Именно отсутствие четких и стабильных диагностических характеристик у представителей рода послужило причиной того, что он считался искусственным на протяжении всей своей истории. Однако, как показали молекулярно-фи-логенетические исследования, отсутствие общих морфологических признаков не является подтверждением сборной природы Staurastrum. Напротив, разнообразие форм клеток, их размеров и типов орнаментации клеточной стенки у изученных нами видов не находит отражения в генетических дистанциях между ними. Большинство внутренних ветвей клады Staurastrum короткие и отражают невысокую дивергенцию последовательностей. Подобная особенность топологии, вероятно, указывает на недавнюю радиацию видов в роде.

Особенности внутренней структуры родовой клады: базовое положение имеющих отростки форм (члены секции I (West, West 1912) или Staurastrum s. str. (Пала-марь-Мордвинцева, 1976, 1982) и вершинное видов, не имеющих их (секция Е; West, West (1912), роды Cylindriastrum, Cosmoastrum и Raphidiastrum (Паламарь-Мордвин-. цева, 1976, 1982)) - указывают на то, что наличие отростков является предковым (плезиоморфным) признаком в роде. Вероятно, что в ходе эволюции способность продуцировать отростки была утрачена некоторыми таксонами. Наши построения отвергают точку зрения Fritsch (1953), считавшего космароидные (без отростков) виды наиболее примитивными в роде Staurastrum. He находят подтверждения и предложения о выделении из Staurastrum родов или подродов, основанных на признаке наличия/отсутствия отростков (Паламарь-Мордвинцева, 1976, 1982;Hirano, 1959).

Вопрос о том, какие признаки являются общими для видов, слагающих кладу/ род Staurastrum, и что отличает их от остальных таксонов сем. Desmidiaceae, остается открытым. Морфологическое разнообразие в роде трудно поддается даже качественному описанию, а найти какие-либо признаки, общие для всех видов, не представляется возможным. Следует отметить, что у всех видов Staurastrum s. str. клеточная стенка орнаментирована, тогда как у S. orbiculare и S. brachiatum подобные образования отсутствуют, a S. tumidum имеет только бородавковидное утолщение на каждом углу полуклетки. Поэтому можно предположить, что и другие неорнамен-тированные виды Staurastrum могут не принадлежать этому роду. Даже если данное предположение и будет подтверждено дальнейшими исследованиями, данный признак (орнаментированность клеточной стенки) сам по себе не может быть использован для разграничения рода, так как представители большинства родов десмиди-евых также характеризуются наличием орнаментации клеточной оболочки, а вопрос о гомологии или гомоплазии этого признака в сем. Desmidiaceae пока остается без ответа.

Полифилия родов Staurodesmusи Cosmarium. Согласно результатам нашего исследования, оба рода: Staurodesmus и Cosmarium - не являются монофилетичными, что подтверждает данные раннего анализа гена 18S рРНК (Gontcharov et al., 2003).

Однако если ранее родственные связи видов Staurodesmus определить не удалось, то теперь установлены 3 устойчивые клады представителей рода: STD 1, STD 2 и ARTHR. Эти клады и независимые ветви (S. mamillatus и S. bulnheimii) не обнаруживают родства друг с другом, a STD 2 и ARTHR, кроме этого, включают представителей других родов десмидиевых. Таким образом, представленный анализ характеризует род Staurodesmus как высокополифилетичный. В настоящее время трудно аргументировано объяснить столь существенную дивергенцию между кладами и отдельными таксонами Staurodesmus, однако сам факт ее наличия очевиден.

Общим признаком видов рода Staurodesmus (ранее членов Arthrodesmus и Staurastrum) является наличие одиночных шипов на углах полуклетки (Telling, 1948, 1967). Однако некоторые таксоны, в наших анализах проявляющие родство с его представителями: Staurastrum orbiculareи Cosmarium contractum (рис. 9) - не имеют их. Устойчивое (100% ВР, 1.00 РР) вершинное положение S. orbiculare в кладе STD 2 указывает на то, что шипы могут утрачиваться в процессе эволюции, и такое состояние признака можно рассматривать как аутапоморфное. Однако статус этого признака в кладе ARTHR остался не выясненным, так как положение в ней Cosmarium contractum менее устойчиво. В зависимости от метода анализа и молекулярного маркера этот вид является либо базовым в кладе, что не отрицает изначальное отсутствие шипов у этого вида, либо занимает положение внутри клады (рис. 9), что предполагает их утрату. Таким образом, установленное нами родство видов Staurodesmus, имеющих шипы, с таксонами лишенными их ставит под сомнение правомерность использования этого признака в качестве диагностического для рода.

Результаты наших анализов ставят под сомнение и мнение о родстве видов Staurodesmus, отличающихся степенью радиальности (Teiling, 1948, 1967). Как показали наши исследования, 3 из 4 проанализированных видов Staurodesmus, имеющие бирадиальные клетки, являются членами устойчивой (90-98 % ВР, 1.00 РР) клады ARTHR. Однако однозначно говорить о восстановлении статуса рода Arthrodesmus нельзя, так как по крайней мере еще один строго бирадиальный вид Std. bulnheimii не являлся членом этой клады. В какой-то мере это подтверждает утверждение о том, что степень радиальности является гомопластическим признаком, состояние которого может зависеть и от условий среды (Teiling, 1948, 1952, 1967).

Анализируя представителей Cosmarium, мы попытались оценить родство двух видов - С. contractum и С. depressum. Хотя эти виды и близки морфологически [характеризуются эллиптическими полуклетками, гладкой клеточной стенкой и относятся к одной секции (Prescott et al., 1981)], они не проявляли близости друг к другу, а также к остальным проанализированным нами видам Cosmarium. Этот результат указывает на то, что относительно простая морфология многих видов рода может маскировать большие генетические дистанции между ними.

Утилитарность декодирующих участков рДНК оперона для целей филогении в сем. Desmidiaceae. Использование кодирующих и некодирующих последовательностей рДНК для анализа филогенетических связей в сем. Desmidiaceae показало сходство индивидуальных топологий 18S рДНК, 1506 интрона I группы, ITS1 и ITS2, указывающее на их общую эволюционную историю. Все три некодирующих элемента характеризуются большим, чем 18S рДНК числом информативных позиций, однако в случае интрона и особенно ITS2 это не приводит к большей информативности их топологий, а скорее снижает ее. Напротив, матрица данных ITS 1 отличается большой информативностью, особенно в отношении рода Staurastrum. Объединение же в едином анализе четырех участков рДНК позволило добиться большей статистической достоверности топологии и частично нейтрализовать эффект насыщения

мутациями в интроне и ITS2. В случае немонофилетичных родов Staurodesmus и Cosmarium топологии, основанные на анализе спейсеров и интрона, были полностью конгруэнтны результатам анализа консервативного гена 18S рРНК и лишь еще больше подчеркивали различия между отдельными кладами. Основываясь на полученных результатах, мы можем предположить, что клады STD 1, STD 2 и ARTHR, а также отдельные ветви Cosmarium являются неродственными друг другу и могут представлять критические роды десмидиевых, несомненно заслуживающие дальнейшего изучения. Существенная дивергенция нуклеотидных последовательностей между этими кладами и отсутствие достоверных различий в темпах эволюции между ними предполагают давнее происхождение и длительную филогенетическую историю.

Невысокая информативность наших анализов на уровне выше рода может указывать на высокий уровень гомоплазии в рибосомальном цистроне или же являться отражением дальнего родства клад. Второй вывод представляется нам ближе к действительности, поскольку он полностью согласуется с результатами анализов всего сем. Desmidiaceae (Gontcharov et al., 2003; McCourt et al., 2000), основанных на сравнении консервативных кодирующих последовательностей генов, также не установивших родство Straurastrum, Staurodesmus и Cosmarium.

Заключение

Анализ филогенетических взаимоотношений представителей класса Zygnematophyceae с использованием молекулярных методов в целом подтвердил традиционные взгляды на эволюцию конъюгат, базирующиеся на фенотипических признаках. Изучение двух генов из разных геномов и нескольких некодирующих участков ДНК позволило реконструировать эволюцию конъюгат на разных таксономических уровнях и придало большую достоверность предлагаемым филогенетическим построениям. Многие этапы этого процесса остаются невыясненными, а синапомор-фные признаки, характеризующие те или иные группы, е ще предстоит уточнить. Несомненно, утрата жгутикового аппарата и возникновение конъюгации, являются основными событиями, выделяющими конъюгат из царства зеленых растений. Дивергентное положение рода Spirotaenia на филогенетической дереве отдела Streptophyta (рис. 1, 3) ставит под сомнение уникальность этого события и предполагает, что конъюгация могла возникнуть, по крайней мере, дважды в отделе — у предка Spirotaenia и у организма, давшей начало классу Zygnematophyceae. Однако мы считаем это допущение маловероятным и рассматриваем роц Spirotaenia как группу, рано выделившуюся в составе класса (рис. 10).

Усложнение строения клеточной стенки привело к обособлению пор. Desmidiales. В порядке выделяются несколько хорошо очерченных эволюционных линий (семейств), наиболее продвинутой из которых является Desmidiaceae. Проведенные анализы установил последовательность возникновения признаков, характеризующих это семейство.

После ее обособления произошло встраивание интрона I группы в 18S рДНК конъюгат на позицию, гомологичную позиции 1506 16S рДНК Е. coli. В дальнейшем происходило последовательное обособление как отдельных видов (Mesotaenium endlicherianum, Netrium spp.), так и родов (Spirogyra) и надродовых групп ("Zygnemataceae s. str."), характеризующихся определенными аутапоморфными признаками. Природа этих апоморфий весьма разнообразна, они относятся к морфологии хлоропластов (Mesotaenium endlicherianum, Spirogyra), особенностям тонкого строения клеточной стенки и поведения ядра в процессе цитокинеза (Netrium

Рис 10 Эволюция некоторых фенотииических и генетических признаков в классе 2>^пеша1орЬусеае |-аутапоморфные признаки, ?- признаки неизвестны Пунктиром отмечена общая ветвь Spirotaenia и Chlorokybus, предположительно, обусловленная гомоплазией нук-леотидных последовательностей

врр) или уникальным заменам нуклеотидов ("Zygnemataceae и их значи-

мость в общем контексте эволюции группы еще предстоит оценить. Общим для всех базовых ветвей класса является просто устроенная клеточная стенка, и это признак был использован в качестве диагностического для выделения пор. Zygnematales, естественность которого мы оспариваем.

Выводы

1. На основе молекулярно-филогенетических анализов нуклеотидных последовательностей ядерного (188 рРНК) и хлоропластного (rbcL) генов изучены эволюционные взаимоотношения между представителями класса Zygnematophyceae ^П^орИу^) и установлена его филогенетическая структура

2. Показано, что класс Zygnematophyceae является монофилетическим таксоном, четко отграниченным от остальных представителей отдела фенотипическими (половое размножение в форме конъюгации, утрата жгутиковых стадий) и молекулярными (компенсаторная замена нуклеотидов в стебле 33 транскрипта 188 рРНК) синапоморфиями.

3. На основе анализа симплезиоморфных морфологических признаков, характеризующих базовые ветви филогенетического дерева класса, показано, что пред-ковой формой конъюгат могла быть одноклеточная стрептофитная водоросль, имевшая клетки эллиптической формы и пристенные хлоропласты. В ходе эволюции конъюгат несколько раз появлялись многоклеточные организмы с нитчатыми талломами, а осевые хлоропласты стали преобладающим типом.

4. Установлена ранняя (> 300-400 млн лет) дивергенция рода Spirotaenia с основным стволом конъюгат, произошедшая, предположительно, до встраивания инт-рона I группы, характеризующего других представителей Zygnematohyceae, в их 18S рРНК на позицию, гомологичную позиции 1506 16S рРНК Е. coli Предположительно, представители рода сохранили плезиоморфные признаки процесса конъюгации и химического состава клеточной стенки, свойственные предковым формам класса. Высказано предположение, что род Spirotaenia заслуживает выделения в подкласс.

5. Молекулярные данные характеризуют высшие таксоны конъюгат, выделенные на основе апоморфных морфологических и ультраструктурных признаков, как монофилетические - пор. Desmidiales, сем. Desmidiaceae, Gonatozygaceae и Closteriaceae. В случаях, когда в качестве диагностических использовались плезио-морфные (пор. Zygnematales) или гомопластические (сем. Zygnemataceae, Mesotaeniaceae и Peniaceae) признаки, монофилия этих таксонов отвергается.

6. Установлено обособленное положение рода Phymatodocis на филогенетическом древе коньюгат, отвергающее его принадлежность к сем. Desmidiaceae. Молекулярные и ультраструктурные (сочетание признаков тонкого строения клеточной стенки у типового вида рода) данные указывают на необходимость выделения его в новое семейство в составе порядка Desmidiales.

7. Эволюционнаядинамика ядерного (18S рРНК) и хлоропластного^^) генов отличается у представителей класса Zygnematophyceae, однако эти маркеры сходным образом отражают филогенетические отношения в классе и успешно дополняют друг друга в совместном анализе, повышая его информативность.

8. Показано, что большинство фенотипических признаков, использовавшихся для выделения родов конъюгат, отличаются высокой гомоплазией и не отражают общность происхождения видов, что находит отражение в достоверно установленной по-лифилии родов Mesotaenium, Cylindrocystis, Cosmarium, Staurodesmus и многихдругих, и отмечена необходимость их ревизии.

9. Установлено монофилетическое ядро рода Staurastrum, длительное время считавшегося искусственным. Высказано предположение, что полирадиальность и наличие отростков на углах полуклетки являются предковыми признакам для его представителей, однако они не могут использоваться в качестве диагностических т.к. многократно утрачивались в ходе эволюции.

Список публикаций по теме диссертации

Глава коллективной монографии

1. Гончаров А. А., Догадина Т. В., Кухаренко Л. А. Водоросли // Флора, мико-бита и растительность Лазовского заповедника/Л. Н. Егорова. — Владивосток: Русский остров. 2002. С. 31-48.

Статьи, опубликованные в ведущих научных журналах

2. Гончаров А А. Альгофлора Приморского водохранилища-охладителя (Приморский край) // Ботан. журн. 1996.Т. 81. С. 32-40.

3. Гончаров А. А. Дополнение к флоре десмидиевых (Desmidiales, Chlorophyta) Приморского края // Ботан. журн. 1999. Т. 84. С. 118-123.

4. Гончаров А. А., Гончарова, С. Б. IV Международный симпозиум «Биология и таксономия зеленых водорослей» (Смоленице, Словакия, 24-28 июня 2002) // Ботан. журн. 2003. Т. 88. С. 166-168.

5. Гончаров А. А., Осипов С. В. Дополнение к флоре десмидиевых (Desmidiaceae, Chlorophyta) Камчатки // Ботан. журн. 1999. Т. 84. С. 61-66.

Статьи, опубликованные в международных и зарубежных журналах

6. Гончаров А. А. Новые для Приморского края виды Chlorophyta // Альгология. 1994. Т. 5. С. 300-303.

7. Gontcharov A. A. The algal flora ofthe Primorsky Territory, Russian Far East // Hydrobiologia. 1996. Vol. 336. P. 93-97.

8. Gontcharov A. A. Contribution to the desmid flora of the Primorsky Territory, Russia//Bull. Natn. Sci. Mus., Tokyo, Ser. B. 1997. Vol. 23. P. 59-80.

9. Gontcharov A. A. Desmids of lakes Chuhunenko and Zaria (Lazovsky Nature Reserve, Russia) //Algological Studies. 1998. Vol. 90. P. 9-43.

10. Gontcharov A. A. Taxa ofChlorophyta new for the Primorsky Region (Russian Far East) // Intn. J. Algae 1999. Vol. X. P. 104-107.

11. Gontcharov A. A., Findlay D. L., Kling H. J., Watanabe M. M. Desmids (Desmidiales, Streptophyta) from the Experimental Lakes Area, Ontario, Canada. The genera Actinotaenium and Cosmarium//Algological Studies. 2002. Vol. 105. P. 51-78.

12. Gontcharov A. A., Kasai F., Watanabe M. M. Morphology and taxonomy oftwo planktic species of Staurastrum (Desmidiaceae, Chlorophyta) in Lake Biwa, Japan // Algological Studies. 1999. Vol. 93. P. 79-90.

13. Gontcharov A. A., Marin В., Melkonian M. Are combined analyses better than single gene phylogenies? A case study using SSU rDNA and rbcL sequence comparisons in the Zygnematophyceae (Streptophyta) // Mol. Biol. Evol. 2004. Vol. 21. P. 612-624.

14. Gontcharov A. A., Marin В., Melkonian M. Molecular phylogeny of conjugating green algae (Zygnemophyceae, Streptophyta) inferred from SSU rDNA sequence comparisons//J. Mol. Evol. 2003. Vol. 56. P. 89-104.

15. Gontcharov A. A., Melkonian M. Unusual position of the genus Spirotaenia (Zygnematophyceae) among streptophytes revealed by SSU rDNA and rbcL sequence comparisons// Phycologia. 2004. Vol. 43. P. 105-113

16. Gontcharov A. A., Niiyama Y., Watanabe M. Chlorococcales and Desmideaceae (Chlorophyta) in the Imperial Palace, Tokyo// Mem. Natn. Sci. Mus., Tokyo. 2000. Vol. 34. P. 93-107.

17. Gontcharov A. A., Watanabe M. 1999. Brachytheca sulcata gen. et sp. nov. (Desmidiaceae, Chlorophyta), a new alga from the highlands of Papua New Guinea. Phycologia. 38:354-348.

18. Gontcharov A. A., Watanabe M. M. Rare and new desmids (Desmidiaceae, Chlorophyta) from Japan // Phycological Studies. 1999. Vol. 47. P. 233-240.

19. Gontcharov A. A., Watanabe M., Watanabe M. M. Contribution to the desmid flora ofPapuaNew Guinea // Bull. Natn. Sci. Mus., Tokyo, Ser. B. 1999. Vol. 25. P. 7-42.

20. Gontcharov A. A., Watanabe M., Watanabe M. M. Contribution to the desmid flora ofPapua New Guinea II // Bull. Natn. Sci. Mus., Tokyo, Ser. B. 2001. Vol. 27. P. 7-42.

Работы, опубликованные в материалах международных и зарубежных конференций

21. Gontcharov A. A. The algal flora ofthe Primorsky Territory, Russian Far East // Abstr. V Int. Phycol. Congr., Quindao, China, June 26-July 2, 1994. P. 11.

22. Gontcharov A. A. Polymorphism in populations of Staurastrum saltans Josh, and its taxonomic implication//Abstr. Annual Meeting ofJap. Phycol. Soc, Shimoda, Japan, March 25-27, 1998. P. 96.

23. Gontcharov A. A., Kasai E, Watanabe M. M. On the taxonomy ofsome planktic Staurastrum in Lake Biwa//Abstr.Annual Meeting ofJap. Phycol. Soc, Yamagata, March 19-21, 1999. P. 23.

24. Gontcharov A. A., Kasai E, Watanabe M. M. Morphology and taxonomy ofsome planktic Staurastrum // Abstr. 12th Int. Assoc. Phytoplankton Taxonomy and Ecology Workshop, Winnipeg, Canada, September 13-23, 1999. P. 22-23.

25. Gontcharov A. A., Marin В., Melkonian M. Phylogeny ofthe Zygnemophyceae (Streptophyta) inferred from SSU rDNA sequence comparison //Abstr. VII Int. Phycol. Congr., Thessaloniki, Greece, August 18-25, 2001. P. 62.

26. Gontcharov A. A., Marin В., Melkonian M. Molecular phylogeny of the conjugating green algae (Zygnematophyceae, Streptophyta) // Abstr. IV International Symposium "Biology and taxonomy ofgreen algae", Smolenitce, Slovakia, June 24-28, 2002. P. 34.

27. Gontcharov A. A., Marin В., Melkonian M Sequence and secondary structure comparisons of ITS-I rDNA in some desmid genera (Desmidiaceae, Zygnemophyceae) // Abstr. IV International Symposium "Biology and taxonomy ofgreen algae" Smolenitce, Slovakia, June 24-28, 2002. P. 35.

Подписано в печать 22.03.2005 г. Формат 60x90/16. Уч.-изд. л. 2. Тираж 100. Заказ 35. Отпечатано в типографии ЧП Ермаков, Владивосток, ул. Адм. Кузнецова, 76.

* V

/ í' t i

t i rm *>*» é i ^ * f . I > t Л *

* i V* • /

\ « " • y

2 2 АПР 2005 *

üúl

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Гончаров, Андрей Анатольевич

Введение.

Глава 1. Положение конъюгирующих водорослей в системе растительных организмов и их филогенетические связи.

1.1. Принципы классификации и возможные пути эволюции Zygnemato-phyceae.

1.2. Таксономический состав класса.

Глава 2. Объекты и методы исследования.

2.1. Источники культур водорослей.

2.2. Выделение, амплифицирование и секвенирование ДНК.

2.3. Выравнивание последовательностей и построение филогенетических деревьев.

2.4. Совместный анализ генов.

2.5. Создание и проверка альтернативных топологий.

2.6. Поиск молекулярных синапоморфий.

Глава 3. Результаты филогенетических анализов нуклеотидных последовательностей.

3.1. Наличие 1506 интрона I группы в кодирующем регионе 18S рДНК конъюгат.

3.2. Анализ 18S рДНК 103 таксонов Streptophyta и Chlorophyta.

3.3. Анализ 18S рДНК 41 вида Streptophyta.

3.4. Анализ филогенетических взаимоотношений в сем. Desmidiaceae.

3.5. Положение рода Spirotaenia среди стрептофитных водорослей.

3.5.1. Сравнение кодирующих регионов 18S рДНК Streptophyta.

3.5.2. Анализ последовательностей rbcL.

Глава 4. Сравнение результатов индивидуальных и комбинированных анализов последовательностей 18S рДНК и rbcL в классе Zygnematophyceae.

4.1. Выбор анализированных видов.

4.2. 18S рДНК филогения.

4.3. RbcL филогения.

4.4. Особенности индивидуальных наборов данных и их анализов.

4.4. Комбинированный анализ генов (18S рДНК+rtaL).

4.5. Комбинированный анализ и проблема длинных ветвей.

4.6. Тестирование альтернативных топологий.

4.7. Бейесова филогения.

4.8. Анализ молекулярных синапоморфий.

4.8.1. Синапоморфные признаки в 18S рРНК представителей Zygnematophyceae.

4.8.2. Синапоморфии в гене rbcL.

Глава 5. Филогенетическая структура класса Zygnematophyceae.100 ;

5.1. Монофилии класса в связи с положением рода Spirotaenia. щ. 5.2.Порядок Zygnematales.

5.2:1. Роды Netrium и Roya.

5;3. Порядок Desmidiales.

5.3; 1 . Семейство Gonatozygaceae.

5.3.2. Семейство Glosteriaceae.

5.3.3. Семейство Peniaceae.

5.3.4. Семейство Desmidiaceae.

5.3.5. Филогенетический статус некоторых родов десмидиевых.

Глава 6. Концепции родов Staurastrum, Staurodesmus и Cosmarium.

6.1. Выбор анализированных видов.

6.2. Первичная и вторичная структуры 1506 интрона I группы.

6.3. Первичная и вторичная структуры ITS 1.

6.4. Первичная и вторичная структуры ITS2.

6.5. Филогенетический анализ последовательностей 18S рДНК.

6.6. Анализ некодирующих участков рибосомального оперона.

6.7. Комбинированный анализ кодирующих и некодирующих последовательностей рДНК.

6.8. Филогенетическая структура рода Staurastrum.

6.9. Полифилия родов Staurodesmus и Cosmarium.

6.10. Утилитарность некодирующих участков оперона рДНК для целей филогении в сем. Desmidiaceae.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Филогенетические связи представителей класса Zygnematophyceae (Streptophyta)"

Зеленые конъюгирующие водоросли являются неотъемлемым компонентом всех пресноводных экосистем и играют существенную роль в трофических цепях водоемов. Эта группа растительных организмов, объединяющая кокко-идные, нитчатые и колониальные водоросли, характеризуется особым типом полового размножения - конъюгацией, при котором происходит слияние не имеющих жгутиков гамет. Отсутствие не только жгутиковых стадий, но и любых следов жгутикового аппарата на протяжении всего жизненного цикла - еще одна отличительная черта представителей группы. Эти признаки не имеют аналогов среди других автотрофных организмов, что обусловливает обособленное положение конъюгат среди растений.

До сих пор не существует удовлетворительного объяснения того, почему и каким образом произошла утрата жгутикового аппарата и возникла конъюгация как способ полового размножения. При этом обсуждаются две гипотезы - происхождение конъюгат в результате редукции подвижных стадий (Голлербах, Полянский, 1951; Скабичевский, 1960; Fott, 1959; Fritsch, 1944; Nakahara, Ichi-mura, 1992; Pascher, 1914) или от организмов, никогда их не имевших (Топа-чевський, 1952; 1954).

Несмотря на уникальность фенотипических признаков, принадлежность конъюгат к зеленым водорослям никогда серьезно не оспаривалась, и большинство исследователей рассматривали эту группу в ранге порядка или класса в составе Chlorophyta (Brook, 2002; Krieger, 1933-1939; Prescott et al., 1972; Ruzicka, 1977; West, 1916). По мере развития биохимических и ультраструктурных исследований стали появляться новые данные, еще более отличающие конъюгат от остальных зеленых водорослей и указывающие на их близость с морфологически сложно устроенными харовыми водорослями и наземными растениями (deJesus et al. 1989; Frederick et al. 1973; Graham et al. 1991; Mishler, Churchill 1985). На определенном этапе харовые, конъюгаты, а также некоторые другие группы зеленых водорослей были выделены из состава Chlorophyta и объединены в класс Charophyceae (Mattox, Stewart, 1984), включенного в отдел Strep-tophyta, куда были отнесены и наземные растения (Kendrik, Crane, 1997). В настоящее время конъюгаты рассматриваются в ранге самостоятельного класса Zygnematophyceae в составе отдела Streptophyta (Bremer, 1985; Bremer et al., 1987; van Hoeketal., 1995).

Класс Zygnematophyceae характеризуется исключительным видовым разнообразием, и это позволяет предположить, что утрата жгутикового аппарата способствовала процессу видообразования в нем. Следует отметить, что сведения о числе видов конъюгат различаются на порядок. Одни авторы (Hoshaw et al., 1990) сообщают о 10000-15000 видах, в то время как другие (Cranwell et al., 1990) приводят 1500 видов. Такой разброс данных относится только к одному из двух порядков класса-Desmidiales, в то время как объем Zygnematales споров не вызывает. Наиболее реалистичной на наш взгляд выглядит оценка Gerrath (1993) и Hoshaw, McCourt (1988), указывавших около 4000 валидно описанных видов зигнематофициевых водорослей.

Существует несколько классификационных схем Zygnematophyceae, которые выделяют в составе класса от двух до четырех порядков. В настоящее время общепринятой считается классификация Mix (1972), основанная на признаках ультраструктуры клеточной стенки и признающая в составе конъюгат два порядка: Zygnematales с двумя семействами, и Desmidiales - с четырьмя. Данная система носит явно выраженный эволюционный характер как на уровне порядков, так и на уровне семейств, однако не все ее положения можно считать бесспорными.

Все семейства, а также большая часть более чем 50 родов конъюгат были описаны более 100 лет назад, и с тех пор их концепция практически не претерпела изменений. В то же время, едва ли не с момента описания многие роды считались искусственными, и предпринимались многочисленные попытки преодолеть эту искусственность путем разделения их на более мелкие, морфологически однородные группы таксонов. Наиболее проблемными в этом отношении считаются роды Cosmarium и Stcmrastriim, на долю которых приходится около 50% видового разнообразия класса. Исключительная вариабельность небольшого числа морфологических признаков в пределах каждого рода зачастую не позволяет провести четкую границу между ними и препятствует созданию более или менее естественной таксономической системы конъюгат. Эти же причины затрудняют эволюционный анализ признаков в группе.

Появление новых методов филогенетических исследований, существенно расширяющих число признаков, доступных для сравнительного анализа, позволяет с новых позиций подойти к решению давних эволюционных проблем и зачастую успешно с ними справляться. Одним из таких подходов, интенсивно развивающихся в последнее десятилетие, является метод молекулярно-филогенети-ческих исследований, основанный на сравнении нуклеотидных и аминокислотных последовательностей различных участков генома организмов. Новые массивы данных позволяют, с одной стороны, провести тестирование существующих эволюционных гипотез, а с другой, соотнести темпы и направления эволюции различных признаков в отдельно взятой группе организмов. Учитывая, что более чем 150-летняя история изучения зеленых конъюгирую-щих водорослей оставила много неразрешенных таксономических и эволюционных проблем, нами была предпринята попытка использовать для их решения комплекс имеющихся данных о морфологии, биологии, биохимии и генетике конъюгат.

Целью настоящей работы было определение филогенетической структуры класса Zygnematophyceae с помощью молекулярно-филогенетических методов и анализ его морфологической (эволюционной) дифференциации, а также выделение монофилетических комплексов, составляющих крупнейшие роды с тем, чтобы в дальнейшем разработать естественную концепцию последних и создать таксономическую систему класса, основанную на филогенетическом родстве организмов.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1) получить последовательности кодирующих (18S рДНК) и некодирующих (1506 интрон I группы, внутренний транскрибируемый спейсер 1 и 2 [Internal Transcribed Spacer, далее ITS]) участков ядерной рибосомальной ДНК и про-теин-кодирующей ДНК хлоропластов {rbcL) представительных видов класса Zygnematophyceae,

2) на основе молекулярно-филогенетических анализов нуклеотидных последовательностей построить филогенетическое древо конъюгат,

3) сравнить полученные результаты с существующими филогенетическими и таксономическими схемами, основанными на фенотипических признаках,

4) провести сравнительный анализ филогений, полученных с использованием различных молекулярных маркеров.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Класс Zygnematophyceae является монофилетической группой в составе стрептофитных зеленых водорослей и хорошо отграничен от них как фено-типическими (отсутствие жгутиков, половой процесс в виде конъюгации), так и генетическими синапоморфиями (уникальные замены в транскрипте 18S рРНК).

2. Род Spirotaenia является первой (базовой) дивергенцией в классе, и его представители предположительно сохраняют плезиоморфное состояние нескольких признаков (особенности процесса конъюгации, отсутствие 1506 интрона I группы в 18S рДНК).

3. Порядок Zygnematales, выделяемый на основе плезиоморфоного состояния признака (простая несегментированная клеточная стенка без пор), является парафилетическим и его таксономическая структура требует пересмотра с учетом генетических и фенотипических признаков.

4. Своеобразное сочетание признаков ультраструктуры клеточной стенки и особенности положения на филогенетическом древе рода Phymcitodocis указывают на необходимость выделения его в новое семейство в составе порядка Desmidiales.

5. Большинство исследованных родов конъюгат является немонофилетически-ми и их концепции нуждаются в ревизии.

Научная новизна, теоретическое и практическое значение работы. На основе молекулярно-филогенетических анализов установлены эволюционные связи между представителями класса Zygnematophyceae. Показано, что морфологические признаки, используемые для целей классификации в классе (особенности ультраструктуры клеточной стенки, тип организации таллома, особенности морфологии клетки и др.), не всегда адекватно отражают родство таксонов, а общепринятая система конъюгат требует пересмотра.

Обнаружена ранняя дивергенция рода Spirotaenia от основного ствола класса. Высказано предположение, что этот род должен быть выделен в новый подкласс в составе Zygnematophyceae.

Разработана оригинальная методика поиска молекулярных синапоморфий, с ее помощью обнаружены новые признаки, характеризующие как весь класс Zygnematophyceae, так и его отдельные клады.

Впервые проведено сравнительное изучение эволюционной динамики двух генов (ядерного 18S рДНК и хлоропластного rbcL) из разных геномов клетки на примере конкретной группы организмов.

Разработаны модели вторичной структуры транскриптов ITS1 и ITS2 рДНК конъюгат, и на основе этих структурных данных проведен анализ филогенетических взаимоотношений между предположительно близкородственными родами десмидиевых водорослей.

Работа послужит фундаментальной основой для дальнейших исследований в области систематики и филогении отдела Streptophyta, в особенности класса Zygnematophyceae, на разных таксономических уровнях.

За время исследования была создана обширная коллекция штаммов зеленых конъюгирующих водорослей, многие из которых не представлены в мировых коллекциях.

Определены и депонированы в международные базы данных более 200 новых нуклеотидных последовательностей генов, интронов и спейсерных участков ДНК.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на 2 Всероссийском совещании альгологов (С-Пб., 2002), 5-7 International Phycologi-cal Congresses, Qingdao, China (1994), Leiden, The Netherlands (1997),. Thessalo-niki, Greece (2000); IV International Symposium "Biology and taxonomy of green algae" Smolenice,. Slovakia (2002), 12th International Association of Phytoplankton Taxonomy and Ecology Workshop, Winnipeg, Canada (1999), Annual Meetings of Japanese Phycological Society, Shimoda (1998), Yamagata,( 1999),.научных семинарах Botanisches Institut der Universitat zu Koln (2000-2003), Institut fur Allge-meine Botanik der Universitat Hamburg (2001), Института биологии внутренних вод (п. Борок, 2000, 2003) и Биолого-почвенного института ДВО РАН (20002005), Владивостокского Общества развития генетики (2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано: глава коллективной монографии, 19 статей и 7 тезисов докладов международных конференций. Основные результаты исследований опубликованы в ведущих отечественных и международных научных журналах: Ботанический журнал, Альгология, Algo-logical Studies, Hydrobiologia, Journal of Molecular Evolution, Molecular Biology and Evolution, Phycologia.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения; обзора литературы (Глава 1), объектов и методов (Глава 2), результатов и обсуждения (Главы 3-6), заключения и выводов. Материалы диссертации изложены на 216 стр. машинописного текста и проиллюстрированы 32 рисунками и 9 таблицами. Список литературы включает 304 источника.

Заключение Диссертация по теме "Ботаника", Гончаров, Андрей Анатольевич

Выводы

1. На основе молекулярно-филогенетических анализов нуклеотидных последовательностей ядерного (18S рРНК) и хлоропластного (rbcL) генов изучены эволюционные взаимоотношения между представителями класса Zygnematophyceae (Streptophyta) и установлена его филогенетическая структура.

2. Показано, что класс Zygnematophyceae является монофилетическим таксоном, четко отграниченным от остальных представителей отдела фенотипиче-скими (половое размножение в форме конъюгации, утрата жгутиковых стадий) и молекулярными (компенсаторная замена нуклеотидов в стебле 33 транскрипта 18S рРНК) синапоморфиями.

3. На основе анализа симплезиоморфных морфологических признаков, характеризующих базовые ветви филогенетического дерева класса, показано, что пред-ковой формой конъюгат могла быть одноклеточная стрептофитная водоросль, имевшая клетки эллиптической формы и пристенные хлоропласты. В ходе эволюции конъюгат несколько раз появлялись многоклеточные организмы с нитчатыми талломами, а осевые хлоропласты стали преобладающим типом.

4. Установлена ранняя (> 300-400 млн лет) дивергенция рода Spirotaenia с основным стволом конъюгат, произошедшая, предположительно, до встраивания интрона I группы, характеризующего других представителей Zygnematohyceae, в их 18S рРНК на позицию, гомологичную позиции 1506 16S рРНК Е. coli. Предположительно, представители рода сохранили плезиоморфные признаки процесса конъюгации и химического состава клеточной стенки, свойственные предковым формам класса. Высказано предположение, что род Spirotaenia заслуживает выделения в подкласс.

5. Молекулярные данные характеризуют высшие таксоны конъюгат, выделенные на основе апоморфных морфологических и ультраструктурных признаков, как монофилетические - пор. Desmidiales, сем. Desmidiaceae, Gonatozygaceae и Closteriaceae. В случаях, когда в качестве диагностических использовались пле-зиоморфные (пор. Zygnematales) или гомопластические (сем. Zygnemataceae, Mesotaeniaceae и Peniaceae) признаки, монофилия этих таксонов отвергается.

6. Установлено обособленное положение рода Phymatodocis на филогенетическом древе коньюгат, отвергающее его принадлежность к сем. Desmidiaceae. Молекулярные и ультраструктурные (сочетание признаков тонкого строения клеточной стенки у типового вида рода) данные указывают на необходимость выделения его в новое семейство в составе порядка Desmidiales.

7. Эволюционная динамика ядерного (18S рРНК) и хлоропластного (rbcL) генов отличается у представителей класса Zygnematophyceae, однако эти маркеры сходным образом отражают филогенетические отношения в классе и успешно дополняют друг друга в совместном анализе, повышая его информативность.

8. Показано, что большинство фенотипических признаков, использовавшихся для выделения родов конъюгат, отличаются высокой гомоплазией и не отражают общность происхождения видов, что находит отражение в достоверно установленной полифилии родов Mesotaenium, Cylindrocystis, Cosmarium, Staurodesmus и многих других, и отмечена необходимость их ревизии.

9. Установлено монофилетическое ядро рода Staurastrum, длительное время считавшегося искусственным. Высказано предположение, что полирадиальность и наличие отростков на углах полуклетки являются предковыми признакам для его представителей, однако они не могут использоваться в качестве диагностических т.к. многократно утрачивались в ходе эволюции.

Заключение

Анализ филогенетических взаимоотношений представителей класса Zyg-nematophyceae с использованием молекулярных методов в целом подтвердил традиционные взгляды на эволюцию конъюгат, базирующиеся на фенотипич-ских признаках. Изучение двух генов из разных геномов и нескольких некодирующих участков ДНК позволило реконструировать эволюцию конъюгат на разных таксономических уровнях и придало большую достоверность предлагаемым филогенетическим построениям.

Многие этапы процесса эволюции признаков, внесших свой вклад в становление современного разнообразия класса, остаются невыясненными, а сина-поморфные признаки, характеризующие те или иные группы, еще предстоит уточнить. Несомненно, утрата жгутикового аппарата и возникновение конъюгации являются основными событиями, выделяющими конъюгат из царства зеленых растений. Дивергентное положение рода Spirotaenia на филогенетическом древе отдела Streptophyta ставит под сомнение уникальность этого события и предполагает, что конъюгация могла возникнуть, по крайней мере, дважды в отделе - у предка Spirotaenia и у водоросли, давшей начало классу Zygnematophyceae. Однако мы считаем это допущение маловероятным и рассматриваем род Spirotaenia как рано обособившуюся группу в составе класса (рис. 32). ^ После ее обособления произошло встраивание в 18S рДНК конъюгат интрона I группы на позицию, гомологичную позиции 1506 16S рДНК Е. coli. В дальнейшем происходило последовательное отщепление как отдельных видов (Mesotaenium endlicherianum, Netrium spp.), так и родов (Spirogyra) и надродо-вых групп ("Zygnemataceae s. str."), характеризующихся определенными аута-поморфными признаками. Природа этих аутапоморфий весьма разнообразна, они относятся к морфологии хлоропластов (Mesotaenium endlicherianum, Spirogyra), особенностям тонкого строения клеточной стенки и поведения ядра в * процессе цитокинеза (Netrium spp.) или уникальным заменам нуклеотидов

Zygnemataceae s. str."), и их значимость в общем контексте эволюции группы еще предстоит оценить. Адаптивное значение данных признаков также не очевидно. Общим для всех базовых ветвей класса является просто устроенная кпеточная стенка, и этот признак был использован в качестве диагностического для пор. Zygnematales, естественность которого мы оспариваем.

Усложнение строения клеточной стенки привело к обособлению пор. Desmidiales. В порядке выделяются несколько хорошо очерченных эволюционных линий (семейств), наиболее продвинутой из которых является сем. Desmidiaceae. Нами была установлена последовательность возникновения признаков, характеризующих это семейство.

Проведенные исследования показали, что фенотипические признаки, используемые для выделения родов конъюгат, не всегда определяют монофиле-тические группы, вследствии чего многие роды являются искусственными. Вместе с тем, нами было установлено монофилетическое ядро рода Staurastrum, одного из наиболее сложных и спорных в таксономическом отношении, и показана перспективность использования молекулярно-филогенетических методов для целей филогении и таксономии класса Zygnematophyceae. нагтрватофятные плцорослн/наюмныи рис if ни я ч ч утрата жгутиков, возникновение конъюгации, кеш пенса юрпан j а мен а в стебле 33 т р я искрит»

1HS рДНК ветряиндние 1506 ' и и г ршга I группы и I8S рДНК

ЩгоЫеШ я Netrium interruplum -1 Roya

I- Gonatozygaceae j- cciMcMiMpohniHc it f CKV.llilir>pi4)}H3IUi»LMC fr D'iiiuii С[шкН< появление пор | rf Pm&teae

Рапинеаг e 110-1( и -и- h-1J КИ lla 2 mi i'-K.iri км

Ш&ШШШ;

- phymaodocb отделение нервнчнон клеточкой стенки, появление по ропот канала, приникши litem через вторичную кл. ст.

-- Netrium t. srtr,

-b'ctrium oblongum SVCK 25S

Alfl.lCVY.TM|lIH.lv СПНЙМОЧОрфиН 18 рДНК х rbd.

Ш|||| вторичная утрата нитрона \McMitaenium endMcherianurtt}

Рис 32. Эволюция некоторых фенотипических и генетических признаков в классе Zygnematophyceae, | - аутапоморфные признаки, ?- признаки неизвестны. Пунктиром отмечена общая ветвь Spirotaenia и Chlorokybus, предположительно, обусловленная гомоплазией нуклеотидных последовательностей.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Гончаров, Андрей Анатольевич, Владивосток

1. Воденичаров Д.Г. К вопросу о систематике и номенклатуре сцеплянок. // Новости систематики низших растений. 1972. Т. 9. С. 102-106.

2. Голлербах М.М., Полянский В.И. Определитель пресноводных водорослей СССР. Общая часть. М., Наука, 1951. - 199 с.

3. Зеров Д.К. Очерк филогении бессосудистых растений. Киев: Наук.думка, 1972.-316 с.

4. Косинская Е.К. Конъюгаты или сцеплянки (1). Мезотениевые и гонатозиговые водоросли. М.: Изд-во АН СССР, 1952. - 163 С. - (Флора споровых растений СССР; т. 2).

5. Косинская Е.К. Конъюгаты или сцеплянки (2). Десмидиевые водоросли,- М.: Изд-во АН СССР, 1960. 706 с. (Флора споровых растений СССР; т. 5, вып. 1).

6. Koctikob I. Ю., Романенко П. О., Демченко Е. М., Дархенко Т. М., Михайлюк Т. I., Рибчинський О. В., Солоненко А. М. Водорост1 грунпв Украши (ютор1я та методи дошпження, система, конспект флори). -Кшв: Фггосоцюцентр, 2001.-300 с.

7. Мейер К.И. К филогении зеленых водорослей // Бюлл. МОИП. Отд. биологии, 1951, Т. 56. №. 1.С. 53-65.

8. Мейер К.И. Об эволюции хроматофора у водорослей // Бюлл. МОИП. Отд. биологии, 1962. Т. 67. № 2. С. 53-68.

9. Паламарь-Мордвинцева Г.М. Новые роды Desmidiales // Укр. бот. журн. 1976. Т. 33, №3. С. 396-399.

10. Паламарь-Мордвинцева Г.М. Десмидиевые водоросли Украинской ССР. Киев: Наук, думка, 1982а. - 236 с.

11. Паламарь-Мордвинцева Г.М. Зеленые водоросли. Класс Конъюгаты. Порядок Десмидиевые. Вып. 11(2). -Л: Наука, 19826. 620 с. - (Определитель пресноводных водорослей СССР).

12. Топачевский О.В. Критика жгутиковой теории происхождения водорослей //

13. Тр. биол.-почв. фак. Киев, ун-та. Т. 1953. № 9. С. 115-126. Топачевский А.В., Масюк Н. П. Пресноводные водоросли Украинской ССР.

14. Киев: Вища школа. 1984. 332 с. Топачевський, О.В. До питания про виникнення i типии статевого процессу у водорослей//Тр. бюл.-грунтознав. фак. Кшв. Ун-ту. 1954. Т. 11. Р. 65-73. Топачевський О.В. Проходження кон'югат i типии статевого процессу у них //

15. Ботан. журн. АН УРСР. 1952. Т. 96 № 2. Р. 32-35. Agardh С.А. Systema Algarum. Lund, 1824. - 312 p.

16. Bailey J. W. Microscopical observations made in South Carolina, Georgia and Florida

17. Smithson. Contrib. Knowledge. 1851. Vol. 11, № 8. P. 1-48. Baldauf S.L., Roger A.J., Wenk-Siefert I., Doolittle, W.F. A kingdom-level phylog-eny of eukaryotes based on combined protein data // Science 2000. Vol. 290. P. 972-977.

18. Bando Т. A revision of the genera Docidium, Haplotaenium and Pleurotaenium (Desmidiaceae, Chlorophyta) of Japan // J. Sci. Hiroshima Univ, Ser. B, Div. 2 1988. Vol. 22. P. 147-160.

19. Bech-Hansen C.W., Fowke L.C. Mitosis in Mougeotia sp. // Canad. J. Bot. 1972. Vol. 50, №9. 3. 1811-1816.

20. Berggren S. Bidrag till kannedomen om Fanerogamfloran vid Discobugten och Au-leitsivik-fjorden pa Gronlands vestkust // Ofv. Kongl. Vet.-Akad. Forhandl. 1871. P. 853-897.

21. Bernard C. Sur quelques algues unicellulaires d'eau douce recoltees le Domaine Ma-lais. Dept. De 1'Agric.: Aux Indes Neerland., 1909. - 94 p.

22. Besendahl A., Bhattacharya D. Evolutionary analyses of small-subunit rDNA coding regions and the 1506 group I introns of Zygnematales (Charophyceae, Streptophyta)//J. Phycol. 1999. Vol. 35. P. 560-569

23. Bhattacharya D., Surek В., Rtising M., Damberger S., Melkonian M. Group I introns are inherited through common ancestry in the nuclear-encoded rRNA of Zygnematales (Chlorophyta) // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. Vol. 91. P. 99169920

24. Bhattacharya D., Weber K., An S.S., Berning-Koch W. Actin phylogeny identifies Mesostigma viride as a flagellate ancestor of the land plants // J. Mol. Evol. 1998. Vol. 47. P. 544-550.

25. Bhattacharya, D., Damberger S., Surek В., Melkonian M. Primary and secondary structure analysis of the rDNA group I introns of the Zygnematales // Curr. Genet. 1996. Vol. 29: P. 282-286.

26. Bicudo C.M. Prescotiella, a new genus of asymmetric desmids (Chlorophyceae) // J. Phycol. 1976. Vol. 12. № 1. P. 22-24.

27. Biebel P. Morphology and life cycles of saccoderm desmids in culture // Beih. Nova Hedwigia 1975. Vol. 42. P. 39-57.

28. Biebel P. The sexual cycle of Netrium digitus II Am. J. Bot. 1964. Vol. 51. P. 697704.

29. Bold H.C., Wynne M.J. Introduction to the Algae: Structure and Reproduction. 2 nd edition. Englewood Cliffs: Prentice-Hall, Inc., 1985. - 720 p.

30. Bourrelly P. Une nouvelle coupure generique dans la famille des Desmidiees: le genre Teilingia II Rev. Algol. II, 1964. Vol. 7. № 2. P. 187-191.

31. Bowe L.M., Coat G., dePamphilis C.W. Phylogeny of seed plants based on all three genomic compartments: Extant gymnosperms are monophyletic and Gnetales1 closest relatives are conifers // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000. Vol. 97. P. 4092-4097.

32. Brebisson A. 1856. Liste de Desmidiees, observees en Basse-Normandie. // Mem. Soc. Imp. Sci. Nat. de Cherbourg. 4 :113-162.

33. Bremer K. Summary of green plant phylogeny and classification // Cladistics. 1985. Vol. 1. P. 369-385

34. Bremer K., Humphries C.J., Mishle B.D., Churchill S.P. On cladistic relationships in green plants // Taxon. 1987. Vol. 36. P. 339-349

35. Brook A.J. Staurastrum paradoxum, Meyen and S. gracile, Ralfs in the Britishfreshwater plankton and a revision of the S. annatinum -group of radiate desmids //Trans. Roy. Soc. Edinb. 1959. Vol. 58. P. 589-628.

36. Brook A.J. The biology of desmids. Boston: Blackwell Sci Publ., 1981. - 276 p. -(Botanical monographs, vol 16).

37. Brook A.J. The proposed establishment of a new desmid genus Polytaenia, previously the sub-genus Polytaenia of the genus Spirotaenia, and a description of a new species, P. luetkemuelleri II Quekett J. Microsc. 1997. Vol. 38. P. 7-14.

38. Brook A.J. Tortitaenia nom. nov. pro Polytaenia Brook, a name of a genus of saccoderm desmids//Quekett J. Microsc. 1998. Vol. 38. P. 146.

39. Brook A.J. Order Zygnemataies. Sub-order Desmidiineae // The freshwater algalflora of the British Isles An identification guide to freshwater and terrestrial algae / D. John et al.. Cambridge: Cambridge University Press, 2002. P. 530592.

40. Buckley T.R. Model misspecification and probabilistic tests of topology: Evidence from empirical data sets // Syst. Biol. 2002. Vol. 51. P. 509-523.

41. Buckley T.R., Arensburger P., Simon C., Chambers G.K. Combined data, Bayesian phylogenetics, and the origin of the New Zealand cicada genera // Syst. Biol. 2002. Vol. 51. P. 4-18.

42. Cao Y., Fujiwara M., Nikaido M., Okada N., Hasegawa M. Interordinal relationships and timescale of eutherian evolution as inferred from mitochondrial genome data//Gene. 1998. Vol. 259. P. 149-158.

43. Capesius I., Bopp M. New classification of liverworts based on molecular and morphological data//Plant Syst. Evol. 1997. Vol. 207. P. 87-97.

44. Cavalier-Smith T. Eukaryote kingdoms: seven or nine?// BioSystems. 1981. Vol. 14. P. 461-481

45. Cech T.R. Conserved sequence and structure of group I introns: building an active site for RNA catalysis a review // Gene. 1988. Vol. 73 P. 259-271.

46. Chapman R.L., Buchheim M.A. Ribosomal RNA gene sequences: analysis and significance in the phylogeny and taxonomy of green algae // Crit. Rev. PI. Sci. 1991. Vol. 10. P. 343-368.

47. Cimino M.T., Delwiche C. F. Molecular and morphological data identify a cryptic species complex in endophytic members of the genus Coleochaete Breb. (Charophyta: Coleochaetaceae) // J. Phycol. 2002. Vol. 38. P. 1213-1221.

48. Coesel P.F.M. De Desmidiaceeen van Nederland. Deel 6 Fam. Desmidiaceae (4). Wetenschappelijke Mededeling 220, Utrecht: KNNV Uitgeverij, 1997. - 95 p.

49. Coesel P.F.M. Spirotaenia diplobelica spec. nov. (Chlorophyta, Mesotaeniaceae) // Acta Bot. Neerlandica 1981. Vol. 30. P. 433-437.

50. Coesel P.F.M. Taxonomic notes on Dutch Desmids II // Cryptogamie Algologie. 1993. Vol. 14. P. 105-114.

51. Coleman A.W. ITS2 is a double-edged tool for eukaryote evolutionary comparisons // Trends Genet. 2003. Vol. 19. :P. 70-75.

52. Coleman A.W., Preparata R.M., Mehrotra B. Mai J.C. Derivation of the secondary structure of the ITS-1 transcript in Volvocales and its taxonomic correlations // Protist. 1998. Vol. 149. P. 135-146.

53. Coleman A.W., Vacquier V.D. Exploring the phylogenetic utility of ITS sequences for animals: A test case for abalone (Haliotis) // J. Mol. Evol. 2002. Vol. 54. P. 246-257.

54. Compere P. Bourrellyodesmus nouveau genre de Desmidiacees I I Rev. Algol., II. 1976. Vol. 11. № 3/4. P. 339-342.

55. Compere P. Octacanthium (Hansgirg) Compere, a new generic name in the Desmidiaceae // Beih. Nova Hedwigia. 1996. Vol. 112. P. 501-508.

56. Cranwell P. A., Jaworski G.H., Bickley H.M. Hydrocarbons, steroids esters and fatty acids in six freshwater chlorophytes // Phytochemistry. 1990. Vol. 1. P. 145-173.

57. Delwiche C.F., Karol K.G., Cimino M.T., Sytsma K.J. Phylogeny of the genus

58. Coleochaete (Coleochaetales, Charophyta) and related taxa inferred by analysis of the chloroplast gene rbcL Hi. Phycol. 2002. Vol. 38. P. 394-403.

59. Denboh Т., Hendrayanti D., Ichimura T. Monophyly of the genus Closterium and the order Desmidiales (Charophyceae, Chlorophyta) inferred from nuclear small subunit rDNA data//J. Phycol. 2001. Vol. 37. P. 1063-1072.

60. Denboh Т., Ichimura Т., Hendrayanti D. Coleman A.W. Closterium moniliferum-ehrenbergii (Charophyceae, chlorophyta) species complex viewed from the 1506 group I intron and ITS2 of nuclear rDNA // J. Phycol. 2003. Vol. 39. P. 960-977.

61. Douady C.J., Delsuc F., Boucher Y., Doolittle W.F., Douzery E.J.P. Comparison of Bayesian and maximum likelihood bootstrap measures of phylogenetic reliability // Mol. Biol. Evol. 2003. Vol. 20. P. 248-254.

62. Doyle J.J., Doyle J.L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue // Phytochem. Bull. 1987. Vol. 19. P. 11-15.

63. Duthie H.C. Some observations on the ecology of desmids // J. Ecol. 1965. Vol. 53. P. 695-703.

64. Ehrenberg C.G. Uber die Entwicklung und Lebensdauer der Infusionsthiere; nebst ferneren Beitragen zu einer Vergleichung ihrer organischen Systeme // Physik. Abh. Konigl. Akad. Wiss. Berlin. 1831 (1832). S. 1-154.

65. Engels M, Mix M. Nachtrag zur Liste der Sammlung von Conjugaten-Kulturen im Institut fur Allgemeine Botanik der Universitat Hamburg // Mitt. Inst. Allg. Bot. Hamburg. 1980. Vol. 17. P. 165-171.

66. Engels M., Lorch D. Some observation on cell wall structure and taxonomy oiPhymatodocis nordstedtiana (Conjugatophyceae, Chlorophyta) // Plant Syst. Evol. 1981. Vol. 2. №2. P. 217-225.

67. Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap // Evolution. 1985. Vol. 39. P. 783-791.

68. FottB. Algenkunde. Jena: Gustav Fischer, 1959. 581 S.

69. Fowke L.C., Pickett-Heaps J.D. Cell division in Spirogyra. II. Cytokinesis // J. Phycol. 1969. Vol. 5. P. 273-281.

70. Frederick S.E., Gruber P.J., Tolbert N.E. The occurence of glycolate dehydrogenase and glycolate oxidase in green plants // Plant Physiol. 1973, Vol. 2. № 3. P. 318323.

71. Friedl T. The evolution of the Green Algae // Plant Syst. Evol. 1997. Vol. 11. P. 87101.

72. Fritsch F.E. Comparative studies in a polyphyletic group, the Desmidiaceae // Proc. Linn. Soc., London, 1952. Vol. 164. P. 258-280.

73. Fritsch F.E. Comparative studies in a polyphyletic group: The Desmidiaceae // Proc. Linn. Soc., London. 1953. Vol. 164. P. 258-280.

74. Fritsch F.E. Present-day classification of algae // Bot. Rev. 1944. Vol. 10. P. 233-277.

75. Fritsch F.E. The evolutionary sequence among the desmids // Trans. S. E. Union Sci. Soc. 1933. P. 18-37.

76. Fritsch F.E. The structure and reproduction of the algae. Vol. I. Cambridge: Cambridge Univ. Press., 1935. - 791 p.

77. Fritsch F.E. The structure and reproduction of the algae. Vol. II. Cambridge: Cambridge Univ. Press., 1945. - 939 p.

78. Galtier N., Gouy M., Gautier C. Sea View and Phylowin, two graphic tools for sequence alignment and molecular phylogeny // Сотр. Applic. Biosci. 1996. Vol. 12. №4; P. 543-548.

79. Gauthier-Lievre L. Desmidiacees asymetriques. Le genre Allorgeia gen. nov. // Bull. Soc. Hist. Nat. Afr. Nord. 1958. Vol. 49. P. 93-101.

80. Gerrath J.F. Conjugating Green Algal and Desmids // Freshwater algae of the North America. Ecology and classification / J. D. Wehr, R. G. Sheath. London: Academic Press, 2003. P. 353-381.

81. Gerrath J.F. Notes on desmid ultrastructure. I. Cell wall and zygote wall of Cylindro-cystis brebissonii Meneghini. II. The replicate division septum of Bambusina brebissonii Kuzing 11 Beih. Nova Hedwigia 1975. Vol. 42. P. 103-114.

82. Gerrath J.F. Penium spinulosum (Wolle) nov. comb. A taxonomic correction based on cell wall ultrastructure // Phycologia 1969. Vol. 8. P. 109-118.

83. Gerrath J.F. The biology of desmids: a decade of progress // Progress in Phycological Research 9. Bristol, 1993. P. 79-192.

84. Giddings Т.Н., Staehelin S.H. Microtubule-mediated control of microfibril deposition: A re-examination of the hypothesis // The cytoskeletal Basis for plant growth and form / C. W. Lloyd. London: Academic Press, 1991. P. 85-100/

85. Goertzen L.R., Cannone J.J., Gutell R.R. Jansen R.K. ITS secondary structure derived from comparative analysis: implications for sequence alignment and phy-logeny of the Asteraceae // Mol. Phylog. Evol. 2003. Vol. 29. P. 216-234.

86. Gontcharov A.A., Marin В., Melkonian M. Are combined analyses better than single gene phylogenies? A case study using SSU rDNA and rbcL sequence comparisons in the Zygnematophyceae (Streptophyta) // Mol. Biol. Evol. 2004. Vol. 21. №3. P. 612-624.

87. Gontcharov A. A., Marin В., Melkonian M. Molecular phylogeny of conjugating green algae (Zygnemophyceae, Streptophyta) inferred from SSU rDNA sequence comparisons //J. Mol. Evol. 2003. Vol. 56. № 1. P. 89-104.

88. Gontcharov A. A., Melkonian M. Unusual position of the genus Spirotaenia (Zygnematophyceae) among streptophytes revealed by SSU rDNA and rbcL sequence comparisons // Phycologia. 2004. Vol. 43. № 1. P. 105-113.

89. Gontcharov A.A.,Watanabe M. Brachytheca sulcata gen. et sp. nov. (Desmidiaceae, Chlorophyta), a new alga from the highlands of Papua New Guinea // Phycologia. 1999. Vol. 38. P. 354-348.

90. Graham L.E. Origin of land plants: NY: John Wiley & Sons Inc., 1993. - 287 p.

91. Graham L.E. Green algae to land plants: An evolutionary transition // J. Plant Res. 1996. Vol. 109. P. 241-251.

92. Graham L.E., Delwiche C.F., Mishler B. Phylogenetic connections between the "green algae" and the "bryophytes" // Adv. Bryol. 1991. Vol. 4. № 2. P. 213244.

93. Gray M. W., Schnare M.N. Evolution of the modular structure of rRNA // The ribo-some / W. E. Hill et al.. Washington: Amer Soc. Microbiol, 1990. P. 589-97.

94. Graybeal Л. Is it better to add taxa or characters to a difficult phylogenetic problem?

95. Entwurfs einer systematischen Stammgeshichte. Berlin, 1894. 400 S. Haga M., Ehara J. Observations on vegetative cells and the process of sexual reproduction in Spirotaenia obscura Ralfs // Bull. Jap Phycol. Soc. 1977. Vol. 25. P. 45-54.

96. Hendy M.D., Penny D. A framework for the quantitative study of evolutionary trees

97. Kyoto Univ. 1959b. Vol. 9. P. 302-386. Hoef-Emden K, Marin В., Melkonian M. Nuclear and nucleomorph SSU rDNA phy-Iogeny in the cryptophyta and the evolution of cryptophyte diversity // J. Mol. Evol. 2002. Vol. 55. № 1. P. 161-79.

98. Hoftberger M, Meindl U. Cell differentiation, ultrastructure and nuclear migration in the desmid Xanthidium armatum // Nova Hedwigia 1993. Vol. 56. P. 75-88

99. Hoshaw R.W., McCourt R M. The Zygnemataceae (Chlorophyta): a twenty-year up-^ date of research // Phycologia. 1988. Vol. 27. № 4. P. 511-548.

100. Hoshaw R.W., McCourt R.M., Wang J.-C. Phylum Conjugaphyta // Handbook of Protoctista / L. Margulis et al.. Boston: Jones and Bartlett Publ., 1990. P. 119-131.

101. Hoshaw R.W., Wells С. V. Systematics of the Zygnemataceae (Chlorophyceae). IV. Nuclear cytology of Sirogonium melanosporum, a species with large chromosomes//Trans. Am. Microsc. Soc. 1982. Vol. 101. P. 276-286.

102. Hoshaw R.W., Hilton R.L. Observation on the sexual cycle of the saccoderm desmid ^ Spirotaenia condensate II J. Arizona-Nevada Acad. Sci. 1966. Vol. 4. P. 88-92.

103. Huelsenbeck J.P., Ronquist F. MRBAYES: Bayesian inference of phylogenetic trees // Bioinformatics. 2001. Vol. 17. № 8. P. 754-755.

104. Jacquier A. Group II introns: Elaborate ribozymes // Biochimie. 1996. Vol. 78. № 6. 4 P. 474-487.

105. Jarman M., Pickett-Heaps J. Cell division and nuclear movement in the saccoderm desmid Netrium interruptum //Protoplasma. 1990. Vol. 157. № 1. P. 136-143

106. Joseph N., Krauskopf E., Vera M.I., Michot B. Ribosomal internal transcribed spacer 2 (ITS2) exhibits a common core of secondary structure in vertebrates and yeast //Nucleic Acids Res. 1999. Vol. 27. P. 4533-4540.

107. Kadlubowska J.Z. Susswasserflora von Mitteleuropa. Bd. 16, Chlorophyta VIII, Con-jugatophyceae I, Zygnematales. Stuttgat, Gustav Fischer Verlag, 1984. - 532 P

108. Karol K.G., McCourt R.M., Cimino M.T., Delwiche C.F. The closest living relatives of land plants // Science 2001. Vol. 294. P. 2351-2353.

109. Kellogg E.A., Juliano N.D. The structure and function of RuBisCO and their implications for systematic studies //Am. J. Bot. 1997. Vol. 84. P. 413-428.

110. Kenrick P, Crane P.R. The origin and early diversification of land plants. A cladistic study. Washington, Smithsonian Institute Press, 1997. - 441 p.

111. Kiermayer O, Meindl U. Cellular morphogenesis: the desmid (Chlorophyceae) system // Algae as experimental systems / A. W. Coleman et al., 1989. New York Alan: R. Liss Inc. P. 149-167

112. Kies L. LJber Zellteilung und Zygotenbildung bei Roya obtusa (Breb.) W. et G.S. West//Mitt. Inst. Allg. Bot. Hamburg. 1967. Vol. 12. P. 35-42.

113. Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences // J. Mol. Evol. 1980. Vol. 16. P. 111-120

114. Kirk W.L., Postek M.T., Cox E.R. The desmid genera Sphaerozosma, Onychonema and Teilingia: a historical appraisal// J. Phycol. 1976. Vol. 12. P. 5-9.

115. Kishino H., Hasegawa M. Evaluation of the maximum likelihood estimate of the evolutionary tree topologies from DNA sequence data, and the branching order of the Hominoidea//J. Molec. Evol. 1989. Vol. 29. P. 170-179.

116. Kouwets F.A.C., Coesel P.F.M. Taxonomic revision of the conjugatophycean family Peniaceae on the basis of cell wall ultrastructure // J. Phycol. 1984. Vol.20. № 4. P. 555-562

117. P. 1-6, 51-57, 88-94. Mai J.C., Coleman A.W. The internal transcribed spacer 2 exhibits a common secondary structure in green algae and flowering plants // J. Mol. Evol. 1997. Vol. 44. P. 258-271.

118. Marin В., Melkonian M. Mesostigmatophyceae, a new class of streptophyte green algae revealed by SSU rRNA sequence comparisons // Protist 1999. Vol. 150. P. 399-417.

119. Mathews D.H., Sabina J., Zuker M. Turner D.H. Expanded sequence dependence of thermodynamic parameters improves prediction of RNA Secondary Structure // J. Mol. Biol. 1999. Vol. 288. P. 911-940.

120. Mattox K.R., Stewart K.D. Classification of the green algae: a concept based on comparative cytology // Systematics of the green algae / D. E. G. Irvine, D. M. John. London: Academic Press, 1984. P. 29-72.

121. McCourt R.M. Green algal phylogeny // Trends Ecol. Evol. 1995. Vol. 10:159-63.

122. McCourt R.M., Delwiche C.F. Karol K.G. Charophyte algae and land plant origins // Trends Ecol. Evol. 2004. Vol.19. № 12. P. 661-666.

123. McCourt R.M., Karol K.G., Bell J., Helm-Bychowski K.M., Grajewska A., Wo-jciechowski M.F., Hoshaw R.W. Phylogeny of the conjugating green algae (Zygnemophyceae) based on rbcL sequences // J. Phycol. 2000. Vol.36. № 5. P. 747-758.

124. McCourt R.M., Karol K.G., Kaplan S., Hoshaw R.W. Using rbcL sequences to test hypotheses of chloroplast and thallus evolution in conjugating green algae (Zyg-nematales, Charophyceae) //J. Phycol. 1995. Vol. 31. № 11. P. 989-995.

125. McFadden G.I., Melkonian M. Use of Hepes buffer for microalgal culture media and fixation for electron microscopy// Phycologia. 1986. Vol. 25. № 4. P. 551-557.

126. Meindl U. Autonomous circular and radial motions of the nucleus in Pleurenterium tumidum and their relation to cytoskeletal elements and the plasma membrane // Protoplasma. 1986. Vol. 135. P. 50-66.

127. Melkonian M. Flagellar apparatus ultrastructure in Mesostigma viride (Prasinophy-ceae) // Plant Syst. Evol. 1989. Vol. 164. 93-122.

128. Melkonian M. Flagellar apparatus ultrastructure in relation to green algal classification // Systematics of the green algae / D. E. G. Irvine, D. M. John. London: Academic Press, 1984. P. 73-120.

129. Melkonian M., Surek В. Phylogeny of the Chlorophyta: congruence between ultra-structural and molecular evidence // Bull. Soc. Zool. Fr. 1995. Vol. 120. P. 191208.

130. Meneghini G. Cenni sulla organografia e fisiologia delle Alghe. Nuovi saggi dell'I // R. Accad. Sc. Lwtt. Ed Arti di Padova, V. 1838. Vol. 4. P. 324-388.

131. Michel F., Westhof E. Modeling the tree-dimensional architecture of group I catalytic introns based on comparative sequence analyses // J. Mol. Biol. 1990. Vol. 216. P. 585-610.

132. Mishler B.D., Churchill S.P. Transition to a land flora: phylogenetic relationships of the green algae and bryophytes // Cladistics. 1985. Vol. 1. P. 305-328.

133. Mix M. Die Feinstruktur der Zellwande bei Genicularia spirotaenia (de Bary) de Bary// Mitt. Inst. Allg. Bot., Hamburg. 1980. Vol. 18. S. 5-22.

134. Mix M. Die Feinstruktur der Zellwande bei Mesotaeniaceae und Gonatozygaceae mit einer vergleichenden Betrachtung der verschiedenen Wandtypen der Conjugatophyceae und iiber deren systematischen Wert// Arch. Mikrobiol. 1972. Vol. 81. № l.P. 197-220.

135. Mix M. Die Feinstruktur der Zellwande der Conjugaten und ihre systematische Bedeutung// Beih. Nova Hedwigia 1975. Vol. 42. P. 179-194

136. Mix M. Die Feinstruktur der Zellwande in der Gattung Penium (Desmidiaceae) // Ber. Dt. bot. Ges., Berlin. 1968. Vol. 80. S. 715-721.

137. Mollenhauer D. Contribution towards a revision of the genus Spirotaenia (Mesotaeniaceae) // Beih. Nova Hedwigia. 1986. Vol. 56. P. 61-90.

138. Morgan, J.A.T., Blair D. Trematode and monogenean rRNA ITS2 secondary structures support a four-domain model//J. Mol. Evol. 1998. Vol. 47. P. 406-419.

139. Morrissey J.P., Tollervey D. Yeast snr30 is a small nucleolar RNA required for 8S ribosomal-RNA synthesis //Mol. Cell. 1993. Vol. 13, №4. P. 2469-2477.

140. Morton В. R. Codon use and the rate of divergence of land plant chloroplast gene // Mol. Biol. Evol. 1994. Vol. 11. P. 231-238.

141. Nageli C. Gattungen einzelliger Algen, physiologisch und systematisch bearbeitet // Neue Denkschr. Allgem. Schweiz. Ges. gesamt. Naturwiss. 1849. Vol. 8. P. 4460.

142. Nakahara H., Ichimura T. Convergent evolution of gametangiogamy both in the 14 Zygnematalean green algae and in the pennate diatoms. Japan // J. Phycol. 1992. Vol. 40. P. 161-166.

143. Nei M., Kumar S., Takahashi K. The optimization principle in phylogenetic analysis tends to give incorrect topologies when the number of nucleotides or amino acids used is small// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. Vol. 95. P. 12390-12397.

144. Nickrent D.L., Parkinson C.L., Palmer J.D.,Duff R.J. Multigene phylogeny of land plants with special reference to bryophytes and the earliest land plants // Mol. Biol. Evol. 2000. Vol. 17. P. 1885-1895.

145. Nordstedt C.F. Nonnullae algae aquae dulcis brasilienses // Oft. Kongl. Vet.-Akad. Forhandl. 1877. № 3. P. 15-28.

146. Nozaki H., Misawa K., Kajita Т., Kato M., Nohara S., Watanabe M.M. Origin and evolution of the colonial Volvocales (Chlorophyceae) as inferred from multiple, chloroplast gene sequences // Mol. Phylog. Evol. 2000. 17. P. 256-268.

147. Ohtani S. A taxonomic revision of the genus Netrium (Zygnemataies, Chlorophyceae) // J. Sci. Hiroshima Univ. Ser. В Div. 2, 1990. Vol. 23. P. 1-51

148. Okada Y. A new classification of Conjugatae with special reference to Desmids // Mem. Fac. Fish. Hokkaido Univ. 1953. Vol. 3. P. 165-192.

149. Olsen G.J. Sequence editor and analysis program. Urbana: University of Illinois, 1990.

150. Oltmanns F. Morphologie und Biologie der Algen. Bd. 4. Jena: Gustave Fischer, 1904.-459 S.

151. Page R.D.M. Tree View: An application to display phylogenetic trees on personal computers // Сотр. Appl. Biosci. 1996. Vol. 12. P. 357-358.

152. Palla, E. Uber eine neue, pyrenoidlose Art und Gattung der Conjugaten // Ber. Dt. Bot. Ges. 1894. Vol. 12. P. 228-236.

153. Park N.E., Karol K.G., Hoshaw R.W., McCourt R.M. Phylogeny of Gonatozygon and Genicularia (Gonatozygaceae, Desmidiales) based on rbcL sequences // Europ. J. Phycol. 1996. Vol. 31. P. 309-313.

154. Pascher A. Uber Flagellaten und Algen// Ber. Dt. Bot. Ges. 1914. Vol. 12. P. 136160.

155. Peculis B.A., Greer C.L. The structure of the ITS2-proximal stem is required for pre-rRNA processing in yeast // RNA. 1998. Vol. 4, № 12. P. 1610-1622.

156. Philippe H. Opinion: Long branch attraction and protist phylogeny // Protist 2000. Vol. 151. P. 307-316.

157. Pickett-Heaps J. D., Marchant H.J. The phylogeny of the green algae: a new proposal // Cytobios 1972. Vol. 6. P. 255-264.

158. Pickett-Heaps J:D., Wetherbee R. Spindle function in the green algae Mougeotia: absence of anaphase A correlates with postmitotic nuclear migration // Cell Motil. Cytoskeleton. 1987. Vol. 7. P. 68-77.

159. Pickett-Heaps J.D. Electron microscopy and the phylogeny of green algae and land plants // Am. Zoologist. 1979. Vol. 19. P. 545-554.

160. Pickett-Heaps J.D. Green algae: structure, reproduction and evolution in selected genera. Sunderland: Sinauer Associates, Inc., 1975. - 606 p.

161. Pickett-Heaps J.D. The evolution of the mitotic apparatus: an attempt at comparative ultrastructural cytology in the dividing plant cells // Cytobios 1969. Vol. 1. P. 257-280.

162. Pickett-Heaps J.D. Ultrastructurae and differentiation in Chara sp. II. Mitosis // Aust.

163. J. Biol. Sci. 1967. Vol. 20. P. 883-894. Рое S., Swofford D.L. Taxon sampling revisited // Nature. 1999: Vol. 398. P. 299300.

164. Posada D., Crandal K.A. MODELTEST: testing the model of DNA substitution //

165. Pritchard A. A history of infusorian animalcules, living and fossil. Ed. 3. London, 1852.-704 p.

166. Gaz. 1941. Vol. 119.№3.P. 192-197. Randhawa M.S. Zygnemaceae. New Dehli: Indian Council Agric. Res., 1959. - 478 P

167. Rannala В., Yang Z. Probability distribution of molecular evolutionary trees: a newmethod of phylogenetic inference // J Mol. Evol. 1996. Vol. 43. P. 304 -311. Rino J.A. Ecologie des algues d'eau douce du sud de Mozambique. Paris, 1979. -362 p.

168. Rokas A., Holland P. W. Rare genomic changes as a tool for phylogenetics // Trends

169. Ecol. Evol. 2000. Vol. 15. P. 454-459 Rosenvinge L.K. Note sur le Zygnema reticulatum E. Hallas // Rev. Algolog. 1924. Vol. l.P. 209-212.

170. Ruzicka J. Die Desmidiaceen Mitteleuropas. Band I, 1 Lief. Stuttgart: E. Schweizerbart'sche Verlagsbuchhandlung 1977. - 299 p.

171. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffen S., Scharf S.J., Higuchi R., Horn G.T., Mullis K.B., Erlich H.A. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with thermo-stable DNA polymerase // Science 1988. Vol. 239. P. 487-491

172. Sampaio J. Desmidias portugeasas // Bol. Soc. Broter. 1944. Vol. 18, № 2. P. 1-547.

173. Sanderson M.J., Wojciechowski M. F., Hu J. M., Khan T. S., Brady S. G. Error, bias, and long-branch attraction in data for two chloroplast photosystem genes in seed plants // Mol. Biol. Evol. 2000. Vol. 17. P. 782-797.

174. Schlosser U.G. SAG-Sammlung von Algenkulturen at the University of Gottingen. Catalogue of strains 19947/ Bot. Acta 1994. Vol. 107. P. 113-186.

175. Scott A.M., Prescott G.W. Notes on Indonesian freshwater algae. II. Ichthyodontium, a new desmid genus from Sumatra. // Reinwardtia. 1956. Vol. 4. № 1. P. 105112.

176. Shaw A.J., Allen B: Phylogenetic relationships, morphological incongruence, and geographic speciation in the Fontinalaceae (Bryophyta) // Mol. Phylog. Evol. 2000. Vol. 16. P. 225-237.

177. Shimodaira H. An approximately unbiased test of phylogenetic tree selection // Syst. Biol. 2002. Vol. 51. P. 492-508

178. Shimodaira H., Hasegawa M. Multiple comparisons of log-likelihoods with applications to phylogenetic inference // Mol. Biol. Evol. Vol. 1999. Vol. 16. P. 11141116

179. Shimodaira H., Hasegawa M. CONSEL: for assessing the confidence of phylogenetic tree selection// Bioinformatics 2001. Vol. 17. P. 1246-1247.

180. Silva P.C. Remarks on algal nomenclature VI // Taxon. 1980. Vol. 29. P. 121-145

181. Sluiman H.J. A cladistic evaluation of the lower and higher green plants (Viridiplan-tae) // PI. Syst. Evol. 1985. Vol. 149. P. 217-232.

182. Smith G.M. The freshwater algae of the United States. NY: McGraw-Hill, 1933. -716 p.

183. Smith G.M. The freshwater algae of the United States. NY: McGraw-Hill, 1950. -719 p.

184. Starr R.C., Zeikus J.A. UTEX-the culture collection of algae at the University of Texas at Austin // J. Phycol. Suppl. 1993. Vol. 29. P. 1-106

185. Stebbins G.L., Hill, J.C. Did multicellular plants invade the land? // Am. Nat. 1980. Vol. 115. P. 342-353.

186. Stewart K.D., Mattox K.R. Comparative cytology, evolution and classification of the green algae, with some consideration of the origin of other organisms with chlorophylls a and b. II Bot. Rev. 1975. Vol. 41. P. 104-135.

187. Stiller J.W., Hall B.D. Long-branch attraction and the rDNA model of early eu-karyotic evolution// Mol. Biol. Evol. 1999. Vol. 16. № 9. p. 1270-1279.

188. Surek В., Beemelmanns U., Melkonian M., Bhattacharya D. Ribosomal RNA sequence comparisons demonstrate an evolutionary relationship between Zygnematales and charophytes//Plant Syst. Evol. 1994. Vol. 191. № 1. P. 171-181

189. Surek В., Melkonian M. CCAC Culture collection of algae at the University of Cologne: a new collection of axenic algae with emphasis on flagellates // Nova Hedwigia. 2004. Vol. 79:77-91.

190. Surek В., Sengbusch P. The localization of galactosyl residues and lectin receptors in the mucilage and the cell walls of Cosmocladium saxonicum (Desmidiaceae) by means of fluorescent probes//Protoplasma. 1981. Vol. 108. № 1. P. 149-161.

191. Suzuki Y., Glazko G. V., Nei M. Overcredibility of molecular phylogenies obtained by Bayesian phylogenetics // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. Vol. 99. P. 16138-16143.

192. Swofford D.L. 2002. PAUP* Phylogenetic analysis using parsimony (and other methods). Beta version 10. Sunderland: Sinauer Associates.

193. Tamura K., Nei M. Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees // Mol. Biol. Evol. 1993. Vol. 10. P. 512-526.

194. Tappan H. The paleobotany of plant protists. NY: Freeman, 1980. - 1028 p.

195. Teiling E. Staurastrum planctonicum and S. pingue. A study of planktic evolution // Svensk. Bot. Tidsk. 1947. Vol. 41. P. 218-34.

196. Teiling E. Staurodesmus, genus novum -containing monospinous desmids // Bot. Not. 1948. Vol. 101. P. 49-83.

197. Teiling E. Radiation of desmids, its origin and its consequences as regards taxonomy and nomenclature // Bot. Not. 1950. Vol. 103, № 2. P. 299-327.

198. Teiling E. Evolutionary studies on the shape of the cell and the cloroplasts in Desmids // Bot. Not. 1952. Vol. 105, № 3. P. 214-306.

199. Teiling E. Actinotaenium, genus Desmidiacearum resuscitatum // Bot. Not. 1954. Vol. 107. P. 376-426.

200. Teiling E. Morphological investigations of symmetry in desmids // Bot. Not. 1957. Vol. 110. P. 49-82.

201. Teiling E. The genus Staurodesmus II Ark. Bot., Ser 2, 1967. Vol. 6. P. 467-629

202. Transeau E.N. The Zygnemataceae. Columbus: Ohio State University Press, 1951. -327 p.

203. Transeau E.N. The genera of the Zygnemataceae // Trans. Amer. Microsc. Soc., 1934. Vol. 53. P. 201-207.

204. Turmel M, Ehara M., Otis C., Lemieux C. Phylogenetic relationships among strepto-phytes as inferred from chloroplast small and large subunit rRNA gene sequences // J. Phycol. 2002a. Vol. 38. P. 364-375.

205. Turmel M, Otis M., Lemieux C. The mitochondrial genome of Chara vulgaris: insights into the mitochondrial DNA architecture of the last common ancestor of green algae and land plants // Plant Cell 2003. Vol. 15. P. 1888-1903.

206. Waddell P.J., Kishino H., Ota R. A phylogenetic foundation for comparative mammalian genomics// Genome Informatics Series. 2001. Vol. 12. P. 141-155;

207. Wallich G. C. Description of Desmidiaceae from Lower Bengal // Ann. Mag. Nat. Hist., Ill, I860. Vol. 5. P. 184-197.

208. Watanabe M:M., Kawachi M., Hiroki M., Kasai F. NIES-Colletion. List of strains. Sixth edition. Microalgae and protozoa. Tsukuba: NEES, 2000. - 140 p.

209. Wawrik F. Neue Algen aus den Grundwasserweihern bei Kienberg-Gaming, N-Osterreich // Osterr. Bot. Zeitschr. 1949. Vol. 96. P. 1-4.

210. West G.S. Algae. Vol. I. -Cambridge: Cambridge University Press. 1916. 473 pp.

211. West G.S., Fritsch F.E. A treatise on the British freshwater algae. 2nd ed. Cambridge: Cambridge University Press, 1927. - 534 p.

212. West W., West G.S. On some new and interesting freshwater algae // J. Roy. Mi-crosc. Soc. London 1896. P. 149-165.

213. West W., West G.S. Welwitsch's African freshwater algae // J. Bot. 1897. Vol. 35. P. 1-7, 33-42, 77-89, 113-183, 235-243, 264-272, 297-332.

214. West W., West G.S. A monograph of the British Desmidiaceae. Vol. 1. London: Ray Soc., 1904.-224 p.

215. West W., West G.S. A Monograph of the British Desmidiaceae. Vol. 4. London: Ray Soc., 1912.-191 p.

216. West W., West G.S. Carter N. A Monograph of the British Desmidiaceae. Vol. 5. -London: Ray Soc., 1923. 300 p.

217. Wettstein R. Handbuch der Systematischen Botanik. Vol. 4. Leipzig, 1901. - 1152 pp.

218. Weyland H. Zwei neue Algeri aus der Braunkohle von Baccinello (Toscana) // Plaeontographica, B. 1963. Vol. 113. P. 30-37.

219. Wilcox L.W., Fuerst P. A., Floyd G.L. Phylogenetic relationships of four charophy-cean green algae inferred from complete nuclear-encoded small subunit rRNA gene sequences //Am. J. Bot. 1993. Vol. 80. P. 1028-1033

220. Wilcox T.P., Zwickl D.J., Heath T.A., Hillis D. M. Phylogenetic relationships of the dwarf boas and a comparison of Bayesian and bootstrap measures of phylogenetic support// Mol. Phylog. Evol. 2002. Vol. 25. P. 361-371.

221. Wille N. Bidrag til Sydamerikas Algflora. I-III // Bih. Kongl. Svenska Vet.-Akad. Handl. 1884 Vol. 8. P. 1-64.

222. Wille N. Desmidiaceae // Die Natiirlichen Pflazenfamilien / A. Engler, E. Prantl .Leipzig: W. Engelmann, 1890. P. 1-16.

223. Wittrock V.B. Om Gotlands och Olands Sotvattens-alger// Bih. Kongl. Svenska Vet.-Akad. Handl., Afd. 3. 1872. Vol. 1. № 1. P. 1-72.

224. Woese C.R., Winker S., Gutell R.R. Architecture of ribosomal RNA: constrains on the sequence of "tetra-loops"//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. Vol. 87. P. 8467-8471.

225. Wuyts J., Van de Peer Y., De Wachter R. Distribution of substitution rates and location of insertion sites in the tertiary structure of ribosomal RNA // Nucleic Acids Res. 2001. Vol. 29. № 24. P. 5017-5028.

226. Yamagishi T. Classification of the Zygnemataceae // Sci. Rep. Tokyo Kyoiku Dai-gaku, B. 1963. Vol. 11. P. 191-210.

227. Yang Z. 1996. Maximum-likelihood models for combined analyses of multiple sequence data. J//Mol. Evol. Vol. 42. 587-596.