Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ферментативные технологии направленной биоконверсии целлюлозо- и крахмалсодержащего растительного сырья

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Ферментативные технологии направленной биоконверсии целлюлозо- и крахмалсодержащего растительного сырья"



На правах рукописи

Тарабукин Дмитрий Валерьянович

ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ НАПРАВЛЕННОЙ БИОКОНВЕРСИИ ЦЕЛЛЮЛОЗО- И КРАХМАЛСОДЕРЖАЩЕГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ

Специальность 03.00.23 «Биотехнология»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 з НОЯ

Уфа2009

003483595

Работа выполнена в лаборатории биохимии и биотехнологии Института биологии Коми научного центра УрО РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Володин Владимир Витальевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Логинов Олег Николаевич

доктор биологических наук, профессор Акопян Валентин Бабкенович

Ведущая организация

ОАО ГосНИИ СИНТЕЗ БЕЛОК

Защита состоится 4 декабря 2009 г. в 1600 на заседании диссертационного совета ДМ 002.136.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054 г. Уфа, пр. Октября, д. 69. Тел./факс (347)2355362, E-mail: ib@anrb.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии Уфимского научного центра РАН и на официальном сайте: http://vyvvvv.anbr.ru/inbio/dissovet/index.htm

Автореферат разослан 3 ноября 2009 г.

Ученый секретарь

Объединенного диссертационного совета, кандидат биологических наук

Р. В. Уразгильдин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. К настоящему времени ферментативные технологии стали одним из наиболее эффективных средств трансформации многих видов биологического сырья (Биотехнология..., 1987; Болобоваидр.,2001; Квеситадзе, Безбородов, 2002; Rabinovich, 2006; Шишков, 2007; Salazar, 2007). Применение ферментов в качестве биокатализаторов позволяет существенно расширить сырьевую базу пищевой промышленности и кормопроизводства, повысить глубину переработки сырья, создать новые виды пищевых продуктов и кормов, а также улучшить усвояемость и органолептические свойства известных (Кислухина, 2002; Nicemol, 2008). Кроме того, переход от традиционных химических к биотехнологическим методам во многих случаях становится единственной возможностью для создания малоотходных технологий и экологически чистых производств (Быков, 1989; Araujo et al., 2008; Sanchez, 2009). Ярким примером является процесс ферментативного получения глюкозы из крахмала (Производство..., 1967).

Однако, несмотря на очевидные преимущества получения глюкозы ферментативным гидролизом целлюлозосодержащего сырья и прогресс, достигнутый в этой области (создание теоретических основ, разработка аппаратов и опытно-промышленных установок для ферментативного гидролиза целлюлозы), до настоящего времени процесс не удается реализовать на промышленном уровне из-за его относительно низкой рентабельности по сравнению с традиционным кислотным гидролизом (Даниляк и др., 1989; Синицын и др., 1995). В то же время целлюлолитические и амилолитические ферменты получают широкое применение как улучшающие структуру целлюлозных материалов биологические агенты в текстильной промышленности, а также в качестве компонентов комбикормов для повышения их усвояемости (Быков, 1984; Чешкова, 1996,2000; Кричевский, 1998; Bhat, 2000; Барышева, 2006). Следовательно, разработка новых ферментативных процессов и продуктов с использованием целлюлаз и амилаз остается одной из актуальных задач современной биотехнологии.

Цель работы заключается в разработке научных основ ферментативных технологий получения новых материалов с заданными свойствами путем направленной биоконверсии целлюлозо- и крахмалсодержащего сырья.

Задачи работы:

1. Исследовать влияние надмолекулярной структуры порошковых целлюлоз, полученных с помощью различных модифицирующих агентов, на их реакционную способность к ферментативному гидролизу.

2. Оценить возможность одновременного получения порошковой целлюлозы заданной структуры и глюкозы при совместном ферментативном гидролизе лиственной беленой целлюлозы и крахмала.

3. Оптимизировать процесс осахаривания многокомпонентных трудноусвояемых растительных субстратов и разработать новую белково-углевод-ную основу кормов моногастричных животных.

Научная новизна. Выявлена связь между особенностями строения порошковых целлюлоз, полученных с использованием модифицирующих агентов различной природы, и их способностью к ферментативной деструкции. Впервые установлено, что порошковые целлюлозы, полученные продолжительным воздействием на исходную целлюлозу кислотами Льюиса, обладают низкой адсорбционной емкостью по отношению к целлюлазам, характеризуются наибольшей начальной реакционной способностью при наименьшем изменении степени полимеризации целлюлозы, что обусловлено ослаблением субстрат-ферментных взаимодействий за счет разупоря-доченности надмолекулярной структуры и химической модификации макроцепей в порошковых целлюлозах указанного типа.

Показана возможность получения порошковых целлюлоз заданной структуры и глюкозы при совместном ферментативном гидролизе лиственной беленой целлюлозы и крахмала. Выявлено, что характеристики получаемой порошковой целлюлозы в значительной мере определяются вязкостью водной среды, задаваемой концентрацией крахмала в исходной смеси.

Исследован и оптимизирован процесс совместного ферментативного гидролиза целлюлазами и амилазами многокомпонентного растительного сырья (стебли травянистых растений и неочищенные зерна злаковых культур). Показана возможность исключения стадии обработки коммерческими препаратами Р-амилаз растительных субстратов с большим содержанием некрахмалистых полисахаридов.

Практическая значимость. Показана принципиальная возможность получения новых устойчивых к биодеструкции функциональных материалов путем ферментативной деструкции порошковых целлюлоз, модифицированных кислотами Льюиса.

Предложен режим ферментативного гидролиза лиственной беленой целлюлозы в присутствии крахмала, позволяющий получать порошковую целлюлозу с физико-химическими характеристиками, оптимальными для использования в медицине и химической промышленности, и увеличить рентабельность процесса за счет дополнительного выхода восстанавливающих Сахаров при гидролизе целлюлозы по сравнению с ожидаемым выходом Сахаров из крахмала.

С использованием ферментативных биотехнологий трансформации труд-ноусваеваемых многокомпонентных растительных субстратов разработана новая белково-углеводная основа кормов для птицеводства, обогащенная сахарами, с оптимальным аминокислотным составом, близким к идеальному белку FAO, и не содержащей антипитательных веществ.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на республиканских Молодежных научных конференциях «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2004,2005,2007), IV Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар 2006), XI международной конференции «Эфиры целлюлозы и крахмала: синтез свойства, применение» (Владимир, 2007). I Всероссийской молодежной научной конференции «Молодежь и наука на Севере» (Сыктывкар, 2008), II Всероссийской молодежной научной конференции «Молодежь и наука на Севере» (Сыктывкар, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК и два патента Российской Федерации.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста и включает введение, литературный обзор, материалы и методы исследований, три главы экспериментальной части, выводы, а также содержит 10 таблиц и 42 рисунка. Список литературы состоит из 180 ссылок.

Глава 2.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали беленую сульфатную целлюлозу из лиственных пород древесины производства ОАО «Сыктывкарский ЛПК», (СПср = 520; I = 0.54), хлопковую микрокристаллическую целлюлозу производства АО «Полиэкс», (г. Бийск), СПср = 230, льняную беленую целлюлозу (СП>2000, содержание лигнина 2 %). В качестве субстрата для амилаз использовался картофельный крахмал (ГОСТ 7699-78), содержание углеводов 90%.

Источником целлюлаз являлись промышленный ферментный препарат Целловиридин Г20х (Ц) (активность по хроматографической бумаге 500 ед/г) и Пектофоетидин ГЗх (П) (активность по целлобиазе 35 ед/г). Источником амилаз служили препараты Амилосубтилин ГЗх (Ам) (а-амилазная активность 600 ед/г) и Глюкаваморин ГЗх (Гл) (ппокоамилазная активность 400 ед/г).

ИК-спектры получены на ИК-Фурье спектрометре MIR-8000 (ORIEL) в таблетках КВг. Рентгенофазовый анализ (РФА) проведен на рентгеновском дифрактометре ДРОН-3 (начальный угол 5.00 град., шаг измерения 0.05 град.,

конечный угол 40.00 град.). Индекс кристалличности (1^ рассчитан по отношению интенсивностей рефлекса при углах 22° и 19° при углах дифракции 20—метод Сегала (Мартынов, 1972). Степень полимеризации (СП^) образцов определяли по вязкости растворов в кадоксене на вискозиметре Оствальда с диаметром капилляра 0.82 мм (Болотникова, 1966). Концентрацию восстанавливающих Сахаров (ВС) определяли методом Шомоди-Нельсона (Somogyi, 1945).

Ферментативный гидролиз порошковых целлюлоз (ПЦ) проводили на водяной качалке в герметично закрытых бюксах при 55 °С и 150 об/мин. Масса образца—50 мг, объем реакционной смеси—2 см3. Концентрация ферментного препарата 0.25 мг/см3. Отбор проб осуществляли через 3, 6, 15,24,48 ч. Количество фермента, адсорбируемого на субстрате, рассчитывали по разности значений активности целлюлаз в ферментном растворе до и после адсорбции.

Ферментативный гидролиз крахмал-целлюлозной смеси проводили на термостатируемой качалке в герметично закрытых бюксах объемом 10 см3 в 0.1 М ацетатном буфере (рН 4.7) при 55 °С, и 150 об/мин. Оценку эффективности совместного ферментативного гидролиза вели по динамике накопления ВС в реакционной смеси, снижению степени полимеризации лиственной целлюлозы, а также качественному составу продуктов гидролиза целлюлозы и крахмала (массы навесок целлюлозы и крахмала 250 мг). Адсорбцию амилаз на целлюлозе проводили при 20 °С в течение 10 мин, соотношение целлюлоза/ферментный препарат—5:1.

За единицу активности целлюлаз принято такое количество ферментов, которое, действуя на 50 мгхроматографической бумаги (Ватман 1) при 50 °С и рН 4.7 в течение 1 часа, образует 1 мг восстанавливающих Сахаров (в пересчете на глюкозу).

За единицу активности целлобиазы принято такое количество ферментов, которое, действуя на 1 г целлобиозы при 40 °С и рН 4.7 в течение 1 мин, образует 1 мкмоль глюкозы.

За единицу глюкоамилазной активности принимали способность фермента катализировать гидролиз растворимого крахмала при 30 °С и рН 4.7, высвобождая за 1 мин 1 мкмоль глюкозы.

За единицу амилолитической активности принимают такое количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 г крахмала за 1 час.

Уреазную активность определяли по методу И. Н. Ромейко и С. М. Ма-линского (Хазиев, 2005) с применением реактива Неслера. Активность уре-азы выражали в миллиграммах NH4 на один грамм образца за 1 час.

Содержание р-глюкана в образцах определяли по ICC Standard Method No .168 (www.megazyme.com).

Содержание аминокислот в образцах определяли на аминокислотном анализаторе АААТ-339М (Чехословакия) после предварительного гидролиза последних 20%-ным раствором соляной кислоты при 110 °С в течение 24 часов и разделении гидролизата на хроматографической колонке, заполненной ионообменной смолой «Ostión».

Исследование углеводного состава гидролизатов проводилось методом ВЭЖХ на хроматографе Knauer (Германия), детектор рефрактометрический Smartline 2300, колонка 150x3 мм, сорбент Sepharon SGX NH2 7 мкм, элюент ацетонитрил/ацетатный буфер (0.002 М, рН 5.0) 80:20 об.%, скорость подачи элюента 1 см3/мин.

Глава 3.

ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ И ФЕРМЕНТАТИВНОЙ ДЕСТРУКЦИИ ПОРОШКОВЫХ ЦЕЛЛЮЛОЗ

В качестве объектов исследования были использованы ПЦ, полученные методами гидролиза целлюлозы перкислотами и обработки целлюлозы кислотами Льюиса в апротонных растворителях, а также коммерческий препарат хлопковой микрокристаллической целлюлозы (ТУ 64-11-124-90) (табл.1).

В ходе ферментативного гидролиза препаратом Целловиридин Г20х для образцов 3 и 4 отмечена самая высокая скорость накопления ВС в начальный период реакции, однако после 6 ч ферментативной обработки скорость накопления ВС значительно снизилась и далее изменялась незначительно (рис. 1). Было предположено, что происходит сильное ингибирова-ние ферментов продуктами реакции, однако после того, как к непрогидро-лизованным промытым остаткам образцов 3 и 4 после 15 часов гидролиза был добавлен свежий ферментный раствор в том же объеме, увеличение скорости накопления ВС не происходило. Отмечено, что и для остальных образцов скорость накопления ВС уменьшается после 6 ч обработки.

Исследование адсорбционной способности образцов ПЦ выявило следующие результаты: образец 7 при самой низкой реакционной способности, обладал наибольшей сорбционной способностью; образец 6, полученный, как и 7, обработкой целлюлозы льна перуксусной кислотой, однако при меньшей длительности обработки уступал по сорбционной способности исходной целлюлозе льна. В то же время образцы 3 и 4 при высокой реакционной способности, практически не сорбировали целлюлазы.

Поскольку для атаки целлюлаз в начальный период реакции наиболее доступными являются аморфные области целлюлозного материала, следовало ожидать значительное снижение СПср для образцов ПЦ 2,3,4, однако

Таблица 1

Условия получения и свойства ПЦ

Образец Исходная СПср исходного Деструктирующий агент и СПср после 1кр 1кр

№ п/п целлюлоза субстрата условия деструкции дуструкции (ИКС) (РФА)

1 Лиственная 520±10 H2SO4-H2O2, 120 мин 240±10 0.72 0.70

2 Лиственная 520±10 0Л% TiCl4 в СС14, 10 мин 260±10 - 0.54

3 Лиственная 520±10 1.5% TiCI4 в СС14, 60 мин 180±10 0.12 0Л5

4 Лиственная 520±10 0Л% А1С13 в СС14, 60 мин 210±10 0.00 0.00

5а Хлопковая - HCl 230±10 0.86 0.88

6б Льняная > 10000 СН3С00Н-Н202, 2 ч ззо±ю 0.74 0.84

7б Льняная > 10000 СН3СООН-Н2О2, 4 ч 300±10 - 0.82

а — коммерческий образец; б

— значения СПср приведены по литературным данным (Льноводство, 1967)

—ПЦ5 —а—ПЦ1 —А— ПЦ7 ГЦЗ —Ж— ПЦ4 —ПЦ6

О 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Время, ч

Рис. 1. Накопления восстанавливающих Сахаров при ферментативном гидролизе ПЦ

при относительно высокой реакционной способности по сравнению с другими образцами ПЦ значительное падения СПср, в данном случае наблюдалось лишь для образца 2, в то же время изменение данного показателя для образцов 3 и 4 оказалось небольшим (табл. 2).

Для образцов 5,6 и 7, полученных из целлюлозы хлопка и льна методами кислотного гидролиза, в начальный период реакции отмечали незначительное снижение СПср. Полученные данные для этих образцов может быть объяснено быстрым ферментативным гидролизом присутствовавших в

Таблица 2

Изменение степени полимеризации целлюлозы в образцах ПЦ после ферментативной обработки

Образец Исходная СПс„ в процессе ферментативной деструкции

целлюлоза 0 3 6 15 24 48

ПЦ-1 Лиственная 240±10 170±10 170±10 170±10 170±10 162±10

ПЦ-2 Лиственная 260±10 260±10 210±10 180±10 180±10 160±10

ПЦ-3 Лиственная 180±10 180±10 1В0±10 180±10 180±10 140±10

ПЦ-4 Лиственная 210±10 190±10 190±10 190±10 190±10 190±10

ПЦ-5 Хлопковая 230±10 220±10 210±10 210±10 200±10 110±10

ПЦ-6 Льняная 300±10 280±10 280±10 280±10 270±10 140±10

ПЦ-7 Льняная 330±10 320±10 320±10 300±10 300±10 260±10

лц Льняная >2000 1300±50 1280±50 1280±50 1280±50 1240±50

образцах низкомолекулярных фракций, по-видимому, образующих аморфные области, доля которых в исходном образце была относительно мала. В то же время у образца 1 при относительно высоком показателе индекса кристалличности, СПср значительно падала в начальный период, но далее практически не изменялась.

Для образцов с преобладанием кристаллической структуры, как правило, происходил небольшой рост содержания упорядоченной части после 6 часов ферментативного гидролиза (рис. 2,3), при продолжительности процесса до 24 ч наблюдается незначительные снижение содержания в целлюлозе упорядоченной части.

'^•Члл,.

Л

К. 1

/ \

1 ¡«"»д/у

ч.

Л

мм

д * М'^ДЧУ

? 1\

5 Ю 15 20 25 30 35 40~

Рис. 2. Рентгенограмма ПЦ1 (1 — исходный образец; 2,3 — после 6 ч и 24 ч ферментативного гидролиза)

Ч. Гил I

V-.' Л ,1

Ю 15

20 25 30 35 40

Рис. 3. Рентгенограмма ПЦ5 (1 — исходный образец; 2,3 — после 6 ч и 24 ч ферментативного гидролиза)

ВЭЖХ-анализ продуктов гидролиза образцов показал, что в состав ВС ПЦ-1, ПЦ-3 из лиственной целлюлозы входят ксилоза, глюкоза и целлобиоза. В то же время гидролизат ПЦ-4 при наличии ксилозы и глюкозы, характеризуется отсутствием целлобиозы. Для ПЦ-5 отмечено наличие, как глюкозы, так и целлобиозы. Преобладающим восстанавливающим сахаром в гидро-лизатах ПЦ из льна является целлобиоза, причем ее доля возрастает для ПЦ-7 полученной более продолжительным действием перуксусной кислоты.

Таким образом, в процессе получения ПЦ каталитической деструкцией кислотами Льюиса, происходит значительная химическая модификация исходной целлюлозы, что вызывает ослабление фермент-субстратных взаимодействий. Отсутствие адсорбции целлюлаз на негидролизуемом субстрате дает перспективу многократного использование ферментов с целью удале-

ния оставшихся природных фрагментов целлюлозы. Это позволяет использовать химически модифициронный остаток целлюлозы для изготовления материалов устойчивых к биодеструкции.

Глава 4.

ПОЛУЧЕНИЕ ПОРОШКОВОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ И ГЛЮКОЗЫ ФЕРМЕНТАТИВНЫМ ГИДРОЛИЗОМ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ В СМЕСИС КРАХМАЛОМ

Целью данного исследования являлась оценка возможности получения порошковой целлюлозы с характеристиками, близкими к образцам порошковых целлюлоз, получаемых традиционными кислотными методами, и глюкозы при совместном ферментативном гидролизе лиственной беленой целлюлозы и крахмала.

При проведении ферментативного гидролиза целлюлозы и крахмала при совместном присутствии была дана оценка влияния целлюлозы на активность различных типов амилаз, а также влияние мальтозы (продукта гидролиза крахмала) на целлюлазную активность. Показано, что после инкубирования с целлюлозой ферментный препарат Амилосубтилин ГЗх значительно теряет активность а-амилазы, однако в большей мере сохраняет экзоа-милазную активность (табл. 3). Глюкаваморин ГЗх теряет около 50 % ппоко-амилазной активности. Полученные данные свидетельствуют о необходимости учета фермент-субстратных взаимодействий амилаз с целлюлозой, приводящих к частичной инактивации амилолитических ферментов.

В свою очередь, установлено, что мальтоза (главный продукт действия (3-амилазы) ингибирует целлюлазы, по нашему предположению, вследствие структурного сходства с целлобиозой.

Принимая во внимание известные в литературе факты, что гидролиз крахмала грибными и бактериальными амилазами проходит стадию разжижения крахмалсодержащей среды а-амилазой с последующим осахарива-нием субстрата глюкоамилазой (Жеребцов и др., 1995; Технология спирта,

Таблица 3

Остаточная амнлолитическая активность ферментных препаратов после инкубирования с беленой лиственной целлюлозой, %

а-амилазная Экзоамилазная Глюкоамилазная

Ферментный препарат активность, активность, активность,

ед/г ед/г ед/г

Амилосубтилин ГЗх 37±5 87±5 н/о

Глюкаваморин ГЗх н/о* н/о 53±5

Примечание: * н/о—данный тип активности в ферментом препарате не определялся

2002), а также полученные нами экспериментальные данные по ингибиро-ванию ферментов амилазного и целлюлазного комплексов, нами предложены следующие расходы ферментных препаратов (в расчете на использование в качестве субстрата 5%-ной смеси беленой лиственной целлюлозы и крахмала в соотношении 1:1): Целловиридин Г20х — 20 ед/г целлюлозы, Глюкаваморин ГЗх — 8 ед/г крахмала, для Амилосубтилин ГЗх — 5 ед/г крахмала. При использовании Амилосубтшшна ГЗх данный препарат вносили в начале процесса, а остальные ферментные препараты—после полутора часов, при этом расход Глюкаваморина ГЗх был уменьшен вдвое. Общее время гидролиза — 8 часов.

При проведении совместного ферментативного гидролиза целлюлозы и крахмала было показано, что без предварительной активации крахмал в присутствии амилаз практически не подвергался гидролизу, концентрация ВС в гидролизатах была фактически равна концентрации ВС в гидролизате целлюлозы, полученном без добавления крахмала. При перемешивании реакционной смеси в течение 8 часов концентрация ВС в гидролизате увеличилась в два раза по сравнению с режимом без перемешивания.

Предварительная активация крахмал-целлюлозной смеси в течение 5 мин при 100 °С перед ферментативным гидролизом привела к значительному увеличению выхода ВС в конечном гидролизате, причем наличие Амилосубтшшна ГЗх в композиционном ферментном препарате не сказывалось на увеличении выхода ВС (рис. 4). Применение препарата Амилосубтилин ГЗх без Глюкаваморина ГЗх оказалось не целесообразным, что, вероятно, обусловлено ингибированием целлюлаз мальтозой, с одной стороны, и неспособностью ферментов, входящих в состав Амилосубтилина, гидролизовать 1,6-а связи крахмала, с другой.

Для оптимизации режимов получения ПЦ и глюкозы в следующей серии опытов продолжительность процесса ферментативного гидролиза была увеличена до 17 часов, расход Целловиридина Г20х был уменьшен вдвое, добавлен Пектофоетидин ГЗх из расчета 0.72 ед/г целлюлозы. Остальные параметры состава композиционного ферментного препарата не изменяли.

За указанное время активированный крахмал в отсутствие целлюлозы гидролизуется полностью препаратом Глюкаваморин ГЗх (табл. 4). Кроме того, было экспериментально показано, что способностью осахаривать крахмал обладает и препарат Пектофоетидин ГЗх. Этот факт является немаловажным в том плане, что при гидролизе крахмала препаратом Глюкаваморин ГЗх в присутствии целлюлозы, часть активности пиокоамилазы уменьшается из-за сорбции фермента на целлюлозе и в то же время будет скомпенсирована за счет экзоамилазной активности, которой обладает Пектофоетидин ГЗх. Гидролиз целлюлозы прапаратом Целловиридин Г20х с добавлением

а 2 4 6 8 1&

Время, ч

Рис. 4. Совместный гидролиз крахмал-целлюлозной смеси амилазами и целлюлазами в режиме с перемешиванием и предварительной активацией при 100 °С в течение 5 мин (1 — Гл + Ц; 2 — Ам + Гл + Ц; 3 — Ам + Ц)

Таблица 4

Гидролиз отдельных компонентов крахмал-целлюлозной смеси с помощью различных ферментных препаратов (время гидролиза 17 часов)

Режим ВС, мг СП непрогидролизованного остатка целлюлозы

Без целлюлозы, 250 мг крахмала (Гл) 230±5 н/о

Без целлюлозы, 250 мг крахмала (П) 100±10 н/о

Без крахмала, 250 мг целлюлозы (Ц) 30±3 240±Ю

Без крахмала, 250 мг целлюлозы (Ц + Гл + П) 50±5 210±10

препаратов Глюкаваморин ГЗх и Пектофоетидин ГЗх дает сравнительно больший выход ВС за счет дополнительного количества вносимых целлюлаз.

При гидролизе 5%-ной крахмал-целлюлозной смеси наиболее оптимальным с позиции выхода ВС и характеристик ПЦ (непрогидролизованного остатка целлюлозы после ферментативного гидролиза) оказался режим с применением композиции препаратов Целловиридин Г20х, Глюкаваморин ГЗх и Пектофоетидин ГЗх, но без препарата Амилосубтилин ГЗх. Указанный режим позволяет увеличить выход ВС за счет гидролиза целлюлозы на 17 % по сравнению с ожидаемым выходом ВС из крахмала (табл. 5). По данным ВЭЖХ-анализа главным продуктом совместного гидролиза крахмала и целлюлозы является глюкоза при незначительном содержании ксилозы, СПср непрогидролизованного остатка целлюлозы — 240. Индекс кристалличности ПЦ составил 0.80±0.02.

Увеличение исходной концентрации крахмал-целлюлозной смеси до 10 % при соотношении компонентов (1:1) и двукратное увеличение расходов ферментных препаратов при 17-и часовом гидролизе, как и ожидалось, привело к увеличению выхода ВС до 510± 10 мг, однако негативно сказалось на величине СПф непрогидролизованного остатка целлюлозы (400±10 вместо оптимальной для ПЦ СП = 250 и менее) вследствие более высокой вязкости реакционной среды (табл. 5). Режим с применением Амилосубтилина ГЗх не сказался ни на увеличении выхода ВС, ни на уменьшении величины СПср. Отмечено, что при всех режимах обработки наблюдали увеличение I целлюлозы в непрогидролизованных остатках до 0.75—0.85 (I исходной лиственной целлюлозы 0.54).

Учитывая полученные закономерности, нами был отработан следующий режим гидролиза крахмал-целлюлозной смеси: в конечный гидролизат 5%-ной крахмал-целлюлозной смеси объемом 8 см3 после 17 ч гидролиза вносили свежие порции крахмала, целлюлозы и ферментных препаратов, объем смеси доводили до 10 см3 и цикл повторяли заново. Использование двухстадийного процесса гидролиза позволяет не только повысить выход ВС (520±10 мг), но, главным образом, получить ПЦ с оптимальной СПср= 240. Последний результат, вероятнее всего, достигается благодаря проведению процесса гидролиза в менее вязкой среде.

Таблица 5

Режимы совместного гидролиза крахмал-целлюлозной смеси

Режим ВС, мг СП непрогидролизованного остатка целлюлозы Остаток целлюлозы, % к исходной массе

Целлюлоза + крахмал, 500 мг (Ам + Гл + Ц + П) 260+5 290+10 85+2

Целлюлоза + крахмал, 500 мг (Гл + Ц + П) 270+5 240+10 85+2

Целлюлоза + крахмал, 1000 мг (Гл + Ц + П)* 510+10 400+10 88+2

Целлюлоза + крахмал, 1000 мг (Ам +Гл + Ц + П)* 510+10 400+10 88+2

Целлюлоза + крахмал, 2 раза по 500 мг (Гл + Ц + П) 520+10 240+10 85+2

* Двукратное количество вносимых ферментных препаратов (объяснение по тексту)

Глава 5.

ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ IN VITRO КАК СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙЦЕННОСГИ ТРУД1ЮУСНАИ НА Е ÍY1Ы X КОРМОВ

Была оценена эффективность применения ферментативного гидролиза модельной кормосмеси, содержащей в качестве субстратов трудноусваи-ваемые компоненты.

В качестве компонентов модельной кормосмеси нами использовались измолотые неочищенные зерна овса Avena sativum L., измолотые стебли серпухи венценосной {Serratula coronata L.) (растительные отходы при получении экдистероидсодержащей субстанции Серпистен из листьев этого вида растений) и подсолнечный шрот. Ферментативный гидролиз модельной кормосмеси проводили с использованием отечественных амило- и целлюлолитических ферментных препаратов, причем в случае применения препарата Амилосубтилин ГЗх использовали 0.01 М фосфатный буфер с рН 6.0, а в случае препаратов Целловиридин Г20х и Глюкаваморин ГЗх -0.01 ацетатный буфер с рН 4.7.

Совместное воздействие эндо-фермента б-амилазы и экзо-фермента (3-амилазы препарата Амилосубтилин ГЗх (0.2 % к массе смеси) на крахмал кормосмеси приводит к ускоренному накоплению в реакционной смеси ВС, однако процесс гидролиза выходит на стационарный уровень после четвертого часа, вероятно, вследствие недостаточного количества ферментов, способных расщеплять 1,6-а-связи крахмала (рис. 5).

Под действием целлюлазно-гемицеллюлазного комплекса препарата Целловиридин Г20х (0.2% к массе смеси) гидролизуются некрахмапьные полисахариды, однако, наличие основного полисахарида — крахмала не приводит к существенному образованию Сахаров. Из-за низкой эндоами-лазной активности препарата Глюкаваморин ГЗх (0.2 % к массе смеси) накопление Сахаров на начальном этапе замедленно, однако после 8 часов гидролиза наблюдается наибольший выход ВС. Поскольку в кормосмеси и крахмал, и некрахмалистые полисахариды содержатся в значительном количестве, в дальнейших экспериментах в основное внимание было сконцентрировано на эффективном комбинировании данных препаратов между собой с учетом знания температурного и рН оптимумов действия используемых ферментов. Дозировка ферментных препаратов составляла (к массе смеси): для Амилосубтилина ГЗх—0.1%, для Глюкаваморина ГЗх — 0.2 %, для Целловиридина Г20х—0.1 % от массы кормосмеси. В случае применения препарата Амилосубтилин ГЗх ферментативный гидролиз проводился в две стадии: первая длилась три часа при рН 6.0 и температуре 60 °С, вторая

Накопление ВС в рабочем объеме, мг 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 250 0

0123456789 Время, ч

1 - Цепловиридин Г20х, 2 - Глюковаморин ГЗх, 3- Амлосубтилин ГЗх

Рис. 5. Гидролиз двухкомпонентного субстрата отдельными ферментными препаратами (9 г измолотых неочищенных зерен овса + 1 г измолотых стеблей серпухи венценосной в 100 см3 буфера)

(с доведением рН до значения 4.7 и добавлением остальных ферментных препаратов) продолжалась 5 часов при температуре 55 °С.

В ходе отработки различных режимов ферментативного гидролиза выявлено, что наибольший выход ВС наблюдается при совместном воздействии ферментативных комплексов препаратов Глюкаваморин ГЗх и Цел-ловиридин Г20х (рис. 6). Режимы гидролиза модельной кормосмеси с применением препарата Амилосубтилин ГЗх не выявили значительного преимущества в выходе ВС, поэтому в дальнейших экспериментах за основу был принят одностадийный процесс с применением ферментных препаратов Глюкаваморин ГЗх и Целловиридин Г20х.

Оценка влияния количества подсолнечного шрота, вводимого перед гидролизом к двухкомпонентной кормосмеси (стебли серпухи + овес) выявила, что увеличение доли шрота приводит к снижению выхода ВС. В то же время подсолнечный шрот, введенный на конечной стадии гидролиза (25% от массы остальных компонентов кормосмеси) привел к некоторому увеличению выхода ВС. Для увеличения экономичности процесса концентрация кормосмеси была увеличена до 20%, при этом подсолнечный шрот вводился после третьего часа гидролиза, а для интенсификации гидролиза после четвертого часа температуру увеличили до 60°С. В данных условиях после проведения ферментативного гидролиза модельной кормосмеси (состав: 7 г из-

Рис. 6. Выход ВС после обработки различным составом гидролаз 1 0%-ой кормосмеси (9 г измолотых неочищенных зерен овса + 1 г измолотых стеблей серпухи венценосной)

молотых неочищенных зерен овса, 1 г измолотых стеблей серпухи венценосной, 2 г подсолнечного шрота в 50 см3 0.01 М ацет. буфера рН 4.7) выход ВС составил 29% (рис. 7).

Замена таких компонентов кормосмеси как овес и стебли серпухи на кукурузу приводит почти к двухкратному снижению выхода ВС (рис. 8). Это указывает на то, что значительная часть определенных Сахаров является

4 5 Время, ч

Рис. 7. Динамика накопления ВС при разных концентрациях субстрата

Время, ч

Рис. 8. Гидролиз кормосмесей различного состава (1—7 г овса + 1 г стеблей серпухи + 2 г подсолнечного шрота;

2—8 г кукурузы + 2 г подсолнечного шрота)

продуктами ферментативного гидролиза именно некрахмалистых полисахаридов.

Для сгущения полупродукта нами предложено использование натуральной полножирной сои (до 20 % от массы остальных компонентов). В нашем случае при упаривании сгущенной смеси при повышенных температурах мы одновременно разрушаем находящиеся в сое антипитательные вещества и достигаем консистенцию смеси, достаточную для получения гранул.

Биохимическая характеристика белково-углеводного корма

Легкоусвояемые сахара. ВЭЖХ-анализ продуктов гидролиза кормосме-си после воздействия ферментных препаратов Глюкаваморин ГЗх и Целло-виридин Г20х до и после выпарки с добавлением сои показал, что преобладающими сахарами являются глюкоза, целлобиоза и мальтоза, причем содержание дисахаридов после стадии термической обработки резко снижается. Также в гидролизатах наблюдается незначительное содержание невос-станавливаюших Сахаров — фруктозы и сахарозы (рис. 9).

Аминокислотный состав. Показано, что содержание серина, пролина, глицина, аланина, фенилаланина, гистидина, аргинана, трионина, валинав ферментированном корме после гидролиза и выпарки в присутствии сои не изменяется по сравнению с исходной смесью, однако наблюдается незначительное снижение содержание тирозина. Содержание изолейцина снижает-

ся почти вдвое, при этом содержание лейцина наоборот возрастает двукратно (рис. 10,11).

с последующей выпаркой гидролизата в присутствии сои (1 — вода, 2 — фруктоза, 3 — глюкоза, 4 — сахароза, 5 — мальтоза+целлобиоза)

9

8,14

8 !

П Идеальный белок (эталон РАО) Ш Готовый продукт

Рис. 10. Содержание незаменимых аминокислот в составе белка многокомпонентного субстрата без ферментативного гидролиза и выпарки (г/100 г белка)

9 8,5

Р Идеальный бело к (эталон РАО) О Готовый продукт

Рис. 11. Содержание незаменимых аминокислот в составе белка многокомпонентного субстрата после ферментативного гидролиза и выпарки (г/100 г белка)

Необходимо отметить ощутимое снижение содержания лизина в конечном продукте, что, предположительно, происходит в результате гликозили-рования данной аминокислоты в процессе термической обработки кормо-смеси в присутствии значительного количества восстанавливающих групп Сахаров (Степаненко. 1977), что требует более тщательного подхода к режиму выпарки. В целом, содержание незаменимых аминокислот в полученном конечном продукте соответствует данным для идеального белка РАО (Сельскохозяйственная.... 1998).

Содержание антипитательных веществ. Анализ на содержание Р-глю-кана (одного из основных растворимых некрахмалистых полисахаридов овса, обладающего антипитательными свойствами) показал, что в исходном овсе его содержание составляет 3.5 %, что почти в шесть и 27 раз больше, чем в пшенице и кукурузе, для которых значения составляют 0.61 и 0.13 % соответственно; в подсолнечном шроте и сое р-глюкан не обнаружен. В конечном продукте, прошедшем все стадии обработки содержание р-глюкана составило 0.21%.

Среди антипитательных веществ сои доминирующим является ингибитор трипсина, максимально допустимый уровень, которого зависит от содержания белка. На практике для оценки содержания антипитательных веществ в сое применяется косвенный показатель — активность уреазы, которая при тепловой обработке продукта теряет свою активность, как и инги-

битор трипсина1. Исходная кормосмесь перед выпаркой характеризуется высоким значением уреазной активности (9.3 М->Ш4мг/г сои за 1 час). После выпарки в конечном продукте уреазная активность не обнаружена.

ВЫВОДЫ

1. Выявлена связь между особенностями строения порошковых целлюлоз, полученных с использованием модифицирующих агентов различной природы, и их способностью к ферментативной деструкции. Впервые установлено, что ПЦ, полученные продолжительным воздействием на исходную целлюлозу кислотами Льюиса, обладают низкой адсорбционной емкостью по отношению к целлюлазам, характеризуются наибольшей начальной реакционной способностью при наименьшем изменении степени полимеризации целлюлозы, что обусловлено ослаблением субстрат-ферментных взаимодействий за счет разупорядоченности надмолекулярной структуры и химической модификации макроцепей в порошковых целлюлозах указанного типа.

2. Оптимизирован состав целлюлазного и амилазного ферментативного комплекса для одновременного получения ПЦ заданной структуры и глюкозы путем совместного гидролиза целлюлозы и крахмала. Выявлено уменьшение активности амилаз в присутствии целлюлозы, причем по сравнению с Р" и у-амилазой ингибирование а-амилазы более выражено. Предложен режим гидролиза лиственной беленой целлюлозы в присутствии крахмала, позволяющий увеличить выход ВС за счет гидролиза лиственной беленой целлюлозы на 17 % по сравнению с ожидаемым выходом Сахаров из крахмала и получить ПЦ со степенью полимеризации 240 и индексом кристалличности 0.8, что удовлетворяет требованиям для коммерческих образцов ПЦ.

3. Исследован и оптимизирован процесс совместного ферментативного гидролиза целлюлазами и амилазами растительного сырья (стебли травянистых растений и неочищенные зерна злаковых культур). Показана возможность исключения стадии обработки коммерческим препаратом содержащим а-амилазу растительных субстратов с большим содержанием некрахмалистых полисахаридов. На основе отходов растениеводства и трудноусвояемых зерновых культур с использованием ферментативного гидрорлиза разработана новая белково-углеводная основа кормов для птицеводства. По данным биохимического анализа ферментированный корм содержит до 30% легкоусваиваемых углеводов; характеризуется оптимальным составом незаменимых аминокислот, близких к идеальному белку (эталон РАО) и прак-

1 http://www.jasko.ru

тически не содержит (3-глюкана и других антипитательных веществ, содержащихся в исходном субстрате.

СПИСОК НАУЧНЫХ ТРУДОВ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в журналах, рекомендованных ВАК:

1. Торлопов М. А., ТарабукинД. В., Фролова Т. П., Щербакова С. В., Володин В. В, Ферментативный гидролиз порошковых целлюлоз, полученных различными методами / Химия растительного сырья. 2007. № 3. С. 69—76.

2. ТарабукинД. В., Торлопов М. А., Володин В. В., Донцов А. Г. Получение порошковой целлюлозы и глюкозы ферментативным гидролизом целлюлозы в смеси с крахмалом / Биотехнология. 2009. № 4. С. 57—63.

3. ТарабукинД. В., Донцов А. Г. Биотехнология получения углеводно-белковой основы кормов для птицеводства с повышенной питательной ценностью/Естественные и технические науки. 2009. № 3. С. 148—151.

Патенты

1. ТарабукинД. В., Донцов А. Г. Способ приготовления макрокомпонен-тной смеси для комбикормов / Патент РФ 2367194, МПК А23К1/00 // Институт биологии Коми Научного центра УрО РАН; № 2008112445/13; заявл. 31.03.2008; опубл. 20.09.2009. Бюл. № 26.

2. ТарабукинД. В., Донцов А. Г. Макрокомпонентная смесь для комбикормов / Патент РФ 2368234, МПК А23К 1/00 // Институт биологии Коми Научного центра УрО РАН; № 2008112443/13; заявл. 31.03.2008; опубл. 27.09.2009. Бюл. №27.

Остальные публикации

1. ТарабукинД. В. Исследование мембранных способов очистки ферментов эндоглюканаз из целлюлазного комплекса штамма продуцента Тпскойегта \iride / Актуальные проблемы биологии и экологии. Материалы докладов XI молодежной научной конференции Института биологии УрО РАН. Сыктывкар, 2004. Том И. С. 289—291.

2. ТарабукинД. В. Ферментативный гидролиз как способ повышения питательной ценности трудноусваиваемых компонентов кормов / Актуальные проблемы биологии и экологии. Материалы докладов I всероссийской Коми республиканской молодежной научной конференции. Сыктывкар, 2007. С. 246—249.

3. ТарабукинД. В., Торлопов М. А. Особенности структуры и ферментативной деструкции порошковых целлюлоз / Молодежь и наука на Севере. Материалы докладов I всероссийской молодежной научной конференции. Сыктывкар, 2008. Том 1П. С. 291—292.

Тираж 100

Заказ 47 (09)

Информационно-издательская группа Института биологии Коми научного центра Уральского отделения РАН 167982, г. Сыктывкар, ул. Коммунистическая, д. 28

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тарабукин, Дмитрий Валерьянович

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Целлюлоза как возобновляемый источник углеводов

1.2 Общая характеристика структуры целлюлозы

1.3 Продуценты целлюлолитических ферментов

1.4 Характеристика ферментов, участвующих в ферментативном гидролизе целлюлозы ^

1.5 Влияние физико-химических и структурных характеристик субстрата на эффективность ферментативного гидролиза

1.6 Аппараты и режимы ферментативного гидролиза целлюлозы

1.7 Применение целлюлаз, амилаз и других гидролаз в промышленности и 24 сельском хозяйстве

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Субстраты, методы получения и анализа порошковых целлюлоз

2.2 Условия совместного ферментативного гидролиза целлюлозы и крахмала

2.3 Методика фотометрического определения восстанавливающих

Сахаров

2.4 Методика ВЭЖХ-анализа Сахаров в продуктах ферментативного гидролиза целлюлозы и крахмала

2.5 Методики определения активностей ферментов гидролаз

2.6 Методика определения аминокислот в ферментированном белково-углеводном корме 4Q

2.7 Методика определения (3-глюкана в кормах ъ

Глава 3. ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ И ФЕРМЕНТАТИВНОЙ ДЕСТРУКЦИИ ПОРОШКОВЫХ ЦЕЛЛЮЛОЗ

3.1 Физико-химическая характеристика порошковых целлюлоз

3.2 Ферментативная деструкция порошковых целлюлоз

3.3 Исследование структуры модифицированных порошковых целлюлоз и низкомолекулярных продуктов ферментативной деструкции

Глава 4. ПОЛУЧЕНИЕ ПОРОШКОВОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ И ГЛЮКОЗЫ ФЕРМЕНТАТИВНЫМ ГИДРОЛИЗОМ ЛИСТВЕННОЙ БЕЛЕНОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ В СМЕСИ С КРАХМАЛОМ

4.1 Обоснование выбора субстрата для получения порошковой целлюлозы и исследование фермент-субстратных взаимодействий амилаз с целлюлозой

4.2 Особенности процесса совместного ферментативного гидролиза лиственной беленой целлюлозы и крахмала

4.3 Оптимизация процесса ферментативного получения порошковой целлюлозы и анализ продуктов совместного гидролиза лиственной целлюлозы и крахмала

Глава 5. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ IN VITRO КАК СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ ЦЕННОСТИ ТРУДНОУСВАИВАЕМЫХ КОРМОВ

5.1 Особенности процесса ферментативного гидролиза многокомпонентных трудноусваиваемых кормов

5.2 Биотехнология получения новой белково-углеводной кормовой основы для птицеводства из трудноусваиваемого растительного сырья

5.3 Биохимическая характеристика ферментированного белковоуглеводного корма

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ферментативные технологии направленной биоконверсии целлюлозо- и крахмалсодержащего растительного сырья"

К настоящему времени ферментативные технологии стали одним из наиболее эффективных средств трансформации многих видов биологического сырья (Биотехнология., 1987; Болобова и др., 2001; Квеситадзе, Безбородов, 2002; Rabinovich, 2006; Шишков, 2007; Salazar, 2007). Применение ферментов в качестве биокатализаторов позволяет существенно расширить сырьевую базу пищевой промышленности и кормопроизводства, повысить глубину переработки сырья, создать новые виды пищевых продуктов и кормов, а также улучшить усвояемость и органолептические свойства известных (Кислухина, 2002; Nicemol, 2008). Кроме того, переход от традиционных химических к биотехнологическим методам во многих случаях становится единственной возможностью для создания малоотходных технологий и экологически чистых производств (Быков, 1989; Araujo et al., 2008; Sanchez, 2009). Ярким примером является процесс ферментативного получения глюкозы из крахмала (Производство., 1967).

Однако, несмотря на очевидные преимущества получения глюкозы ферментативным гидролизом целлюлозосодержащего сырья и прогресс, достигнутый в этой области (создание теоретических основ, разработка аппаратов и опытно-промышленных установок для ферментативного гидролиза целлюлозы), до настоящего времени процесс не удается реализовать на промышленном уровне из-за его относительно низкой рентабельности по сравнению с традиционным кислотным гидролизом (Даниляк и др., 1989; Синицын и др., 1995). В то же время целлюлолитические и амилолитические ферменты, получают широкое применение как улучшающие структуру целлюлозных материалов биологические агенты в текстильной промышленности, а также в качестве компонентов комбикормов для повышения их усвояемости (Быков, 1984; Чешкова, 1996, 2000; Кричевский, 1998; Bhat, 2000; Барышева, 2006). Следовательно, разработка новых ферментативных процессов и продуктов с использованием целлюлаз и амилаз остается одной из актуальных задач современной биотехнологии.

Цель работы заключается в разработке научных основ ферментативных технологий получения новых материалов с заданными свойствами путем направленной биоконверсии целлюлозо- и крахмалсодержащего сырья.

Задачи работы:

1. Исследовать влияние надмолекулярной структуры ПЦ, полученных с помощью различных модифицирующих агентов, на их реакционную способность к ферментативному гидролизу.

2. Оценить возможность одновременного получения ПЦ заданной структуры и глюкозы при совместном ферментативном гидролизе лиственной беленой целлюлозы и крахмала.

3. Оптимизировать процесс осахаривания многокомпонентных трудноусвояемых растительных субстратов и разработать новую белково-углеводную основу кормов моногастричных животных.

Научная новизна. Выявлена связь между особенностями строения ПЦ, полученных с использованием модифицирующих агентов различной природы, и их способностью к ферментативной деструкции. Впервые установлено, что ПЦ, полученные продолжительным воздействием на исходную целлюлозу кислотами Льюиса, обладают низкой адсорбционной емкостью по отношению к целлюлазам, характеризуются наибольшей начальной реакционной способностью при наименьшем изменении степени полимеризации целлюлозы, что обусловлено ослаблением субстрат-ферментных взаимодействий за счет разупорядоченности надмолекулярной структуры и химической модификации макроцепей в ПЦ указанного типа.

Показана возможность получения ПЦ заданной структуры и глюкозы при совместном ферментативном гидролизе лиственной беленой целлюлозы и крахмала. Выявлено, что характеристики получаемой ПЦ в значительной мере определяются вязкостью водной среды, задаваемой концентрацией крахмала в исходной смеси.

Исследован и оптимизирован процесс совместного ферментативного гидролиза целлюлазами и амилазами многокомпонентного растительного сырья (стебли травянистых растений и неочищенные зерна злаковых культур). Показана возможность исключения стадии обработки коммерческими препаратами а-амилаз растительных субстратов с большим содержанием некрахмалистых полисахаридов.

Практическая значимость. Показана принципиальная возможность получения новых устойчивых к биодеструкции функциональных материалов путем ферментативной деструкции ПЦ, модифицированных кислотами Льюиса.

Предложен режим ферментативного гидролиза лиственной беленой целлюлозы в присутствии крахмала, позволяющий получать ПЦ с физико-химическими характеристиками, оптимальными для использования в медицине и химической промышленности, и увеличить рентабельность процесса за счет дополнительного выхода восстанавливающих Сахаров при гидролизе целлюлозы по сравнению с ожидаемым выходом Сахаров из крахмала.

С использованием ферментативных биотехнологий трансформации трудноусваиваемых многокомпонентных растительных субстратов разработана новая белково-углеводная основа кормов для птицеводства, обогащенная сахарами, с оптимальным аминокислотным составом, близким к идеальному белку FAO, и не содержащая антипитательных веществ.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на республиканских Молодежных научных конференциях «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2004, 2005, 2007), IV Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар 2006), XI международной конференции «Эфиры целлюлозы и крахмала: синтез свойства, применение» (Владимир, 2007), I Всероссийской молодежной научной конференции «Молодежь и наука на Севере» (Сыктывкар, 2008), II Всероссийской молодежной научной конференции «Молодежь и наука на Севере» (Сыктывкар, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК и два патента Российской Федерации.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, выводов, списка литературы, включающего 180 источников, в том числе 82 на иностранном. Текст изложен на 112 страницах, иллюстрирован 10 таблицами и 42 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Тарабукин, Дмитрий Валерьянович

ВЫВОДЫ

1. Выявлена связь между особенностями строения порошковых целлюлоз, полученных с использованием модифицирующих агентов различной природы, и их способностью к ферментативной деструкции. Впервые установлено, что ПЦ, полученные продолжительным воздействием на исходную целлюлозу кислотами Льюиса, обладают низкой адсорбционной емкостью по отношению к целлюлазам, характеризуются наибольшей начальной реакционной способностью при наименьшем изменении степени полимеризации целлюлозы, что обусловлено ослаблением субстрат-ферментных взаимодействий за счет разупорядоченности надмолекулярной структуры и химической модификации макроцепей в порошковых целлюлозах указанного типа. Несмотря на то, что ПЦ из льна, полученные продолжительным воздействием пероксиуксусной кислоты, обладают высокой адсорбционной способностью по отношению к целлюлазам, они оказались наиболее устойчивы к ферментативной деструкции.

2. Оптимизирован состав целлюлазного и амилазного ферментативного комплекса для одновременного получения ПЦ заданной структуры и глюкозы путем совместного гидролиза целлюлозы и крахмала. Выявлено, что амилолитические ферменты способны сорбироваться на лиственной беленой целлюлозе с частичной потерей активности, что необходимо учитывать при совмещении данных процессов. Показано, что характеристики получаемой ПЦ в значительной мере определяются вязкостью водной среды, задаваемой концентрацией крахмала в исходной смеси. Предложен режим гидролиза лиственной беленой целлюлозы в присутствии крахмала, позволяющий увеличить выход ВС за счет гидролиза лиственной беленой целлюлозы на 17% по сравнению с ожидаемым выходом Сахаров из крахмала и получить ПЦ со степенью полимеризации 240 и индексом кристалличности 0.8, что удовлетворяет требованиям для коммерческих образцов ПЦ.

3. Исследован и оптимизирован процесс совместного ферментативного гидролиза целлюлазами и глкжоамилазами растительного сырья (стебли травянистых растений и неочищенные зерна злаковых культур). Разработанная схема позволяет повысить выход моно- и дисахаридов не только за счет гидролиза лигноуглеводного, но и крахмального компонентов. Показана возможность исключения стадии обработки коммерческим препаратом содержащим а-амилазу растительных субстратов с большим содержанием некрахмалистых полисахаридов. На основе отходов растениеводства и трудноусвояемых зерновых культур с использованием ферментативного гидролиза разработана новая белково-углеводная основа кормов для птицеводства. Технология получения продукта заключается в оптимальной дозировке трудноусваеваемых компонентов, их ферментативном осахаривании, сгущении и выпарке прогидролизованной смеси в присутствии натуральной сои, обогащающей конечный продукт рядом незаменимых аминокислот и жиров. По данным биохимического анализа ферментированный корм содержит до 30% легкоусваиваемых углеводов; характеризуется оптимальным составом незаменимых аминокислот, близких к идеальному белку (эталон FAO) и практически не содержит (3-глюкана и других антипитательных веществ, содержащихся в исходном субстрате.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тарабукин, Дмитрий Валерьянович, Сыктывкар

1. Бакай С.М. Применение ферментных препаратов в животноводстве и кормопроизводстве: Тезисы докладов V Всес. совещания, г Тарту. — М., 1979.-С. 30-32.

2. Барышева Н.В. Разработка основ ферментативной технологии отварки хлопчатобумажных тканей / Автореферат дисс. канд. техн. наук. — М., 2006.-16 с.

3. Березин И.В. Способ получения сахара из целлюлозосодержащего сырья / И.В. Березин, К.А. Калунянц, М.Л. Рабинович, А.А. Клесов. // А.С. СССР № 949002. Бюл. - 1982а. - № 29.

4. Березин И.В. Аппарат для гидролиза полисахаридного сырья / И.В. Березин, К.А. Калунянц, М.Л. Рабинович, А.А. Клесов. // А.С. СССР № 962310. Бюл. - 19826. - № 36.

5. Бессарабов Б.Ф. Болезни сельскохозяйственной птицы / Б.Ф Бессарабов М.: Колос.- 1983.-126 с.

6. Биоконверсия целлюлозы: микробиология и биохимия / Под ред. М.Н. Манакова. М.: Итоги науки и техники. Биотехнология. - 1988. - Т. 11. — 224 с.

7. Биотехнология: Учебное пособие для вузов в 8 книгах / Под редакцией Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова, Кн. 8: Инженерная энзимология / И.В. Березин, А.А. Клесов, В.К. Швядае и др. — М.: Высшая школа. 1987. -143 с.

8. Болобова А.В. Целлюлазы Clostridium thermocellum / А.В. Болобова, И.Г. Корнилова, М.В. Симанькова и др. // Прикладная биохимия и микробиология. 1988. - Т. 24. -№ 3. - С.342-351.

9. Болобова А.В. Сравнение эффективности гидролиза микрокристаллической целлюлозы целлюлазами бактериального и грибного происхождения / А.В. Болобова, Клесов А.А. // Прикладная биохимия и микробиология. 1990. - Т. 26. -№ 3. - С.321-327.

10. Болобова А.В. Поиск грибных продуцентов алкалостабильных и термостабильных целлюлаз / А.В. Болобова, А.В. Кураков // Прикладная биохимия и микробиология. — 1999. — Т. 35. — № 4. — С.402-408.

11. Болобова А.В. Теоретические основы биотехнологии древесных композитов. Кн. И: Ферменты, модели, процессы. /А.В. Болобова, А.А. Аскадский, В.И. Кондращенко, M.JI. Рабинович; Отв. Ред.

12. A.М.Безбородов. — М.: Наука. 2001. - 343 с.

13. Болотникова JI.C. Метод определения вязкости и степени полимеризации целлюлозы / JI.C. Болотникова, С.Н. Данилов, Т.Н. Самсонова // ЖПХ. — 1966. -№ 1. С.176-180.

14. Болтовский B.C. Повышение эффективности биоконверсии отходов девевообработки / B.C. Болтовский // Деревообрабатывающая промышленность. 1996. - № 3. - С.29-31.

15. Быков В.А. Разработка безотходной технологии углеводных и белковых компонентов кормов на основе гидролиза и биоконверсии целлюлозного сырья / Автореферат дисс. докт. техн. наук. М., 1989. - 39 с.

16. Власенко Е.Ю. Реакционная способность различных видов целлюлосодержащего сырья при гидролизе целлюлолитическими ферментами / Е.Ю. Власенко, О. Кастельянос, А.П. Синицын // Прикладная биохимия и микробиология. 1993. - Т. 29. - №6. - С.834-842.

17. Володин В.В. Строение координационных центров и молекулярная подвижность цепей в гель иммобилизованных каталитических системах /

18. B.В. Володин, А.Н. Шупик // Высокомолекулярные соединения. — 1987. — Т. 34. С.469-498.

19. Глущенко Е.В. Биотехнология ферментативного превращения целлюлосодержащих отходов в сахаристые вещества / Автореферат дисс. канд. техн. наук. М., 1987. - 18 с.

20. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов / И.М. Грачева // 3-е издание перераб. и допол. М.: Агропромиздат. - 2000. - 510 с.

21. Громов B.C. Клеточная стенка древесины и ее изменения при химическом воздействии / B.C. Громов. Рига, 1972. - 500 с.

22. Губрий Г.Г. Конверсия целлюлозосодержащего сырья препаратами целлюлаз в производстве этанола / Г.Г. Губрий, П.Я. Бачурин, Н.С. Мазур // Пищевая промышленность. 1995. - № 5. - С.24 — 25.

23. Гусаков А.В. Ферментативный гидролиз целлюлозы. Инактивация и стабилизация ферментов целлюлазного комплекса / А.В. Гусаков, А.П. Синицын, А.А. Клесов // Биохимия. 1982. - Т. 47. - № 8. - С. 1322 - 1331.

24. Гусев А.И. Нанокристаллические материалы: методы получения и свойства / А.И. Гусев. // Екатиринбург УрО РАН. — 1998. 198 с.

25. Даниляк Н.И. Ферментные системы высших базидиомицетов / Н.И Даниляк, В.Д. Семичаевский, JI. Г. Дудченко и др.; Отв. Ред. Е.Г. Судьина, И.А. Дудка. Киев: Наук. Думка, 1989. - 280 с.

26. Дарбре А. Практическая химия белка: Пер. с анг. / Под ред. А. Дарбре. -М.: Мир, 1989. С. 249-250.

27. Жеребцов Н.А. О механизме кислотного и ферментативного гидролиза крахмала / Н.А. Жеребцов, И.Д. Руадзе, А.Н. Яковлев // Прикладная биохимия и микробиология. 1995. - № 6. - С.599-603.

28. Изумрудов В.А. Равновесие интерполиэлектролитных реакций и явление молекулярого «узнавания» в растворах интерполиэлектролитных комплексов / В.А. Изумрудов, А.Б. Зезин, В.А. Кабанов // Успехи химии. — 1991. -Т.60. -№ 7. С. 1534 - 1570.

29. Использование ферментных препаратов в кормлении сельскохозяйственных животных и птицы / Под редакцией Зайцевой Г.А. -М.: Агропромиздат, 1990. 13 с.

30. Кастельянос О. Исследование свойств целлюлазного комплекса Penicillium verruculosum / О. Кастельянос, А.П. Синицын, Е.Ю. Власенко // Прикладная биохимическая микробиология, — 1994. — Т. 30. — № 6. — С. 799-811.

31. Каткевич Р.Г. Ферментативный гидролиз полисахаридов древесины и соломы / Р.Г. Каткевич, B.C. Громов, Д.Э. Пизане // Химия древесины. — 1984. -№ 5. С.51-59.

32. Каткевич Ю.Ю. Ферментативный гидролиз древесных целлюлоз / Ю.Ю. Каткевич, П.Я. Вевере // Превращения древесины при энзиматическом и микробиологическом воздействиях: Тез.докл. 3-го науч. семинара. Рига, 1988.-С.7-26.

33. Квеситадзе Г.И. Введение в биотехнологию / Г.И. Квеситадзе, A.M. Безбородов; Институт им. А.Н. Баха М.: Наука, 2002. - 284 с.

34. Киричков А.П. / А.П. Киричков, Л.П. Соловьев, Л.Н. Лунин и др. Ав. св. № 899034; БИ. - №3. - 1982.

35. Кислухина О.В. Ферменты в производстве пищи и кормов / О.В. Кислухина М.: ДеЛи принт, 2002. - С.77-79.

36. Кленкова Н.И. Структура и реакционная способность целлюлозы / Н.И. Кленкова Л.: Наука, 1976. - 367 с.

37. Клесов А.А. Ферментативный гидролиз целлюлозы. Влияние физико-химических и структурных факторов субстрата на эффективность ферментативного гидролиза / А.А. Клесов, А.П. Синицын // Биоорганическая химия. 1981а. -Т. 7.-№ 12. - С.1801-1812.

38. Клесов А.А. Влияние гамма облучения целлюлозы на эффективность ее ферментативного гидролиза. Роль степени полимеризации и98кристалличности субстрата / А.А. Клесов, А.П. Синицын, Г.В. Ковалев //

39. ДАН. 19816. - Т. 259. -№ 6. - С.1495-1497.

40. Клесов А.А. Роль адсорбционной способности эндоглюканазы вдеградации кристаллической и аморфной целлюлозы / А.А. Клесов, В.М.

41. Черноглазое, M.JI. Рабинович, и др. // Биоорганическая химия. 1982. - Т.8. № 5. - С.643-650.

42. Клесов А.А. Целлюлозы третьего поколения / А.А. Клесов //

43. Биотехнология. 1987.-Т. 3. - № 2. - С. 132-138

44. Клесов А.А. Биохимия и энзимология гидролиза целлюлозы / А.А. Клесов

45. Биохимия, 1990.-Т. 55. -№ 10. - С.132-138.

46. Кокшаров С.А. Получение и применение нативных ферментов длябиохимических технологий облагораживания текстильных материалов /

47. С.А. Кокшаров, И.В. Куликова, A.JI. Сибирев // Текстильная химия. 2000.-Т. 17.-№ 1. С.78-88.

48. Комарова 3. Влияние целловиридина на продуктивность кур-несушек / 3.

49. Комарова, Е. Хрищатая // Комбикорма. 2000. - № 1. - С. 43-44.

50. Корма и ферменты / Т.М. Околекова, Н.В. Кулаков и др. Сергиев Посад,2001.- 112 с.

51. Кричевский Г.Е. Прошлое, настоящее и будущее биотехнологий в отделкетекстильных материалов и смежных отраслях / Г.Е. Кричевский //

52. Текстильная химия, Биотехнология в XXI век. 1998. - № 2. - С. 41-57.

53. Крюков B.C. Популярно о кормовых ферментных препаратах / B.C.

54. Крюков // Ветеринарная газета. — 1996. — № 24. — 112 с.

55. Кучин А.В. Способ получения микрокристаллической целлюлозы / А.В.

56. Кучин, А.В. Попов, М.В. Сазонов, В.А. Демин. Патент РФ 2163945, БИ,7. 2000.

57. Льноводство / Под ред. А.Р. Рогаш. М., 1967. - 583 с.

58. Мартынов М.А. Рентгенография полимеров / М.А. Мартынов, К.А.

59. Вылегжанова. JL: Химия, 1972. - 94 с.99

60. Мельник М.С. Изучение поверхности целлюлозосодержащих материалов спомощью ферментов / М.С. Мельник, А.Б. Бадалов, М.Л. Рабинович //

61. Биосинтез целлюлозы: Тез. докл. 2-й Всесоюз. конф. Казань, 1985. — С.91.92.

62. Мельник М.С. Новый тип эноглюканазы Clostridium thermocellum,образуемой рекомбинантным штаммом Е. Coli. Очистка и характеристикамножественных форм / М.С. Мельник, М.Л. Рабинович, А.А. Клесов //

63. Биохимия. 1989. - Т.54. - № 2. - С. 284-289.

64. Методы исследования целлюлозы / Под ред. В.П. Карливан- Рига,1. Знание», 1981. 257 с.

65. Морозов A.M. Ферментативное получение глюкозы изцеллюлозосодержащих материалов на стендовой установке непрерывногодействия / A.M. Морозов, А.А. Клесов, Е.В. Глущенко // Биотехнология. 1987.-№1.-С. 31-38.

66. Морозова Е.С. Основные достижения и направления селекциипродуцентов целлюлаз в СССР и за рубежом // Итоги науки и техники.

67. Сер. Биотехнология. М.: ВИНИТИ. - 1988. - Т.10. - С.6-71.

68. Нефедов П.П. Транспортные методы в аналитической химии полимеров /

69. П.П. Нефедов, П.Н. Лавренко. Л.: Химия, 1979. - 232 с.

70. Новорадовский А. Применение ферментов концерна «Клариант» в отделкетекстильных материалов / А. Новорадовский // Текстильная химия. 1998.-№ 2. С.73-84.

71. Нормы и рационы кормления сельскохозяйственных животных:

72. Спровочное пособие / А.П. Калашников, Н.И. Клейменов, В.Н. Баканов идр. М.: Агропромиздат, 1985. - 352 с.

73. Оболенская А. В. Лабораторные работы по химии древесины и целлюлозы:

74. Учебное пособие для вузов / А.В. Оболенская, З.П. Ельницкая, А.А.

75. Леонович М.: Экология, 1991. - С. 168.100

76. Полыгалина Г.В. Определение активности ферментов. Справочник / Г.В.

77. Полыгалина, B.C. Чередниченко, JI.B. Римарева. М.: ДеЛи принт, 2003. —375 с.

78. Производство кристаллической глюкозы из крахмала / Е.Я. Жарова, Т.А.

79. Ладур и др. —М.: «Пищевая промышленность», 1967. С.10-28.

80. Рабинович М.Л. Эффективность адсорбции целлюлолитических ферментовфактор, определяющий реакционную способность нерастворимойкристаллической) целлюлозы /.В. Рабинович, В.М. Черноглазов, А.А.

81. Клесов // Докл. АН СССР, сер. Биохимия. 1981. - Т.260. - № 6. - С.14811486.

82. Рабинович М.Л. Адсорбция целлюлолитических ферментов на целлюлозеи кинетика действия адсорбированных ферментов. Два типавзаимодействия ферментов с нерастворимым субстратом / М.В. Рабинович,

83. В.В. Нгуен, А.А. Клесов / /Биохимия. 1982. - Т.47. - № 3. - С.465-477.

84. Рабинович М.Л. .Синергизм при совместном действии эндоглюканаз свысоким и низким сродством к целлюлозе / М.В. Рабинович, В.В. Нгуен,

85. А.А. Клесов // Прикладная биохимия и микробиология. 1986. - Т. 22. - №1. С.70-79.

86. Рабинович М.Л. Аппарат для гидролиза полисахаридного сырья. / М.Л.

87. Рабинович, М.С. Мельник, A.M. Морозов, А.А. Клесов // А.С. СССР №1541263.-Бюл,- 1990,-№5.

88. Рабинович М.Л. Процесс изучения целлюлолитических ферментов имеханизм биодеградации высокоупорядоченных форм целлюлозы / М.Л

89. Рабинович, М.С. Мельник // Успехи биологической химии. Пущино:

90. ОНТИ ПНЦ РАН. 2000. - Т. 40. - С.205-266.

91. Рейзиньш Р.Э. Структурообразование в суспензиях целлюлозных волокон /

92. Р.Э. Рейзиньш. Рига, 1987. - С. 17-27.

93. Роговин З.А. Химия целлюлозы / З.А. Роговин. М.: Химия, 1972. - 519 с.

94. Родионова А.С. Ферментные препараты некоторых мицеальных грибов,расщепляющие полимеры злаков / А.С. Родионова, А.Ю. Килимник, Л.В.101

95. Капрельянц и др.// Прикладная биохимия и микробиология. — 1995. № 4.- С.433-440.

96. Сарыбаева Р.И. Применение кислот Льюиса в химии углеводов / Р.И.

97. Сарыбаева, В.А. Афанасьев, Г.Е. Заиков и др. // Успехи химии. 1977. - Т.

98. XLVI. № 8. - С. 1395-1410.

99. Селиванов А.С. Аппарат для гидролиза растительного сырья / А.С.

100. Селиванов, A.M. Морозов, М.Л. Рабинович, А.А. Клесов // А.С. СССР №1620487.-Бюл.- 1989.

101. Селиванов А.С. Аппараты для ферментативного гидролизацеллюлозосодержащего сырья / Биоконверсия целлюлозосодержащегосырья, труды Коми научного центра УрО РАН. 1992. - № 125. - С.21-31.

102. Сельскохозяйственная биотехнология: Учебник / B.C. Шевелуха, Е.А.,

103. Калашникова, С.В. Дегтярев и др.: Под ред. B.C. Шевелухи. М.: Высшаяшкола.-1998.-С. 265.

104. Синицын А.П. Влияние предобработки на эффективностьферментативного превращения хлопкового линта / А.П. Синицын, А.А.

105. Клесов // Прикладная биохимическая микробиология, 1981а. - Т. 17. - №5.-С. 682-695.

106. Синицын А.П. Ферментативное получение глюкозы из целлюлозы:влияние ингибирования продуктами и изменения реакционнойспособности субстрата на скорость ферментативного гидролиза / А.П.

107. Синицын, Б. Наджеми, А.А. Клесов // Прикладная биохимия имикробиология. 1981 б. - Т. 17. - № 3. - С.315-321.

108. Синицын А.П. Сравнительное изучение влияния различных видовпредобработки на скорость ферментативного гидролиза природныхцеллюлозосодержащих материалов / А.П. Синицын, Г.В. Ковалев, С.Р.

109. Меса-Манреса и др. // Химия древесины. 1984. - № 5. - С. 60-71.

110. Синицын А.П. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов: Учеб.

111. Пособие / А.П. Синицын, А.В. Гусаков, В.М. Черноглазов. М.: Изд-во1. МГУ, 1995.-224 с.

112. Сирвидис В. Влияние МЭК на питательную ценность комбикормов / В. Сирвидис // Комбикорма. — 1999. № 2. - 32 с.

113. Супрунов Д. Обогащение комбикормов ферментными комплексами для цыплят-бройлеров / Д. Супрунов // Комбикорма. 2000. - № 1. - С.47-48.

114. Сихтола X. Целлюлоза. Химия древесины / X. Сихтола, X. Макконен. М.: Лесная промышленность, 1982. - С. 96-129.

115. Скомаровский А.А. Новые целлюлазы для высокоэффективного гидролиза лигноцеллюлозной биомассы / А.А. Скомаровский, А.В. Марков, А.В. Гусаков // Прикладная биохимия и микробиология. — 2006. Т. 42. - №. 6. -Р. 674-680.

116. Справочник по кормовым добавкам / сост. Н.В. Редько, А .Я. Антонов; Под ред. К.М. Солнцева. 2-е изд., перераб. и доп. - Мн.: Ураджай, 1990. - 3971. С. jU

117. Степаненко Б. Н. Химия и биохимия углеводов (моносахариды) / Б.Н. Степаненко. — М., 1977.-С. 114-117.

118. Технология спирта / В.Л. Яровенко, В.А. Маринченко, В.А. Смирнов и др.; Под ред. проф. В.Л. Яровенко. М.: Колос, 2002. - С.104-105.

119. Тиунова Н.А. Применение целлюлаз. Целлюлазы микроорганизмов / Н.А. Тиунова. М.: Наука, 1981. - С. 40-73.

120. Торлопов М.А. Сульфатирование порошковых материалов, полученных деструкцией целлюлозы тетрахлоридом титана / М.А. Торлопов, С.В. Фролова, В.А. Демин // Химия в интересах устойчивого развитии. 2007. -№4.-С. 491-496.

121. Трипп Б.У. Определение кристалличности целлюлозы. Целлюлоза и ее производные/Б.У. Трипп.-М.: Мир, 1974. Т.1. - С. 214-235.

122. Фитоэкдистероиды / Под ред. В.В. Володина. СПб.: Наука, 2003. - 293 с.

123. Хазиев Ф.Х. Методы почвенной энзимологии / Ф.Х. Хазиев, Институт биологии НЦ. М.: Наука, 2005. - 252 с.

124. Химия высокомолекулярных соединений, лесохимия и органический синтез. (Труды Коми научного центра УрО РАН, No. 167)

125. Электроповерхностные характеристики порошковой целлюлозы, полученной в результате деструкции под действием кислот Льюиса // Сыктывкар: Коми научный центр УрО РАН. 2002. - С. 95-101.

126. Целлюлолитические микроорганизмы и ферменты / Под редакцией А.А Клесова, Итоги науки и техники, сер. Биотехнология. — 1988. Т. 10. - 224 с.

127. Целлюлоза и ее производные / Под ред. Н. Байклз, Л. Сегал. М.: Мир, 1974.-Т. 2. -500 с.

128. Чешкова А.В. Использование биопроцессов при отделке тканей из смеси хлопка и химических волокон / А.В. Чешкова, В.И. Лебедева, Б.Н. Мельников, С.Ю Шебашева // Химические волокна. 1996. - № 4. - С. 5254.

129. Чешкова А.В. Одностадийный способ расшлихтовки и крашения тканей / А.В. Чешкова, В.И. Лебедева, Б.Н. Мельников // Химические волокна. -1997.-№ 1.-С. 55-58.

130. Чешкова А.В. Текстильные биохимические технологии сегодня и завтра / А.В. Чешкова, Б.Н. Мельников // Текстильная химия, спец. вып. РСХТК. — 2000. -№2(18). -С. 112-117.

131. Чешкова А.В. Ферменты для текстиля моющих средств, кожи, меха: Учебное пособие / А.В.Чешкова. И.: ГОУВПО ИГХТУ, 2007. - С. 46-67.

132. Чурилова И.В. Целлобиоза — регулятор активности эндоглюканаз целлюлазных комплексов. Механизм регуляции / И.В. Чурилова, В.И. Максимов, А.А. Клесов // Биохимия. 1979. - Т. 44. - № 11. - С. 21002102.

133. Шишков В.А. Разработка технологии получения белковых препаратов из растительного сырья с применением ферментативных и мембранных процессов: диссертация / Дисс. канд. техн. наук. — М., 2007. — 157 с.

134. Юлдашев Б.Т. Сравнительное изучение поведения целлюлаз на поверхности целлюлозы и лигноцеллюлозы в ходе ферментативногогидролиза / Б.Т. Юлдашев, М.М. Рахимов, М.Л. Рабинович // Прикладная биохимия и микробиология. 1985. — Т. 29. — № 2. — С. 233.

135. Anderson L.N. A thermostable endo-beta-l,4-glucanase / L.N. Anderson, M.E. Bjornvad, M. Schulein // WO/1998/033895. 1998.

136. Ando S. Hyperthermostable endoglucanase from Pyrococcus horikoshii / S. Ando, H. Ishida, Y. Kosugi and others // Appl Environ Microbiol. 2002. -Vol. 68. -№ l.-P. 430-433.

137. Araujo R. Application of enzymes for textile fibres processing / R. Araujo, M. Casal, A. Cavaco-Paulo //Biocatalysis and Biotransformation. 2008. - Vol. 26. - № 5.-P. 332-349.

138. Baeck A.C. Fabric care compositions comprising cellulose binding domains / A.C. Baeck, J. Smets, S.L. Boyer // USA Patent 6906024. 2005.

139. Bailey, M.J. Induction, isolation and testing of stable Trichoderma reesei mutants with improved production of solubilzing cellulose / M.J Bailey, K.M.H Nevalainen // Enz. Micr. Tech. 1981. - Vol. 3. - № 2 - P. 153-157.

140. Bailey M.J. Hydrolytic properties of two cellulases of Trichoderma reesei expressed in yeast. / M.J. Bailey, M. Siika-aho, A. Valkeajarvi and others // Biotechnol. Appl. Biochem. 1993. - № 17. - P. 65-76.

141. Barbel G.R. Cellulolytic enzyme system of Thermoactinomyces sp. grown on microcrystalline cellulose / G.R. Barbel // Appl. Environ. Microbiol. 1978. — Vol. 36.-P. 606-612.

142. Bedford M.R. Enzyme feed additive and animal feed including it / M.R. Bedford, A.G. Morgan, T. Fowler // USA Patent № 6562340. 2003.

143. Belyaev E.Yu. New medical materials based on modified polysaccharides / E.Yu. Belyaev // Pharmaceutical Chemistry Journal. — 2000. — Vol. 34. — №.11. -P. 36-41.

144. Bhat M.K. Cellulases and related enzymes in biotechnology / M.K. Bhat // Biotechnology Advances. 2000. - Vol. 18. - № 5. -P. 355-383.

145. Biofinishing of cotton with Trichoderma reesei cellulases: 18 IFATCC «Congress 1999». Copenhagen. - P.193.

146. Busch A. Laundry detergent and/or fabric care compositions comprising a modified cellulose / A. Busch, J-L. P. Bettiol and others // W0/1999/057256, 1999.

147. Cheshkova A.V. Technologies for biochemical synthesis and modification of chemical fibres / A.V. Cheshkova // Fibre chemistry. 2004. - Vol. 36. - №.6. -P. 437-441.

148. Cooney, C.L. Gordon and M. Jiminez, Simultaneous Cellulose Hydrolysis and Ethanol Production by a Celluloytic Anaerobic Bacterium / C.L. Cooney, D.I.C. Wang, S.D. Wang, and others // Biotechnology and Bioengineering Symposium, 1978.-№. 8.-P. 103-114.

149. Dees C.H. Genetically enhanced cellulase production in Pseudomonas cellulosa using recombinant DNA technology / USA Patent № 5958740. 1999.

150. Farid M. Effect of peracetic acid, sodium hydroxide and phosphoric acid on cellulosic materials as a pretreatment for enzymatic hydrolysis. / M. Farid, M. Shaker, A.I. El-Diwany // Enzyme Microb. Technol. 1983. - Vol. 5. - № 10. -P. 441-444.

151. Fennington G. Cellulase biosynthesis in a catabolite repression-resistant mutant of Thermomonospora curvata / G. Fennington, D. Neubauer, F. Stutzenberger // Appl Environ Microbiol. 1984. - Vol. 47. - № 1. - P. 201-204.

152. Ferket P.R. Practical use of feed enzymes for turkeys and broilers / P.R. Ferket // Journal of applied poultry research. 1993. - Vol. 2. - P. 75-81.

153. Fowler T. EGIII-like cellulase compositions, DNA encoding such EGIII compositions and methods for obtaining same / WQ/2000/014208. 2000.

154. Fukuda T. Improvement in enzymatic desizing of starched cotton cloth using yeast codisplaying glucoamylase and cellulose-binding domain / T. Fukuda, KM. Michiko, K. Kuroda et. al. // Appl. Biochem. Biotechnol. 2008. - № 77. -P. 1225-1232.

155. Goksoyr J. / In: Symposium on Enzymatic Hydrolysis of Cellulose, 1975. P. 217.

156. Goswami L. Inducing large deformation in wood cell walls by enzymatic modification / L. Goswami, M. Eder, N. Gierlinger et. al. // Journal of Materials Science. 2008. - Vol. 43. - №. 4. - P. 1286-1291.

157. Gregg D.J. Factors affecting cellulose hydrolysis and the potential of enzyme recycle to enhance the efficiency of an integrated wood to ethanol process / D.J. Gregg, J.N. Saddler //Biotechnology and Bioengineering. 1996. - Vol. 51. -№4.-P. 375-383.

158. Gusacov A.V. A theoretical comparison of the reactors for the enzymatic hydrolysis of cellulose / A.V. Gusacov, A.P. Sinitsyn // Biotechnology and Bioengineering. 1987. - Vol. 29. - № 27. - P. 898-900.

159. Gusacov A.V. Design of highly efficient cellulase mixtures for enzymatic hydrolysis of cellulose / A.V. Gusakov, T.N. Salanovich, A.I. Antonov and others // Biotechnology and Bioengineering. 2007. - Vol. 97. - № 5. - P. 1028-1038.

160. Haggett K.D. Crystalline cellulose degradation by a strain of Cellulomonas and its mutant derivatives / K.D. Haggett, P.P. Gray, N.W. Dunn // Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1979. -№ 8. - P. 183-190.

161. Halliwell G. Hydrolysis of fibrous cotton and reprecipitated cellulose by cellulolytic enzymes from soil micro-organisms / G. Halliwell // Biochem. Journal. 1965. - Vol. 95.-№ l.-P. 270-281.

162. Harkki A. Genetic engineering of Trichoderma to produce strains with novel cellulase profiles / A. Harkki // Enzyme Microb. Technol. 1993. - Vol.13. — № 3.-P. 227-233.

163. D.S. Zagorskaya, A.N. Levov et al. // Applied Biochemistry and Microbiology. 2009. - Vol. 45. - № 4. - P. 374-379.

164. Jingchan Z. Enzymatic surface modification of Kevlar fibers / Z. Jingchan, F. Guoning, G. Zhian et. al. // Science in China, Ser. В Chemistry. 2005. - Vol. 48.-P. 37-40.

165. Jones E.O. Kinetic analysis of byconversion of cellulose in attrition bioreactor /

166. E.O. Jones, J.M. Lee // Biotechnol. Bioeng. 1988. - Vol.31. - № 31. - P. 3540.

167. Jorgensen H. Enzymatic conversion of lignocellulose into fermentable sugars: challenges and opportunities / H. Jorgensen, B. Kristensen, C. Felby // Biofuels, Bioproducts and Biorefining. 2007. - Vol. 1. - № 2. - P. 119-134.

168. Kan C. Effect of enzymatic treatment and reactive dyeing on the low stress mechanical properties of linen fabric / C.W. Kan, C.W.M. Yuen, Y.L. Lam and C.K. Chan // Fibers and Polymers. 2009. - Vol. 10. - № 3. - P. 325-332.

169. Kim J. Nanobiocatalysis and its potential applications / J. Kim, J.W. Grate, P. Wang // Trends in Biotechnology. 2008. - Vol. 26. - №. 11. - P. 639-646.

170. Kulish E.I. Macromolecular effects upon enzymatic degradation of chitosan in solution / E.I. Kulish, V.P. Volodina, R.R. Fatkullina et. al. // Polymer Science, Series B. 2008. - Vol. 50.-№7.-P. 172-174.

171. Lawrence H.M. Preliminary characterization of bacteriophages infecting the thermophilic actinomycete Thermomonospora / H.M. Lawrence, H. Merivuori, J.A. Sands and others // Appl Environ Microbiol. 1986. - Vol.52. - № 4. - P. 631-636.

172. Larry U.L. Column cellulose hydrolysis reactor: the effect of retention time, temperarure, cellulose concentration and exogenously added cellobiase on the overall process / U.L. Larry // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1987. - Vol. 26. -№ 1.-P. 21-27.

173. Lee J.M. Continuos attrition bioreactor with enzyme recycling for the bioconversion of cellulose / J.M. Lee., J.H. Wolf // Appl. Biochem. Biotechnol. 1988. - Vol. 18. - P. 203-215.

174. Lund H. Family 6 ENDO-1,4-p-glucanase variants and cleaning composite ions containing them / H, Lund, J.B. Nielsen and others // WO/1999/001544. 1999.

175. McDonald D.G. Alkali treatment of corn stover to improve sugar production of enzymatic hydrilysis / D.G. McDonald, N.N. Bakhshi, J.F. Matheys and others // Biotechnol. Bioeng. 1983. -№ 25. - P. 2067-2076.

176. Mendels M. The use of adsorbed cellulose in the conversion of cellulose to glucose / M. Mendels, J. Kostick // J. Polymer Sci. 1971. - Vol. 36. - P. 445459.

177. Miettinen-oinonen A. Cellulases, the genes encoding them and uses thereof / A. Miettinen-oinonen, J. Londesborough, J. Vehmaanperg and others // WQ/1997/014804, 1997.

178. Mitchinson C. Variant EGIII-like cellulase compositions / C. Mitchinson, DJ. Wendt // US Patent 6268328. 2001.

179. Nicemol J. Optimization of enzymatic clarification of sapodilla juice: A statistical perspective / J. Nicemol, R. K. Sukumaran, P. Prema // Appl. Biochem. Biotechnol. 2008. - № 151.-P. 353-363.

180. Nguyen Т.Н. Feed additive for poultry, poultry feed and method of poultry feeding. / Т.Н. Nguyen, D.W. Cowan, O.B. Joergensen // W0/1991/004673. -1991.

181. Ong E. Enzyme immobilization using the cellulose-binding domain of a Cellulomonas fimi exoglucanase / E. Ong, N.R. Gilkes, R. Warren and others // Bio/technology. 1989. - Vol. 7. - № 5. - P. 604-607.

182. Рус R. Biosynthesis of enzymes by Aspergillus Niger IBT-90 and an evaluation of their application in textile technologies / R. Рус, J. Sojka-Ledakovicz, G. Bratkowska // Fibres & Textiles in Eastern Europe. 2003. - Vol. 11. - № 4. -P. 71-77.

183. Rabinovich M.L. Ethanol production from materials containing cellulose: The potential of Russian research and development / M.L. Rabinovich // Applied Biochemistry and Microbiology. 2006. - Vol. 42. - № 1. - P. 1-26.

184. Rau M. Application of cellulases from Acrophialophora nainiana and Penicillium echinulatum in textile processing of ceMosic fibres / M. Rau, C. Heidemann, A. Pascoalin and others //Biocatalysis and Biotransformation. 2008. - Vol. 26. -№5.-P. 383-390.

185. Ryu S.K. Bioconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor / S.K. Ryu, I.M. Lee //Biotechnol. Bioeng. 1983. - Vol.25. -№ l. p. 53-65.

186. Salazar O. Enzymatic lysis of microbial cells / O. Salazar, J. A. Asenjo // Biotechnol. Letters. 2007. - Vol. 29. - P. 985-994.

187. Sanchez C. Lignocellulosic residues: biodegradation and bioconversion by fungi / C. Sanchez // Biotechnology Advances. 2009. - № 27. - P. 185-194.

188. Sarybaeva I. Physico-chemical and technological properties of powdery celluloses, obtained by the Lewis acids / I. Sarybaeva, A.S. Sultankulova et al. // Cellulose Chem. and Technol. 1991. - V.24. - P. 199-210.

189. Schempp W. Zellulosepulver eineneus klasse von Zeterisierung und Anwendung / W. Schempp, B. Philipp, H.H. Steege // Papier (BDR). - 1976. Bd. 30.-№12.-S. 501-509.

190. Schou C. Stereochemistry, specificity and kinetics of the hydrolysis of reduced cellodextrins by nine cellulases / C. Schou, G. Rasmussen, M.B. Kaltoft et al. // Ibid. 1993.-Vol. 217.-№3.-P. 947-957.

191. Shewale J.G. Enzymatic hydrolysis of cellulosic materials by Sclerotium rolfsii culture filtrate for sugar production / J.G. Shewale., J.C. Sadana // Can. J. Microbiol. 1979. - Vol. 25. - P. 773-783.

192. Silver R.S. Saccharification method / USA patent 4409329. 1983.

193. Somogyi M.A. A new reagent for the determination of sugars / M.A. Somogyi // J. Biol. Chem. 1945. - V. 160. - P. 61-68.

194. Spiridonov N.A. Regulation of biosynthesis of individual cellulases in Thermomonospora fusca / N.A. Spiridonov, D.B. Wilson // J. Bacteriol. 1998. - Vol.180. — № 14.-P. 3529-3532.

195. Srisodsuk M. Role of the interdomain linker peptide of T. reesei cellobiohydrolase I in its interaction with crystalline cellulose / M. Srisodsuk, T.

196. Reinikainen, T.T. Teeri // J. Biol. Chem. 1993. - V. 268. - № 28. - P. 2075620761.

197. Stutzenberger F.J. Cellulolytic activity of Thermomonospora curvata: autritional requirements for cellulase production / F.J. Stutzenberger // Applied Microbiology. 1972. - №24. - P. 77-82.

198. Sulaiman Al-Z. The effect of crystallinity of cellulose on the rate of reducingsugars production by heterogeneous enzymatic hydrolysis / Bioresource Technology. 2007. - 8 p

199. Sunol J.J. Thermal behavior of cellulose fibers with enzymatic or Na2C03 treatment / J.J. Sunol, D. Miralpeixl, J. Saurinal et. al. // Journal of thermal analysis and calorimetry. 2005. - Vol. 80. - P. 117-121.

200. Suzuki H. In: Symposium on Enzymatic Hydrolysis of Cellulose. 1975. - P. 83.

201. Wang N. Preparation and Liquid Crystalline Properties of Spherical Cellulose Nanocrystals / N. Wang, E. Ding, R. Cheng // Langmuir. 2008. - Vol. 24. -№. 1.-P.5-8.

202. Wang Q. Synthesis and application of carbohydrate-containing polymers / Q. Wang, J.S. Dordick, R.J. Linhardt // Chem. Mater. 2002. - V. 14. - P. 32323244.

203. Wicher K.B. Thermostable cellulase / K.B. Wicher, M.Y.A. Hashem and others // USA Patent № 6812018. 2004.

204. Wilke C.R. Process development studies on the enzymatic hydrolysis the cellulose / C.R. Wilke., I.M. Lee // Biotechnol. Bioeng .Symp. 1975. - Vol. 5. -P. 253-274.

205. Wilson R.C. Expression systems for commercial production of cellulase and xylanase in Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis / R.C. Wilson, M.R. Tang, T. Christianson and others // USA Patent № 5888800. 1999.

206. Yang B. Pretreatment: the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol / B. Yang, C.E. Wyman // Biofuels, Bioproducts and Biorefining. 2008. - Vol. 2. -№ 1. - P. 26-40.

207. Zhang Y.P. Toward an aggregated understanding of enzymatic hydrolysis of cellulose: Noncomplexed cellulase systems / Y.P. Zhang, L.R. Lynd // Biotechnology and Bioengineering. 2004. - V. 88. - № 7. - P. 797-824.