Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Фенотипическая и генетическая изменчивость клонов плюсовых деревьев сосны обыкновенной в Среднем Поволжье

ВАК РФ 06.03.01, Лесные культуры, селекция, семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Фенотипическая и генетическая изменчивость клонов плюсовых деревьев сосны обыкновенной в Среднем Поволжье"

На правах рукописи

Криворотова Татьяна Николаевна

ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ КЛОНОВ ПЛЮСОВЫХ ДЕРЕВЬЕВ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ В СРЕДНЕМ ПОВОЛЖЬЕ

Специальность: 06.03.01 - лесные культуры, селекция, семеноводство

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Йошкар-Ола - 2014

Работа выполнена на кафедре лесной селекции, недревесных ресурсов и биотехнологии ФГБОУ ВПО «Поволжский государственный технологический университет»

Научный руководитель: кандидат сельскохозяйственных наук,

доцент Шейкина Ольга Викторовна

Официальные оппоненты: Коновалов Владимир Федорович, доктор

сельскохозяйственных наук, профессор (Башкирский государственный аграрный университет, профессор)

Бессчётнова Наталья Николаевна, кандидат сельскохозяйственных наук, доцент (Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия, декан факультета лесного хозяйства)

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО "Сибирский государственный технологический университет"

Защита состоится 23 декабря 2014 года в 900 часов на заседании диссертационного совета Д 212.115.03 при Поволжском государственном технологическом университете по адресу: 424000, Республика Марий Эл, г. Йошкар-Ола, пл. Ленина, 3, ауд. 406.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Поволжского государственного технологического университета: http://www.volgatech.net/sciences/thesis-boards/.

Отзыв на автореферат просим направлять в двух экземплярах с подписями, заверенными гербовой печатью, ученому секретарю диссертационного совета Д 212.115.03. Факс 8 (8362) 41-08-72; e-mail: muhortovdi@volgatech.net

Автореферат разослан «27» октября 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор сельскохозяйственных наук, доцент { Д.И. Мухортов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Акггуалыюсть темы. Повышение продуктивности лесов является одной из важных лесохозяйственных задач. Создание постоянной семенной базы на генетико-селекционной основе - один из возможных путей повышения хозяйственной ценности лесов (Лесной кодекс РФ, 1997). За последние десятилетия в нашей стране отобраны десятки тысяч плюсовых деревьев основных лесообразующих пород и созданы многочисленные объекты единого генетико-селекционного комплекса. Поэтому одним из приоритетных направлений является изучение и оценка отобранного плюсового генофонда и разработка предложений по дальнейшему развитию лесного семеноводства (Кублик, 1999; Тараканов и др., 2001; Видякин, 2010; Бессчетное, Бессчетнова, 2012, и др.).

Научные работы, направленные на изучение и оценку разнообразия плюсового генофонда, который является родоначальником искусственных лесов, крайне необходимы. Особенно эффективными для оценки внутривидового разнообразия являются молекулярные генетические маркеры. Отмечается явный недостаток исследований с использованием современных методов генетического анализа, основанных на применении ДНК-маркеров (Яковлев, Клейншмит, 2002; Яетепкоу, ЬаБСоих, 2003; Козыренко и др., 2004; Семериков, Семериков, 2007) особенно в области лесной селекции и семеноводства.

В связи с этим исследование морфогенетического полиморфизма плюсового генофонда сосны обыкновенной с использованием классических методов селекции и современных ДНК-методов представляется необходимым и своевременным.

Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы - изучение фенотипической и генетической изменчивости клонов плюсовых деревьев, насаждений и семян сосны обыкновенной для повышения эффективности семеноводства в Среднем Поволжье.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1) изучить генетическую изменчивость лесосеменных плантаций, насаждений и семян с использованием ^БЯ-маркеров;

2) оценить перспективность использования ГЭЗЯ-маркеров при селекции сосны обыкновенной;

3) дать оценку степени генетической дифференциации ЛСП, насаждений и семян из разных лесосеменных районов и подрайонов;

4) изучить индивидуальную изменчивость клонов плюсовых деревьев по росту, признакам репродуктивной сферы, смолопродуктивно-сти и ^БЯ-фрагментам ДНК;

5) обосновать критерии и выполнить отбор быстрорастущих, высокоурожайных и высокосмолопродуктивных клонов.

Научная новизна. Получены новые данные об индивидуальной изменчивости клонов плюсовых деревьев сосны обыкновенной из Республики Марий Эл по росту, признакам репродуктивной сферы, смолопро-дуктивности и ГББЯ-фрагментам ДНК. В районе исследования впервые изучены особенности генетической структуры и дифференциации кло-новых ЛСП 1 порядка и насаждений сосны обыкновенной с использованием 1Б8Я-праймеров. Впервые получены данные об уровне изменчивости ^БЯ-фрагментов ДНК семян различных селекционных категорий и двухлетних сеянцев, выращенных из улучшенных семян. Показана селективная нейтральность ГББЯ-маркеров.

Практическая значимость работы. По результатам исследования индивидуальной фенотипической и генетической изменчивости клонов плюсовых деревьев обоснованы критерии и отобраны перспективные для дальнейшей селекции генотипы. Отобранные клоны были рекомендованы для использования при создании ЛСП ПГЦ в Марийском лесо-семенном подрайоне Приволжского района. Новые данные о генетической дифференциации ЛСП, насаждений и семян могут быть рекомендованы для использования при актуализации действующего лесосемен-ного районирования и при разработке программ сохранения генофонда сосны в Среднем Поволжье. Теоретические и практические результаты исследований используются при преподавании учебных дисциплин «Селекция растений» и «Биотехнология в лесном хозяйстве».

Положения, выносимые на защиту:

1. Селективная нейтральность 1ББЯ-маркеров при реализации принципов плюсовой селекции сосны обыкновенной.

2. Актуализация действующего лесосеменного районирования сосны обыкновенной на основе анализа генетической дифференциации лесосеменных плантаций, насаждений и семян в пределах Приволжского и Средне-Волжского лесосеменного районов.

3. Особенности изменчивости клонов плюсовых деревьев сосны обыкновенной, произрастающих в условиях коллекционно-маточного участка, и обоснование критериев отбора ценных генотипов.

Обоснованность и достоверность результатов работы. Достоверность и обоснованность полученных результатов обеспечена большим объемом экспериментального материала; использованием методов математического статистического анализа при оценке результатов экспериментов (вариационная статистика, кластерный анализ, дисперсионный анализ, статистические методы популяционной генетики); приме-

нением современного метода ДНК-анализа (ISSR-анализ) и обработкой полученных результатов с использованием общепринятых и специализированных программ (Statistic, Quantity One (Bia-Rad), PopGen).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 3 статьи в реферируемых журналах рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Личный вклад автора. В диссертации использованы полевые и экспериментальные данные, полученные лично диссертантом на всех этапах работы. Автор провел экспедиционные исследования и сбор растительного материала, лабораторные исследования методом генетического анализа, основанного на ПЦР с ISSR-праймерами, обработал полученные материалы, изложил и обобщил результаты.

Апробация. Результаты научных исследований представлены на молодежном научно-инновационном конкурсе («УМНИК») (Йошкар-Ола, 2009); III всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Волгоград, 2010); V всероссийском фестивале науки по направлению «Биотехнология» (Йошкар-Ола, 2010); международной конференции с элементами научной школы для молодежи «Лесные экосистемы в условиях изменения климата: биологическая продуктивность, мониторинг и адаптационные технологии» (Йошкар-Ола, 2010); международной молодежной научной конференции по естественнонаучным и техническим дисциплинам «Научному прогрессу - творчество молодых» (Йошкар-Ола, 2009-2011); региональном инновационном конвенте в рамках конкурса молодежных инновационных проектов «Зворыкин-ская премия» (Йошкар-Ола, 2010); научной конференции профессорско-преподавательского состава ПГТУ (Йошкар-Ола, 2009-2011), а также на Всероссийской научно-практической конференции «Лесовосстановле-ние в Поволжье: состояние и задачи по совершенствованию» (Йошкар-Ола, 2013).

Работа в рамках финансируемых НИР. Диссертационные исследования выполнялись в рамках государственных контрактов:

1. Выполнение исследований в области диссертационной работы по программе «УМНИК», 2009-2010 гг.

2. Государственный контракт № 14.740.11.0740 от 12 октября 2010 г. по федеральной целевой программе «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы по направлению 1.3.2 «Проведение научных исследований целевыми аспирантами».

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит 'из введения, 5 глав, выводов и рекомендаций, списка литературы и при-

ложений. Основной текст изложен на 124 страницах, в работе приведено 11 рисунков и 26 таблиц. Список литературы содержит 171 название, из которых 75 на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. СОСТОЯНИЕ ВОПРОСА

В главе дан обзор литературы по биологическому разнообразию как основе селекции, рассмотрены понятия и методы оценки. Также рассмотрены биологические особенности, внутривидовой полиморфизм, селекция и семеноводство сосны обыкновенной. Приведены исследования древесных растений с помощью молекулярных маркеров.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований являлись плюсовые деревья, лесосемен-ные плантации, спелые и приспевающие насаждения и семенной материал сосны обыкновенной из Марийского и Мордовско-Чувашского подрайонов Приволжского лесосеменного района, а также из Пензен-ско-Ульяновского подрайона Средне-Волжского лесосеменного района (Лесосеменное районирование ... , 1982). Изучение морфологического полиморфизма клонов плюсовых деревьев сосны обыкновенной проводилось на коллекционно-маточном участке Республики Марий Эл.

Высоту измеряли с помощью высотомера с точностью до 0,1 м, окружность ствола на высоте 1,3 м - мерной лентой с точностью до 1 мм. Замеры ширины кроны в ряду и между рядами проводили с помощью металлической рулетки с точностью до 1 см. Для определения урожайности на каждой рамете осуществлялся подсчет количества шишек. Для изучения изменчивости клонов плюсовых деревьев по признакам репродуктивной сферы с 69 клонов на КМУ в Сернурском лесничестве было собрано по 30 шишек. Шишки взвешивали, измеряли их длину и ширину. Были рассчитаны масса 1000 штук семян и выход семян из шишек каждого клона. Для определения смолопродуктивности использовали методику А.В.Чудного (1966). Все полученные данные обрабатывались методами вариационной статистики в среде Microsoft Excel. Для определения сходства клонов по признакам генеративной и репродуктивной сферы использовался кластерный анализ, выполненный в программе «Statistica».

Для анализа генетической изменчивости в качестве исходного материала для экстракции ДНК использовалась хвоя, древесина и проростки семян сосны обыкновенной. За основу бралась методика с приме-

нением 2*СТАВ-буфера (Doyle J.J., Doyle J.L., 1991). Для проведения ПЦР был использован набор реактивов Encyclo PCR kit («Евроген», Россия). Использовали 6 полиморфных ISSR-праймеров: (CA)6RY, (CA)6AG, (CA)6GT, (СА)6АС, (AG)ST, (AG)SYT.

Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР проводили в горизонтальной электрофоретической камере (Power РасТМ Universal (BIO-RAD)) в 1,5% агарозном геле с добавлением этидия бромида при напряжении 70 mV в течение 2-3 часов. Визуализацию ДНК, обработку и анализ полученных изображений проводили с помощью системы гель-документации GelDoc 2000 (BIO-RAD) с использованием программного пакета Quantity One® Version 4.6.3. Для количественной оценки степени полиморфизма и определения уровня дивергенции между изучаемыми объектами создавали матрицу бинарных признаков в программе Bioimage Geles PCR Analysis v. 1.0. Для расчета генетических параметров использовали специализированную программу POPGENE Version 1.32.

3. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ЛЕСОСЕМЕННЫХ ПЛАНТАЦИЙ ПЕРВОГО ПОРЯДКА, НАСАЖДЕНИЙ И СЕМЯН СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ

3.1. Генетическая изменчивость насаждений и лесосеменных плантаций сосны обыкновенной. В результате ISSR-анализа ДНК с использованием шести праймеров было выявлено 215 амплифицированных фрагментов ДНК, из которых 208 фрагментов оказались полиморфными на ЛСП и 206 в насаждениях. Число амплифицированных фрагментов ДНК в выборке варьировало в зависимости от праймера от 27 до 40. Размеры ампликонов варьировали от 200 до 2500 пар нуклеотидов.

Для оценки уровня генетической изменчивости лесосеменных плантаций и насаждений были рассчитаны следующие параметры: доля полиморфных локусов (Р), наблюдаемое (Na) и эффективное (Ne) число аллелей, общее генетическое разнообразие (Н), информационный индекс Шеннона (I) (табл. 3.1).

Таблица 3.1

Основные показатели генетической изменчивости лесосеменных плантаций _и насаждений сосны обыкновенной

Объект исследования Р,% Na Ne н I

ЛСП

Республика Марий Эл 83,26 1,8326 1,3404 0,2124 0,3344

Чувашская Республика 91,16 1,9116 1,4547 0,2775 0,4260

Пензенская область 81,40 1,8140 1,3761 0,2305 0,3577

Объект исследования Р, % Ыа Ые Н I

В целом для ЛСП 96,74 1,9674 1,4264 0,2657 0,4149

Насаждения

Республика Марий Эл 77,21 1,7721 1,3316 0,2071 0,3246

Чувашская Республика 88,84 1,8884 1,3615 0,2298 0,3644

Пензенская область 86,05 1,8605 1,3823 0,2377 0,3721

В целом для вида 95,81 1,9581 1,4008 0,2547 0,4018

В целом для ЛСП и насаждений 97,21 1,9721 1,4261 0,2662 0,4165

Результаты исследований показали, что доля полиморфных локусов у всех изученных деревьев сосны обыкновенной составила 97,21%, при этом отдельно для всех ЛСП и насаждений данный показатель был близок — 96,74 и 95,81% соответственно.

Изученные ЛСП и насаждения несущественно отличаются по наблюдаемому и эффективному числу аллелей. Наивысшее значение генетического разнообразия по Нею и информационного индекса Шеннона характерно для ЛСП из Чувашской Республики (0,2775 и 0,426 соответственно), а для сосновых насаждений этого же подрайона эти показатели оказались значительно ниже - 0,2298 и 0,3644 соответственно. В двух других лесосеменных подрайонах у ЛСП и насаждений данные показатели оказались близкими.

Необходимо отметить, что обобщенные показатели для ЛСП и насаждений оказались достаточно близкими к показателям, установленным для всех изученных образцов, которые составили соответственно 0,2662 и 0,4165. Таким образом, полученные результаты показывают, что уровень генетической изменчивости отобранного плюсового генофонда сосны обыкновенной, оцениваемый с использованием 18811-маркеров, не уступает уровню генетической изменчивости, обнаруженному у случайной выборки деревьев из насаждений. Этот факт является подтверждением того, что 18811-маркеры являются селективно нейтральными.

3.2. Генетическая изменчивость семян сосны обыкновенной разных селекционных категорий. В результате исследований семян разной селекционной категории было выявлено 215 ДНК-фрагментов с использованием шести 18811-праймеров. Количество амплифициро-ванных фрагментов варьировало от 24 до 41, а их длины составляли от 200 до 2790 пар нуклеотидов.

В ходе исследований не было установлено какой-либо зависимости степени полиморфности локусов от селекционной категории семян. В целом для улучшенных семян со всех ЛСП количество полиморфных

фрагментов составило 204, или 94,88%, а для нормальных семян с ПЛСУ - 94,42% (табл. 3.2). Для семян всех селекционных категорий показатель полиморфности равен 97,67%, что указывает на большую изменчивость семян с ЛСП и ПЛСУ.

Таблица 3.2

Основные показатели генетической изменчивости семян сосны обыкновенной

Объект исследования Селекционная категория семян Количество полиморфных фрагментов N. Н 1

шт. %

ЛСП

Семена из Кузнецкого лесничества ПО Улучшенные 156 72,56 1,7256 1,2580 0,1654 0,2666

Семена из Ибресиско-го лесничества (1 поле) ЧР Улучшенные 121 56,28 1,5628 1,3214 0,1918 0,2895

Семена из Ибресиско-го лесничества (2 поле) ЧР Улучшенные 138 64,19 1,6419 1,3898 0,2294 0,3432

Семена из Сернурско-го лесничества РМЭ Улучшенные 128 59,53 1,5953 1,2798 0,1725 0,2665

В целом для ЛСП Улучшенные 204 94,88 1,9488 1,3882 0,2459 0,3891

ПЛСУ

Семена из Ахунского хозяйства ПО Нормальные 147 68,37 1,6837 1,2529 0,1657 0,2665

Семена из Порецкого лесничества ЧР Нормальные 132 61,40 1,6140 1,3333 0,1987 0,3014

Семена из Сернурско-го лесничества РМЭ Нормальные 123 57,21 1,5721 1,2567 0,1581 0,2460

В целом для ПЛСУ Нормальные 203 94,42 1,9442 1,3409 0,2232 0,3598

В целом для всех семян 210 97,67 1,9767 1,3756 0,2436 0,3895

Наблюдаемое и эффективное число аллелей у нормальных и улучшенных семян варьировало незначительно.

Для всех изученных семян установленные показатели генетического разнообразия можно считать характерными для вида в целом в районе проведения исследований. Уровень генетического разнообразия партии семян достаточно высокий, если он максимально приближен к видовому уровню. В частности, в нашем исследовании более соответствуют данному требованию семена улучшенной селекционной категории, полученные с 2-го поля ЛСП сосны обыкновенной Ибресинского лесничества Чувашской Республики.

Какой-либо зависимости между источником получения семян, которые отличались по принципу создания (ЛСП и ПЛСУ), и уровнем генетического разнообразия семян не было установлено. Рассчитанные итоговые показатели генетического разнообразия для ЛСП и ПЛСУ существенно не различались. Отсутствие различий между генетическими параметрами улучшенных и нормальных семян, вычисленных на основе анализа ^БЯ-участков ДНК, также подтверждают их селективную нейтральность.

С целью подтверждения высокого уровня генетического полиморфизма, который был установлен для партий семян с ЛСП Ибре-синского лесничества Чувашской Республики, были проведены исследования генетической изменчивости выращенных из них двухлетних сеянцев.

Доля полиморфных локусов для двухлетних сеянцев составляет 93,81%, что незначительно меньше, чем у улучшенных (94,88%) и нормальных семян (94,42%). Также было установлено, что семена улучшенной селекционной категории, полученные с ЛСП, и выращенные из них сеянцы имеют близкие параметры генетической изменчивости: наблюдаемое число аллелей соответственно 1,95 и 1,94, эффективное число аллелей 1,39 и 1,37, генетическое разнообразие по Нею 0,25 и 0,24, а информационный индеек Шеннона 0,39 и 0,38.

Таким образом, полученные с использованием 18811-маркеров данные подтвердили высокий уровень изменчивости партий семян улучшенной селекционной категории, заготовленных на ЛСП Ибресинского лесничества.

3.3. Генетическая дифференциация насаждений, лесосеменных плантаций и семян сосны обыкновенной. Одним из неукоснительных принципов при организации лесного семеноводства в России является соблюдение правил лесосеменного районирования (Лесосеменное районирование ..., 1982). Для оценки действующего лесосеменного районирования были проведены исследования генетической дифференциации клоновых ЛСП, насаждений и семян из двух сопредельных лесосеменных районов: Приволжский лесосеменной район, представленный в исследовании Марийским (Республика Марий Эл) и Мордовско-Чувашским (Чувашская Республика) подрайонами, и Средне-Волжский лесосеменной район, представленный в исследовании Пензенско-Ульяновским подрайоном (Пензенская область).

Расчет стандартного генетического расстояния по методике Нея (Ие1, 1972) показал, что генетическая дистанция между включенными в

анализ объектами варьирует незначительно от 0,011 до 0,079, при этом наиболее генетически близкими являются ЛСП и насаждение из Пензенской области, а наиболее генетически дифференцированными - насаждение из Республики Марий Эл, с одной стороны, и насаждение из Пензенской области - с другой.

Дифференциацию популяций и генетическое взаимоотношение иллюстрирует дендрограмма, построенная на основе рассчитанной генетической дистанции Нея (рис. 3.1).

ПО - ЛСП

ПО - насаждение

РМО-ЛСП

1 1 _____________________________

| +-----3

-5 ! +-------------------------ЧР-ЛСП

! *------2

ЧР - насаждение РМО - насаждение

Рис. 3.1. Дендрограмма генетических взаимоотношений лесосеменных плантаций и насаждений из разных географических районов

На дендрограмме видно, что четкого разделения ЛСП и насаждений по лесосеменным районам и подрайонам не наблюдается. В первый большой кластер вошли как ЛСП и насаждения из Средне-Волжского лесосеменного (Пензенская область), так и из Приволжского лесосеменного района (Чувашская Республика и Республика Марий Эл). Второй кластер представлен только одним насаждением из Республики Марий Эл, которое генетически дифференцировано от других объектов. На наш взгляд, генетическая особенность этого насаждения обусловлена не географическим расположением, а тем, что именно у данного насаждения было выявлено самое низкое генетическое разнообразие.

Для оценки степени гомогенности генофондов также была рассчитана генетическая дистанция между семенами. Минимальная генетическая дистанция (0,0272) была установлена между семенами с ПЛСУ Ахун-ского хозяйства и ЛСП Кузнецкого лесничества Пензенской области. Самая большая генетическая дистанция (0,1127) была выявлена у семян с ЛСП и ПЛСУ из Республики Марий Эл.

Построенная на основе дистанции Нея дендрограмма (рис. 3.2) также не показала четкого разделения партий семян по лесосеменным районам и подрайонам.

-------------- ПЛСУ ЧР

,----------------------------лсп по

1.

----------------------------ПЛСУ по

--------------------------------ЛСП no 1 г чр

------------ЛСП РМЭ

------------ЛСП 1 поле "ЧР

------------ПЛСУ РМЭ

Рис. 3.2 Дендрограмма генетической дифференциации семян сосны обыкновенной

различной селекционной категории из Пензенской области, Республики Марий Эл и Чувашской Республики

В первом кластере сгруппированы семена из Средне-Волжского (ЛСП и ПЛСУ из Пензенской области) и Приволжского (ПЛСУ и ЛСП 2 из Чувашской Республики и ЛСП из Республики Марий Эл) ле-сосеменного районов. Во второй кластер вошли семена из двух подрайонов Приволжского лесосеменного района (ЛСП 1 из Чувашской Республик и ПЛСУ из Республики Марий Эл).

Оценка уровня генетической дифференциации была также выполнена на основе анализа доли межпопуляционного разнообразия (Gst) и оценки потока генов (Nm). Обобщенный расчетный показатель доли Gst для ЛСП и насаждений составил 0,127, т.е. на долю межпопуляци-онной изменчивости приходится всего 12,7% от всей генетической изменчивости, а на изменчивость деревьев в пределах изученных подрайонов - около 87,3%. О наличии прямого обмена генами также свидетельствует наличие генного потока (Nm), который составил для ЛСП и насаждений 3,45-4,71 мигранта на поколение.

Полученные данные о низкой генетической дифференциации смежных популяций сосны обыкновенной согласуются с результатами других исследований, в которых была показана низкая внутривидовая дифференциация близко расположенных популяций сосны (Шигапов, 2005; Li Bin, 2003; Абдуллина, 2009). Большие генетические различия наблюдаются только на больших расстояниях или в контрастных условиях, например в горных и пустынных популяциях (Li Hui-yu, 2005).

С целью актуализации действующего лесосеменного районирования (Лесосеменное районирование ... , 1982) было выполнено сравнение полученных данных с рекомендациями по переброске семян. В соответствии с действующим лесосеменным районированием, все изученные лесосеменные подрайоны могут быть поставщиками друг для друга, за одним исключением: семена в Республику Марий Эл могут поставляться только из части Пензенско-Ульяновского подрайона Средне-Волжского лесосеменного района, а именно из Ульяновской области, расположенной на правом берегу Волги. В то же время Пен-

зенская область не внесена в список возможных поставщиков семян для Республики Марий Эл. На переброску семян в обратном направлении, т.е. из Республики Марий Эл в Пензенскую область, ограничений нет. В ходе наших исследований оснований для введения запрета ввоза семян из Пензенской области в Республику Марий Эл выявлено не было, так как были установлены низкая генетическая дифференциация и близкие значения генетических параметров для ЛСП и насаждений из этих регионов.

4. АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА КЛОНОВ ПЛЮСОВЫХ ДЕРЕВЬЕВ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ ПО РОСТУ, СЕМЕНОШЕНИЮ, СМОЛОПРОДУКТИВНОСТИ И ^Я-УЧАСТКАМ ДНК

4.1. Изменчивость показателей роста клонов плюсовых деревьев сосны обыкновенной. В ходе исследований были установлены показатели изменчивости высоты, окружности ствола, протяженности кроны у клонов плюсовых деревьев, произрастающих на КМУ (табл. 4.1).

Таблица 4.1

Статистические показатели роста клонов плюсовых деревьев сосны обыкновенной

Признак Среднее значение ± стандартная ошибка Лимиты по клонам Коэффициент вариации, %

Высота, м 6,19±0,03 5,10-7,34 14,7

Окружность ствола, см 38,10±0,28 26,50-47,20 19,3

Протяженность кроны, см: в ряду между рядами 3,35±0,03 3,18±0,03 2,04-4,84 1,86-4,73 25,3 26,6

Для клонов плюсовых деревьев был установлен значительный и большой уровень изменчивости показателей роста, межклоновый коэффициент вариации составил 14,70% для высоты, 19,30% для окружности ствола, 25,3 и 26,6% для протяженности кроны в ряду и междурядьях соответственно. Однофакторным дисперсионным анализом было подтверждено, что на изменчивость клонов по показателям роста существенное влияние оказывают генотипические особенности, для всех признаков критерий Фишера фактический (Рф = 4,49; 6,184; 9,013 и 9,384) превышает критическое значение (Рк = 1,357).

4.2. Изменчивость признаков репродуктивной сферы клонов плюсовых деревьев. Включенные в анализ клоны существенно различаются по признакам репродуктивной сферы (табл. 4.2). Длина и ширина шишек — это признак, который характеризуется значительной

изменчивостью, о чем говорит коэффициент вариации равный соответственно 13,7 и 16,3%. Большая изменчивость наблюдается у исследованных клонов по таким характеризующим семенную продуктивность признакам, как общая масса шишек с одного дерева, масса одной шишки и масса 1000 штук семян. У вышеперечисленных признаков коэффициент меж-кло-новой вариации варьирует от 24,2 до 37,3%.

Таблица 4.2

Статистические показатели изменчивости признаков шишек и семян деревьев сосны обыкновенной

Признак Среднее значение ± стандартная ошибка Лимиты по клонам Коэффициент вариации, %

Длина шишек 4,47±0,01 3,05 - 5,24 13,7

Ширина шишек 2,17±0,01 1,64-2,65 16,3

Общая масса шишек, г 309,8±3,89 55,3 - 583,8 37,3

Масса одной шишки, г 9,59±0,28 3,7-14,4 24,5

Количество семян из всех шишек, шт. 308±27,25 0-903 74,1

Общая масса семян из всех шишек, г 2,06±0,18 0-5,93 74,2

Количество семян из 1 шишки, шт. 9,64±0,78 0-22,7 66,9

Масса 1000 штук семян 6,46±0,19 0-9,6 24,2

Выход семян, % 0,64±0,05 0-1,51 64,6

Очень большой уровень изменчивости был установлен для общего количества семян, общей массы семян из всех шишек, количества семян из одной шишки и выхода семян, у которых межклоновый коэффициент вариации достигает 64,9-74,2%. Кластерный анализ показал, что все исследованные клоны по сходству изученных признаков репродуктивной сферы можно разделить на три группы: первая группа составляет 30,4% от общего количества клонов, а вторая и третья группа - 31,9 и 37,7% соответственно.

4.3. Изменчивость клонов плюсовых деревьев по смолопродук-тивности. Средняя масса смолы по клонам составляет 0,83 г. Самая максимальная масса составила 4,60 г, а минимальная - 0,01 г. Изменчивость признака очень большая, коэффициент вариации 89,2%.

Наибольшая доля клонов (49%) характеризуется очень низкой смо-лопродуктивностью, наименьшая доля клонов имеет высокую и очень высокую смолопродуктивность - 7 и 10% соответственно. Корреляционный анализ не показал связи между массой смолы и биометрическими показателями ствола; коэффициент корреляции, вычисленный между массой смолы и высотой, равен -0,10, и между массой смолы и окружностью дерева -0,17.

4.4. Генетический полиморфизм клонов плюсовых деревьев сосны обыкновенной. По результатам анализа ДНК было установлено 170 амплифицированных ^БЛ-фрагментов ДНК, из которых 147 фрагментов оказались полиморфными, что составляет 86,47% от общего их количества (табл. 4.3).

Таблица 4.3

Основные показатели генетического полиморфизма сосны обыкновенной на КМУ

Показатели генетического полиморфизма В среднем в выборке

Полиморфность (Р), % 86,47

Наблюдаемое число аллелей (№) 1,8647

Эффективное число аллелей (Ые) 1,4459

Генетическое разнообразие по Нею (Н) 0,2711

Индекс Шеннона (I) 0,4152

Число амплифицированных фрагментов ДНК в выборке варьировало в зависимости от праймера от 22 до 36, а их размеры составляли от 170 до 2130 пар нуклеотидов. Показатели генетического полиморфизма, приведенные в таблице 4.3, говорят о том, что уровень генетической изменчивости изученных клонов плюсовых деревьев на КМУ можно охарактеризовать как достаточно высокий. Данные показатели превышают значения этих параметров, установленные для разных популяций сосны обыкновенной по ^БЯ-маркерам.

5. ОТБОР ЦЕННЫХ ГЕНОТИПОВ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ

5.1. Отбор быстрорастущих клонов плюсовых деревьев. Анализ ценности клонов проводился на основе комплексного изучения признаков вегетативной сферы с использованием кластерного анализа. Кластерный анализ позволил сгруппировать все клоны в три кластера. В первом кластере сгруппированы 14 клонов, во втором — 26 клонов, в третьем — 13 клонов (рис. 5.1).

'Л *л»с*«р 5 вл.стер

Рис. 5.1. Дендрограмма сходства клонов плюсовых деревьев по показателям роста (высоте, окружности ствола и ширине кроны)

Клоны, отнесенные к разным кластерам, имеют различия по высоте, окружности ствола и протяженности кроны (табл. 5.1). В первый кластер вошли отстающие в росте клоны, средняя высота которых составила 5,8 м, окружность ствола 33,2 см, протяженность кроны в ряду 3,4 м и между рядами 3,3 м. Самые быстрорастущие клоны были отнесены в третий кластер, их средняя высота составила 6,5 м, окружность ствола - 42,0 см, протяженность кроны в ряду - 4,1 м, а в междурядьях - 3,9 м. Во второй кластер вошли клоны со средними показателями.

Таблица 5.1

Характеристика кластеров, выделенных по показателям роста

Признак Среднее значение ± Коэффициент Достоверность

стандартная ошибка вариации, % различия, Ь

1 кластер

Высота, м 5,8±0,12 8,3 3,8*

Окружность ствола, см 33,2±1,11 12,6 8,8**

Протяженность кроны, см:

в ряду 2,6±0,08 10,9 12,5**

между рядами 2,4±0,08 12,8 11,7**

2 кластер

Высота, м 6,1±0,07 6,0 2,7*

Окружность ствола, см 38,9±0,51 6,7 3,2*

Протяженность кроны, см:

в ряду 3,4±0,04 5,4 7,1**

между рядами 3,3±0,05 8,0 5,8**

3 кластер

Высота, м 6,5±0,13 7,6 -

Окружность ствола, см 42,СЬЮ, 81 7,0 -

Протяженность кроны, см:

в ряду 4,1±0,09 7,9 -

между рядами 3,9±0,10 9,1 -

* На уровне значимости 0,01.

** На уровне значимости 0,001

Клоны третьего кластера имеют достоверно большее значение высоты, окружности ствола и протяженности кроны по сравнению с первым (1с1 от 3,8 до 12,5) и вторым кластерами Ос) от 2,7 до 7,1). Математически значимые отличия по показателям роста клонов третьего кластера позволяют их обоснованно выделить в группу перспективных и рекомендовать их использовать при создании лесосеменных плантаций повышенной генетической ценности и целевых плантаций.

5.2. Отбор высокосмолопродуктивных клонов плюсовых деревьев. Важным в хозяйственном отношении признаком является смолопродуктивная способность деревьев. Проведенные исследования показали, что клоны сильно различаются по смолопродуктивности, что

позволило все клоны сгруппировать в 5 категорий смолопродук-тивности. Такая высокая индивидуальная изменчивость клонов создает предпосылки для выделения ценных высокосмолопродуктивных клонов. Было установлено, что средняя масса смолы у групп клонов, отнесенных к разным категориям смолопродуктивности, варьирует от 0,18 до 3,12 г (табл. 5.2). Среднее значение массы живицы у групп клонов, имеющих высокую и очень высокую смолопродуктивность, достоверно выше по сравнению со средним значением массы живицы у клонов других категорий, достоверность различия составляет от 7,0 до 26,8, что позволяет данные клоны выделить в качестве перспективных.

Таблица 5.2

Статистические показатели массы живицы у групп клопов, принадлежащих _ к разным категориям смолопродуктивностн_

Категории смоло-продукти вности Кол-во генотипов Статистические показатели Достоверность различия. ь'

Х±8, ггнп шах V, % Р, %

Очень низкая 49 0,18±0,02 0,01 0,48 77,8 11,11 26,8 14,9

Низкая 22 0,71 ±0,03 0,5 0,91 19,7 4,23 18,2 11,2

Средняя 12 1,27±0,03 1,13 1,45 9,5 2,36 7,0 9,2

Высокая 7 1,62±0,05 1,51 1,87 8,0 3,09 _ 7,3

Очень высокая 10 3,12±0,2 2,25 4,6 23,7 7,69 7,3

* На уровне значимости 0,001.

Таким образом, по результатам изучения смолопродуктивности клонов плюсовых деревьев было выделено 17 высокосмолопродуктивных клонов сосны обыкновенной. Отобранные клоны могут быть рекомендованы для лесосырьевой базы повышенной биологической смолопродуктивности, что значительно повысит технико-экономические показатели на добыче живицы.

5.3. Отбор высокоурожайных клонов плюсовых деревьев.

Основная задача лесосеменных плантаций заключается в массовом получении улучшенных семян. Поэтому весьма важно, чтобы на ЛСП были представлены высокоурожайные клоны.

Кластерный анализ показал, что все исследованные клоны по сходству изученных признаков репродуктивной сферы можно разделить на 3 группы (рис. 5.2). Характеристика выделенных групп клонов дана на рисунке 5.3. Клоны первого кластера характеризуются средними значениями признаков, клоны второго кластера имеют значения всех признаков выше среднего, и для клонов третьего кластера свойственны самые низкие значения изученных признаков.

JrV~i ri^ ¡3» Ггч cSa i-H

Рис. 5.2. Дендрограмма сходства клонов плюсовых деревьев по признакам репродуктивной сферы

2.0 1.6 1 .о

0.5 о.о -0.5

—о- Cluster 1 - о - Cluster 2 Cluster 3

Рис. 5.3. Характеристика групп клонов, выделенных по признакам репродуктивной сферы

С точки зрения обеспечения высоких урожаев на лесосеменных плантациях с целью повышения экономического эффекта данных объектов можно считать наиболее перспективными клоны 1 и 2 кластеров. Доля урожайных клонов составила 62,3%.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Уровень генетического разнообразия плюсового генофонда сосны обыкновенной, представленного клонами плюсовых деревьев и оцениваемого на основе анализа ISSR-фрагментов ДНК, не уступает уровню генетического разнообразия, выявленному в насаждениях из этих же географических районов. Полученные данные говорят о том, что при проведении отбора по фенотипу не происходит снижения из-

менчивости ^БЛ-маркеров, и, следовательно, данный вид маркеров является селективно нейтральным.

2. Было установлено, что уровень изменчивости ^БЯ-участков ДНК не зависит от селекционной категории семян. Партии семян с высокими и низкими показателями генетической изменчивости присутствовали как среди нормальных, так и среди улучшенных семян. При этом значения обобщенных показателей генетических параметров для семян улучшенной и нормальной селекционных категорий оказались близкими, что также подтверждает низкую эффективность использования ¡ЗБЯ-маркеров в селекционном процессе.

3. Видовой уровень генетической изменчивости сосны обыкновенной в районе исследования, оцениваемый с использованием маркеров, характеризуется следующими параметрами: доля полиморфных локусов - 97,2%, число наблюдаемых аллелей - 1,972, число эффективных аллелей - 1,426, генетическое разнообразие по Нею - 0,266 и индекс Шеннона — 0,417.

4. Значения генетической дистанции (0,011 - 0,079), доли межпопу-ляционного разнообразия (вэ! = 0,096...0,250) и генного потока (Иш = 1,50...4,71) свидетельствуют о незначительной генетической изолированности сосны обыкновенной в изученных лесосеменных районах и подрайонах, что вполне ожидаемо в связи с особенностями системы размножения вида (ветроопыляемый вид, у которого пыльца легко распространяется на дальние расстояния). Следовательно, включенные в анализ лесосеменные подрайоны могут быть поставщиками семян друг для друга.

5. В результате исследований был выявлен высокий полиморфизм клонов плюсовых деревьев сосны обыкновенной на КМУ из Республики Марий Эл по росту, семеношению, смолопродуктивности и по маркерам. Выявленная большая генетическая и фенотипическая неоднородность клонов является предпосылкой для проведения селекционного отбора и выделения ценных генотипов для использования при реконструкции существующих и закладке новых ЛСП.

6. Выявленные границы фенотипической изменчивости и использование методов математического анализа позволили выделить группу ценных клонов, для которых характерны достоверно лучшие значения селектируемых признаков. Доля таких клонов составляет при селекции на быстроту роста 24,5%, на смолопродуктивность - 17% и на урожайность — 62,3%. Селекционный эффект при селекции на быстроту роста составил 106,6- 120,0%, на смолопродуктивность-301,2%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для создания ЛСП ПГЦ в Приволжском лесосеменном районе в подрайоне Марийский рекомендуется использовать 13 клонов плюсовых деревьев, отобранных по результатам комплексной оценки параметров роста: 186, 173, 184, 172, 146, 182, 206, 257, 176, 245, 263, 191, 60. Ожидаемый селекционный эффект по высоте составляет 6,6%.

2. Отстающие в росте клоны (181, 179, 154, 237, 148, 156, 200, 224, 274, 255, 198, 226, 223 и 61) нецелесообразно использовать в семеноводческих целях до тех пор, пока они не пройдут полную оценку в испытательных культурах.

3. Генетические исследования показали, что потомство 13 клонов, которые были отселектированны по скорости роста, не могут обеспечить сохранение генетического разнообразия установленного для насаждений и ЛСП 1 порядка в регионе исследования. Поэтому необходимо следовать Указаниям по лесному семеноводству в РФ (2000) и проводить дополнительные исследования по отбору ценных клонов, так как для создания ЛСП повышенной генетической ценности должно быть использовано не менее 50 плюсовых деревьев.

4. Для создания искусственной лесосырьевой базы повышенной биологической смолопродуктивности или включения в состав ЛСП как резистентных к корневым патогенам рекомендуется использовать 17 высокосмолопродуктивных генотипов: 171/11, 272/2, 157/2, 173/4, 154/5, 210/6, 191/6, 148/9, 198/8, 230/1, 172/7, 229/2, 181/2, 229/4, 184/7, 269/15, 175/3. Ожидаемый селекционный эффект составляет 301,2%.

5. Для обеспечения высоких и стабильных урожаев с целью повышения экономического эффекта при создании новых ЛСП целесообразно использовать 43 урожайных клона: 60, 192, 201, 195, 198, 114, 146, 210, 206, 272, 229, 244, 111, 239, 147, 155, 177, 191, 189, 255, 199, 257, 19, 188, 263, 230, 181, 109, 176, 101, 153, 193, 200, 154, 243, 242, 158, 270, 179, 187, 175,205,274.

6. Малоурожайные клоны (112, 143, 228, 223, 269, 271, 207, 273, 242, 250, 224, 245, 113, 251, 203, 157, 240, 226, 227, 156, 186, 185, 171, 184, 172, 173) нецелесообразно включать в состав ЛСП, так как это приведет к снижению общей семенной продуктивности плантаций и, следовательно, к снижению экономической эффективности.

7. Результаты оценки генетической дифференциации ЛСП и насаждений из Марийского и Мордовского-Чувашского подрайонов Приволжского лесосеменного района и Пензенско-Ульяновского подрайона Средне-Волжского лесосеменного района позволяют рекомендовать их в качестве поставщиков семян друг для друга.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ АВТОРОМ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Научные статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ:

1. Криворотова, Т. Н. Генетическая структура лесосеменных плантаций и насаждений сосны обыкновенной в Среднем Поволжье / Т. Н. Криворотова, О. В. Шейкина // Вестник ПГТУ. Сер.: Лес. Экология. Природопользование. 2014. №1. с. 77-86.

2. Оценка клоновых потомств плюсовых деревьев сосны обыкновенной на коллекционно-маточном участке Республики Марий Эл / Т. Н. Криворотова, Е. В. Прохорова, О. В. Шейкина, П. С. Новиков // Известия Оренбурского государственного аграрного университета. Сер.: Агрономия и лесное хозяйство. 2013. №1 (39). С. 18-20.

3. Милютина, Т. Н. Молекулярно-генетические исследования изменчивости клонов плюсовых деревьев pinus sylvestris по lSSR-маркерам / Т. Н. Милютина, О. В. Шейкина, П. С. Новиков // Хвойные бореальной зоны. 2013. №1-2 (XXXI). С. 102-105.

Публикации в других научных изданиях:

4. Криворотова, Т. Н. Генетическая структура лесосеменных плантаций и насаждений сосны обыкновенной в Среднем Поволжье / Т. Н. Криворотова, О. В. Шейкина // Лесовосстановление в Поволжье: состояние и пути совершенствования: сборник статей. Йошкар-Ола: ПГТУ, 2013. С. 246-249.

5. Криворотова, Т. Н. Анализ генетической изменчивости двухлетних сеянцев сосны обыкновенной в Чувашской Республике / Т. Н. Криворотова, О. В. Шейкина // Лесовосстановление в Поволжье: состояние и пути совершенствования: сборник статей. Йошкар-Ола: ПГТУ, 2013. С. 241-245.

6. Милютина, Т. Н. Молекулярно-генетические исследования плюсовых деревьев сосны на коллекционно-маточном участке / Т. Н. Милютина, П. С. Новиков, О. В. Шейкина // Лесные экосистемы в условиях изменения климата: биологическая продуктивность, мониторинг и адаптационные технологии: материалы международной конференции с элементами научной школы для молодежи [Электронный ресурс]. Йошкар-Ола: МарГТУ. 2010. С. 81-84. URL: http://csfm.marstu.net/publications.htrnl

7. Милютина, Т. Н. Молекулярно-генетические исследования плюсовых деревьев сосны обыкновенной / Т. Н. Милютина, П. С. Новиков, О. В. Шейкина // Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира: сборник статей по материалам III Всероссийской научно-практической конференции, Волгоград, 4-6 августа 2010 г. Волгоград: AVATARS, 2010. С. 334-338.

8. Милютина, Т. Н. Генетическая паспортизация плюсовых деревьев Pinus sylvestris / Т. Н. Милютина, П. С. Новиков, О. В. Шейкина // Россия в глобальном мире: вызовы и перспективы развития. Четырнадцатые Вавилов-ские чтения: материалы постоянно действующей Всероссийской междисциплинарной научной конференции с международным участием: в 2 ч. / под общ. ред. проф. В.П. Шалаева. Йошкар-Ола: МарГТУ, 2011. Ч. 2. С. 227-228.

9. Милютина, Т. Н. ISSR-анализ, как метод изучения генетического разнообразия сосны обыкновенной / Т. Н. Милютина, П. С. Новиков,

0. В. Шейкина // Научному прогрессу - творчество молодых: сборник материалов международной молодежной научной конференции по естественнонаучным и техническим дисциплинам, 15-16 апр. 2011: в 3 ч. Йошкар-Ола: МарГТУ, 2011. 4.3. С. 29-30.

10. Новиков, П. С. Молекулярно-генетические исследования плюсовых деревьев сосны на архиве клонов / П. С. Новиков, Т. Н. Милютина, О. В. Шейкина // Лесные экосистемы в условиях изменения климата: биологическая продуктивность, мониторинг и адаптационные технологии: материалы международной конференции с элементами научной школы для молодёжи [Электронный ресурс]. Йошкар-Ола: МарГТУ, 2010. С. 100-104. URL: http://csfm.marstu.net/publications.html.

11. Новиков, П. С. Молекулярно-генетические исследования плюсовых деревьев сосны обыкновенной (Pinus sylvestris) ISSR-маркерами / П. С.Новиков, Т. Н. Милютина, О. В. Шейкина // Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира: сборник статей по материалам III Всероссийской научно-практической конференции. Волгоград, 4-6 августа 2010. Волгоград: Изд-во AVATARS, 2010. С. 339-343.

12. Шейкина, О. В. Исследования генетической изменчивости плюсовых деревьев Pinus sylvestris ISSR-маркерами / О. В. Шейкина, П. С. Новиков, Т. Н. Милютина // Биотехнология: состояние и перспективы развития: материалы VI Московского международного конгресса, Москва, 21-25 марта 2011 г. Ч.

1. М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2011. С. 292.

13. Новиков, П. С. Оптимизация проведения ПЦР-реакции при ISSR-анализе ДНК плюсовых деревьев сосны обыкновенной / П. С. Новиков, О. В. Шейкина, Т. Н. Милютина // Плодоводство, семеноводство, интродукция древесных растений: материалы XIV Международной научной конференции. Красноярск: СибГТУ, 2011. С. 79-81.

14. Шейкина, О. В. Молекулярно-генетические исследования плюсовых деревьев Pinus sylvestris на лесосеменной плантации в Пензенской области / О. В. Шейкина, Т. Н. Милютина, П. С. Новиков // Плодоводство, семеноводство, интродукция древесных растений: материалы XIV Международной научной конференции. Красноярск: СибГТУ, 2011. С. 127-130.

15. Новиков, П. С. Подбор ISSR-праймеров для фрагментного анализа ДНК сосны обыкновенной / П. С. Новиков, Т. Н. Милютина, О. В. Шейкина // Научному прогрессу - творчество молодых: сборник материалов международной молодежной научной конференции по естественнонаучным и техническим дисциплинам, 15-16 апр. 2011 г.: в 3 ч. Йошкар-Ола: МарГТУ, 2011. Ч. 3. С. 35-36.

Подписано в печать 21.10.2014. Усл. п.л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 5453. Редакционно-издательский центр ПГТУ. 424006 Йошкар-Ола, ул. Панфилова, 17