Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фибрин-полимерные сетки, математическое моделирование и экспериментальные исследования

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Фибрин-полимерные сетки, математическое моделирование и экспериментальные исследования"

На правах рукописи

иМ)

Николаев Андрей Владимирович

ФИБРИН-ПОЛИМЕРНЫЕ СЕТКИ, МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Специальность 03.00.02 Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 2009

003479228

Работа выполнена в отделе строения вещества учреждения Российской Академии Наук Институт химической физики им. H.H. Семенова РАН Научные руководители: доктор физико-математических наук,

профессор Лобанов Алексей Иванович доктор физико-математических наук Буравцев Владимир Николаевич Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

доцент Мухин Сергей Иванович

доктор физико-математических наук, доцент Смолянинов Владимир Владимирович Ведущая организация: Государственное учреждение Гематологический

научный центр Российской Академии Медицинских Наук

Защита состоится 22 октября 2009 г. в 17:30 на заседании Диссертационного совета Д 501.002.11 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992, г. Москва, Ленинские горы, МГУ, Физический факультет, аудитория 5-19.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Физического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «_)_£_» 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 501.002.11, доктор физико-математических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Процессы, протекающие при свертывании крови, и их взаимное влияние еще до конца не описаны. Выделяют первичный и вторичный гемостаз1,2. Первичный представляет собой формирование тромбоцитами рыхлой пробки в месте повреждения сосудистого русла. Вторичным гемостазом (или плазменным звеном) называют сложный многостадийный процесс в плазме крови, приводящий к формированию фибрин-полимера (далее ф.-п.) и геля на его основе. Образование ф.-п. геля, эффективно изменяющее форму сосудистого русла, и гидродинамические факторы наряду с биохимическими реакциями плазменного звена гемостаза играют существенную роль в процессе свертывания. По сути, плазменное звено системы свертывания крови (ССК) — это сложная система с одновременно протекающими процессами реакции и диффузии в потоке вязкой жидкости в реакторе, форма которого изменяется в зависимости от истории реакции. Из-за сложности этой системы до сих пор не существует полных моделей ее функционирования. Для различных целей успешно строятся огрубленные3, зачастую феноменологические модели ССК и процесса образования ф.-п4. Относительно недавно появился ряд математических моделей с детальным описанием биохимических процессов плазменного звена ССК, верифицированных по большому числу экспериментальных данных и использующих экспериментально измеренные константы5. В то же время, общей модели полимеризации фибрина, учитывающей желирова-ние, еще не создано. Это значительно затрудняет создание общих моделей ССК, описывающих взаимное влияние процессов образования ф.-п. и потока крови. Заметим, что построение даже упрощенных моделей плазменного звена ССК оказывается весьма полезным, так как неотъемлемой частью моделирования является математическая формализация описания предлагаемых гипотез. В свою очередь, эксперименты, поставленные для проверки допущений моделей, позволяют развить и дополнять последние.

В данной работе проведена проверка допущений упрощенной модели полимеризации фибрина и приближения нулевых конвективных потоков внутри ф.-п. сгустка.

' Балуда В.П. и др. —М: Медицина, 1995.—244С.

3 Stassen J.M. et al.// Curr. Med. Chem.—2004,—v. 17 — p.2245-2260 3AnandM. etaU/J Theoret Med—2003,— v.5.—p. 183-218..

4 Weisel J.W. et al.// Biophys J.—1992.—v.63.—p.l 11-128

5 Panteleev M. A. et al.// Biophys J.—2006,—v.90 — p. 1489-1500.

Цель исследования

Описать физико-химические механизмы влияния структуры фибрин-полимерного сгустка на фильтрацию внутри него. Выяснить допустимость использования упрощенной модели полимеризации фибрина и приближения нулевых фильтрационных потоков внутри фибрин-полимера для математического моделирования плазменного звена гемостаза и эволюции фибринового сгустка в сдвиговом потоке.

Задачи исследования

1. Произвести анализ математической модели типа реакция-диффузия-конвекция на основе двухавтоволновой модели плазменного звена гемостаза в потоке жидкости с малыми скоростями (<1 см/сек) методом подобия и размерности.

2. Создать и реализовать алгоритм решения уравнений данной модели, учитывающий обратное влияние ф.-п. сгустка на поток жидкости в приближении нулевых конвективных потоков внутри сгустка.

3. Экспериментально исследовать возможность накопления на фибрин-полимерной сетке альбуминов в количествах, сопоставимых с массой фибрина и возможное влияние этого процесса на проницаемость фибриновых сгустков.

4. Средствами сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) высокого разрешения определить структуру зрелых фибрин-полимерньос. сгустков, сформированных из плазмы доноров с гиподисфибриногенемией Марбург, и сравнить их со структурой нормальных сгустков. Фибрин Марбург выбран для сравнения как предельный случай фибрин-полимера, у которого предположительно полностью отсутствует одна из фаз полимеризации — латеральная агрегация.

5. Оценить применимость закона Дарси для вычисления проницаемости фибрин-полимерных сгустков на основе представления о микровязкосги и сравнения с экспериментальными данными.

Научная новизна

Построена математическая модель эволюции ф.-п. сгустка в потоке жидкости с малыми скоростями (< 1 см/сек) на основе двухавтоволновой модели плазменного звена гемостаза и упрощенной модели полимеризации в приближении нулевых фильтрационных потоков внутри ф.-п. Произведен анализ модели методом подобия и размерности. Создан программный комплекс, реализовывающий алгоритм расчета данной модели. На

основании результатов моделирования и теоретических расчетов по двухавтоволновой модели показано, что запуск автоволны активатора происходит в диапазоне скоростей движения жидкости, соответствующего параметрам течений внутри ф.-п. сгустка, а не в просвете сосуда Для параболического профиля скоростей жидкости аналитически выделены характерные зоны течения, закономерности развития процессов в которых качественно отличаются. На основе представления о микровязкости теоретически обоснована связь между свойствами ф.-п. (полной длиной фибров) и его коэффициентом проницаемости Дарси. Экспериментально показано, что альбумин не накашивается на сформированной ф.-п. сетке в количествах, сопоставимых с массой самого фибрина, а потому не может играть существенной роли в процессах фильтрации плазмы через ф.-п. сгусток. Средствами СЭМ высокого разрешения исследован мутантный фибрин Мар-бург. Показано, что фибры мутантного ф.-п. Марбург состоят из единичных фибрилл, не агрегировавших латерально. Это позволяет считать его предельным случаем ф.-п. с наименьшей проницаемостью. На основе представления о микровязкости показано, что структура мутантного ф.-п. Марбург не будет мешать процессу диффузии крупных белковых молекул. Предложены критерии для построения модели полимеризации фибрина, которые позволят использовать соответствующую им модель для корректных количественных расчетов процессов плазменного звена гемостаза и эволюции ф.-п. сгустка в сдвиговых потоках.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Для описания движения жидкости внутри фибрин-полимерного сгустка с малыми скоростями (<1 см/сек) справедлив эмпирический закон Дарси. Коэффициент проницаемости Дарси фибрин-полимерного сгустка зависит от суммарной длины фибров в единице объема.

2. Альбумин не накапливается на сформированной фибрин-полимерной сетке в количествах, сопоставимых с массой самого фибрина, и на проницаемость сформированного фибрин-полимерного сгустка влияния не оказывает.

3. Фибры мутантного фибрин-полимера Марбург состоят из единичных фибрилл не агрегировавших латерально.

4. Согласно двухавтоволновой модели диапазон скоростей сдвига, в котором возможен запуск автоволны активатора (|/| <8,9мтГ'), соответствует параметрам

фильтрационных течений внутри сгустка (|г|т„ ~ 3,1-10 1 -ь 2,9 мин '), а не в просвете сосуда

5. Для построения количественной модели плазменного звена гемостаза и эволюции фибрин-полимерного сгустка в сдвиговом потоке необходимо использовать описание полимеризации фибрина, учитывающее длину фибров в единице объема. Это сделает возможным рассчитывать проницаемость сгустка

Теоретическая и практическая ценность

Современные модели ССК строятся на базе детальных знаний о биохимии взаимодействий факторов свертывания. Процесс полимеризации самого конечного продукта реакций ССК — фибрина — в них учитывается в упрощенном виде. Такой подход безусловно оправдан с методической точки зрения и тем, что до относительно недавнего времени модели строились для систем с отсутствующими потоками жидкости. В то же время, основной задачей ССК в организме является локализация повреждений сосудистого русла и подавление потоков крови путем образования непроницаемых преград. Естественно, что при моделировании ССК в присутствии потока нужно учитывать как влияние потока на реакцию, так и обратное влияние продуктов реакции, в том числе и ф.-п. геля, на поток. С этой точки зрения вопросы о взаимодействии потока и ф.-п. геля имеют большое значение. Согласно современным представлениям процесс полимеризации фибрина состоит из нескольких этапов. Показано, что этот процесс зависит не только от структуры полимеризующегося фибрина, но и от кинетики наработки фибрин-мономера Поэтому полная модель такого процесса может быть вопросом достаточно далекого будущего. Построение промежуточной модели полимеризации, хорошо описывающей только ключевые для взаимодействия с потоком параметры ф.-п., может оказаться гораздо проще и дать полезные результаты для моделирования ССК. На наш взгляд работа направленная на выделение таких ключевых параметров ф.-п. имеет важное значение для создания уточненных моделей ССК.

Апробация и публикации

По теме работы было опубликовано 6 печатных работ, включая 4 статьи и 2 тезиса докладов. В т.ч. 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.

Апробация работы прошла 23 апреля 2009 года на заседании секции №5 ученого совета ИХФРАН.

Материалы работы были представлены на международной конференции "Критерии самоорганизации в физических, химических и биологических системах" (Суздаль, 1995), школе по современной нейтронографии НИИЯФ МГУ (зимняя, Дубна 2004), ХЬУШ конференции МФТИ, секция биофизики и физики живых систем (Долгопрудный, 2005), научном семинаре кафедры биофизики биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова (2006), научных семинарах лаборатории физической биохимии системы крови ГНЦ РАМН (Москва, 2006-2008), научных семинарах в лаборатории биофизики отдела строения вещества в ИХФ РАН (Москва 2006-2008).

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 125 страницах, иллюстрирована 34 рисунками и 5 таблицами. Работа состоит из введения, и трех глав (обзора литературы, математического моделирования работы плазменного звена системы свертывания и роста фибриновош сгустка в потоке, экспериментов по определению свойств ф.-п. сеток), заключения, выводов, списка литературы, включающего 305 отечественных и зарубежных источников, а также 5 приложений с описанием расчетов.

Личный вклад автора

Диссертационная работа является результатом исследований, выполненных автором на протяжении 10 лет. В исследованиях по проницаемости ф.-п. сгустка, электронной микроскопии фибрина Марбург и нормального фибрина автор выполнял большую часть объема работ на всех этапах — сбор и анализ первичной информации, выполнение экспериментов, обработка и интерпретация полученных данных, подготовка публикаций. В исследовании по математическому моделированию активации плазменного звена гемостаза и росту фибринового сгустка в потоке автор выполнял работы по проектированию и реализации блока программного комплекса для решения уравнений реакция-диффузия-конвекция и стыковке этой части с блоком расчета течений жидкости, проведению тестовых расчетов, анализу результатов. Автор провел анализ системы уравнений методами подобия и размерности, опубликованный позднее.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы

В первой главе кратко излагаются современные представления о ССК. Особое внимание уделено источникам с описанием плазменного звена гемостаза как каскадного саморегу-

лирующегося автокаталитического процесса Проанализированы публикации о строении молекулы фибриногена6'7, полимеризации фибриногена, структуре ф.-п.8, экспериментальных методах изучения свойств ф.-п., желировании ф.-п.9 Рассмотрены математические модели плазменного звена гемостаза

На основе литературных источников показано, что плазма крови обладает уникальным набором свойств, позволяющем говорить о ней как об активной среде нового типа — с активным восстановлением10. Существуют как феноменологические модели плазменного звена ССК, так и редуцированные", с различной степенью детализации описания каскада биохимических реакций. При численном исследовании феноменологических моделей ССК выявлено наличие решений, существенно зависящих от интегральной величины начальною возмущения12. Также показана чувствительность процессов автоволновой природы в околопороговых состояниях к свойствам среды13. Биохимия плазменного звена гемостаза детально изучена и описана, в отличие от процесса полимеризации фибрина Из-за многосгадийности этого процесса его математическое описание представляет серьезную проблему. На современном этапе не существует цельной модели возникновения ф.-п. сгустка В то же время свойства ф.-п. сгустка сильно отличаются от свойств жидкой плазмы.

При рассмотрении литературных данных о свойствах ф.-п. сеток автором проводится уточнение известной эмпирической формулы для коэффициента проницаемости Дарси ф.-п. сгустка Используя понятие микровязкости, автором получено выражение для проницаемости без эмпирических коэффициентов. Также автором показано, что в общем случае связь между оптической плотностью и проницаемостью полидисперсной ф.-п. сетки может быть получена только при наличии информации о распределении диаметров фибров сетки.

На основании обзора делается вывод о том, что для построения уточненных моделей ССК естественным требованием является учет взаимодействия процессов конвекции, реакции и диффузии с растущим ф.-п. сгустком.

6 Weisel J.W.//Adv Protein Chem.—2005,—v.70.—р.247-299.

1 Mosesson M.W.//J Thromb Haemost.—2005 —v.3—№8.—p.1894-1904.

8 Ferri F. et at.// Phys Rev E—2001.—v.63.—p.031401 -1 -031401 -17.

® Hantgan R.R. et al.// J Biol Chem.—1979.—v.254.—№22—p.l 1272-11281.

10 Атауллаханов Ф.И. и др.// Биофизика.—1994,—Т.39.—С.89-96.

" Zamitsina V.l. et al.// Thrombosis Research.—1996.—v.84,— p.225-236.

12 Лобанов А.И. и др.// Математическое моделирование.—1997.—Т.9.—С. 83-95.

" Попцова М.С. и др.// Биофизика,— 2003,— T.48.—С. 1116-1122.

Глава 2. Математическое моделирование работы плазменного звена гемостаза и роста фибрннового сгустка в потоке

В данной главе описана разработанная с участием автора математическая модель роста ф.-п. сгустка в потоке. Целью построения данной модели являлось рассмотрение развития процессов плазменного звена гемостаза и образования ф.-п. сгустка в потоке вязкой несжимаемой жидкости рядом с поврежденной сосудистой стенкой. Рассматривались условия запуска автоволны активатора в пристеночной области или разрушения надпорогового возмущения сдвиговым потоком.

Уравнения математической модели. Для описания биохимических процессов использована двуавтоволновая феноменологическая модель (ДАФМ)14, дополненная членами, описывающими адвективный перенос. Процесс желирования фибрина, как и в оригинальной ДАФМ, принят мгновенным по достижении пороговой концентрации фибрина-мономера ц/ = 1//е. Сам фибрин считается неподвижно закрепленным в месте образования. Потоки внутри ф.-п. сгустка полагаются нулевыми. Напротив, диффузия реагентов в сгустке считается такой же, как и в остальном объеме.

Рассматривается формирование сгустка в плоском канале с твердыми стенками длиной £т, шириной и перепадом давления на концах АР. Размер канала по третьей оси принимается равным бесконечности, что ведет к двумерной постановке задачи. В начальный момент времени течение описывается стационарными уравнениями Навье-Стокса для несжимаемой жидкости с условием прилипания на стенках канала и на границе сгустка:

АуУ=0, (УУ)У = -—У/> + иДУ, Р

где V — поле скоростей движения жидкости, и — кинематическая вязкость, р — плотность, Р — давление. Профиль скоростей жидкости в канале в начальный момент времени дается формулой Пуайзеля:

При повреждении сосудистой стенки кровь приходит в контакт с клетками, на мембранах которых есть тканевой фактор, чем запускается внешний путь свертывания. Поскольку ДАФМ не учитывает детальную схему каскадов ССК, то в рамках модели можно считать,

14 Атауллаханов Ф.И. и др.// Биофизика,—1994,—'Г.39,— вып. I,— С.97-104.

что вплотную с поврежденной поверхностью в канале мгновенно формируется область с размерами Ах х Ау и концентрацией активатора Ат. Изменение поля скоростей у) в результате роста сгустка описывается в квазиставдонарном приближении, т.к. предполагается что вязкая релаксация поля скоростей происходит много быстрее, чем развитие биохимических процессов. Таким образом система уравнений модели примет вид:

Р

3/ ' в+в„ '

1+

■Хг <Р>

л

где в(г/) — концентрация активатора (тромбин), <р(г,1) — концентрация ингибитора (предположительно активированного протеина С), £>, и О,— коэффициенты диффузии, и Хг—коэффициенты пассивных утечек, а и р—константы, определяющие скорости наработки тромбина и ингибитора, у — скорость инактивации тромбина ингибитором, к — константа скорости наработки фибрина при избыточной концентрации фибриногена (положена равной единице). Значения параметров модели приведены в таблице 1. Величины большинства из них совпадают со значениями из первой публикации по ДАФМ и соответствуют режиму, в котором надпороговое возмущение приводит к образованию одиночного локализованного ф.-п. сгустка Геометрические параметры сосудов, приведенные в таблице 4, соответствуют венулам и артериолам15.

а, мин 1 3, мин"1 у, мин 1нМ 1 ео,нм Фо, нМ

2,0 0,0015 5,0 5,0 0,05

С,нМ Х.ь мин 1 Хз, мин"' £)(, см"/мин £>2, СМ"/МИН

5,0 0,05 0,35 6-Ю"4 6-10^

чЛ нМ А, мин"1 А„, нМ Дх, мм Ау, мм

45 1,0 10 0,06 0,03

V, см МИН /.„ мм мм ДРтт, г-см~'мин 2 АР,,,,,,, г см 'мин"2

1,2 2,4 0,3 5 170

Таблица 1. Значения параметров, используемых в модели. Большинство параметров, используемых в МС, имеют те же значения. А1'п,„, и ЛР„пх указывают диапазон постоянного перепада давления на границах канала, используемый в расчетах. Соответствующие начальные скорости плазмы в центре канала У= 1,9510'+6,64-10"2 см/мин, а число Рейнольдса 10 10 \

15 Каро К. и др.—М.:Мир,1981,—624С.

Использовалась следующая схема перехода к безразмерным переменным:

"к

сс ~ О

<р = <?0-ф,С = %-С ,а. = а-х, ,у = у- — = ,

% Ща.)

Ьу, <х± УкЬ л2 г о У в > ^ и

где Ре — число Пекле, Оа — число Дамкелера, Ие— число Рейнольдса. Числа Ре и Оа являются независимыми параметрами. Анализ того, как от их значения будет зависеть поведение системы (1), представляет определенный интерес.

УЯ 1

СКуУ = 0, (У-У)У =—-+—ДУ, 1 > р Ке

г!Й 1

— = — Д0-УУ0+Оа 51 Ре

V V / (1)

= Оа ■ кв.

81

Рекционно-диффузионная система обладает своими характерными масштабами скорости У. = и длины Ь. = ^[Б[а. 16. Очевидно, что дая эффективной борьбы с гидродинамическим потоком, необходимо чтобы У. и V^ были сопоставимы. По предложению Г. Т. Гурия был введен безразмерный параметр Си = У,,/У. ■ Несложно убедиться, что

Г^Г К£ I а.Ь а.ь/Б . Ь

ви = , —= * = ви , Оа =—- =—= (2)

V Оа О о/а. и V, У,,4Ъ £.

Из (2) можно сделать вывод, что при фиксированных параметрах кинетики и геометрии системы, основным управляющим фактором будет выступать отношение скоростей химической автоволны активатора к максимальной гидродинамической скорости потока (Си"1). В представленных экспериментах ви менялось в диапазоне от 0,56 до 19 .

Одной из альтернативных форм записи числа Пекле является В = у/г^ ,

где = £>/Гг, а у — скорость сдвига. В канале с пуайзелевым профилем скоростей

16 Романовский Ю.М. и др.—М.:Наука,1984,—304С.

наибольшая скорость сдвига будет рядом со стенками, а по направле-

нию к центру канала у будет уменьшаться вплоть до нуля. Положив г(усо„)/^ж = ¡можно указать зону шириной 4К|Ш,Ч.)1", в которой

процессы диффузии будут превалировать над процессами адвекции. Или в безразмерном виде = = . Назовем такую зону «диффузионным ядром

потока». Оценки для при параметрах из таблицы 1 дают значения до 0,09 мм (^„./¿,=0,3). Таким образом, наличие сдвигового потока в канале, не влияет на события в его центральной (до 30% ширины) зоне до возникновения существенного количества ф.-п.

Методы исследования математической модели. Система уравнений модели (1) решалась численно методом расщепления по физическим процессам17. Для решения стационарных уравнений Навье-Стокса в области фиксированной геометрии применялась аппроксимация на разнесенной сетке: давление считалось в центрах ячеек, а скорости соотносились к серединам соответствующих ребер. Полученная система решалась методом простой итерации.18 Для решения уравнений реакция-диффузия-конвекция применялась неявная разностная схема первого порядка аппроксимации по пространственным переменным. Основными расчетными величинами являлись полные потоки веществ, относившиеся к серединам соответствующих граней. Для аппроксимации переносных слагаемых использовались разности «против потока». Ввиду того, что кинетическая часть системы является жесткой, первая итерация распределения активатора и ингибитора находилась из решения в каждой ячейке системы ОДУ однократно диагонально-неявным А-устойчивым методом Рунге-Кутты второго порядка аппроксимации19.

Наконец, на каждом шаге по времени решалось уравнение, описывающее производство фибрин-полимера. Если из-за роста сгустка менялась форма доступной течению области, то поле скоростей вновь определялось путем решения стационарных уравнений Навье-Стокса. А за начальное приближение для метода итераций бралось поле скоростей с предыдущего шага.

17 Кобельков Г.М. // Вычислительные процессы и системы. Вып. 8.— М :Наука, 1991—С.204-236

18 Фаворский А.П. // Современные проблемы математической физики и вычислительной математики.— М. :Наука,!982.—С. 312-320.

19 Хайрер Э. и др.—М.:Мир,!990,—512С.

Результаты и обсуждение. Проведенные расчеты показали наличие трех принципиально различных сценариев развития событий — возникновение локализованного сгустка, возникновение множественного сгустка, подавления реакции свертывания сдвиговым потоком путем разрушения зоны надпорогового возмущения. Представленная на рис. 1 параметрическая плоскость (А„„ Е1е) делится на три фрагмента соответствующих упомянутым сценариям. Фактически, наличие потока сдвигает порог активации свертывания (1-.о = /(а ~ )= 128, по таблице 1) даже при малых скоростях.

50

кМ 15

Рис. I. Разбиение параметрической плоскости (Ке, Ап<) (Яе варьировалось с помощью изменения АР) на области, с различным сценариям развития пристеночных сгустков. Область I — отсутствие свертывания из-за разрушения зоны начального закритического возбуждения сдвиговым потоком. Область II — множественное образование сгустков. Область III — образование локализованного сгустка. Кривая (а) соответствует границе локализованный-множественный сгусток, кривая (Ь) — границе свертывания-подавление свертывания сдвиговым потоком.

На рис. 2 приведены два сценария образования ф.-п. сгустков, соответствующих ДР = 5 г см~' мин'2 и ДР =12 г-см~'-мин~2. При АР = 5 г см_1мин~2 скорость на входе сосуда составляла Кпих= 1,95-10"3 см/мин (Ие = 4,9-1 (X5, Рс= 10, Оа=31, Си = 0,56, =2,6-10'' мин"1). В этом случае зона запорогового возбуждения активатора инициирует рост локализованного вокруг повреждения сгустка Остатки активатора с подпороговой концентрацией уносятся потоком и реакция прекращается. При повышении разницы давлений до АР = 12 г-см~'мин~2 (Утя = 4,69-10~3 см/мин, Ие=1,17-10Л Ре = 23, Эа= 13, Си=1,34, |г|т1Ч=6,3-Ю"1 мин"1) наблюдается другой

сценарий. До 24 минуты он очень схож со сценарием при ДР = 5 г-см"'-мин~2. Примерно за то же время вокруг зоны повреждения возникает локализованный сгусток. Однако, остатки активатора, унесенные потоком, очевидно, попадают в диффузионное ядро течения в запороговой концентрации. В результате происходит вспышка реакции по центру канала на 1 мм ниже по течению от зоны повреждения, что приводит к формированию там перекрывающего просвет сгустка. При разнице давлений свыше 170 г-см~'-мин~2 =6,64-10"2см/мин, Яе=1,7-10~3, 0а = 0,92 , Си = 19, |/|т^=8,9 мин"') процесс свертывания подавляется гидродинамическим потоком и образования сгустка не наблюдается.

Рис.2. Слева — АР - 5 г-см ' мин Сценарий развития сгустка, локализованного вокруг места повреждения. Справа — ЛР - 12 г-см '-мин Сценарий «убежавшей» "¡акритической зоны активатора, приводящей к окклюзии канала 1 мм ниже по течению.

Рассмотрим вопрос о границе режимов тромбообразование — подавление свертывания сдвиговым потоком. Поскольку конвективное число Дамкелера (Оас1)ет =г/у) обладает свойством «точечности» и не привязано явно ни какому размеру, то в различных местах канала это число будет строго говоря своим. Т.к. химическая кинетика г не зависит от гидродинамического потока с малыми характерными скоростями, то наименьшее число Дамкелера будет там, где модуль сдвига И.™ = ^а/Х максимален. В нашем случае в начале процесса число Дамкелера будет наименьшим в пристеночных областях Оат1п = г - £„/41^. Как уже подчеркивалось выше, свертывание в потоке возможно, когда скорость реакции г превалирует (Оа> 1). Используя ДАФМ можно записать выражение для г = —Х\ в

точке пространства, где в = А„„ <р~ 0. Используя выражение для Оа|П]П > 1, получим оценку для начального момента времени: —/[-|/|>0. Из этой оценки,

Ат

вытекает условие на зависимость порога активации от модуля локальной скорости сдвига |/|:

шу-ЩЧ,- (3)

«-(*,+и)

Сопоставление (3) с данными таблицы 1 показывает, что даже при малых 11е = 4,9-1(Г5 (Кгах= 1,95-Ю"3 см/мин, |у|тх = 0,2б мшГ1,^ =0,05 мин'1) сдвиг будет играть доминирующую роль при определении порога активации в пристеночной области — вл0,92 нМ против 0,128 нМ. Эта зависимость качест-

венно объясняет ветвь Ь на рис. 1 при малых числах Рейнольдса. Формальная оценка по формуле (3) приводит к тому, что порог вл (|/|) обращается в бесконечность при условии а = +|/|). Определенный биологический смысл имеет условие активации реакции в той же макроточке размером в которой был расположен начальный стимул. Такой сценарий возможен когда сумма скоростей распада и конвективного переноса активатора меньше, чем скорость его автокаталитической генерации. Однако возможна ситуация, когда конвекция сдвинет зону запорогового возмущения и вспышка произойдет немного ниже по течению, но образовавшийся ф,-п. сгусток накроет исходное повреждение.

Множественные сгустки возникают тогда, когда сдвиговый поток и диффузия способны создать зону запорогового возмущения достаточно далеко, чтобы последующая вспышка ингибитора не могла достичь ее.

Глава 3. Эксперименты по определению свойств фибрин-полимерных сеток Экспериментальное исследование проницаемости фибрин-полимерного сгустка в присутствии альбумина. Основным результатом работы системы свертывания является формирование твердого тромба в месте повреждения сосуда. Тромб противостоит гидродинамическому потоку и предотвращает потерю крови из сосуда. Он состоит из тромбоцитов, других клеток крови и ф.-п. сетки. В физиологической норме концентрация тромбоцитов составляет 300 тыс. шт./мм3, концентрация фибриногена 1,4 + 4 мг/мл, а удельная длина волокон ф.-п. сгустка при полимеризации всего фибриногена /ф = 0,44 + 1,26-108 см~2 (или -108 см в 1 мл). Для понимания относительной эффективности ф.-п. сетки и клеточного агрегата полезно провести оценку коэффициентов проницаемости Дарси ф.-п. сгустка и модели тромбоцитарного тромба, сформировавшихся из одного объема плазмы. При малых скоростях (и < 1 см/с) потока проницаемость

1 1п(3.70-У/ЯИ)

монодисперснои ф.-п. сетки будет выражаться как кг„ =--5-где К—

" 4л /ф

радиус фибра ф.-п. сетки (порядка 50 4- 70 нм в норме). В качестве модели тромбоци-тарного тромба возьмем закрепленные равномерно по объему в узлах кубической решетгки сферы диаметром ¿/р1 =3-10"6м. Используя формулу Стокса, можно получить оценку для коэффициента Дарси такого тромба как к^ = 1Дзл-^р|Ср|). При физиологической норме оценки дают кф = 1 дарси, a ip[ ~ 110 дарси. Конечно,

данные оценки являются грубыми, и не учитывают, например, накопление в тромбе тромбоцитов, приносимых потоком.

Помимо фибриногена плазма крови содержит большие количества других белков, в частности альбумина. Его концентрация в норме составляет примерно 35-55 мг/мл, т.е. она превосходит массовую концентрацию фибриногена (4 мг/мл) в 8-14 раз. Существует большое количество экспериментальных свидетельств нековалентного взаимодействия фибриногена с альбумином20. Если благодаря нековалентным взаимодействиям ф.-п. сетка связывает альбумин в количествах сопоставимых или превосходящих массу самой сетки, то это должно существенным образом влиять на динамику роста сопротивления сетки потоку и ее механические свойства. Материалы. В работе использовалась донорская плазма, заготовленная на стандартном цитратном антикоагулянте на станции переливания крови ГУ ГНЦ РАМН. Концентрации белков измерялись биуретовым методом. Концентрация общего белка в плазме составляла 74±3 мг/мл. В работе были использованы также растворы 10% альбумина человека (фирма «Биофарма», Киев, Украина), который перед использованием разбавляли до 5% буферным раствором, содержащим 0,01 М HEPES и 0,15 М NaCl (pH 7,35), 1% раствор бычьего гемоглобина, L-динитрофенилаланин (Serva, США), 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин-2-этаносульфоновая кислота (HEPES) фирмы Fisher Biotech (Fair Lawn), CaCi2 (Sigma) и NaCl (осч) («Реахим», Россия). Формирование фибринового сгустка. Сгустки, свойства которых (проницаемость и способность сорбировать альбумин) изучались, были предобразованы из плазмы путем ее рекальцификации. При этом к 2,5 мл плазмы добавляли 50 мкл 1 М раствора СаС12 (конечная концентрация добавленного СаС12 составляла 19,6 мМ). Затем плазму перемешивали в течение 10 секунд и 2 мл аккуратно переносили в стеклянную колонку (d = 5,6 мм, длина = 22 см, сделана из стеклянной пипетки), в которой

20 London М.//Clinical Biochemistry.— 1997.—v.30.—р.83-89.

происходил процесс свертывания. Для фиксации сгустка в колонке, ее нижний конец был затянут капроновой сеткой, которая была укреплена на трубке липкой лентой, а поверх этого пленкой Parafilm (Sigma). В результате в колонке формировался фибри-новый сгусток высотой примерно 8 см. Сгусток выдерживали в колонке 3-4 часа после начала процесса коагуляции. После полного свертывания плазмы пленку парафильм удаляли и систему использовали подобно хроматографической колонке (Рис. 3). Перед началом эксперимента сгусток промывали 6-8 мл буфера Высоту столба буфера над верхней границей сгустка поддерживали постоянной (L= 10 ±0,5 см) с помощью перистальтического насоса. Суммарная высота сгустка и раствора над ним составляла hp= 18 см. В пробах элюата определялся белок. После промывки сгустка 5 мл буфера общий белок в элюате составлял менее 0,1 мг/мл. Отмытые сгустки использовали в экспериментах по измерению их проницаемости или сорбции на них альбумина из растворов.

Определение массы фибриновых сгустков. В отдельных экспериментах была определена масса сформированных и промытых фибриновых сгустков. Для этого сгустки (в объеме 2 мл вместе с объемом окружающего буфера) были перенесены в 2 мл раствора 0,4 М NaOH и растворялись в течение 12 часов при 37 °С. В полученном растворе была измерена концентрация белка, после чего была рассчитана общая масса белка в растворенном сгустке.

Измерение проницаемости фибриновых сгустков. Для измерения проницаемости фибриновых сгустков, ф.-п. сгустки, промытые буферным раствором, использовались как неподвижная фаза хроматографической колонки. По 0,1 мл растворов 5% альбумина или 1% гемоглобина, а также 1% раствора низкомолекулярного L-динитрофенилаланина, использованного как маркер хромагографического фронта, в буфере наносили шприцем с длинной иглой непосредственно на верхнюю границу

Q(t)

Рис. 3. Схема установки для проведения экспериментов по определению проницаемости фибриновых сгустков: I — стеклянная трубка (внутренний диаметр 5,6 мм); 2 — сформированный сгусток (объем 2 мл, высота Ис — 8 см); 3 — капроновая сетка, поддержи ваюшая сгусток; 4 — резервуар для сбора проб; 5 — резервуар с буфером для промывания сгустка; 6 — перистальтический насос, поддерживающий постоянную высоту столба буфера со сгустком в колонке (Ир- 18 ± 0,5 см); 7 - силиконовая магистраль внутренним диаметром I мм.

сгустка (Рис. 4 А). О проницаемости сгустка судили по скорости прохождения через него нанесенного вещества. Фильтрация окрашенного белка, например, гемоглобина, удобна для визуального наблюдения. Если в сгустке присутствуют какие-либо дефекты, то это становится заметно по изменению формы прокрашенной зоны и такие сгустки выбраковывались. Для оценки взаимодействия подвижной и неподвижной фаз использовали зависимость положения фронта нанесенного белка от объема прошедшего элюата. При этом положение полосы нанесенного белка в ф.-п. определяли по центру — «ядру» полосы, т.к. полосы могут деформироваться, в первую очередь, из-за пристеночных эффектов. На рис. 4 приведены последовательные фотографии колонки с нанесенным на нее раствором гемоглобина Скорости элюции составляли от 0,011 до 0,1 мл/мин (Vmax~ 4,4-10~2^ 4,МО-1 см/мин, макроскопический сдвиг I^L«« 3,110"'-f- 2,9 мин"1 ). Падение скорости элюции было обусловлено формированием уплотнения на верхней незакрепленной границе сгустка. Элюат собирался каплями в пробирки Eppendorf.

Изучение связывания альбумина с отмытыми фибрин-полимерными сгустками. К •' • т ЩЩ'1 отмытым сгусткам объемом 2 мл (вместе с ЧЯр-Л , **~ .г — ч— : окружающим буфером) добавляли по 2мл _ \ • ; 5 %-ного раствора альбумина Таким

_ „ ► щ .

—•%: - »ЩИ® образом» конечная концентрация альбумина

А —В - : . с —- ,„ 0 ииа..: составляла 2,5 % (или 25 мг/мл), а количест-

Рис. 4. Фотографии колонки с нанесенным на сгусток раствором 0,1 %-ного гемоглобина (0,1 мл) в различные моменты после начала элюции. Положения «ядра» полосы отмечены черными треугольниками и 'соответствуют прохождению 0; 0,4; 1,4 и 1,55 мл элюата для случаев А, В, С и О соответственно.

во ф.-п, в 4 мл суммарного объема было равно 7,7 мг, учитывая что измеренная масса ф.-п. сгустков составляла 3,85 мг/мл. Растворы аккуратно перемешивали в течение 15 мин так, чтобы избежать полного коллапса сгустков. После перемешивания сгустки выдерживали при температуре 20-27 °С в течение разного времени (от 6 до 24 часов). В определенный момент времени из каждого образца отбирали по 3 пробы для определения концентрации оставшегося в объеме альбумина.

Результаты. Определение массы ф.-п. сгустков показало, что концентрация белка (фибрина) в них составляла 3,85 ± 0,08 мг/мл (п = 3). Это находится в хорошем соответствии с разностью величин концентраций общего белка в исходной плазме (74 + 3 мг/мл) и суммарным количеством белка оказавшегося в элюаге в ходе промывки (70 ± 3 мг/мл).

В экспериментах по адсорбции альбумина промытые ф.-п. сгустки экспонировались в растворе белка 6, 18 или 24 часа Результаты показали, что для каждого их исследованных времен экспозиции, усредненная из 3 независимых измерений концентрация общего, оставшегося в растворе белка, соответствовала 25 ± 1 мг/мл. С одной стороны, это говорит о том, что равновесие адсорбции устанавливается гораздо быстрее 6 часов, а с другой — что масса связшшого альбумина гораздо меньше общей массы фибрина, в отмытом сгустке (7,7 ± 0,16 мг из оценки выше).

Для измерения проницаемости отмытых ф.-п. сгустков, на колонку со сгустком наносили 0,1 мл раствора 5% альбумина или 1% гемоглобина, или низкомолекулярного Ь-динитрофенилаланина и следили за скоростью прохождения полосы нанесенного

вещества при смывании буферным раствором. Несмотря на то, что в \ некоторой части опытов фибрино-

" вый сгусток не выдерживал

I

длительного промывания, что • помешало набрать хорошую

' статистику, в тех случаях, когда

^ Ь-диншрофенилаланин и гемогло-

«Г™ " бин демонстрировали равномерное

движение по колонке, были получены очень схожие зависимости объема прошедшего элюата от времени. Для всех образцов константы Дарси (£ф), рассчитанные для начального этапа фильтрации, лежали в

диапазоне 3+1 дарси, что совпадает с приведенными в литературе данными21 и оценочным расчетом.

Поскольку скорость фильтрации через ф.-п. сгусток в ходе опыта изменялась, то для характеристики проницаемости была использована зависимость положения полосы вещества (в см от верхней границы сгустка) от объема прошедшего элюата (в см3). Эти зависимости для гемоглобина и Ь-динитрофенилалаиина были линейны, а тангенсы углов наклона оказались одинаковы (-3,9 ±0,1 см/мл для бычьего гемоглобина и -4,1 ±0,1 см/мл для Ь-динитрофенилалашна). За скоростью фильтрации альбумина

§ *

ь

I Г

Рис. 5. Концентрации человеческого альбумина в пробах, элюированных с колонки с отмытым предварительно фибриновым сгустком, в зависимости от объема прошедшего элюата. На колонку было нанесено 0,12 ±0,1 мл раствора альбумина с концентрацией 50 мг/мл.

21 Diamond S.L.// Annual Review of Biomedical Engineering.—1999.—v.l.—p.427—16t.

можно следить, измеряя концентрацию прошедшего белка в пробах элюата. На рис. 5 приведен график зависимости концентрации альбумина от объема прошедшего элюата в одном из экспериментов. Центр пятна альбумина в данном случае вышел примерно на объеме 2 мл. Это позволяет положить, что тангенс угла наклона прямой зависимости положения «ядра» полосы от объема элюата для альбумина примерно равен таковым для гемоглобина и L-динитрофенилаланина Полный интеграл массы альбумина под графиком равен 5,14 мг. Наблюдаемый концентрационный хвост (Рис. 5) можно объяснить деформациями полосы из-за пристеночных эффектов, схожими с теми, что были видны ранее при фильтрации гемоглобина (Рис. 4).

СЭМ сгустков из плазмы доноров с гиподисфибриногенемией Марбург. Известно более 300 генетических мутаций фибриногена. Структура мутантных форм ф.-п. может сильно отличается от нормальной, особенно в случае гомозиготных мутаций. Мутация фибриногена Marburg была впервые обнаружена в 1975 году22. Эта мугантная форма примечательна тем, что у нее нарушена латеральная агрегация фибрилл23. Следовательно, ф.-п. сгустки фибрина Marburg должны обладать наибольшей возможной удельной длиной фибров.

СЭМ широко применяется для исследования структурных особенностей ф.-п. сеток, полученных из нормального фибрина и его мутантных форм. Прочность, реологические и динамические параметры макроскопических сгустков определяются статистическими свойствами ф.-п. сеток. Для определения этих свойств анализ СЭМ-микрографий дает большие возможности.

Основная цель данного исследования состояла в том, чтобы получить микрографии высокого разрешения зрелых ф.-п. сгустков фибрина Marburg и сравнить их структуру со структурой нормальных сгустков.

Приготовление образцов плазмы. К девяти объемам цельной крови добавлялся один объем 3,8% раствора цитрата натрия. Тромбоциты вместе с другими клетками крови были удалены путем центрифугирования в 4 приема: 2 раза по 15 мин на 200 g и два раза по 20 мин на 5000 g24. Центрифугирование образцов производилось при температуре 4°С, для каждого последующего центрифугирования отби-

" Fuchs G. et al.// Blut,—1977.—v.34— р. 107-118.

23 Sobel J.H. et al.//Blood—1995,—v.86.—p,989-1000.

-4 Leitzel K. et al.// Cancer Res — 1991—v.5l.—p.4149^1154.

рался супернатант от предыдущего. Приготовленные образцы обедненной тромбоцитами плазмы хранились при -18°С.

Формирование фибриновых сгустков. Пробирки с плазмой размораживались в водяной бане при 10°С. Образцы по 0,25 мл плазмы отбиралось для каждого эксперимента по коагуляции в стандартную 2 мл пластиковую пробирку фирмы Эппендорф. К образцам добавлялось 3 мкл 0,2 М СаС12 (конечная концентрация добавленного СаС12 в растворе составляла 2,5 мМ) с последующим интенсивным перемешиванием. Сразу после этого добавлялся тромбин в количестве 2 NIH U/мл. Использованный тромбин был приобретен в SIGMA (Т6884, из человеческой плазмы). Процесс коагуляции производился при 27°С в течение 3 часов для нормальной плазмы и 6 часов для плазмы типа Марбург. В итоге получался зрелый макроскопический сгусток, пригодный для последующей обработки. Реакция прекращалась путем замещения буферного раствора на 2 % раствор глютаральде-гида в фосфатном буфере (pH 7,3, Merck) с 1 % сахарозы25. Опыт показал, что в отсутствие дополнительного Са++ сгустки фибрина Марбург не обладали необходимой механической прочностью и разрушались при дальнейших манипуляциях. Сканирующая электронная микроскопия. Сгустки тщательно промывались в стандартном PBS буфере, затем дегидратировались путем перенесения в растворы с увеличивающимися концентрациями этанола (20%, 40%, 60%, 80%, 100%). После этого сгустки просушивались методом критической точки26. Высушенные сгустки приклеивались к держателю образцов с помощью проводящей пасты Leit-C (G3300, Plano GmbH) и подвергались покрытию 3 нм слоем платины и углерода методом испарения электронным пучком. Образцы исследовались в микроскопе Hitachi S-5200, детектирование изображений производилось по вторичному электронному сигналу. Статистическая обработка изображений. Измерения характерных размеров на СЭМ-микрографиях производились с помощью графического редактора GIMP. Статистические распределения толщины фибров для нормального и мутантного сгустков были полученн из серий по 4 микрографии каждого. Диаметры фибрилл нормального фибрина измерялись по латеральному узору микроструктуры на фибрах (Рис. 6). На микрографиях мутантного ф.-п. сгустка видны нити, напоминающие четки (Рис. 6). Поэтому

35 Reimer L. et al — Berlm:Springer-Vertag,1977 — 282S.

26 Anderson T.F.//Trans NY Acad Sei —1951— v.I3.—p.130-134.

Hernial Fbn

Fön Marburg

толщины этих нитей рассчитывались, как среднее на основании измерений в соседних точках. Средние значения и их стандартные отклонения (указываются после знака «+») были рассчитаны для каждого распределения. Гистограммы распределений были построены с помощью Microsoft Excel (Рис. 7).

Рис. 6. Слева — СЭМ-микрофотографии высокого разрешения фибринового сгустка мутантного фибрина типа Марбурт (А) и нормальных плазменных тромбов (Б), полученные автором. Длина масштабных отрезков составляет 250 нм. Обращает на себя внимание микроструктура фибра нормального фибрина (Б), указывающая на ф и б |Жл ь ну го субструктуру. Сверху — СЭМ-1 микрофотографии фибрина Марбург из литературы. Длина | масштабных отрезков — 1 мкм.

Результаты и обсуждение. СЭМ микрографии высокого разрешения нормального ф.-п. сгустка и сгустка фибрина типа Марбург представлены на рис. 6. Различия между ними легко заметны. Они проявляются в толщине фибров, образующих фибриновые

сети. Полученные СЭМ микрографии обладают разрешением достаточным, чггобы различать в образцах ф.-п. сгустка упакованные в фибр отдельные фибриллы, проявляющиеся как элементы микроструктуры (Рис. 6 Б). Распределение толщин фибров, измеренных для образцов ф.-п. сгустка мутантного фибрина представлено на рис. 7 А (средний размер равен 20 ± 2,0 нм). Толщина фибрилл в фибрах нормального плазменного сгустка равна 21+ 2,4 нм. Средняя толщина фибров нормального ф.-п. сгустка 0,18 ± 0,048 мкм. Из чего следует, что каждый фибр в норме содержит в среднем 64 фибриллы. Толщины

Рис. 7. Распределение толщин фибров для мутантного плазменного сгустка (А) и нормального (Б), Распределение А (среднее значение толщин фибров 20 ± 2.0 нм. п = 35) Распределение толщин фибров нормального плазменного тромба показано на Б (средняя толщина 0,18 ±0,048 мкм, п = 169. соответствует литературным данным).

единичных фибрилл, полученные по периоду латеральньк микроструктур на фибрах (20 ± 2,0 нм), согласуются с литературными данными (19 нм)27.

Очевидно, что «бесфибровая» структура сгустка фибрина типа Марбург будет влиять на их макроскопические свойства, такие как механическая прочность, модули упругости, проницаемость и т.д. Оценка соотношение проницаемостей нормального ф.-п. сгустка и мутантиого дает 0 /ф/'фм к 2-10"2. В то же время, «тонкая» структура ф.-п.

сетки мутакшого фибрина Марбург не будет оказывать влияние на коэффициенты броуновской диффузии для большинства факторов свертывания и лизиса согласно проведенным оценкам.

Заключение

В заключении автор обобщает полученные результаты. Оценки автора показали, что коэффициент проницаемости Дарси ф.-п. сгустка зависит от суммарной длины фибров в единице объема. Экспериментально полученная проницаемость ф.-п. сгустка, сформированного из плазмы, содержащей 3,8 мг/мл фибриногена, оказалась равна 3+1 дарси, что находится в согласии с литературными данными и оценками автора Таким образом, закон Дарси адекватно описывает фильтрационные потоки в ф.-п. сгустках. Макроскопическая скорость потока через ф.-п. сгусток составляла У< 4,МО-1 см/мин, а макроскопический сдвиг и 3,1-10 1 * 2,9 мин-1. Этот сдвиг примерно соответствует диапазону,

при котором в модели, представленной в главе 2, наблюдалась сильная зависимость сценария эволюции запороговогого возмущения от пристеночной скорости сдвига (1^« 2,610"1 + 8,9 мшГ1). Следовательно, эволюция любого запорогового возмущения, находящегося внутри ф.-п. сгустка может быть адекватно описана только с учетом фильтрационных потоков. Очевидно также, что сценарии образования сгустков будут зависеть от величины параметра ц/' из-за большой чувствительности к сдвигу, а значит и к полю скоростей потока Экспериментально показано, что свойства ф.-п. сеток, в частности, проницаемость, сильно зависят от особенностей процесса полимеризации. Следовательно, любая модель, претендующая на хорошее количественное соответствие с экспериментом, должна учитывать особенности полимеризации фибрина, чтобы корректно рассчитывать локальную длину фибров в единице объема

37 \Veiscl}Ж// .1 иипилгиа Мо1 Бнис! Яез.—1986.—у.96.—р. 176-188

Результаты и выводы

1. Экспериментально показано, что альбумин не накапливается на сформированной фибрин-полимерной сетке в количествах, сопоставимых с массой самого фибрина.

2. Показано, что для описания движения жидкости с малыми скоростями (<1 см/сек) внутри фибрин-полимерного сгустка справедлив эмпирический закон Дарси. Выполненные в рамках представления о микровязкости расчеты автора совпадают с экспериментальными данными, полученными автором. Количественное согласие расчетных и экспериментальных данных указывает на зависимость проницаемости фибрин-полимерного сгустка от суммарной длины фибров в единице объема. Анализ литературных данных и результаты автора по исследованию мутантного фибрина Марбург методами электронной микроскопии позволяют заключить, что суммарная длина фибров сгустка может варьироваться в широких пределах, как и его проницаемость.

3. Проведенные с участием автора расчеты по двухавтоволновой модели показали, что запуск автоволны активатора происходит в диапазоне скоростей сдвига жидкости < 8,9 мин"'), соответствующего параметрам течений внутри фибрин-полимерного сгустка (|у| « 3,1-КГ1 -ь 2,9 мин"1), а не в просвете сосуда

4. Для построения количественной модели плазменного звена гемостаза и эволюции фибрин-полимерного сгустка в сдвиговом потоке необходимо использовать описание полимеризации фибрина, учитывающее длину фибров в единице объема. Это сделает возможным рассчитывать проницаемость сгустка.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Чуличков А.Л., Николаев A.B., Лобанов А.И., Гурия Г.Т. Пороговая активация свертывания крови и рост тромба в условиях кровотока // Математическое моделирование.— 2000, Т. 12, №3, стр. 75-96.

2. Николаев A.B., Синауридзе Е.И., Буравцев В.Н. Экспериментальное наблюдение проницаемости фибринового тромба // Вестник Московского университета.— Сер. Физика и астрономия 2009, №3, стр. 85-89.

3. Николаев A.B., Вальтер П., Эгбринг Р., Гурия Г. Т. Тромбы из плазмы доноров с гиподисфибриногенемией Марбург не обладают фибровой структурой // Тромбоз Гемостаз и Реология.— 2004, Т. 1, №17, стр. 30-36.

4. Куриленко И.А., Лобанов А.И., Николаев A.B. Качественное исследование математической модели свертывания крови в сдвиговом потоке // Материалы Международной научной конференции «Моделирование нелинейных процессов и систем», Москва, 2009 г., стр. 515-529.

5. Николаев A.B., Лобанов А.И. Применение метода потоков при численном исследовании структурообразования в реакционно-диффузионной возбудимой 20-системе с активным восстановлением // Тез. докл. Международной конференции "Критерии самоорганизации в физических, химических и биологических системах", Москва- Суздаль, 12-18 июня 1995

6. Николаев A.B., Ковалев Ю.С., Горделий В.И. Исследование структурных свойств фибрин-полимерных сетей методом малоуглового рассеяния нейтронов // Сборник трудов XLV1II конференции МФТИ, секция биофизики и физики живых систем, 2005 г., МФТИ, стр. 145-149.

Николаев Андрей Владимирович

Фибрин-полимерные сетки, математическое моделирование и экспериментальные исследования

Подписано в печать 16.09.09 Формат 60x84 Усл. печ.л. 1,2 Тираж экз. 80 Заказ 33 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский физико-технический институт (государственный университет)

141700, Московская область г. Долгопрудный, Институтский пер. 9

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фибрин-полимерные сетки, математическое моделирование и экспериментальные исследования"

Актуальность темы.3

Цель исследования.4

Задачи исследования.4

Научная новизна.5

Основные положения, выносимые на защиту.5

Теоретическая и практическая ценность.6

Личный вклад автора.б

Структура работы.7

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Николаев, Андрей Владимирович

Выводы

1. Экспериментально показано, что альбумин не накапливается на сформированной фибрин-полимерной сетке в количествах, сопоставимых с массой самого фибрина.

2. Показано, что для описания движения жидкости с малыми скоростями (<1 см/сек) внутри фибрин-полимерного сгустка справедлив эмпирический закон Дарси. Выполненные в рамках представления о микровязкости расчеты автора совпадают с экспериментальными данными, полученными автором. Количественное согласие расчетных и экспериментальных данных указывает на зависимость проницаемости фибрин-полимерного сгустка от суммарной длины фибров в единице объема. Анализ литературных данных и результаты автора по исследованию мутантного фибрина Марбург методами электронной микроскопии позволяют заключить, что суммарная длина фибров сгустка может варьироваться в широких пределах, как и его проницаемость.

3. Проведенные с участием автора расчеты по двухавтоволновой модели показали, что запуск автоволны активатора происходит в диапазоне скоростей сдвига жидкости (Итах мин-1), соответствующем параметрам течений внутри фибрин-полимерного сгустка (|/|max ~ ЗД-1СГ1 -г 2,9 мин-1), а не в просвете сосуда.

4. Для построения количественной модели плазменного звена гемостаза и эволюции фибрин-полимерного сгустка в сдвиговом потоке необходимо использовать описание полимеризации фибрина, учитывающее длину фибров в единице объема. Это сделает возможным рассчитывать проницаемость сгустка.

Заключение

В заключении проведем обобщение некоторых важных результатов, полученных в работе:

1. Проведенные оценки показали, что коэффициент проницаемости Дарси фибрин-полимерного сгустка зависит от суммарной длины фибров в единице объема. Экспериментально полученная проницаемость фибрин-полимерного сгустка, сформированного из плазмы, содержащей 3,8 мг/мл фибриногена, оказалась равна 3±1 Дарси, что находится в согласии с литературными данными и проведенными оценками. Таким образом, закон Дарси адекватно описывает фильтрационные потоки в фибрин-полимерных сгустках. Макроскопическая скорость потока через фибрин-полимерный сгусток в эксперименте составляла V < 4,1-Ю-1 см/мин, а макроскопический сдвиг |x|maj[~ ЗД-1СГ1 -f- 2,9 мин-1.

2. При моделировании работы плазменного звена гемостаза и роста фибринового сгустка в потоке рассматривались только типичные картины развития фибрин-полимерного сгустка. Хотя модельные сценарии демонстрируют общие черты с явлениями, наблюдаемыми в клинической практике, данная модель претендует лишь на выявление некоторых качественных закономерностей. Показано, что при использованных параметрах модели (таблица 4), запуск автоволны активатора происходит в диапазоне скоростей сдвига жидкости \у\тлу. < 8,9 мин-1. Это примерно соответствует диапазону макроскопических скоростей сдвига для потоков внутри фибрин-полимерных сгустков, а не в просвете сосуда. Следовательно, эволюция запорогового возмущения, находящегося внутри фибрин-полимерного сгустка может быть адекватно описана только с учетом фильтрационных потоков. Очевидно также, что в созданной модели сценарии образования сгустков будут зависеть от величины параметра у/с из-за большой чувствительности к сдвигу, а значит и к полю скоростей потока.

3. Экспериментально показано, что плазменный сгусток из плазмы доноров с гиподисфибриногенемией Марбург имеет специфичную фибриновую сеть, которая состоит из элементарных не соединенных латерально в жгуты фибрилл. Проведенные в рамках теории подобия оценки показывают, что коэффициент проницаемости Дарси такого сгустка будет на полтора порядка ниже, чем у нормального из-за большой разницы в суммарной длине фибров в единице объема. Из этого можно заключить, что проницаемость фибрин-полимерного сгустка сильно зависит от особенностей процесса полимеризации. Следовательно, любая модель, претендующая на хорошее количественное соответствие с экспериментом, должна учитывать особенности полимеризации фибрина, чтобы корректно рассчитывать локальную длину фибров в единице объема.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Николаев, Андрей Владимирович, Москва

1. Население и условия жизни в странах Содружества Независимых Государств: Статистический сборник — М., Межгосударственный статистический комитет СНГ, 1998.

2. Anand М. A model incorporating some of the mechanical and biochemical factors underlying clot formation and dissolution in flowing blood / M. Anand M., K. Rajagopal, K.R. Rajagopal //J Theoret Med.—2003.—v.5.-p.l83-218.

3. Panteleev M.A. Spatial propagation and localization of blood coagulation are regulated by intrinsic and protein С pathways, respectively / M.A. Panteleev, M.V. Ovanesov, et al. // BiophysJ.—2006.—v.90.—№5,—p.1489-1500.

4. Ermakova E.A. Blood coagulation and propagation of autowaves in flow / E.A. Ermakova, M.A. Panteleev, E.E. Shnol. // Pathophysiol Haemost Thromb.—2005.—v.34.—№2-3.— p.135-142.

5. Brandt J.T. Overview of hemostasis / J.T. Brandt // Clinical Laboratory Medicine / под. ред. K.D. McClatchey, —2-е изд. —Baltimore, Md: Lippincott Williams and Wilkins, 2002.—p.987—1009.

6. Stassen J.M. The hemostatic system / J.M. Stassen, J. Arnout, H. Deckmyn // Curr. Med. Chem.—2004.—v.17.—№11.—p.2245-2260.

7. Triplett D.A. Coagulation and bleeding disorders: review and update / D.A. Triplett // Clin Chem.—2000.—v.46.—№8(Pt. 2).—p. 1260-1269.

8. Schenone M. The blood coagulation cascade / M. Schenone, B.C. Furie, B. Furie // Curr Opin Hem atol.—2004.—v. 11.—№4.—p.272-277.

9. Бутенас С. Свертывание крови. Обзор / С. Бутенас, К.Т. Манн // Биохимия.—2002.— Т.67.—№1.—С.5—15.

10. Sixma J.J. Platelet adhesion to collagen: an update / J.J. Sixma, G.H. van Zanten, et al. // Thromb Haemost.—1997.—v.78.—№l .-p.434-438.

11. Watson S. Update on collagen receptor interactions in platelets: is the two-state model still valid? / S. Watson, O. Berlanga, et al.// Platelets.—2000,—v.ll.—№5.—p.252-258.

12. Andrews R.K. The glycoprotein Ib-IX-V complex in platelet adhesion and signaling / R.K. Andrews, Y. Shen, et al.// Thromb. Haemost.—1999.—v.82.—№2.—p.357-364.

13. Spisani S. Modulation of neutrophil functions by activated platelet release factors / S. Spisani, A.L. Giuliani, et al. // Inflammation.—1992.—'v.16.—№ 2,—p.147-158.

14. Zarbock A. Platelet-neutrophil-interactions: Linking hemostasis and inflammation /

15. A. Zarbock, R.K. Polanowska-Grabowska, K. Ley. // Blood Rev.—2006.—v.21.—p.99-111.

16. Macfarlane R.G. An enzyme cascade in the blood clotting mechanism, and its function as a biochemical amplifier/ R.G. Macfarlane //Nature.—1964.—v.202— p.498-499.

17. Зубаиров Д.М. Молекулярные основы свертывания и тромбообразования / Д.М. Зубаиров. — Казань: Фэн, 2000—364С.

18. Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. — М.: Медицина, 1998.—704С.

19. Butenas S. "Normal" thrombin generation / S. Butenas, C. van't Veer, K.G. Mann // Blood.—1999—v.94.—№7,—p.2169-2178.21