Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Фемтосекундные процессы разделения зарядов в реакционных центрах бактериального фотосинтеза
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Фемтосекундные процессы разделения зарядов в реакционных центрах бактериального фотосинтеза"

На правах рукописи

Яковлев Андрей Георгиевич

ФЕМТОСЕКУНДНЫЕ ПРОЦЕССЫ РАЗДЕЛЕНИЯ ЗАРЯДОВ В РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРАХ БАКТЕРИАЛЬНОГО ФОТОСИНТЕЗА

Специальность 03.01.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

Москва-2011

Работа выполнена в отделе фотобиофизики НИИ физико-химической биологии им Белозерского Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Научный консультант:

академик РАН, доктор биологических наук, профессор Шувалов Владимир Анатольевич

Официальные огтоненты:

доктор физико-математических наук, профессор

Крюков Петр Георгиевич;

доктор физико-математических наук, профессор

Пащенко Владимир Захарович;

доктор физико-математических наук

Чекалин Сергей Васильевич

Ведущая организация:

Институт химической физики им. H.H. Семенова РАН

Защита состоится « 24 » марта 2011 г.вМ ч. 00 м. на заседании Диссертационного совета Д 501.001.96 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, кафедра биофизики, аудитория «Новая».

Автореферат разослан « % » февраля 2011 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Ученый секретарь Диссертационного совета к.б.н.

М.Г. Страховская

РОССИЙЮКЛЖАЯ ГОСУДАРСТВБЮеИНАЯ

библиотбюрека 2011011

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Фотосинтез это глобальный биологический процесс преобразования солнечной энергии в энергию химически устойчивых соединений. Фотосинтез растении водорослей является основным источником кислорода органических соединений на Земле, которые служат для питания человека и животных п настоящее прсмя, а также запасены в виде ископаемых углеводородов. Солнечная энергия это практически неисчерпаемый экологически чистый вид энергии. Важность исследований процессов фотосинтеза является очевидной как с научной стороны, так и с прикладной.

Фотосинтез представляет собой совокупность сложнейших физических химических превращений, которые начинаются с поглощения квантов света в свстособнрающих комплексах хлорофилла. Затем энергия возбуждения передается па реакционные центры (РЦ) фотосинтеза, представляющие собой особые пигмент-белковые комплексы в составе клеточной мембраны. Создание лазерных спектрометров сверхвысокого временного разрешения в сочетании с методами направленного мутагенеза ir получением рентгеноструктурных данных о трехмерном строении ряда РЦ обусловило быстрый рост объема данных о первичных этапах фотосинтеза. Эти данные имеют фундаментальный характер формируют современные представления о мире. В результате серии быстрых реакций переноса электрона в РЦ происходит первичное преобразование световой энергии в энергию разделенных зарядов с феноменальной квантовой (-100%) высокой энергетической эффективностью. Универсальность структуры н функции РЦ всех известных фотоеннтезирующнх организмов заключается в том, что первичное разделение зарядов в этих РЦ происходит между сниглетио-возбуждепным первичным донором электрона Р и производными хлорофилла. В РЦ пурпурной бактерии Rhodobacter (Rba.) sphaeroides, которая является классическим объектом изучения, разделение зарядов происходит вдоль фотоактивной А-цепн пигментов заключается в переносе электрона от возбужденного димера бактернохлорофнлла Р* па бактернофеофнтнн НА за -3 пс и далее с 11А на хннон QA за -200 пс [Holten et al. 1980; Paschcnko et al., 1985; Kaufmann et al. 1975; Hockey et al., 19751.

Проблема участия молекулы мономерного бактернохлорофнлла Вд в качестве промежуточного акцептора в первичном разделении зарядов имеет многолетнюю историю и логично следует из положения ВА между Р и НА согласно рснтгеноструктурпым данным [Deisenlioler et al. 1984; Emilcr et al. 1994]. В течение долгого времени в большом количестве лидирующих лаборатории не удавалось получить убедительные

доказательства прямого участия ВА в разделении зарядов. Во многом благодаря этому возникло представление о виртуальном участии вакантного электронного уровня ВА, находящегося выше уровня Р*, в переносе электрона от Р на НА по механизму суперобмена. Результаты пико- и фемтосекундноп спектроскопии постепенно привели к пониманию оснооной сложности обнаружения состояния Р*ВА , которая связана с тем, что время образования Р*ВА в несколько раз превышает время его распада из-за переноса электрона с ВА на HA [Holzapfel et al. 1989, Arlt et al. 1993]. Это приводит к малой заселенности состояния Р+ВА в течение всего времени его существования, которое не превышает нескольких пс. Другая сложность связана с тем, что в видимом диапазоне, где проводилось подавляющее большинство измерений, спектр состояния PfBA сильно замаскирован спектрами других состояний. Получить убедительное доказательство существования состояния Р+ВА удапалось только в химически модифицированных РЦ, п которых блокирование переноса электрона па НА приводило к накоплению состояния Р+ВА в пнкосекундпом диапазоне [Kennis et al. 1997]. Тем не менее, вопрос об участии молекулы ВА в переносе электрона в нативпых РЦ оставался во многом открытым.

ближайшее окружение молекулы ВА может влиять на первичное разделение зарядов, динамически воздействуя на уровень свободной энергии состояния Р+ВА" или являясь составной частью пути переноса электрона. Интересной практически неизученной стороной этой проблемы является влияние молекулы воды, обнаруженной недавно в непосредственной близости ог ВА [Ermlcr et al., 1994]. Другим важным аспектом является выявление механизма существенного влияния молекулы тирозина М210, расположенной вблизи ВА, на первичное разделение зарядов [Hamm cl al, 1993]. Кроме того, движение ядерной подсистемы, па фоне которого происходит перепое электрона, также влияет па параметры первичной реакции разделения зарядов [Vos et al. 1991, 1993]. Для решения вопроса об участии определенных мод этого движения в разделении зарядов в РЦ необходима прямая регистрация первичного состояния фотопродукта методами фемтосекундноп спектроскопии.

Цели н щдачн исследования. Целью данной работы было исследование вовлеченности молекулы бактернохлорофнлла ВА ее ближайшего окружения первичную (физическую) фазу разделения зарядов в РЦ бактериального фотосинтеза. В работе были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать участие молекулы бактернохлорофнлла Д-ненн ВА в первичном разделении зарядов п РЦ пурпурной бактерии Rhodobacter (Rba.) sphaeroides R-26 п зеленой бактерии Chloroßcxus (Cfx). auranticicus, для чего:

а) Определить взаимное расположение уровней свободной энергии первичного состояния с разделенными зарядами Р*Вд~ и возбужденного состояния днмера бактернохлорофилла Р* в РЦ ИЬа зрИаего1с1ех Я-26;

б) Исследовать динамику формирования и распада ИК полосы поглощения аниона бактернохлорофилла Вд~ в процессе первичного разделения зпрядов в РЦ.

2. Исследовать влияние молекулы кристаллографической воды НОН55, входящей в состав РЦ ЯЬа. хр!гаего1с!ез 11-26, на процессы первичного разделения и переноса зарядов.

3. Исследовать роль тирозина М210 в процессе первичного разделения зарядов стабилизации разделенных зарядов в РЦ ЛЬа. зрИаего1с1ез [1-26 и п РЦ мутантов по этому сайту.

4. Экспериментально и теоретически исследовать влияние коллективных движений ядерной подсистемы на процессы первичного разделения зарядов в РЦ фотоепптезпрующнх бактерий, для чего:

а) Исследовать влияние коллективных движений ядер на населенности состояний с первично разделенными зарядами при фсмтосекундном световом возбуждении;

б) Провести теоретическое моделирование первичного разделения зарядов с учетом движений ядерного волнового пакета, который формируется при фсмтосекундном возбуждении РЦ;

в) Исследовать возможность когерентного переноса электрона в малоактивную В-цспь пигментов РЦ.

Научная новизна работы.

1. В результате исследования фемтосскунднон динамики И К полосы поглощения аниона мономерного бактернохлорофилла в А-цени Вд впервые получено прямое доказательство реального участия Вд » первичном разделении зарядов в нативиых РЦ Я.Ьа. $рИаего!(}е5 Я-26 и С/х. аигаШшсш. Аналогичный вывод сделан и в отношении ряда мутаптных РЦ

Таким образом, Вд является первичным акцептором электрона, а состояние Р+Вл - первичным состоянием с разделенными зарядами в этих РЦ.

2. По результатам исследования температурной зависимости замедленной флуоресценции фсофптнн-молпфпцнрованпых РЦ ЯЬа. зрИаегокЛез Я-26 найдено, что уровень свободной энергии перпичного состояния с разделенными зарядами Р+Вд находится ниже уровня свободной энергии возбужденного состояния днмера Р* на -550 см"1 Положение уровня свободной энергии Р+Вд~ ниже аналогичного уровня Р* создает условия для реального участия молекулы Вд в переносе электрона от Р*

3. Впервые получены прямые экспериментальные доказательства влияния коллективных движении ядер (в форме волнового пакета) в возбужденном состоянии днмера Р* на первичное разделение зарядов в натнвных и мутантных РЦ Rba. sphaeroides н в нативных РЦ Cfx. auranliacus. Показано, что обнаруженные осцилляции нассленностен первичных состоянии с разделенными зарядами отражают обратимые переходы полнового пакета ядер с поверхности потенциальной энергии Р* на аналогичные поверхности фотопродуктов. Выявлены характерные моды ядерных движений, сопряженные с переносом электрона.

4. Впервые показано, что молекула кристаллографически определенной поды НОИ55, расположенная вблизи бактернохлорофнлла Вл в РЦ Rba. sphaeroides, оказывает сильное влияние на перенос элеюропа от днмера бактернохлорофнлла Р к Вл. Присутствие воды HOI155 ускоряет первичное разделение зарядов в -4 раза, а ее вращение, регистрируемое при фсмтосекундном возбуждении Р, модулирует населенность состояния Р*Вл~ с частотой 32 см"1 и кратными частотами. Анализ влияния поды НОН55 па перенос электрона с помощью мутантов по сайту М203 выявил одни из возможных наиболее эффективных путей переноса электрона от Р к Вд с участием НОН55 по цепочке полярных групп атомов N-Mg(Pn) -N-C-N(HisM202)-HOH55-O=(BA).

5. Выявлена ключевая роль тирозина М210, находящегося вблизи днмера мономерного бактернохлорофнлла ВЛ в РЦ Rba. sphaeroides, в процессе первичного разделения зарядов стабилизации разделенных зарядов. Впсрпыс показано, что замедление первичной реакции переноса электрона в десятки раз » мутантных РГД, не содержащих тирозин М210, сопровождается отсутствием стабилизации разделенных зарядов в состоянии Р+ВЛ~ Показано, что отсугствие тирозина М210 в мутантных РЦ не компенсируется его введением в положение M197 увеличением разницы спободпой энергии состояний Р* и РЧ1Л Выявлено стабилизирующее влияние полярной ОН-группы тирозина M2I0 на состояние Р*ВЛ в процессе разделения зарядов в тнро знн-содержащих РЦ.

6. Впервые в мутантных РЦ Rba. sphaeroides и в РЦ Cfx auranliacus обнаружен обратимый перенос электрона малоактивную В-цень, вызнанный когерентным движением ядерного волнового пакета. Этот перенос возникает раньше на 60-80 фс, чем аналогичный когерентный перепое электрона п фотоактиппой Л-цепи. Возникновение когерентного переноса электрона в В-цепн не зависит от наличия или отсутствия условий для обычного, некогерентного переноса, а определяется п основном динамикой волнового пакета.

Научная н практическая значимость. Работа имеет выраженную фундаментальную направленность. Получена новая информация о самых ранних стадиях процессов преобразования световой энергии в энергию состояний с разделенными зарядами в реакционных центрах бактериального фотосинтеза. Полученные результаты имеют приоритетный характер и во многом задают направление исследований в данной области. Работы по выявлению участников первичного разделения зарядов в РЦ, исследования по когерентному переносу электрона в обеих цепях РЦ, изучение роли ближайшего окружения первичного донора Р и акцептора Вд в разделении зарядов между ними - все эти направления находятся в русле мировых исследований. Данные по участию мономера бактериохлорофилла Вд в первичном разделении зарядов, по когерентным оецнлляцням в первичных состояниях с разделенными зарядами, по влиянию кристаллографической воды НОН55 в переносе электрона, по ключевой роли тирозина М210 в стабилизации первично разделенных зарядов, по обратимому переносу электрона в неактивную В-цепь получены впервые. Полученные результаты могут найти применение при моделировании живых систем и создании преобразователей солнечной энергии. Основные положении, hi.ihociimi.ic и» защиту.

1. Мономер бактериохлорофилла Вл является первичным акцептором электрона в РЦ Rba. sphaeroides п C-fx. auranliacus, участвуя в двухступенчатой схеме переноса электрона от возбужденного днмера бактериохлорофилла Р* к Вд и далее от ВЛ

к бактернофеофптнну Ид. Этому способствует положение уровня свободной энергии состояния Р+ВЛ ниже аналогичного уровня Р* на -550 см"1

2. Коллективные движения ядер влияют па первичное разделение зарядов в РЦ Rba. sphaeroides и Cfx. auranliacus и визуализируются в виде осцилляции, возникающих в результате фсмтосскундиого возбуждения РЦ в населснностях первичных состояний с разделенными зарядами населенности возбужденного состояния днмера Р* Временные спектральные особенности данных осцилляции отражают движение ядерного волнового пакета по поверхностям потенциальной энергии указанных состояний. Теоретическое моделирование коллективных ядерных движений с помощью теории Рслфнлда в приближении двух независимых координат объясняет осциллирующий характер процессов первичного разделения зарядов и формирования соответствующих состояний с разделенными зарядами в РЦ.

3. Молекула воды 1101155, расположенная РЦ Rba. sphaeroides между днмером бактериохлорофилла Р и мономером бактериохлорофилла Вд, ускоряет перепое электрона от Р* к Вд, который может происходить по цепи полярных групп атомов N-Mg(Pn) -N-C-N(IIisM202) -I I0H55-0=(B,\). Вращение этой молекулы, выявляемое при

фемтосскундном свстсшом возбуждении днмера Р, происходит с фундаментальной частотой 32 см"1 и приводит к появлению моды 32 см"1 и ее обертонов в осцилляцнях кинетики полосы поглощения аннона бактерпохлорофилла Вд~ при 1020 им. 4. Тирозин М210, находящийся вблизи димера бактерпохлорофилла Р мономера бактерпохлорофилла ВА п РЦ Rba. sphaeroides, играет ключевую роль процессе первичного разделения зарядов стабилизации разделенных зарядов в этих РЦ. Отсутствие тирозина М210 в мутаптных РЦ приводит к значительному замедлению первичного разделения зарядов отсутствию стабилизации разделенных зарядов. Взаимодействие полярной ОН-группы ТугМ210 с заряженными молекулами Р+ и Вл ускоряет разделение зарядов между ними и стабилизирует состояние Р+Вд* в патпвных РЦ Rba. sphaeroides.

Апробации результатов. Основные результаты диссертации отражены в 37 публикациях и доложены на рабочем совещании « Реакционные центры фотосинтстнческнх бактерий: структура и динамика» (Фелдафинг, Германия, 1995); XI международном конгрессе по фотосинтезу (Будапешт, Венгрия, 1998); па XI международном симпозиуме «Сверхбыстрые явления в спектроскопии» (Тайпей, Тайвань, 1999); па 60-ом ежегодном Тимирязевском чтении (Москва, 1999); XII международной конференции

«Сверхбыстрые процессы в спектроскопии» (Флоренция, Италия, 2001); на III съезде Российского биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); па III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); на 13-ом международном конгрессе по фотосинтезу (Монреаль, Канада, 2004); на 14-ой европейской конференции по биоэнергетике (Москва, 2006); па 3-сй Московской международной конференции по компьютерной молекулярной биологии (Москва, 2007); па международной конференции «Преобразование световой энергии при фотосинтезе (Пущппо, 2008); па 4-ой Московской международной конференции по компьютерной молекулярной биологин (Москва, 2009); на XIX Путинских чтениях по фотосинтезу и Всероссийской конференции "Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах" (Пущнио, 2009); 15-ом международном конгрессе по фотосинтезу (Пекин, Китай, 2010); на семинарах НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова и кафедры биофизики Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 37 работ (25 - в журналах и сборниках, 12 - в трудах конференции и конгрессов), список которых приведен п конце автореферата. Структур» и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 7 глав, заключения, выполов и списка цитируемой литературы. Материалы работы изложены на 263 страницах

машинописного текста, включая 69 рисунков. Список литературы содержит 368 библиографических ссылок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении формулируется актуальность темы, цель диссертационном работы, ее научная новизна, научная и практическая значимость, перечислены поставленные задачи, приводятся основные защищаемые положения.

Первая глава содержит аналитический обзор экспериментальных и теоретических работ по первичным процессам разделения зарядов в реакционных центрах фотосинтеза.

Реакционный центр (РЦ) бактериального фотосинтеза это пигмент-белковый комплекс в составе фотосинтетической мембраны, в котором световая энергия преобразуется в химическую энергию состояний с разделенными зарядами в результате серии быстрых реакций переноса электрона. Пространственная структура РЦ пурпурных бактерий Blastochloris (Rhodopseudomonas) viridis и Rhodobcicter (Rba.) sphaeroides изучена с помощью рептгеноструктурного анализа кристаллов РЦ [Deisenhofen et al. 1984]. РЦ Rba. sphaeroides состоит из трех белковых субъединнц с разной массой, обозначаемых как Н (тяжелая), L (легкая) М (средняя), и ряда кофакторов, вмонтированных в L М субъсднннцы. Эти кофакторы образуют две пространственно симметричные ветви, обозначаемые А В. Обе ветви начинаются с двух общих для них молекул бактернохлорофнлла (BChl), РА и PD, образующих первичный донор электрона, дпмер Р, расположенный вблизи псрнплазматнческой стороны мембраны. По мерс удаления от днмера в каждой ветви находится молекула мономерного BChl (Вд или Вп), молекула бактернофеофнтнна (BPhco) (НА »ли Нц) молекула хннона (Q,\ или Qn), которая находится в конце ветви вблизи цитоплазматнчсской стороны мембраны. Также и состап РЦ входит атом негемового железа молекула каротннондов. Фотохимически активной является только ветвь A [Kinnaier et al. 1985]. Установлено, что после светового возбуждения Р электрон переносится с первого спнглетиого возбужденного уровня Р* па Нд за -3,5 пс при комнатной температуре, образуя состояние P+HA" [Holten el al. 1980]. Этот перепое происходит при участии ВА. Механизм и степень этого участия дискутировались в течение последних 30 лет. Пнкосскупдные измерения спектров изменения поглощения ряда РЦ, выполненные в 1970-е голы, указали на возможность участия Вд в переносе электрона в качестве первого акцептора [Shuvalov, Fílimov, 1976; Shuvalov, 1978]. Вместе с тем, измерения кинстнк переноса электрона с разрешением 100-200 фс, выполненные в ряде более поздних работ, привели к противоположному выводу о том, что возможно лишь

виртуальное участие Вд в прямом переносе электрона от возбужденного днмера Р* к бактсриофеофнтнну Ид по механизму суперобмена[ Martin et al., 1986; Woodbury et al., 1985; Breton et al., 1986J. Сложность обнаружения состояния Р^Вд в нативных РЦ объясняется тем, что время его образования в несколько раз больше времени его распада, связанного с дальнейшим переносом электрона от ВЛ на I [л [Holzapfel et al., 1989, Arlt et al. 1993]. Дополнительная сложность связана с тем, что изменения в полосах поглощения ВА при 800 и 600 им при разделении зарядов маскируются изменениями в полосах поглощения Р, а также сдвигами и изменением формы этих полос. В фсофитни-моднфнцнрованных РЦ перенос электрона от Вд к Нд блокирован в пнкосскундиом масштабе времени при низких температурах, что приводит к накоплению состояния Р+Вд и значительно облегчает его регистрацию [Kennis et al., 1997]. Следующая ступень разделения зарядов заключается в переносе электрона с Нд на QA за -200 пс при комнатной температуре с образованием состояния P+Qa [Kaufmann et. al., 1975]. При криогенных температурах все реакции ускоряются в 2-3 раза. Квантовый выход процесса первичного разделения зарядов в целом близок к 1 как при комнатной, так и при низкой температуре [Wraight, Clayton, 1974]. Каждый новый этап переноса электрона сопровождается потерей свободной энергии в обмен на увеличение времени диссипации запасенной энергии от -300 пс в состоянии Р* до -0,1 с в состоянии PfQA На каждом следующем этапе электрон все дальше уходит от катиона Pf- расстояние между центрами молекул Р Вд, Р Нд, Р и QA равно соответственно 11, 16 25 ангстрем. Молекулы Р, В, И Q РЦ окружены аминокислотными остатками. Часть этих остатков имеет водородные связи с указанными хромофорами, другая часть находится в Ван-дер-ваальсовом контакте с ними. Взаимодействие белкового окружения с участниками первичного разделения зарядов очень важно при движении ядерной подсистемы вдоль координаты реакции переноса электрона. В состав РЦ также входит молекула кристаллографической воды НОП55, расположенная между Рв и ВА [Ermler et al., 1994]. В B-цепи РЦ находится симметрично расположенная молекула воды НОНЗО. Вода IIOI155 находится на расстоянии образования водородной связи как от кислорода П'-кстокарбопнльиой группы Вд, так и от атома азота остатка Iiis М202, который обеспечивает аксиальное лнганднроваине центрального атома магния BChI Pu. Таким образом, имеется прямая пространственная связь между Рц и ВА через IIÜH55 и Iiis М202.

РЦ термофильных зеле и Iii х бактерий Chloruflexus (Сfx.) auraniiacus имеют в своем составе 3 молекулы ВСЫ, 3 молекулы BPhco, 2 молекулы менахниона QA и Qu и атом марганца (Blankcnship et al. 1983]. Большое количество данных по структуре полннентндов, спектроскопии и расчеты жеитоипого взаимодействия указывают на го, что кофакторы в

РЦ Cfx. auranliacus образуют две цепи пигментов, как и в РЦ Rba. sphaeroides [Vasmel et al., 1983]. Первичным донором электрона в РЦ Cfx. auranliacus является димер ВСЫ. Фотохимически активная А-цепь содержит молекулу BCIil ВА, молекулу BPhco НА в качестве промежуточного акцептора электронов молекулу QA. В-цепь в РЦ Cfx. auranliacus содержит две молекулы BPlieo, Фп и Нв, и молекулу Qn, причем Фв находится в положении Вв. Трехмерная структура этих РЦ до сих пор неизвестна. Распад возбужденного состояния Р* РЦ Cfx. auranliacus происходит с постоянной времени 7 пс при 296 К, а при 10 К в нем выделяют две компоненты с постоянными времени 2 и 24 пс [Feick et al. 1990J. Квантовый выход первичного разделения зарядов при 280 К и комнатной температуре близок к 1 [Volk et al., 1991]. Перенос электрона от НА" к первичному хннону QA происходит в РЦ Cfx. aurantiacus с константой времени -320 пс при 280 К [Kirmaicr et al. 1986]. Несмотря на схожесть с бактериальными РЦ в расположении хромофоров и фотохимии, РЦ Cfx. aurantiacus имеют ряд существенных отличий по составу белков и кофакторов.

Оптическая спектроскопия с фсмтосекундным временным разрешением позволяет исследовать ядерные движения кофакторов белка, которые могут вызывать сопровождать реакции переноса электрона. Идентификация когерентных сигналов колебаний или вращений молекулярных групп, связанных с рсдокс-хромофорамн молекулами окружения, может также дать информацию о возможных путях начального переноса электрона. Показано, что возбуждение Р в РЦ пурпурных бактерий сверхкороткими (<30 фс) лазерными импульсами с широким спектром приводит к осцилляциям в кииетнках спада стимулированного излучения Р* с частотами в диапазоне 10-400 см"' [Vos et al. 1991. 1992, 1993]. Такие же осцилляции были обнаружены в спонтанной флуоресценции РЦ. Эти данные объяснялись формированием и когерентным распространением ядерного полнового пакета на поверхности потенциальной энергии возбужденного состояния Р* Из-за того, что положение полкового пакета па поверхности потенциальной энергии зависит от времени, а также из-за относительного смещения поверхностей Р* и Р, полоса стимулированного излучения имеет коротковолновый ( около 900 им) и длнннополновый (930-940 им) максимумы. Осцилляции в обоих максимумах противоположны друг другу по фазе, по имеют одинаковые чпетоты. Когерентные компоненты были обнаружены в кннетиках пыцпетанпя сложной полосы при 800 им, имеющей вклад поглощения BA [Strcltsov et al., 1997]. Когерентные эффекты в динамике формирования состояния Р*НА РЦ Rba. sphaeroides наблюдались и кннетиках элсктрохромпого едпига мономера BCIil [Vos ct al., 2000].

Направленная модификация структуры белка в составе РЦ путем мутации гена, кодирующего его биосинтез, оказалась очень плодотворным направлением в изучении первичных процессов фотосинтеза. При сайт-специфическом мутагенезе происходит точечная замена только одного из оснований в ДНК, что приводит к направленной замене одних аминокислот в структуре белка на другие. Один из примеров работ в этом направлении - это изменение количества и локализации водород пых связен в димсрс Р с помощью комбинации мутаций HL168F, LM160H, LL131H, FM197H [Lin et al. 1994, Allen et al., 1996]. Для изучения процессов переноса электрона в В-цспн кофакторов, которая в иативных РЦ практически неактивна, используют комбинации различных мутаций, активирующих перенос электрона в B-цепи и тормозящих его в А-цепи. Сочетание методов направленного мутагенеза с фемтосекундной спектроскопией является одним из мощных инструментов в исследовании первичных реакций фотосинтеза.

Анализ работ показал необходимость дальнейшего исследования первичных процессоп бактериального фотосинтеза на качественно новом экспериментальном уровне. Прежде всего это касается окончательного выяснения роли мономера BClil ВЛ первичном переносе электрона от Р*. влияния ближайшего окружения Р Вд разделение зарядов между ними, выяснения роли В-цепн в первичном фотосинтезе. Для выполнения этих задач в данной диссертационной работе применено сочетание высокочувствительной спектроскопии поглощения с временным разрешением менее 30 фс и методов направленного мутагенеза.

Во второй глапс дано описание методов и объектов экспериментальных исследований. Для генетических манипуляций пыдслеиия реакционных центров использовались стандартные методики с небольшими изменениями [Васильева и др., 2001; Paddock et al. 1989; de Boer et al. 2002; Goldsmith, Boxer, 1996]. Низкотемпературные измерения при 90 К были выполнены па образцах, содержащих 65% глицерина. Оптическая плотность образцов составляла 0,5 при 860 им в кювете с длиной оптического пути I мм. Для поддержания состояния РВЛ! UQa в образцы добавляли 5 мМ дитноннта натрия.

Процесс дсйтсрировапия реакционных центров заключался в замене 11гО в буфере па D2O, для чего реакционные центры концентрировались мембране переносились в D2O буфер. Данная процедура повторялась дважды.

Замена молекулы бактериального фсофитина ИЛ » реакционных центрах Rba. sphaeroides R-26 на молекулу растительного фсофитина производилась следующим образом [Shkuropatov, Sluivalov, 1993]. РЦ в буфере 10 мМ Tris-MCI (pH 8,0), 0,1% ШЛО, 10% метанол, содержащем 20-кратиый избыток растительного феофитинг, были инкубированы в темноте при 42° С в течение 90 мин. Затем избыток свободных пигментов

удалялся хроматографией па DEAE - целлюлозе. Для контроля аналогичной процедуре инкубации и очистки подвергались те же РЦ в среде без растительного феофнтниа.

Спектры поглощения невозбужденпых образцов измерялись на спектрофотометре Shimadzu UV-1601 PC.

Фемтосскундные измерения изменении поглощения (свет - темнота) были выполнены при помощи лазерного спектрометра, созданного в отделе фотобиофизики НИИ ФХБ А.И. Белозерского МГУ Для генерации фсмтосекундных световых импульсов использовался лазер с синхронизацией мод па Ti-сапфире Tsunami, который непрерывно накачивался лазером па гранате Millennia (оба «Spectra Physics», США). Лазерные импульсы усиливались в 8-проходпом усилителе па Ti- сапфире («Авеста», Россия) и использовались для генерации континуума в смеси обычной и тяжелой воды (1:1). Малая часть континуума (-4%) использовалась для зондирования образцов. Для возбуждения образцов из основной части континуума с помощью фильтров вырезалась полоса с центром при 870 им. Длительность импульсов накачки и зондирования могла варьироваться от 16 до 30 фс. Оптический многоканальный анализатор («Oriel», Франция), сопряженный с полнхроматором, использовался для измерения спектров изменения поглощения с частотой 15 Гц. Задержка между импульсами возбуждения и зондирования устанавливалась с точностью I фс и варьировалась с переменным шагом 15100 фс. Временная дисперсия после дополнительной компенсации не превышала 30 фс в диапазоне 940-1060 им, а в диапазоне 735-790 им - 20 фс. Импульсы возбуждения и зондирования были почти полностью (> 95%) деполяризованы. Дифференциальные спектры поглощения являлись результатом усреднения 3000-10000 измерений для каждой задержки. Чувствительность спектрометра составляла (1-3)-10"5 единиц оптической плотности. Кинетики изменений поглощения (¿1/1) для узких спектральных полос в области -1020 и -760 нм были построены с использованием измеренных в максимумах амплитуд полос поглощения при дополнительном вычитании широкополосного фон: Этот подход отличается от обычных измерений кинстнк изменении поглощения при фиксированной длине волны относительно нуля. Данный метод позволяет строить кпистпкн формирования затухания «чистых» состояний с помощью регистрации выцветания или нарастания соответствующих относительно узких полос па фойе широких спектральных полос. Для аппроксимации экспериментальных кинетпк использовались полиномиальные пеосциллирующие кривые, которые находились математически. При изучении ранних процессов разделения зарядов такой подход более приемлем, чем стандартная аппроксимация экспонентами, которая использовалась только для оценки характерных времен различных процессов. Осциллирующие части кинстнк получались в

результате вычитания аппроксимирующих кривых из исходных кпнетпк анализировались при помощи преобразования Фурье для получения частотного спектра осцилляции. Нсосцнллиругащие кривые соответствовали минимальному шуму в спектрах Фурье и минимальной амплитуде оецнлляцнй.

Для возбуждения флуоресценции реакционных центров использовалось непрерывное излучение узкополосного титан-сапфирового лазера мощностью 100-200 мВт на длине волны 840 им, который накачивался аргоновым лазером («Spectra Physics», США). С помощью комбинации из цилиндрической и сферической линз лазерный луч, падающий па образец под углом 45°, имел форму полоски шириной I мм и высотой 12 мм. Флуоресценция собиралась под углом 90° к возбуждающему лучу, при этом отраженный возбуждающий свет блокировался. Образец толщиной 2 мм помещался в крностате между двумя пластинками из плексигласа диаметром 15 Спектр флуоресценции

регистрировался оптическим многоканальным анализатором («Oricl», Франция), сопряженным с полнхроматором с вертикальной щелыо. Величину флуоресценции нативпых фсофитип-молнфицироваппых реакционных центров Rba. sphaeroides определяли по амплитуде в максимуме ее спектра при 920 им.

Третья глава посвящена экспериментальному исследованию участия мономера бактерпохлорофилла (ВСЫ) Вл в первичном разделении зарядов в реакционных центрах пурпурной бактерии Rba. sphaeroides R-26 и зеленой бактерии Cfx. aurantiacus.

Для определения участия ВЛ в прямом переносе электрона ключевым вопросом является положение уровня свободной энергии состояния Р+ВЛ относительно уровня свободной энергии возбужденного состояния Р* Если уровень Р+ВЛ находится ниже уровня Р*, то позможеп обычный перенос электрона от Р* на ВЛ. Для определения разницы указанных уровней использованы фсофитнн-моднфицнроваппые РЦ Rba. sphaeroides R-26, в которых МЛ заменен на растительный фсофптин ФфЛ, в результате чего состояние Р*ВЛ становится долгоживущнм. В этих РЦ измерялась флуоресценция, появляющаяся при рекомбинации Р*Вд с образованием Р* Найдено, что температурная зависимость флуорссцепцнн фсофитин-модифицнровапиых РЦ с прсдвосстаиовлеппыми хннонамн имеет значительный полностью обратимый подъем с ростом температуры в диапазоне 95-200 К. Меньший подъем флуоресценции с ростом температуры наблюдается в фсофитнн-модифпцированных РЦ без восстановителя. В нативпых РЦ температурная зависимость флуоресценции не имеет подъема с ростом температуры. В рамках теоретической модели разделения зарядов в нативпых и фсофптнп-молнфнцкропанпых РЦ с учетом обратных переходов, рекомбинации и «быстрой» флуорссцепцнн получены температурные зависимости выхода флуоресценции. Аппроксимация экспериментальных

температурных зависимостей теоретическими позволяет сделать вывод о том, что в фсофнтии-моднфнцироваппых РЦ Rba. sphaeroides R-26 уровень Р*Вд находится ниже уровня Р* па -550 см"' Поскольку данная модификация не затрагивает молекулы ВА и Р, есть основания считать, что полученная оценка справедлива и для пативиых РЦ Rba. sphaeroides R-26.

Для прямого определения участия ВЛ в переносе электрона в РЦ Rba. sphaeroides R-26 п Cfx. anranliacits измерены спектры ДА в диапазоне 900-1070 им ( полоса вынужденного излучения Р* и полоса поглощения аниона ВА~) н 730-790 им (полоса поглощения НА) в диапазоне задержек 0 - 4 пс (с шагом 30 фс) относительно момента возбуждения Р при 90 К. Аналогичные измерения проведены для фсофитпн-модифицированных РЦ Rba. sphaeroides R-26, которых происходит накопление состояния Р+ВА в пнкосекундном диапазоне премепн, что облегчает исследование этого состояния. Впервые обнаружена слабая полоса поглощения ВА~ с центром при 1020 им в РЦ Rba. sphaeroides R-26 и при 1028 им в РЦ C/r. auranliacus, которая по своей форме идентична полосе поглощения ВА~ в феофнтпп-моднфицпровапных РЦ Rba. sphaeroides R-26 (рис. 1). Форма спектральное положение обнаруженной полосы остаются неизменными в диапазоне задержек 0 - 4 пс, однако амплитуда меняется во времени сложным осциллирующим образом (рис. 2). Первый, наиболее интенсивный максимум в оецнлляциях амплитуды полосы ВА наблюдается при задержке 120 фс, за ним следует ряд менее интенсивных максимумов. Полоса поглощения ВА полностью исчезает при задержках > 2,5 пс, что указывает па дальнейший переход электрона с ВА на 11А. После математического выделения оецнлляцнй в псосцнллпрующей части кинетики ¿1/1 при 1020 им можно видеть фазу роста с константой времени -0,2 пс, за которой следует фаза спада с константой времени -0,8 пс. В фсофитнп-модпфнцнрованпых РЦ наблюдается монотонный рост полосы поглощения ВА отражающий накопление состояния PfBA", который сопровождается затухающими осцилляцнямн. Это обстоятельство облегчает исследование оецнлляцнй при задержках > I пс. Спад вынужденного излучения Р* при 935 им в нативных фсофнтнп-моднфнцнровапных РЦ имеет основную константу времени -1,2 пс при 90 К и также сопровождается быстро-затухающими оецнлляцпямн (рис. 2). Эти осцилляции находятся в фазе с осцилляцнямн в полосе поглощения ВА Выцветание полосы поглощения МА при 760 им в нативных РЦ Rba. sphaeroides R-26 отражает появление электрона на НА с константой времени -1,2 пс при 90 К (рис. 2). Кинетика ЛА при 760 им имеет небольшой временной лаг -0,2 пс при 90 К, который указывает на задержку появления электрона па НА из-за его более раннего появления па ВА. Выцпетание полосы поглощения ПА при 760 им сопровождается слабыми

осцилляцнямн, которые примерно соответствуют нптегрпропашпо по прсмспк осцилляции полосы Вд , что указывает на эффективный перенос электрона от Вл на Нд.

Длина волны, нм

Рис. I Разностные (свет - темнота) спектры поглощения при некоторых фемтосскундных задержках для иатнвиых (а) и феофнтнн-модифнцнрованных (G) РЦ Rba. sphaeroides R-26, а также РЦ Cfx. aurantiacus (в), возбуждаемых при 90 К 25-фемтосекунднымн импульсами при 870 нм. Двойные стрелки показывают амплитуду полос, которая использовалась при построении кппстнк. Числа над кривыми - задержка в фс. Кривые смещены по вертикали для наглядности.

Спектры преобразования Фурье для оецнлляций при 935, 1020 760 нм содержат несколько полос имеют сложную форму (рис. 2). В Фурье-спектре осцилляции вынужденного излучения Р* при 935 им доминирует широкая полоса с центром при 130 см ', в которой можно выделить несколько более узких полос, разделенных интервалом -25-35 см 1 Отот спектр отражает, в основном, колебательные движения внугрн димера Р с основным периодом -250 фс [Vos et al., 1994, 1996, 1998]. В Фурье-спектре оецнлляций полосы Вд при 1020 им широкая полоса при 130 см 1 присутствует наряду с более низкочастотны ми полосами, среди которых выделяется интенсивная полоса при 32 см"1, соответствующая периоду осцилляции I не (рис. 2). Мода при 32 см 1 особенно выделяется в оецнлляцнях полосы Вд фсофнтпп-модпфпцпрованных РЦ, где она является доминирующей. Фурье-спектр оецнлляций полосы Пд при 760 им содержит, в оснопном, ряд узких полос в диапазоне 10-120 см"1, среди которых выделяется полоса при 32 см '.

Таким образом, мода ядерных движений 130 см"1 имеет сопряжение с реакцией Р* —» Р'Вд", а мода 32 см-1 - с реакцией Р*ВЛ —» Р*На~

4001 Частота, см"

Частота, см'

1020 нм

Рис. 2. Кинетики АЛ (верхние кривые), их осциллирующая часть (средние кривые) и спектр Фурье-преобразования осциллирующей части (нижние кривые) полосы поглощения Вд при 1020 им, вынужденного излучения Р* при 935 нм и поглощения Мд при 760 нм нативиых РЦ /1Ьа. зр!\асгоШе$ 11-26, возбуждаемых прн 90К 25-фсмтосекунднымп импульсами при 870 нм. Числа - частоты максимумов Фурье-спектра.

0 200 400

Частота, см*1

В РЦ Cfx. auranliacus динамика полосы вынужденного излучения Р* при 940 им, поглощения Вд" при 1028 поглощения Нд при 750 им качественно схожа с

аналогичной динамикой для РЦ Rba. sphaeroides R-26. Фаза роста неосциллнрующей части кинетики А А при 1028 им имеет константу времени -1 пс при 90 К, а фаза спада имеет константу времени -5 пс. Время затухания Р* выцветания НА в РЦ Cfx. auranliacus при 90 К составляет -5 пс, что указывает на более медленное разделение зарядов по сравнению с РЦ Rba. sphaeroides. В полосе поглощения Вд при 1028 им регистрируются очень слабые осцилляции, частотный спектр которых имеет широкую полосу при -150 см"1 и ряд более узких полос при 35, 52 и 72 см" Осцилляции в полосе поглощения Нд имеют похожий набор частот, а в осцилляцнях полосы вынужденного излучения Р* преобладают частоты -150 см"1

Таким образом, полученные данные указывают на то, что первичное разделение зарядов в РЦ Rba. sphaeroides и Cfx. auranliacus происходит по двухступенчатой схеме Р* —* Р'Вд —* Р+Нд" [Schcnck et al. 1982] с непосредственным участием Вд. Этот классический, необратимый перепое электрона сопровождается обратимым, осциллирующим переносом, который связан с движением ядерного волнового пакета. Полученные данные позволяют конкретизировать движение волнового пакета по поверхностям потенциальной энергии различных состояний (рис. 3), которые для краткости обозначены далее как Р, Р\ Р+ВА и PfHA В натнвиых РЦ Rba. sphaeroides R-26 уровень Р'Вд находится ниже уровня Р* на -550 см"1, а уровень Р+НА находится ниже уровня Р* па 1500-2000 см"1 Поверхность Р*ВА пересекает поверхность Р* на ее правом, длинноволновом склоне недалеко от се дна, так что энергия активации реакции Р*—» Р*ВА пе превышает нескольких десятков см 1 Аналогично поверхность Р+МА пересекает поверхность Р+ВА вблизи се В точках пересечения происходит

расщепление поверхностей на верхнюю нижнюю. Энергетическая щель между расщепленными поверхностями Р* и Р*ВА составляет величину - 10-30 см"1 [Marcus, 1985; Parson et al. 1987]. Волновой пакет, образованный несколькими колебательными подуровнями, возникает на левом, коротковолновом склоне поверхности Р*, где его излучение имеет длину волны -900 После этого пакет начинает движение по поверхности Р* в сторону длинноволнового склона и через -120 фс достигает точки пересечения поверхностей Р* и Р+ВА В этот момент волновой пакет излучает при 935 им. В точке пересечения часть волнового пакета переходит поверхность Р+ВА сохранением когерентного движения, что сопровождается познпкновспнем полосы поглощения ВА При задержке -190 фс эта часть пакета, двигаясь по поверхности Р+ВА ,

Рис. 3. Упрощенная однокоордппатная схема движения ядерного полнопого пакета по поверхностям потенциальной энергии основного состояния РВдНд, возбужденного состояния Р*ВлНд н состояний с разделенными зарядами Р+Вд~НА и Р+ВАНА В тексте также используются сокращенные обозначения Р, Р*, Р+Вд~ и Р*Нд~

достигает се пересечения с поверхностью Р^Нд" и частично переходит на нес, вызывая увеличение выцветания полосы Ид. Основная часть пакета остается па поверхности Р* и, достигнув ее края, начинает движение в обратную сторону. Точка поворота пакета находится вблизи точки пересечения поверхностей Р* н Р*ВА При задержке -360 фс волновой пакет вновь оказывается вблпзп этой точки пересечения, события повторяются. Циркуляция волнового пакета сопровождается его затуханием раенлываинем нз-за процессов диссипации и релаксации. Реальное движение волнового пакета па каждой из поверхностей ноент сложный характер п происходит одновременно в разных направлениях па нескольких частотах, среди которых можно выделить, как минимум, две основные моды при 130 н 32 см"1 Относительный вклад различных мод в общую картину осцилляцнй в продукте определяется проекциями этих мод направление первичной реакции Р* —» Р+ВА Сложный характер движения пакета может быть следствием ангармоничности поверхностей может означать формирование многомодовых гиперповерхностей Неизменность формы полосы поглощения Вл во времени означает отсутствие смещения поверхностей Р*ВА и Р'(Вд")* по координате. В этом случае дпижеипе волнового пакета по поверхности Р*Вд не визуализируется, однако осцилляции в полосе поглощения НЛ подтверждают его присутствие па поверхности

Р+ВА Характер осцилляции п полосе поглощения ВА указывает па существенную обратимость переноса электрона, вызванного движением пакета с частотой 130 см-1 В принципе, коэффициент переноса волнового пакета с одной поверхности на другую запиент от времени его пребывания вблизи места переноса от ширины его энергетического спектра. Чем меньше время пребывания и чем шире спектр пакета по сравнению с шириной энергетической щели в точке расщепления поверхностей, тем меньшая часть пакета перейдет на другую поверхность. Для моды 130 см"1 характерное время пребывания волнового пакета вблизи пересечения поверхностей составляет -100 фс, а для моды 32 см"1 это время увеличивается до -600 фс, что обуславливает увеличение необратимости переноса электрона на этой частоте.

Согласно формуле Ландау-Зеисра вероятность однократного перехода квазнчастпцы с поверхности донора на поверхность акцептора р обратно пропорциональна ее скорости с1х/с11:

р = 1 -ехр(-2тгУ2/(П с1х/ск | с1и ,/с1х - сШ2/с1х|)). (1)

где V - энергия электронного сопряжения, сИУск и сЮг/сЬс - кривизна поверхностей донора и акцептора в точке их пересечения ^епег, 1932|. При малых ёх/Л величина р стремится к В значительной степени обратимый характер переноса электрона па частоте 130 см-1 означает, что вероятность обратного перехода волнового пакета с поверхности Р*ВА на поверхность Р* сравнима с 1. Анализ экспериментальных данных показывают, что для прямого и обратного перехода волнового пакета при задержке 120 фс величина р достигает 0, 8-0,9. Из этого следует, что скорость волнового пакета па обеих поверхностях Р* и Р'ВА вблизи точки пересечения поверхностен достаточно мала, что означает близость точек поворота к точке пересечения. Поскольку скорость осциллирующего движения пропорциональна частоте осцилляции, из (1) следует, что высокочастотные моды движения волнового пакета имеют меньшую вероятность перехода р, чем низкочастотные. Ого означает, что в оецнлляцнях продукта доля низких частот будет выше, чем в оецнлляцннх донора, что полностью подтверждается в эксперименте. Особенно ярко фильтрация низких частот оецнлляций проявляется в полосе поглощения вторичного продукта Нд Четвертая глиаа посвящена теоретическому моделированию дпнампкн переноса электрона в РЦ с помощью теории Редфилда [КесШеЫ, 1965| для случая сильной связи электронных состояний Р* и Р+ВА с двумя колебательными модами. Теория Редфилда в адаптации В.И I (оводережкнна позволила рассчитать когерентное движение электронно-колебательного волнового пакета между потенциальными поверхностями первичного донора и

фотопродукта. В модели учитывались 4 электронных состояния: основное состояние первичного донора Р, возбужденное состояние Р*, первичное состояние с разделенными зарядами Р+Вд~ и возбужденное состояние Р*(Вд )* Поверхности потенциальной энергии состоянии Р* Р^Вд" зависели от двух эффективных ядерных координат. Первая координата реакции была связана со смещением состояния Р* относительно Р, что приводило к формированию неравновесного колебательного состояния при возбуждении Р и к когерентным колебаниям волнового пакета с частотой 130 см 1 Смещение поверхности Р+ВЛ" вдоль второй координаты реакции создает колебательное движение с частотой 32 см-1 вдоль этой координаты. Это дополнительное движение создаст осцилляции на частоте 32 см"1 в состоянии Р+Вд которые накладываются па осцилляции с частотой 130 см проникающие в это состояние из состояния Р* За счет связи состояний Р* и Р'Вд мода 32 см"1 проникает на поверхность Р*, создавая осцилляции па этой частоте в кинетике стимулированного излучения Р* В расчетах достигнуто хорошее согласие с экспериментальными кнпетнкамн АЛ вынужденного излучения Р* и поглощения Вд~ (рис. 4). Расчеты показывают, что невысокий потенциальный барьер между состояниями Р* и

Время. пс

Рис. 4. Экспериментальные (точки, соединенные тонкой линией) и рассчитанные (толстые линии) кинетики изменений поглощения л фсофитнн-моднфицнрованиых РЦ на длинах волн 900, 935 (вынужденное излучение Р*) и 1020 (поглощение Вд") им.

Р+Вд вдоль координаты реакции, соответствующей моде 130 см"1, задает высокую скорость проникновения пакета в область продукта. Смещение пакета вдоль второй координаты, соответствующей моде 32 см-1, приводит к необратимому разделению зарядов. Из расчетов следует, что комбинация двух коллективных ядерных мод увеличивает скорость прямой реакции и уменьшает скорость обратной. Эффективность переноса электрона, определяемая конфигурацией потенциальных поверхностей донора и продукта, практически одинакова в случае когерентного и некогерентпого возбуждения. Наличие когерентных осцилляции в эксперименте лишь модулирует динамику переноса, но общая скорость остается такой же, как и в природном фотосинтезе (где когерентность отсугствует). Однако когерентные (и долгожнвущне) осцилляции помогают визуализировать вклады различных коллективных ядерных мод на разных стадиях реакции, в конечном счете, дают возможность определить осиопные координаты реакции конфигурацию соответствующих

потенциальных поверхностей. Относительно большие времена жизни оецнлляций связаны с переносом когерентности в процессе анбропной релаксации, включая перенос когерентности из одной моды п другую. Так, когерентные колебания вдоль первой координаты реакции, созданные импульсным возбуждением в области первичного донора, сохраняются и при движении пдоль второй координаты. Математически это связано с несскулярными членами в релаксационном тензоре Рсдфнлда. Эти члены ответственны также за связь когсрснтностей с насслснностямн внбронных уровнен.

Питии глава посвящена исследованию влияния молекулы кристаллографической воды НОН55, входящей в состав РЦ Rba. sphaeroides, на процессы первичного разделения и переноса зарядов. Интерес к воде НОН55 вызван тем, что она находится как вблизи Вд на расстоянии образования водородной связи от кислорода 13'-кстокарбонилыюй группы Вд, так и вблизи Рп на расстоянии образования водородной связи or атома азота остатка His М202 [firmier el « 1994]. Для решения поставленной задачи были взяты РЦ, в которых вода НОП55 отсутствовала или была заменена тяжелой водой, и проведено детальное сравнение результатов фемтосекупдпон спектроскопии с таковыми для контрольных обрпзцов РЦ, содержащих воду НОИ55. В мутанте GM203L Rba. sphaeroides основной результат замены Gly М203 па Leu состоит в стерическом удалении кристаллографической воды НОН55 за счет того, что Leu М203 занимает часть объема, принадлежащего воде MOI 155 в натнвных РЦ [Polier et al. 2005]. Данная мутация не оказывает заметных влияний на структуру РЦ. за исключением небольшого изменения коиформацнн His М202. Отсутствие воды НОН55 в мутанте GM203L также подтверждается измерениями резонансного рассеяния Романа, согласно которым п РЦ мутант; отсутствует взаимодействие по Н-связи с 131-кстокарбонилмюй группой в Вд.

Анализ кннстнк ДА п РЦ мутанта СМ203Ь показывает, что при 90 К спад стимулированного излучения Р* в его длинноволновом максимуме при 940 им имеет основную константу времени -4,3 пе (рис. 5, а), что почти в 4 раза больше таковой для нативных РЦ (см. рис. 2). Таким образом, мутация СМ203Ь приводит к существенному увеличению времени жизни Р+ Спад излучения Р* сопровождается выраженными осцилляцнями. Фурье-спектр этих осцнлляцнй в мутаптных РЦ отличается от такового для нативных РЦ (см. рис. 2) подавлением моды при 125 см"1 В мутанте йШОЗЬ впервые обнаружена полоса поглощения ВА при 1020 нм, которая возникает при задержке 113 фс после возбуждения Р в ответ на перенос электрона от возбужденного состояния Р* на Вл. (рис. 5, б). Этот процесс переноса электрона происходит обратимо, и при задержке 206 фс поглощение Вд существенно уменьшается. Следующее увеличение полосы поглощения при 1020 нм наблюдается при 331 фс. Как и в нативных РЦ, полоса прн 1020 нм в РЦ мутанта СМ203Ь существует не более 2-3 пс. В кинетике АА полосы поглощения Вл при 1020 им мутаптных РЦ па фоне сильных осцнлляцнй можно выделить фазу подъема и спада, как это имеет место и в нативных РЦ. Этот факт говорит в пользу двухступенчатого

Рис. 5. Кинетики АА (левая колонка) п спектры Фурьс-прсобразоваиия осцнлляцнй в этих книстнках (правая колонка) в РЦ мутанта ОМ2031. /?Ло. зрИаегоЖа для полосы вынужденного излучения Р* при 940 им (а) и полосы поглощения Вд при 1020 нм (б) и в РЦ дейтернровапных феофншн-молифицироианпых РЦ Шю. зрИаегоШех Я-26 для полосы

поглощения ВЛ при 1020 им (в). Тонкая линия - аналогичный спектр Фурье для нсдейтерированных РЦ. РЦ возбуждались 18-20 фсмтосекундными импульсами на длине волны 870 им при 90 К. Числа - частоты максимумов Фурье-спектра.

механизма переноса электрона в РЦ мутанта GM203L по схеме Р* —► Вд —» Нд В мутантных РЦ эти фазы замедлены по сравнению с натнвными РЦ. Основное отличие спектров Фурье для оецнлляцнй в полосе Вд" мутантных РЦ (рис. 5, б) от таковых для нативных РЦ (рис. 2) состоит в отсутствии моды при 32 и 127 см"1 Эти моды являются доминирующими в спектрах Фурье нативных РЦ для этой полосы. Другие частоты спектра Фурье осцилляции п полосе 1020 им мутантных РЦ при 25, 41, 64, 95 и 153 см"1 практически совпадают с таковыми для осцилляций стимулированного излучения Р* с точностью 2-4 см Кинетики АЛ при 760 им для РЦ мутанта GM203L и нативных РЦ, отражающие перенос электрона от Вд на НА, качественно схожи. Характерное время накопления состояния Р*Нд в мутантных РЦ в несколько раз больше, чем в нативных РЦ. Выцветание полосы Нд в мутантных РЦ сопровождается слабыми осцилляцнями, как и в нативных РЦ. В спектре Фурье осцилляций при 760 им РЦ мутанта отсутствует полоса при 32 см"1, характерная для аналогичных спектров нативных РЦ. Похожие изменения наблюдаются и в кинстнках перечисленных выше полос для сухих пленок РЦ Rba. sphaeroides R-26.

Перейдем к результатам, полученным в дейтернрованных РЦ Rba. sphaeroides R-26 при 90 К. Дейтсрировапню подвергались как натианые, так и феофптип-моднфнцпрованные РЦ. Замена НОН-буфера па DOD-буфср не привела к деструктивным изменениям структуре РЦ. Об этом говорит неизменность формы и спектрального положения полосы поглощения Вд при 1020 им и полосы поглощения Нд при 760 им, а также неизменность характерных констант времени для спада стимулированного излучения Р*, выцветания полосы Пд и динамики полосы Вд В дейтернрованных РЦ первичное разделение зарядов сопровождается осцилляцнями во всех перечисленных спектральных полосах. Амплитуда и характерные времена затухания этих осцилляции схожи с таковыми для РЦ в МОП-буфере. Основной результат дейтернроваипи РЦ заключается в изменении спектров Фурье этих осцилляций. В лейтернропанных РЦ аблюдается общий низкочастотный сдвиг характерных полос в спектрах Фурье оецнлляцнй в диапазоне 50-200 см-1 по сравнению с РЦ в МОП-буфере, что соответствует увеличению периода оецнлляцнй (рис. 5, в для полосы поглощения Вд ). Этот сдвиг имеет коэффициент -1,4-1,6 феофитнн-

моднфицпрованпых РЦ. Поскольку узкая интенсивная полоса при 32 см-1 доминирует в Фурье-спектрах осцилляции поглощения Вд Пд и недейтерироиапиых РЦ,

низкочастотный сдвиг при дсйтсрированнн РЦ особенно заметен. Сдвиг других полос в Фурье спектрах осцилляции вынужденного излучения Р* и поглощения ВА и НЛ может маскироваться изменением их относительных амплитуд. Сдвиг центра широкой полосы при 130 см 1 в Фурье-спектрах оецнлляций Р* и Вл" при дсйтсрированнн РЦ имеет тот же коэффициент, что и сдвиг полосы при 32 см-1

Таким образом, при удалении воды из РЦ пли прп ее замене тяжелой водой изменения касаются в первую очередь моды 32 см"1 осцилляции в полосе поглощения Вд при 1020 им и ряда более высокочастотных мод в осцилляцнях вынужденного излучения Р* при 940 им и поглощения Вл при 1020 им. В пативных РЦ этот ряд мод имеет частоты, очень близкие к частотам, кратным 32 см"1 (рис. 2), что указывает на их принадлежность к обертонам фундаментальной моды 32 см"' При удалении воды мода 32 см"1 и кратные ей моды исчезают в РЦ мутанта СМ203Ц а при дейтерпрованнп РЦ все указанные моды смещаются вниз по шкале частот с примерно одинаковым коэффициентом. Так как вода НОН55 определенно отсутствует в мутанте СМ203Ц то исчезновение моды 32 см"1 и кратных ей мод в кинстнках РЦ этого мутанта означает принадлежность данной моды к этой молекуле воды.

Появление высоких гармоник в осцилляцнях (вплоть до седьмой) характерно скорее для вращательных мод, чем для колебательных. Хорошо известно, что молекула воды в газовой фазе имеет три типа вращения с характерными частотами 20, 32 и 52 см"' [Герцберг, 1949]. Частота вращения 32 см"1 в точности соответствует наблюдаемой экспериментально моде оецплляцнй, а разность двух других частот также равна 32 см"1 Оцепить величину изотопического сдвига проще всего для узкой интенсивной моды 32 см"1 которая наиболее удалена от колебательной полосы 130 см"1 Экспериментальная величина этого сдвига составила -1,6, что больше расчетной величины для сдвига колебательных полос молекулярных групп, содержащих протон (1,375), по меньше расчетной величины 1,8 для сдвига вращательных полос этих молекулярных групп. Полученное расхождение указывает па неполное дейтернровапне или его отсутствие в некоторой части РЦ. Присутствие глицерина, содержащего ОН-группы, в буфере РЦ при низкотемпературных измерениях увеличивает вероятность получения молекул ООН (изотопический коэффициент 1,422) вместо РОР. Совокупность полученных данных указывает па то. чго мода 32 см"1, регистрируемая в осцилляцнях продуктов Р+Вл Р*МЛ , является одной из вращательных частот молекулы воды.

Существенное замедление спада стимулированного излучения Р* в РЦ мутанта ОМ2031. является наиболее ярким следствием удаления воды 1101155 из этих РЦ.

Сравнение данных рентгеновского анализа структуры РЦ мутанта GM203L и пативных РЦ исключает существенное изменение их конформации в результате данной мутации. В РЦ мутанта GM203L величина среднеточсчного потенциала ЕП1 пары Р/Р+ такая же, как и в нативных РЦ [Potter et al. 2005]. Можно ожидать, что отсутствие водородной связи между кетокарбонильной группой ВА и водой НОН55 в мутанте GM203L изменит величину Ет пары ВА/ВА * однако никаких данных по этому вопросу в настоящее время нет. Также отсутствуют данные о том, происходит ли образование водородной связи между ВА и НОН55 в течение времени жизни состояния Р+ВА , или нет. Таким образом, нельзя исключить возможность того, что мутация GM203L вызывает изменения в энергетике первичной реакции разделения зарядов.

Время жизни Р* в РЦ мутанта GM203L (4,3 пс) совпадает с минорной компонентой (15-20%) кинетики вынужденного излучения Р* в нативных РЦ. Исчезновение основной компоненты переноса электрона со временем 1,2 пс (80-85% в нативных РЦ) при исключении воды НОН55 из структуры РЦ указывает на удаление наиболее вероятного пути переноса электрона. Более медленная компонента (4,3 пс) может отражать другие, менее эффективные пути электронного транспорта от Р* к ВА. Положение молекулы воды ИОН55 таково, что она входит в состав следующей цепи полярных атомов: N-Mg(Po) -N-C-N(IIisM202) -Н0Н55-0=(ВА), которая соединяет Р и ВА и может использоваться для переноса электрона. С этой точки зрения, увеличение времени жизни Р* в мутанте GM203L означает нарушение целостности этой цепи из-за исключения воды ИОИ55. Согласно квантово-механическим расчетам, максимальная плотность я-электронов в состоянии Р* локализована на атомах азота, соединенных с центральным атомом Mg в молекуле Рц [Plato et al. 1988]. Это означает, что атом азота в Mis М202, лнганднрующнй атом Mg, также очень близок (около 2 ангстрем) к максимальной спиновой плотности в Рц. Указанная выше цепь полярных групп обеспечивает основной (80-85%) путь переноса электрона с высокой скоростью (1/1,2 пс"1) и нативных РЦ. Когда эта цепь разорвана из-за отсутствия HOI-I55, скорость электронного транспорта сильно уменьшается (1/4,3 пс"1) и он происходит по другим («нсспсцифпческнм») путям электронного тунпелировапия. Доля этого более медленного транспорта пс превышает 15-20% в нативных РЦ, но становится основной в РЦ мутанта GM203L. Необходимо отметить, что указанный мост из полярных групп имеет большую длину, чем кратчайший путь тупнелироваипя электрона через пространство между РА/ Рц и ВА (-8,5 ангстрем но сравнению с 3,5-5,5 ангстрем). Большую скорость переноса электрона по этому мосту можно объяснить тем, что цепь полярных групп создаст более эффективную среду для тунпелировапия электрона, чем вакуум, компенсируя тем самым разницу в расстоянии Так, водородная

связь создаст среду, которая почти в три раза эффективнее вакуума при тупнслнрованнп электрона [de Rege et al., 1995].

Анализ полученных данных приводит к выводу, что, безотносительно к причине замедления спада Р* в РЦ GM203L, вращение воды НОН55, следующее за фемтосекундным возбуждением РЦ, влияет па динамику переноса электрона от Р* к ВА. Водородная связь между водой НОН55 и ВА силон ~4 ккал/моль отчетливо регистрируется в окисленных РЦ Rba. sphaeroides методами спектроскопии комбинационного рассеяния, но не регистрируется в нейтральных РЦ [Potter et al., 2005]. Это означает, что данная связь устанавливается в процессе разделения зарядов в ответ на появление положительного заряда Р* и отрицательного заряда ВА , которые разворачивают диполь воды. После 1-3 оборотов с частотой 32 см"1 вращение воды прекращается. Установление Н-связи между НОН55 и ВА способствует стабилизации состояния Р+ВА Вращение воды вызывает периодический перенос электрона от Рв на ВА обратно с частотой 32 см-1 Периодическое появление дополнительной электронной плотности на ВА па ранней стадии разделения зарядов, когда населенности состояний Р* и Р+ВА примерно равны, может дополнительно стабилизировать состояние ВА Эта стабилизация происходит быстрее, чем относительно медленная релаксация окружающих молекул к новой электронной конфигурации.

И1сст«н глава посвящена исследованию роли тирозина М210 в процессе первичного разделения зарядов и стабилизации разделенных зарядов в РЦ Rba. sphaeroides. Согласно данным о пространственной структуре РЦ Rba. sphaeroides, кислород тирозина М2Ю локализован симметрично между РА и Ро " находится на расстоянии ~5 ангстрем как от углерода C-N(IV) РА, так и от азота N(ll) ВА [PDB, файл 1AIJ]. Для исследования этого вопроса дифференциальная спектроскопия поглощения с разрешением 20 фс была применена к мутантам YM2I0W, YM2I0L/FMI97Y и YM2I0L/11L168L Rba. sphaeroides при детальном сравнении результатов с контрольными образцами натнвных РЦ Rba. sphaeroides. Мутация YM210W(L) заменяет тирозин М210 па триптофан (лейцпн). Мутация FM197Y меняет феинлаланнн Ml97 тирозин, который образует дополнительную водородную связь с ацетил-карбонилыюй группой кольца I в Pn [Kuglstalter et al., 1999]. Мутация ML168L заменяет гистндии L168 па лейцин, что удаляет водородную связь между ацетил-карбонильной группой кольца I в РА и природным гнетнднном Н1Л68 и приводит к сильному понижению редокс-потсиииала РТР па 123 мВ [Spiedcl et al., 2002].

Кинетики АЛ при 935-940 им всех исследованных мутантов демонстрируют очень медленное затухание вынужденного излучения Р* в пикосскуидиом диапазоне, сопровождаемое отчетливыми осцилляцнямп ложной формы (рис. 6 для мугаита

YM210W). Время жизни Р* в указанных мутантах и несколько десяткоп раз больше, чем п натипных РЦ, в соответствии с полученными ранее данными [Hamm et al. 1993; Jia et al., 1993]. Амплитуда осцилляции вынужденного излучения Р* в РЦ мутантов близка к амплитуде аналогичных осцилляции в нативных РЦ. В отличие от нативных РЦ, осцилляции вынужденного излучения Р* в РЦ мутантов сохраняются в течение -1,5 пс (-0,5 пс в нативных РЦ), что позволяет увидеть до 7 пиков осцнлляцнй. Первый, самый интенсивный пик осцнлляцнй наблюдается при задержке -120 фс относительно возбуждения. Фурье-спектр осцнлляцнй вынужденного излучения Р* мутанта YM210W содержит широкую доминирующую полосу сложной формы с Петром при -150 см"1, что соответствует основному периоду осцилляции -230 фс. В мутанте YM210L/FM197Y наблюдается низкочастотный сдвиг основной полосы Фурье-спектра осцнлляцнй вынужденного излучения Р* от 150 к 100 см"1 что указывает на увеличение эффективной массы некоторой части согласованно осциллирующих (вследствие фемтосекупдного возбуждения) молекулярных групп благодаря присоединению к ним новых групп через водородную связь. В мутанте YM210L/HLI68L Фурье-спектр осцилляции вынужденного излучения Р* содержит две основные перекрывающиеся полосы при 117 и 152 см"1, а сами осцилляции затухают несколько быстрее, чем в других указанных мутантах.

Во всех перечисленных мутантах впервые обнаружена очень слабая полоса поглощения аниона Вд~ при 1020 им. Появление этой полосы однозначно указывает па участие Вд в первичном переносе электрона от Р* в данных мутантах. Форма спектральное положение данной полосы идентично таковой в нативных РЦ Rba. sphaeroides R-26. Кинетика А А при 1020 нм исследованных мутантов показывает практически полное отсутствие стабилизации состояния Р*Вд в РЦ мутантов YM210W (рис. 6) YM210L/FM197Y и очень слабую стабилизацию состояния Р+ВЛ (в форме подставки в кинетике) в РЦ мутанта YM210L/IÍLI68L. В РЦ этих мутантов обнаружены осцилляции полосы поглощения Вд как целого без изменения ее формы положения, подобно аналогичным оецнлляциям нативных РЦ. Эти осцилляции примерно синхронны осцилляцпям в вынужденном излучении Р* Характер оецнлляцпй п полосе 1020 нм указывает на почти полностью обратимый перепое электрона между Р* и ВА, вызванный движением ядерного волнового пакета вблизи пересечения потенциальных поверхностей Р* и PfBA (см. гл. 3 h 4). Амплитуда осцнлляцнй полосы поглощения Вд" мутаптных РЦ в несколько раз меньше, чем пативпых и фсофптпп-модпфнцпроваппых РЦ. Осцилляции в полосе поглощения Вд" мутантов прекращаются через -1,5 пс после возбуждения. Как и в оецнлляциях Р*. в осцилляцнях полосы Вд насчитывается до 7 пиков. Фурье-спектр осцнлляцнй в полосе Вд нсслсдопанных мутантов содержит полосы, характерные для

аналогичных осцилляции Р*. а также ряд узких низкочастотных полос н диапазоне 10-70 см"1, среди которых выделяется полоса при 28-33 см"1

935 нм

0.0004 | ДА 0,0000 | 0.0004 г 0

да 0.0000

1020 нм

" 0.0004 г 4 4

V» 0.0000 -

0.2 -ДА

0,0 -ДА 0,02

0,00

0 2 4

Время, пс

0 2 4

Частота, см"1

Рис. 6. Кинетики ЛЛ (верхний ряд), их осциллирующая часть (средний ряд) и спектр Фурьс-прсобразопання осциллирующей части (нижний ряд) полосы иынужденного излучения Р* при 935 нм (лепая колонка) и полосы поглощения ВА при 1020 нм (прапая колонка) РЦ мутанта УМ210\У ЯЬа. 5рИаего1с1е5. РЦ возбуждались при 90 К 20-фемтосекупднымн импульсами при 870 нм. Числа - частоты максимумов Фурьс-спсктра.

Анализ полученных данных приводит к выводу, что присутствие тирозина М210 в РЦ является необходимым фактором, обеспечивающим стабилизацию разделенных зарядов в состоянии Р*ВА В мутантах, пс содержащих тирозин М210, необратимый перенос электрона от Р* к Вл практически отсутствует, а время жизни Р* увеличено в десятки раз по сравнению с натнвпымн РЦ, содержащими тирозин М210. Наличие обратимого фемтосекундного переноса электрона между Р* ВЛ в мутантах, не содержащих тирозин М210, означает, что в этих мутантах стабилизация первичного состояния с разделенными зарядами Р*ВЛ отсутствует. Можно выделить два аспекта стабилизации Р*ВА в РЦ. Во-первых, электрон может быть псрсмссси от Р* на высокий колебательный уровень потенциальной энергетической поверхности Р*ВЛ с последующей

колебательной релаксацией на более низкий уровень. Для эффективной стабилизации Р+Вд за счет колебательной релаксации необходимо, чтобы потенциальная поверхность Р+ВА~ находилась заметно ниже поверхности Р* Характерное время колебательной релаксации является фактором, ограничивающим скорость разделения зарядов между Р* и ВЛ. В двойном мутанте YM210L/HL168L Бторая мутация понижает редокс-потенцпал пары РТР на 123 мВ [Spicdel et al., 2002], что может привести к значительному понижению уровня Р+ВА относительно Р* и увеличить роль колебательной релаксации в процессе стабилизации состояния Р'Вд Отсутствие заметной стабилизации состояния Р+Вд в двойном мутанте YM210L/HL168L указывает на важность присутствия тирозина М210 для осуществления этой стабилизации и ее иной механизм. Присутствие тирозина М197 в двойном мутанте YM210L/FM197Y также не исправляет ситуацию, на что указывает отсутствие стабилизации состояния Р*ВА в этом мутанте.

Во-вторых, стабилизация состояния Р*ВЛ может достигаться п результате переориентации окружающих полярных групп пол действием разделенных зарядов Р+ ВА В патнвных РЦ ядерная конфигурация может быть изменена путем переориентации окружающих полярных групп типа 0°"HÖ+ тирозина M2I0. Движение Hö+ в направлении Вд уменьшает энергию Р*ВА относительно Р* таким образом, стабилизирует состояние Р*Вл" Hs+ группы ОН тирозина М210 может занимать два характерных положения относительно РЛ и Вд. В первом положении диполь 05"Hfi+ тирозина М210 перпендикулярен линии, проходящей между углеродом C-N(IV) Рд и азотом N(11) Вд, которые являются ближайшими соседями тирозина М210 имеют максимальный положительный и отрицательный заряды, соответственно, в состоянии Р*ВА [Plato et al. 1988]. Это положение реализуется в нейтральном состоянии РВА или Р*ВА. Во втором положении IIs* группы ОН тирозина M2I0 располагается па липни, соединяющей кислород Огруппы ОН тирозина М210 и азот N(11) Вд. Это положение реализуется, когда Р'Вд стабилизируется благодаря движению Höf в направлении Вд, притягиваясь к ВЛ и отталкиваясь от Рд* Оценка энергии электростатического взаимодействия дает энергетическую разницу между двумя положениями -900 см"1 Экспериментальное значение разницы в энергии между Р* и Р+ВЛ для стабильного состояния Р+ВА феофитнп'модпфнцпроваппых РЦ составляет -550 см"1 (гл. 3). Тпкнм образом, энергия, лтрачнвасмая переориентацию группы Oil тирозина М210, достаточна для стабилизации состояния Р'Вд Важно, что притяжение и отгалкиваиис I Iй' зарядами Вд и Рд* соответственно происходит только при образов. Р+Вд отсутствует в нейтральном состоянии Р*В. Экспериментально наблюдаемое увеличение времени стабилизации с температурой согласуется с предложенным механизмом, так кг

взаимодействие Н4+ группы ОМ тирозина M2I0 с фононамн среды способно индуцировать некоторые дополнительные движения М°\ ведущие к увеличению времени стабилизации.

В РЦ Cfx. aurantiacus отсутствует тирозин M2I0, но присутствует другой тирозин М195, локализованный между Р и Вд [Bruce et al. 1982], который может отвечать за стабилизацию Р*ВА в этих РЦ. Стабилизация Р+ВЛ~ в РЦ Cfx. aurantiacus занимает большее время (~5 пс) при 90 К, чел« в РЦ Rba. sphaeroides R-26 (-1,5 пс) (глава 3). Это согласуется с несимметричным положением тирозина Ml95 по отношению к РА и ВА (в противоположность тому, что наблюдается для тирозина М210).

Существенное уменьшение амплитуды осцилляции населенности состояния Р+ВА в мутаптных РЦ по сравнению с таковой в нативных РЦ означает, что значительная часть волнового пакета не достигает пересечения потенциальных поверхностей Р* и Р*ВА в мутаптных РЦ. Это происходит, если место пересечения поверхностей P* Р+ВА находится достаточно высоко по шкале энергии, то есть поверхность Р*ВА находится выше поверхности Р*, а энергия активации реакции Р* —► Р*ВА~ сравнима с энергией волнового пакета. К аналогичному выводу приводят и расчеты констант скорости разделения зарядов в РЦ исследованных мутантов в рамках теории Маркуса [Marcus, 1964]. Сравнительно медленное затухание оецнлляцнй в мутантах, не содержащих тирозин M2I0, указывает отсутствие пекогереитных изменений ядерной конфигурации при обратимом перемещении волнового пакета по поверхности Р* и его периодическом появлении вблизи пересечения поверхностей Р* и P*BA~

Полученные данные согласуются с расчетами молекулярной динамики для РЦ Rba. sphaeroides. Эти расчеты показывают, что присутствие тирозина М210 понижает уровень энергии полностью стабилизированного состояния Р+ВА~ более чем на 1000 см 1 благодаря совместному действию двух механизмов: статическому перераспределению зарядов в прилегающей области и динамическому эффекту реорнентацнп полярной ОП-группы TyrM210 [Alden et j 1996]. Если процесс стабилизации разделенных зарядов Р* и ВА авершеи, понижение уровня Р+Вд оказывается меньшим. Расчеты молекулярной динамики позволяют оценить характерное время реорнентацни ОИ-груниы ТугМ210, которое оказывается близким к времени жизни Р* Анализ расчетов молекулярной динамики приводит к выводу о существенном вкладе реорнентацни ОН-группы ТугМ210 стабилизацию состояния Р+ВА Расчетный спектр автокорреляционной функции флуктуации стохастических поворотов Oil-группы ТугМ210 состоит из нескольких пиков в диапазоне от 270 до 390 см"1 с двумя главными пиками при 356 и 368 см 1 [Parson, Warshel, 2009]. Эти пики отсутствуют п аналогичном расчетном спектре мутаптных РЦ, лишенных тирозина М210, а также в спектре резонансного комбинационного рассеяния

тирозина. Важным является то, что точно такие же пики присутствуют в Фурье-спектре автокорреляционной функции флуктуаций электростатической энергии AVeiec в состоянии PB и Р*ВА~, но отсутствуют в аналогичном спектре флуктуаций электростатической энергии прямого взаимодействия Р+ и ВА AVqq. Это еще раз указывает на принадлежность пиков при 356 и 368 см"1 к окружению Р и ВА. Спектр Фурье-преобразования для осцилляций в полосе поглощения ВА" при 1020 им и в полосе вынужденного излучения Р* при 935-940 им нативных и фсофитин-молпфнцированных РЦ Rba. sphaeroides содержит слабые полосы в диапазоне 300-400 см"1, близкие к расчетным (рис. 2).

Седьмая глава посвящена исследованию когерентного переноса электрона при первичном разделении зарядов в B-цепи РЦ мутанта HMI82L Rba. sphaeroides и РЦ С/х. aurantiacus. Мутация HM182L заменяет молекулу бактсриохлорофнлла Во в В-цспи РЦ Rba. sphaeroides па молекулу бактсриофсофнтпиа Фв [Katilius et al., 1999]. Уровень Р+Фв" оказывается ниже Р* па -0,16 эВ в мутанте I IM182L, что приводит к некогерептному переносу электрона ira Фв с небольшим квантовым выходом -12% при 77 К характерным временем - 8 пс [Katilius et al. 2002]. В В-цепн РЦ С/х. aurantiacus также имеется молекула Фв в положении Во, что сближает эти РЦ с РЦ мутанта IIM182L [Blankcnship et al., 1983]. Оценки уровня энергии Р+Фв » РЦ С/х. aurantiacus дают его положение вблизи или даже ниже уровня Р*, что открывает теоретическую возможность переноса электрона в В-цспь в этих РЦ.

В РЦ мутанта HM182L впервые обнаружена слабая полоса поглощения ВА при 1020 им, что дало возможность исследовать самый ранний этап разделения зарядов в А-цсин Формирование состояния Р*ВА мутанте HM182L при фемтосекуидном возбуждении происходит качественно также, как и в РЦ Rba. sphaeroides R-26, то есть сопровождается выраженными осцилляцнямн как в полосе вынужденного излучения Р*, так и в полосе поглощения ВА Эти осцилляции еннфазны, их первый, наиболее интенсивный максимум наблюдается при задержке -120 фс. Также в мутанте HMI82L впервые обнаружено небольшое динамическое выцветание полосы поглощения Фв при 785 им. Это выцветание регистрируется только в диапазоне задержек 0 80 фс и однозначно указывает на полностью обратимый перенос электрона B-цепь с формированием состояния Р*Фп Кинетика Л А полосы поглощения Фв при 785 им имеет вид одиночного пика с максимумом при -40 фс, что па -80 фс раньше, чем первый ник осцилляции в полосе ВА и Р* (рис. 7). Отметим, что при задержке 40 фс полоса поглощения ВА еще полност ью отсутствует.

Pire 7 Кинетики АЛ (верхний ряд) и их осциллирующая часть (нижний ряд) полос поглощения Фп прн 785 и 748 ни, полосы поглощения ВЛ" при 1020-1028 им и полосы пыпужденного излучения Р* при 940 им п РЦ мутанта HM182L Rba. sphaeroides (левая колонка) и в РЦ С/х. auranliacus (правая колонка). РЦ возбуждались при 90 К 20-фемтосекупдиымн импульсами при 870 им.

В РЦ С/х. auranliacus при фемтосскундном возбуждении впервые обнаружены атухающие осцилляции в полосах поглощения Фв при 748 и 785 им (рис. 7). Полоса прн 785 им начинает выцветать с очень малой задержкой -10 фс после возбуждения н достигает первого максимума при задержке -25 фс. Полоса прн 748 нм начинает при несколько большей задержке -30 фс, достигая первого максимума прн задержке -60 фс. Далее осцилляции в обеих полосах развиваются синхронно со средним периодом -200-220 фс. Фурье-анализ осцилляции выяпляст характерные частоты 79 и 108 см"1 в осцилляциях полосы 785 им и 73 п 154 см 1 в оецнлляциях полосы 748 нм. Синхронные осцилляции вынужденного излучения Р* при 940 нм и поглощения Вл прн 1028 им в РЦ Cfx. auranliacus развиваются заметно позже. Первый максимум утих

осцилляции наблюдается при задержке -110 фс, а при задержках менее 50 фс они отсутствуют.

Таким образом, во всех перечисленных выше РЦ перенос электрона в В-цспь сопровождается осцнлляцпямн в состоянии с разделенными зарядами. Эти осцилляции начинаются на несколько десятков фс раньше, чем осцилляции, сопровождающие перенос электрона п А-цспь. В РЦ мутанта НМ182Ь осцилляции в В- цепи имеют вид одиночного пика, а в РЦ С/х. аигапИасш - это быстро- затухающие осцилляции. Полученные данные позволяют детализировать когерентные процессы, сопровождающие первичное разделение зарядов в РЦ при фсмтосекундиом возбуждении. Возбуждение Р 18-20 фс импульсами с широким спектром формирует ядерный волновой пакет, который начинает осциллирующее движение по поверхности Р* вдоль двух независимых координат, соответствующих реакциям Р*—► Р*ВЛ Р*—► Р+Фп" Сразу после формирования волновой пакет находится на коротковолновом склоне поверхности Р* и излучает свет при -900 Тот факт, что осцилляция в полосе поглощения первичного акцептора электронов в В-цепи возникает сразу после возбуждения, указывает на близость области пересечения поверхностей Р* и Р+Фв к области формирования полнового пакета. Временной ход данной осцилляции указывает на обратимость когерентного переноса электрона в В-цепи под действием волнового пакета. При задержке -100-120 фс волновой пакет достигает области пересечения поверхностей Р* и Р*ВЛ~ на длинноволновом склоне кривой Р* В этой области волновой пакет излучает при 930-940 им. Появление волнового пакета в области пересечения поверхностей Р* и Р*ВЛ приводит к появлению осцилляции в полосе поглощения Вд , которая синфазна осцилляции излучения Р* прн 940 нм. После отражения волнового пакета в области пересечения поверхностей и его ухода в обратную сторону поглощение в полосе ВА резко уменьшается, что указывает на обратимость когерентной реакции Р* —» Р+ВЛ и отсутствие стабилизации разделенных зарядов прн этой задержке. Таким образом, когерентные компоненты реакций переноса электрона в Ан В-цспп разделены во времени, причем в В-цепи перенос начинается раньше па 60-80 фс, чем в А-цепн. Это указывает на различие в оптимальных конфигурациях ядер для переноса электрона по двум цепям. Прн задержке -200-250 фс волновой пакет снова оказывается па левом склоне поверхности Р* вблизи области пересечения поверхностей Р* и Р+Ф„ В РЦ С/х. аигапНасш это приводит к появлению второго пика осцилляции в полосе поглощения Фп~ В мутанте НМ1821. аналогичные пики отсутствуют, что указывает па уменьшение энергии волнового пакета к этому времени, которая становится недостаточной для преодоления потенциального барьера. При задержке -350 фс волновой пакет пиовь оказывается па правом склоне поверхности Р* вблизи области пересечения

поверхностен Р* н Р+Вд , что приводит к появлению второго максимума в осцплляцнях продукта при 1020 им н излучения Р* прн 940 нм. В процессе движения волновой пакет быстро расплывается из-за процессов диссипации, что приводит к регистрации всего нескольких периодов осцилляции.

В заключении сформулирован общин итог работы, определяющий ее место в общемировых исследованиях по данной тематике. Первичный акт фотосинтеза заключается в преобразовании энергии света в энергию разделенных зарядов, которая используется в дальнейших реакциях фотосинтеза. Он происходит специальных пигмент-белковых комплексах (реакционных центрах) с высокой эффективностью. Поглощение фотона свстособнрающсй антенне самих реакционных центрах

приводит в конечном итоге к возбуждению спсцпары (димер бактериохлорофплла в реакционных центрах бактерий), которая выполняет функцию конечного акцептора энергии возбуждения и одновременно первичного донора электронов Р. Первичный перенос электрона в реакционных центрах происходит с высокой скоростью между кофакторами хлорофилловой природы, взаимное расположение которых обеспечивается структурой белка реакционных центров. Каждый новый этап переноса электрона сопровождается потерей энергии исходно поглощенного кванта в обмен на увеличение времени диссипации запасенной энергии при постепенном его увеличении на каждом этапе разделения зарядов. Удаление электрона от его первичного донора сопровождается уменьшением энергии взаимодействия исснарсниых электронов, а скорость движения электрона назад по вакантным орбнталям также уменьшается в связи с увеличением фактора Больцмана. В результате время диссипации запасенной энергии увеличивается от -300 не в состоянии Р* до -0,1 с в состоянии Р'Од Максимально высокая скорость прямых реакций переноса электрона, намного превышающая скорость процессов рекомбинации и релаксации, является ключевым фактором, обеспечивающим высокую эффективность работы реакционных центров и фотосинтеза в целом.

В реакционных центрах бактерий молекула дополнительного бактериохлорофплла ВЛ является первичным акцептором электрона и обеспечивает высокую скорость приема электрона от первичного донора Р* и еще большую скорость передачи электрона на следующий акцептор, бактсриофеофитнп Пд. Это достигается за счет малости пли отсутствия активацноииых барьеров реакций разделения арядов и за счет хорошего перекрытия электронных орбиталей участников этих реакции Без прямого участия Вд в переносе электрона достижение максимально высокой скорости этого переноса

невозможно. Ближайшее окружение молекулы Вл служит достижению той же цели, ускоряя перенос электрона. Ярким примером этого ускорения яплястся влияние на первичный перенос электрона молекулы кристаллической воды НОН55 и молекулы тирозина М210. Отсутствие данных молекул в окружении Вд приводит к сильному замедлению переноса электрона. Механизмы влияния молекул окружения Вл на перенос электрона могут включать прямое влияние на энергетику реакций разделения зарядов, участие в процессе динамической стабилизации разделенных зарядов в состоянии Р+ВА или прямую включенность в состав пространственной тропы переноса электрона. Отличительной особенностью молекул ИОН55 и тирозина М210 является их полярность, которая позволяет настраивать механизмы влияния в ответ на появление разделенных зарядов, то есть обеспечивает обратную связь между этими механизмами и процессом разделения зарядов.

В переносе электрона между реагентами активную роль играют колебания ядерной подсистемы. Возбуждение реакционных центров фсмтосскундпымн световыми импульсами создаст коллективные движения ядер в форме волнового пакета. Это состояние не имеет аналогов в природе, но служит ценным источником информации о влиянии ядерных движений на перенос электрона в эксперименте. Фсмтосскундная спектроскопия демонстрирует, что само возбуждение одного из электронов Р не приводит к разделению зарядов. Только движение ядерной подсистемы вначале в самом Р*, а затем в его окружении, куда входит и молекула Вд, приводит в итоге к переносу электрона с Р* на ВА с образованием первичного продукта Р*ВА Это движение, вероятно, направлено па максимально возможное сближение Р* и Вл. Импульс, приобретенный в результате такого движения, может быть использован как для преодоления энергетического барьера переноса электрона с Р* на Вд, так и для дальнейшего движения, приводящего к разведению продуктов реакции Р" и Вд в пространстве. Сопряжение движений ядерной и электронной подсистем, таким образом, важно для эффективного преобразования световой энергии в энергию разделенных зарядов прн фотосинтезе. Это справедливо как в отношении активной Л-цспи реакционных центров бактерий, так и для малоактивной В-цепп.

Автор выражает глубокую благодарность всему коллективу соавторов за неоценимую помощь в работе. Работы по теме диссертации частично финансировались грантами РФФИ, NWO, JNTAS и МИ'ГЦ.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ I. Впервые получены прямые экспериментальные доказательства того, что в реакционных центрах Rba. sphaeroides R-26, Cfx. aurantiacus ряда мутантов Rba. sphaeroides первичным акцептором электрона является молекула мопомерного бактернохлорофнлла в А-цепи ВА.

1) В этих реакционных центрах с помощью высокочувствительной дифференциальном спектроскопии поглощения с временным разрешением 18-25 фс проведена прямая регистрация ИК полосы поглощения аннона В а (при 1020 нм в Rba. sphaeroides и при 1028 нм в Cfx. aurantiacus), появление которой однозначно указывает на разделение зарядов между возбужденным состоянием первичного донора электронов, днмера бактернохлорофнлла Р*. и ВА.

2) Исследование температурной зависимости замедленной флуоресценции фсофнтпп-модпфнцированных реакционных центров Rba. sphaeroides R-26 показало, что уровень свободной энергии первичного состояния с разделенными зарядами Р*Вд~ находится ниже уровня свободной энергии возбужденного состояния днмера Р* на 550 ± 30 см"1 Этот фундаментальный факт создаст предпосылку для прямого участия ВА в первичном переносе электрона от Р*

3) Исследование фсмтосекундной динамики полосы поглощения Вд" полностью подтверждает последовательную схему переноса электрона при первичном разделении зарядов в бактериальных реакционных центрах (Р* —» мопомерный бактерпохлорофплл ВА —» бактсрнофсофитнн Пд —1► ), впервые предложенную более 30 лет назад в пионерских работах В.А. Шувалова и соавт Показано, что премя жизни состояния Р+ВА в реакционных центрах Rba. sphaeroides R-26 и Cfx. aurantiacus не превышает нескольких не, что связано с быстрым переносом электрона бактсрнофсофитнн НА.

И. Впервые экспериментально показано, что молекула кристаллографической поды ИОИ55, входящая в состав реакционного центра Rba. sphaeroides, играет важную роль п переносе электрона от первичного донора электрона Р* к первичному акцептору ВА.

1) Удаление воды IIOH55 из структуры РЦ в мутантах по сайту М203 замедляет первичную реакцию разделения зарядов между Р* и ВА примерно в 4 раза.

2) Вращение молекулы воды ИОН55, выявляемое при фемтосскундиом возбуждении реакционного центра Rba. sphaeroides, приводит к модуляции насслснпостсй первичных состояний с разделенными зарядами Р+ВА и Р*11д на частоте вращения 32

см"1 и кратных ей частотах. Принадлежность моды 32 см"1 и ее гармоник к вращению воды НОН55 доказана d экспериментах с реакционными центрами, ire содержащими данную молекулу. При удалении воды НОН55 из структуры реакционного центра мода осцилляции при 32 см"1 и ее гармоники исчезают, а при замене этой воды на тяжелую воду происходит изотопическое понижение частот указанных мод с коэффициентом, характерным для вращательных спектров.

3) С учетом данных рентгепоструктурного анализа реакционных центров, вода НОН55 может быть включена в одну из пространственных троп эффективного переноса электрона по цепи полярных групп атомов, соединяющей днмер Р и мономер ВЛ. N-Mg(PB) -N-C-N(HisM202) -Н0Н55-0=(ВЛ).

III. Впервые экспериментально раскрыто определяющее влияние тирозина M2I0, находящегося в реакционном центре Rba. sphaeroides вблизи днмера Р и мономера бактернохлорофилла ВА, на первичное разделение зарядов и стабилизацию разделенных зарядов в реакционных центрах.

1) Показано, что отсутствие тирозина М210 в мутаптных реакционных центрах препятствует стабилизации разделенных зарядов состоянии Р+Вл что сопровождается сильным замедлением процесса первичного разделения зарядов.

2) Найдено, что значительное понижение уровня свободной энергии состояния Р'Вд относительно аналогичного уровня возбужденного состояния Р* в реакционных центрах мутантов Rba. sphaeroides не способно компенсировать отсутствие тирозина М210 и ускорить разделение зарядов.

3) Показано, что отсутствие тирозина М210 в мутаптных реакционных центрах не компенсируется его введением в положение Ml97.

4) Выявлено стабилизирующее влияние полярной ОН-группы тирозина М210 на состояние Р*Вд » процессе разделения зарядов в тпрозин-содержашнх РЦ.

IV. Впервые получены прямые экспериментальные доказательства (подтверждаемые теоретически) сопряжения ядерных движений с переносом электрона при первичном разделении зарядов в реакционных центрах пурпурных и зеленых бактерий.

I) Продемонстрирована связь коллективных ядерных движений в виде волнового пакета, созданного в состоянии Р* при фемтосекундном возбуждении реакционных центров Rba. sphaeroides R-26 и Cfx. aurantiacus, и впервые обнаруженных оецплляцнй пасслснностсП состояний фотопродуктов Р+Вд и Р*ИД С помощью Фурье-анализа

этих осцилляции выявлены характерные моды ядерных движении, сопряженные с первичным переносом электрона.

2) Экспериментально показано, что периодическое появление волнового пакета с частотой -130 см"1 вблизи пересечения поверхностей потенциальной энергии Р* и Р+ВА~ в реакционных центрах приводит к обратимому переносу электрона на Вд, что выражается в синхронных осцилляцпях поглощения Вд и вынужденного излучения Р* Найдено, что часть волнового пакета, проникшая на поверхность Р+Вд , затем эффективно переходит на поверхность Р*НА

3) Обнаружено, что при фемтосекундном возбуждении реакционных центров С/х. auraniiacus и мутантных по сайту Ml82 реакционных центров Rba. sphaeroides происходит обратимый перенос электрона от Р* в малоактивную В-цспь, который целиком определяется движениями ядерного волнового пакета и опережает начало аналогичного переноса в А-цспь на 60-80 фс. Показано, что этот процесс определяется присутствием волнового пакета коротковолновом склоне потенциальной поверхности Р* вблизи се пересечения с потенциальной поверхностью первичного состояния с разделенными зарядами в В-цепн.

4) Теоретическое моделирование динамики волнового пакета в рамках теории Рсдфилда подтвердило возможность его многократных, обратимых переходов с поверхности донора Р* поверхность фотопродукта Р+Вд с сохранением когерентности. Показано, что учет как минимум двух коллективных ядерных мод, соответствующих двум координатам реакции, необходим для объяснения экспериментальных киистик состояний Р* и Р*Вд

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИ01IIЮЙ РАБОТЫ:

Streltsov A.M., Yakovlev A.G., Shkuropatov A.Ya., Shuvalov V.A. (1995) Dynamic hole burning within special pair absorption band of Rhodobacter sphaeroides (R-26) reaction center at room temperature. FEBS Lett., 357, 239-241.

2. Streltsov A.M. Yakovlev A.G., Shkuropatov A.Ya. Shuvalov V.A. (1996) Femtosecond kinetics of electron transfer in the bacteriochlorophyll(M)-modificd reaction centers from Rhodobacter sphaeroides (R-26). FEBS Lett., 383. 129-132.

3. Shuvalov V.A. Streltsov A.M. Yakovlev A.G., Shkuropatov A.Ya. (1996) Femtosecond kinetics of special pair blenching and electron transfer in Rhodobacter sphaeroides (R-26)

'action centers. In: The Reaction Center о/ Photosynthetic Bacteria; Structure and Dynamic., Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, M.E. Michel-Ucycrlc (ed.)pp. 175-186.

4. Шувалов В.А., Якоплсв А.Г. (1998) Положение уровня энергии Р+В~ относительно Р*. найденное по измерениям рскомбннацпоппой флуоресценции в фсофнтин-модифицироваиных реакционных центрах Rhodobacter sphaeroides R-26. Биол. мембр. 15, 455-460.

5. Nowak F.R., Kennis J.T.M., Franken E.M., Shkuropatov A.Ya., Yakovlcv A.G., Gast P., HoiT A.J., Aartsma T.J., Shuvalov V.A. (1998) The energy level of P+B" in plant pheophytin exchanged bacterial reaction centers probed by the temperature dependence of delayed fluorescence. Proc. XI Intern. Congress on Photosynthesis, Kluwer Acad. Pubis., Dordrecht, pp. 783-786.

6. Yakovlcv A.G., Shuvalov V.A. (1999) Nuclear wavepacket motion producing a reversible charge separation in bacterial reaction centers. Abstr. XI Intern. Symposium «Ultrafast Phenomena in Spectroscopy», Taipei, Taiwan, ROC, p. 35.

7. Yakovlcv A.G., Shuvalov V.A. (2000) Formation of bacteriochlorophyll anion band at 1020 nm produced by nuclear wavepacket motion in bacterial reaction centers. J. Chin. Chem. Soc., 47, 709-714.

8. Yakovlcv A.G., Shkuropatov A.Ya., Shuvalov V.A. (2000) Nuclear wavepacket motion producing a reversible charge separation in bacterial reaction centers. FEBS Lett., 466, 209-212.

9. Yakovlcv A.G., Shkuropatov A.Ya. Shuvalov V.A. (2001) Nuclear wavepacket motions leading to electron transfer in bacterial reaction centers. Proc. XII Conference "Ultrafast Processes in Spectroscopy" Califano S. Foggi P. Righini R. (cds.), Firenzc Leo S. Olschki Editore ММШ, Florence, Italy, pp. 405-418.

10. Якоплсп А.Г., Шувалов В.A. (2001) Разделение зарядов в реакционных центрах фотосинтеза прн фсмтосскупдном возбуждении. Биохимия, 66, 261-272.

11. Якоплсп А.Г., Шкуропатов А.Я., Шувалов В.А. (2002) Молекулярная цепь переноса электрона в первичном акте бактериального фотосинтеза, определенная с помощью фемтосскуидпой спектроскопии. Докл. АН 385, 262-268.

12. Yakovlcv A.G., Shkuropatov A.Ya. Shuvalov V.A. (2002) Nuclear wavepacket motion between P* and P+BA potential surfaces with a subsequent electron transfer to HA in bacteria! reaction centers at 90 K. Electron transfer pathway. Biochemistry, 41, 14019-14027

13. Yakovlcv A.G., Shkuropatov A.Ya. Shuvalov V.A. (2002) Nuclear wavepacket motion between P* and P*BA potential surfaces with a subsequent electron transfer to HA in bacterial

■action ccntcrs. I. Room temperature. Biochemistry, 41, 2667-2674.

14. Якоплсп А.Г., Шкуропатов А.Я. Шувалов В.A. (2002) Природа первичпого акта разделения зарядов в бактериальных реакционных neirrpax по данным фемтосскуидпой

спектроскопии. Ill съезд биохимического общества, Санкт-Петербург, тез. докладов, с. 275.

15. Yakovlcv A.G., Vasilieva L.G. Shkuropatov A.Ya., Bolgarina T.I., Slikuropatova V.A., V.A. Shuvalov (2003) Mechanism of charge separation and stabilization of separated charges in reaction centers of Chlorojlexus aurantiacus and of YM2t0W(L) mutants of Rhodobacter sphaeroides excited by 20 fs pulses at 90 K. J. Phys. Chem. A, 107, 8330-8338.

16. Shuvalov V.A., Yakovlcv A.G. (2003) Coupling of nuclear wavepackct motion and charge separation in bacterial reaction centers. FEBS Lett., 540, 26-34.

17. Яковлев А.Г., Шувалов В.A. (2003) Перенос электрона в дентсрированпых реакционных центрах Rhodobacler sphaeroides при 90 К по данным фемтосскуидиоП спектроскопии. Биохимия, 68, 741-749.

18. Яковлев А.Г., Шкуропатов А.Я. Шувалов В.А. (2003) Фсмтосскундныс ядерные осцилляции прн разделении зарядов в реакционных центрах фотосинтеза. Биохимия, 68, 664-675.

19. Novodcrezhkin V.I., Yakovlcv A.G., van Grondcllc R., Shuvalov V.A. (2004) Coherent nuclear and electronic dynamics in primary charge separation in photosynthetic reaction centers: a Redfield theory approach. J. Phys. Chem. D, 108, 7445-7457.

20. Яковлев А.Г., Васильева Л.Г., Шкуропатов А.Я., Болгарина Т.Н., Шкуропатова В.А., Долгова Т.А., Шувалов В.А. (2004) Механизм разделения зарядов и их стабилизации в бактериальных реакционных центрах. Биофизика, 49, 199-211.

21. Yakovlcv A.G., Vasilieva L.G. Shkuropatov A. Ya, Jones M.R., Shuvalov V.A. (2004) Mechanism of charge separation and stabilization of separated charges in native and mutant reaction centers of Rhodobacter sphaeroides excited by 20 fs pulses at 90 K. Abstr. I3'h International Congress of Photosynthesis, Montreal, Canada, p. 134.

22. 51 коплен А.Г., Васильева Л.Г Шкуропатов А.Я. Болгарина Т.Н., Шкуропатова В.А. Долгова Т А., Шувалов В.А. (2004) Фсмтосскупдная спектроскопия первичных процессов разделения зарядов их стабилизации бактериальных реакционных центрах фотосинтеза при 90 К. ¡1! съезд биофизиков России, тез. докладов, Воронеж, с. 484-485.

23. Новодсрсжкнп В.И. Яковлев А.Г., Шупалов В.А. (2005) Когерентный перенос электрона в первичном акте бактериального фотосинтеза: моделирование с помощью теории Редфилда. Докл. АН, 402, 697-701

24. Yakovlcv A. G„ Jones M.R. Potter J.A. Fyfc P.K. Vasilieva L.G. Shkuropatov A.Ya. Shuvalov V.A. (2005) Primary charge separation between P* and Вл: electron-transfer pathways in native and mutant GM203L bactcrial reaction centers. Chem. Phys., 319, 297-307.

25. Shuvalov V.A., Yakovlcv Л.С., Shkuropatova T.A. Vasilicva L.G., Shkuropatov A.Y., Gasl P (2006) Electron transfer in bacterial reaction centers with modified B-branch pigment composition. Proc. 14-th European Bioenergetic Conj.Biochim. Biophys. Acta. 1757, supplement 1, p. 38.

26. Shuvalov V.A., Yakovlcv A.G., Vasilieva L.G., Shkuropatov A.Ya. (2006) Primary charge separation between P700* and primary electron acceptor complex A-Ao: comparison with bacterial reaction centers. In: Photosystem I: The Light-Driven Plastocyanin: Ferredoxin Oxidoreductase. Series: Advances in Photosynthesis and Respiration, Golbeck J.H. (ed.), Springer, The Netherlands, 24, 291-300.

27. Yakovlcv A.G., Shkuropatova T.A. Vasilicva L.G., Shkuropatov A.Ya, Gast P Shuvalov V.A. (2006) Vibrational coherence in bacterial reaction centers with genetically modified B-branch pigment composition. Biochim. Biophys. Acta, 1757, 369-379.

28. Yakovlcv A.G., Jones M.R., Potter J.A., Fyfe P.K.., Vasilicva L.G., Shkuropatov A.Ya. Shuvalov V.A. (2007) Electron-transfer pathways in native and mutant GM203L bacterial reaction centers. Proc. 3-rd Moscow conference on computational molecular biology, Moscow State University publ., Moscow, pp. 320-322.

29. Yakovlev A.G., Shkuropatova T.A., Vasilicva L.G., Shkuropatov A.Ya., Shuvalov V.A. (2008) Wave packct motions coupled to electron transfer in reaction ccntcrs of Chlorojlexus aurantiacus. Abstr. Intern. Conference "Light Energy Conversion in Photosynthesis" Puschino, p. 67.

30. Yakovlcv A.G., Shkuropatova T.A., Vasilicva L.G., Shkuropatov A.Ya, Shuvalov V.A.

(2008) Wave packet motions coupled to electron transfer in reaction centers of Chloroflexus aurantiacus. J. Bioinform. Comput. Bio/., 6, N4, 643-666.

31. Яковлев А.Г., Шкуропатопа Т.Д. Васильева Л.Г Шкуропатов А.Я. Шувалов В.А.

(2009) Фемтосскупдпая фаза разделения зарядов в реакционных центрах Chloroflexus aurantiacus. Биохимия,!А, 1042-1051

32. Якоплсп А.Г., Васильева Л.Г Шкуроиатов А.Я., Шувалов В.А. (2009) Первичные процессы разделения зарядов в реакционных центрах мутантов YM210L/FMI97Y YM210L Rhodobacter sphaeroides. Биохимия, 74, 1479-1487.

33. Yakovlcv A.G., Shuvalov V.A. (2009) Stabilization of separated charges in reaction ccntcrs of bacterial photosynthesis. Proc. 4-th Moscow conference on computational molecular biology, Moscow State University publ., Moscow, pp. 374-375.

34. Якоплсп Л.Г., Васильева Л.Г Шкуропатов A.51. Шувалов В.А. (2009) Разделение зарядов в реакционных центрах мутантов YM2I0L и YM210L/FM197Y Rhodobacter

sphaeroides. XIX Пущинские чтения по фотосинтезу и Всероссийская конференция "Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах", посвященные 100-летию со дня рождения В. Б. Евстигнеева, тезисы доклада, Пущино, с. 68-69.

35. Якоплсп А.Г., Шкуропатова Т А. Шкуропатова В.А., Шувалов В.А. (2010) Фемтосскундиын этап переноса электрона в реакционных центрах тронного мутанта SL178K/GМ203D/LМ214Н Rhodobacter sphaeroides. Биохимия, 75, 501-513.

36. Якоплсп А.Г., Васильева Л.Г Хмельницкая Т.И., Шкуропатова В.А.. Шкуропатов А.Я., Шувалов В.А. (2010) Первичный перенос электрона в реакционных центрах мутантов YM210L и YM210L/HL168L Rhodobacter sphaeroides. Биохимия, 75, 944-953.

37. Yakovlcv A. G., Vasilieva L. G., Khmclnitskaya T I., Slikuropatova V A., Slikuropatov A. Ya., Shuvalov V A. (2010) Coherent electron transfer in reaction centers of YM210L and YM210L/HL168L mutants of Rba. sphaeroides. Abstr. 15th International Congress of Photosynthesis, Beijing, China, p. 25.

Подписано в печать 23.12.2010 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 1067 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

ЧУ

2010176087

Содержание диссертации, доктора физико-математических наук, Яковлев, Андрей Георгиевич

Принятые сокращения ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структура реакционных центров фотосинтезирующих бактерий

1.2. Разделение зарядов в реакционных центрах фотосинтезирующих бактерий

Глава 2. МЕТОДЫ И ОБЪЕКТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Приготовление образцов реакционных центров

2.2. Спектроскопические измерения

Глава 3. УЧАСТИЕ МОНОМЕРА БАКТЕРИОХЛОРОФИЛЛА ВА В ПЕРВИЧНОМ РАЗДЕЛЕНИИ ЗАРЯДОВ В РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРАХ ПУРПУРНЫХ БАКТЕРИЙ Rhodobacter sphaeroides R-26 И ЗЕЛЕНЫХ БАКТЕРИЙ Chloroflexus aurantiacus

3.1. Определение положения уровня энергии Р+Ва~ относительно Р* методом замедленной флуоресценции в феофитин-модифицированных реакционных центрах Rhodobacter sphaeroides R

3.2. Фемтосекундная спектроскопия первичных процессов разделения зарядов в реакционных центрах феофитин-модифицированных Rhodobacter sphaeroides R

3.3. Фемтосекундная спектроскопия первичных процессов разделения зарядов в реакционных центрах нативных (немодифицированных) Rhodobacter sphaeroides R

3. 4. Фемтосекундная спектроскопия первичных процессов разделения зарядов в реакционных центрах Chloroflexus aurantiacus 3.5. Когерентный и некогерентный перенос электрона при первичном разделении зарядов в реакционных центрах Rhodobacter sphaeroides R-26 и Chloroflexus aurantiacus

Глава 4. ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ РАЗДЕЛЕНИЯ ЗАРЯДОВ В ПЕРВИЧНОМ АКТЕ БАКТЕРИАЛЬНОГО ФОТОСИНТЕЗА

4.1. Теоретическая модель

4.2. Результаты теоретического моделирования

Глава 5. РОЛЬ КРИСТАЛЛОГРАФИЧЕСКОЙ ВОДЫ НОН55 В ПЕРВИЧНОМ РАЗДЕЛЕНИИ ЗАРЯДОВ В РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРАХ ПУРПУРНЫХ БАКТЕРИЙ Rhodobacter sphaeroides

5.1. Первичная фаза разделения зарядов в реакционных центрах мутанта GM203L Rhodobacter sphaeroides

5.2. Первичная фаза разделения зарядов в дейтерированных реакционных центрах Rhodobacter sphaeroides R

5.3. Первичная фаза разделения зарядов в сухих пленках реакционных центров Rhodobacter sphaeroides R

5. 4. Влияние воды НОН55 на первичные процессы разделения зарядов в реакционных центрах Rba. sphaeroides R

Глава 6. РОЛЬ ТИРОЗИНА М210 В СТАБИЛИЗАЦИИ ПЕРВИЧНО РАЗДЕЛЕННЫХ ЗАРЯДОВ В РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРАХ

БАКТЕРИАЛЬНОГО ФОТОСИНТЕЗА

6. 1. Первичный этап разделения зарядов в реакционных центрах мутанта

YM21OW Rhodobacter sphaeroides

6. 2. Первичный этап разделения зарядов в реакционных центрах мутантов YM210L/FM197Y и YM210L/IiL16SL Rhodobacter sphaeroides 162 6.3. Стабилизация состояния Р+ВА~ с участием тирозина М

Глава 7. КОГЕРЕНТНЫЙ ПЕРЕНОС ЭЛЕКТРОНА В В-ЦЕПИ

РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРОВ БАКТЕРИАЛЬНОГО ФОТОСИНТЕЗА

7. 1. Когерентный перенос электрона в В-цепи реакционных центров мутанта

НМ182L Rba. sphaeroides

7.2. Когерентный перенос электрона в В-цепи реакционных центров Cfic. aurantiacus

7. 3. Схема движения волнового пакета при когерентном разделении зарядов в А- и В-цепи реакционных центров Cfic. aurantiacus и мутанта HM182L Rba. sphaeroides

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фемтосекундные процессы разделения зарядов в реакционных центрах бактериального фотосинтеза"

Актуальность темы.

Фотосинтез - это глобальный биологический процесс преобразования солнечной энергии в энергию химически устойчивых соединений. Фотосинтез растений и водорослей является основным источником кислорода и органических соединений на Земле, которые служат для питания человека и животных в настоящее время, а также запасены в виде ископаемых углеводородов. Солнечная энергия - это практически неисчерпаемый и экологически чистый вид энергии. Важность исследований процессов фотосинтеза является очевидной как с научной стороны, так и с прикладной.

Фотосинтез представляет собой совокупность сложнейших физических и химических превращений, которые начинаются с поглощения квантов света в светособирающих комплексах хлорофилла. Затем энергия возбуждения передается на реакционные центры (РЦ) фотосинтеза, представляющие собой особые пигмент-белковые комплексы в составе клеточной мембраны. Создание лазерных спектрометров сверхвысокого временного разрешения в сочетании с методами направленного мутагенеза и получением рентгеноструктурных данных о трехмерном строении ряда РЦ обусловило быстрый рост объема данных о первичных этапах фотосинтеза. Эти данные имеют фундаментальный характер и формируют современные представления о мире. В результате серии быстрых реакций переноса электрона в РЦ происходит первичное преобразование световой энергии в энергию разделенных зарядов с феноменальной квантовой (~100%) и высокой энергетической эффективностью. Универсальность структуры и функции РЦ всех известных фотосинтезирующих организмов заключается в том, что первичное разделение зарядов в этих РЦ происходит между синглетно-возбужденным первичным донором электрона Р и производными хлорофилла. В РЦ пурпурной бактерии ЮгойоЪаМег (ЯЬа.) sphaeroid.es, которая является классическим объектом изучения, разделение зарядов происходит вдоль фотоактивной А-цепи пигментов и заключается в переносе электрона от возбужденного димера бактериохлорофилла Р* на бактериофеофитин На за ~3 пс и далее с Нд~ на хинон СЫ за -200 пс [Нокеп еі аі., 1980; РаБсЬепко еі аі., 1985; Каийпапп й аі., 1975; Яоскеу й а1., 1975].

Проблема участия молекулы мономерного бактериохлорофилла ВА в качестве промежуточного акцептора в первичном разделении зарядов имеет многолетнюю историю и логично следует из положения Вд между Р и На согласно рентгеноструктурным данным ІРеізепІюґег сі аі., 1984; Егтіег еі аі., 1994]. Первые указания на возможность переноса электрона на Вд были получены в [Бішуаіоу еі аі., 1978; Сііекаїіп еі аі., 1987], однако затем в течение долгого времени в ряде лабораторий не удавалось получить убедительные доказательства прямого участия ВА в разделении зарядов. Результаты пико- и фемтосекундной спектроскопии постепенно привели к пониманию основной сложности обнаружения состояния Р+Вд~, которая связана с его малой заселенностью [Holzapfel et al., 1989, Arlt et al., 1993]. Другая сложность связана с тем, что в видимом диапазоне, где проводилось подавляющее большинство измерений, спектр состояния Р+ВА~ сильно замаскирован спектрами других состояний. Получить убедительное доказательство существования состояния Р+Вд~ удавалось только в химически модифицированных РЦ, в которых блокирование переноса электрона на Нд приводило к накоплению состояния Р+Вд в пикосекундном диапазоне [Kennis et al., 1997]. Таким образом, вопрос об участии молекулы Вд в переносе электрона в нативных РЦ оставался во многом открытым. Анализ большого количества данных, полученных по данной проблеме, указывает на их противоречивость и неоднозначность интерпретации, что связано как с техническими сложностями, так и с недостатком знаний (обзоры в [Шувалов, 1990, 2000]). Для окончательного решения вопроса о роли Вд в разделении зарядов перспективно изучение полосы поглощения аниона ВА~ в области 1 мкм, которая впервые обнаружена в растворе BChl- в [Fajer et al., 1975].

Ближайшее окружение молекулы Вд может влиять на первичное разделение зарядов, динамически воздействуя на уровень свободной энергии состояния Р+Вд~ или являясь составной частью пути переноса электрона. Интересной и практически неизученной стороной этой проблемы является влияние молекулы воды, обнаруженной недавно в непосредственной близости от ВА [Ermler et al., 1994]. Другим важным аспектом является выявление механизма существенного влияния молекулы тирозина М210, расположенной вблизи Вд, на первичное разделение зарядов [Hamm et al, 1993]. Кроме того, движение ядерной подсистемы, на фоне которого происходит перенос электрона, также влияет на параметры первичной реакции разделения зарядов [Vos et al., 1991, 1993]. Для решения вопроса об участии определенных мод этого движения в разделении зарядов в РЦ необходима прямая регистрация первичного состояния фотопродукта методами фемтосекундной спектроскопии. Цели и задачи исследования.

Целью данной работы было исследование вовлеченности молекулы бактериохлорофилла ВА и ее ближайшего окружения в первичную (физическую) фазу разделения зарядов в РЦ бактериального фотосинтеза. В работе были поставлены следующие задачи: 1. Исследовать участие молекулы бактериохлорофилла в А-цепи ВА в первичном разделении зарядов в РЦ пурпурной бактерии Rhodobacter (Rba.) sphaeroides R-26 и зеленой бактерии Chloroßexus (CJx). aurantiacus, для чего: а) Определить взаимное расположение уровней свободной энергии первичного состояния с разделенными зарядами Р+ВЛ~ и возбужденного состояния димера бактериохлорофилла Р* в РЦ ЯЬа. зрЬаегоЫся К-26; б) Исследовать динамику формирования и распада ИК полосы поглощения аниона бактериохлорофилла Вд~ в процессе первичного разделения зпрядов в РЦ.

2. Исследовать влияние молекулы кристаллографической воды НОН55, входящей в состав РЦ ЯЬа. .чрИаего1с1е^- К-26, на процессы первичного разделения и переноса зарядов.

3. Исследовать роль тирозина М210 в процессе первичного разделения зарядов и стабилизации разделенных зарядов в РЦ ЯЬа. sphaeroid.es Я-26 и в РЦ мутантов по этому сайту.

4. Экспериментально и теоретически исследовать влияние коллективных движений ядерной подсистемы на процессы первичного разделения зарядов в РЦ фотосинтезирующих бактерий, для чего: а) Исследовать влияние коллективных движений ядер на населенности состояний с первично разделенными зарядами при фемтосекундном световом возбуждении; б) Провести теоретическое моделирование первичного разделения зарядов с учетом движений ядерного волнового пакета, который формируется при фемтосекундном возбуждении РЦ; в) Исследовать возможность когерентного переноса электрона в малоактивную В-цепь пигментов РЦ.

Научная новизна работы.

1. В результате исследования фемтосекундной динамики ИК полосы поглощения аниона мономерного бактериохлорофилла в А-цепи Вл~ впервые получено прямое доказательство реального участия Вд в первичном разделении зарядов в нативных РЦ ЯЬа. sphaeroid.es П-26 и С/х. аигапИаст. Аналогичный вывод сделан и в отношении ряда мутантных РЦ ЯЬа. sphaeroides. Таким образом, Вд является первичным акцептором электрона, а состояние Р+ВА~ - первичным состоянием с разделенными зарядами в этих РЦ.

2. По результатам исследования температурной зависимости замедленной флуоресценции феофитин-модифицированных РЦ ЯЬа. 8рЬаего'1йе8 К-26 найдено, что уровень свободной энергии первичного состояния с разделенными зарядами Р+Вд~ находится ниже уровня свободной энергии возбужденного состояния димера Р* на -550 см-1. Положение уровня свободной энергии Р+Вд ниже аналогичного уровня Р* создает условия для реального участия молекулы Вд в переносе электрона от Р*.

3. Впервые получены прямые экспериментальные доказательства влияния коллективных движений ядер (в форме волнового пакета) в возбужденном состоянии димера Р* на первичное разделение зарядов в нативных и мутантных РЦ Rba. sphaeroides и в нативных РЦ Cfx. aurantiacus. Показано, что обнаруженные осцилляции населенностей первичных состояний с разделенными зарядами отражают обратимые переходы волнового пакета ядер с поверхности потенциальной энергии Р* на аналогичные поверхности фотопродуктов. Выявлены характерные моды ядерных движений, сопряженные с переносом электрона.

4. Впервые показано, что молекула кристаллографически определенной воды НОН55, расположенная вблизи бактериохлорофилла Вд в РЦ Rba. sphaeroides, оказывает сильное влияние на перенос электрона от димера бактериохлорофилла Р к Вд. Присутствие воды НОН55 ускоряет первичное разделение зарядов в ~4 раза, а ее вращение, регистрируемое при фемтосекундном возбуждении Р, модулирует населенность состояния Р+Вд~ с частотой 32 см-1 и кратными частотами. Анализ влияния воды НОН55 на перенос электрона с помощью мутантов по сайту М203 выявил один из возможных наиболее эффективных путей переноса электрона от Р к Вд с участием НОН55 по цепочке полярных групп атомов N-Mg(PB) -N-C-N(HisM202)-HOH55-O=(BA).

5. Выявлена ключевая роль тирозина М210, находящегося вблизи димера Р и мономерного бактериохлорофилла Вд в РЦ Rba. sphaeroides, в процессе первичного разделения зарядов и стабилизации разделенных зарядов. Впервые показано, что замедление первичной реакции переноса электрона в десятки раз в мутантных РЦ, не содержащих тирозин М210, сопровождается отсутствием стабилизации разделенных зарядов в состоянии Р+Вд~". Показано, что отсутствие тирозина М210 в мутантных РЦ не компенсируегся его введением в положение Ml 97 или значительным увеличением разницы свободной энергии состояний Р* и Р+Вд~. Выявлено стабилизирующее влияние полярной ОН-группы тирозина М210 на состояние Р+Вд~ в процессе разделения зарядов в тирозин-содержащих РЦ.

6. Впервые в мутантных РЦ ЯЬа. spiiaeroid.es и в РЦ С/х. аигапИаст обнаружен обратимый перенос электрона в малоактивную В-цепь, вызванный когерентным движением ядерного волнового пакета. Этот перенос возникает раньше на 60-80 фс, чем аналогичный когерентный перенос электрона в фотоактивной А-цепи. Возникновение когерентного переноса электрона в В-цепи не зависит от наличия или отсутствия условий для обычного, некогерентного переноса, а определяется в основном динамикой волнового пакета.

Научная и практическая значимость.

Работа имеет выраженную фундаментальную направленность. Получена новая информация о самых ранних стадиях процессов преобразования световой энергии в энергию состояний с разделенными зарядами в реакционных центрах бактериального фотосинтеза. Полученные результаты имеют приоритетный характер и во многом задают направление исследований в данной области. Работы по выявлению участников первичного разделения зарядов в РЦ, исследования по когерентному переносу электрона в обеих цепях РЦ, изучение роли ближайшего окружения первичного донора Р и акцептора Вд в разделении зарядов между ними - все эти направления находятся в русле мировых исследований. Данные по участию мономера бактериохлорофилла Вд в первичном разделении зарядов, по когерентным осцилляциям в первичных состояниях с разделенными зарядами, по влиянию кристаллографической воды НОН55 в переносе электрона, по ключевой роли тирозина М210 в стабилизации первично разделенных зарядов, по обратимому переносу электрона в неактивную В-цепь получены впервые. Полученные результаты могут найти применение при моделировании живых систем и создании преобразователей солнечной энергии.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Мономер бактериохлорофилла Вд является первичным акцептором электрона в РЦ ЛЬа. $р}гаего1с1е$ и С/х. аигапйасия, участвуя в двухступенчатой схеме переноса электрона от возбужденного димера бактериохлорофилла Р* к Вд и далее от Вд к бактериофеофитину Нд. Этому способствует положение уровня свободной энергии состояния Р+ВА" ниже аналогичного уровня Р* на ~550 см-1.

2. Коллективные движения ядер влияют на первичное разделение зарядов в РЦ Ш>а. яркаего^Лея и С/х. сшгапйаст и визуализируются в виде осцилляций, возникающих в результате фемтосекундного возбуждения РЦ в населенностях первичных состояний с

разделенными зарядами и в населенности возбужденного состояния димера Р*. Временные и спектральные особенности данных осцилляций отражают движение ядерного волнового пакета по поверхностям потенциальной энергии указанных состояний. Теоретическое моделирование коллективных ядерных движений с помощью теории Редфилда в приближении двух независимых координат объясняет осциллирующий характер процессов первичного разделения зарядов и формирования соответствующих состояний с разделенными зарядами в РЦ.

3. Молекула воды НОН55, расположенная в РЦ КЬа. зркаегогйез между димером бактериохлорофилла Р и мономером бактериохлорофилла Вд, ускоряет перенос электрона от Р* к Вд, который может происходить по цепи полярных групп атомов 1чГ-1^(Рв) -N-0-К(ШзМ202) -Н0Н55-0=(Вд). Вращение этой молекулы, выявляемое при фемтосекундном световом возбуждении димера Р, происходит с фундаментальной частотой 32 см-1 и приводит к появлению моды 32 см-1 и ее обертонов в осцилляциях кинетики полосы поглощения аниона бактериохлорофилла Вд" при 1020 нм.

4. Тирозин М210, находящийся вблизи димера бактериохлорофилла Р и мономера бактериохлорофилла Вд в РЦ КЬа. sphaeroid.es, играет ключевую роль в процессе первичного разделения зарядов и стабилизации разделенных зарядов в этих РЦ. Отсутствие тирозина М210 в мутантных РЦ приводит к значительному замедлению первичного разделения зарядов и отсутствию стабилизации разделенных зарядов. Взаимодействие полярной ОН-группы ТугМ210 с заряженными молекулами Р+ и Вд~ ускоряет разделение зарядов между ними и стабилизирует состояние Р+Вд" в нативных РЦ ЯЬа. $рЬаего1с1ез.

Апробация результатов.

Основные результаты диссертации отражены в 37 публикациях и доложены на рабочем совещании « Реакционные центры фотосинтетических бактерий: структура и динамика» (Фелдафинг, Германия, 1995); XI международном конгрессе по фотосинтезу (Будапешт, Венгрия, 1998); на XI международном симпозиуме «Сверхбыстрые явления в спектроскопии» (Тайпей, Тайвань, 1999); на 60-ом ежегодном Тимирязевском чтении (Москва, 1999); на XII международной конференции «Сверхбыстрые процессы в спектроскопии» (Флоренция, Италия, 2001); на III съезде Российского биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); на III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); на 13-ом международном конгрессе по фотосинтезу (Монреаль, Канада, 2004); на 14-ой европейской конференции по биоэнергетике (Москва, 2006); на 3-ей Московской международной конференции по компьютерной молекулярной биологии (Москва, 2007); на международной конференции «Преобразование световой энергии при фотосинтезе (Пущино, 2008); на 4-ой Московской международной конференции по компьютерной молекулярной биологии (Москва, 2009); на XIX Пущинских чтениях по фотосинтезу и Всероссийской конференции "Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах" (Пущино, 2009); на 15-ом международном конгрессе по фотосинтезу (Пекин, Китай, 2010); на семинарах НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова и кафедры биофизики Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 37 работ (25 - в журналах и сборниках, 12 - в трудах конференций и конгрессов), список которых приведен в конце автореферата.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Материалы работы изложены на 263 страницах машинописного текста, включая 69 рисунков. Список литературы содержит 368 библиографических ссылок.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Яковлев, Андрей Георгиевич

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

I. Впервые получены прямые экспериментальные доказательства того, что в реакционных центрах КЬа. sphaeroid.es 11-26, С/5;. аигапИасш и ряда мутантов ЯЬа. sphaeroides первичным акцептором электрона является молекула мономерного бактериохлорофилла в А-цепи Вд.

1) В этих реакционных центрах с помощью высокочувствительной дифференциальной спектроскопии поглощения с временным разрешением 18-25 фс проведена прямая регистрация ИК полосы поглощения аниона Вд~ (при 1020 нм в КЬа. sphaeroides и при 1028 нм в С^с. аигапНаст), появление которой однозначно указывает на разделение зарядов между возбужденным состоянием первичного донора электронов, димера бактериохлорофилла Р*, и Вд.

2) Исследование температурной зависимости замедленной флуоресценции феофитин-модифицированных реакционных центров КЬа. sphaeroides 11-26 показало, что уровень свободной энергии первичного состояния с разделенными зарядами Р+Вд~ находится ниже уровня свободной энергии возбужденного состояния димера Р* на 550 ± 30 см-1. Этот фундаментальный факт создает предпосылку для прямого участия Вд в первичном переносе электрона от Р*.

3) Исследование фемтосекундной динамики полосы поглощения Вд~ полностью подтверждает последовательную схему переноса электрона при первичном разделении зарядов в бактериальных реакционных центрах (Р* —» мономерный бактериохлорофилл Вд —> бактериофеофитин Нд —>.), впервые предложенную более 30 лет назад в пионерских работах В.А. Шувалова и соавт. Показано, что время жизни состояния Р+Вд~ в реакционных центрах ЯЬа. sphaeroides 11-26 и С/х. аигапНаст не превышает нескольких пс, что связано с быстрым переносом электрона на бактериофеофитин Нд.

II. Впервые экспериментально показано, что молекула кристаллографической воды НОН55, входящая в состав реакционного центра КЬа. sphaeroides, играет важную роль в переносе электрона от первичного донора электрона Р* к первичному акцептору Вд.

1) Удаление воды НОН55 из структуры РЦ в мутантах по сайту М203 замедляет первичную реакцию разделения зарядов между Р* и Вд примерно в 4 раза.

2) Вращение молекулы воды НОН55, выявляемое при фемтосекундном возбуждении реакционного центра КЬа. 5рЬаего'^ез, приводит к модуляции населенностей первичных состояний с разделенными зарядами Р+Вд~ и Р+Нд~ на частоте вращения 32 см-1 и кратных ей частотах. Принадлежность моды 32 см-1 и ее гармоник к вращению воды НОН55 доказана в экспериментах с реакционными центрами, не содержащими данную молекулу. При удалении воды НОН55 из структуры реакционного центра мода осцилляций при 32 см-1 и ее гармоники исчезают, а при замене этой воды на тяжелую воду происходит изотопическое понижение частот указанных мод с коэффициентом, характерным для вращательных спектров.

3) С учетом данных рентгеноструктурного анализа реакционных центров, вода НОН55 может быть включена в одну из пространственных троп эффективного переноса электрона по цепи полярных групп атомов, соединяющей димер Р и мономер Вд: N— Mg(PB) -N-C-N(HisM202) -Н0Н55-0=(ВЛ).

III. Впервые экспериментально раскрыто определяющее влияние тирозина М210, находящегося в реакционном центре Rba. sphaeroides вблизи димера Р и мономера бактериохлорофилла Вд, на первичное разделение зарядов и стабилизацию разделенных зарядов в реакционных центрах.

1) Показано, что отсутствие тирозина М210 в мутантных реакционных центрах препятствует стабилизации разделенных зарядов в состоянии Р+ВА~, что сопровождается сильным замедлением процесса первичного разделения зарядов.

2) Найдено, что значительное понижение уровня свободной энергии состояния Р+ВА~ относительно аналогичного уровня возбужденного состояния Р* в реакционных центрах мутантов Rba. sphaeroides не способно компенсировать отсутствие тирозина М210 и ускорить разделение зарядов.

3) Показано, что отсутствие тирозина М210 в мутантных реакционных центрах не компенсируется его введением в положение М197.

4) Выявлено стабилизирующее влияние полярной ОН-группы тирозина М210 на состояние Р+Вд" в процессе разделения зарядов в тирозин-содержащих РЦ.

IV. Впервые получены прямые экспериментальные доказательства (подтверждаемые теоретически) сопряжения ядерных движений с переносом электрона при первичном разделении зарядов в реакционных центрах пурпурных и зеленых бактерий.

1) Продемонстрирована связь коллективных ядерных движений в виде волнового пакета, созданного в состоянии Р* при фемтосекундном возбуждении реакционных центров Rba. sphaeroides R-26 и Cfx. aurantiacus, и впервые обнаруженных осцилляций населенностей состояний фотопродуктов Р+Вд~ и Р+НА~. С помощью Фурье-анализа этих осцилляций выявлены характерные моды ядерных движений, сопряженные с первичным переносом электрона.

2) Экспериментально показано, что периодическое появление волнового пакета с частотой -130 см-1 вблизи пересечения поверхностей потенциальной энергии Р* и Р+Ва~ в реакционных центрах приводит к обратимому переносу электрона на Вд, что выражается в синхронных осцилляциях поглощения ВА~ и вынужденного излучения P*. Найдено, что часть волнового пакета, проникшая на поверхность Р^ТЗд-, затем эффективно переходит на поверхность Р+НА".

3) Обнаружено, что при фемтосекундном возбуждении реакционных центров Cfx. aurantiacus и мутантных по сайту Ml 82 реакционных центров Rba. sphaeroides происходит обратимый перенос электрона от Р* в малоактивную В-цепь, который целиком определяется движениями ядерного волнового пакета и опережает начало аналогичного переноса в А-цепь на 60-80 фс. Показано, что этот процесс определяется присутствием волнового пакета на коротковолновом склоне потенциальной поверхности Р* вблизи ее пересечения с потенциальной поверхностью первичного состояния с разделенными зарядами в В-цепи.

4) Теоретическое моделирование динамики волнового пакета в рамках теории Редфилда подтвердило возможность его многократных, обратимых переходов с поверхности донора Р* на поверхность фотопродукта Р+ВА~ с сохранением когерентности. Показано, что учет как минимум двух коллективных ядерных мод, соответствующих двум координатам реакции, необходим для объяснения экспериментальных кинетик состояний Р* и Р+Вд~.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В заключении сформулирован общий итог работы, определяющий ее место в общемировых исследованиях по данной тематике. Первичный акт фотосинтеза заключается в преобразовании энергии света в энергию разделенных зарядов, которая используется в дальнейших реакциях фотосинтеза. Он происходит в специальных пигмент-белковых комплексах (реакционных центрах) с высокой эффективностью. Поглощение фотона в светособирающей антенне и в самих реакционных центрах приводит в конечном итоге к возбуждению спецпары (димер бактериохлорофилла в реакционных центрах бактерий), которая выполняет функцию конечного акцептора энергии возбуждения и одновременно первичного донора электронов Р. Первичный перенос электрона в реакционных центрах происходит с высокой скоростью между кофакторами хлорофилловой природы, взаимное расположение которых обеспечивается структурой белка реакционных центров. Каждый новый этап переноса электрона сопровождается потерей энергии исходно поглощенного кванта в обмен на увеличение времени диссипации запасенной энергии при постепенном его увеличении на каждом этапе разделения зарядов. Удаление электрона от его первичного донора сопровождается уменьшением энергии взаимодействия неспаренных электронов, а скорость движения электрона назад по вакантным орбиталям также уменьшается в связи с увеличением фактора Больцмана. В результате время диссипации запасенной энергии увеличивается от -300 пс в состоянии Р* до -0,1 с в состоянии Р+СЫ~ Максимально высокая скорость прямых реакций переноса электрона, намного превышающая скорость процессов рекомбинации и релаксации, является ключевым фактором, обеспечивающим высокую эффективность работы реакционных центров и фотосинтеза в целом.

В реакционных центрах бактерий молекула дополнительного бактериохлорофилла Вд является первичным акцептором электрона и обеспечивает высокую скорость приема электрона от первичного донора Р* и еще большую скорость передачи электрона на следующий акцептор, бактериофеофитин Нд. Это достигается за счет малости или отсутствия активационных барьеров реакций разделения зарядов и за счет хорошего перекрытия электронных орбиталей участников этих реакций. Без прямого участия Вд в переносе электрона достижение максимально высокой скорости этого переноса невозможно. Ближайшее окружение молекулы Вд служит достижению той же цели, ускоряя перенос электрона. Ярким примером этого ускорения является влияние на первичный перенос электрона молекулы кристаллической воды НОН55 и молекулы тирозина М210. Отсутствие данных молекул в окружении Вд приводит к сильному замедлению переноса электрона. Механизмы влияния молекул окружения Вд на перенос электрона могут включать прямое влияние на энергетику реакций разделения зарядов, участие в процессе динамической стабилизации разделенных зарядов в состоянии Р+ВА-или прямую включенность в состав пространственной тропы переноса электрона. Отличительной особенностью молекул НОН55 и тирозина М210 является их полярность, которая позволяет настраивать механизмы влияния в ответ на появление разделенных зарядов, то есть обеспечивает обратную связь между этими механизмами и процессом разделения зарядов.

В переносе электрона между реагентами активную роль играют колебания ядерной подсистемы. Возбуждение реакционных центров фемтосекундными световыми импульсами создает коллективные движения ядер в форме волнового пакета. Это состояние не имеет аналогов в природе, но служит ценным источником информации о влиянии ядерных движений на перенос электрона в эксперименте. Фемтосекундная спектроскопия демонстрирует, что само возбуждение одного из электронов Р не приводит к разделению зарядов. Только движение ядерной подсистемы вначале в самом Р*, а затем в его окружении, куда входит и молекула ВА, приводит в итоге к переносу электрона с Р* на Вд с образованием первичного продукта Р+ВА~. Это движение, вероятно, направлено на максимально возможное сближение Р* и ВА. Импульс, приобретенный в результате такого движения, может быть использован как для преодоления энергетического барьера переноса электрона с Р* на ВА, так и для дальнейшего движения, приводящего к разведению продуктов реакции Р+ и ВА~ в пространстве. Сопряжение движений ядерной и электронной подсистем, таким образом, важно для эффективного преобразования световой энергии в энергию разделенных зарядов при фотосинтезе. Это справедливо как в отношении активной А-цепи реакционных центров бактерий, так и для малоактивной В-цепи.

Автор выражает глубокую благодарность всему коллективу соавторов за неоценимую помощь в работе. Работы по теме диссертации частично финансировались грантами РФФИ, ШТАБ и МНТЦ.

Библиография Диссертация по биологии, доктора физико-математических наук, Яковлев, Андрей Георгиевич, Москва

1. Волошин В.П., Желиговская Е.А., Маленков Г.Г., Наберухин Ю.И., Тытик Д.Л. (2001) Структуры сеток водородных связей и динамика молекул воды в конденсированных водных системах. Росс. хим. журн. (Жури. Росс хим. общ-ва) XLV, N 3, 31-37.

2. Волькенштейн М.В. (1981) Биофизика, Наука, Москва, 575 с.

3. Герцберг Г.(1949) Колебательные и вращательные спектры многоатомных молекул. Пер. с англ. под ред. H.H. Соболева. Изд.-во иностр. лит.-ры. Москва, 858 с.

4. Горохов В.В., Нокс П.П., Корватовский Б.Н., Пащенко В.З. Захарова Н.И., Рубин А.Б. (1998) Эффекты дейтерирования и криорастворителей в первичных процессах фотосинтетического преобразования энергии. Биологические мембраны, 15, №5, 477-489.

5. Ландау Л.Д., Лившиц, Е.М. (1963) Квантовая механика. Физматгиз, Москва.

6. Матвеец Ю.А., Чекалин C.B., Шкуропатов А.Я., Шувалов В.А., Ярцев А.П. (1987) Фемтосекундная спектроскопия первичного переноса заряда в реакционных центрах Rhodopseudomonas Sphaeroides, модифицированных NaB Н4. ДЛ H СССР, 294, 1480-1484.

7. Набиев И.Р., Ефремов Р.Г., Чуманов Г.Д. (1988) Гигантское комбинационное рассеяние и его применение к изучению биологических молекул. Успехи физических наук, 154, 459-496.

8. Петров Э.Г. (1984) Физика переноса зарядов в биосистемах. Киев, Наукова Думка, 368 с.

9. Рубин А.Б., Шинкарев В.П. (1984) Транспорт электронов в биологических системах. М., Наука, 320 с.

10. Рубин А.Б. (2000) Биофизика, Москва, в 2-х т.

11. Соколов А. А., Тернов И.М. (1970) Квантовая механика и атомная физика. Просвещение, Москва, 423 с.

12. Фок М.В., Борисов А.Ю. (1981) Роль воды в стабилизации разделенных зарядов в первичном акте фотосинтеза. Молекуляр. биология, 15, №3, 575-581.

13. Шувалов В.А. (1990) Первичное преобразование световой энергии при фотосинтезе. М., Наука, 208 с.

14. Шувалов В.А. (2000) Преобразование солнечной энергии в первичном акте разделения зарядов в реакционных центрах фотосинтеза. М., Наука, 50 с.

15. Яворский Б. М., Детлаф А. А. (1990) Справочник по физике, Наука, Москва, 624 с.

16. Alden R.G., Parson W.W., Chu Z.T., and Warshel A. (1995) Calculations of electrostatic energies in photosynthetic reaction centers. J. Am. Chem. Soc., 117, 12284-12298.

17. Alden R.G., Parson W.W., Chu Z.T., and Warshel A. (1996b) Orientation of the OH dipole of tyrosine (M)210 and its effect on electrostatic energies in photosynthetic bacterial reaction centers. J. Phys. Chem., 100, 16761-16770.

18. Allen J.P., Feher J., Yeates T.O., Komiya H., and Rees D.C. (1987a) Structure of reaction center from Rhodobacter sphaeroides R-26: The cofactors. Proc. Natl. Sci. USA., 84, 5730-5734.

19. Allen J.P., Feher J., Yeates T.O., Komiya H., and Rees D.C. (1987b) Structure of reaction center from Rhodobacter sphaeroides R-26: The protein subunits. Proc. Natl. Sci. USA., 84, 6162-6166.

20. Allen J.P., and Williams J.C. (1995) Relationship between the oxidation potential of the bacteriochlorophyll dimer and electron transfer in photosynthetic reaction centers. J. Bioenerg. Biomembr., 27, 275-283.

21. Ando K., Sumi H. (1998) Nonequilibrium oscillatory electron transfer in bacterial photosynthesis. J. Phys. Chem. B., 102, 10991-11000.

22. Arlt T., Schmidt S., Kaiser W., Lauterwasser C., Meyer M., Scheer H., and Zinth W. (1993) The accessory bacteriochlorophyll: A real electron carrier in primary photosynthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 11757-11762.

23. Arlt T., Bibikova M., Penzkofer H., Oesterhelt D., and Zinth W. (1996a) Strong acceleration of primary photosynthetic electron transfer in a mutated reaction center of Rhodopseudomonas viridis. J. Phys. Chem., 100, 12060-12065.

24. Bixon M., Jortner J., and Michel-Beyerle M.E. (1991) On the mechanism of the primary charge separation in bacterial photosynthesis Biochim. Biophys. Acta, 1056, 301-315.

25. Bixon M., Jortner J., and Michel-Beyerle M.E. (1995) A kinetic analysis of the primary charge separation in bacterial photosynthesis. Energy gaps and static heterogeneity. Chem. Phys., 197, 389404.

26. Blankenship R.E., Schaafsma T.J., and Parson W.W. (1977) Magnetic field effects on radical-pair intermediates in bacterial photosynthesis. Biochim. Biophys. Acta, 461, 297-305.

27. Blankenship R. E., Feick R., Bruce B. D., Kirmaier C., Holten D., and Fuller R. C. (1983) Primary photochemistry in the facultative green photosynthetic bacterium Chloroflexus aurantiacus. J. Cell. Biochem., 22, 251-261.

28. Blomberg M.R.A., Siegbahn P.H.M., and Babcock G.T. (1998) Modeling electron transfer in biochemistry: A quantum chemical study of charge separation in Rhodobacter sphaeroides and photosystem II. J. Am. Chem. Soc., 120, 8812-8824.

29. Boxer S.G., Chidsey E.D., and Roelofs M.G. (1983) Magnetic field effects on reaction yields in the solid state: An example from photosynthetic reaction centers. Ann. Rev. Phys. Chem., 34, 389-417.

30. Boxer S.G., Goldstein R.A., Lockhart D.J., Middendorf T.R., and Takiff L. (1989) Excited states, electron-transfer reactions, and intermediates in bacterial photosynthetic reaction centers. J. Phys. Chem. 93, 8280-8294.

31. Breton J., Martin J.-L., Fleming G.R., and Lambry J.-C. (1988) Low temperature femtosecond spectroscopy of the initial step of electron transfer in reaction centers from photosynthetic purple bacteria. Biochemistry, 27, 8276-8284.

32. Bruce B. D., Fuller R. C., and Blankenship R. E. (1982) Primary photochemistry in the facultativelyaerobic green photosynthetic bacterium Chloroflexns aurantiacus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79, 6532-6536.

33. Bylina E.J., Kirmaier C., McDowell L., Holten D., and Youvan D.C. (1988) Influence of an amino-acid residue on the optical properties and electron transfer dynamics of a photosynthetic reaction centre complex. Nature, 336, 182-184.

34. Bylina E.J., and Youvan D.C. (1988) Directed mutations affecting spectroscopic and electron transfer properties of the primary donor in the photosynthetic reaction center. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 7226-7230.

35. Bylina E.J., Kolaczkowski S.V., Norris J.R., and Youvan D.C. (1990) EPR characterization of genetically modified reaction centers of Rhodobacter capsulatus. Biochemistry, 29, 6203-6210.

36. Ceccarelli M. and Marchi M. (2003) Simulation and modeling of the Rhodobacter sphaeroides bacterial reaction center II: Primary charge separation. J. Phys. Chem. B, 107, 5630-5641.

37. Chan C.K., DiMagno T.J., Chen L.X.Q., Norris J.R., and Fleming G.R. (1991a) Mechanism of the initial charge separation in bacterial photosynthetic reaction centers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 11202-11206.

38. Chan C.K., Chen L.X.Q., Dimagno T.J., Hanson D.K., Nance S.L., Schiffer M., Norris J.R., and Fleming G.R. (1991b) Mechanism of the initial charge separation in photosynthetic bacterial reaction centers. Chem. Phys. Lett., 176, 366-372.

39. Chang C.-H., Schiffer M., Tiede D., Smith U., and Norris J. (1985) Characterization of bacterial photosynthetic reaction center crystals from Rhodopseudomonas sphaeroides R-26 by X-ray diffraction. J. Mol. Biol., 186, 201-203.

40. Chang C.-H., Tiede D., Tang J., Smith U., and Norris J., and Schiffer M. (1986) Structure of Rhodopseudomonas sphaeroides R-26 reaction center. FEBS Lett., 205, 82-86.

41. Czarnecki, K., Kirmaier, C., Holten, D., and Bocian, D.F. (1999) Vibrational and photochemical consequences of an Asp residue near the photoactive accessory bacteriochorophyll in the photosynthetic reaction center. J. Phys. Chem. A 103, 2235-2246.

42. Chekalin S.V., Matveetz Yu.A., Shkuropatov A.Ya., Shuvalov V.A., and Yartsev A.P. (1987) Femtosecond spectroscopy of primary charge separation in modified reaction centers Rhodopseudomonas Sphaeroides (R26). FEBS Lett., 216, 245-248.

43. Chen L., Holten D., Bocian D.F., and Kirmaier C. (2004) Effects of hydrogen bonding and structure of the accessory bacteriochlorophylls on charge separation in Rb. capsulatus reaction centers. J. Phys. Chem. B, 108, 10457-10464.

44. Cherepanov D.A., Krishtalik L.I., Mulkidjanian A.Y. (2001) Photosynthetic electron transfer controlled by protein relaxation: analysis by Langevin stochastic approach. Biophys. J., 80, 10331049.

45. Chernyak V., Minami T., and Mukamel S. (2000) Exciton transport in molecular aggregates probed by time and frequency gated optical spectroscopy. J. Chem. Phys., 112, 7953-7963.

46. Chuang J.I., Boxer S.G., Holten D., and Kirmaier C. (2006) High yield of M-side electron transfer in mutants of Rhodobacter capsulatus reaction centers lacking the L-side bacteriopheophytin. Biochemistry, 45, 3845-3851.

47. Creighton S., Hwang J.-K., Warshel A., Parson W.W., and Norris J. (1988) Simulating the dynamics of the primary charge separation process in bacterial photosynthesis. Biochemistry, 27, 774-781.

48. Czarnecki K., Kirmaier C., Holten D., and Bocian D.F. (1999) Vibrational and photochemical consequences of an Asp residue near the photoactive accessory bacteriochlorophyll in the photosynthetic reaction center. J. Phys. Chem. A, 103,2235-2246.

49. Dahlbom M., Minami T., Chernyak V., Pillerits T., Sundstrom V., and Mukamel S. (2000) Exciton-wave packet dynamics in molecular aggregates studied with pump-probe spectroscopy. J. Phys. Chem. B, 104, 3976-3983.

50. Deisenhofer J., and Norris J.R. (eds.) (1993) The Photosynthetic Reaction Center. Vols. 1, 2. Academic Press, San Diego.

51. Deisenhofer J., Epp. O., Miki K., Huber R., and Michel H. (1985a) Structure of the protein subunits in the photosynthetic reaction centre of Rhodopseudomonas viridis at 3 Ä resolution. Nature, 318, 618-624.

52. Deisenhofer J., Michel H., and Huber R. (1985b) The structural basis of photosynthetic light reactions in bacteria. Trends Biochem., 10, 243-248.

53. Deisenhofer, J., Epp, O., Sinning, I., and Michel, H. (1995) Crystallographic refinement at 2.3 A resolution and refined model of the photosynthetic reaction centre from Rhodopseudomonas viridis. J. Mol. Biol 246, 429-457.

54. Du M., Rosenthal S.J., Xie X., DiMagno T.J., Schmidt M., Hanson D.K., Schiffer M., Norris J.R. and Fleming G.R. (1992) Femtosecond spontaneous emission studies of reaction centers from photosynthetic bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 8517-8521.

55. Egger R., and Mak C.H. (1994) Dissipative three-state system and the primary electron transfer in the bacterial photosynthetic reaction center. J. Phys. Chem. 98, 9903-9918.

56. Ermler U., Fritzsch G., Buchanan S.K., and Michel H. (1994) Structure of the photosynthetic reaction centre from Rhodobacter sphaeroides at 2.65-A resolution: Cofactors and protein-cofactor interactions. Structure, 2, 925-936.

57. Fajer J,, Brune D. C., Davis M. S., Forman A., and Spaulding L. D. (1975) Primary charge separation in bacterial photosynyhesis: oxidized chlorophylls and reduced pheophytin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 4956-4960.

58. Feher G., and Okamura M.Y. (1978) Chemical composition and properties of reaction centers. In: The photosynthetic bacteria, Clayton R.K., and Sistrom W.R. (eds.) N.Y.: Plenum Press, pp. 349386.

59. Figueirido F., Del Buono G.S., and Levy R.M. (1997) On the finite size corrections to the free energy of ionic hydration. J. Phys. Chem. B., 101, 5622-5623.

60. Finkele U„ Lauterwasser C., Zinth W., Gray K.A., and Oesterhelt D. (1990) Role of tyrosine M210 in the initial charge separation of reaction centers of Rhodobacter sphaeroides. Biochemistry, 29, 8517-8521.

61. Fleming G.R., Martin J.-L., and Breton J. (1988) Rates of primary electron transfer in photosynthetic reaction centers and their mechanistic implications. Nature, 333, 190-192.

62. Fyfe, P.K., Ridge, J.P., McAuley, K.E., Cogdell, R.J., Isaacs, N.W., and Jones, M.R. (2000) Structural consequences of the replacement of glycine M203 with aspartic acid in the reaction center from Rhodobacter sphaeroides. Biochemistry 39, 5953-5960.

63. Gardner K.H., and Kay L.E. (1998) The use of 2H, 13C, 15N multidimensional NMR to study the structure and dynamics of proteins. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 27, 357-406.

64. Gehlen J.N., Marchi M., and Chandler D. (1994) Dynamics affecting the primary charge-transfer in photosynthesis. Science, 263, 499-502.

65. Gilson M.K., Rashin A., Fine R., and Honig B. (1985) On the calculation of electrostatic interactions in proteins. J. Mol. Biol., 184, 503-516.

66. Godik V.I. and Borisov A.Y. (1979) Short-lived delayed luminescence of photosynthetic organisms. I. Nanosecond afterglows in purple bacteria at low temperatures. Biochim. Biophys. Acta, 548, 296308.

67. Godik V.I., Kotova E.A., and Borisov A.Y. (1982) Nanosecond recombination luminescence of purple bacteria. The lifetime temperature dependence in Rhodospirillum rubrwn chromatophores. Photobiochem. Photobiophys., 4, 219-226.

68. Goldsmith J.O., Boxer S.G., (1996) Rapid isolation of bacterial photosynthetic reaction centers with an engineered poly-histidine tag. Biochim. Biophys. Acta, 1276, 171-175.

69. Goldsmith J.O., King B., and Boxer S.G. (1996) Mg coordination by amino acid side chains is not required for assembly and function of the special pair in bacterial photosynthetic reaction centers. Biochemistry, 35, 2421-2428.

70. Goldstein R.A., and Boxer S.G. (1988) The effect of very high magnetic fields on the reaction dynamics in bacterial reaction centers: Implications for the reaction mechanism. Biochim. Biophys. Acta., 911, 70-77.

71. Gray K.A., Farchhaus J.W., Wachtweitl J., Breton J., Oesterhelt D. (1990) Initial characterization of site-directed mutants of tyrosine M210 in the reaction centre of Rhodobacter sphaeroides. EMBO J., 9, 2061-2070.

72. Gray H.B., and Winkler J.R. (1996) Electron transfer in proteins. Ann. Rev. Biochem., 65, 537-561.

73. Gray H.B., and Winkler J.R. (2005) Long-range electron transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 3534-3539.

74. Gunner M.R., and Dutton P.L. (1989) Temperature and -AG0 dependence of the electron transfer from BPh'~ to Qa in reaction center protein from Rhodobacter sphaeroides with different quinones as Qa. J. Am. Chem. Soc., Ill, 3400-3412.

75. Gunner M., Nichols A., and Honig B. (1996) Electrostatic potentials in Rhodopseudomonas viridis reaction centers: Implications for the driving force and directionality of electron transfer. J. Phys. Chem., 100,4277-4291.

76. Haberkorn R., and Michel-Beyerle M.E. (1979) On the mechanism of magnetic field effects in bacterial photosynthesis. Biophys. J., 26, 489-498.

77. Haffa A.L.M., Lin S., Katilius E., Williams J.C., Taguchi A.K.W., Allen J.P., and Woodbury N.W. (2002) The dependence of the initial electron-transfer rate on driving force in Rhodobacter sphaeroides reaction centers. J. Phys. Chem. B., 106, 7376-7384.

78. Haffa A.L.M., Lin S., Williams J.C., Taguchi A.K.W., Allen J.P., and Woodbury N.W. (2003) High yield of long-lived B-side charge separation at room temperature in mutant bacterial reaction centers. J. Phys. Chem. B, 107, 12503-12510.

79. Haffa A.L.M., Lin S., Williams J.C., Bowen B.P., Taguchi A.K.W., Allen J.P., and Woodbury N.W. (2004) Controlling the pathway of photosynthetic charge separation in bacterial reaction centers. J. Phys. Chem. B., 108, 4-7.

80. Hale M.B., Blankenship R.E., Fuller R.C. (1983) Menaquinone is the sole quinone in the facultatively aerobic green photosynthetic bacterium Chloroflexus aurantiacus. Biochim. Biophys. Acta, 723, 376-382.

81. Hamm P., and Zinth W. (1995) Ultrafast initial reaction in bacterial photosynthesis revealedby femtosecond infrared spectroscopy. J. Phys. Chem., 99, 13537-13544.

82. Hamm P., Gray K.A., Oesterhelt D., Feik R., Scheer H., and Zinth W. (1993) Subpicosecond emission studies of bacterial reaction centers. Biochim. Biophys. Acta, 1142, 90-105.

83. Hartwich G., Lossau H., Michel-Beyerle M.E., and Ogrodnik A. (1998) Nonexponential fluorescence decay in reaction centers of Rhodobacter sphaeroides reflecting dispersive charge separation up to I ns. J. Phys. Chem. B., 102, 3815-3820.

84. Hasegawa J., and Nakatsuji H. (1998) Mechanism and unidirectionality of the electron transfer in the photosynthetic reaction center of Rhodopseudomonas viridis: SAC-CI theoretical study. J. Phys. Chem. B., 102, 10420-10430.

85. Heller B.A., Holten D., and Kirmaier C. (1995a) Characterization of bacterial reaction centers having mutations of aromatic residues in the binding site of the bacteriopheophytin intermediary electron carrier. Biochemistry, 34, 5294-5302.

86. Heller B.A., Holten D., and Kirmaier C. (1995b) Control of electron transfer between the L- and M-sides of the photosynthetic reaction center. Science, 269, 940-945.

87. Heller B.A., Holten D., and Kirmaier C. (1996) Effects of Asp residues near the L-side pigments in bacterial reaction centers. Biochemistry, 35, 15418-15427.

88. Hoff A.J. (1981) Magnetic field effects on photosynthetic reaction centers. Quart. Rev. Biophys., 14, 599-665.

89. Hoff A.J., and Deisenhofer J. (1997) Photophysics of photosynthesis: Structure and spectroscopy of reaction centres of purple bacteria. Physics Reports-Review. Section of Physics Letters, 287,2-247.

90. Holten D., Windsor M.W., Parson W.W., and Thornber J.P. (1978) Primary photochemical processes in isolated reaction centers of Rhodopseudomonas viridis. Biochim. Biophys.1. Acta., 501, 112-126.

91. Holzapfel W., Finkele U., Kaiser W., Oesterhelt D., Scheer H., Stilz H.U., and Zinth W. (1989) Observation of a bacteriochlorophyll anion radical during the primary charge separation in a reaction center. Chem. Phys. Lett., 160, 1-7.

92. Holzapfel W., Finkele U., Kaiser W., Oesterhelt D., Scheer 11., Stilz H.U., and Zinth W. (1990) Initial electron transfer in the reaction center from Rhodobacter sphaeroides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87,5168-5172.

93. Holzwarth A.R., and Muller M.G. (1996) Energetics and kinetics of radical pairs in reaction centers from Rhodobacter sphaeroides. A femtosecond transient absorption study. Biochemistry, 35, 11820-11831.

94. Hu, Y. and Mukamel, S., (1990) Sequential versus superexchange electron transfer in the photosynthetic reaction center. In: Perspectives in Photosynthesis, Jortner J., and Pullman B. (eds.), Kluwer Acad. Publ., Amsterdam, pp. 171-184.

95. Hunenberger P.H., Mark A.E. and van Gunsteren W.F. (1995) Fluctuation and cross-correlation analysis of protein motions observed in nanosecond molecular dynamics simulations. J. Mol. Biol., 252,492-503.

96. Huppmann P., Sporlein S., Bibikova M., Oesterhelt D., Wachtveitl J., and Zinth W (2003) Electron transfer in reaction centers of Blastochloris viridis: Photosynthetic reactions approximating the adiabatic regime. J. Phys. Chem. A., 107, 8302-8309.

97. Horber J.K.H., Gobel W., Ogrodnik A., Michel-Beyerle M.-E., and Cogdell R.J. (1986) Time-resolved measurements of fluorescence from reaction centers of Rhodopseudomonas sphaeroides. FEBS Lett., 198, 273-278.

98. Jackson J.A., Lin S., Taguchi A.K.W., Williams J.C., Allen J.P., and Woodbury N.W. (1997) Energy transfer in Rhodobacter sphaeroides reaction centers with the initial electron donor oxidized or missing. J. Phys. Chem. B, 101, 5747-5754.

99. Jean J.M., Friesner R.A., Fleming G.R. (1992) Application of a multilevel Redfield theory to electron transfer in condensed phases. J. Chem. Phys. 96, 5827-5842.

100. Jean J.M. (1994) Time and frequency - resolved spontaneous emission as a probe of coherence effects in ultrafast electron transfer reactions. J. Chem. Phys., 101, 10464-10473.

101. Jean J. M., Fleming G. R. (1995) Competition between energy and phase relaxation in electronic curve crossing processes. J. Chem. Phys., 103, 2092-2101.

102. Jia Y., DiMagno T.J., Chan C.-K., Wang Z., Du M., Hanson D.K., Schiffer M., Norris J.R., Fleming G.R., and Popov M.S. (1993) Primary charge separation in mutant reaction centers of Rhodobacter capsulatus. J. Phys. Chem., 97, 13180-13191.

103. Johnson E.T., and Parson W.W. (2002) Electrostatic interactions in an integral membrane protein. Biochemistty, 41, 6483-6494.

104. Johnson S.G., Tang D., Jankowiak R., Hayes J.M., Small G.J., and Tiede D.M. (1990) Primary donor state mode structure and energy transfer in bacterial reaction centers. J. Phys. Chem., 94, 5849-5855.

105. Jones M.R. (2009) Structural plasticity of reaction centers from purple bacteria. In: The Purple Phototrophic Bacteria, Hunter, C.N., Daldal, F., Thurnauer, M.C., and Beatty, J.T. (eds.), Springer Science + Business Media B.V., Dordreht, pp. 295-321.

106. Kalman L., LoBrutto R., Allen J.P., and Williams J.C. (1999) Modified reaction centres oxidize tyrosine in reactions that mirror Photosystem II. Nature, 402, 696-699.

107. Kalman L., Thielges M.C., Williams J.C., and Allen J.P. (2005) Proton release due to manganese binding and oxidation in modified bacterial reaction centers. Biochemistry, 44, 13266-13273.

108. Katilius E., Katiliene Z., Lin S., Taguchi A.K.W., and Woodbury N.W. (2002b) B-side electron transfer in the HE(M182) reaction center mutant from Rhodobacter sphaeroides. J. Phys. Chem. B., 106, 12344-12350.

109. Katilius E., Babendure J.L., Katiliene Z., Lin S., Taguchi A.K.W., and Woodbury N.W. (2003) Manipulations of the B-side charge separated states' energetics in the Rhodobacter sphaeroides reaction center. J. Phys. Chem. B, 107, 12029-12034.

110. Katilius E., Babendure J.L., Lin S., and Woodbury N.W. (2004) Electron transfer dynamics in Rhodobacter sphaeroides reaction center mutants with a modified ligand for the monomer bacteriochlorophyll on the active side. Photosynth. Res., 81, 165-180.

111. Kaufmann K.J., Petty K.M., Dutton P.L., and Rentzepis P.M. (1975) Picosecond kinetics of events leading to reaction center bacteriochlorophyll oxidation. Science, 188, 1301-1304.

112. Kee H.L., Laible P.D., Bautista J.A., Hanson D.K., Holten D., and Kirmaier C. (2006) Determination of the rate and yield of B-side quinone reduction in Rhodobacter capsulatus reaction centers. Biochemistiy, 45, 7314-7322.

113. Kellog E.C., Kolaczkowski S., Wasielewski M.R., and Tiede D.M. (1989) Measurement of the extent of electron transfer to the bacteriopheophytin in the M-subunit in reaction centers of Rhodopseudomonas viridis. Photosynth. Res., 22, 47-59.

114. King B.A., de Winter A., McAnaney T., and Boxer S.G. (2001) Excited state energy transfer pathways in photosynthetic reaction centers. 4. Asymmetric energy transfer in the heterodimer mutant. J. Phys. Chem. B., 105, 1856-1862.

115. Kirmaier C., Blankenship R. E., and Holten D. (1986) Formation and decay of radical pair state P+I~ in Chloroflexus aurantiacus reaction centers. Biochim. Biophys. Acta, 850, 275-285.

116. Kirmaier C., and Holten D. (1988) Subpicosecond spectroscopy of charge separation in Rhodobacter capsulatus reaction centers. Israel J. Chem., 28, 79-85.

117. Kirmaier C., Holten D., Bylina E.J., and Youvan D.C. (1988) Electron transfer in a genetically modified bacterial reaction center containing a heterodimer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 75627566.

118. Kirmaier C., Gaul D., DeBey R., Holten D., and Schenck C.C. (1991) Charge separation in a reaction center incorporating bacteriochlorophyll for photoactive bacteriopheophytin. Science, 251, 922-927.

119. Kirmaier C., Weems D., and Holten D. (1999) M-side electron transfer in reaction center mutants with a lysine near the nonphotoactive B bacteriochlorophyll. Biochemistry, 38, 11516-11530.

120. Kirmaier C., He C., and Holten D (2001) Manipulating the direction of electron transfer in the bacterial reaction center by swapping Phe for Tyr near BChlM (LI81) and Tyr for Phe near BChlL (M208). Biochemistry, 40, 12132-12139.

121. Kirmaier C., Laible P.D., Czarnecki K., Hata A.N., Hanson D.K., Bocian D.F., and Holten D. (2002b) Comparison of M-side electron transfer in Rba. sphaeroides and Rba. capsulatus reaction centers. J. Phys. Chem. B., 106, 1799-1808.

122. Kirmaier C., Laible P.D., Hanson D.K., and Holten D. (2003) B-side charge separation in bacterial photosynthetic reaction centers: nanosecond time scale electron transfer from Hb~ to Qb. Biochemistry, 42, 2016-2024.

123. Kirmaier C., Laible P.D., Hanson D.K., and Holten D. (2004) B-side electron transfer to form P^b " in reaction centers from the F(L181)Y/Y(M208)F mutant of Rhodobacter capsulatus. J. Phys. Chem. B., 108, 11827-11832.

124. Kirmaier C., Bautista J.A., Laible P.D., Hanson D.K., and Holten D. (2005) Probing the contribution of electronic coupling to the directionality of electron transfer in photosynthetic reaction centers. J. Phys. Chem. B, 109, 24160-24172.

125. Kitzing E., and Kiihn H. (1990) Primary electron transfer in photosynthetic reaction centers. J. Phys. Chem., 94, 1699-1702.

126. Kolbasov D., and Scherz A, (1998) Matrix elements play a significant role in asymétrie electron transfer in bacterial reaction centers. In: Photosynthesis: Mechanisms and Effects, Garab G (ed.) Vol II, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp. 719-722.

127. Kolbasov D., and Scherz A. (2000) Asymmetric electron transfer in reaction centers of purple bacteria strongly depends on different electron matrix elements in the active and inactive branches. J. Phys. Chem. B., 104, 1802-1809.

128. Mar T., and Gingras G. (1990) Relative phototrapping rates of the two bacteriopheophytins in the photoreaction center of Ectothiorhodospira sp. Biochim. Biophys. Acta, 1017, 112-117.

129. Marchi M., Gehlen J.N., Chandler D., and Newton M. (1993) Diabatic surfaces and the pathway for primary electron transfer in a photosynthetic reaction center. J. Am. Chem. Soc., 115, 4178-4190.

130. Marcus R.A. (1956) On the theory of oxidation-reduction reactions involving electron-transfer. 1. J. Chem. Phys., 24, 966-978.

131. Marcus R.A. (1964) Chemical and electrochemical electron transfer theory. Ann. Rev. Phys. Chem., 15, 155-196.

132. Marcus R.A., SutinN. (1985) Electron transfer in chemistry and biology. Biochim. Biophys. Acta, 811, 265-322.

133. Marcus R.A. (1993) Electron-transfer reactions in chemistry: theory and experiment (Nobel lecture). Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 32, 1111-1121.

134. Martin J.-L., and Vos M.H. (1992) Femtosecond biology. Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 21, 199-222.

135. McAuley K.E., Fyfe P.K., Cogdell, R.J., Isaacs N.W., and Jones M.R. (2000) X-ray crystal structure of the YM210W mutant reaction centre from Rhodobacter sphaeroides. FEBS Lett., 467, 285-290.

136. McDowell L.M., Gaul D., Kirmaier C., Holten D., and Schenck C.C. (1991) Investigation into the source of electron transfer asymmetry in bacterial reaction centers. Biochemistry, 30, 8315-8322.

137. Michel, H., Epp, O., and Deisenhofer, J. (1986) Pigment-protein interaction in the photosynthetic reaction center from Rhodopseudomonas viridis. EMBO J., 5, 2445-2451.

138. Moore L.J., and Boxer S.G. (1998) Inter-chromophore interactions in pigment-modified and dimer-less bacterial photosynthetic reaction centers. Photosynth. Res., 55, 173-180.

139. Moser C.C., Keske J.M., Warncke K., Farid R.S., and Dutton P.L. (1992) Nature of biological electron transfer. Nature, 355, 796-802.

140. Mukamel S. (1995) Principles of nonlinear optical spectroscopy, Oxford University Press, New York.

141. Miih F., Williams J.C., Allen J.P., and Lubitz W. (1998) A conformational change of the photoactive bacteriopheophytin in reaction centers from Rhodobacter sphaeroides. Biochemistry, 37, 13066-13074.

142. Nagarajan V., Parson W.W., Gaul D., and Schenck C. (1990) Effect of directed mutations of the tyrosine at site (M)210 on the primary photosynthetic electron transfer process in Rhodobacter sphaeroides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 7888-7892.

143. Nagarajan V., Parson W.W., Davis D., and Schenck C.C. (1993) Kinetics and free energy gaps of electron-transfer reactions in Rhodobacter sphaeroides reaction centers. Biochemistry, 32, 1232412336.

144. Narväez A.J., Kalman L., LoBrutto R., Allen J.P., and Williams J.C. (2002) Influence of the protein environment on the properties of a tyrosyl radical in reaction centers from Rhodobacter sphaeroides. Biochemistry, 41, 15253-15258.

145. Narväez A.J., LoBrutto R., Allen J.P., and Williams J.C. (2004) Trapped tyrosyl radical populations in modified reaction centers from Rhodobacter sphaeroides. Biochemistry, 43, 14379-14384.

146. Newton M.D. (2003) Electronic coupling in electron transfer and the influence of nuclear modes: theoretical and computational probes. Theor. Chem. Acc., 110, 307-321.

147. Novoderezhkin V., Monshouwer R., and van Grondelle R. (2000) Electronic and vibrational coherence in the core light-harvesting antenna of Rhodopseudomonas viridis. J. Phys. Chem. B, 104, 12056-12071.

148. Noy D., Moser C.C., and Dutton P.L. (2006) Design and engineering of photosynthetic light-harvesting and electron transfer using length, time, and energy scales. Biochim. Biophys Acta, 1757, 90-105.

149. Ogrodnik A. (1990) The free energy difference between the excited primary donor *P* and the radical pair state P+PI~ in reaction centers of Rhodobacter sphaeroides. Biochim. Biophys. Acta, 1020, 65-71.

150. Ogrodnik A., Volk M., Letterer R., Feik R., and Michel-Beyerle M.-E. (1988) Determination of free energies in reaction centers of lib. sphaeroides. Biochim. Biophys. Acta, 936, 361-371.

151. Ogrodnik A., Hartwich G., Lossau H., and Michel-Beyerle M.E. (1999) Dispersive charge separation and conformational cooling of P+HA~ in reaction centers of Rb. sphaeroides R26: A spontaneous emission study. Chem. Phys., 244, 461-478.

152. Okamura M.Y., Paddock M.L., Graige M.S., and Feher G. (2000) Proton and electron transfer in bacterial reaction centers. Biochim Biophys Acta: Bioenerg., 1458, 148-163.

153. Olson J.M., and Thornber J.P. (1978) Photosynthetic reaction centers. In: Membrane proteins in energy transduction, Capaldi R.A. (ed.), N.Y.: Dekker, pp. 279-340.

154. Parot P., Delmas N., Garcia D., and Vermeglio A. (1985) Structure of Chloroflexus aurantiacus reaction center: Photoselection at low temperature. Biochim. Biophys. Acta, 809, 137-140.

155. Parson W.W. and Warshel A. (2004a) A density-matrix model of photosynthetic electron transfer with microscopically estimated vibrational relaxation times. Chem. Phys., 296, 201-206.

156. Parson W.W. and Warshel A. (2004b) Dependence of photosynthetic electron-transfer kinetics on temperature and energy in a density-matrix model. J. Phys. Chem. B., 108, 10474-10483.

157. Parson W.W., Clayton R.K., and Cogdell R.J. (1975) Excited states of photosynthetic reaction centers at low redox potentials. Biochim. Biophys. Acta, 387, 265-278.

158. Parson W.W., Chu Z.T., and Warshel A. (1990) Electrostatic control of charge separation in bacterial photosynthesis. Biochim. Biophys. Acta, 1017, 251-272.

159. Parson W.W. (1991) Reaction centers. In: Chlorophylls, Scheer H. (ed.), CRC Press, Boca Raton, pp.1153-1180.

160. Parson W.W. (1996) Photosynthetic bacterial reaction centers. In: Protein Electron Transfer, Bendall D.S. (ed.), BIOS Scientific Publishers, Oxford, pp. 125-160.

161. Parson W.W., Chu Z.T., and Warshel A. (1998a) Reorganization energy of the initial electron-transfer step in photosynthetic bacterial reaction centers. Biophys. J. 74, 182-191.

162. Parson W.W., Chu Z.T., and Warshel A. (1998b) Oscillations of the energy gap for the initial electron-transfer step in bacterial reaction centers. Photosynth. Res., 55, 147-152.

163. Peloquin J.M., Williams J.C., Lin X., Alden R.G., Taguchi A.K.W., Allen J.P., and Woodbury N.W. (1994) Time-dependent thermodynamics during early electron transfer in reaction centers from Rhodobacter sphaeroides. Biochemistry, 33, 8089-8100.

164. Peloquin J.M., Lin S., Taguchi A.K.W., and Woodbury N.W. (1995) Excitation wavelength dependence of bacterial reaction center photochemistry. 1. Ground state and excited state evolution. J. Phys. Chem., 99, 1349-1356.

165. Peloquin J.M., Lin S., Taguchi A.K.W., and Woodbury N.W. (1996) Excitation wavelength dependence of bacterial reaction center photochemistry. 2. Low-temperature measurements and spectroscopy of charge separation. J. Phys. Chem., 100, 14228-14235.

166. Pierson B.K., Thornber J.P., (1983) Isolation and spectral characterization of photochemical reaction centers from thermophilic green bacterium Chloroflexus aurantiacus strain J-10-F1. Proc. Natl. Sei. USA, 80, 80-84.

167. Pollard W. T., Felts A. K., and Friesner R.A. (1996) The Redfield equation in condensed-phase quantum dynamics. Adv. Chem. Phys. 93, 77-134.

168. Rademaker J., and Hoff A.J. (1981) The balance between primary forward and back reaction in bacterial photosynthesis. Biophys. J., 34, 325-344.

169. Redfield A. G. (1965) The theory of relaxation processes. In: Advances in Magnetic Resonance, Waugh J.S., (ed.), Acad. Press, New York, v. 1, pp. 1-32.

170. Reddy N.R.S., Lyle P.A., and Small G.J. (1992) Applications of spectral hole burning spectroscopies to antenna and reaction center complexes. Photosynth. Res., 31, 167-194.

171. Reimers J.R .and Hush N.S. (2004) A unified description of the electrochemical, charge distribution, and spectroscopic properties of the special-pair radical cation in bacterial photosynthesis. J. Am. Chem. Soc. 126, 4132-4144.

172. Renger Th., May V., and Kiihn O. (2001) Ultrafast excitation energy transfer dynamics in photosynthetic pigment-protein complexes. Phys. Rep. 343, 137-254.

173. Roberts J.A., Holten D., and Kirmaier C. (2001) Primary events in photosynthetic reaction centers with multiple mutations near the photoactive electron carriers. J. Phys. Chem. B., 105, 5575-5584.

174. Robles S.J., Breton J., and Youvan D.C. (1990a) Partial symmetrization of the photosynthetic reaction center. Science, 248, 1402-1405.

175. Rockley M.G., Windsor M.W., Cogdell R.J., and Parson W.W. (1975) Picosecond detection of an intermediate in the photochemical reaction of bacterial photosynthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72,2251-2255.

176. Schenck C.C., Blankenship R.E., and Parson W.W. (1982) Radical-pair decay kinetics, triplet yields, and delayed fluorescence from bacterial reaction centers. Biochim. Biophys. Acta, 680, 4459.

177. Scherer P. O. J., and Fischer S. F. (1987) Model studies to to low-temperature optical transitions of photosynthetic reaction centers. II. Rhodobacter sphaeroides and Chloroflexus aurantiacus. Biochim. Biophys. Acta, 891, 157-164.

178. Scherer P.O.J, and Fischer S.F. (1989) Long-range electron transfer within the hexamer of the photosynthetic reaction center Rhodopseudomonas viridis. J. Phys. Chem., 93, 1633-1637.

179. Scherer P.O. J., and Fischer S.F. (1998) Charge transfer states of the reaction center. Spectrochim. Acta A, 54A, 1191-1199.

180. Schweitzer G., Hucke M., Griebenow K., Muller M. G., and Holzwarth A. R. (1992) Charge separation kinetics in isolated photosynthetic reaction centers of Chloroflexus aurantiacus (with Qa reduced) at low temperatures. Chem. Phys. Lett., 190, 149-154.

181. Sham Y.Y., and Warshel A. (1998) The surface constrained all atom model provides size-independent results in calculations of hydration free energies. J. Chem. Phys., 109, 7940-7944.

182. Shiozawa, J.A., Lottspeich, F., and Feick, R. (1987) The ptotochemical reaction center of Chloroflexus aurantiacus is composed of two structurally similar polypeptides. Eur. J. Biochem.,167, 595-600.

183. Shiozawa J. A., Lottspeich F., Oesterhelt D., and Feick R. (1989) The primary structure of the Chloroflexus aurantiacus reaction-center polypeptides. Eur. J. Biochem., 180, 75-84.

184. Shkuropatov A.Y., and Shuvalov V.A. (1993) Electron transfer in pheophytin a-modified reaction centers from Rhodobacter sphaeroides (R-26). FEBS Lett., 322, 168-172.

185. Shuvalov V.A., and Klimov V.V. (1976) The primary photoreactions in the complex cytochrome-P-890 — P-760 (bacteriopheophytin76o) of Chromatium minutissimum at low redox potentials. Biochim. Biophys. Acta., 440, 587-599.

186. Shuvalov V.A., and Duysens L.N.M. (1986) Primary electron transfer reactions in modified reaction centers from R. sphaeroides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 1690-1694.

187. Shuvalov V.A., and Parson W.W. (1980) Energies and kinetics of radical pairs involving bacteriochlorophyll and bacteriopheophytin in bacterial reaction centers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 957-961.

188. Sim E., and Makri N. (1997) Path integral simulation of charge transfer dynamics in photosynthetic reaction centers. J. Phys. Chem. B., 101, 5446-5458.

189. Skourtis S.S., Balabin I.A., Kawatsu T., and Beratan D.N. (2005) Protein dynamics and electron transfer: Electronic decoherence and non-Condon effects. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 35523557.

190. Slichter C.P. (1963) Principles of Magnetic Resonance with Examples from Solid State Physics. Harper & Row, New York.

191. Small G.J. (1995) On the validity of the standard model for primary charge separation in the bacterial reaction center. Chem. Phys., 197, 239-257.

192. Small G.J., Hayes J.M., and Silbey R.J. (1992) The question of dispersive kinetics for the initial phase of charge separation in bacterial reaction centers. J. Phys. Chem., 96, 7499-7501.

193. Spiedel D., Jones M.R., and Robert B. (2002) Tuning of the redox potential of the primary electron donor in reaction centres of purple bacteria: Effects of amino acid polarity and position. FEBS Lett., 527, 171-175.

194. Sporlein S., Zinth W., and Wachtveitl J. (1998) Vibrational coherence in photosynthetic reaction centers observed in the bacteriochlorophyll anion band. J. Phys. Chem. B, 102, 7492-7496.

195. Sporlein S., Zinth W., Meyer M., Scheer H., and Wachtveitl J. (2000) Primary electron transfer in modified bacterial reaction centers: Optimization of the first events in photosynthesis. Chem. Phys. Lett., 322, 454-464.

196. Stanley R.J., and Boxer S.G. (1995) Oscillations in spontaneous fluorescence from photosynthetic reaction centers. J. Phys. Chem., 99, 859-863.

197. Steffen M.A., Lao K.Q., and Boxer S.G. (1994) Dielectric asymmetry in the photosynthetic reaction center. Science, 264, 810-816.

198. Stowell, M.H.B., McPhillips, T.M., Rees, D.C., Soltis, S.M., Abresch, E., and Feher, G. (1997) Light-induced structural changes in photosynthetic reaction center: implications for mechanism of electron-proton transfer. Science, 276, 812-816.

199. Streltsov A.M., Aartsma T.J., Hoff A.J., and Shuvalov V.A. (1997) Oscillations within the BL absorption band of Rhodobacter sphaeroides reaction centers upon 30 femtosecond excitation at 865 nm. Chem. Phys. Lett., 266, 347-352.

200. Sumi H., and Marcus R.A. (1986) Dielectric relaxation and intramolecular electron transfers. J. Chem. Phys. 84, 4272-4276.

201. Sumi H. (1997) Electron transfer via a midway molecule as seen in primary processes in photosynthesis: Superexchange or sequential, or unified? J. Electroanal. Chem., 438, 11-20.

202. Taguchi A.K.W., Eastman J.E., Gallo D.M., Sheagley E., Xiao W., and Woodbury N.W. (1996) Asymmetry requirements in the photosynthetic reaction center of Rhodobacter capsulatus. Biochemistry, 35, 3175-3186.

203. Takiff L., and Boxer S.G. (1988) Phosphorescence from the primary electron donor in Rhodobacter sphaeroides and Rhodopseudomonas viridis reaction centers. Biochim. Biophys. Acta, 932, 325-334.

204. Thielges M., Uyeda G., Cámara-Artigas A., Kálmán L., Williams J.C., and Allen J.P. (2005) Design of a redox-linked active metal site: Manganese bound to bacterial reaction centers at a site resembling that of Photosystem II. Biochemistry, 44, 7389-7394.

205. Thompson M.A., Zerner M.C., and Fajer J. (1991) A theoretical examination of the electronic structure and spectroscopy of the photosynthetic reaction center from Rhodopseudomonas viridis. J. Am. Chem. Soc., 113, 8210-8215.

206. Vasmel H., Meiburg R. F., Kramer H. J. M., de Vos L. J., and Amesz J. (1983) Optical properties of the photosynthetic reaction center of Chloroflexus aurantiacus at low temperature. Biochim. Biophys. Acta, 724, 333-339.

207. Vasmel H., and Amesz J. (1983) Photoreduction of menaquinone in the reaction center of the green photosynthetic bacterium Chloroflexus aurantiacus. Biochim. Biophys. Acta, 724, 118-122.

208. Vasmel H., Amesz J., and Hoff A. J. (1986) Analysis by excitation theory of the optical properties of the Chloroflexus aurantiacus reaction center. Biochim. Biophys. Acta, 852, 159-168.

209. Volk M., Scheidel G., Ogrodnik A., Feick R., and Michel-Beyerle M. E. (1991) High quantum yield of charge separation in reaction centers of Chloroflexus aurantiacus. Biochim. Biophys. Acta, 1058, 217-224.

210. Vos M., and Martin J.-L. (1999) Femtosecond processes in proteins. Biochim. Biophys. Acta, 1411, 1-20.

211. Vos M.H., Lambry J.C., Robles S.J., Youvan D.C., Breton J., and Martin J.-L. (1991) Direct observation of vibrational coherence in bacterial reaction centers using femtosecond absorption spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 8885-8889.

212. Vos M.H., Lambry J.C., Robles S.J., Youvan D.C., Breton J., and Martin J.-L. (1992) Femtosecond spectral evolution of the excited state of bacterial reaction centers at 10 K. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89,613-617.

213. Vos M.H., Rappaport F., Lambry J.-H., Breton J., and Martin J.-L. (1993) Visualization of coherent nuclear motion in a membrane protein by femtosecond spectroscopy. Nature, 363, 320-325.

214. Vos M.H., Jones M.R., Hunter C.N., Breton J., and Martin J.-L. (1994a) Coherent nuclear dynamics at room temperature in bacterial reaction centers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 12701-12705.

215. Vos M.H., Jones M.R., Hunter C.N., Breton J., Lambry J.-C., and Martin J.-L. (1994b) Coherent dynamics during the primary electron-transfer reaction in membrane-bound reaction centers of Rhodobacter sphaeroides. Biochemistry, 33, 6750-6757.

216. Vos M.H., Jones M.R., Breton J., Lambry J.C., and Martin J.-L .(1996) Vibrational dephasing of long- and short-lived primary donor excited states in mutant reaction centers of Rhodobacter sphaeroides. Biochemistry, 35, 2687-2692.

217. Vos M.H., Jones M.R., and Martin J.-L. (1998) Vibrational coherence in bacterial reaction centers: spectroscopic characterisation of motions active during primary electron transfer. Chem. Phys., 233, 179-190.

218. Vos M.H., Rischel C., Jones M.R., and Martin J.-L. (2000) Electrochromic detection of a coherent component in the formation of the charge pair P+HL~ in bacterial reaction centers. Biochemistry, 39, 8353-8361.

219. Wakeham M.C., Goodwin M.G., McKibbin C., and Jones M.R. (2003) Photo-accumulation of the P+Qb~ radical pair state in purple bacterial reaction centres that lack the QA ubiquinone. FEBS Lett., 540, 234-240.

220. Wakeham M.C., Breton J., Nabedryk E., and Jones M.R. (2004) Formation of a semiquinone at the Qb site by A- or B-branch electron transfer in the reaction center from Rhodobacter sphaeroides. Biochemistry, 43, 4755-4763.

221. Wakeham M.C., and Jones M.R. (2005) Rewiring photosynthesis: Engineering wrong-way electron transfer in the purple bacterial reaction center. Biochem. Soc. Trans., 133, 851-857.

222. Wang H.W, Lin S., and Woodbury N.W. (2006) Electronic transitions of the Soret band of reaction centers from Rhodobacter sphaeroides studied by femtosecond transient absorbance spectroscopy. J. Phys. Chem. B, 110, 6956-6961.

223. Wang H.W., Lin S„ Allen J.P., Williams J.C., Blankert S„ Laser C., and Woodbury N.W. (2007) Protein dynamics control the kinetics of initial electron transfer in photosynthesis. Science, 316, 747-750.

224. Wang Z., Pearlstein R.M., Jia Y., Fleming G.R., andNorris J.R. (1993) Inhomogeneous electron-transfer kinetics in reaction centers of bacterial photosynthesis. Chem. Phys., 176,421-425.

225. Warshel A., and Parson W.W. (2001) Dynamics of biochemical and biophysical reactions: insight from computer simulations. Quart. Rev. Biophys., 34, 563-679.

226. Warshel A., and Russell S.T. (1984) Calculations of electrostatic interactions in biological systems and in solutions. Quart. Rev. Biophys., 17, 283-290.

227. Warshel A., Creighton S., and Parson W.W. (1988) Electron-transfer pathways in the primary event of bacterial photosynthesis. J. Phys. Chem., 92, 2698-2701.

228. Warshel A., Sharma P.K., Kato M., and Parson W.W. (2006) Modeling electrostatic effects in proteins. Biochim. Biophys. Acta, 1764, 1647-1676.

229. Wasielewski M.R., and Tiede D.M. (1986) Sub-picosecond measurements of primary electron transfer in Rhodopseudomonas viridis reaction centers using near-infrared excitation. FEBS Lett. 204, 368-372.

230. Watanabe T., and Kobayashi M. (1991) Electrochemistry of chlorophylls. In: Chlorophylls, Scheer H., (ed.), CRC Press: Boca Raton, FL, pp. 287-315.

231. Webber A.N., and Lubitz W. (2001) P700: The primary electron donor of Photosystem I. Biochim. Biophys. Acta, 1507, 61-79.

232. Weiner S.J., Kollman P.A., Case D., Singh U.C., Ghio C., Alagona G., Profeta P.S., and Weiner P. (1984) A new force field for molecular mechanical simulation of nucleic acids and proteins. J. Am. Chem. Soc., 106, 765-784.

233. Williams J.C., Steiner L.A., Feher G., and Simon M.J. (1984) Primary structure of the L-subunit of the reaction center from Rhodopseudomonas sphaeroides. Proc. Natl. Sci. USA, 81, 7303-7307.

234. Williams J.C., Steiner L.A., Ogden R.C., Simon M.I., and Feher G. (1983) Primary structure of the M-subunit of the reaction center from Rhodopseudomonas sphaeroides. Proc. Natl. Sci. USA, 80, 6505-6509.

235. Williams J.C., Alden R.G., Murchison H.A., Peloquin J.M., Woodbury N.W., and Allen J.P. (1992) Effects of mutations near the bacteriochlorophylls in reaction centers from Rhodobacter sphaeroides. Biochemistry, 31, 11029-11037.

236. Williams J.C., Paddock M.L., Way Y.P., and Allen J.P. (2007) Changes in metal specificity due to iron ligand substitutions in reaction centers from Rhodobacter sphaeroides. Appl. Magn. Reson., 31, 45-58.

237. Woodbury N.W., and Parson W.W. (1984) Nanosecond fluorescence from isolated reaction centers of Rhodopseudomonas sphaeroides. Biochim. Biophys. Acta, 767, 345-361.

238. Woodbury N.W., Becker M., Middendorf D., and Parson W.W .(1985) Picosecond kinetics of the initial photochemical electrontransfer reaction in bacterial photosynthetic reaction centers. Biochemistry, 24, 7516-7521.

239. Wraight C.A., and Clayton R.K. (1974) The absolute quantum efficiency of bacteriochlorophyll photooxidation in reaction centres of Rhodopseudomonas sphaeroides. Biochim. Biophys. Acta, 333, 246-260.

240. Wraight C.A. (2004) Proton and electron transfer in the acceptor quinone complex of photosynthetic reaction centers from Rhodobacter sphaeroides. Frontiers in Biosciences, 9, 309337.

241. Youvan D.C., Bylina E.J., Alberti M., Begusch H., and Hearst J.E. (1984) Nucleotide and deduced polypeptide sequences of the photosynthetic reaction center, B870 antenna, and flanking polypeptides from R. capsulata. Cell, 37, 949-957.

242. Zener C. (1932) Non-adiabatic crossing of energy levels. Proc. Roy. Soc. London A, 137, 696-702.

243. Zhang W.M., Meier T., Chernyak V., and Mukamel S.J. (1998) Exciton-migration and three-pulse femtosecond optical spectroscopies of photosynthetic antenna complexes. J. Chem. Phys., 108, 7763-7774.

244. Zhang L.Y., and Friesner R.A. (1998) Ab initio calculation of electronic coupling in the photosynthetic reaction center. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 13603-13605.

245. Zhou H., and Boxer S.G. (1998a) Probing excited-state electron transfer by resonance Stark spectroscopy. 1. Experimental results for photosynthetic reaction centers. J. Phys. Chem. B, 102, 9139-9147.

246. Zhou H., and Boxer S.G. (1998b) Probing excited-state electron transfer by resonance Stark spectroscopy. 2. Theory and application. J. Phys. Chem. B. 102, 9148-9160.

247. Zusman L.D., and Beratan D.N. (1998) Electron transfer in the photosynthetic reaction center: Mechanistic implications of mutagenesis studies. Spectrochim. Acta A, 54A, 1211-1218.