Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ферменты биосинтеза и распада пролина в мозжечке крыс и регулирование их активности

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ферменты биосинтеза и распада пролина в мозжечке крыс и регулирование их активности"

ОГК НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ АРМЕНИЯ ri D УН ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. Г.Х. ПУНЯТЯНЛ

па щитах рукопчт УДК 591.1.05.

АГАД ЖАН Я H ВАГЕ АРАМАИСОВИЧ

ФЕРМЕНТЫ БИОСИНТЕЗА И РАСПАДА ПРОЛИНА В МОЗЖЕЧКЕ КРЫС И РЕГУЛИРОВАНИЕ ИХ АКТИВНОСТИ

Q- 00.04-Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЕРЕВАН-1997

^usuusutib а ич, р цт)ь s п над in, о-мш-г^зш-т/ъь-р!» царизм» u<iuo-b-u>a А. I". РП1-ЪМ1РШ1Ф шСф 41Л,и1ЧР.МГМ13Ь KMJShSill-S

A furiut/r/i /тифа (ifml il hS 1-591.1.05.

uniairoain, -гиль upuutibmjï»

ilPilLKbl» ïitF^UUMiia-bfih 3>fcPUtfbS'biïPC ьч. U4SI"UlHfr3lTb ЧЦРОДМЛРПНГе UÎKbbSh пьаьи^пнг

4-.00.04.-kbGumf|nî{im

4hGuiupuifiuiI[iufi qJism.pjni.Gfibr]i pbffiuicftuji q|isiul|iufi musliiiiufiji Iiiujyiïuifi iu.sh(iui]unu!upjui(î

UkllTUO-hP

UPb^llVb 1997

Работа выполнена в Институте биохимии им. Г.Х. Бунятяна и на Кафедре биохимии Ереванского Государственного Университета

Научный руководитель: академик HAH Республики Армения, доктор

биологических наук, профессор Галоян A.A.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук профессор

часов на заседании Специализированного Совета 042 пс присуждению ученых степеней при Институте биохимии им Пупятяна HAI I РА. (375 0-М, Пропан, ул. П.Соиака 5/1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии им. Г.Х. Бунятяна HAH РА.

Автореферат разослан " Л*7 " __ 1997 г

Априкян Г.В.

кандидат биологических наук, доцент Геворкян Дж.А.

Подущай оршшкищин: Кафедра биохимик Преиашкого

Государственного Медицинского Университета

Защита диссертации состоится

Ученый секретарь Специализированного Совета,

доктор биологических наук,

профессор

Симонян A.A.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние годы удалось выяснить некоторые крайне интересные биохимические взаимосвязи между метаболизмами глутамата, аргинина, орнитина и пролина. Эти аминокислоты служат не только строительными блоками ири синтезе белков, но и предшественниками многих биомолекул, выполняющих различные специализированные функции.

Пути биосинтеза этих родственных аминокислот, по-видимому, в целом идентичны для псех форм живого и осуществляются через общие промежуточные продукты. Тем не менее их роль в метаболизме клетки весьма специфична и далеко еще окончательно не раскрыта. Следует отметить, что гормон гипоталамуса тиролиберин является трипептидом, состоящим из пирроглутаминовой кислоты (оксопролина), гистидина и пролинамида. Люлиберин же являясь декапептидом содержит пирроглутаминовую кислоту и пролин.

В последнее время интенсивно изучается энергетическая роль пролина при полете насекомых Имеются достоверные данные о коррелятивном уменьшении содержания пролина и, наоборот, возрастании содержания глутамата и аланина (Weeda et al, 1980).

Доказано включение пролина в состав коллагена, особенно при заживлении термических ран у крыс (Rama Rao, Mestra, 1980) и при регенеративных и восстановительных процессах у дождевого червя (Давтян и др., 1982).

Более того, установлено (Давтян и др., 1982), что при повышении потребности и пролине индуцируется неуреотелическая аргиназа с целью обеспечения его биосинтеза из необходимого предшественника - орнитина. В этом отношении уникальной является корреляция между активностью аргиназы и ферментами биосинтеза пролина при регенерации дождевого червя, когда налицо потребность организма в пролине и заметно .усилены восстановительные и пролиферативные процессы.

Имеется довольно много убедительных данных относительно взаимосвязи между обменом аргинина и пролина. Наблюдается интенсивный синтез пролина на фоне возрастания активности аргиназы в опухолевых тканях мышей и значительное ингибирование активности аргиназы пролином ¡Kesava Rao el al, 1974). По-видимому, интенсивное расходование свободного пролина приводит к эффективной пролиферации клеток.

Относительно мозга мышей (Johnson, Roberts, 1984] установлен механизм транспорта аргинина вовнутрь синаптосом, егс превращение в орнитин, глутамат, ГАМК и пролин.

В литературе почти нет данных о метаболизме пролина i различных отделах мозга.

Наши исследования в определенной степени разъясняют отдельные стороны метаболизма пролина п мозжечке крыс и выявляют регуляторные возможности ферментов биосинтезе пролина - орнитин-5-трансаминазы (ОТ) и пирролин-5-карбоксилат редуктазы (П5КР).

Цель и залами исследований. Целью настоящей работы является изучение процесса биосинтеза пролина и характеристика ферментов ОТ и П5КР, катализирующих указанный процесс Изучены следующие вопросы:

1. Установлены предшественники биосинтеза пролина и внутриклеточная локализация ферментов биосинтеза пролина е мозжечке крыс.

2. Исследовано влияние адениловых нуклеотидов и аминокислот на ферменты биосинтеза пролина мозжечка крыс.

3. Осуществлена очистка ферментов биосинтеза пролина мозжечка крыс и изучены их регуляторные свойства.

4. Изучено влияние окисленных нуклеотидов и органических кислот на ферменты биосинтеза пролина мозжечка крыс.

5. Выявлены ферменты окисления пролина в мозжечке крыс.

Научная новизна. Впервые изучены ферменты биосинтеза

пролина мозжечка крыс. Получены ОТ и П5КР мозжечка крыс со степенью очистки 53,1 и 700 соответственно. Доказано пигпбировлние активности П5КР окисленными 11ЛДФ И НАД.

Осуществлен биосинтез пролина в присутствии окисленных нуклеотидов (НАД и НАДФ) и органических кислот (цитрат, изоцитрат, малат). Впервые изучено окисление пролина в мозжечке крыс и ингибирование этого процесса п-ХМБ и гидроксиламином .

Практическая ценность. Полученные данные о синтезе пролина с участием окисленных нуклеотидов и органических кислот, в первую очередь цитрата, на уровне гомогената могут быть применены для усиления синтеза этой аминокислоты в клетке.

Результаты данной работы можно использовать для препаративного получения ферментов биосинтеза пролина - ОТ и П5КР.

Апробация работы. Материалы диссертации в виде отчетов ежегодно обсуждались на Ученом Совете Института биохимии НАН Армении (1994-1997).

Публикации. Всего по теме диссертации опубликовано 4 гаучные работы.

Объем работы. Диссертационная работа напечатана на 95 траницах машинописного текста и состоит из введения, обзора лтературы, материала и методов исследования, собственных [сследований, заключения, выводов и списка литературы. Работа ключает 17 таблиц и 8 графиков.

Библиографический указатель содержит 138 источников.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Объектом исследований служили белые крысы линии Вистар [ассой 150-180 г

Приготовление гомогената. Готовили 20% гомогенат мозжеч-а крыс на 0,1 М калий-фосфатном буфере в стеклянном гомогени-аторе типа Поттера-Эльведжейма. Для определения ферментов био-интеза и окисления пролина были использованы рН 7,4 и 8,0 соот-етственно. Гомогенаты центрифугировали при 27 000д в течение 30 ин.

Определение активности ОТ и П5КР. Инкубационная смесь 5 мл) содержала 50 мкмоль Ь-орнитина, 20 мкмоль а-КГ, 100 мкмоль алий-фосфатного буфера (рН 7,4), 1 мкмоль пиридоксаль-5-фосфата 0,5 мл гомогената мозжечка. Инкубация проводилась при 37°С в гчение 1 часа. За это время орнитин под действием ОТ среды преп-ащается в пирролин-5-карбоксилат. Затем в среду добавлялось мкмоль НАДН или НАДФН и 0,5 мл свежего гомогената, смесь ин-убировалась еще 15 мин. Под действием П5КР П5К превращается в ролин.

Реакцию останавливали холодным этиловым спиртом (96%) ри хромотографическом определении пролина и 20% ТХУ - при хи-ическом определении. Пробы центрифугировались при 8 000 5/мин в течение 10 мин, после чего определялся пролин. Актив-эсть ферментов биосинтеза пролина (ОТ и П5КР) выражалась в кмолях образовавшегося пролина на 1 г свежей ткани.

Определение активности ПО и П5КА. Осадок гомогенатов, элученный центрифугированием при 27 000д в течение 30 мин, отворяли в 4 мл 0,01 М Трис-НС1 буфера, содержащего 0,5 М

ЭДТА (рН 8,2) и центрифугировали при 27 000g 30 мин. Эт} процедуру повторяли 3 раза. В последний раз к осадку добавляла 10% этиловый спирт, замораживали, оттаивали и центрифугировал} при 27 000g 30 мин, раствояли в 0,01 M Трис-HCl буфере (с ЭДТА рН 8,2) и использовали в качестве ферментного препарата обладающего ПО и П5КД активностями.

Инкубационная смось п 1,9 мл содержала: 53 ммоль калш фосфатного буфера (рП 8,0), 0,2 ммоль L-иролшш, 1,0 мкмсш цитохрома С и 4 мкмоль НАД. Инкубацию проводили при 37°С i течение 60 мин. Реакцию останавливали добавлением 96% холодногс этилового спирта в соотношении 1:1. Осадок удалял!; центрифугированием при 12 000g в течение 10 мин. Об активностям ПО и П5КД судили по синтезу глутамата.Содержание глутамате определяли методом бумажной хроматографии. Плотность окраска определяли путем фотометрирования на фотокалориметре типе КФК-2 с зеленым фильтром.

Определение пролина проводилось по Блюменкрантц) (Blumenkrantz, 1980). Чувствительность метода составляет 1 мкг. К 1 мл образца добавляли 1 мл шшгидриноиого реагента (3 i шшгидрина в 180 мл ледяной уксусной кислоты и 20 мл формалина) Смесь кипятили 1 мин при 100°С или 4 мин при 75°С, охлаждал* льдом и измеряли красную окраску спектрофотометром при 515 нм В качестве стандарта применяли пролин в концентрации 2 мкг/мл.

Гель-фильтрация, Для выявления пзоэнзимиого спектр* ферментов биосинтеза пролина проводилась гельфильтрацш бесклеточного экстракта мозжечка крыс на сефадексе G-150. Для получения экстракта гомогенат центрифугировался при 27 000g i течение 30 мин. На колонку наносилось 3 мл бесклеточногс экстракта. Уравновешивание и элюция осуществлялись 0,005 M Трис-HCl буфером, рН 7,4. Скорость элюции - 30 мл/час. Объе* фракций - 5 мл. Была собрана 21 фракция.

Очистка ОТ и П5КР мозжечка крыс была осуществлена пс разработанной нами методике.

Белок определяли по методу Лоури и сотр. (Lowry et al, 1951] и спектрофотометричоски по шпччкпшюсти поглощения спета при 280 нм на СФ-4А.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Предшественники и внутриклеточная локализация ферментов биосинтеза пролина мозжечка крыс. Исследовали активность ферментов биосинтеза пролина в целых гомогенатах мозжечка, а также в надосадочной жидкости и в осадке, полученном при центрифугировании при 27 ОООд. Полученные данные приведены в табл. 1.

Таблица 1

Внутриклеточная локализация ферментов биосинтеза пролина _в мозжечке крыс, мкмоль про на 1 г ткани, п = 6_

Фракции Активность

НАДН % распределения НАДФН % распределения

Гомогснат б,77±1,08 100 8,12:1,34 100

Надосадок 2,13±0,34 30,5 2,03+0,33 32,2

Осадок 5,06+0,77 72,5 5,85±1,28 72,0

Полученные данные показывают, что ферменты биосинтеза пролина в мозжечке крыс в большей части локализованы в □садочной фракции гомогената, по-видимому, активность локализована в синаптосомах. Были выделены синаптосомы, и изучена активность ферментов биосинтеза пролина в этих эбразованиях.

Исследовано влияние различных кетокислот на биосинтез пролина из орнитина в надосадочной жидкости и осадке. Данные приведены в табл. 2.

Таблица 2

Биосинтез пролина из орнитина в мозжечке крыс в присутствии

различных кетокислот, мкмоль про на 1 г ткани, п = 6

Кетокислоты Кофактор Гомогенат Надосадок Осадок

а-КГ НАДН б,97±1,02 2,03±0,25 4,91+0,75

Пиравут НАДН 4,27±0,31 2,29±0,35 2,36+0,50

Оксалоацетат НАДН 1,31+0,09 0,28+0,03 0,52±0,04

а-КГ НАДФН 7,25±1,11 2(22±0,31 5,18±0,83

Показано, что трансаминирование орнитина наиболе' интенсивно протекает с а-КГ, несколько слабее с пируватом i гораздо хуже с оксалоацетатом.

2. Регулирование биосинтеза пролина мозжечка крыс адениловыми нуклеотидами и аминокислотами.

В следующей серии экспериментов было изучено влияпи* аденилоьых нуклеотидои (ЛТФ, ЛДФ и АМФ) на активность ОТ i П5КР мозжечка крыс. Полученные данные предостовлены на рис. и 2, согласно которым АТФ (рис. 1) оказывает ингибирующе« влияние на активность обоих ферментов, тогда как АДФ и AMcI (рис. 2) иигибируют лишь актшшость П5К.Р. Лктшшогп. же ОТ i этих условиях, напротив, несколько повышается, особенно i присутствии низких концентраций адениловых нуклеотидо! (5 10'3М). Характерно, что ингибирующий эффект АТФ на процесс биосинтеза пролина значительно более выражен, если в качеств( кофактора П5КР используется НАДН, а не НАДФН.

По влиянию аминокислот на ферменты биосинтеза пролиш установленно, что при сравнительно высоких концентрациях (13,5 26,510"3М) аспарагин, аспартат и аланин значительно подавляю: активность ОТ и П5КР. Следует отметить, что ингибирующе« влияние аспарагина проявляется даже при более низкго концентрациях (2,710'3М). Аспартат в низких концентрация? никакого влияния па активность обоих ферментов не оказывает начиная с концентрации 13,5 10'3М наблюдается ингибирование активностей обоих ферментов, участвующих в процессе биосинтезе пролина. Примечательно, что по сравнению с а-аланином ß-аланш пмаынает довольно слабое ингпбированио актишкктн ОТ п П5КР i мозжечке крыс. Серии и глицин ни в одной из испытанные концентраций не действуют на процесс биосинтеза пролина i мозжечке.

Ингибирование процесса аспартатом и аланином, по-видимому, объясняется интенсивным функционированием i мозжечке крыс аспартат- и аланинаминотрансфераз, с которыми орнитинаминотрансфераза не в состоянии конкурировать за а-КГ

Из литературы известно (Miler, Stewart, 1976), чте ингибирующее влияние АТФ на П5КР снимается ионами магния

Нас интересовало, имеется ли подобное явление относительно ферментов биосинтеза пролина в мозжечке крыс.

Рис.1 Влияние АТФ на биосинтез пролина (мкмоль про и а 1 г ткани) в мозжечке крыс. 1-ОТ, кофактор П5КР НАДФН, 2-ОТ, кофактор П5КР НАДН, 3-П5КР, кофактор НАДФН, 4-П5КР, кофактор НАДН. По оси абсцисс-концентрация ингибитора (10'4М)

Рис.2.Влияние АДФ и АМФ на биосинтез пролина (мкмоль про на 1 г ткани) в мозжечке крыс. 1-ОТ, 2-П5КР. В качестве кофактора использовали НАДН. По оси абсцисс-концентрация ингибитора. (10'5М)

Полученные нами данные показывают, что реактивирование П5КР двухвалентными ионами магния, вслед за ингибированием АТФ, удалось вызвать для фермента, функционирующего с кофактором НАДФН, а при функционировании его с кофактором НАДН реактивировать не удается.

3. Фракционирование и очистка ферментов биосинтеза пролина мозжечка крыс и регулирование их активности.

Ферменты биосинтеза пролина в большей степени локализованы в осадке гомогената, полученного после центрифугирования при 27 000д, в то время как в надосадочной фракции обнаруживается менее 20% этой активности. Такая стпень экстракции фермеитои иоудоилотиорительна для их гель-фильтрации через сефадекс. Поэтому мы испробовали ряд систем и приемов для перенесения ферментов из осадка в надосадочную фракцию.

Рис.3 Фракционирование ОТ и П5КР мозжечка крыс на сефадексе G-150. — белок,- ОТ , — • — • — П5КР

Лучшей системой для перенесения ферментов из осадка в надосадок является система, содержащая ЭДТА и глицерин, с помощью которой удается перенести в растворенное состояние более половины ферментативных активностей.

ПрОИОДИЛОГЬ ф|ШКЦ1|<>1Ш|)0||(11ШК l|lH|)Mi'IITOII nitOCHIITOIIfl

пролит» Скч'клеточпого же/факта мозжечка, полученного после гомогенизации в 0,1 М калий-фосфатном буфере на сефадексе G-150. Полученные данные проиллюстрированы на рис.3

Данные показывают, что максимальная активность ОТ обнаруживается в 8 и 9 фракциях, а П5КР - в 6 и 7 фракциях. Таким образом, оба фермента биосинтеза пролина при гель-фильтрации на сефадексе выявляют по одному изоэнзиму,

В дальнейшем мы осуществляли очистку указанных ферментов. Процедуры очистки ОТ и П5КР мозжечка крыс представлены в таблицах 3 и 4.

Таблица 3

Очистка орнитинтрансаминазы мозжечка крыс.

Этапы отчистки Общий белок (мг) Общая активность (мкмоль про/ч) Удельная активность мкмоль про/мг белка/ч Выход фермента (%) Степень очис тки

Гомогенат 48,3 9,34 0,19 100

Надосадочная жидкость, полученная при центрифугировании гомоге-ната при 27000д 15,3 5,84 0,38 62.5 2,0

Высаливание 50-65% (NH4)2S04 2,24 2,85 1,27 30,5 6,68

Тепловая обработка при 60°С 1,21 2,98 2,46 31,9 12,9

Высаливание 65% (NH4)2S04 и фракционирование на сефадексе G-150 (фракции 8 и 9) 0,07 0,81 10,1. 8,6 53,1

Таблица 4

Очистка пирролин -5 -карбоксилатредуктазы мозжечка крыс

Этапы Общий белок (мг) Общая активность (мкмоль про/мг Ч) Удельная активность (мкмоль про/мг белка/ч) Выход фермента (%) Степень очистки

Гомогепат 68,1 14,1 0,20 100

Надосадоч-ная жидкость 18,3 7,0 0,38 49,6 2

Высаливание (NHJ2S04 при 60-80% -ном насыщении 7,1 3,3 0,46 23,4 2,3

Фракционирование на цппокроне (фракции 5 и 6) 0,25 1,7 6,8 12,0 34,0

Фракционирование на софодексе G-150 (фракции 6 и 7) 0,005 0,70 140 4,96 700

Из таблиц 3 и 4 следует, что получена ОТ мозжечка крыс со степенью очистки 53,1 и с выходом фермента 8,6%, и П5КР - 700 и 5% соответственно.

Серии экспериментов подтвердили, что ингибирующее влияние адениловых нуклеотидов и аминокислот на очищенные ферменты биосинтеза пролина такое же, что и на уровне гомогената мозжечка крыс. Отличие заключается в том, что: если АДФ и АМФ в гомогенате при низких концентрациях оказывают стимулирующее влияние, то в случае чистых ферментов слабо выраженное стимулирование наблюдается лишь при низких концентрациях АДФ. Как на уровне гомогената, так и на очищенных ферментах нами

установлено сравнительно слабое ингибирование активности П5КР при функционировании последней с НАДФН, по сравнению с НАДН. Полученные результаты дают нам основание прийти к заключению, что восстановление П5К с НАДН может регулировать энергетические процессы клетки, а восстановление П5К с НАДФН, очевидно, связано с анаболическими процессами клетки, чем и обусловлено слабое ингибирующее влияние АТФ на процесс биосинтеза пролина в присутствии НАДФН. Таким образом, восстановление П5К. НАДФН и, особенно, НАДН может быть своеобразным процессом регулирования внутриклеточного уровня АТФ.

Изучено влияние п-ХМБ и монойодуксусной кислоты на процесс биосинтеза пролина с использоваяиием очищенных ОТ и ПЖ1\ Данные, свидетельствуют, что П-Х.МБ и монойодуксусная кислота при низких концентрациях ингибируют процесс биосинтеза пролина в мозжечке крыс наполовину, а при высоких концентрациях п-ХМБ - полностью. Результаты относительно п-ХМБ вполне соответствуют данным литературы, полученным на хрусталике глаза крысы (БЫопо е1 а1, 1982).

Нами была сконструирована система биосинтеза пролина из орнитина с использованием очищенных изоэнзимов ОТ и П5КР. Данные показывают, что в модельных опытах выделенные изоэнзимы проявляют достаточную для биосинтеза пролина активность.

4. Влияние окисленных нуклеотидов и органических кислот на активность ферментов биосинтеза пролина в мозжечке крыс

Согласно нашим экспериментальным данным, окисленные нуклеотиды (НАД, 11АДФ) ингибируют активность очищенных ферментов биосинтеза пролина - ОТ и П5КР мозжечка крыс. Следовало выяснить, происходит ли - подобное ингибирование указанного процесса на уровне гомогената? Полученные нами \анные приведены в табл. 5.

Данные таблицы вновь убеждают, что для П5КР мозжечка <рыс НАДФН имеет преимущество по сравнению с НАДН. Все испытанные органические кислоты и окисленные нуклеотиды, в первую очередь НАДФ сильно стимулируют биосинтез пролина . Тричем по активированию этого процесса органические кислоты

располагаются в следующем убывающем порядке: изоцитрат, цитрат и малат.

Таблица 5

Влияние окисленных нуклеотидов, органических

на биосинтез пролина в мозжечке крыс, мкмоль пролина на 1 г. ткани.

Нуклеотиды Органические кислоты Фракция

Гомогенат Надосадок Осадок

НАДФН - 7,40±0,71 3,01±0,32 1,89±0,20

НАДФН цитрат 5,45±0,С5 2,54 ±0,22 1,02±0,13

НАДФ - 2,03±0,31 1,32±0,20 0,30±0,10

НАДФ малат 2,40±0,33 2,20±0,32 3,57±0,30

НАДФ изоцитрат 4,32±0,37 4,11 ±0,37 0,67±0,15

НАДФ цитрат 2,45±0,40 2,52±0,31 0,51 ±0,13

НАДФ цитрат АТФ 0,50±0,11 0,55±0,13 0

НАДФ цитрат АТФ 3,20±0,35 2,96±0,30 0,10±0,05

НАДФ цитрат АТФ 2,40±0,35 2,7 ±0,08 0,10±0,06

НАДН - 6,01 ±0,63 2,66±0,27 2,06±0,24

НАДН цитрат 5,37±0,51 2,25±0,20 2,14±0,20

НАД - 0,96±0,12 0,57±0,10 0,25±0,10

НАД малат 1,29±0,19 0,37 ±0,10 0,21 ±0,08

НАД изоцитрат 1,75±0,22 1,42±0,20 0,32±0,10

НАД цитрат 1,54±0,20 1,34±0,16 0,17±0,07

Примечание: Эффекторы были применены в следующих концентрациях (М): нуклеотиды - 1,2 10'3, малат - 2,2 10'3, цитрат, изоцитрат - 2,6 10'3, адениловые нуклеотиды - 0,69 10"3, АТФ, АДФ, АМФ - 2,9 Ю'3.

Следует отметить, что в мозжечке крыс стимулирование процесса биосинтеза пролина органическими кислотами довольно эффективно в присутствии НАДФ, чем НАД. Стимулированием процесса биосинтеза пролина в присутствии цитрата и НАДФ объясняется интенсивным функционированием пентозофосфатного цикла, приводящего к усилению восстановленных потенциалов в виде НАДФН. Имеются также сведения, что в мозгу крыс около 10% расщепления глюкозы происходит пентозофосфатным путем (Ленинджер, 1985).

Стимулирование биосинтеза пролина изоцитратом и алатом можно объяснить функционированием соответствующих ¡гилрогеназ, восстанавливающих окисленные нуклеотиды, тужащие в качестве кофактора одного из ферментов биосинтеза золина - П5КР.

Примечательно, что в присутствии малата (кофактор -АДФ) процесс биосинтеза пролина довольно интенсивно протекает ж в подосадке, так и в осадке гомогената, причем процесс в осадке ютекает с большей интенсивностью. Это объясняется тем, что, >мимо НАДФ-зависимой малатдегидрогеназы цикла Кребса, 'ществует и НАД-зависимая малатдегидрогеназа, но она >средоточена преимущественно в цитозоле и не имеет отношения к пслу Кребса. НАДФ-зависимая малатдегидрогеназа необходима как нератор НАДФН для синтетических процессов, в данном случае -л синтеза пролина (Строев, 1986).

Из изученных нуклеотидов лишь АТФ сильно ингибирует юцесс биосинтеза пролина, осуществляемый с участием НАДФ и гграта. Этот факт на данном этапе исследования трудно объяснить.

Таким образом, можно с уверенностью сказать, что юсинтез пролина теснейшим образом связан с пентозофосфатным ислом расщепления глюкозы, синтезом жирных кислот и икарбоновым циклом, особенно с НАДФ-зависимыми изоцитрат- и (латдегидрогеназами, снабжающими кофакторами (главным ¡разом, НЛДФ11) для эффективного восстановления П5К в пролин.

5.Ферменты окисления пролина в мозжечке крыс.

Результаты экспериментов приведены в табл.6, 7.

Данные табл. 6 свидетельствуют, что ферменты окисления юлина локализованы исключительно в осадочной фракции могената.

Таблица 6

ПО и П5КД активности гомогенатов мозжечка крыс, _мкмоль глу на 1 г ткани, п~5_

Фракции Активность

Гомогенаты 0,45 ±0,05

Надосадок 0

Осадок 0,33 ±0,05

Данные табл. 7 показывают, что окисление пролина не протекает в присутствии как О- , так и БЬ-формы субстата. Очевидно, Э-форма не только не может служить субстратом для ПО, но и наличие ее в виде рацемата с ¿-формой подавляет ПО-активность в отношении природного субстрата.

Таблица 7

Влиянте стереоизомеров пролина и некоторых ингибиторов на активность ПО и П5КД осадка гомогената мозжечка крыс, _мкмоль глу на 1 г ткани, п = 5_

Субстрат и ингибиторы Активность

L-пролии 0,50±0,07

п-ХМБ (3,3*10-°М) 0,55±0,05

п-ХМБ (3,3*10-4М) 0

Гидроксиламин (10"3М) 0,16±0,03

D-пролип 0

DL-пролнн 0

Из данных таблицы следует также, что процесс окисления пролина полностью подавляется при сравнительно высоких концентрациях п-ХМБ (3,3'10"4M). Разумеется, к п-ХМБ чувствительна П5КД, которая, как известно из литературы (Johnson, Strecker, 1962), является тиоловым ферментом. Процесс окисления пролина подавляется также гидроксиламином.

Таким образом, нами обнаружена, хотя и слабая, ПО и П5КД активность мозжечка крыс. Для сравнения отметим, что окисление пролина у жуков фасолевой зерновки (Гукасян, Лгаджаняи, 1988) протекает и 215 раз интенсивнее по срашкмшю с таковыми мозжечка крыс.

ВЫВОДЫ

1. Установлено преимущество НАДФН, по сравнению с НАДН, в качестве кофактора П5КР в мозжечке крыс.

2. При гель-фильтрации на сефадексе С-150 надосадочной фракции гомогената и надосадка солюбилизированного осадка мозжечка крыс обнаружено по одному изоэнзиму ОТ и П5КР. Ферменты биосинтеза пролина ОТ и П5КР мозжечка крыс локализованы в осадочной фракции гомогената, преимущественно в синаптосомах.

3. Разработана схема очистки ферментов биосинтеза проли-на ОТ и П5КР. Получены ОТ и П5КР мозжечка крыс со степенью очистки 53,1 и 700 соответственно.

4. Установлено ингибирующее. влияние адениловых нуклео-тидов, и в первую очередь АТФ, на активность ферментов биосинтеза пролина ОТ и П5КР мозжечка крыс. Причем, ингибирующий эфект АТФ па указанный процесс выражен гораздо сильное, если в качестве кофактора П5КР используется НАДН, а не НАДФН. Обнаруженный факт является своеобразным механизмом для регулирования внутриклеточного содержания АТФ.

5. Обнаружено ингибирование активности ОТ и П5КР в присутствии аспарагина, аспартата и аланина вследствие интенсивного функционирования в мозжечке крыс аспартат- и аланинаминотранс-фераз, с которыми орнитинаминотрансфераза не в состоянии конкурировать. Причем, ингибирующий эффект .указанных аминокислот и адениловых нуклеотидов проявляется одинаково, как на очищенных, так и на неочищенных ферментах - ОТ и П5КР.

6. Очищенная П5КР мозжечка крыс ингибируется п-ХМБ при слабых концентрациях (1,72"10'4М) наполовину, а при сравнительно высоких концентрациях (34,3 Ю'^М) - полностью, что свидетельствует о тиоловом характере фермента. Ингибирование процесса биосинтеза пролина происходит также монойодуксусной кислотой.

7. Сконструирована модельная система биосинтеза пролина в мозжечке крыс из орнитина с использованием очищенных изоэн-зимов ОТ и П5КР.

8. Обнаружена, хотя и слабая, активность ферментов окисления пролина в мозжечке крыс, активность которых ингибируется п-ХМБ и гидроксиламином.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. . Агаджанян В.А., Агаджанян А.Х., Галоян А.А.'Очистка ферментов

биосинтеза пролпна мозжечка крыс и их регуляторпые свойства. // Биолог, ж. Армении. - 1997. - Т.50,- N 1-2. - ст. 140-141.

2. Агаджанян А.Х., Агаджанян В.А., Давтян М.А. Ферменты биосинтеза пролина в мозжечке крыс. // Биолог, ж. Армении. -1997. - Т.50. - N. 1-2. - ст. 141-142.

3. Aghajanian V.A., Agliajanian A.Ch. The influence of oxiding-nucleotides and organic acids on the biosynthesis of proline in little brain of rats. // Abstracts. - Small International Conference on Brain and Immune System. - Yerevan. - Dilijan. - 1997. - P.2.

. 4. Aghajanian A.Ch., Aghajanian V.A.r Manukian I.P., Davtian M.A.Enzymes of proline biosynthesis in brain of rats. // Abstracts. -Small International Conference on Brain and Immune system. -Yerevan. - Dilijan. - 1997. - P.3.

ЧдиЬЬ Uruuîiuj]iu{i llrimçiufijuifi

"lpniJiGli IjhGuuiuliGphqli tyhpiîbGinûhpp Ь GpuiGg ш^иффирриО Цшцчшфцийр uinGbinJi пщЬгфЦтй:

uuonouq-M1

^uiûqnigwjjiû ршпЬр u¡pn¡liG, Iibduiuujiûpbq, ojiûJip[iû, а-Щшинцшпиршш, opü¡ipjití uiptuüuiuiíjiüiuqiu, utfipn-¡}¡ü-5-lpuppopuJiiiup nbipnlpmuqiu, uinûbui, mi¡bq¡il].

<huimqnini[h^ hü uipn^idji libGuuiuJiGphqli $hpúbGmGbpp' opGlipJiG-S-ipiuGuiuiî|iGuiqiuG (OS) b u]|i[i||iG-5-lpup|Hipuli|Uiin nbipuljiniuqiuG (П15ЧП-), n-íüp mbi\uilpuji}uiô UG ишйЬиф iui\Ui\lilili JiGjuiliu puàbQi uijGiqUubi ííGiugiipipu-iG 4>inul}gliuiGbpmtf: ¿,шишшш1|Ь[ 1;, np (¡¿ijuid фЬрйЬйтйЬрр inbipuljuij^iiiö 1 пщЬ^йф uliGmvqinnumSGhpimS, npmhq uipji]jiG{i IjbGuuiuJiGpbqli GuifuuiGjnip diunuipml piugji opGJipliQJig Grnb mpgliGJiGp:

3niji| t mpijhi, np puigji ot-ljhinnqpitmuipuimlig, opGJipliGp тршйиииф-лдфпй t GiuU tqlipnjuuiipiriuippilli b pppGglpupuigiufuiuppiHi libin:

Ub3)-p, uiuupupuiqliGuippniG, luuujuipiuqliGp Ь iupuû}iGp ЬшОгфиш-niî bG OS-í1 b i)5Wfi--ji uipiyniGuiiibm pGlidiuiGbp, pGipipmil Utri-Ji uiqqb-npjniGp mi)bi]i uiljGhuijin t , Ьрр npiqhu Ipi^uilpnnp oqmiuqnpômiî t

lIUI-p: TlpniliGJi IjbGumuliGpbqlx pGL[6niúp uiuiquipuiq][iGuippi{ml b uipuG[iGnil, uiluiGuipuip puiguiuipiJiiS t niqbijlil|niii ¿u^iuquiGg ш1рп1п[ шшцшртшт b ui-iG]iG u)|iiuGuiuií|iGiuqiuübp¡i qnpôniûbuipjiutîp npiiGg hbui opG|iin]iG mpiuGuiu-lGiuquiG ¿li Ipupiiq йрдафдЬ^ libinuppijli huiiîuip:

fhqhrijilili .^hptfbGuiuijliG ищЬирирштр иЬфшцЬри G-150-ni[ ЬЬ^ЭДцт-ugjimjli bGpuiplibpng кицтйшрЬрфз^ t OS-{i Ь ]i úblpulpuQ ¡iqntûq{uî-

¡p: QiuiudGiüu¡i¡ii|hi 1. uiaipuipinpiibplpup¡ipUQqnuiui[i (uj-RUP) b línGujnqpui-uluiuppi|li luqqbgnipjniüp шпйЬиф ji2ii|biijil|iiiiS uipniliGji ljbGuuiu]iGpbqli .'|)bp-¡GmGbpli фш: \>2д}ш0 ú]iuiginpjniüGhpli guiöp IpGgbGinpuigliuiü Щшт} ¿шф iljfiniiJ t tupi $bpiSbGui'Gbpli ифиффиррпОр, |iulj uj-filTP-Ji hunîbiîuiinuipuip upáp IjnGgbümpuigliuiQ püljßniü t uiiSpnr^mpjuiúp:

UhqbpujliG фпрйЬртй liGuipu^np t bqb[ lipuilpuGuigGbi ujpniliGJi uliG-¡q, oqmmqnpöbpiil ишйЬиф inqbijiyig uiûçuimiluiiï b üujppijuiö OS b ^б^П-¡piîbGuiûbpp:

<buiiuqnuii|h[ t opulii}uigt]ui& Gnil}[bnmligGbpli (Ы1Т-, "Ы1'1-Л>) b opqui-uljuiG ppniGbpli (gliinpium, liqnglimpuim, lïuipum) uiqiibgnipjniGp шпОЬиф m-itJilpiiií ujpniliGli libüuiuujiüpbqji i[pui: "b;i[ui& Gnil)[hninju]Gbpp, lunuiGáGui-ju ЪИ1-3)-р, [iGlj6bpii| iíuiuGiul{¡i iluippijiuö .^bpiîbûmGbpji ш^иффпррп Gp,

pGi]!nulpnnujljp, ¡upiuGniü hQ uiji] iqpngbup luiúnqhGiuinGbpmií: ^[тфО^ IjbG-ииифйрЦр [upiuGiuii UG thuU opquUuul|iuG ppiuGbpp opujupuqijtuí) Сни^Ьиифц-Gbpji lunliiujiiipjiuúp: Ършйр [ípbüg iul[in]ii{uigikuü índqüinpjiuiSp цшишфф-i}iniî Ьй hbmbjuii Gi{aiqii]| huijnpqiuliiuGiupjiuiSp' liqnglnnpium, glimpium, lîui-[шш: h i^huj, fupuiûùuiQ ujpiigbup un]bi]i uipryiuGiuiJbui t \>UfH>-li úuiuGuilj-tjmpjiuiïp:

Uliji liiiipíjii) ityiul|i|iuô bi|iul¡uil¡m| l4uul|iuGiu(|i|li| I. шпШшф nii|lii|liljliy iuGjiumi[iu0 OS b "15 Uli- ;}>bpdbGmühpli iîuippiinïii:Uunugi[b| t OS' 53,1 ú'tupp-úuiü muinli6iuQii4 Ь 8,6% bipni¡ U f45kü-' 700 úuippúiuú uium}i6iuûinl U 5% b^-рпф

lin Q h in ¡i ini]bi}]itpiid hmjmGmpbpi}b[ t Gmb ицшфйр opuJiqmgGnri фЬр-úbGinGbp, lipnQg ш^иффиррийр рй^бфий t upJïUP-nil b hjirpiop ифршфйт): ^lmpqilbL t, np iqpiqjiQ opujupuquijli hiuúiup îipujbu umpumpuim t öuiniujniiS ицшфйр L -uuibphnjiqnúhpp, ]iul¡ D-àLp, n¿ úliuijü ¿Ii öuinuijiuiS npiqbu unipain-puiui,iupU йрш umljuijnipjuitíp DL-nuigbiíuiui¡i ábm[ uipqhpul}ilnuS t фЬрйЬйиф qnpômGhnipjmGp' pûiulpiiQ unipuinpiump Gpiipa^mJuuiQailpiipjiuü ицшдЬи GbpqpmiJhiJiu:

•4imin|h|\ II)?

Su|ui|Mii(inil| M)

l.-[ibuiU|i ii|l.uuiil|Liili luiiüuiiuiuiiiuti|i uu|b|uuui|u| uini¡u|iuii.'|>lnujli uuinpiupiuiliulimiî Upliuli, U[. 1Гшйш1цшй 1