Фенотипический эффект экспрессии рекомбинантных генов в организме трансгенных животных

Волкова, Наталья Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Фенотипический эффект экспрессии рекомбинантных генов в организме трансгенных животных
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Фенотипический эффект экспрессии рекомбинантных генов в организме трансгенных животных"

На правахрукописи

Ошъ

ВОЛКОВА Наталья Александровна

ФЕНОТИПИЧЕСКИИ ЭФФЕКТ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ГЕНОВ В ОРГАНИЗМЕ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

03.00.23 - Биотехнология 03.00.13 - Физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

003450264

п. Дубровицы. Московская обл. 2008

003450264

Работа выполнена в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных Государственного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук».

Научные консультанты: доктор сельскохозяйственных наук,

профессор, академик РАСХН Эрнст Лев Константинович; доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАСХН Зиновьева Наталия Анатольевна

Официальные оппоненты: доктор биолог ических наук, профессор,

Дьяконов Лев Петрович; доктор биологических наук, профессор Народицкий Борис Савельевич; доктор биологических наук, профессор, Фомичев Юрий Павлович

Ведущее учреждение: Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина.

Защита состоится 11 ноября 2008 года, в 10 часов, на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.013.01 при ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии».

Адрес института; 142132 Московская область, Подольский район, пос. Дубровицы, ВНИИЖ, т/факс (4967) 65-11-01

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВНИИЖ. Автореферат разослан « » октября 2008 года.

Ученый секретарь сов!

В.П. Губанова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Успехи в технологии получения рекомбинантных ДНК открыли возможность создания новых генотипов путем введения, удаления или изменения генома животного уже в первом поколении. Значительный прогресс, достигнутый в этой области, связан, прежде всего, с разработкой новых более эффективных способов получения трансгенных организмов и созданием качественно новых генных конструкций, обеспечивающих более высокие уровни экспрессии трансгенов в организме животных [Зиновьева H.A., Эрнст Л.К., 2006]. Однако, несмотря на достигнутые успехи при получении трансгенных животных, все еще остается проблема, связанная с не прогнозируемостью физиологических последствий реализации внесённой генетической информации.

Данные последствия являются, с одной стороны, результатом изменений на уровне генотипа, обусловленных дестабилизацией генома трансгенных животных [Кленовицкий П.М. и др., 1999, Медведев С.Ю., 1992, Brem, 1993, Constantini et al., 1989, Gasaryan et al, 1987]. С другой стороны, нарушения в функционировании отдельных систем организма могут быть связаны с дополнительной экспрессией интегрированных рекомбинантных генов и проявляться на различных уровнях организации индивидуумов: генетическом, цитологическом, тканевом, организменном [Nancarraw et al., 1991, Pursei et al, 1987, 1989, Эрнст Л.К и др., 1993, Голъдман И.Л.и др., 1993, 1994]. И если влияние чужеродных генов на организм трансгенных животных достаточно полно изучено на макроуровне (организм в целом), то исследований на клеточном и тканевом уровнях (микроуровне) проводится мало. Хотя именно последнее в некоторых случаях может дать полный ответ на ряд вопросов, касающихся взаимодействия вырабатываемых в организме трансгенных животных рекомбинантных бежов с собственными (эндогенными) белками организма и объяснить вызванные данным взаимодействием нарушения в нормальном развитии животного.

В связи с этим, для оценки влияния интеграции чужеродных генов на организм животных необходимо наряду с анализом генотипа проводить комплексные исследования трансгенных животных по фенотипическим признакам, затрагивая проявление экспрессии вырабатываемых рекомбинантных продуктов на уровне тканей и клеток.

Цель и задачи. Исходя из вышеизложенного, целью диссертационной работы являлось изучение фенотипического эффекта экспрессии рекомбинантных генов в организме трансгенных животных разных форм на различных уровнях организации индивидуумов: организменном, тканевом и клеточном.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

I. Разработать технологию получения соматических трансгенных сельскохозяйственных животных (коров, коз, свиней) посредством использования ретровирусных векторов.

( & \J

2. Изучить молекулярные аспекты трансформации клеток молочной железы сельскохозяйственных животных при локальном трансгенезе и исследовать динамику синтеза рекомбинантных белков с молоком полученных соматических трансгенных животных.

3. Изучить наследование трансгенов в ряде поколений свиней, интегрировавших ген соматолиберина человека, и кроликов со встроенными генами кластера RCA и оценить влияние интеграции чужеродной ДНК на сохранение стабильности генома трансгенных животных.

4. Исследовать изменения биохимического статуса, морфофункциональных характеристик внутренних органов и тканей, динамики роста, показателей откормочной и мясной продуктивности у трансгенных свиней по сравнению с аналогами. Выполнить анализ корреляционных зависимостей в организме трансгенных и интактных свиней.

5. Исследовать экспрессию генов кластера RCA в организме трансгенных кроликов и изучить характер изменения фенотипа кроликов под влиянием трансгенеза.

6. Выполнить теоретическое и экспериментальное обоснование отдельных элементов технологии трансгенеза кур, направленное на повышение результативности создания трансгенной птицы.

7. Изучить характер интеграции и экспрессии рекомбинантных генов в органах и тканях трансгенных кур.

8. Выполнить сравнительную оценку влияния интеграции и экспрессии рекомбинантных генов на фенотип и генотип трансгенных животных различных форм.

Научная новизна. В ходе выполнения диссертационной работы впервые исследованы механизмы создания соматических трансгенных животных (коров, коз, свиней) методом локального трансгенеза и изучены факторы, обуславливающие результативность генетической трансформации клеток молочной железы in vivo. Выполнено исследование уровня синтеза рекомбинантных белков - гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (ГКСФ) и эритропоэтина человека (ЭПО) в молоко полученных трансгенных животных в динамике и оценены изменения морфофункциональных характеристик ткани молочной железы опытных животных под воздействием экспрессии трансгенов.

Впервые выполнена комплексная оценка влияния интеграции и экспрессии трансгена на генотип и фенотип свиней, трансгенных по гену соматолиберина человека в ряде генераций в сравнительном аспекте. Изучен характер изменения корреляционных связей в организме опытных животных.

сохранение стабильности генома трансгенных животных. Исследована экспрессия генов кластера RCA в организме трансгенных кроликов и изучены особенности их фенотипа.

Оценена результативность генетической модификации эмбрионов кур in vivo с использованием ретровирусных векторов. Изучены факторы, влияющие на эффективность получения трансгенных кур. Исследован характер экспрессии репортерных генов lacZ и GFP (зеленый флюоресцирующий белок) в различных органах и тканях полученной трансгенной птицы.

На основании проведенных исследований дана оценка фенотипического эффекта экспрессии рекомбинантных белков в организме трансгенных животных разных форм.

Практическая значимость.

Разработана технология локального трансгенеза молочной железы сельскохозяйственных животных - коров, коз и свиней с целью создания соматических трансгенных животных - биореакторов. Установлены факторы, обуславливающие результативность генетической трансформации клеток вымени сельскохозяйственных животных in vivo. Получены соматические трансгенные коровы, козы и свиноматки, продуцирующие с молоком гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) и эритропоэтин (ЭПО) человека.

Изучены биологические и некоторые продуктивные особенности свиней, трансгенных по гену соматолиберина человека, в сравнительном аспекте в ряде поколений. Выявлены изменения показателей биохимического статуса и морфофункциональных характеристик внутренних органов. Установлено изменение характера корреляционных связей в организме трансгенных свиней.

Изучены биологические особенности кроликов, трансгенных по генам-ингибиторам комплемента кластера RCA. Установлено, что интеграция больших фрагментов ДНК (длиной 700 тысяч и.о.) на основе YAC не оказывает существенного влияния на жизнеспособность трансгенных кроликов, что позволяет рассматривать этих животных в качестве функциональной модели для изучения проблем ксенотрансплантации. Показана повышенная устойчивость клеток трансгенных кроликов к лизису сывороткой крови человека, • что указывает на потенциальную значимость генов-ингибиторов комплемента кластера RCA в разработке технологий клеточной терапии.

Усовершенствована технология получения трансгенных кур, основанная на использовании ретровирусных векторов. Разработан способ введения ретровирусных векторов в эмбрионы кур in vivo. Установлены факторы, влияющие на результативность генетической модификации эмбрионов кур. Получена трансгенная птица с интеграцией и экспрессией репортерных генов lacZ и GFP (зеленый флюоресцирующий белок) в ряде внутренних органов: сердце, печени, кишечнике, желудке, мышцах, репродуктивных органах.

Основные положения, выносимые на защиту.

• Опосредованный ретровирусами перенос генов как результативный способ доставки экзогенной ДНК в клетки молочной железы животных и создания соматических трансгенных сельскохозяйственных животных — коров, коз и свиней.

• Тип генной конструкции и вектора, способ подготовки инъекционного препарата и стадия введения в организм животных как факторы, обуславливающие результативность локального трансгенеза молочной железы и создания соматических трансгенных животных-продуцентов.

• Изменения биохимического статуса, морфофункциональных характеристик внутренних органов и некоторых продуктивных показателей у свиней, трансгенных по гену соматодиберина, разных генераций.

• Повышенная устойчивость различных типов клеток кроликов, трансгенных по генам-ингибиторам комплемента кластера RCA, к лизису сывороткой крови человека.

• Динамика уровня хромосомных нарушений у трансгенных животных - свиней и кроликов в ряде генераций.

• Усовершенствованная технология создания трансгенных кур и факторы, обуславливающие ее результативность.

• Сравнительный анализ проявления интеграции и экспрессии рекомбинантных генов в фенотипе трансгенных сельскохозяйственных животных различных форм.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 16 международных конференциях (Дубровицы, 2001, 2002, 2003, 2004, 2005, 2006; Быково, 2002; Москва, 2004, 2005, 2006; Бишкек, 2005; Чимкент, 2005; Боровск, 2006; Санкт-Петербург, 2007).

По материалам диссертации опубликовано 45 научных работ, в том числе в центральных научных журналах, рекомендованных ВАК - 12, книг -1, методических рекомендаций - 2, патентов -1.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 324 страницах, содержит 69 таблиц, 35 рисунков, 17 графиков, 10 схем. Библиографический список содержит 407 источников, в том числе 366 на иностранных языках.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа была выполнена в период с 2001 по 2008 гг. в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии» (ГНУ ВНИИЖ), физиологическом дворе и экспериментальных хозяйствах ГНУ ВНИИЖ ОПХ «Дубровицы», ОНО э/х «Кленово-Чегодаево», а также агрофирме «Толмачево» Нижегородской области согласно схеме, представленной на рисунке 1.

Рис.1. Схема исследований.

Объектом исследований служили различные трансгенные формы сельскохозяйственных животных:

1. Свиньи, трансгенные ио гену соматолиберина (генная конструкция MTl-hGRF). Исследования проводили на свиньях II, Ш, IV, VIII, IX и X генераций. Животные II генерации были восстановлены посредством внутриутробного осеменения нетрансгенных маток глубоко замороженным семенем трансгенных хряков, хранившимся в криобанке более 10 лет [Багиров В.А., 2004]. Возобновление поколений трансгенных свиней позволило провести сравнительные исследования свиней генераций II - VIII, III-IXhIV-X.

2. Кролики, интегрировавшие гены-ингибиторы DAF и MCP кластера регуляторов активации комплемента (генная конструкция RCA-YAC размером 700 тыс. п.о.). При различных типах спаривания от двух трансгенных самцов первого поколения было получено и изучено три генерации трансгенных кроликов (п=164).

3. Куры, трансгенные по генам LacZ и GFP, полученные методом опосредованного ретровирусами переноса генов с использованной разработанной в ходе выполнения диссертационной работы технологии [Патент РФ, RU2303068 С1, Волкова H.A., 2006, 2007] Для трансформации эмбрионов кур (п=780) использовали два ретровирусных вектора pBMN-lacZ и pLN-GFP, содержащих, соответственно, репортерные гены lacZ и GFP под контролем промотора цитомегаловируса человека (CMV). В качестве источника генных конструкций использовали клетки-упаковщицы и рекомбинантный вирусный препарат, представляющий собой среду культивирования клеток-упаковщиц [Новое в клонировании ДНК, 1989].

4. Соматические трансгенные коровы, козы и свиноматки, продуцирующие с молоком эритропоэтин (ЭПО) и гранулоцнтарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) человека. Животные были получены методом локального трансгенеза молочной железы с использованием технологии, усовершенствованной в ходе выполнения диссертационной работы. Для трансгенеза были использованы векторные конструкции pLN-a, содержащая ген ЭПО человека (ген предоставлен д.б.н., профессором Рябых В.П., ВНИИФБиП, г. Боровск), и pLN-G-CSF, содержащая ген Г-КСФ человека. Конструкции были получены к.б.н. Фоминым И.К., Институт цитологии и генетики HAH Беларуси. Введение ретровирусных векторов осуществляли на разных сроках беременности непосредственно в молочную железу коров (п=24), коз (п=13) и свиноматок (п=24).

Выделение ДНК из крови, спермы и ткани осуществляли с использованием солевого и перхлоратного методов [Зиновьева H.A. и др., 1998]. Наличие генной конструкции в тканях и органах опытных животных определяли методом ПЦР по стандартной методике.

Для оценки экспрессии рекомбинантных белков в молоке и тканях опытных животных использовали методы иммуноферментного анализа и иммуногистохимии [Волкова ДА, 2003; Волкова Н.А и др., 2004].

Гистологические препараты готовили по общепринятой методике [.Ромейс, 1953]. Для фиксации образцов органов и тканей использовали 10% раствор формалина и фиксатор Буэна (для эмбрионов). Срезы для гистологических препаратов готовили на ротационном микротоме (TermoShandon, Великобритания).

Получение и приготовление препаратов митотических хромосом трансгенных животных осуществляли согласно методике [Кпеновицкий П.М. и др., 2003]. Цитогенетический анализ полученных препаратов хромосом, а также микроскопирование гистопрепаратов осуществляли с помощью микроскопа «Opton», оборудованного цифровым фотоаппаратом, с использованием компьютерной программы Image Scope (г. Москва, ООО «Системы для микроскопии и анализа»).

Динамику роста и развития трансгенных свиней оценивали путем проведения контрольного откорма с последующим убоем [Методические указания по изучению качества туш, мяса и подкожного жира убойных свиней, 1978]. Было проведено три сравнительных опыта на животных разных генераций: (1) II и VIII генераций, откорм с 30 до 120 кг, (2) III и IX генераций, откорм с 30 до 120 кг, (3) свиньи X генерации, откорм с 45 до 150 кг.

Для оценки биохимического статуса трансгенных животных определяли концентрацию в сыворотке крови метаболитов белкового, углеводного, липидного и минерального обменов с использованием биохимического анализатора (ChemWell, США).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием стандартных методов [Меркурьева Е.А., 1991] с применением программного обеспечения MS Excel.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Получение и исследование соматических трансгенных животных - биореакторов

3.1.1. Трансформация клеток молочной железы животных в культуре in vitro

С целью оценки тропности используемых генных конструкций были проведены эксперименты по трансформации первичной культуры клеток молочной железы коровы, козы и свиноматки рекомбинантными векторами in vitro. Проведенные исследования выявили различия в эффективности трансформации клеток-мишеней в зависимости от их видовой принадлежности, используемой генной конструкции и пакующей линии клеток. Максимальное число генетически трансформированных клонов было получено при использовании вектора pLNa и пакующей линии клеток GP+envAml2: частота генетической трансформации достигала 2*10"3, что было в 2-9 раз выше по сравнению с использованием для этих целей ретровирусного вектора pLN-G-CSF и пакующей линии pgl3. Данные, полученные в экспериментах in vitro, позволили прогнозировать более

высокую экспрессию рекомбинантных белков в молоко коров, коз и свиней и при введении вектора pLNa в молочную железу опытных животных in vivo.

3.1.2. Создание соматических трансгенных животных и анализ факторов, влияющих на результативность локального трансгенеза клеток молочной железы животных in vivo

В рамках выполнения диссертационной работы были выявлены и изучены факторы, влияющие на результативность переноса экзогенной ДНК в клетки молочной железы сельскохозяйственных животных in vivo. Основываясь на полученных результатах, была выполнена оптимизация следующих элементов технологии локального трансгенеза клеток вымени животных: (1) метод введения рекомбинантных векторов в клетки-мишени, (2) способ подготовки конструкций для инъекций (клетки-упаковщицы, культуральная жидкость) и их концентрация, (3) стадия введения векторов в молочную железу животных и (4) тип пакующей линии клеток.

• Метод введения рекомбинантных векторов. Введение рекомбинатных векторов осуществляли внутривенно (п=2) и непосредственно в молочную железу (п=2) подопытных животных, в частности, свиноматок. Максимальная экспрессия рекомбинантного продукта (ЭПО) в молоко была установлена при введении векторов в молочную железу - 600 нг/мл (при средней концентрации за лактацию 153+52 нг/мл). При инъекции генных конструкций в кровяное русло содержание ЭПО в молоке свиноматок достигало лишь 70 нг/мл (при средней концентрации 11±4 нг/мл). Учитывая это, в своих дальнейших исследованиях введение векторов осуществляли непосредственно в молочную железу животных.

• Способ подготовки генных конструкций для инъекций и их концентрация. В качестве источника генных конструкций были использованы клетки-упаковщицы, предварительно блокированные митомицином С, и культуральная жидкость, содержащая рекомбинантный вектор. Препараты были введены в молочную железу коров (п=5) и свиноматок (п=6). Максимальный уровень экспрессии рекомбинантного ЭПО с молоком коров и свиноматок был установлен при введении клеток-упаковщиц в концентрации, соответственно, 25-35 и 6-10 млн. клеток на долю вымени и достигал в среднем 200±39 нг/мл (при максимальной концентрации в молоке 450 нг/мл). При использовании в качестве источника генных конструкций культуральной жидкости содержание рекомбинантного продукта в молоке было на 40-66% ниже и варьировало от 24±3 до 71±7 нг/мл (при максимальной концентрации 150 нг/мл).

• Стадия введения векторов. Введение клеток-упаковщиц в молочную железу коров (п=10), коз (п=4) и свиноматок (п=7) осуществляли на разных сроках беременности. Максимальная экспрессия рекомбинантного продукта с молоком соматических трансгенных животных была установлена при введении генных конструкций во второй половине беременности: у коров -на 4-6-м месяцах стельности, свиноматок - на 3-м месяце супоростности, коз

- на 4-5-м месяцах сукозности. Средняя концентрация рекомбинантного ЭПО в молоке коров, свиноматок и коз за лактацию достигала, соответственно, 147±28, 177+39 и 204+23 нг/мл при максимальной концентрации, соответственно, 800, 500 и 400 нг/мл. Данные иммуноферментного анализа были подтверждены результатами ДНК-анализа результативности генетической трансформации клеток молочной железы. Высокая эффективность трансформации секреторных клеток вымени отмечалась при введении генных конструкций в молочную железу во второй половине беременности: рекомбинантная ДНК диагностировалась в 57-73% проб соматических клеток, выделенных из молока.

• Тип пакующей линии клеток. Высокая результативность переноса рекомбинантной ДНК в секреторные клетки молочной железы опытных животных была установлена при использовании пакующей линии GP+envAml2. При введении векторов, помещенных в пакующую линию pgl3, в молочную железу коров (п=4), коз (п=4) и свиноматок (п=4) уровень экспрессии рекомбинантных белков с молоком животных был ниже в 1,5-2 раза: средняя концентрация рекомбинантного ЭПО в молоке коз и свиноматок за лактацию достигала, соответственно, 92±28 и 137±32 нг/мл при максимальной концентрации 350 и 400 нг/мл, Г-КСФ - соответственно, 29±7 и 20±5 нг/мл при максимальной концентрации 100 и 65 нг/мл. У коров при использовании пакующей линии pgl3 экспрессия рекомбинантных белков в молоко наблюдалась только первые три месяца лактации: среднее содержание ЭПО в молоке за данный период достигало 198±79 нг/мл, Г-КСФ

- 25±9 нг/мл, максимальный уровень ЭПО - 1000 нг/мл, Г-КСФ - 150 нг/мл. В то же время при использовании клеточной линии GP+envAml2 рекомбинантный продукт с молоком опытных коров экспрессировался в течение всей лактации.

С целью апробации разработанной технологии локального трансгенеза было осуществлено введение векторов pLNa и pLN-G-CSF, содержащих, соответственно, гены ЭПО и Г-КСФ человека, в молочную железу коров (п=5), свиноматок (п=3) и коз (п=5) с учетом установленных ранее оптимальных факторов. В качестве источника генных конструкций использовали клетки-упаковщицы в концентрации 25-30 (для коров) и 6-10 (для коз и свиноматок) млн. клеток на долю вымени. Для упаковки рекомбинантных векторов использовали пакующую линию GP+envAml2.

Наличие ДНК генной конструкции в соматических клетках молока было установлено у всех подопытных животных. Следует отметить, что положительные сигналы наблюдались также в пробах молока, взятых из долей вымени, инъекцию клеток-упаковщиц в которые не осуществляли, что, возможно, связано с распространением генной конструкции в соседние доли вымени через кровь. Наличие ДНК генной конструкции pLNa было выявлено у коров - в 62-85%, у коз - в 62-66%, у свиноматок - в 43-85% исследованных проб, отобранных в различные периоды лактации. При введении вектора pLN-G-CSF данные показатели составили, соответственно, 34-58, 28-56 и 5157%.

Экспрессия рекомбинантных белков в молоко была установлена у всех опытных животных и наблюдалась в течение всей лактации. Содержание рекомбинантного ЭПО в молоке свиноматок достигало 600 нг/мл, коров и коз - 400 нг/мл. Г-КСФ экспрессировался в количестве до 60, 200 и 125 нг/мл, соответственно (табл. 1).

Таблица 1

Уровень экспрессии рекомбинантных белков с молоком соматических

трансгенных животных

Вид Рекомби- № Стадия Введено Уровень

живот- нантный живот введения, клеток, млн. экспрессии, нг/мл

ного белок ного мес.* на долю все М±т Макс

вымени го

коровы ЭПО 3180 4-6 25-30 115 138+18 400

ЭПО 3284 6,5 30 120 118±15 350

Г-КСФ 3204 4-6 25-30 115 34±10 200

Г-КСФ 3340 6,5 30 120 20±5 60

козы ЭПО 10 4 10 10 137+19 350

ЭПО 14 4,5 10 10 192+16 400

Г-КСФ 5 4 10 10 37+8 120

Г-КСФ 6 4 10 10 39±7 125

ТЧССФ 8 4,5 10 10 46±7 120

свиньи ЭПО 5183 3 6 12 185+35 400

ЭПО 3973 3 6 60 153+52 600

Г-КСФ 1397 3 10 100 25±7 60

Примечание: * месяц беременности.

Анализ уровня синтеза рекомбинантных белков в течение лактации показал, что периоды активного синтеза сменялись периодами, когда экспрессия рекомбинантных продуктов была низкая или вообще отсутствовала (рис 2). При этом вне зависимости от используемой генной конструкции наибольшее число пиков активного синтеза белка отмечалось в первую треть лактации (табл. 2). Средняя концентрация ЭПО в молоке в первую треть лактации по сравнению со второй и последней третями лактации была выше, соответственно, в 1,1-1,9 и 1,3-2,6 раз. Аналогичная тенденция наблюдалась и при введении генной конструкции рЬ№-Сг-С8Р: среднее содержание Г-КСФ в молоке опытных животных в первую треть лактации достигало 34-58 нг/мл, что было на 11-88% выше уровня экспрессии во вторую и последнюю трети лактации. Данные ИФА были подтверждены иммуногистохимическими исследованиями: наличие рекомбинантного продукта в секреторных клетках молочной железы было установлено у всех исследованных животных (коров, коз и свиноматок).

Дннлактаиггн

Дннлзкгацнн

Рис. 2 Динамика экспрессии рекомбинантных белков с молоком соматических трансгенных коз (верхний график) и коров (нижний график) в течение лактации. Черным цветом показано изменение концентрации рекомбинантного ЭПО в молоке опытных животных, серым цветом ~ Г-КСФ.

Таблица 2

Средние показатели уровня экспрессии рекомбинантных белков с молоком опытных животных в течение лактации, нг/мл (М+т)

Вид животного Рекомбинан-тный белок Период лактации

первая треть вторая треть последняя треть

Коровы ЭПО 134+9 72+13 77+26

Г-КСФ 34±5 30±7 11±1

Свиньи ЭПО 160+15 141+6 121±46

Козы ЭПО 222+30 197±25 84+15

Г-КСФ 58+16 24±5 7±2

3.1.3. Влияние проводимых генно-инженерных манипуляций на организм опытных животных.

• Распространение ретровирусных векторов в организме опытных животных. Принимая во внимание выявленную у опытных животных неспецифическую экспрессию рекомбинантных продуктов в интактных долях вымени, нами было изучено распространение вводимых конструкций в организме животных после инъекций ретровирусных векторов в молочную

железу и кровь. Проведенный ДНК-анализ показал наличие рекомбинантных последовательностей не только в молочной железе, но и в ряде других органов и тканей опытных животных. При этом характер локализации трансгенов и степень генетической трансформации зависели от метода введения векторов. При инъекции векторов в молочную железу наличие ДНК генной конструкции идентифицировалось так же в клетках надпочечников, поджелудочной, слюнной железах и спинном мозге. При введении генных конструкций в кровь рекомбинантная ДНК распространялась в большее число органов: почки, селезёнку, щитовидную и слюнную железы, головной мозг. Исследование образцов, отобранных из различных участков внутренних органов, показало очаговый характер интеграции рекомбинантной ДНК.

• Сравнительное исследование гистоструктуры вымени и других органов опытных животных. Изучение морфогистологических особенностей вымени опытных коров, коз и свиноматок, подвергшихся локальному трансгенезу молочной железы, не выявило значительных изменений в гистологической структуре органа-мишени. Различий в структуре молочной железы опытных и контрольных животных установлено не было. Гистологическое исследование других органов опытных животных так же не выявило каких-либо структурных изменений.

3.2. Изучение трансгенных животных с измененными хозяйственно-полезными признаками

Введение в геном сельскохозяйственных животных генов каскада гормона роста предполагает повышение интенсивности роста и улучшение качества животноводческой продукции. С целью проверки данной гипотезы были изучены особенности генотипа и фенотипа свиней, трансгенных по гену соматолиберина ранних (П, III и IV) и поздних (VIII, IX и X) генераций в сравнительном аспекте.

3.2.1. Анализ наследования генной конструкции соматолиберина человека в ряде генераций трансгенных свиней

Наследование трансгена у свиней определялось типом спаривания и происхождением. При спаривании по типу «трансген» - «нетрансген» доля трансгенных животных в потомстве варьировала в среднем от 28,4 до 40,0%. При спаривании трансгенных родителей данный показатель достигал 50,062,5%. Характер наследования генной конструкции у животных разных генераций существенно не различался.

Вместе с тем, было установлено индивидуальное влияние отдельных особей на степень наследования трансгена: так, методом анализирующего спаривания трансгенных хряков с нетрансгенными самками была установлена высокая степень наследования рекомбинантной ДНК в потомстве хряка №831 - 51% и, напротив, низкая степень наследования трансгена в потомстве хряка №046 -10%.

3.2.2. Влияние интеграции рекомбинантной ДНК на сохранение стабильности генома трансгенных свиней

Цитогенетический анализ трансгенных свиней не выявил отклонений в хромосомной формуле пола: кариотип у свиней всех исследованных генераций в большинстве клеток соответствовал видовой норме и содержал 38 хромосом. Однако в части клеток встречались различные хромосомные аберрации. Подавляющее число нарушений, обнаруженных у трансгенных свиней, было представлено разрывами хромосом (рис. За) и более сложными хромосомными перестройками, в основном, дицентриками (рис. 36). Наличие дицентрических хромосом было установлено у трансгенных свиней только II и III генераций в 2,4 и 2,6% случаев, соответственно. У животных II генерации в 3,6% исследованных клеток наблюдалась так же пульверизация хромосом (рис. Зв). У животных IV, VI, IX и X генераций аберрации хромосом были представлены только разрывами.

Рис. 3. Хромосомные аберрации, выявленные у трансгенных по гену соматолиберина свиней: а) хроматидный разрыв в коротком плече хромосомы 1-й пары (показано стрелкой); б) дицентрическая хромосома (.показано стрелкой); в) пульверизация хромосом.

Изучение стабильности кариотипов трансгенных свиней разных генераций выявило уменьшение доли аберрантных клеток с увеличением числа генераций. Высокий процент хромосомных аномачий был установлен у свиней II и III генераций - 38,8 и 24,0%, соответственно. У животных последующих генераций доля аберрантных клеток составляла лишь 4,813,0%. Количество аберраций в контроле варьировало от 3,1 до 4,0%.

Наряду с оценкой уровня спонтанной хромосомной изменчивости кариотипа трансгенных животных была изучена активность ядрышковых организаторов (ЯО). Проведенные исследования выявили достоверное увеличение числа активных ЯО (р<0,001) у трансгенных животных: у трансгенных свиней данный показатель достигал 2,88±0,12, в то время как у их аналогов - только 2,00±0,07.

3.2.3. Особенности фенотипа трансгенных свиней

Оценку фенотипа трансгенных животных проводили в разные периоды онтогенеза. Были изучены следующие показатели: уровень синтеза

а)

б)

в)

собственного гормона роста как одного из ключевых показателей, характеризующих экспрессию интегрированного гена соматолиберина в организме трансгенных свиней, показатели мясной и откормочной продуктивности, биохимический статус, гистоструктура внутренних органов и тканей.

• Гормональный статуе. Трансгенные животные превосходили своих нетрансгенных сверстников по содержанию гормона роста в крови в среднем в 1,5-2 раза (табл. 3). При этом животные ранних генераций (II и III) характеризовались более высоким содержанием соматотропина в крови по сравнению с животными поздних генераций (VIII, IX и X).

Таблица 3

Экспрессия гормона роста в организме трансгенных свиней и их

нетрансгенных аналогов

Генерации ИФА, нг/мл (Cv,%) ИГХ, усл.ед (Cv,%)

опыт контроль опыт контроль

II 6,20±1,11 (54) 3,31±0,44 (56) 106,7±5,1 (45) 98,3±2,9 (28)

П1 7,15±1,34 (56) 3,11±0,37 (51) 91,4±4,2 (44) 82,8±3,7 (42)

vni 4,60±1,10 (72) 3,31 ±0,44 (56) 100,5±4,7 (44) 98,3±2,9 (28)

IX 6,16±1,12 (54) 3,11±0,37 (51) 99,3±4,2 (33) 82,8±3,7 (42)

X 4,88±0,56 (44) 3,40±0,42 (43) 96,0±3,2 (41) 88,0±3,2 (35)

Примечание: ИФА - гшмуноферментный анализ, ИГХ -шшуногжтохимия.

Данные, полученные методом иммуноферментного анализа, были подтверждены и иммуногистохимическими исследованиями: относительное содержание соматотропина в клетках гипофиза трансгенных животных было до 20% выше аналогичных показателей контрольных животных {табл. 3).

• Особенности роста и развития. Изучение динамики роста трансгенных свиней и их аналогов в различные периоды онтогенеза выявило тенденцию к увеличению скорости роста у трансгенных свиней в конце эмбриогенеза и в постнатальный период развития. Трансгенные животные практически во всех изучаемых возрастах превосходили своих нетрансгенных сверстников по живой массе и среднесуточному приросту: максимальная разница между экспериментальными группами по данным показателям достигала, соответственно, 11,9 и 35,7%. При этом животные ранних генераций характеризовались повышенной скоростью роста по сравнению с животными последующих генераций (рис. 4).

Анализ результатов двух независимых опытов по контрольному откорму свиней генераций II, VIII (опыт №1) и III, IX (опыт №2) показал, что животные ранних генераций (II и III) превосходили животных более поздних генераций (VIII и IX) по живой массе и среднесуточному приросту в среднем на 1,8-12,4% и 3,0-14,5%, соответственно.

—♦—2 поколение --»-8 поколение ■!>--контроль

170 200 240 возраст, дн

3 поколение -«-9 поколение :: контрол]

175 205 возраст, дн

Рис. 4. Динамика роста трансгенных свиней разных генераций. Генерации II, VIII (левый график) и III, IX (правый график).

Анализ весовых показателей внутренних органов показал, что трансгенные животные в ряде генераций превосходили своих аналогов по весу печени, желудка, кишечника, почек, матки, яичников, щитовидной железы и гипофиза. Причем преимущество трансгенных животных по массе органов желудочно-кишечного тракта и репродуктивных органов сохранялось во всех исследованных генерациях (различия до +65,2%).

• Мясная продуктивность и качество туш. Анализ морфологического состава и качества туш трансгенных и контрольных свиней выявил различия по длине туши, процентному содержанию мяса и сала, толщине шпика (табл.

4)-

Таблица 4

Морфологический состав и качество туш трансгенных свиней и их

аналогов

Опыт Группа Длина полутуши, см Выход туши, % Состав туши, % Толщина шпика,см

мясо сало кости

1 II генерация 97,3+3,6 66,4 54,0 34,3 11,7 3,81+0,27

VIII генерация 108,7+3,9 65,1 55,9 32,2 11,9 3,46+0,29

контроль 96,0±0,7 66,1 56,3 31,3 12,4 3,26+0,31

2 III генерация 100,7+2,9 64,5 52,8 37,8 9,4 3,54+0,27

IX генерация 98,5+5,0 67,3 55,6 34,1 10,3 3,13+0,39

контроль 97,0+0,8 65,2 Г54Д 36,4 9,5 3,03+0,30

3 X генерация 107,4+0,8 72,9 52,4 37,1 10,5 4,55+0,27

контроль 111,0+1,5 73,5 51,1 39,2 9,7 4,56+0,47

Примечание; * - средняя толщина шпика по 4 точкам - на холке, над 6-7 грудными позвонками, на пояснице и на крестце.

При этом у трансгенных животных поздних генераций (IX и X) по сравнению с контролем отмечалось увеличение процентного содержания мяса (+1,5%) и уменьшение доли сала (-1,9%) в туше. С увеличением числа генераций наблюдалось уменьшение толщины шпика у трансгенных

животных. Если животные ранних генераций превосходили аналогов по данному показателю на 16,9%, то животные более поздних генераций - на 3,3-6,1%.

• Биохимический статус. Сравнительный анализ метаболического профиля трансгенных свиней и их аналогов выявил некоторые отличия в интенсивности протекания процессов метаболизма. Причем выявленные отличия наблюдались практически во всех изученных генерациях. Так, в возрасте 3,5-4,5 месяцев у трансгенных животных по сравнению с контролем отмечалось снижение в крови уровня общего белка на 1,5-8,2%. Липидный обмен характеризовался, преимущественно, повышением концентрации в крови триглицеридов (до +32,1%) и снижением уровня холестерина (до -13,8%).

При снятии с откорма в возрасте 8-9 месяцев у трансгенных животных, наоборот, наблюдалось повышение уровня общего белка в крови по сравнению с контролем до 13,9%. Углеводно-липидный обмен при этом характеризовался повышением в крови концентрации глюкозы (до +39,2%) и триглицеридов (до +31,5%). Снижение уровня холестерина в крови (на 6,48,1%) было установлено только у животных поздних генераций при откорме до 120 кг. Из метаболитов минерального обмена повторяющиеся в ряде генераций различия были установлены по уровню в крови магния и хлоридов: у трансгенных животных наблюдалось повышение в крови концентрации магния до 11,6% и снижение уровня хлоридов до 4,3%.

• Гистологические исследования внутренних органов. Анализ гистоструктуры внутренних органов и тканей трансгенных животных не выявил каких-либо изменений, связанных с воспалительными или патологическими процессами. Вместе с тем, были установлены некоторые морфометрические изменения в структуре большинства исследованных органов трансгенных свиней. В частности, увеличение по сравнению с контролем практически во всех исследованных поколениях толщины печеночных балок (до +22,7%, р<0,01), толщины железистого слоя донной части желудка (до +11,2%, р<0,01) и высоты ворсинок 12-перстной кишки (до +24,3%, р<0,05), что свидетельствует о более интенсивном темпе развития пищеварительных функций у трансгенных свиней. У трансгенных животных ранних генераций наблюдалось увеличение диаметра ацинусов поджелудочной железы и фолликулов щитовидной железы, соответственно, на 7,3 (р<0,05) и 6,5-19,1%, в более поздних генерациях трансгенные животные, наоборот, уступали своим аналогам по данном показателям, соответственно, на 6,4-8,8 (р<0,01) и 2,6-21,8% (р<0,001).

Значительные изменения были выявлены и в структуре органов сердечнососудистой и выделительной систем организма, а также в мышечной ткани. Однако данные различия варьировали в ряде поколений (табл. 5). Практически во всех изученных генерациях трансгенных свиней было установлено увеличение размеров клеток большинства исследованных органов, что было связано, преимущественно, с увеличением цитоплазмы клеток. Изучение характера накопления нуклеиновых кислот в клетках таких

органов выявило более высокое содержание РНК у трансгенных животных по сравнению с контролем (до +34,6%, р<0,001), что свидетельствует о более интенсивном синтезе белков в организме трансгенных животных.

Таблица 5

Морфометрические показатели внутренних органов и тканей

трансгенных свиней и их аналогов

н Группа Толщина, |л Диаметр

д с печеночных мышечных кардио фолликулов

о балок волокон миоцитов щит. железы, |х

1 П генерация 25,2±0,6 47,9±1,3 25,1±0,5 185±8,1

VIII генерация 21,9±0,6 48,9±1,5 24,8±0,6 197±8,9

контроль 2б,7±0,7 52,4±1,5 24,6±0,7 176±7,8

2 III генерация 20,7+0,2 69,6+2,0 22,5±0,3 188±9,6

IX генерация 25,4±0,6 68,6±1,8 23,2±0,5 224±16,2

контроль 24,9±0,6 55,6±1,2 20,9±0,5 183±12,9

3 X генерация 19,3±0,3 75,1±1,2 19,1 ±0,4 181±5,5

контроль 19,6±0,3 71,4±1,1 27,6±0,6 141±4,5

3.2.4. Анализ корреляций в организме трансгенных свиней и их аналогов

Анализ корреляционных зависимостей выявил изменение у трансгенных свиней характера связей по ряду признаков. В частности, было установлено изменение корреляций между уровнем соматотропина в крови и некоторыми показателями биохимического статуса и хозяйственно-полезными признаками. У трансгенных животных с увеличением числа генераций наблюдалась некоторая стабилизация значений коэффициента корреляции между уровнем соматотропина и показателями белкового обмена и их приближение к аналогичным показателям контрольной группы. Вместе с тем, между уровнем соматотропина и большинством показателей липидно-минерального обмена аналогичная тенденция отмечалась только в раннем возрасте. В более позднем возрасте (8-9 месяцев) с увеличением числа генераций наблюдалось установление новых корреляционных зависимостей, связанных не только с изменением значения коэффициента корреляции, но и его знака. Изменение знака коэффициента корреляции между уровнем соматотропина и большинством хозяйственно-полезных признаков установлено при откорме свиней до 120 кг. При откорме до более тяжелых кондиций таких изменений в характере корреляций не наблюдалось. Однако была выявлена высокая корреляционная зависимость между уровнем соматотропина и рядом селекционных признаков (табл. 6).

Изучение характера корреляций между биохимическими показателями крови выявило стабилизацию у трансгенных животных с увеличением числа генераций корреляционных зависимостей между большинством биохимических показателей за исключением показателей липидного обмена.

Между показателями мясной и откормочной продуктивности у трансгенных животных наблюдалось установление корреляционных зависимостей иного характера (табл. 6).

Таблица 6

Корреляционные связи в организме трансгенных свиней и их аналогов

Признаки Коэффициент корреляции

Откорм до 120 кг Откорм до 150 кг

опыт контроль опыт контроль

СТГ - с/сут. прирост -0,25 0,93 0,81 0,29

СТГ - выход мяса -0,42 0,61 0,89 0,23

СТГ- выход сала 0,06 -0,02 0,33 0,70

СТГ - вес внутреннего жира 0,44 0,83 -0,92 -0,13

с/сут. прирост - выход мяса 0,97 0,44 0,83 0,00

с/сут. прирост - выход сала -0,94 0,13 0,76 0,85

с/сут. прирост - масса костей 0,38 -0,36 0,73 -0,25

Мясо - сало -0,84 -0,30 -0,18. -0,09

Мясо - кости 0,43 -0,91 0,59 -0,59

Предубойная живая масса -вес внутреннего жира -0,47 0,89 -0,60 0,18

3.3. Изучение трансгенных животных - доноров для ксенотрансплантацни

При создании трансгенных животных с целью их использования в клеточной терапии, а также как доноров для ксенотрансплантацни в качестве перспективного подхода рассматривают введение в геном данных животных одновременно нескольких генов - ингибиторов комплемента человека. Однако стандартные плазмидные, космидные или фаговые векторы в большинстве случаев не пригодны для этой цели вследствие их ограниченной емкости. В качестве альтернативы рассматриваются векторные системы на основе искусственных хромосом дрожжей - YAC. В этой связи, нами была изучена результативность использования вектора RCA-YAC для получения трансгенных кроликов с интегрированными генами ингибиторами комплемента МСР и DAF. Было исследовано влияние интеграции и экспрессии трансгенов на генотип и фенотип трансгенных кроликов.

3.3.1. Анализ наследования трансгена в ряде генераций.

Характер наследования генной конструкции RCA-YAC зависел от типа спаривания. При спаривании по типу «трансген» х «нетрансген» степень наследования трансгена оставалось практически одинаковой в течение всех исследованных генераций и варьировала от 31,7 до 36,7%. При спаривании кроликов по типу «трансген» х «трансген» доля трансгенных потомков возрастала с генерациями и составила во втором поколении - 50,0%, в третьем - 71,4%, в четвертом - 72,7%. Была выявлена зависимость характера наследования трансгена от происхождения животных. Анализирующим скрещиванием трансгенных самцов первой генерации с нетрансгенными

самками был установлен более высокий процент трансгенного потомства у самца №025 - 40,9%. Доля трансгенных потомков, полученных от самца №074, была меньше на 11,3% и составила 29,6%.

3.3.2. Анализ экспрессии рекомбинантных генов в организме трансгенных кроликов

Экспрессию генной конструкции RCA-YAC оценивали посредством анализа устойчивости клеток органов и тканей трансгенных кроликов к лизису сывороткой крови человека. Цитотоксическое действие сыворотки крови человека на клетки изучали in vitro на полученных первичных культурах клеток органов трансгенных кроликов: сердца, почек, кишечника, щитовидной и поджелудочной желез.

Инкубация культивируемых клеток тканей трансгенных и контрольных кроликов с сывороткой человека не выявила сильно выраженного лизирующего действия на клетки трансгенного происхождения в присутствии аллогенного (человеческого) комплемента. У трансгенных кроликов цитотоксическое действие сыворотки крови человека было установлено только в отношении клеток сердца: лизис клеток наблюдался в 2 из 14 проведенных опытов. При инкубации сыворотки крови человека с клетками кишечника и почек, полученных от трансгенных животных, выраженного лизиса клеток не отмечалось.

Изучение цитотоксического действия сыворотки -крови человека на культуру клеток сердца, почек, кишечника, щитовидной и поджелудочной желез трансгенных и контрольных кроликов при их культивировании in vitro в среде, содержащей 10 и 50% сыворотки человека, показало устойчивость клеток трансгенного происхождения к иммуноглобулинам сыворотки крови человека. Выраженное цитотоксическое действие.«-, иммуноглобулинов сыворотки крови человека было установлено при культивировании клеток в среде с добавлением 50% сыворотки человека. Через несколько суток культивирования в контрольной культуре наблюдался лизис большей части клеток. В культуре клеток трансгенного происхождения на 3-4 сутки культивирования наблюдалось повышение пролиферации клеток в среднем на 16-22% по сравнению с контролем, что можно рассматривать как подтверждение устойчивости клеток трансгенного происхождения к лизису сывороткой крови человека.

3.3.3. Влияние интеграции рекомбинантной ДНК на сохранение стабильности генома трансгенных кроликов

Цитогенетические исследования трансгенных кроликов не выявили конституциональных нарушений кариотипа, а также отклонений в хромосомной формуле пола. Хромосомный набор всех обследованных животных соответствовал видовой норме и содержал 44 хромосомы. Вместе с тем, у трансгенных животных по сравнению с нетрансгенными сибсами и полусибсами был установлен более высокий уровень хромосомной изменчивости. Хромосомные аномалии были представлены, главным образом, хроматидными, изохроматидными пробелами и разрывами. Были установлены также множественные перестройки. Около 3% выявленных

аберраций составляли дицентрики. Максимальный уровень хромосомной изменчивости был установлен у трансгенных кроликов второй генерации -13,9% (п=17). У особей третьей генерации число клеток с аберрациями было почти в 2 раза меньше и составило 6,4% (п=6). У нетрансгенных животных этот показатель оставался приблизительно на аналогичном уровне (4,9-5,1%), что позволяет предположить некоторую стабилизацию уровня хромосомной изменчивости у трансгенных особей с увеличением числа генераций.

3.3.4. Особенности фенотипа трансгенных кроликов

• Биохимический статус. Биохимический анализ параметров крови трансгенных и нетрансгенных кроликов не выявил значительных различий в интенсивности протекания процессов метаболизма. Наиболее существенные различия были установлены по содержанию в крови глюкозы и холестерина (соответственно, 6,7 и 6,2% в пользу нетрансгенных животных), а также по активности АЛТ (7,1% в пользу трансгенных животных). Однако данные различия были недостоверными. Содержание белковых фракций у животных исследуемых групп практически не различалось. В качестве тенденции, следует отметить, незначительное снижение в крови трансгенных животных уровня общего белка на 2,1%, которое происходило, главным образом, за счет альбуминовой фракции.

• Морфофункциональная характеристика внутренних органов. С целью оценки влияния трансгена на гистоструктуру внутренних органов были проведены гистологические исследования органов (печень, почки, селезенка и сердце), с которыми связывают активность RCA как в организме хозяина, так и в случае его трансгенной природы. Сравнительный анализ не выявил каких-либо значительных изменений в общей архитектонике данных органов у трансгенных кроликов и их аналогов. Анализ морфометрических показателей изучаемых органов также не вьивил существенных различий между экспериментальными группами. Трансгенные животные по размеру клеток и величине структурных единиц исследованных органов практически не отличались от аналогичных показателей контрольной группы.

3.4. Разработка технологии создания трансгенной птицы.

3.4.1. Эффективность трансформации эмбриональных клеток кур ретровирусными векторами в культуре in vitro

С целью оценки тропности используемых ретровирусных генных конструкций был проведен ряд экспериментов по переносу экзогенной ДНК в эмбриональные клетки кур в культуре in vitro. Частота генетической трансформации клеток-мишеней варьировала в зависимости от типа используемого подготовки генной конструкции. Максимальное число генетически трансформированных клонов было получено при совместном культивировании клеток-мишеней с клетками-упаковщицами: было получено от 3 до 5 трансформированных клонов, экспрессирующих репортерные гены lacZ и GFP, на каждые 1000 клеток. При использовании в качестве источника генных конструкций среды культивирования клеток-упаковщиц, эффективность генетической трансформации клеток-мишеней была ниже

более чем в 3 раза и составила от 0,9-1 трансформированных клонов на каждые 1000 клеток.

3.4.2. Создание трансгенных кур и изучение факторов, влияющих на результативность трансгенеза эмбрионов кур in vivo

С целью повышения эффективности трансгенеза было изучено влияние рада факторов, в частности (1) метода и стадии введения рекомбинантных векторов, (2) концентрации генных конструкций и способа их подготовки для инъекции.

• Метод и стадия введения рекомбинантных векторов в эмбрионы кур. Введение рекомбинантных векторов в эмбрионы кур осуществляли на разных стадиях эмбриогенеза: до инкубации яиц вблизи зародышевого диска (п=70), на первый день инкубации непосредственно в эмбрион (л~66) и на третий день инкубации в дорсальную аорту (п=70). В качестве источника генных конструкций использовали культуральную жидкость.

Максимальная частота интеграции трансгена (процент трансгенных эмбрионов от общего числа развившихся эмбрионов) была установлена при проведении генноинженерных манипуляций с эмбрионами на более поздних стадиях развития (1- и 3-й дни инкубации) - 70-75%, что было почти в 2 раза выше по сравнению с введением векторов в зародышевый диск яиц до инкубации. Общая эффективность трансгенеза (процент полученных трансгенных цыплят от числа проинъецированных эмбрионов) была так же выше при проведении манипуляций на 1- и 3-й дни инкубации и составила 6,7% против 3,3% при введении в зародышевый диск яиц до инкубации.

Введение векторов в эмбрионы кур обуславливало получение трансгенных кур-мозаиков. У 5-дневных эмбрионов экспрессия маркерного гена GFP наблюдалась преимущественно в первичной почке, печени и гонадах. На более поздних стадиях развития эмбриона, а также у трансгенных цыплят экспрессия GFP выявлялась в клетках печени, сердца, желудка, кишечника, мышечной ткани и репродуктивных органах. Трансформация гонад наблюдалась преимущественно при введении генных конструкций в дорсальную аорту эмбрионов на 3-й день инкубации, что можно объяснить миграцией в кровь в данный период эмбриогенеза примордиальных зародышевых клеток, являющихся предшественниками половых клеток. Учитывая этот факт, а также высокую результативность переноса рекомбинантной ДНК в данный период эмбриогенеза, введение генных конструкций в дальнейших исследованиях проводилось в дорсальную аорту эмбрионов на 3-й день инкубации.

• Концентрация генных конструкций и способ их подготовки для инъекций. Введение векторов в эмбрионы кур осуществляли в дорсальную аорту. В качестве источника генных конструкций использовали концентрированную (в 20 и 100 раз) культуральную жидкость или суспензию клеток-упаковщиц (500, 1000 и 2000 клеток/эмбрион), предварительно блокированных митомицином С. В каждом случае было проинъецировано от 68 до 98 эмбрионов.

Высокая результативность получения трансгенных кур была установлена при использовании в качестве источника генных конструкций клеток-упаковщиц в концентрации 1000 клеток/эмбрион: наличие и экспрессия гена ОБР наблюдались у 20,0% инъецированных эмбрионов при общей эффективности трансгенеза до 8%. При использовании концентрированной культуральной жидкости (в 20 и 100 раз) и клеток-упаковщиц в количестве 500 и 2000 клеток/эмбрион данный показатель составил, соответственно, 3,6, 3,3, 7,5 и 0%.

Базируясь на оптимизированных отдельных элементах технологии получения трансгенных кур, нами была проведена трансформация эмбрионов кур (п=80-100) рекомбинантными векторами рВММ-1ас2 и рЬМ-СРР, содержащими маркерные гены 1ас2 и СРР, соответственно. Частота интеграции составила, соответственно, 69,4 и 67,9%, общая эффективность трансгенеза - 8,0 и 8,7% (табл 7).

Таблица 7

Показатель Опыт Контроль

Генная конструкция рВШИасг рШ-ОБР

Заложено на инкубацию яиц, шт 100 80 40

Введено клеток-упаковщиц: объем, мкл (концентрация, кл./мкл) 1 (1000) 1 (1000)

Развилось эмбрионов, п (%) в т.ч. трансгенных, п 62 (62,0) 43 56 (70,0) 38 36(91,0)

Вылупилось цыплят, п (%) в т.ч. трансгенных, п 12 (12,0) 8 15(18,8) 7 30 (75,0)

Частота интеграции , % 69,4 67,9 -

Эффективность получения трансгенных кур *, % 43,0 47,5 -

Общая эффективность трансгенеза*", % 8,0 8,7 -

Примечание; *отношение числа полученных трансгенных цыплят и эмбрионов к числу развившихся эмбрионов, выраженное в %; **отношение числа полученных трансгенных цыплят и эмбрионов, к числу инъецированных яиц, выраженное в %; ***отношение числа вылупившихся трансгенных цыплят к числу инъецированных яиц, выраженное в %.

Интеграция рекомбинантной ДНК была установлена, преимущественно, в клетках печени, сердца, кишечника, желудка, репродуктивных органах, а также мышечной ткани (рис 5). При этом характер экспрессии рекомбинантных белков в данных органах при использовании двух типов векторов был практически идентичным.

12 3 4 5 6 7 8 9 10

Рис. 5. ПЦР-анализ органов и тканей петуха №2673. 1 - селезенка, 2 - мышцы, 3-легкие, 4 - сердце, 5 - почки, 6 -печень, 7 - кишечник, 8 - семенник, 9 - «-» контроль (ДНК интактной курицы), 10 - «+» контроль (ДНК генной конструкции).

ВЫВОДЫ

1. Разработана технология локального трансгенеза клеток молочной железы сельскохозяйственных животных на основе использования рекомбинантных ретровирусн ых векторов. Установлено, что результативность генетической трансформации клеток-мишеней зависит от (1) метода введения рекомбинангных векторов, (2) способа подготовки конструкций для инъекций (клетки-упаковщицы, культуральная жидкость) и их концентрации, (3) стадии введения векторов в вымя животных и (4) типа пакующей линии клеток. Показано, что оптимальным с точки зрения результативности трансгенеза является введение векторов в молочную железу коров на 4-6 месяцах стельности, коз - на 4-5 месяцах сукозности, свиноматок - на 3-ем месяце супоростности.

2. Получены соматические трансгенные коровы (п=24), козы (п=13) и свиноматки (п=24), продуцирующие с молоком эритропоэтин в концентрации до 138±18, 192±16, 185+35 нг/мл, соответственно, и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор в концентрации до 34+10, 46+7, 25+7 нг/мл, соответственно. Показано, что уровень экспрессии рекомбинантных белков с молоком варьирует в течение лактации и зависит от вида животного, периода лактации, используемой генной конструкции и способа ее подготовки для инъекции. Уровень синтеза рекомбинантных белков в молоко животных в первую треть лактации превышает аналогичные показатели во вторую и последнюю треть лактации в среднем в 2-3 раза.

3. Установлено, что интеграция рекомбинантных генов в геном трансгенных животных (кроликов и свиней) оказывает дестабилизующее влияние на кариотип и модифицирует активность ядрышковых организаторов (ЯОР). У трансгенных животных наблюдается повышение уровня хромосомных аберраций до 38.8% (против 3,1% в контроле) и происходит достоверное увеличение активности ЯОР (у трансгенных свиней) до 2,88+0,12 (р<0,001). С увеличением числа генераций у трансгенных животных отмечается уменьшение частоты аберраций.

4. Показано, что характер наследования чужеродных генов у трансгенных животных (кроликов и свиней) зависит от типа спаривания и происхождения животных. При скрещивании по типу «трансген» х «нетрансген» доля трансгенных потомков составила 28,4-40,0% у свиней и 31,7-36,7% у кроликов, по типу «трансген» х «трансген» - 50,0-62,5% и 50,072,7%, соответственно.

5. Установлено, что интеграция в геном свиней гена соматолиберина оказывает влияние на продуктивные признаки свиней разных генераций. У трансгенных свиней по сравнению с аналогами отмечается тенденция увеличения среднесуточных приростов до 35,7%, которая более заметно проявляется у трансгенных свиней ранних (П и III) генераций. У трансгенных свиней поздних генераций (IX и X), а также при откорме животных до более тяжелых кондиций (150 кг) установлена тенденция увеличения содержания мяса в тушах (+1,5%) и снижения доли сала (-1,9%). Отмечено снижение толщины шпика у трансгенных свиней с увеличением числа генераций.

6. Выявлено изменение гормонального и биохимического статуса трансгенных свиней. У трансгенных животных по сравнению с их негрансгенными аналогами усиливается синтез соматотропина в среднем в 1,5-2 раза, повышается содержание в крови общего белка (до +13,9%), глюкозы (до +39,2%), триглицеридов (до +31,5%), магния (до +11,6%) и снижается уровень хлоридов (до -4,3%).

7. Выявлен ряд морфометрических изменений в структуре органов пищеварительной, сердечнососудистой, выделительной систем организма, мышечной ткани и желез внутренней секреции. У трансгенных животных практически во всех исследованных генерациях по сравнению с контролем наблюдается увеличение толщины печеночных балок до 22,7%. У трансгенных животных поздних генераций (VIII, IX и X) обнаружено уменьшение диаметра ацинусов поджелудочной железы (до 8,8%, р<0,01) и фоллйкулов щитовидной железы (до 21,8%, р<0,001). Установлены изменения ряда морфологических корреляций в организме трансгенных свиней по сравнению с контрольными животными.

8. Показана перспективность использования генов-ингибиторов комплемента генного кластера RCA для генетической модификации животных, в частности кроликов, с целью использования их в клеточной терапии. На модели in vitro показана устойчивость клеток трансгенного происхождения к лизису сывороткой крови человека по сравнению с контрольными культурами. Доказано, что продукты экспрессии чужеродных генов не оказывают влияния на гистоструктуру внутренних органов трансгенных кроликов.

9. Усовершенствована технология получения трансгенных кур, позволяющая получать трансгенную птицу с эффективностью 8,0-8,7%. Установлено влияние на результативность трансформации эмбрионов кур in vivo метода и стадии введения рекомбинантных векторов, концентрации генных конструкций и способа их подготовки для инъекции. Максимальная результативность трансгенеза установлена при введении клеток-упаковщиц (в концентрации 1000 клеток/эмбрион) в дорсальную аорту 3-дневных эмбрионов кур.

10. Установлен мозаичный характер интеграции генных конструкций в эмбрионах кур. Наличие ДНК генной конструкции выявлено,

преимущественно, в клетках сердца, печени, желудка, кишечника, репродуктивных органах, а также мышечной ткани.

11. Показано, что степень влияния рекомбинантных генов на фенотипические особенности трансгенных животных зависит от целей эксперимента. Наибольшие изменения наблюдаются у трансгенных животных с измененными хозяйственно-ценными признаками: отмечены изменения характера обмена веществ, ряда биохимических, физиологических и морфологических показателей. При локальном переносе чужеродной ДНК влияние трансгенов на организм животных является минимальным: экспрессия рекомбинантных белков с молоком соматических трансгенных животных не оказывает заметного влияния на гистоструктуру вымени опытных животных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Лабораториям, занимающимся созданием и изучением трансгенных форм животных, рекомендуем:

1. Для результативного проведения локального трансгенеза вымени сельскохозяйственных животных использовать векторные конструкции на основе модифицированных ретровирусов и осуществлять их введение в паренхиму молочной железы на 4-6 месяцах стельности у коров, 4-5 месяцах сукозности - у коз и 3-й месяц супоросности - у свиней.

2. С целью повышения результативности получения трансгенных кур на основе использования ретровирусных векторов проводить введение генных конструкций в дорсальную аорту эмбрионов на 3-й день инкубации.

3. Использовать гены-ингибиторы комплемента генного кластера RCA для генетической модификации животных с целью их последующего применения в клеточной терапии.

4. Учитывать уровень хромосомных аберраций при отборе трансгенных животных для дальнейшего воспроизводства.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК РФ

1) Титова, В.А. Использование ретровирусных векторных систем для получения рекомбинантных белков в молоке сельскохозяйственных животных / В.А. Титова, H.A. Волкова, H.A. Зиновьева, В.Н. Шатайло, Л.К. Эрнст // Сельскохозяйственная биология - 2002 - № 6 - С. 53-58.

2) Волкова, H.A. Локальная инфекция молочной железы как альтернатива получения сельскохозяйственных животных - продуцентов рекомбинантных белков / H.A. Волкова, Л.А. Волкова // Достижения науки и техники АПК - №10 -2003-С. 11-14.

3) Волкова, H.A. Опосредованный ретровирусами перенос генов как эффективный метод генетической трансформации эмбриональных клеток кур in vitro и получения трансгенной птицы / H.A. Волкова, JI.A. Волкова, Л.К. Эрнст, H.A. Зиновьева // Генетика - №1 - том 42 - 2006 - С.83-88.

4) Волкова, Н.А Изучение факторов, влияющих на эффективность создания соматических трансгенных сельскохозяйственных животных - продуцентов

рекомбинантных белков человека с молоком / H.A. Волкова, Н.А Зиновьева, JI.A. Волкова, JI.K. Эрнст // Биотехнология - 2006 - Ks 4 - С. 36-44.

5) Эрнст, Л.К. Хозяйственно-ценные признаки трансгенных и дитрансгенных свиней / Л.К. Эрнст, H.A. Зиновьева, H.A. Волкова, Й.А. Ралков, Г. Брем // Достижения науки и техники АПК - 2006 - N 12. - С. 34-36

6) Волкова, H.A. Эффективность переноса экзогенной ДНК в клетки эмбрионов кур in vitro и in vivo с использованием ретровирусных векторов / H.A. Волкова, А.О. Тулякова, J1.A. Волкова, H.A. Зиновьева, Л.К. Эрнст, Е.К. Томгорова, Н.С Лоцманова // Доклады РАСХН - 2007 - № 3 - С. 37-39.

7) Волкова, H.A. Цитогенетические профили свиней, трансгенных по генной конструкции соматолиберина человека / H.A. Волкова, Л.А. Волкова, П.М.Кленовицкий, И.В. Гусев, В.А. Багиров, Л.К. Эрнст, H.A. Зиновьева, Г. Брем // Доклады РАСХН - 2007 - №5 - С. 37-39.

8) Волкова, H.A. Фенотипические особенности свиней в период эмбриогенеза при интеграции гена рилизинг-фактора гормона роста человека / H.A. Волкова, И .Я. Шихов, H.A. Зиновьева, Л.А. Волкова, Л.К. Эрнст, Е.К. Томгорова, Г. Брем // Сельскохозяйственная биология - 2007 - № 2 - С. 37-41.

9) Зиновьева, H.A. Влияние интеграции и экспрессии чужеродных генов на стабильность генома трансгенных кроликов в ряде поколений / H.A. Зиновьева, П.М. Кленовицкий, H.A. Волкова, A.B. Доцев, Л.К. Эрнст, Г. Брем // Биотехнология - 2007 - №1 - С.52-57.

10) Эрнст, Л.К. Влияние интеграции гена рилизинг-фактора гормона роста на некоторые хозяйственно-ценные признаки свиней / Л.К. Эрнст, H.A. Зиновьева, H.A. Волкова, Е.Г. Пархоменко, В.Н. Шатайло, Г Брем // Зоотехния - 2007 - №5-С. 2-4.

11) Эрнст, Л.К. Мясные и откормочные качества трансгенных свиней / Л.К. Эрнст, H.A. Зиновьева, В.А. Багиров, H.A. Волкова, Л.А Волкова, Е.Г. Пархоменко, И.А. Ралков // Свиноводство - 2007 - №3 - С. 2-5.

12) Эрнст, Л.К. Цигогенетическая характеристика свиней, трансгенных по гену релизинг-фактора гормона роста человека / Л.К. Эрнст, H.A. Волкова, П.М.Югеновицкий, Н.А.Зиновьева, B.Ä. Багиров, С.С. Данч, Г. Брем И Сельскохозяйственная биология - 2008 - №2 - С 40-47.

Монографии

13) Эрнст, Л.К. Некоторые аспекты использования ретровирусных векторов для переноса чужеродной ДНК in vivo и in vitro / Л.К. Эрнст, H.A. Зиновьева, Н.А.Волкова, В.А. Титова // М.: РАСХН, 2003, 84 с.

Методические рекомендации

14) Волкова, H.A. Методические рекомендации по использованию ретровирусных векторов для доставки ДНК в клетки сельскохозяйственных животных in vitro и in vivo / H.A. Волкова, H.A. Зиновьева, Л.А.Волкова, Л.К.Эрнст // Дубровицы - 2004 - 52 с.

15) Волкова, Л.А. Методические вопросы цигогенетики птицы / Л.А. Волкова, П.В. Ларионова, П М. Кленовицкий, H.A. Волкова, Н.А.Зиновьева // Дубровицы -2004-21с.

Публикации в сборниках научных трудов международных конференций, конгрессов

16) Волкова, H.A. Динамика экспрессии рекомбинантного эритропоэтина в молоке соматических трансгенных животных / Н А. Волкова, Б.С Иолчиев, В.А. Титова, H.A. Зиновьева, Л.К. Эрнст // Материалы международной конференции «ДНК-технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных», Дубровицы, 2001, С.58-61.

17) Титова, В.А Использование ретровирусных векторов для переноса генов в органы-мишени сельскохозяйственных животных / В.А. Титова, H.A. Зиновьева,

H.A. Волкова, И.П. Савченкова, Е.А. Гладырь, Л.К. Эрнст // Материалы международной конференции «ДНК-технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных», Дубровицы, 2001, С.90-93.

18) Волкова, H.A. Ретровирусные векторные системы для получения животных - продуцентов рекомбинантных белков / Н.А Волкова, В.А. Титова, H.A. Зиновьева, И.М. Чабан, Н.В. Костерева, Л.К. Эрнсг // Материалы международной научной конференции «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения», Быково, 2002, С.61-62

19) Волкова, H.A. Уровень и динамика экспрессии рекомбинантного эритропоэтина человека в молочной железе животных / H.A. Волкова, В.А. Титова, Н.В. Соломенцева, H.A. Зиновьева // Материалы международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», Дубровицы, 2002, С. 103-105.

20) Волкова, Н.А Экспрессия рекомбинантного Г-КСФ в молоко соматических трансгенных животных / H.A. Волкова, В.А. Титова, H.A. Зиновьева, Л.К. Эрнст // Материалы международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», Дубровицы, 2002, С. 171-173.

21) Титова, В.А. Влияние различных факторов на уровень экспрессии рекомбинантного белка в молоко соматических трансгенных животных / В.А. Титова, H.A. Волкова, Н.А Зиновьева, Л.К. Эрнст // Материалы международной научной конференции «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения», Быково, 2002, С.59-60.

22) Титова, В.А Использование ретровирусных векторных систем для трансформации клеток молочной железы животных ш vivo / В.А. Титова, H.A. Волкова // Материалы международной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», Дубровицы, 2002, С. 78-83.

23) Волкова, H.A. Иммуногистохимическое определение соматотрошша и соматостатина в гипофизе трансгенных по MT-hGRF хряков / H.A. Волкова, И Я. Шихов, H.A. Зиновьева, В.Н. Шатайдо, Л.К. Эрнст // Материалы международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», Дубровицы, 2003, С.88-90.

24) Волкова, Л.А. Успехи соматического переноса генов в молочную железу сельскохозяйственных животных / Л.А. Волкова, H.A. Волкова, H.A. Зиновьева, Л.К. Эрнст // Материалы международной научно-практической конференции «Прошлое, настоящее и будущее зоотехнической науки», научные труды ВИЖ, 2004, вып. 62, Т. 3, с. 215-220.

25) Волкова, H.A. Некоторые аспекты генетической трансформации эмбриональных клеток кур in vitro и in vivo / H.A. Волкова, Л.А. Волкова, H.A. Зиновьева, Л.К. Эрнст // Материалы третьей международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 2004, С.124-127.

26) Волкова, Н А. Некоторые аспекты генетической трансформации эмбриональных линий кур in vitro и ra vivo в рамках разработки технологии создания трансгенной птицы / H.A. Волкова, Л.А. Волкова, Л.К. Эрнст, Н А. Зиновьева Н Материалы международной научной конференции «Биологические и

медицинские технологии: от научных результатов - к инновационным разработкам», Москва, 2005, С. 122-125.

27) Волкова, Н.А. Использование ретровирусных векторов для генетической трансформации эмбриональных клеток кур / Н.А. Волкова, Л.А. Волкова, Н.А. Зиновьева, Н.С. Лоцманова, А.О. Килыбаева, Л.К. Эрнст // Материалы III международной научно-практической конференции «Современные технологические и селекционные аспекты развития животноводства России», научные труды ВИЖ, 2005, вып. 63, Т. 2, с. С 247-249

28) Volkova, N.A. Retrovirus-mediated gene transfer as a perspective method of the transgenic chicken production / N.A. Volkova, L.A. Volkova, L.K. Ernst, N.A. Zinovieva // Proceedings of II Moscow international congress "Biotechnology: state of the art and prospects of development", 2005, Part 1, p. 239.

29) Zinovieva, N.A. Perspective technologies in transgenic animal production / N.A. Zinovieva, N.A. Volkova, L.A. Volkova, L.K. Ernst // Proceedings of II Moscow international congress "Biotechnology: state of the art and prospects of development", 2005, Parti, p. 247.

30) Волкова, Н.А. Особенности фенотипа эмбрионов свиней, трансгенных по гену релизинг-фактору гормона роста человека / Н.А. Волкова, И.Я. Шихов, Е.К. Томгорова, Н.А. Зиновьева, Л.А. Волкова, Л.К. Эрнст // Материалы международной научной конференции «Перспективы развития животноводства в аридной зоне Казахстана», г. Чимкент, Казахстан, 2005, С. 126-127.

31) Волкова Н.А. Изучение эффективности переноса рекомбинантной ДНК в молочную железу сельскохозяйственных животных с использованием ретровирусных векторов // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения акад. М.Н. Лущихина «Биотехнология в мире животных и растений», 2005, Бишкек, Киргизия, С.171 -174.

32) Волкова, Л.А. Ретровирусный перенос генов как эффективный метод доставки экзогенной ДНК в клетки эмбрионов кур in vitro и in vivo / Л.А. Волкова, Н.А. Волкова, Н.А. Зиновьева, А.О. Килыбаева, Н.С. Лоцманова, Л.К. Эрнст // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения акад. М.Н. Лущихина «Биотехнология в мире животных и растений», 2005, Бишкек, Киргизия, С.157-159.

33) Волкова, Н.А. Гистогенез железистых органов у эмбрионов свиней, трансгенных по гену релизинг-фактора гормона роста человека / Н.А. Волкова, И.Я. Шихов, Е.К. Томгорова, Н.А. Зиновьева, Л.А. Волкова, Л.К. Эрнст // Материалы международной научно-практической конференции «Новые методы генодиагностики и генотерапии: современное состояние и перспективы использования в сохранении генофонда сельскохозяйственных животных», ВИЖ, 2005, С.42-45.

34) Volkova, N.A. Usmg of the retroviral vectors to develop the technology for production of genetically modified chicken / N.A. Volkova, L.A. Volkova, N.A. Zinovieva, L.K. Ernst // Proceedings of the Moscow international conference "Biotechnology and medicine", 2006, p. 71.

35) Волкова, Н.А. Динамика роста трансгенных свиней в эмбриональный и постнатальный периоды развития / Н.А. Волкова, Е.Г. Пархоменко, Л.А. Волкова, Н.А. Зиновьева // Материалы научно-практической конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем современной науки», Чебоксары, 2006, С. 179-180.

36) Пархоменко, Е.Г. Особенности иммунного статуса трансгенных свиней / Е.Г. Пархоменко, H.A. Волкова, H.A. Зиновьева, JI.A. Волкова // Материалы научно-пракгической конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем современной науки», Чебоксары, 2006, С. 217-218.

37) Волкова, H.A. Морфофункциональная характеристика железистых органов трансгенных свиней / H.A. Волкова, И.Я. Шихов, H.A. Зиновьева, JI.A. Волкова, JI.K. Эрнст, Г. Брем // Материалы IV международной конференции «Актуальные проблемы биологии в животноводстве», Боровск, 2006, С. 228-229.

38) Волкова, Л.А. Оптимизация отдельных элементов технологии создания трансгенной птицы / Л.А. Волкова, А.О. Тулякова, H.A. Волкова, H.A. Зиновьева, Л.К. Эрнст // Материалы IV международной конференции «Актуальные проблемы биологии в животноводстве», Боровск, 2006, С. 229-230.

39) Кленовицкий, П.М. Цитогенетическая характеристика свиней, трансгенных по генам каскада гормона роста / П.М. Кленовицкий, H.A. Волкова, Л.А. Волкова, В.А. Багиров, H.A. Зиновьева, Л.К. Эрнст, Г. Брем // Материалы VI международной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», Дубровицы, 2006, С. 79-82.

40) Волкова, H.A. Эффективность использования ретровирусных векторов для трансформации эмбриональных клеток кур in vivo / H.A. Волкова, Л.А. Волкова, А.О. Тулякова, H.A. Зиновьева, Л.К. Эрнст // Материалы VI международной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», Дубровицы, 2006, С.52-53.

41) Волкова, H.A. Эффективность создания трансгенных кур методом опосредованного ретровирусами переноса генов / H.A. Волкова, Е.К. Томгорова, Л.А. Волкова, H.A. Зиновьева, Л.К. Эрнст // Материалы IV международной конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования, образование», Санкт-Петербург, 2007, с. 176-177.

Патенты

42) Волкова, H.A. Способ введения ретровирусных векторов в клетки бластодермы при получении трансгенных кур / H.A. Волкова, Л.А. Волкова, H.A. Зиновьева, Л.К. Эрнст // Патент РФ, RU 2303068 С1.

Другие издания

43) Волкова, H.A. Иммуноферментный анализ определения концентрации рекомбинантного эритропоэтина в молоке сельскохозяйственных животных / H.A. Волкова, В.А. Титова // Школа-практикум: «Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных», Дубровицы, 2002, С. 12-17.

44) Волкова, H.A. Иммуногистохимическое определение рекомбинантных белков в тканях трансгенных животных // Школа-практикум: «Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных», Дубровицы, Выпуск 2, 2003, с: 7-31.

45) Волкова, H.A. Получение трансгенной птицы методом опосредованного ретровирусами переноса генов / H.A. Волкова, Л.А. Волкова // Школа-практикум «Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных», Дубровицы, выпуск 4, 2005, с. 7-10.

Издательство РУЦ ЭБТЖ 142132, Московская обл.. Подольский р-н, п. Дубровицы Тел. (8 - 27) 65-14-24, (8 - 27) 65-14-07

Слано в набор 25.09.2008. Подписано в печать 26.09.2008 Заказ №11. Печ. л. 2,0 Тираж 100 экз.

Отпечатано в типографии РУЭЦ

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Волкова, Наталья Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Методы трансгенеза в животноводстве.

1.1.1. Микроинъекция ДНК в пронуклеус зигот.

1.1.2. Использование ретровирусных векторов.

1.1.3. Липосомы как переносчики ДНК.

1.1.4. Трансфекция эмбриональных стволовых клеток и получение трансгенных химер.

1.1.5. Пересадка ядер из трансфецированных соматических клеток.

1.1.6. Использование сперматозоидов в качестве переносчиков чужеродной ДНК.

1.2. Применение трансгенных животных.

1.2.1. Трансгенные животные с измененными хозяйственно- 36 ценными признаками.

1.2.2. Трансгенные животные - биореакторы.

1.2.2.1. Преимущества использование трансгенных животных для производства рекомбинантных белков.;.

1.2.2.2. Продукция рекомбинантных белков в молоко трансгенных животных.

1.2.2.3. Использование вирусных векторов для получения трансгенных животных.

1.2.3. Трансгенные животные, генетически устойчивые к инфекционным заболеваниям.

1.2.4. Трансгенные животные как доноры внутренних органов.

1.2.4.1. Проблемы при ксенотрансплантации.

1.2.4.2. Экспериментальные наработки в ксенотрансплантации.

1.2.4.3. Создание генетически модифицированных доноров.

1.2.4.4. Исследования в области ксенотрансплантации.

1.3. Особенности трансгенеза сельскохозяйственной птицы.

1.3.1. Микроинъекция ДНК в цитоплазму зиготы.

1.3.2. Использование вирусных векторов для переноса экзогенной 72 ДНК в эмбриональные клетки и органы птицы.

1.3.3. Использование эмбриональных стволовых клеток.

1.3.4. Использование примордиальных зародышевых клеток (ПЗК) для получения трансгенной птицы.

1.3.5. Осеменение самок трансформированными спермиями.

1.4. Влияние интегрированных рекомбинантных генов на генотип и фенотип трансгенных животных.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фенотипический эффект экспрессии рекомбинантных генов в организме трансгенных животных"

Актуальность темы. Успехи в технологии получения рекомбинантных ДНК открыли возможность создания новых генотипов путем введения, удаления или изменения генома животного уже в первом поколении. Значительный прогресс, достигнутый в этой области, связан прежде всего с разработкой новых более эффективных способов получения трансгенных организмов и созданием качественно новых генных конструкций, обеспечивающих более высокие уровни экспрессии трансгенов в организме животных. Однако, несмотря на достигнутые успехи, при получении трансгенных животных все еще остается проблема, связанная с не прогнозируемостью физиологических последствий реализации внесённой генетической информации.

Данные последствия являются с одной стороны результатом изменений на уровне генотипа, обусловленных дестабилизацией генома трансгенных животных [Кленовицкий и др., 1998, Медведев, 1992, Brem., 1993, Constantini et ah, 1989, Gasaryan et ah, 1987]. С другой стороны нарушения в функционирование отдельных систем организма могут быть связаны с дополнительной экспрессией экзогенного белка, изменяющего характер и уровень^ синтеза эндогенных белков. Последнее является наиболее актуальным при получении трансгенных животных с измененными хозяйственно-полезными признаками и продуцентов рекомбинантных белков фармакологического назначения. Причем в первом случае степень влияния интеграции чужеродных генов на функциональное состояние отдельных систем и организма в целом бывает высокой. Так, при введении генов, кодирующих белки каскада гормона роста (гормон роста, рилизинг фактор гормона роста, инсулиноподобный фактор гормон роста) у трансгенных животных наряду с положительным эффектом, выражающимся в улучшении мясных и товарных качеств получаемых мясопродуктов, наблюдается и негативное влияние экспрессии экзогенных белков на характер и уровень синтеза эндогенных белков организма. Результатом данного влияния являются различные отклонения в развитии животного

Pursel et ah, 1988; Murray et ah, 1989, Nancarrow et ah, 1991; Rexroad et ah, 1990].

При получении трансгенных животных - продуцентов рекомбинантных белков следует ожидать меньшего влияния интеграции чужеродного гена на физиологические показатели организма, так как направленная экспрессия ре-комбинантного продукта носит, как правило, локальный характер, в связи с чем не оказывает существенного влияния на организм животного. Однако данный факт является исключением в случае высокого уровня синтеза экзогенного белка или неспецифической его экспрессии в других органах и тканях.

Таким образом, экспрессия экзогенных белков в организме трансгенных животных может в различной степени влиять на функциональное состояние отдельных систем организма и проявляться на различных уровнях организации индивидуумов (генетическом, цитологическом, тканевом, организмен-ном). И если влияние чужеродных генов на организм трансгенных животных достаточно полно изучено на макроуровне (организм в целом), то исследований на цитологическом и тканевом уровнях (микроуровне) проводится мало. Хотя именно последнее в некоторых случаях может дать полный ответ на ряд вопросов, касающихся взаимодействия вырабатываемых в организме трансгенных животных рекомбинантных белков с собственными (эндогенными) белками организма и объяснить вызванные данным взаимодействием нарушения в нормальном развитии животного.

В связи с этим, с точки зрения оценки влияния интеграции чужеродного гена на состояние здоровья трансгенных животных необходимо наряду с анализом генотипа проводить комплексные исследования данных животных по фенотипическим признакам, затрагивая оценку экспрессии вырабатываемого рекомбинантного продукта на уровне ткани и клетки.

Цель и задачи

Исходя из вышеизложенного, целью диссертационной работы являлось изучение фенотипического эффекта экспрессии рекомбинантных генов в организме трансгенных животных разных форм на различных уровнях организации индивидуумов: организменном, тканевом и клеточном.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать технологию получения соматических трансгенных сельскохозяйственных животных (коров, коз, свиней) посредством использования ретровирусных векторов.

4. Исследовать изменения биохимического статуса, морфофункцио-нальных характеристик внутренних органов и тканей, динамики роста, показателей откормочной и мясной продуктивности у трансгенных свиней по сравнению с аналогами. Выполнить анализ корреляционных зависимостей в организме трансгенных и интактных свиней.

7. Изучить характер интеграции и экспрессии рекомбинантных генов в органах и тканях трансгенных кур.

Научная новизна

В ходе выполнения диссертационной работы впервые исследованы механизмы создания соматических трансгенных животных (коров, коз, свиней) методом локального трансгенеза и изучены факторы, обуславливающие результативность генетической трансформации клеток молочной железы in vivo. Выполнено исследование уровня синтеза рекомбинантных белков - гра-нулоцитарного колониестимулирующего фактора (ГКСФ) и эритропоэтина человека (ЭПО) в молоко полученных трансгенных животных в динамике и оценены изменения морфофункциональных характеристик ткани молочной железы опытных животных под воздействием экспрессии трансгенов.

Впервые выполнена комплексная оценка влияния интеграции и экспрессии трансгена на генотип и фенотип свиней, трансгенных по гену соматоли-берина человека в ряде генераций в сравнительном аспекте. Изучен характер изменения корреляционных связей в организме опытных животных.

Изучена возможность использования генных конструкций на основе искусственных хромосом дрожжей (YAC) для получения трансгенных кроликов, интегрировавших гены-ингибиторы комплемента кластера RCA, как моделей для ксенотрансплантации. Проведена оценка влияния интеграции больших фрагментов ДНК (700 тысяч пар оснований) на сохранение стабильности генома трансгенных животных. Исследована экспрессия генов кластера RCA в организме трансгенных кроликов и изучены особенности их фенотипа.

Практическая значимость

Разработана технология локального трансгенеза молочной железы сельскохозяйственных животных - коров, коз и свиней с целью создания соматических трансгенных животных - биореакторов. Установлены факторы, обуславливающие результативность генетической трансформации клеток вымени сельскохозяйственных животных in vivo. Получены соматические трансгенные коровы, козы и свиноматки, продуцирующие с молоком грану-лоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) и эритропоэтин (ЭПО) человека.

Изучены биологические и некоторые продуктивные особенности свиней, трансгенных по гену соматолиберина человека, в сравнительном аспекте в ряде поколений. Выявлены изменения показателей биохимического статуса и морфофункциональных характеристик внутренних органов.' Установлено изменение характера корреляционных связей в организме трансгенных свиней.

Изучены биологические особенности кроликов, трансгенных по генам-ингибиторам комплемента кластера RCA. Установлено, что интеграция больших фрагментов ДНК (длиной 700 тысяч п.о.) на основе YAC не оказывает существенного влияния на жизнеспособность трансгенных кроликов, что позволяет рассматривать этих животных в качестве функциональной модели для изучения проблем ксенотрансплантации. Показана повышенная устойчивость клеток трансгенных кроликов к лизису сывороткой крови человека, что указывает на потенциальную значимость генов-ингибиторов комплемента кластера RCA в разработке технологий клеточной терапии.

Усовершенствована технология получения трансгенных кур, основанная на использовании ретровирусных векторов. Разработан способ введения рет-ровирусных векторов в эмбрионы кур in vivo. Установлены факторы, влияющие на результативность генетической модификации эмбрионов кур. Получена трансгенная птица с интеграцией и экспрессией репортерных генов lacZ и GFP (зеленый флюоресцирующий белок) в ряде внутренних органов: сердце, печени, кишечнике, желудке, мышцах, репродуктивных органах.

Основные положения, выносимые на защиту

• Изменения биохимического статуса, морфофункциональных характеристик внутренних органов и некоторых продуктивных показателей у свиней, трансгенных по гену соматолиберина, разных генераций.

• Динамика уровня хромосомных нарушений у трансгенных животных - свиней и кроликов в ряде генераций.

• Усовершенствованная технология создания трансгенных кур и факторы, обуславливающие ее результативность.

• Сравнительный анализ проявления интеграции и экспрессии реком-бинантных генов в фенотипе трансгенных сельскохозяйственных животных различных форм.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на международных конференциях: «ДНК-технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных», Дубровицы, 2001; «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения», Быково, 2002; «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», Дубровицы, 2002, 2003, 2006; «Прошлое, настоящее и будущее зоотехнической науки», Дубровицы, 2004, 2005; «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 2004; «Биологические и медицинские технологии: от научных результатов - к инновационным разработкам», Москва, 2005; «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2005, 2006; «Новые методы генодиагностики и генотерапии: современное состояние и перспективы использования в сохранении генофонда сельскохозяйственных животных», Дубровицы, 2005; «Актуальные проблемы биологии в животноводстве», Боровск, 2006; «Биотехнология в мире животных и растений», Бишкек, 2005; «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования, образование», Санкт-Петербург, 2007.

Публикация результатов исследований.

По материалам диссертации опубликовано 45 научных работ, в том числе в центральных научных журналах, рекомендованных ВАК - 12, книг - 1, методических рекомендаций - 2, патентов - 1.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 324 страницах, содержит 69 таблиц, 35 рисунков, 17 графиков, 10 схем. Библиографический список содержит 407 источников, в том числе 366 на иностранных языках.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Волкова, Наталья Александровна

4. ВЫВОДЫ

1. Разработана технология локального трансгенеза клеток молочной железы сельскохозяйственных животных на основе использования рекомби-нантных ретровирусных векторов. Установлено, что результативность генетической трансформации клеток-мишеней зависит от (1) метода введения рекомбинантных векторов, (2) способа подготовки конструкций для инъекций (клетки-упаковщицы, культуральная жидкость) и их концентрации, (3) стадии введения векторов в вымя животных и (4) типа пакующей линии клеток. Показано, что оптимальным с точки зрения результативности трансгенеза является введение векторов в молочную железу коров на 4-6 месяцах стельности, коз - на 4-5 месяцах сукозности, свиноматок - на 3-ем месяце супоростности.

2. Получены соматические трансгенные коровы (п=24), козы (п=14) и свиноматки (п=24), продуцирующие с молоком эритропоэтин в концентрации до 138+18, 192+16, 185+35 нг/мл, соответственно, и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор в концентрации до 34+10, 46+7, 25+7 нг/мл, соответственно. Показано, что уровень экспрессии рекомбинантных белков с молоком варьирует в течение лактации и зависит от вида животного, периода лактации, используемой генной конструкции и способа ее подготовки для инъекции. Уровень синтеза рекомбинантных белков в молоко животных в первую треть лактации превышает аналогичные показатели во вторую и последнюю треть лактации в среднем в 2-3 раза.

3. Установлено, что интеграция рекомбинантных генов в геном трансгенных животных (кроликов и свиней) оказывает дестабилизующее влияние на кариотип и модифицирует активность ядрышковых организаторов (ЯОР). У трансгенных животных наблюдается повышение уровня хромосомных аберраций до 38,8% (против 3,1% в контроле) и происходит достоверное увеличение активности ЯОР (у трансгенных свиней) до 2,88+0,12 (Р<0,001). С увеличением числа генераций у трансгенных животных отмечается уменьшение частоты аберраций.

5. Установлено, что интеграция в геном свиней гена соматолиберина оказывает влияние на продуктивные признаки свиней разных генераций. У трансгенных свиней по сравнению с аналогами отмечается тенденция увеличения среднесуточных приростов до 35,7%), которая более заметно проявляется у трансгенных свиней ранних (II и III) генераций. У трансгенных свиней поздних генераций (IX и X), а также при откорме животных до более тяжелых кондиций (150 кг) установлена тенденция увеличения содержания мяса в тушах (+1,5%) и снижения доли сала (-1,9%). Отмечено снижение толщины шпика у трансгенных свиней с увеличением числа генераций.

6. Выявлено изменение гормонального и биохимического статуса трансгенных свиней. У трансгенных животных по сравнению с аналогами практически всех исследованных генераций усиливается синтез соматотро-пина в среднем в 1,5-2 раза, повышается содержание в крови общего белка (до +13,9%)), глюкозы (до +39,2%), триглицеридов (до +31,5%), магния (до + 11,6%) и снижается уровень хлоридов (до -4,3%).

7. Выявлен ряд морфометрических изменений в структуре органов пищеварительной, сердечнососудистой, выделительной систем организма, мышечной ткани и желез внутренней секреции. У трансгенных животных практически всех исследованных генераций по сравнению с контролем наблюдается увеличение толщины печеночных балок до 22,7%. У трансгенных животных поздних генераций (VIII, IX и X) обнаружено уменьшение диаметра ацинусов поджелудочной железы (до 8,8%, Р<0,01) и фолликулов щитовидной железы (до 21,8%, Р<0,001). Установлены изменения ряда морфологических корреляций в организме трансгенных свиней по сравнению с контрольными животными.

10. Установлен мозаичный характер интеграции генных конструкций в эмбрионах кур. Наличие ДНК генной конструкции выявлено, преимущественно, в клетках сердца, печени, желудка, кишечника, репродуктивных органах, а также мышечной ткани.

11. Показано, что степень влияния рекомбинантных генов на фенотипи-ческие особенности трансгенных животных зависит от целей эксперимента. Наибольшие изменения наблюдаются у трансгенных животных с измененными хозяйственно-полезными признаками: отмечены изменения характера обмена веществ, ряда биохимических, физиологических и морфологических показателей. При локальном переносе чужеродной ДНК влияние трансгенов на организм животных является минимальным: экспрессия рекомбинантных белков с молоком соматических трансгенных животных не оказывает заметного влияния на гистоструктуру вымени опытных животных.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Лабораториям, занимающимся созданием и изучением трансгенных форм животных, рекомендуем:

1. Для результативного проведения локального трансгенеза вымени сельскохозяйственных животных использовать векторные конструкции на основе модифицированных ретровирусов и осуществлять их введение в паренхиму молочной железы на 4-6 месяцы стельности у коров, 4-5 месяцы су-козности - у коз и 3-й месяц супоросности - у свиней.

1.5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в последние годы достигнуты значительные успехи в технологии получения трансгенных животных: разработано множество методов направленного переноса генов в клетки животных, изучены механизмы интеграции, экспрессии и наследования введенных генов. Вместе с тем, методы генетической трансформации клеток животных, успешно применяемые на лабораторных животных, не всегда бывают такими же эффективными при получении трансгенных сельскохозяйственных животных. Все это требует разработки методологических подходов к проблеме создания генных конструкций и усовершенствования методов их введения, что позволит наряду с повышением общей эффективности трансгенеза у сельскохозяйственных животных снизить негативное влияние интегрированных рекомбинантных генов на жизнеспособность и здоровье получаемых трансгенных животных.

В настоящее время выделяют несколько направлений в использовании трансгенных животных. Все более востребованным становится получение трансгенных животных, в том числе и птицы, продуцирующих рекомбинант-ные белки фармакологического назначения. Такие животные рассматриваются как альтернатива традиционным методам получения рекомбинантных белков человека, характеризующихся более высокими материальными затратами. К тому же не все белки человека могут быть синтезированы в микроорганизмах. С развитием методов генной инженерии, направленных на создание эффективных генных конструкций и методов их введения, станет возможным преобразовать животноводство в стабильный источник производства широкого спектра веществ, обладающих фармакологическими и иными полезными свойствами.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Материалы

2.1.1. Реактивы и оборудование Реактивы

Агароза (Lift Tehnologies, США) Антибиотик-антимикотик (Sigma, США) Бромид димидия (Boehringer, Германия) Бычий сывороточный альбумин (Sigma, США) Генетицин (ПанЭко, Россия) Гидроксид натрия (Merk, Германия) Глюкоза (ПанЭко, Россия) L-глутамин (ПанЭко, Россия) Двузамещенный фосфат натрия (Диа-М, Россия) Изоамиловый спирт (Merk, Германия) Лимонная кислота (Диа-М, Россия) Митомицин С (Sigma, США) О-фенилендиамин (Sigma, США) Протеиназа К (Диа-М, Россия) Раствор гентамицина сульфат (ПанЭко, Россия) Соляная кислота (Merk, Германия) Среда DMEM (ПанЭко, Россия) Среда F-12 (ПанЭко, Россия) Сульфат аммония (Merk, Германия)

Рис. 10. Схема исследований.

Сыворотка плода крупного рогатого скота (ПанЭко, Россия)

Tag- полимераза (Диалат, Россия)

Твин-20 (Диа-М, Россия)

Трипсин (Sigma, США)

Фосфатно-солевой буфер (Sigma, США)

Уксусная кислота (Merk, Германия)

Хлорид натрия (Merk, Германия)

Хлорид магния (Merk, Германия)

Хлороформ (Merk, Германия)

Оборудование

Автоклав (Harvard/LTE, Великобритания) Амплификатор «Amply 4L-50» (Biokom, Россия) Амплификатор «Cyclotemp» (СМТ, Россия) Водяная баня (Bio-Rad, США) Деионизатор воды (Elgastat UHQ, Англия) Дистиллятор АЦД-4 (Россия)

Источник ультрафиолетового света (Pharmacia Biotech, Швеция) Ламинарный шкаф (БОВ-001-АМС, Россия) Магнитная мешалка «Magnetic stirrer» (Польша) Микроскоп (Opton, ICM, Германия; Diaphot, Nikon, Япония) Микротом ротационный (TermoShandon, Великобритания) Микроцентрифуга (Eppendorf, США) Перистальтический насос Walson-Marlow (США), Пластиковые криопробирки (Nunk, Дания)

Прибор для горизонтального электрофореза (Life Technologies, США) Рефрижератор «Ultra low» (Sanio, Япония) С02-инкубатор (Sanyo, Япония) Сосуд Дьюара (Франция)

Спектрофотометр «DYNATECH MR5000» (Life Technologies, США)

Сухожаровой шкаф «КВС G-65/250» (Польша) Термостат (Bio-Rad, США) Термостат ТС-80М-2 (Россия)

Фильтры GS Millipore с диаметром пор 0,22 мкм (Sigma, CUTA) Центрифуга «Janetzki» (ГДР), «Precyzyjna» (Польша) Центрифужные пробирки объемом 15 и 50 мл (Corning, Германия) Цифровой фотоаппарат «Olympus Camedia С-4000 700М» (Корея) Чашки Петри d=35 и 60 мм (Corning, США) Электронные весы R 200D (Sartorius, Германия)

2.1.2. Животные

Объектом исследований служили различные трансгенные формы сельскохозяйственных животных:

1. Свиньи, трансгенные по гену соматолиберина (генная конструкция MTl-hGRF). Исследования проводили на свиньях II, III, IV, VIII, IX и X генераций. Животные II генерации были восстановлены посредством внутриутробного осеменения нетрансгенных маток глубоко замороженным семенем трансгенных хряков, хранившимся в криобанке более 10 лет [Багиров В.А., 2004]. Возобновление поколений трансгенных свиней позволило провести сравнительные исследования свиней генераций II — VIII, III — IX и IV — X.

3. Куры, трансгенные по генам LacZ и GFP, полученные методом опосредованного ретровирусами переноса генов. Для трансформации эмбрионов кур (п=780) использовали два ретровирусных вектора pBMN-lacZ и pLN-GFP, содержащих, соответственно, репортерные гены lacZ и GFP под контролем промотора цитомегаловируса человека (CMV). В качестве источника генных конструкций использовали клетки-упаковщицы и рекомбинантный вирусный препарат, представляющий собой среду культивирования клеток-упаковщиц [Новое в клонировании ДНК, 1989].

4. Соматические трансгенные коровы, козы и свиноматки, продуцирующие с молоком эритропоэтин (ЭПО) и гранулоцитарный колониестимули-рующий фактор (Г-КСФ) человека. Животные были получены методом локального трансгенеза молочной железы с использованием технологии, усовершенствованной в ходе выполнения диссертационной работы. Для трансгенеза были использованы векторные конструкции pLN-a, содержащая ген ЭПО человека (ген предоставлен д.б.н., профессором Рябых В.П., ВНИИФ-БиП, г. Боровск), и pLN-G-CSF, содержащая ген Г-КСФ человека. Конструкции были получены к.б.н. Фоминым И.К. (Институт цитологии и генетики HAH Беларуси) на основе вектора pLNS путем встраивания в прямой ориентации в сайт Xho I под контролем промотора а51-казеина крупного рогатого скота генов ЭПО (вектор pLN-a) и Г-КСФ (вектор pLN-G-CSF) человека (рис. 11).

Xhol

ЕР рА pLNS pLNa pLN-G-CSF

LTR Н4 NEO LTR

600 900 / '"BOG--. / 1400 . 420 as i -казеин/эритро поэтин asi-казеин/Г-КСФ

Рис. 11. Схема строения вектора pLNS: LTR - длинный концевой повтор, - сигнал упаковки, Н4 - промотор гистона человека, NEO - ген устойчивости к неомицину, ЕР - делеция в области промотора-энхансера, рА - сигнал полиадени-лирования.

Для упаковки ретровирусных векторов в вирусные частицы были использованы две пакующие линии клеток GP+envAml2 и pg!3. Обе пакующие линии были получены на основе эмбриональных фибробластов мыши N1H3T3, в которые последовательно были встроены вирус-кодирующие последовательности gag, pol и env. Линия GP+envAml2 содержала белок env амфотропного вируса лейкемии мышей Молони (MLV), который способен взаимодействовать с рецепторами, присутствующими на клетках многих видов - от птиц до человека. Линия pgJ3 экспрессировала белок env вируса лейкемии гиббона (GaLV), который также проявляет тропизм к широкому спектру клеток-хозяев за исключением мыши.

2.2. Работа с культурой клеток

2.2.1. Культивирование клеток

Культивирование пакующих линий клеток, продуцирующих рекомби-нантный ретровирус, осуществляли в среде DMEM с добавлением 10% сыворотки плода коров (СПК), 2мМ L-глутамина, D-глюкозы (4-4,5 г/л) и антибиотика (гентамицина) в конечной концентрации 50 мкг/мл. L-глутамин обновляли каждые 14 дней. Пассирование клеток-«упаковщиц» проводили каждые 3-5 суток в соотношении 1:3, 1:5.

Для культивирования первичной культуры клеток молочной железы коровы, свиньи, козы и эмбрионов кур использовали ростовую среду следующего состава: 45% F-12, 45% DMEM, 10% СПК, 2мМ L-глутамин, гентами-цин (50 мкг/мл). В случае культивирования первичных клеток молочной железы в ростовую среду добавляли инсулин в конечной концентрации 3,5мкг/мл. Клетки пассировали каждые 3-5 суток в соотношении 1:3.

Снятие клеток с субстрата проводили с помощью 0,25% раствора трипсина, рН=7,6 (2,5г трипсина, 1г NaCl, 0,37г KCl, 0,15г Na2HP04) 0,24г КН2РО4, 1г D-глюкозы, Зг Tris, 1 мл фенолового красного растворяли в 1л деионизированной воды). Клетки после удаления ростовой среды промывали

94- 94

ФСБ без ионов Ca , Mg и инкубировали при 37°С 3-5 минут в растворе трипсина. Для инактивации трипсина использовали ростовую среду, содержащую сыворотку.

Криоконсервирование клеток осуществляли с использованием криопро-тектора диметилсульфоксида (ДМСО). Клетки в концентрации ЗЛО6 ресус-пензировали в криозащитной среде, включающей 10% ДМСО, 40% СПК, 50% БМЕМ, и замораживали в криопробирках при -70°С. Для длительного хранения клетки через сутки переносили в сосуд Дьюара с жидким азотом (-196°С).

2.2.2. Получение первичной культуры клеток молочной железы

Ткань молочной железы сразу после взятия помещали в физиологический раствор, содержащий гентамицин (100 мкг/мл.). В асептических условиях ткань переносили в чашку Петри и максимально измельчали с помощью ножниц, периодически промывая в физиологическом растворе. После удаления 0,9% раствора ЫаС1 путем низкоскоростного центрифугирования (1

2 Н тыс.об/мин) измельченную ткань помещали в раствор ФСБ без ионов Са , М£2+, хорошо пипетировали и центрифугировали при 1 тыс.об/мин в течение 5 мин. Эту процедуру повторяли 3 раза.

Для наиболее полной дезагрегации ткани использовали растворы 0,25% трипсина и коллагеназы. Максимально измельченную ткань инкубировали в растворе трипсина в течение 25-30 минут при 37°С, периодически помешивая, после чего для нейтрализации трипсина добавляли свежую ростовую среду, содержащую сыворотку, и центрифугировали при 1 тыс.об/мин. в течение 5 мин. К осадку добавляли свежую ростовую среду, хорошо пипетировали и высевали на чашки Петри (1=6см.

К оставшимся крупным кусочкам ткани приливали раствор коллагеназы (конечная концентрация 1мк1ткл) и выдерживали в течение 30 минут в термостате (+37°С), периодически помешивая. Среду, содержащую коллагеназу, удаляли путем низкоскоростного центрифугирования (1000 об/мин) в течение 5 минут. Осадок ресуспензировали в свежей ростовой среде и высевали на чашки Петри d=6cM.

2.2.3. Получение первичной культуры клеток эмбриона курицы

Извлечение эмбрионов кур из яиц осуществляли на 5-8 дни инкубации в асептических условиях. Эмбрион помещали в физиологический раствор, измельчали и центрифугировали при 1 тыс.об/мин в течение 5 минут. Осадок дополнительно промывали в растворе ФСБ без ионов Са2+, Mg2+, после чего измельченную ткань инкубировали в 0,25% растворе трипсина в течение 5-7 минут при 37 С, периодически помешивая. По истечению периода инкубации с целью инактивации трипсина добавляли свежую ростовую среду с сывороткой, хорошо пипетировали и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 минут. Осадок ресуспензировали в свежей ростовой среде и высевали на чашки Петри d=6cM.

2.2.4. Трансформация клеток-мишеней in vitro ретровирусными векторами

Трансформацию клеток молочной железы и эмбрионов кур осуществляли путем совместного культивирования с клетками-«упаковщицами» и инфицирования культуральной жидкостью, содержащей рекомбинантный рет-ровирус [Новое в клонировании ДНК, 1989]. Частоту генетической трансформации определяли как отношение числа полученных генетически трансформированных клонов к общему числу инфицированных клеток.

Совместное культивирование с клетками-«упаковщицами». Клетки, продуцирующие ретровирус, высевали на чашки Петри диаметром 6 см в концентрации 4*105 клеток на чашку. Через сутки для подавления митоза клетки обрабатывали летальной дозой митомицина С (конечная концентрация 30мке4ш) в течении 4 часов, после чего промывали раствором ФСБ без ионов Са2+ и Mg2+ и заливали ростовой средой. На эту же чашку высевали клетки-мишени в концентрации 4*105 и одновременно добавляли полибрен конечная концентрация 8 мкг/кл). Клетки совместно культивировали в течение 2-3 дней до формирования полного монослоя, затем рассевали на чашки Петри (1=1 Осм для получения стабильных генетически трансформированных клонов. В качестве селективной среды использовали ростовую среду, содержащую 0418 (Оепсйст, С1Ьсо). Селекцию клеток проводили на протяжение 15-20 дней с 4-х суточной сменой среды.

Инфицирование культуральной жидкостью, содержащей рекомбинант-ный ретровирус. Клетки-мишени в концентрации 4*105 высевали на чашки Петри диаметром 6 см и культивировали 24 часа до формирования субкон-флуентного монослоя. После удаления ростовой среды клетки заливали 2 мл культуральной жидкости с добавлением полибрена (8 мкг/мл). С целью получения препарата с высоким титром сбор культуральной среды осуществляли на стадии, предшествующей формированию слитного монослоя, т.к. именно в этот период достигается максимальное содержание вируса в среде. При формировании монослоя на 80-90%, клетки помещали в новую ростовую среду и инкубировали 12-24 часа, после чего собирали вирус. Флотирующие клетки и клеточные обломки удаляли центрифугированием при 1000 об/мин. в течение 5 минут.

Инкубацию клеток-мишеней с культуральной жидкостью осуществляли в течение 16 часов при 37°С в присутствии С02. По прошествии времени инкубации среду, содержащую вирус, удаляли и приливали к клеткам свежую ростовую среду, после чего проводили предселективный период (24 часа) до следующего пассирования. Селекцию генетически трансформированных клонов осуществляли также как и при совместном культивировании с клетками-упаковщицами.

2.2.5. Введение ретровирусных векторов в клетки-мишени in vivo

2.2.5.1. Трансформация клеток молочной железы сельскохозяйственных животных

Трансформацию клеток молочной железы осуществляли путем множественной инъекции раствора генных конструкций непосредственно в паренхиму вымени взрослых животных (коров, коз и свиноматок). В качестве источника генных конструкций использовали как суспензию клеток-упаковщиц, так и культуральную жидкость, представляющую собой среду культивирования клеток-упаковщиц. Клетки-упаковщицы перед введением в молочную железу ресуспензировали в физиологическом растворе с высоким содержанием глюкозы (4-4,5 г/л). В полученную суспензию клеток добавляли полибрен в конечной концентрации 8 мкг/мл.

2.2.5.2. Введение генных конструкций в эмбрионы кур

Введение генных конструкций в эмбрионы кур осуществляли на разных стадиях развития эмбриона: до начала инкубации в зародышевый диск, на первый день инкубации непосредственно в эмбрион, на третий день - в дорсальную аорту. Для инъекций использовали как суспензию клеток-упаковщиц, так и культуральную жидкость, содержащую рекомбинантный ретровирус. Для получения инъекционного раствора клеток-упаковщиц, последние ресуспензировали в среде DMEM, содержащей полибрен (8мкг/мл). Культуральную жидкость также вводили с добавлением полибрена (8 мкг/мл), причем наряду с неконцентрированным вирусным препаратом использовали и концентрированный. Концентрирование культуральной среды проводили следующим образом. В суточный супернатант добавляли анион хондроитин сульфат С (CSC) в концентрации 80 мкскл и инкубировали в течение 10 минут при 37°С. Затем вносили катион полибрен (РВ) в той же концентрации и инкубировали еще 10 минут при 37°С. Среду, содержащую CSC и РВ удаляли путем центрифугирования при 10 тыс.об/мин в течение 5 минут. Осадок разводили в ростовой среде в нужной нам концентрации и использовали для работы.

2.3. Анализ на наличие генной конструкции

Выделение ДНК из крови, ткани и соматических клеток молока, осуществляли с использованием солевого и перхлоратного методов [,Зиновьева H.A. и др., 1998].

ПЦР проводили в объёме 20 мкл., применяя следующую инкубационную смесь: х10 буфер для ПЦР (166,7мМ (NH4)2S04; ЮОмМ Трис-HCl, рН=8,3; 1,5мМ MgCl2; 0,1% Tween 20); 0,2мМ dNTP, 25 пкмол каждого из праймеров, 1 ЕД Taq-полимеразы. ДНК для анализа брали в объёме 1,0 мкл. Праймеры, используемые для анализа, представлены в таблице 3.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Волкова, Наталья Александровна, Дубровицы

1. Абдрахманов, И.К. Характеристика линий клеток, упаковывающих рекомбинантные ретровирусные векторы в переносе экзогенной ДНК в клетки млекопитающих/ И.К. Абдрахманов //Автореф. дисс. . канд. биол. наук. - Дубровицы - 2001 - 21с.

2. Балаболкин, М.И. Секреция гормона роста в норме и патологии / М.И. Балаболкин М.: Медицина, 1978. - 173 с.

3. Балаболкин, М.И. Эндокринология / М.И. Балаболкин М.: Медицина, 1989.-416 с.

4. Брем, Г. Генные фермы новый путь производства биологически активных протеинов трансгенными животными / Г. Брем, H.A. Зиновьева, Л.К. Эрнст // Биотехнология - 1993 - №6 - С. 3-27.

5. Брем, Г. Трансгенные свиньи (mMTl- hGRF): оценка качества туш и химического состава мяса при убое животных / Г. Брем, Л.К. Эрнст, Л.А. Андропов // Генноинженерные сельскохозяйственные животные / Сб. науч. тр,-1995.-Вып. 1.- С.26-33.

6. Брем, Г. Экспериментальная генетика в животноводстве / Г.Брем, Х.Кройслих, Г.Штранцингер М.: РАСХН, 1995. - 326с.

7. Галат, В.В. Методы микроинъекции спермиев как инструмент вспомогательной репродукции и изучения биологии оплодотворения / В.В. Галат // Онтогенез 2000 - Т.31 - №1 - С.5-13.

8. Гистология / Под ред. Ю.И. Афанасьева, H.A. Юрина М.: Медицина, 2002. - 695с.

9. Глебов, O.K. Генетическая трансформация соматических клеток / O.K. Глебов-Л.: Наука, 1989-251 с.

10. Глик, Б. Молекулярная биотехнология: принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак. Пер. с англ. М.: Мир, 2002. - 589с.

11. Гольдман, И.Л. Молекулярно-биологические аспекты проблемы позиционно-независимой экспрессии чужеродных генов в клетках трансгепных животных / И.Л. Гольдман, C.B. Разин, Л.К. Эрнст, С.Г. Кадулин, М.А. Гращук // Биотехнология 1994 - N.2 - С.3-8.

12. Дыбан, А.П. Трансгенные млекопитающие: изучение фенотипиче-ских эффектов гена гормона роста человека, индуцированного животным / А.П. Дыбан, С.И. Городецкий // Биотехнология 1987 - N3 - С.352-357.

13. Завада, А.Н. Анализ хромосомной локализации фрагмента вируса лейкоза коров у трансгенных кроликов / А.Н. Завада // Молекулярно-генетические маркеры животных Киев: Аграрная наука, 1994. - С.56-57.

14. Зиновьева, H.A. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве / H.A. Зиновьева,

15. A.Н. Попов, Л.К. Эрнст и др. Дубровицы: ВИЖ, 1998. - 47с.

16. Зиновьева, H.A. Трансгенные животные и возможности их использования: молекулярно-генетические аспекты трансгенеза в животноводстве / H.A. Зиновьева, Л.К. Эрнст, Г. Брем Дубровицы, ВИЖ, 2000. - 128с.

17. Кленовицкий, П.М. Анализ дифференциальной структуры хромосом у кролика, трансгенного по гену mMTI/bGHatt / П.М. Кленовицкий, М.М. Миталлипова, Т.Г. Цветкова // Бюлл. науч. работ ВИЖ.1. B.109. 1994 - С.80-83.

18. Кленовицкий, П.М. Мутационные изменения у трансгенных животных / П.М. Кленовицкий, A.A. Некрасов // Актуальные проблемы развития животноводства Дубровицы - 1998 - С.184-191.

19. Кленовицкий, П.М. Цитогенетика сельскохозяйственных животных / П.М. Кленовицкий, Л.Г. Моисейкина, Н.С. Марзанов Элиста: Джангар, 1999.- 142 с.

20. Кленовицкий, П.М. Ядрышкообразующие районы у трансгенных свиней (гпТ-1/hGRF) / П.М. Кленовицкий, А.Н. Завада, И.К. Живалев // Генноинженерные с.-х. животные. Сб. науч. тр. ВИЖ М. - Вып.1 - 1995 -С.64-68.

21. Кузнецов, A.B. Исследования переноса чужеродных генов сперматозоидами в яйцеклетки мидии Mytilus Galloprovincialis Lam. / A.B. Кузнецов, A.B. Пиркова, Г.А. Дворянчиков и др. // Онтогенез 2001 - Т.32 - №4 -С.309-318.

22. Лашас, JI.B. Соматотропин человека / JI.B. Лашас, Д.Г. Лашене -Вильнюс:Мокслас, 1981.- 143 с.

23. Медведев, С.Ю. Перенос гена рилизинг-фактора гормона роста человека кроликам, овцам и свиньям / С.Ю. Медведев // Автореф. дисс. . канд. биол. наук. С.- П.- Пушкин - 1992 - 17с.

24. Медведев, С.Ю. Рост и развитие трансгенных кроликов и свиней с перенесенным геном рилизинг-фактора гормона роста человека / С.Ю. Медведев, Л.В. Козикова, В.Г. Бавин, А.Ф. Яковлев // Сельскохозяйственная биология,- 1995.- №.6.- С. 43- 48.

25. Микроскопическая техника: Руководство / под ред. Д.С. Саркизова, Ю.П. Перова. М.: Медицина, 1996. - 544 с.

26. Новое в клонировании ДНК. Методы. / Под ред. Д. Гловера. М.: Мир, 1989. - 368с.

27. Прасолов, B.C. Ретровирусные векторы эффективная система переноса и экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитающих / B.C. Прасолов // Молекулярная биология - 1989 - Т.23, вып.2. - С.8-12.

28. Ромейс, Б. Микроскопическая техника / Б. Ромейс. Пер. с нем. В.Я. Александрова, З.И. Кроковой М.: Изд.-во иностр. лит.-ры, 1953. - 718с.

29. Сингер, М. Гены и геномы / М. Сингер, П. Берг. Пер. с англ. М.: Мир, 1998.-391с.

30. Шатайло, В.Н. Биологические и продуктивные качества трансгенных свиней / В.Н. Шатайло, Л.К. Эрнст M: РАСХН, 2001. - 200 с.

31. Шевелуха, B.C. Сельскохозяйственная биотехнология / B.C. Шевелуха, Е.А. Калашникова, C.B. Дегтярев, Е.З. Кочиева, М.И.Прокофьев и др. М.: Высшая школа, 1998. - 416с.

32. Шихов, И .Я. Методические рекомендации по количественному определению нуклеиновых кислот в клетках и тканях сельскохозяйственных животных / И.Я. Шихов, М.П. Хамицеева, A.C. Лепнов и др. Дубровицы -1985 -28с.

33. Щелкунов, С.Н. Генетическая инженерия. 4.2. / С.Н. Щелкунов -Новосибирск: Изд-во Новосиб. ун-та, 1997. 400с.

34. Щит, И.Ю. Негативное действие экзогенной ДНК на оплодотворение / И.Ю. Щит, A.B. Кузнецов, С.А. Каурова, И.В. Кузнецова, В.В. Гусев // Проблемы репродукции 1998 - №4.

35. Эрнст, Л.К. Биотехнология сельскохозяйственных животных / Л.К. Эрнст, H.A. Зиновьева, Г.Брем М.: РАСХН, 2002. - 192с.

36. Эрнст, Л.К. Биотехнология сельскохозяйственных животных / Л.К. Эрнст, М.И. Прокофьев М.: Колос, 1995. - 192с.

37. Эрнст, Л.К. Генная инженерия в животноводстве: трансгенные сельскохозяйственные животные, кормовые растения, микроорганизмы рубца / Л.К. Эрнст, И.Л. Гольдман, С.Г. Кадулин // Биотехнология 1993 -N5 - С.2-14.

38. Эрнст, Л.К. Молекулярно-генетические аспекты в создании и использовании трансгенных сельскохозяйственных животных / Л.К. Эрнст, Н.А. Зиновьева // Вестник РФФИ. 2002. - №3(29). - С.56-65.

39. Aaronson, S.A. Endogenous type-C RNA viruses of mammalian cells / S.A. Aaronson, J.R. Stephenson // Biochim. Biophys. Acta. 1976. - V.458, P.323-354.

40. Adams, D.H. Cardiac xenotransplantation: clinical experience and future direction / D.H. Adams, R.N. Chen, A. Kadner // Ann. Thorac. Surg. 2000. -V.70. - P.320.

41. Ahearn, J.M. Rosengard A.M. Complement receptors // In: The Human Complement System In Health And Disease. Eds: J.E. Volanakis., M.M. Frank. New York: Marcel Dekker. 1998. - P. 167-202.

42. Akiyoshi, D.E. Identification of a full-length cDNA for an endogenous retrovirus of miniature swine / D.E. Akiyoshi, M. Denaro, H. Zhu, J.L. Greenstein, P. Banerjee et al. // J. Virol. 1998. - V.72. - P.4503-4507.

43. Alexander, L.J. Complete nucleotide sequence of bovine p-lactoglobulin gene / L.J. Alexander, G. Hayes, Bawden W., Stewart A.F., Mackinley A.G.// Animal Biotechnology. 1993. -1 - P. 1-10.

44. Ali, S. Characterisation of the gene encoding ovine B-lactoglobulin: mi-larity to the genes for retinol-binding protein and other secretory proteins/ S.Ali, A.J.Clarke // Mol. Biol. 1988.-V. 199. - P. 415-426.

45. Anderson, D.J. The role of complement component C3b and its receptors in sperm-oocyte interaction / D.J. Anderson, A.F. Abbott, R.M. Jack // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993.- V.90. - P.10051-10055.

46. Archibald, A.L. Molekular Biological Approaches and their Possible Aplications, in J.W. Owen and R.F.E. Axford (eds), Breeding for Disease Resistance in Farm Animals / A.L. Archibald // C.A.B. International, UK. 1991. -P.100-122.

47. Archibald, A.L. High-level expression of biologically active human alpha 1-antitrypsin in the milk of transgenic mice / A.L.Archibald, M.McClenaghan, V.Hornsey, J.P. Simons, A.J. Clark // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. -V. 87. -P. 5178-5182.

48. Arezzo, F. Sea urchin sperm as a vector of foreign genetic information / F. Arezzo // Cell Biol. Int. Rep. 1989. - V.13 (4). - P.391-404.

49. Auchincloss, H.J. Xenogeneic transplantation / H.J. Auchincloss, D.H. Sachs // Annu. Rev. Immunol. 1998. - V.16. - P.433-470.

50. Bach, F.H. Barriers to xenotransplantation / F.H. Bach, et al. // Nature Medicine. 1995. - V.l. - P.869-873.

51. Bachiller, D. Liposome-mediated DNA uptake by sperm cells / D. Bachiller, K. Schellander, J. Peli, et al. // Mol. Reprod. Dev. 1991. - V.30 (3). -P. 194-200.

52. Bailey, L. Baboon-to-human cardiac xenotransplantation in a neonate / L. Bailey, S. Nehlsen-Canarella, W. Concepcion, et al. // Journal of the American Medical Association (JAMA). 1985. - V.254. - P.3321-3329.

53. Ballard, L. A polymorphism of the complement regulatory protein MCP (membrane cofactor protein or gp45-70) / L. Ballard, T. Seya, J. Teckman, et al. // J. Immunol. 1987. -V.138. -P.3850-3855.

54. Barash, I. Expression of B-lactoglobulin/human serum albumin fusion genes in transgenic mice: hormonal regulation and in situ localization / I.Barash, A.Faerman, T.Ratovitsky, R.Puzis, M.Nathan et al. // Transgenic Res. 1994. -V.3. - P. 141-151.

55. Barilla-LaBarca, M. Role of Membrane Cofactor Protein (CD46) in Regulation of C4b and C3b Deposited on Cells / M. Barilla-LaBarca, M. Liszewslci, J. Lambris, D. Hourcade, J. Atkinson // The Journal of Immunology. 2002. -V. 168. - P.6298-6304.

56. Barre-Sinoussi, F. Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for aquired immune deficiency syndrome (AIDS) / F. Barre-Sinoussi, J.C. Cherman, F. Rey, M.T. Nugeyre, S. Chamaret et al. // Science. 1983. V.220. -P.868-871.

57. Bawden, W.S. The genes encoding the major milk-specific proteins and their use in transgenic studies and protein engineering / W.S.Bawden, R.J.Passey, A.G. Mackinlay // Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 1994. - V. 12. - P. 89-137.

58. Bayna, E.M. Tissue-specific, high level expression of the rat whey adic protein gene in transgenic mice / E.M.Bayna, J.M. Rosen // Nucl. Acids Res. -1990.-V. 18. P.2977-2985.

59. Berardino, M. Development and chromosomal constitution of nuclear transplants derived from male germ cells / M. Berardino, M. Hoffher // J. of Exper. Zoology. 1976. - V.176( 1). - P.61-72.

60. Berggard, K. Bordetella pertussis binds the human complement regulator C4BP: role of filamentous hemagglutinin / K. Berggard, E. Johnsson, F.R. Mooi, G. Lindahl Infect. Immun. - 1997. - V.65. - P.3638-3643.

61. Bhatti, F. Survival of life-supporting HDAF transgenic kidneys in primates is enhanced by splenectomy / F. Bhatti, A. Zaidi, M. Schmoeckel, E. Cozzi,

62. G. Chavez et al. // Transplant. Proc. 1998. - V.30. - P.2467.

63. Bigam, D. Xenotransplantation / D. Bigam, R. Zhong, G. Levy, D. Grant //Can. J. Surg. 1999.-V.42.-P. 12-16.

64. Blake, J. Beta geo, a combined selection and reporter gene for retroviral and transgenic studies / J. Blake, P.S. Salinas, S.M. Hughes // Biotechnigues. — 1997. V.23(4). - P.690-695.

65. Bora, N.S. Membrane cofactor protein (MCP) of the complement system: a Hind III RFLP that correlates with expression polymorphism / N.S. Bora, T.W. Post, J.P. Atkinson // J. Immunol. 1991. - V. 146. - P.2821 -2825.

66. Borwompinyo, S. Germ-line transmission of a lacZ gene in chickens using an avian Spleen Necrosis Virus-based vector / S. Borwompinyo, D.W. McCoy, P.E. Mozdziak, J.N. Petitte // J. Anim. Sei., 79 (1), 54th Annu. Ree. Meat Conf., Vol. II, Abstr. 174,42.

67. Bosselman, R.A. Germline transmission of exogenous genes in the chicken / R.A. Bosselman, R.Y. Hsu, T. Boggs, S. Hu, J. Bruszewski et al. // Science. 1989. - V.243 (4890). - P.533-535.

68. Braskett, B.G. Uptake of heterologous genome by mammalian spermatozoa and its transfer to ova through fertilization / B.G. Braskett, W. Baranska, W. Sawicki et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. 1971. - V.68. - P.353-357.

69. Brazolot, C.L. Efficient transfection of chicken cells by lipofection, and introduction of transfected blastodermal cells into the embryo / C.L. Brazolot // Mol. Reprod. Dev. 1991.-V.30.-P.304-312

70. Brem, G. Expression synthetic cDNA sequences encoding human insulinlike growth factor-1 (IGF-1) in the lammary gland of transgenic rabbits / G.Brem, P.Hartl, U.Besenfelder, E.Wolf, N.Zinovieva et al. // Gene. 1994. - V. 149. - P. 351-355.

71. Brem, G. Mammary and specific expression of chymosin constructs in transgenic rabbits / G.Brem, U.Besenfelder, N. Zinovieva, S J.eregi, L.Solti et al. // Theriogenology. 1995. - V. 43. - P. 175.

72. Brem, G. Production of foreign proteins in the mammary ands of transgenic mammals / G.Brem, U.Besenfelder, P. Hartl // Chimica Oggi. 1993. - V. 11.-P. 21-25.

73. Brem, G. Production of transgenic mice rabbits and pigs by microinjection into pronuclei / G. Brem, B. Brenig, H.M. Goodman, R.C. Seiden, F. Graf et al. // Zuchthygiene. 1985. - V. 20. - P. 251 - 252.

74. Brinster, R.L. Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation / R.L. Brinster, M.R. Avarbock // Proc. Natl. Acad. Sei. 1994.-V.91.-P.l 1303-11307.

75. Brinster, R.L. No simple solution for making transgenic mice / R.L. Brinster, E.P. Sandgren, R.R. Behringer, A.F. Palmiter 1989. - V.59. - P.239-241.i

76. Buehler, T. Rabbit b-casein promoter directs secretion of human interleu-kin-2 into the milk of transgenic rabbits / T.Buehler, T.Bruyer, D.F.Went, G.Stranzinger, K.Buerki // Theriogenology. 1990. - V. 8. - P. 140-143.

77. Byrne, G.W. Protection of xeno-geneic cardiac endothelium from human complement by ex-pression of CD59 or DAF in transgenic mice / G.W. Byrne, K.R. McCurry, D. Kagan, C. Quinn, M.J. Martin et al. // Transplantation. 1995. -V.60.- P.l 149-1156.

78. Caffin, J.P. Physiological and pathological factors fluencing bovine a-lactalbumin and p-lactoglobulin concentrations in milk / J.P. Caffin, B. Poutrel, P.Rainard // J. Dairy Sei.- 1985.-V. 68. P. 1087-1094.

79. Capecchi, M.R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells / M.R. Capecchi // Cell. 1980. - V.22 (27). -P.9139-9143.

80. Carrington, C.A. Expression of human DAF and MCP on pig endothelial cells protects from human complement / C.A. Carrington, A.C. Richards, E. Cozzi, G. Langford, N. Yannoutsos, D.J. White // Transplantation Proceedings. 1995. -V.27 (1). - P.321.

81. Carsience, R.S. Germline chimeric chickens from dispersed donor blasto-dermal cells and compromised recipient embryos / R.S. Carsience // Development. 1993. - V. 117. - P.669-675.

82. Casasnovas, J.M. Crystal structure of two CD46 domains reveals an extended measles virus-binding surface / J.M. Casasnovas, M. Larvie, T. Stehle // EMBO J. 1999.-V.18.-P.2911-2922.

83. Castro, F.O. Introduction of foreign DNA into the spermatozoa of farm animals / F.O. Castro, et al. // Theriogenology. 1990. - V.34. - P. 1099-1110.

84. Chang, I.K. Germ line chimera produced by transfer of cultured chick primordial germ cells / I.K. Chang, A. Yoshiki, M. Kusakabe, A. Tajima, T. Chi-kamune et al. // Cell Biol Int. 1995. - V.19 (7). - P.569-576.

85. Chapman, L.E. Xenogenic infections and public health / L.E. Chapman // Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 1999. - V.26. -P.1005-1008.

86. Chapman, L.E. Xenotransplantation and xenogeneic infections / L.E. Chapman, T.M. Folks, D.R. Salomon, A.P. Patterson, T.E. Eggerman et al. // New England Journal of Medicine. 1995. - V.333 - P.1498-1501.

87. Chapman, S.C. Ubiquitous GFP expression in transgenic chickens using a lentiviral vector / S.C.Chapman, A.Lawson, W.C. Macarthur, R.J.Wiese, R.H. Loechcl et al. // Development 2005 - V. 132. - P.935-940.

88. Chong, H. Replication-competent retrovirus produced by a 'split-function' third generation amphotropic packaging cell line / H. Chong, R.G. Vile // Gene Ther. 1996. - V.3. - P.624-629.

89. Clark, A.J. Pharmaceuticals from transgenic livestock. / A.J. Clark // Trends Biotechnol. 1987. - V.5. P.20-24.

90. Clark, A.J. Expression of human anti-gemophilic Factor IX in the milk of transgenic sheep / Clark A.J., Bessos H., Bishop J.O., Brown P., Harris S. et al. // BioTechnology. 1989. - V.7. - P.487-492.

91. Clark, A.J. Expression of human anti-hemophilic factor ix in the milk of transgenic sheep / A.J. Clark, H. Bessos, J.O. Bishop et.al. Bio/Tech. - 1989. -V.7. - P.487-492.

92. Clark, A.J. Expression of human antihemophilic factor IX in the milk of transgenic sheep / A.J. Clark // Biotechnology. N 7. - 1989. - P.487-492.

93. Clark, A.J. Gene targeting in livestock: a preview / A.J. Clark, S. Burl, C. Denning, P. Dickinson Transgenic Research. - 2000. - V.9. - P.263-275.

94. Coffin, J.M. Structure and classification of retroviruses. In 'The Retrovi-ridae' (ed. L.A. Levy) / J.M. Coffm // Plenum Press, NY. 1992. - P. 19-49.

95. Cone, R.D. High-efficiency gene transfer into mammalian cells: generation of helper-free recombinant retrovirus with broad mammalian host range / R.D. Cone, R.C. Mulligan // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. - V.81. - P.6349-6353.

96. Constantini, F. Insertional mutations in transgenic mice / F. Constantini, G. Radoce, G. Lee // Progr. Nucl. Acid Res. And Mol. Biol. San Diego. 1989. -V.36. - P.159-169.

97. Cooper D., Lanza R. // In: Xeno: the promise of transplanting animal organs into humans // Oxford Univ. Press. 2000. - P. 180-184.

98. Cosset, F.L. A new avian leukosis virus-based packaging cell line that uses two separate transcomplementing helper genomes / F.L. Cosset // J. Virol. -1990.-V.64.-P. 1070-1078.

99. Cosset, F.L. Packaging cells for avian leukosis virus-based vectors with various host ranges / F.L. Cosset // J. Virol. 1992. - V.66. - P.5671-5676.

100. Cozzi, E. The generation of transgenic pigs as potential organ donors for humans / E. Cozzi, D. White // Nature Medicine. 1995. - V. 1. - P.964-966.

101. Dahlback, B. Protein S and C4b-binding protein: components involved in the regulation of the protein C anticoagulant system / B. Dahlback // Thromb Haemost. -1991.- V.66. P.49-61.

102. Das, R.C. Production of therapeutic proteins from transgenic animals / R.C. Das // BioBusiness. 2001. - Feb. - P.60-62.

103. Davies, A. Policing the membrane: cell surface proteins which regulate complement / A. Davies // Res. Immunol. 1996. - V.147. - P.82-87.

104. De Rooij, D.G. Proliferation and differentiation of spermatogonial stem cells / D.G. De Rooij //Reproduction. 2001. - V. 121. - P.347-354.

105. Deacon, T. Histologic evidence of fetal pig neural cell survival after transplantation into a patient with Parkinson's disease / T. Deacon, J. Schumacher, J. Dinsmore, C. Thomas, P. Palmer et al. // Nature Medicine. 1997. - V.3. -P.350-353.

106. Denman, J. Transgenic expression of a variant of human tissue-type plasminogen activator in goat milk: purification and characterization of the recombinant enzyme / J. Denman // Biotechnology. 1991. - V.9. - P.839-843.

107. Diamond, L. Characterization of transgenic pigs expressing functionally active human CD59 on cardiac endothelium / L. Diamond, K. McCurry, M.J. Martin, S. McLennan, E. Oldham et al. // Transplantation. 1996. - V.61. -P. 1241.

108. Diamond, L.E. Human CD59 expressed in transgenic mouse hearts inhibits the activation of complement / L.E. Diamond, K.R. McCurry, E.R. Oldham, M. Tone, H. Waldmann et al. // Transpl. Immunol. 1995. - V.3. -P.305-312.

109. DiTullio, P. Production of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in the milk of transgenic mice / P. DiTullio, S.H Cheng., J. Marshall, RJ.Gregory, K.M.Ebert et al. // Biotechnology. 1992. - V. 10. - P. 74-77.

110. Dobrovolsky, V.N. Human gamma-interferon expression in the mammary gland of ansgenic mice / V.N.Dobrovolsky, O.V.Lagutin, T.V.Vinogradova, I.S.Frolova, P.Kuznetsov et al.//FEBS Lett. 1993. -V. 319. - P. 181-184.

111. Dolci, S. Combined action of stem cell factor, leukemia inhibitory factor and cAMP on in vitro proliferation of mouse primordial germ cells / S. Dolci, M. Pesce, M. de. Felici // Mol. Reprod. Dev. 1993. - V.35 - P. - 134-139.

112. Donahue, R.E. Helper vims induced T-cell lymphomas in non-human promates after retroviral mediated gene transfer / R.E. Donahue, S.W. Kessler, D. Bodine, K. McDonagh, C. Dunbar et al. // J. Exp. Med. 1992. - V.176. - P.l 1251135.

113. Dorig, R.E. CD46, a primate-specific receptor for measles virus / R.E.

114. Dorig, A. Marcil, C.D. Richardson // Trends Microbiol. 1994. - V.2. - P.312-318.

115. Dym, M. Expression of c-kit receptor and its autophosphorylation in immature rat type A spermatogonia / M. Dym, M.-C. Jia, G. Dirami, J.M. Price // Biology of reproduction. 1995 - V.52. - P.8-19.

116. Ebert, K.M. Porcine growth hormone gene expression from viral promotors in transgenic swine / K.M. Ebert, T.E. Smith, F.C. Buonoma, E.W. Overstrom // Animal Biotechnology. 1990. - V.l. - P. 145-159.

117. Ebert, K.M. Transgenic production of a variant of human tissue-type plasmingen activator in goat milk: generation of transgenic goats and analysis of expression / K.M. Ebert, J.P. Selgrath, P. Ditullo et el. // BioTechnology. N 9. -1991. - P.835-838.

118. Ebert. K.M. Induction of human tissue asminogen activator in the mammary gland of transgenic goats / K.M.Ebert, P.DiTullio, C.A.Barry, J.E.Schindler, S.L.Ayers et al. // Biotechnology. -1994.-V. 12. P. 699-702.

119. Emery, D.W. Development of a condensed locus control region cassette and testing in retrovirus vectors for a gamma-globin / D.W. Emery // Blood Cells Mol Dis. V.24 (3). - 1998. - P.322-339.

120. Erickson, R.P. Minireview: creating animal models of genetic diseases / R.P. Erickson //Amer. J. Hum. Genet. 1988. - V.43. - P.382-386.

121. Ernst, L.K. Transgenic rabbits with antisense RNA gene targeted at adenovirus H.5 / L.K. Ernst, V.I. Zaharchenko, N.M. Suraeva, T.I. Ponomoreva, O.I. Miroshnichenk et al. // Theriogenology. 1991. - V.35. - P. 1257-1271.

122. Evans, M.G. Establishment in culture of plurepotential cells from mouse embryos / M.G. Evans, M. Kaufman //Nature. 1982. - V.292. - P. 154-156.

123. Eyal-Giladi, H. Avian primordial germ cells are of epiblastic origin / H. Eyal-Giladi, M. Ginsburg, A. Farbarov // J Embryol Exp Morphol. 1981. - V.65.- P.139-147.

124. Fabre, J.W. Nudging xenotransplantation towards humans / J.W. Fabre // Nature Medicine 1995. - V.l. -P.403-404.

125. Fearon, D.T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte and monocyte / D.T. Fearon // J. Exp. Med. 1989. - V.l52. - P.20.

126. Fearon, D.T. The CD 19/CR2/TAPA-1 complex of B lymphocytes: linking natural to acquired immunity / D.T. Fearon, R.H. Carter // Annu. Rev. Immunol. 1995. - V.l3. - P. 127-149.

127. Fischer, E. Characterization of the human glomerular C3 receptor as the C3b/C4b complement type one (CR1) receptor / E. Fischer, M. D. Appay, J. Cook, M.D. Kazatchkine // J. Immunol. 1986. - V.l36. - P. 1373.

128. Folch, J.M. Complete sequence of the caprine B-ttoglobulin gene / J.M. Folch, A.Coll, A.Sanchez//J. Dairy Sci. 1994. -V. 77. - P. 3493-3497.

129. Fransolini, M. Evidence for nuclear internalization of exogenous DNA into mammalian sperm cells / M. Fransolini et al. // Mol. Reprod. and Dev. 1993.- V.34. -P.133-139.

130. Fraser, R.A. Efficient incorporation of transfected blastodermal cells into chimeric chicken embryos / R.A. Fraser // Int. J. Dev. Biol. 1993. - V.37. -P.381-385.

131. Gahne, M.B. Electroporation of bovine spermatozoa to carry foreign DNA in oocytes / M.B. Gahne, F. Pothier, M.A. Sirard //Mol. Reprod. Dev. -1991.-V.29.-P.6-15.

132. Galili, U. A unique natural human IgG antibody with anti-alphagalactosyl specificity / U. Galili, E.A. Rachmilewitz, A. Peleg, I. Flechner // J. Exp. Med. 1984. - V. 164. - P. 1519.

133. Gallo, R.C. Frequent detection and isolation of cytophatic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and at risk for AIDS / R.C. Gallo, S.Z. Sala-huddin, M. Popovic, G.M. Shearer, M. Kaplan et al. // Science. 1984. - V.224. -P.500-503.

134. Gandolfi, F. Spermatozoa, DNA binding and transgenic animals / F. Gandolfi // Trasgenic Research. 1998. - V.7. - P.147-155.

135. Gilbert, A.B. Egg albumen and its formation / A.B. Gilbert // Physiology and Biochemistry of the Domestic Fowl (Bell, D.J., Free, B.M. eds), Academic Press. 1984.-pp. 1291-1329.

136. Gordon, J.W. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA / J.W. Gordon, G.A. Scangos, D.J. Plotkin, J.A. Barbosa, F.H. Ruddle // Proc. Natl. Acd. Sci. USA. 1980. - V.77. - P.7380-7384.

137. Gorodetskii, S.I. Isolation and characterisation Ithe bos taurus b-casein gene / S.I.Gorodetskii, T.M.Tkach, T.V. Kapelinskaya // Gene. 1988. - V. 66. -P. 87-96.

138. Gottschalk, S. Synthetic vehicles for effecient gene transfer and expression in mammalian cells / S. Gottschalk // J. Cell Biochem. Suppl. 21a. - 1995. -P.393.

139. Gray, D.A. Insertional mutagenesis: neoplasia arising from retroviral integration / D.A. Gray // Cancer Invest. 1991. - V.9. - P.295-304.

140. Grosovsky, A.J. Insertional inactivation of the tk-locus in a human B lymphoblastoid cell line by a retroviral shuttle vector / A.J. Grosovsky, A. Skandalis, L. Hasegawa, B.N Walter // Mutat. Res. 1993. - V.289. - P.297-308.

141. Gruendbaum, J. Sperm cells as vectors for generation of transgenic chickens / J. Gruendbaum, E. Revel, S. Yarns, A. Fainsod //J. Cell Biochem. -1991.-Suppl.15.-P.194.

142. Guenzburg, W.H. A mammary-specific romoter directs expression of growth hormone not only to the mammary gland, but also to Bergman glia cells in transgenic mice / W.H.Guenzburg, B.Salmons, B.Zimmerman // Mol. Endocr. -1991. -V. 5. P. 123-33.

143. Hammer, R.E. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection / R.E. Hammer, V.G. Pursel, C.E. Rexroad, R.J. Wall, D.J. et al. // Nature. 1985.- V.315. - P.680-683.

144. Han, J. Y. Production of germline chimeras by transfer of chicken gonadal primordial germ cells maintained in vitro for an extended period / J.Y.Han, T.S. Park, Y.H. Hong, D.K. Jeong, J. N. Kim et al.// Theriogenology. 2002. -V.58. - P.1531-1539.

145. Hancock, W.W. Beyond hyperacute rejection: strategies for development of pig-to-primate xenotransplantation / W.W. Hancock // Kidney Int. 1997. -V.58. - P.36-40.

146. Hansson, L. Structure of the human b-casein encoding gene / L.Hansson, A.Edlund, J. Tohhansson, O.Hernell, M.Stromqvist et al. // Gene. 1994. -V. 13. -P. 193-199.

147. Harvey, A.J. Expression of exogenous protein in the egg white of transgenic chickens / A.J. Harvey // Nat. Biotechnol. 2002. - V.20. - P.396-399.

148. Heneine, W. No evidence of infection with porcine endogenous retrovirus in recipients of porcine islet-cell xeno-grafts / W. Heneine, A. Tibell, W.M. Switzer, P. Sandstrom, G.V. Rosales et al. // Lancet. 1998. - V.352. -P.695-699.

149. Hill, K.G. Production of transgenic cattle by pronuclear injection / K.G. Hill, J.Curry, F.J. DeMayo, K. Jones-Diller, J.R. Slapak // Theriogenology. 1992. -V.37.-P.222.

150. Hitchin, E. Bovine beta-casein expressed in transgenic mouse milk is phosphorylated and incorporated to micelles/ E.Hitchin, E.M.Stevenson, A.J.Clark, M.McClenaghan, J.Leaver // Protein Expr. Purif. 1996. - V. 7. - № 3. - P. 247252.

151. Hochi, S. Fate of exogenous DNA carried into mouse eggs spermatozoa / S. Hochi, T. Ninomiya, A. Mizuno, M. Honma, A. Yuki //Anim. Biotech. 1990. - V.1.-P.21-31.

152. Hu, S. Generation of competent virus in the REV helper cell line C3 / S. Hu, J. Bruszewski, M. Nicolson, J. Tseng, R.Y. Hsu et al. // Virology. 1987. -V. 159. - P.446-449.

153. Hyttinen, J.M. Generation of transgenic dairy cattle from transgene analysed and sexed embryos produced in vitro / J.M. Hyttinen, T.Peura, M.Tolvanen, J.Aalto, L. Alhonen et al. // BioTechnology. 1994. - V.12. - P. 606-608.

154. Ibanez, E. Expression of caprine beta-lactoglobulin in the milk of transgenic mice / E. Ibanez, J.M.Folch, F.Vidal, A.Coll, J.Santalo et al. // Transgenic les. 1997. -V. 6. - P. 69-74.

155. Ivarie, R. Avian transgenesis: progress towards the promise // Trends Biotechnol. -2003. V.21. - P. 14-19.

156. Izadyar, F. Spermatogonial stem cell transplantation / F. Izadyar, F. van Dissel-Emiliani, A. van Pelt, D.G. de Rooij // Molecular and Cellular Endocrinology. 2000. - V. 169. - P.21-26.

157. Jiang, F.X. Behaviour of spermatogonia following recovery from busul-fan treatment in the rat / F.X. Jiang // Anat. Embryol. 1998. - V.198 (1). - P.53-61.

158. Jin, H. Expression of porcine endogenous retrovirus in peripheral blood leukocytes from ten different breeds / H. Jin, Y. Inoshima, D. Wu, A. Morooka, H. Sentsui // Transplant Infectious Disease. 2000. - V.2. - P. 11-14.

159. Jones, W.K. The rat casein mltigene family. Fine structure and the evolution of the b-casein gene / W.K.Jones, L.-Y.Yu-Lee, S.M.Clift, T.L.Brown, J.M. Rosen// Biol. Chem. 1985.- V. 260. - P. 7042-7050.

160. Kagan, D. Expression of complement regulatory factors using heterologous promoters in transgenic mice / D. Kagan, L. Piatt, J. Logan, G. Byrne // Transpl. Proc. 1994. - V.26. - P. 1242.

161. Kamihira, MTransgenic birds for the production of recombinant proteins / M.Kamihira, K.Nishijima, S.Iijima // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. -2004.-V.91.-P.171-189.

162. Karagenc, L. Soluble factors and the emergence of chick primordial germ cells in vitro / L. Karagenc, J.N.Petitte // Poult. Sci.- 2000. V.79. - P.80-85.

163. Khoo, H.-W. Sperm-mediated gene transfer: a review / H.-W. Khoo, J. Patil, E. Chen // SEAMEO Jasper Fellowship Monograph 1993 Seriesl. 1993. -P.75-92.

164. Kiies, W. A. The contribution of farm animals to human health / W. A. Kiies, H. Niemann // Trends Biotechnol. 2004 - V.22. - P.286-294.

165. Kim, J.H. Development of a positive method for male stem cellmediated gene transfer in mouse and pig / J.H. Kim, H.S. Jung-Ha, H.T. Lee, et al. // Mol. Reprod. Dev. 1997. - V.46. - P.515-526.

166. Kitamura, M. Possible association of infertility with sperm-specific abnormality of CD46 / M. Kitamura, M. Matsumiya, M. Yamanaka, S. Takahara, T. Hara et al. // J. Reprod. Immunol. 1997. - V.33. - P.83-88.

167. Ko, J.H. Production of biologically active human granocyte colony stimulating factor in the milk of transgenic goat / J.H. Ko // Transgenic Reseach. V. 9. - 2000. - P.215-222.

168. Koczan, G.,Genomic organisation of the bovine aSl-asein gene / G.Koczan, G.Hobom, H.-M. Seyfert // Nucl. Acids Res. 1991. - V. 19. - P. 55915596.

169. Kooyman, D.L. In vivo transfer of GPI-linked complement restriction factors from erythrocytes to the endothelium / D.L. Kooyman, G.W. Byrne, S. McClellan, D. Nielsen, M. Tone et al. // Science 1995. - V.269. - P.89-92.

170. Korhonen, V.P. Expression of bovine beta-lactoglobulin human erythropoietin fusion protein in the milk of transgenic mice and rabbits / V.P. Korhonen, M. Tolvanen, J.M. Hyttinen // Eur. J. Biochem. 1997. - V.15. - P.482-489.

171. Krimpenfort, P. Generation of transgenic dairy cattle using in vitro embryo production / P. Krimpenfort, A. Rademakers, W. Eyestone, A. van der Schans, S. van den Broek et al. // Bio.Tech. 1991. - V.9. - P.844-847.

172. Lai, L.X. Production of alpha-1,3-galactosyltransferase knockout pigs by nuclear transfer cloning / L.X. Lai, D. Kolber Simonds, K.W. Park, H.Y. Cheong, J.L. Greenstain et al. // Science. - 2002. - V.295 (5557). -P.1089-1092.

173. Lambris, J.D. The chemistry and biology of C3, C4, and C5 / J.D. Lambris, A. Sahu, R. Wetsel // In: Volanakis J.E., Frank M. Eds. The Human Complement System in Health and Disease. Marcel Dekker, New York. 1998. -P.83-118.

174. Lampe, DJ. Factors affecting transposition of the Himarl mariner trans-poson in vitro / D.J. Lampe // Genetics. 1998. - V.149. - P. 179-187.

175. Larsson, E. Human endogenous pro viruses / E. Larsson, N. Kato, M. Cohen // Curr. Top. Microbiol, Immunol. 1989. - V.148. - P. 115-132.

176. Lavitrano, M. Sperm cells as vectors for introducing foreign DNA into eggs: genetic transformation of mice / M. Lavitrano, A. Camaioni, V.M. Fasio, et al. // Cell. 1989. - V.57. - P.717-723.

177. Lavitrano, M. The interaction of sperm cells with exogenous DNA a role of CD4 and major histocompatibility complex class II molecules / M. Lavitrano, B. Maione, E. Forte, M. Francolini, S. Sperandio, et al. // Exp. Cell Res. -1997. - V.233. - P.56-62.

178. Le Tissier, P. Two sets of human-tropic pig retrovirus / P. Le Tissier, J.P. Stoye, Y. Takeuchi, C. Patience, R.A. Weiss // Nature 1997. - V.389. - P.681

179. Lee, C.S. An efficient expression of human growth hormone (hGH) in the milk of transgenic mice using rat beta-casein/hGH fusion genes / C.S.Lee, K.Kim, D.Y.Yu, K.K. Lee // Ippl. Biochem. Biotechnol. 1996. -V. 56. - P. 211222.

180. Lee, K.F. Tissue-specific expression of le rat p-casein gene in transgenic mice / K.F.Lee, F.J.DeMayo, S.H.Atiee, J.M. Rosen // Nucl. Acids Res. 1988. -V. 16. - P.1027-1041.

181. Levy, J.A. Isolation of lymphocytopathic retroviruses from San Francisco patients with AIDS / J.A. Levy, A.D. Hoffmann, S.M. Kramer, J.A. Landis, J.M. Shimabukuro et al. // Science. 1984. - V.225. - P.840-842.

182. Li, Y. Ballistic transfection of avian primordial germ cell in ovo / Y. Li, J. Behnam, K. Simkiss // Transgenic Res. 1995. - V.4 (1). - P.26-29.

183. Lindenmann, J. Inheritance of resistance to influenza virus in mice / J. Lindenmann Proc. Soc. Exp. Biol. Med. - 1964. - V.l 16. - P.506-509.

184. Linial, M. An avian oncovirus mutant (SE21Qlb) deficient in genomic RNA: biological and biochemical characterization. / M. Linial, E. Medeiros, W.S Hayward // Cell. 1978. - V.15. - P.1371-1381.

185. Linial, M. Transfer of defective avian tumor virus genomes by a Rous sarcoma virus RNA packaging mutant / M. Linial // J. Virol. 1981. - V.38. -P.380-382.

186. Lipinski, D.Transgenic rabbit producing human growth hormone in milk / D. Lipinski, J. Jura, R.Kalakl, A. Plawski, M. Kala, M. Szalata. // J. Appl. Genet. 2003. - 44(2). - P. 165-174.

187. Liszewski, M.K. Membrane cofactor protein (MCP or CD46): newest member of the regulators of complement activation gene cluster / M.K. Liszewski,

188. T.W. Post, J.P. Atkinson//Ann. Rev. Immunol. 1991. - V.9. -P.431-455.

189. Logan, J.S. Potential use of genetically modified pigs as organ donors for transplantation into humans / J.S. Logan, A. Sharma // Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 1999. - V.26. - P. 1020-1025.

190. Love, J. Transgenic birds by DNA microinjection / J. Love // Biotechnology. 1994. - V. 12. - P.60-63.

191. Lower, R. Identification of human endogenous retroviruses with complex mRNA expression and particle formation / R. Lower, K. Boiler, B. Hasenmaier, C. Korbmacher, N. Muller-Lantsch et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. -V.90. - P.4480-4484.

192. Maga, E.A. Expression of human fsozyme mRNA in the mammary gland of transgenic mice / E.A.Maga, G.B.Anderson, M.C.Huang, J.D. Murray // Transgenic Res. 1994. - V.3.-P. 36-42.

193. Maga, E.A. Mammary gland expression of transgenes and the potential for altering the properties of milk / E.A.Maga, J.D. Murray // Biotechnol. 1995. -V.13. - P.1452-1457.

194. Makowka, L. The use of a pig liver xenograft for temporary support of a patient with fulminant hepatic failure / L. Makowka, D.V. Cramer, A. Hoffman // Transplantation. 1995. - V.59. - P. 1654-1659.

195. Malhotra, R. Identification of human complement factor H as a ligand for L-selectin / R. Malhotra, M. Ward, R.B. Sim, M.T. Bird // Biochem. J. 1999. -V.341. - P.61-69.

196. Mann, R. Construction of a retrovirus packaging mutant and its use to produce helper-free defective retrovirus / R. Mann, R.C. Mulligan, D. Baltimore // Cell. 1983. - V.33. - P. 153-159.

197. Manon, K. Prenatal letality in a transgenic mouse line is the result of a chromosomal translocation / K. Manon, P. Overbeek, H. Westphal // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1988. - V.85. - P. 1165-1168.

198. Mark, W. An insertional mutation in a transgenic mouse line results in developmental arrest at day 5 of gestation / W. Mark, E. Signorelli, E. Lacy // Cold

199. Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1985. - P.453-460.

200. Martin, U. Expression of pig endogenous retrovirus by primary porcine endothelial cells and infection of human cells / U. Martin, V. Kiessig, J.H. Blusch, A. Haverich, K. von der Helm et al. // Lancet. 1998. - V.352. - P.692-694.

201. Massoud, M. The deleterious effects of human erythropoietin gene driven by the rabbit whey acidic protein gene promoter in transgenic rabbits / M. Massoud, J. Attal, D. Thepot// Reprod. Nutr. Dev. 1996. - V.36. - P.555-563.

202. Mccreath, K.J. Production of genetargered sheep by nuclear transfer from cultured somatic cells / K.J. Mccreath, J. Howcroft, K.H.S. Campbell, A. Colman, A.E. Shnieke et al. // Nature. 2000. - V.405 (6790). - P. 1066-1069.

203. McCurry, K.R. Human complement regulatory proteins protect swine-to-primate cardiac xenografts from humoral injury / K.R. McCurry, D.L. Kooyman, C.G. Alvarado, A.H. Cotterell, M.J. Martin et al. // Nat. Med. 1995. - V.l. -P.423-427.

204. McGrew, M. J. Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors / M. J.McGrew, A.Sherman, F.M.Ellard, S.G.Lillico, H. J.Gilhooley et al. // F.MBO Rep. 2004. - V.5. - P.728-733.

205. Meade, H. Bovine alpha SI-casein gene equences direct high level expression of active human urokinase in mouse milk / H.Meade, L Gates, E.Lacy, N.Lonberg // Biotechnology. 1990. - V. 8. - P. 443-446.

206. Meri, S. Distribution of protectin (CD59), a complement membrane attack inhibitor, in normal human tissues / S. Meri, H. Waldmann, P.J. Lachmann

207. Laboratory Investigation. 1991. - V.65 (5). - P.532.

208. Michaels, M.G. Xenotransplant-associated zoonoses. Strategies for prevention / M.G. Michaels, R.L. Simmons // Transplantation. 1994. - V.57. -P.1-7.

209. Miller, A.D Retroviral packaging cells./ A.D. Miller // Hum. Gene Ther. 1990.-V.l.-P.5-14.

210. Miller, A.D. Generation of helper-free amphotropic retroviruses that transduce a dominant-acting, methotrexate-resistant dihydrofolate reductase gene / A.D. Miller, M.F. Law, I.M. Verma // Mol. Cell. Biol. 1985. - V.5. - P.431-437.

211. Miller, A.D. Redesign of retroviral packaging cell lines to avoid recombination leading to helper virus production / A.D. Miller, C. Buttimore // Mol. and Cell. Biol. 1986. - V.6. - P.2895-2902.

212. Miyagawa, S. In vitro and in vivo studies to prevent hyperacute rejection / S. Miyagawa, M. Mikata, H. Matsuda, M. lkawa, M. Okabe et al. // Transplantation Proceedings. 1996. - V.28 (2). - P. 1031.

213. Miyagawa, S. The mechanism of discordant xenograft rejection / S. Miyagawa, H. Hirose, R. Shirakura, Y. Naka, S. Nakata et al. // Transplantation. -1988. V.46. - P.825-830.

214. Mollnes, T.E. Xentransplantation: how to overcome the complement obstacle? / T.E. Mollnes, A.E. Fiane // Molecular Immunology. 1999. - V.36. -P.269-276.

215. Morgan, B.P. Complement Regulatory Proteins / B.P. Morgan, C.L. Harria // San Diego: Academic Press. 1999.

216. Mozdziak, P. E. Isolation of chicken primordial germ cells using fluorescence-activated cell sorting / P.E.Mozdziak, J. Angerman-Stewart, B. Rushton, S. L. Pardue, J. N. Petitte // Poult. Sci.-2005.-V.84.-P.594-600.

217. Mozdziak, P.E. Development of transgenic chickens expressing bacterial beta-galactosidase / P.E. Mozdziak, S. Borwornpinyo, D.W. McCoy, J.N. Petitte // Dev Dyn. 2003. - V.226 (3). - P.439-445.

218. Muller, M. Transgenic strategies to increase disease resistance in livestock / M.Miiller, G.Brem // Reproduction Fertility and Development. 1996. -V.6.-P. 605-613.

219. Muller, M. Disease resistance of farm animals / M. Muller, G. Brem -Experientia. 1991.

220. Murakami, H. Production of transgenic pigs expressing human DAF (CD55) regulated by the porcine MCP promoters / H. Murakami, H. Nagashima, Y. Takahagi, T. Fujimura, S. Miyagawa et al. // Transplant. Proc. 2001. - V.32. - P.2505-2506.

221. Murray, J.D. The production of transgenic Merino sheep by microinjection of ovine metallothionein-ovine growth hormone fusion genes / J.D. Murray , C.D.Nancarrow, J.T.Marshall, I.G. Flazelton, K.A.Ward // Reprod. Fert. Dev. -1989- V.1.-P.147-155.

222. Naito, M. Production of germline chimeric chickens, with high transmission rate of donor-derived gametes, produced by transfer of primordial germ cells / M. Naito, A. Tajima, Y. Yasuda, T. Kuwana // Mol Reprod Dev. 1994. - V.39 (2). - P.153-161.

223. Nakanishi, A. Gene transfer in the chicken by sper-mediated methods / A. Nakanishi, A. Iritani //Mol. Reprod. Dev. 1993. - V.36. - P.258-261.

224. Naldini, L. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector / L. Naldini, U. Blomer, P. Gallay, D. Ory, R. Mulligan et al. // Science. 1996. - V.272. - P.263-267.

225. Naniche, D. Human membrane cofactor protein (CD46) acts as a cellular receptor for measles virus / D. Naniche, G. Varior-Krishnan, F. Cervoni, T.F. Wild, B. Rossi et al. // J. Virol. 1993. - V.67. - P.6025-6032.

226. Nicholson-Weller, A. Structure and function of decay accelerating factor CD55 / A. Nicholson-Weller, C.E. Wang // J. Lab. Clin. Med. 1994. - V.123. -P.485-491.

227. Niekrasz, M. The pig as organ donor for man / M. Niekrasz, Y. Ye, L.L. Rolf// Transplant. Proc. 1992. - V.24. - P.625.

228. Nilson, B.H.K. Targeting of retroviral vectors through protease- substrate interactions / B.H.K. Nilson //Gene Ther. 1996. - V.3. - P.280-286.

229. Ninomiya, H. The human complement regulatory protein CD59 binds to the alpha-chain of C8 and to the "b"domain of C9/ H. Ninomiya, P.J. Sims // Journal of Biological Chemistry. 1992. - V.267 (19). - P.13675.

230. Ninomiya, T. Functions of milk protein gene flanking regions oh human growth hormone gene / T.Ninomiya, M.Harabayashi, J.Sagara, A. Yuki // Mol. Reprod. Dev. 1994. - V.37. - P. 276-283.

231. Nocka, K. Expression of c-kit gene products in known cellular targets of W mutations in normal and W mutant mice-evidence for an impaired c-kit kinase in mutant mice / K. Nocka, S. Majumder, B. Chabot, et al. // Genes Dev. 1989. -V.3. - P.816-826.

232. Norin, A.J. Enhanced survival of porcine endothelial cells and lung xenografts expressing human CD59 / A.J. Norin, R.J. Brewer, N. Lawson, G.A. Grijalva, M. Vaynblatt et al. // Transplant. Proc. 1996. - V.28. - P.797-798.

233. Norman, D.G. Three-dimensional structure of a complement control protein module in solution / D.G. Norman, P.N. Barlow, M. Baron, A.J. Day, R.B. Sim, I.D. Campbell // J. Mol. Biol. 1991. - V.219. - P.717-725.

234. Ogawa, T. Leuorolide, a gonadotropin-releasing hormone agonist, enhances colonization after spermatogonial transplantation into mouse testes / T. Ogawa, I. Dobrinski, M.R. Avarbock, R.L. Brinster //Tissue Cell. 1998. - V.30 (5). - P.583-588.

235. Ogawa, T. Transplantation of male germ line stem cells restores fertility in infertile mice / T. Ogawa, I. Dobrinski, M.R. Avarbock, R.L. Brinster //Nature Medicine. 2000. - V.6. - P.29-34.

236. Ogawa, T. Transplantation of testis germinal cells into mouse seminiferous tubules / T. Ogawa, J.M. Arechaga, M.R. Avarbock, R.L. Brinster //International Journal of Developmental Biology. 1997. - V.41. - P.l 11-122.

237. Ogawa, T. Xenogeneic spermatogenesis following transplantation of hamster germ cells to mouse testes / T. Ogawa, I. Dobrinski, M.R. Avarbock, R.L. Brinster //Biol. Reprod. 1999a. - V.60. - P.515-521.

238. Oglesby, T.J. Membrane cofactor protein (CD46) protects cells from complement-mediated attack by an intrinsic mechanism / T.J. Oglesby, C.J. Allen, M.K. Liszewski, D.J. White, J.P. Atkinson // J. Exp. Med. 1992. - V.175. -P.1547-1551.

239. Okada N. Membrane cofactor protein (CD46) is a keratinocyte receptor for the M protein of the group A streptococcus / N. Okada, M.K. Liszewski, J.P. Atkinson, M. Caparon // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - V.92. - P.2489-2493.

240. Oldstone, M. Measles virusinfection in a transgenic model: virus-induced immunosuppression and central nervous system disease / M. Oldstone, H.1.wicki, D. Thomas, A. Tishon, S. Dales et al. // Cell. 1999. - V.98. - P.629-640.

241. Ory, D.S. A stable human-derived packaging cell line for production of high retrovirus / vesicular stomatitis virus G pseudotypes / D.S. Ory, B.A. Neugeboren, R.C. Mulligan // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - V.93. - P. 11400 -11406.

242. Pain, B. Long-term in vitro culture and characterisation of avian embryonic stem cells with mul tiple morphogenetic potentialities / B. Pain, M. E. Clark, M. Shen, H. Nakazawa, M. Sakurai et al. // Development. 1996. - V.122. - P.2339-2348.

243. Paleyanda, R.K. Transgenic pigs produce functional luman factor VIII in milk / R.K.Paleyanda, W.H.Velander, T.K.Lee, D.H.Scandella, F.C.Gwazdauskas et al. //Nat. Biotechnol. 1997. -V. 15. - P. 971-975.

244. Palmiter, R. Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothioneingrowth hormone fusion genes / R. Palmiter, R. Brinster, R. Hammer, M. Trumbauer, M. Rosenfeld et al. // Nature 1982. -V.300.-P.611-615.

245. Paradis, K. Search for cross-species trans-mission of porcine endogenous retrovirus in patients treated with living pig tissue / K. Paradis, G. Langford, Z. Long, W. Heneine, P. Sandstrom et al. //Science 1999. - V.285. -P.1236-1241.

246. Parreira, C.G. Development of germ cell transplants in mice / C.G. Par-reira, T. Ogawa, M.R. Avarbock, L.R. Franca, L.R. Brinster et al. //Biology of Reproduction. 1998. - V.59. - P. 1360-1370.

247. Parrish, J.J. Capacitation of bovine sperm by heparin / J.J. Parrish, J.L. Susko-Parrish Biol Reprod. - 1989. - V.41. - P.683-699.

248. Passoni, L. Sperm cells mediated gene transfer: presence of foreign

249. DNAinto bovine blastocyst obtained from in vitro fertilization / L. Passoni, L. Mauri, A. Luciano, P. Pocar, Ajmone-Marsan, et. al. // A preliminary report. -1995. P.427-428.

250. Patience, C. Infection of human cells by an endogenous retrovirus of pigs / C. Patience, Y. Takeuchi, R.A. Weiss Nat. Med. - 1997. - V.3. - P.282-286.

251. Patience, C. No evidence of pig DNA or retroviral infection in patients with short-term extracorporeal connection to pig kidneys / C. Patience, G.S. Patton, Y. Takeuchi, R.A. Weiss, M.O. McClure et al. // Lancet. 1998. - V.352. - P.699-701.

252. Perry, A.C. Mammalian transgenesis by intracytoplasmic sperm injection / A.C. Perry, T. Wakayama, H. Kishikawa, et al. // Science. 1999. - V.284 (5417).-P.l 180-1183.

253. Pervaiz ,S. Homology of b-lactoglobulin, serum retinol-binding protein md protein HC / S.Pervaiz, K.Brew // Science. 1985. - V. 228. - P. 335-337.

254. Petitte, J. N. Avian pluripotent stem cells / J.N. Petitte, G. Liu, Z. Yang // Mech. Dev. 2004. - V. 121. - P. 1159-1168.

255. Petitte, J.N. Production of somatic and germline chimeras in the chicken by transfer of early blastodermal cells / J.N. Petitte // Development. 1990. -V.108. - P.185-189.

256. Petitte, J.N. The origin of the avian germ line and transgenesis in birds / J.N. Petitte, L. Karagenc, M. Ginsburg // Poult. Sei. 1997. - V.76 (8). - P. 10841092.

257. Petranka, J. Structure-Function Relationships of the Complement Regulatory Protein, CD59 / J. Petranka, J. Zhao, J. Norris, N. Tweedy, R. Ware, et al. // Blood Cells, Molecules, and Diseases. 1996. - V.22. - P.281-296.

258. Platenburg, G.J. Expression of human lactoferin in milk of transgenic mice / G.J.Platenburg, E.P.Kootwijk, P.M.Kooiman, S.L Woloshuk, J.H.Nuijens et al. // Transgenic Res. 1994. - V. 3. - P. 99-108.

259. Piatt, J. The transplantation of organs and tissues between species / J. Piatt, J. Logan // In: Xenotransplantation, Eds: Cooper D., et al Springer. - 1997. - P.650-658.

260. Piatt, J.L. Xenotransplantation: recent progress and current perspectives / J.L. Piatt // Current Opinion In Immunology. 1996. - V.8 (5). - P.721.

261. Prunkard, D. High-level expression of recombinant human fibrinogen in the milk of transgenic mice / D.Prunkard, I.Cottingham, I.Garner, M.Dalrymple, G.Lasser et al. //Nat. Biotechnol. 1996. - V. 14. - P. 867-871.

262. Pursel, V. Growth potential of transgenic pigs expressing a bovine growth hormone gene / V. Pursel, R. Cambell, K. Miller, R. Behringer, R. Palmiter et al. // J. Anim. Sci. 1988. - V.66. - P.267.

263. Pursel, V.G. Genetic engineering of livestock / V.G. Pursel, C.A. Pin-kert, K.F. Miller, D.J.,Bolt, R.G.Campbell et al. // Science. 1989. - V. 244. -P.1281-1288.

264. Pursel, V.G. Modification of production traits. In: Clark, A.J. (Ed.), Animal breeding. Technology for the 21st century. Harwood Academic Publishers, 1998, P. 187.

265. Pursel, V.G. Progress in gene transfer in farm animals / V.G. Pursel,

266. C.E. Jr. Rexroad, D.J. Bolt, K.F. Miller, R.J. Wall et al. // Vet. Immunol. Histopath. 1987. -V. 17. - P.303-312.

267. Pursel, V.G. Transfer of an ovine metallothionein-ovine growth hormone fusion gene into swine / V.G.Pursel, R.J. Wall, M.B.Solomon, D.J. Bolt, J.D. Murray et al. // Journal of Animal Science. 1997. - V.75. - P. 2208 - 2214.

268. Ram, S. Interactions between Neisseria gonorrhoeae and C4b-binding protein: a molecular basis for gonococcal serum resistance / S. Ram, S. Gulati,

269. D.P. McQuillen, R. Boden, C. Elkins et al. // Mol. Immunol. Abstr. 1999. - V.36. - P.297.

270. Rapp, J.C. Biologically active human interferon alpha-2b produced in the egg white of transgenic hens / J.C. Rapp, A.J.Harvey, G.L.Speksnijder, W. Hu, R.Ivarie // Transgenic Res. 2003 - V.12. - P.569-575.

271. Reemtsma, K. Renal heterotransplantation in man / K. Reemtsma, B. McCracken, J. Schlegel // Annals of Surgery. 1964. - V.160. - P.384-408.

272. Rexroad, C.E. Insertion, expression and phisiology of growth-regulating genes / C.E. Rexroad, R.E. Hammer, R.R. Behringer, R.D. Palmiter, R.L. Brinster // J. Reprod. Fert. Suppl. 1990. - V.41. - P. 119-124.

273. Rexroad, C.E. Production of transgenic sheep with growth relating genes / C.E.Rexroad, R.E. Hammer, D.J. Bolt, T.H. Elsasser, K.F. Miller, R.R. Behringer // Molecular Reproduction and Development. 1989. - V. 1. - P. 164-169.

274. Rexroad, C.E. Transferrin- and albumin-directed expression of growth-related peptides in transgenic sheep / C.E. Rexroad, K.M. Mayo, D.J. Bolt, T.H.Elsasser, K.F. Miller et al. // Journal of Animal Science. 1991. - V.69. - P. 2995 - 3004.

275. Rigg, R.J. A novel human amphotropic packaging cell line: High titer, complement resistance, and improved safety / R.J. Rigg, J. Chen, J.S. Dando, S.P. Forestell, I. Plavec, E. Bohnlein//Virology. 1996. - V.218. - P.290-295.

276. Rijnkels, M. Expression analysis of the individual bovine beta-, alpha si- and kappa-casein genes in transgenic mice / M. Rijnkels, P.M. Kooiman, P.J.Krimpenfort, H.A. de Boer, F.R. Pieper // Biochem. J. 1995. - V. 311. - P. 929-937.

277. Roberts ,B. Cloning of the goat b-casein encoding gene and expression in transgenic mice / B. Roberts, P.DiTulio, J.Vitale, K.Hehir, K Gordon // Gene. -1992.-V. 121.-P. 255-262.

278. Rodriguez, A. Exogenous cloned DNA can penetrate living sperm cells / A. Rodriguez, F. O. Castro, J. Guillen, et al. //Advances in Gene Technology: Feeding the World in the 21st Century. 1991. - P.53.

279. Rollins, S.A. The complement-inhibi-tory activity of CD59 resides in its capacity to block incorpo-ration of C9 into membrane C5b-9 / S.A. Rollins, P.J. Sims // J. Immunol. 1990. - V.144. - P.3478-3483.

280. Rooney, I.A. Complement in human reproduction: activation and control / I.A. Rooney, T.J. Oglesby, J.P. Atkinson // Immunol. Res. 1993. - V.12. -P.276-294.

281. Roshlau, K. Gene transfer experiments in cattle / K. Roshlau, P. Rommel, L. Andreewa, M. Tackel, D. Roshlau et al. // Journal of Reproduction and Fertility. 1989. - V.38. - P.153-160.

282. Rottman, O. Liposomemediated gene transfer via spermatozoa into avian egg cells / O. Rottman, R. Antes , P. Hofer, G. Maierhofer //J. Anim. Breed. Genet. 1991. - V. 109. - P.64-70.

283. Rowe, J.A. Plasmodium falciparum rosetting mediated by a parasite-variant erythrocyte membrane protein and complement-receptor 1 / J.A. Rowe, J.M. Moulds, C.I. Newbold, L.H. Miller // Nature. 1997. - V.388. - P.292-295.

284. Rowe, P.M. Xenotransplantation: from animal facility to the clinic? / P.M. Rowe//Molecular Medicine Today. 1996. -V.2 (1). - P.10-15.

285. Rubanyi, G. The future of human gene therapy / G. Rubanyi // Mol. aspects of Medicine. 2001. - V.22. - P. 113-142.

286. Russell, S.J. Gene therapy: Science, medicine and the future / S.J. Russell // Br. Med. J. 1997. -V.315. -P.803-815.

287. Ruysschaert, J.-M. A novel cationic amphiphile for transfection of mammalian cells / J.-M. Ruysschaert, A. Ouahabi, V. Willeaume //Biochem. and Bioph. Res. Comm. 1994.-V.203 (3). - P. 1622-1628.

288. Saadi, S. Role of compliment in xenotransplantation / S. Saadi, J.L. Piatt // Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 1999. - V.26. -P.1016-19.

289. Sachs, D.H. The pig as a potential xenograft donor / D.H. Sachs // Vet1.munol Immunopathol. 1994. - V.43. - P. 185.

290. Salter, D.W. Gene insertion into the chicken germ line by retroviruses / D.W. Salter, E.J. Smith, S.H. Hughes, S.E. Wright, A.M. Fadly et al. // Poult Sci. 1986. - V.65 (8). - P.1445-1458.

291. Salter, D.W. Insertion of a disease resistance gene into the chicken germline / D.W. Salter, L.B. Crittenden // Biotechnology. 1991. - V. 16. - P. 125131.

292. Salter, D.W. Transgenic chickens: insertion of retroviral genes into the chicken germ line / D.W. Salter, E.J. Smith, S.H. Hughes, S.E. Wright, L.B. Crittenden//Virology. 1987. - V. 157 (1). - P.236-240.

293. Sang, H. Prospects for transgenesis in the chick // Mech. Dev. 2004 -V.121. - P.l 179-1186.

294. Sato, M. Direct injection of foreign DNA into mouse testis as a possible alternative of sperm-mediated gene transfer / M. Sato, R. Iwase, K. Kasai, N. Tada //Animal Biotechnology. 1994. - V.5 (1). - P. 19-31.

295. Scott, B. B. Generation of tissue-specific transgenic birds with lentiviral vectors / B.B. Scott and C. Lois // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - V.102. -P.16443-16447.

296. Seamon, J.A. Inserting a nuclear targeting signal into a replication-competent Moloney murine leukemia virus affects viral export and is not sufficient for cell cycle-independent infection / J.A. Seamon //J. Virol. V.76 (16). - 2002. -P.8475-8484.

297. Seidel, G. Embryo transfer: the next 100 years / G. Seidel // Therioge-nology.- 1991.-V.35 (1). P.171-180.

298. Seidel, G. Production of genetically identical sets of Mammals: Cloning / G. Seidel //J. Exp. Zool. 1983. - V.2. - P.228.

299. Seya, T. Functional properties of membrane cofactor protein of complement / T. Seya, J.P. Atkinson // Biochem. J. 1989. - V.264. - P.581-588.

300. Seya, T. Human membrane cofactor protein (MCP, CD46): multiple isoforms and functions / T. Seya, A. Hirano, M. Matsumoto, et al. // Int. J. Biochem. Cell Biol. 1999.-V.31.-P.1255-1260.

301. Seya, T. Purification and characterization of a membrane protein (gp45-70) that is a cofactor for cleavage of C3b and C4b / T. Seya, J.R. Turner, J.P. Atkinson// Journal of Experimental Medicine. 1986. - V.163 (4). - P.837.

302. Shafren, D.R. Coxsackievirus A21 binds to decay-accelerating factor but requires intercellular adhesion molecule 1 for cell entry / D.R. Shafren, D.J. Dorahy, R.A. Ingham, G.F. Bums, R.D. Barry // Journal of Virology. 1997. -V.71 (6). - P.4736.

303. Shank, P. Avian oncovirus mutant (SE21Qlb) deficient in genomic RNA: characterization of a deletion in the provirus / P. Shank, M. Linial // J. Virol. -1980. V.36. - P.450-456.

304. Sherman, A. Transposition of the Drosophila element mariner into the chicken germ line / A. Sherman // Nat. Biotechnol. 1998. - V. 16. - P. 1050-1053.

305. Shinohara, T. Enrichment and transplantation of spermatogonial stem cells / T. Shinohara, R.L. Brinster //Int. J. Androl. 2000. - V.23. - P.89-91.

306. Shnieke, A.E. Humanfactor IX transgenic seep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts / A.E. Shnieke, A.J. Kind, W.A. Ritchie, K. Mycock, A.R. Scott etal. //Science. 1997. -V.278 (5346). - P.2130-2133.

307. Simons, J.P. Gene transfer into sheep / J.P. Simons, I. Wilmut, A.J.Clark, A.L. Archibald, J.O. Bishop et al. // Biotechnology. 1988. -V. 6. - P. 189-183.

308. Sperandio, S. Sperm-mediated DNA transfer in bovine and swine species / S. Sperandio, V. Lulli, M. Bacci, M. Form, B. Maioni, et al. //Anim. Biotech. -1996.-V.7.-P.59-77.

309. Starzl, T. // Baboon-to-human liver transplantation / T. Starzl, J. Fung, A. Tzakis, A. Todo, A. J. Demetris et al. // Lancet. 1993. - V.341. - P.65-71.

310. Steele D.J., Auchincloss H.J. Xenotransplantation // Annu. Rev. Med. -1995. V.46. - P.345-360.

311. Stevens, R.B. The pathogenesis of hyperacute xenograft rejection / R.B. Stevens, J.L. Platt // American Journal of Kidney Diseases 1992. - V.20 (4). -P.414.

312. Stoye, J.P. The dangers of xenotransplantation / J.P. Stoye, J.M. Coffin // Nature Medicine 1995. - V. 1. - P. 1100.

313. Stromqvist, M. Recombinant human extracellular superoxide dismutase produced in milk of transgenic rabbits / M.Stromqvist, M.Houdebine, J.O. Anders-son, A.Edlund, C. Johansson et al. //Transgenic Res. 1997. -V. 6. - P. 271-278.

314. Subramanian, A. Rate limitations in posttranslational processing by the mammary gland of transgenic animals / A.Subramanian, K.Paleyanda, H.Lubon, \ B.L.Williams, F.C.Gwazdauskas et al. // Ann. NY Acad. Sei. 1996. - V. 782. - P. 87-96.

315. Sugita, Y. Determination of carboxyl-terminal residue and disulfide bonds of MACIF (CD59), a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored membrane protein / Y. Sugita, Y. Nakano, E. Oda, et al. // J. Biochem. (Tokyo) 1993. -V. 14. - P.473-477.

316. Takeuchi, Y. Host range and interference studies of three classes of pig endogenous retrovirus / Y. Takeuchi, C. Patience, S. Magre, R.A. Weiss, P.T. Banerjee, P. Le Tissier, J.P. Stoye // J. Virol. 1998. - V.72. - P.9986-9991.

317. Temin, H.M. Safety considerations in somatic gene therapy of human disease with retrovirus vectors / H.M. Temin // Hum. Gene Ther. 1990. - V.l. -P.111-123.

318. Thepot, D. Structure of the gene incoding rabbit beta-casein / Thepot D., Devinoy E., Fontaine M.L., Houdebine L.M. //Gene. -1991. V. 97. - P. 301-306.

319. Thern, A. Expression of two different antiphagocytic M proteins by Streptococcus pyogenes of the OF + lineage / A. Thern, M. Wästfelt, G. Lindahl // J. Immunol. 1998. - V.60. - P.860-869.

320. Thern, A. Ig-binding surface proteins of Streptococcus pyogenes also bind human C4b-binding protein (C4BP), a regulatory component of the complement system / A. Thern, L. Stenberg, B. Dahlbäck, G. Lindahl // J. Immunol. 1995. - V. 154. - P.375-386.

321. Todaro, G.J. Characterization of a type C virus released from the porcine cell line PK (15) / G.J. Todaro, R.E. Benveniste, M.M. Lieber, C.J. Sherr // Virology. 1974. - V.58. - P.65-74.

322. Tsai, H.J. Sperm as a carrier to introduce an exogenous DNA fragment into the oocyte of Japanese abalone (Haliotis divorsicolor suportexta) / H.J. Tsai, C.H. Lai, H.S. Yang //Transgenic Res. 1997. - V.6 (1). - P.85-95.

323. Tsunoda, Y. The recent progress on nuclear transfer in mammals / Y. Tsunoda, Y. Kato // Zool. Sei. 2000. - V.17 (9). - P. 1177-1184.

324. Uckert, W. Retrovirus-mediated gene transfer in cancer therapy / W. Uckert, W. Walther //Pharmac. Ther. 1994. - V.63. - P.323-247.

325. Urven, L.E. Distribution of extracellular matrix in the migratory pathway of avian primordial germ cells / L.E. Urven, U.K. Abbott, C.A. Erickson // Anat Ree. 1989. - V.224 (1). - P.14-21.

326. Van Cott, K.E. Phenotypic and genotypic stability of multiple lines of (ansgenic pigs expressing recombinant human protein C / K.E.Van Cott, H.Lubon,

327. C.G.Russel, S.P.Butler, F.C.Gwazdauskas et al. // Transgenic Res. 1997. - V.6. -P. 203-212.

328. Velander, W.H. High-level expression of a heterologous protein in the milk of transgenic swine using the c DNA encoding human protein C / W.H. Velander// Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1992. - V.89. - P. 12003-12007.

329. Vial, C.M. Life supporting function for over one month of a transgenic porcine heart in a baboon / C.M. Vial, D.J. Ostlie, F.N.K. Bhatti, E. Cozzi, M. Goddard et al. // The Journal of Heart and Lung Transplantation. 2000. - V.19. -P.224-229.

330. Vick, L. Transgenic birds from transfonned primordial germ cells / L. Vick, Y. Li, K. Simkiss // Proc. R. Soc. Lond. 1993. - V.251. - P. 179-182.

331. Vize, P.D. Introduction of a porcine growth hormone fusion gene into transgenic pigs promotes growth / P.D. Vize, A.E. Michalska, R. Ashman, B. Lloyd, B.A. Stone, P.Quinn // Journal of Cell Science. 1988. - V.90. - P. 295 -300.

332. Waddington, D. Chronology of events in the first cell cycle of the polys-permic egg of the domestic fowl (Gallus domesticus ) / D. Waddington // Int. J. Dev. Biol. 1998. - V.42. - P.625-628.

333. Wakayama, T. Mouse cloning with nucleus donor cells of different age type / T. Wakayama, R. Yanagimachi Mol. Reprod. Dev. - 2001. - V.58 (4). -P.376-383.

334. Wall, R.J. Synthesis and secretion of the mouse whey acidic protein in transgenic sheep / RJ.Wall, C.E.Rexroad, A.Powell, A.Shamay, R.McKnight et al. // Transgenic Res. 1996. - V. 5. - P. 67-72.

335. Weiss, R.A. Xenografts and retroviruses / R.A. Weiss // Science. 1999. - V.285. - P.1221-1222.

336. Wentworth, B.C. Manipulation of avian primordial germ cells and gonadal differentiation / B.C. Wentworth, H. Tsai, J.H. Hallett, D.S. Gonzales, G. Rajcic-Spasojevic // Poult Sci. 1989. - V.68 (7). - P.999-1010.

337. White, D. Hearts from pigs transgenic for human DAF are not hyperacutely rejected when xenografted to primates / D. White, R. Braidley, J. Dunning, et.al. // 3rd Int. Congr. Xenotranspl. 1995. - P. 128.

338. Whitelaw, C.B.A. Position-ndependent expression of the ovine beta-lactoglobulin gene in transgenic mice / C.B.A.Whitelaw, S.Harris, McClenaghan, J.P.Simons, A.J. Clark // Biochem. J. 1992. - V. 286. - P. 31-39.

339. Wilmut, J. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells / J. Wilmut, A.E. Shnieke , J. McWhir, A.J. Kind, K.H.S. Campbell // Nature. 1997. - V.3 85 (6619). - P.810-813.

340. Wilson, J.G. Characterization of human T lymphocytes that express the C3b receptor / J.G. Wilson, T.F. Tedder,. D.T. Fearon // J. Immunol. 1983. -V.131. - P.684.

341. Wilton, A.N. Strong associations between RFLP and protein polymorphism for CD46 / A.N. Wilton, R.W. Johnstone, I. McKenzie, et al. // Immunogenetics. 1992. - V.36. - P.79-85.

342. Wolf, E. Expressionbedingte Veränderungen bei Wachstumshormong-transgenen Mausen / E. Wolf// München, Diss. med. vet. 1990.

343. Wolf, E. Transgenic technology in farm animals-progress and perspectives / E. Wolf, W. Shernthaner, V. Zakhartchenko, K. Prelle, M. Stojkovic, G. Brem // Exp.Physiol. 2000. - V.85 (6). - P.615-625.

344. Wright, G. High level expression of active human alpha-1-antitrypsin in the milk of transgenic sheep / G.Wright, A.Carver, D.Cottom, D.Reeves, A. Scott et al. // Biotechnology. -1991. -V. 9. P. 830-834.

345. Xu, C. A critical role for murine complement regulator crry in fetomaternal tolerance / C. Xu, D. Mao, V.M. Holers, B. Palanca, A.M. Cheng, H. Molina // Science. 2000. - V.287. - P.498-501.

346. Yamazaki, Y. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells by deoxyribonucleic acid injection into seminerous tubules and subsequent electropo-ration / Y. Yamazaki, H. Fujimoto, H. Ando, et al. //Biol. Reprod. 1998. - V.59. -P. 1439-1444.

347. Yarus, S. Secretion of unprocessed human surfactant protein B in milk of transgenic mice / S.Yarus, N.M.Greenberg, Y.Wei, J.A.Whitsett, T.E.Weaver et al. // Transgenic Res. 1997. - V. 6. - P. 51-57.

348. Yasuda, Y. A method to obtain avian germ-line chimaeras using isolated primordial germ cells / Y. Yasuda, A. Tajima, T. Fujimoto, T. Kuwana // J Reprod Fertil. 1992. - V.96 (2). - P.521-528.

349. Ye, Y. Secondary organ allografting after a primary "bridging" xenotransplant / Y. Ye, Y. Luo, T. Kobayashi, S. Taniguchi, S. Li, S. Kosanke, et al. // Transplantation. 1995. - V.60 (1). - P. 19-22.

350. Ye, Y. The pig as a potential organ donor for man. A study of potentially transferable disease from donor pig to recipient man / Y. Ye, M. Niekrasz, S.

351. Kosanke, R. Welsh, H. E. Jordan et al. // Transplantation. 1994. - V.57. - P.694-703.

352. Yeatman, M. Complement-mediated pulmonary xenograft injury studies in swine-to-primate orthotopic single lung transplant models / M. Yeatman, C.W. Daggett, W. Parker, G.W. Byrne, J.S. Logan et al. // Transplantation. 1998. -V.65. - P.1084-1093.

353. Yoshimura, M. Isolation and the structural analysis of the mouse B-casein gene / M.Yoshimura, T.Oka // Gene. 1989. - V. 78. - P. 267-272.

354. Yu, J. Mapping the Regions of the Complement Inhibitor CD59 Responsible for Its Species Selective Activity / J. Yu, S. Dong, N. Rushmere, B. Morgan, R. Abagyan, S. Tomlinson // Biochemistry. 1997. - V.36. - P.9423-9428.

355. Yu, Z. Gene expression profiles in different stages of mouse spermato-genic cells during spermatogenesis / Z. Yu, R. Guo, Y. Ge, et al. //Biol. Reprod. -2003. V.69 (1). - P.37-47.

356. Zaidi, A. Life-supporting pig-to-primate renal xenotransplantation using genetically modified donors / A. Zaidi, M. Schmoeckel, F. Bhatti, P. Waterworth, M. Tolan et al. // Transplantation. 1998. - V.65. - P.1584-1590.

357. Zandrum, B. Diploid nuclear replacement in mature human ova with cleavage / B. Zandrum, M.D. Shettles //Am. J. Obstet. Gynecol. 1979. - V.l 33. -P.222-224.

358. Zelenin, A.V. Genetic transformation of mouse cultured cells with help of high velocity mechanical DNA-injection / A.V. Zelenin, A.V. Titomirov, V.A. Kolesnikov //FEBS Letters. 1989. - V.244. - P.65-67.

359. Zhao, D. F. Purification of avian circulating primordial germ cells by nycodenz density gradient centrifugation / D. F.Zhao, T. Kuwana. 2003.// Br. Poult. Sci. 2003. - V.44. - P.30-35.

360. Zhu, L. Production of human monoclonal antibody in eggs of chimeric chickens / L.Zhu, M. C. van de Lavoir, J. Albanese, D.O. Beenhouwer // Nat. Biotechnol. 2005. - V.23. - P. 1159-1169.

Информация о работе

Волкова, Наталья Александровна
доктора биологических наук
Дубровицы, 2008
ВАК 03.00.23

Диссертация

Фенотипический эффект экспрессии рекомбинантных генов в организме трансгенных животных - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы