Факторы, влияющие на скорость и эффективность котрансляционного сворачивания белка

Светлов, Максим Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Факторы, влияющие на скорость и эффективность котрансляционного сворачивания белка
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Факторы, влияющие на скорость и эффективность котрансляционного сворачивания белка"

На правах рукописи

СВЕТЛОВ Максим Сергеевич

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА СКОРОСТЬ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ КОТРАНСЛЯЦИОКНОГО СВОРАЧИВАНИЯ БЕЛКА

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ 0034803^ 4

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2009

003480324

Работа выполнена в Институте

Научный руководитель:

доктор биологических наук

белка

РАН

Колб Вячеслав Адамович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук

Завильгельский Геннадий Борисович Кульбачинский Андрей Владимирович

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится «13» ноября 2009 года в II00 часов на заседании совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, лабораторный корпус «А», аудитория 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан « В » октября 2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

И.А. Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сворачивание полипептидной цепи в уникальную пространственную структуру белка является одним из ключевых этапов реализации генетической информации, без которого осуществление белком его биологической функции невозможно. Механизм этого процесса и управляющие им законы не выяснены; их изучение остаётся одним из наиболее актуальных и интересных направлений молекулярной биологии.

Установлено, что белки в клетке сворачиваются котрансляционно, в ходе элонгации синтезируемой полипептидной цепи на рибосоме. Котрансляционное сворачивание отличается по ряду физико-химических параметров от сворачивания свободного развёрнутого полипептида в растворе (ренатурации). Так, при котрансляционном сворачивании С конец растущего полипептида иммобилизован на массивной рибосоме, а длина сворачивающейся цепи не постоянна, а увеличивается с определённой скоростью. Рост цепи происходит векторно, в направлении от N конца к С концу. Кроме того вероятно, что растущая полипептидная цепь начинает сворачиваться из «стартовой» а-спиральной конформации, возникающей в пептидилтрансферазном центре рибосомы. Помимо этих факторов, на сворачивание синтезируемых белков могут влиять молекулярные шапероны и другие «катализаторы фолдинга». Роль перечисленных факторов в обеспечении высокой скорости и эффективности котрансляционного сворачивания либо вообще не исследована, либо исследована недостаточно, что и определяет актуальность настоящей работы.

Основные цели и задачи работы. Ранее для ряда белков и, в частности, для люциферазы светлячка ГкоНпии ругаИ.ч, было показано, что их котрансляционное сворачивание происходит быстро и эффективно (с высоким выходом правильно свёрнутых молекул белка). В то же время сворачивание полностью денатурированной люциферазы в буферном растворе происходит медленно и с низким выходом правильно свёрнутого (ферментативно активного) белка. Ренатурация значительно ускоряется в присутствии молекулярных шаперонов, в частности, белков БпаК, БпаЛ и вгрЕ семейства Нзр70. Цель настоящей работы состояла в том, чтобы выяснить, как скорость и эффективность котрансляционного сворачивания люциферазы зависят от активности шаперонов Нгр70 в системе трансляции, а также определить, как скорость элонгации полипептидной цепи и температура, при которой происходит синтез люциферазы, влияют на эффективность сворачивания этого белка. Кроме того, целью работы было выяснить, ускоряется ли сворачивание денатурированной люциферазы, если её С конец иммобилизован на массивной частице, как это имеет место при котрансляционном сворачивании. Для достижения поставленных целей решали следующие задачи:

■и

- сравнение значений удельной ферментативной активности люциферазы, синтезированной в бактериальных бесклеточных системах трансляции, отличающихся содержанием активных шаперонов Hsp70;

- определение длительности пост-транляционной фазы сворачивания люциферазы, синтезируемой в присутствии избытка шаперонов Hsp70;

- измерение удельной ферментативной активности люциферазы, синтезированной в бесклеточной системе трансляции при разной температуре;

- получение бесклеточной системы трансляции, в которой скорость элонгации синтезируемых полипептидов можно изменять, варьируя содержание фактора элонгации G;

- измерение удельной ферментативной активности люциферазы, синтезированной в такой системе при разных скоростях элонгации;

- измерение скорости и эффективности сворачивания денатурированной полноразмерной люциферазы, С конец которой иммобилизован на массивной частице (грануле хелирующей сефарозы или рибосоме).

Научная новизна и практическая ценность работы. С помощью метода непрерывной регистрации энзиматической активности люциферазы, синтезируемой в бактериальной бесклеточной системе трансляции, было показано, что скорость и эффективность котрансляционного сворачивания этого фермента не зависят от активности молекулярных шаперонов семейства Hsp70 - белков, необходимых для эффективной ренатурации фермента.

Обнаружено, что иммобилизация С конца денатурированной полноразмерной люциферазы на массивной частице (грануле хелирующего носителя или рибосоме) не ускоряет сворачивания белка по сравнению с ренатурацией свободного белка в растворе. Однако иммобилизация фермента существенно увеличивает эффективность его сворачивания из денатурированного состояния. Выяснено, что высокий выход правильно свёрнутой люциферазы, наблюдаемый при ренатурации этого белка в связанном с носителем состоянии, обусловлен отсутствием межмолекулярной агрегации.

Впервые показано, что эффективность котрансляционного сворачивания белка может зависеть от температуры, при которой происходит трансляция его мРНК, Установлено, что оптимальная температура для продуктивного сворачивания синтезируемой de novo люциферазы составляет 25-30°С.

Создана бесклеточная система трансляции, позволяющая варьировать скорость элонгации полипептидной цепи синтезируемого белка. С помощью этой системы показано, что снижение скорости синтеза люциферазы при оптимальной температуре приводит к снижению эффективности её сворачивания.

Основные результаты работы не имеют аналогов в мировой литературе и вносят значительный вклад в представления о закономерностях котрансляционного сворачивания. Полученные данные могут иметь практическое значение для биотехнологии (получение высокоактивных белков) и для медицины (разработка терапевтических подходов в лечении болезней, вызываемых ошибками сворачивания).

Структура диссертации. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы из 160 ссылок. Работу иллюстрируют 22 рисунка и 2 таблицы.

Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи. Результаты исследований докладывались на международной конференции в честь A.C. Спирина «Синтез белка» (Пущино, 2001), научной конференции Института белка РАН (Пущино, 2003), XII международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов - 2005» (Москва, 2005).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава I. Эффективность котрансляционного сворачивания люциферазы в бактериальной бесклеточной системе трансляции

Ранее в нашей лаборатории было показано, что светлячковая люцифераза приобретает структуру ферментативно активного белка в процессе её синтеза на рибосоме, то есть котрансляционно. Котрансляционный характер сворачивания белка наблюдали как в эукариотической, так и в прокариотической бесклеточных системах трансляции. Из литературных данных известно, что сворачивание люциферазы светлячка из полностью развёрнутого состояния (ренатурация) происходит медленно и с низкой эффективностью. В первой серии экспериментов сравнивали эффективность котрансляционного сворачивания люциферазы с эффективностью её спонтанной ренатурации в буферном растворе.

Для синтеза белка использовали бактериальную систему трансляции на основе S30 экстракта клеток Е. coli. За сворачиванием синтезируемой люциферазы следили с помощью описанного ранее метода непрерывного мониторинга активности фермента в реакционной смеси. Метод основан на том, что субстраты люциферазы, АТФ и люциферин, добавляют в реакционную смесь, а инкубацию смеси при заданной температуре проводят в ячейке люминометра. Трансляцию запускают введением в систему мРНК люциферазы. Метод позволяет детектировать формирование ферментативно активной люциферазы без какой-либо задержки на процедуру измерения активности:

появление активных молекул в растворе регистрируется сразу же по возникающей люминесценции. При этом интенсивность излучения света, пропорциональную количеству активных молекул фермента, можно измерять непрерывно на протяжении всего эксперимента.

Как следует из рис. 16, в первые 7 минут после начала трансляции активный фермент в реакционной смеси отсутствовал. Затем активность появлялась и нарастала со временем. Появление и нарастание люциферазной активности коррелировало с появлением и увеличением количества полноразмерных молекул фермента в реакционной смеси, что выявляли с помощью ДСН-электрофореза радиоактивно меченных продуктов трансляции (рис. 1а). Таким образом, между появлением в системе трансляции полноразмерного белка и приобретением им пространственной структуры активного фермента нет существенной временной задержки. Это согласуется с ранее полученными в нашей лаборатории данными о том, что синтезированная de novo люцифераза завершает сворачивание в течение нескольких секунд (или менее того) после ухода из рибосомы.

время, мин. 1 2 3 4 5 7 1013 15 20 304050

FL lue 150

120

W Q. О

бо -

I—I—1—I—I—I—I—I—I—1—I

О 10 20 30 40 50

т—I—I—I—I—I—I—I—I

0 10 20 30 40 50 время, мин.

Рис.1 Синтез и сворачивание люциферазы в бактериальной бесклеточной системе трансляции в сравнении со спонтанной ренатурацией денатурированного белка. Синтез белка и его ренатурацию проводили в ячейке люминометра при 25°С в присутствии люциферина. (а) Анализ меченных ['4С]фенилаланином продуктов трансляции мРНК люциферазы с помощью ДСН-электрофореза в 10% полиакриламид-ном геле и радиоавтографии. Аликвоты для электрофореза отбирали из бесклеточной системы в указанное над дорожками геля время. Положение полосы полноразмерной люциферазы (FL lue) указано стрелкой, (б) Определяемое по люминесценции накопление активной люциферазы в процессе её синтеза в бесклеточной системе трансляции, (в) Определяемое по люминесценции накопление активной люциферазы в процессе её спонтанной ренатурации в буферном растворе. Концентрация белка после разбавления денатуранта составляла 8.4 нМ и соответствовала конечной концентрации фермента, синтезированного в системе трансляции.

Для сравнения эффективности котрансляционного сворачивания люциферазы в системе трансляции и спонтанной ренатурации этого белка из денатурированного состояния в схожих буферных условиях использовали тот

же экспериментальный подход. Люциферазу (коммерческий препарат белка) денатурировали при 20°С в 7.4 М растворе мочевины в течение 5 минут. Рефолдинг инициировали разбавлением пробы буферным раствором, содержащим 0.1 мМ люциферин и имеющим тот же состав, что и система трансляции, но без клеточного экстракта. Конечная концентрация люциферазы после разбавления соответствовала концентрации фермента, синтезированного в бесклеточной системе трансляции, и составляла 8.4 нМ. За восстановлением нативной структуры развёрнутой люциферазы следили по восстановлению её ферментативной активности. На рис. 1в приведена кинетическая кривая восстановления активности люциферазы из состояния беспорядочного клубка. Видно, что, по сравнению со сворачиванием синтезируемого de novo белка, ренатурация люциферазы происходит неэффективно.

Глава II. Влияние шаперонов семейства Hsp70 на котрансляционное сворачивание люциферазы

Известно, что для эффективной ренатурации люциферазы необходимы шапероны семейства Hsp70. В литературе было предложено несколько схем, описывающих последовательность участия молекулярных шаперонов (и, в частности, Hsp70) в котрансляционном сворачивании. Гипотезу о важной роли шаперонов Hsp70 в обеспечении высокой эффективности сворачивания, сопряжённого с синтезом белка, следовало проверить. Для этого использовали синтез светлячковой люциферазы в бесклеточных системах трансляции, отличающихся активностью шаперонов Hsp70.

2.1. Активность шаперонов Hsp70 в бактериальной бесклеточной

системе трансляции

Для оценки активности шаперонов в бактериальном экстракте, используемом для бесклеточной трансляции, использовали функциональный тест - катализ шаперонами сворачивания денатурированной люциферазы. Денатурацию люциферазы проводили в 7.4 М растворе мочевины как описано выше. Рефолдинг фермента инициациировали разбавлением пробы денатурированного белка в бактериальной бесклеточной системе трансляции, в которой присутствовала мРНК GFP (зелёного флюоресцентного белка). Реакционную смесь помещали в термостатируемую при 25°С ячейку люминометра и за ходом восстановления нативной структуры люциферазы следили по восстановлению её ферментативной активности. В качестве контроля использовали разбавление неденатурированного нативного фермента в такой же системе трансляции, содержащей люциферин и мРНК GFP.

Оказалось, что ренатурация люциферазы в системе трансляции происходит с низкой эффективностью: за 60 минут инкубации восстанавливается только 8% от исходной активности (рис. 2). Таким образом, ренатурационный тест показал, что в исходном экстракте, используемом для трансляции, активные

Нзр70 отсутствуют. Для получения системы трансляции с высокой активностью шаперонов использовали коммерческий препарат высокоочищенных бактериальных НэрТО, а именно смесь белков БпаК, Опа1 и ОгрЕ. Их концентрация в системе составляла 1.3 мкМ, 200 нМ и 650 нМ, соответственно, т.е. на порядки превышала концентрацию синтезированного белка. Следует отметить, что добавленные в систему трансляции шапероны не влияли на активность нативной люциферазы (данные не представлены). В то же время, как видно из рис. 2, в присутствии Нхр70 выход активной люциферазы при ренатурации увеличился до 80%.

время, мин

Рис.2 Ренатурация люциферазы в бактериальной бескпеточной системе трансляции.

Ренатурацию люциферазы инициировали 50-кратным разбавлением пробы денатурированного мочевиной белка. Для разбавления использовали бесклеточную систему, транслирующую мРНК СРР и содержащую люциферин. Конечная концентрация белка составляла 8.4 нМ. Ренатурацию проводили при 25°С в отсутствие (-Н$р70) или в присутствии добавленных в систему трансляции шаперонов (+Н8р70). В контрольном эксперименте использовали образец люциферазы, не обработанный мочевиной и разбавленный системой трансляции до конечной концентрации 8.4 нМ (контроль).

2.2. Эффективность котрансляционного сворачивания люциферазы в присутствии шаперонов Нър70

Влияние шаперонов Н$р70 на эффективность котрансляционного сворачивания люциферазы оценивали, используя синтез фермента в бактериальных бесклеточных системах трансляции с разным содержанием активных НБр70. Мерой эффективности сворачивания служила удельная ферментативная активность белка, определяемая как отношение его активности к количеству.

Синтез люциферазы проводили при 25°С в присутствии [14С]фенилаланина. В случае добавления в систему трансляции высокоочищенных шаперонов БпаК, БгЫ и ОгрЕ (димер), их концентрация составляла 1.3 мкМ, 200 нМ и 650 нМ, соответственно. Активность белка измеряли с помощью люминометра (рис. За).

2.0 -|

СО О. О

1,2

8 0,8

£ э

т—п—г— 0 10 20

—1—I—I—

30 40

—I—I—I

50 60 + Нер70

- №р70

10 20

—I—I—I—

30 40

-Нзр70

_1—,—|—,—,—[—|—|—,—|

0 10 20 30 40 50 60 время, мин.

Рис.3 Влияние шаперонов Нзр70 на эффективность сворачивания люциферазы, синтезируемой в бесклеточной системе трансляции.

Люциферазу синтезировали в присутствии [14С]фенилаланина в системе трансляции без (-Нэр70) или с добавлением шаперонов РпаК, DnaJ и вгрЕ (+Нзр70) до концентрации 1.3 мкМ, 200 нМ и 650 нМ, соответственно. Аликвоты, отобранные из трансляционной смеси, разбавляли буфером, содержащим АТФ, люциферин и ингибитор белкового синтеза (тиострептон). (а) Активность люциферазы в аликвотах. (б) Количество полноразмерной люциферазы в этих же аликвотах, определённое с помощью ДСН-электрофореза в полиакриламидном геле, радиоавтографии и подсчёта радиоактивности в полосе полноразмерного белка с помощью программы ОрЮиаМ. (в) Удельная ферментативная активность люциферазы в аликвотах, определённая как отношение активности фермента к его количеству.

Образцы после измерения люминесценции подвергали электрофорезу в денатурирующих условиях, и количество полноразмерного белка оценивали по радиоактивности включившейся в него меченой аминокислоты (рис. 36). Видно, что количество и активность синтезируемой люциферазы практически не зависят от добавления экзогенных шаперонов. Результат подсчёта удельной активности белка представлен на рис. Зв. Очевидно, что эффективность котрансляционного сворачивания люциферазы (в отличие от её ренатурации) не зависит от активности шаперонов в системе трансляции.

2.3. Длительность пост-трансляционной фазы сворачивания люциферазы,

синтезируемой в присутствии шаперонов HsplO

Ранее было показано, что синтезируемая de novo люцифераза завершает сворачивание и приобретает структуру активного фермента за чрезвычайно короткий промежуток времени (секунды или менее того) после освобождения из рибосомы. Иными словами, пост-трансляционная фаза сворачивания люциферазы длится не более секунды. В то же время сворачивание денатурированной люциферазы, катализируемое Hsp70 и осуществляющееся в точно таких же условиях (в бесклеточной системе трансляции), происходит медленно, с характеристическим временем в десятки минут (см. рис.2). Можно было ожидать, что в присутствии активных шаперонов Hsp70 сворачивание синтезируемой люциферазы также замедлится, и будет происходить с длительной пост-трансляционной фазой. Для проверки этого предположения трансляцию люциферазной мРНК проводили в присутствии люциферина, непрерывно регистрируя активность синтезируемого фермента. После появления люциферазной активности в реакционную смесь добавляли ингибитор трансляции. Нарастание свечения после остановки синтеза белка было бы возможно лишь вследствие пост-трансляционного сворачивания.

На рис. 4 видно, что введение миноциклина (антибиотика тетрациклинового ряда) в систему трансляции приводило к немедленному прекращению накопления в ней активного фермента. Никакого нарастания свечения вследствие пост-трансляционного сворачивания обнаружено не было ни в системе трансляции с добавленными шаперонами, ни в системе без экзогенных шаперонов, в которой активность Hsp70 практически отсутствует. В контрольном опыте (рис. 4в) добавление буферного раствора вместо ингибитора вызывало лишь незначительное замедление накопления активной люциферазы из-за разбавления смеси. Таким образом, добавление в систему трансляции активных экзогенных Hsp70 не приводит к увеличению длительности пост-трансляционной фазы сворачивания синтезируемого белка, что указывает на неучастие Hsp70 в котрансляционном сворачивании люциферазы.

О.

40-

Q. О

40 -

МИНОЦИКЛИН

10 20 время, мин.

160 и

120-

40 -

0 10 20 30 время, мин.

Рис.4 Оценка длительности пост-трансляционной фазы сворачивания люциферазы, синтезируемой в присутствии шаперонов Нэр70. Синтез белка проводили в бесклеточной системе трансляции без добавления шаперонов (а) или с шаперонами, добавленными до концентрации 1.3 мкМ, 200 нМ и 650 нМ, соответственно (б). Объём реакционной смеси составлял 25 мкл. В момент, отмеченный стрелкой, в систему вводили 0.5 мкл раствора миноциклина с концентрацией 5 мМ. (в) В контрольном эксперименте в систему добавляли 0.5 мкл буферного раствора.

Глава III. Сворачивание люциферазы с иммобилизованным на массивной частице С концом

Наблюдаемые различия между котрансляционным сворачиванием и ренатурацией люциферазы в скорости и эффективности этих процессов должны определяться физико-химическими факторами. Например, при ренатурации развёрнутого полноразмерного белка оба конца его цепи подвижны и не закреплены, в то время как С конец синтезируемого полипептида закреплён на рибосоме, масса которой на порядки превышает массу растущей полипептидной цепи. Для проверки предположения о том, что иммобилизация С конца полипептида может служить причиной его быстрого и эффективного сворачивания из развёрнутого состояния, использовали два подхода. Первый заключался в иммобилизации С конца люциферазы на гранулах хроматографического носителя, второй - в использовании природных комплексов рибосомы с растущим полипептидом, связанным с рибосомой в виде пептидил-тРНК.

3.1. Сворачивание полипептидной цепи люциферазы, иммобилизованной

на гранулах сефарозы

Иммобилизацию С конца полипептидной цепи на массивной частице проводили, используя высокое сродство олигогистидинового тракта к ионами никеля, связанным на поверхности гранул хелирующей сефарозы. Для получения люциферазы, содержащей С-концевоЙ гексагистидиновый тракт, к 3' концу люциферазного гена была добавлена нуклеотидная последовательность, кодирующая дополнительный 22-членный пептид, оканчивающийся шестью гистидиновыми остатками. Такой ген экспрессировали в клетках Е. coli и синтезированный активный фермент выделяли из клеток и очищали с помощью металл-хелатной хроматографии.

Связанный с никелевой сефарозой белок денатурировали в буферном растворе 7 М мочевины при 25°С в течение 5 минут. Для инициации сворачивания образец при той же температуре разбавляли буферным раствором без денатуранта, содержащим АТФ и люциферин. Конечная концентрация люциферазы составляла 8 нМ. За ренатурацией следили по восстановлению светоизлучающей активности в реакционной смеси, помещённой в ячейку люминометра.

60 •

£ 50-

2 -1 -

контроль

на носителе,

10 15 20 25 время, мин.

30 25

1 15 Н

S 10

на носителе

-г

"Т"

-1

60 120 180 240 300 время, мин.

Рис.5 Сворачивание денатурированной люциферазы, иммобилизованной на гранулах №2*-сефарозы (на носителе) и свободно диффундирующей в растворе, (а) Непрерывная регистрация люминесценции ренатурирующей люциферазы. Контролем служило разбавление неденатурированной люциферазы буферным раствором с АТФ и люциферином. (б) Измерение активности фермента в аликвотах, отобранных из реакционной смеси в указанное время. За 100% принята активность неденатурированной люциферазы.

Оказалось, что иммобилизация С конца белка не ускоряет его ренатурации: уровень плато не был достигнут за 25 минут инкубации (рис. 5а). В то же время иммобилизованный на носителе белок сворачивался с существенно большим выходом, чем белок, ренатурирующий в свободном виде в растворе.

Измерение активности фермента в аликвотах, отобранных из реакционной смеси, позволило определить выход активного белка в процессе ренатурации. На рис. 56 видно, что приблизительно 20% иммобилизованных на носителе молекул белка восстанавливает свою активность. В то же время плато выхода ренатурации свободного белка в растворе достигает значения всего в 5%. При этом характеристическое время восстановления половины от максимально достижимой активности составляет 50 минут как для ренатурации фермента в растворе, так и на носителе. Можно заключить, что иммобилизация С конца люциферазы на гранулах сефарозы увеличивает эффективность ренатурации, но не влияет на скорость этого процесса.

Причина низкой продуктивности ренатурации люциферазы в растворе может заключаться либо в неправильном сворачивании отдельных молекул белка, либо в их агрегации. В отличие от первой, вторая реакция зависит от концентрации белка. В следующей серии опытов ренатурацию проводили при разной концентрации люциферазы, составлявшей после разбавления денатуранта 0.33, 1.6, 8, 32 и 160 нМ. Результат опыта представлен на рис. 6. Видно, что эффективность ренатурации люциферазы в растворе снижается при увеличении концентрации белка.

30-

20-

10-

0-1

60 120 180 240 300

время, мин.

30-

20-

10-

—I-1-1-1-1

60 120 180 240 300

время, мин.

Рис.6 Ренатурация находящейся в растворе (а) и иммобилизованной (б)

полипептидной цепи люциферазы при разной концентрации белка. Концентрация люциферазы составляла 0.33 (7, ■), 1.6 (2, □), 8 (3, ▼), 32 (4, о) и 160 (5, •) нМ.

Так, при концентрации 0.33 нМ выход активного фермента составляет 30%, а при 160 нМ - всего лишь 0.5% (рис. 6а, кривые 1 и 5). Очевидно, что основной причиной низкого выхода активной люциферазы при ренатурации в растворе является её межмолекулярная агрегация. Такой же опыт был проведён с белком, иммобилизованным на гранулах сефарозы (рис. 66). Видно, что в отличие от ренатурации в растворе, эффективность ренатурации полипептидных цепей, связанных с носителем, не зависит от концентрации фермента и составляет при всех использованных концентрациях белка примерно 20%. Следовательно, можно заключить, что иммобилизация белка на носителе исключает его агрегацию и, тем самым, способствует его эффективному сворачиванию.

3.2. Ренатурация люциферазы, иммобилизованной на рибосоме в виде

пептидил-тРНК

Для получения рибосом, содержащих пептидил-тРНК с пептидом заданной длины, применяли "останавливающую" последовательность белка SecM. Эту последовательность составляют аминокислотные остатки со 150 по 166. Известно, что после синтеза этого 17-членного участка полипептидной цепи рибосомой трансляция останавливается и дальнейшего удлинения полипептида не происходит. При этом синтезированная полипептидная цепь остаётся прочно связанной с рибосомой в виде пептидил-тРНК, находящейся в Р-участке.

Для получения люциферазы, иммобилизованной на 70S рибосоме, к 3' концу кодирующей части люциферазного гена была добавлена последовательность, кодирующая 13-членный спейсерный участок и "останавливающий" фрагмент SecM длиной в 17 аминокислотных остатков (рис. 7а). Поскольку связанной с рибосомой люциферазе необходимо не менее 26 дополнительных С-концевых аминокислотных остатков для сворачивания в энзиматически активный белок, наличие спейсера было необходимо для проявления активности "остановленной" люциферазы. Кроме этого, на 5' конец гена люциферазы поместили последовательность, кодирующую гексагистидиновый тракт.

Ген модифицированной люциферазы, находящийся под контролем Т7-промотора, вводили в клетки Е. coli штамма BL21(DE3). Образовавшиеся в результате его экспрессии комплексы рибосомы с энзиматически активной люциферазой выделяли из клеток и подвергали хроматографической очистке на хелирующем носителе. На рис. 76 представлен результат электрофоретического анализа белкового состава комплексов. Видно, что кроме полос рибосомных белков, на геле присутствует дополнительная полоса с электрофоретической подвижностью, соответствующей подвижности белка с массой в ~100 кДа. Это значение соответствует ожидаемой молекулярной массе люциферазной пептидил-тРНК. При обработке комплексов пуромицином (антибиотиком, реагирующим с пептидил-тРНК в Р-участке и вызывающим освобождение полипептида из рибосомы) изменяется электрофоретическая подвижность

только этого компонента комплексов. После пуромициновой реакции подвижность уменьшается до значения, соответствующего белку с молекулярной массой в ~70 кДа, т.е. модифицированной люциферазе. Это доказывает, что люцифераза была связана с рибосомой в виде пептидил-тРНК, находящейся в Р-участке.

jj His-tag

LUC (-stop)

SecM

рибосома

Mr, кДа 20511885

3020.114.3-

шш

'ШвЬ- шш 2 3

-Luc-TPHK - Luc

Рис.7 Получение люциферазы, связанной с рибосомой в виде пептидил-тРНК. (а) Вверху: схема ДНК-матрицы, кодирующей модифицированную люциферазу. Ген белка находится под контролем Т7-промотора (T7), последовательность люциферазы не содержит терминирующего кодона (LUC(-stop)). Дополнительные последовательности кодируют N-концевой гексагистидиновый тракт (His-tag) и С-концевой "останавливающий" фрагмент белка SecM (SecM), соединённый с люциферазой 13-членным пептидом (спейсер). Внизу: схема комплекса рибосомы и люциферазной пептидил-тРНК, образующейся при экспрессии гена модифицированной люциферазы. (б) Электрофоретический анализ белкового состава рибосомных комплексов, содержащих люциферазную пептидил-тРНК. Анализировали вакантные рибосомы Е. coli (1), комплексы, полученные после хроматографической очистки на хелирующей сефарозе (2) и такие же комплексы после реакции с 2 мМ пуромицином (3). Представлена фотография геля, окрашенного кумасси голубым. Положение маркеров молекулярной массы и величины их масс указаны слева от электрофореграммы. Положение люциферазной пептидил-тРНК и люциферазы указано стрелками справа.

Для изучения ренатурации белка, связанного с рибосомой, нельзя применять денатурацию в концентрированном растворе мочевины, поскольку это приведёт к разворачиванию рибосомы и разрушению её комплекса с пептидил-тРНК. Известно, что люцифераза светлячка является термолабильным белком, инактивирующимся при повышенной температуре. Термоинактивацию применили для денатурации люциферазы, связанной с рибосомой. Предварительно нами было установлено, что после 20 минут инкубации при 40°С люцифераза полностью теряла активность, но оставалась связанной с рибосомой в виде пептидил-тРНК, чувствительной к пуромицину.

Для инициации сворачивания люциферазы, денатурированной нагреванием при 40°С, образец возвращали к нормальной температуре в 25°С. За ходом ренатурации следили по восстановлению светоизлучающей активности фермента. В качестве контроля использовали белок, который не подвергался тепловой инактивации.

время, мин.

Рис.8 Ренатурация люциферазы, денатурированной нагреванием.

Связанную с рибосомой в виде пептидил-тРНК (1) или освобождённую из рибосомы в раствор в ходе пуромициновой реакции (2) люциферазу денатурировали в буферном растворе при 40°С в течение 20 минут. В таких же условиях денатурировали белок дикого типа (3). Для инициации сворачивания температуру реакционной смеси понижали до 25°С. Концентрация фермента составляла 8 нМ во всех опытах. Активность неденатурированного фермента принята за 100%.

Ренатурация термически денатурированной люциферазы происходила медленно: уровень плато не был достигнут в течение 5 часов инкубации ни в случае белка, связанного с рибосомой в виде пептидил-тРНК, ни в случае свободного белка, сворачивающегося в растворе (рис. 8, кривые 1 и 3). В то же время связанная с рибосомой люцифераза сворачивалась с большей эффективностью, чем фермент дикого типа в растворе: после 5 часов инкубации выход активного белка составил 20% и 6%, соответственно. Очевидно, что это различие вызвано исключительно иммобилизацией фермента на рибосоме, поскольку его освобождение в раствор с помощью пуромициновой реакции снижает эффективность ренатурации белка с 20 до 8% (рис. 8, кривая 2). Таким образом можно заключить, что иммобилизация С конца люциферазы на рибосоме (так же, как и на гранулах сефарозы) увеличивает эффективность её сворачивания из денатурированного состояния, но не обеспечивает высокой скорости этого процесса, наблюдаемой при котрансляционном сворачивании.

Глава IV. Влияние скорости синтеза полипептидной цепи люциферазы на её котрансляционное сворачивание

При котрансляционном сворачивании синтез белка сопряжён по времени с формированием его третичной структуры. Можно ожидать, что скорость синтеза полипептидной цепи влияет на сопряжённое с ним сворачивание. Чтобы проверить это предположение, было использовано два способа

варьирования скорости синтеза люциферазы в бесклеточной системе трансляции. Первый заключался в синтезе фермента в обычном экстракте при разной температуре, второй основывался на использовании для синтеза специального экстракта, в котором можно варьировать концентрацию фактора элонгации в (ЕР-в) и тем самым менять скорость элонгации полипептидной цепи. Оба подхода были использованы для выявления зависимости эффективности котрансляционного сворачивания люциферазы от скорости её синтеза на рибосоме.

4.1. Влияние температуры на эффективность котрансляционного

сворачивания люциферазы

Известно, что скорость химических реакций (как спонтанных, так и катализируемых ферментами) зависит от температуры. Процесс биосинтеза белка состоит из ряда реакций, и также должен зависеть от температуры. Для выявления вида этой зависимости мРНК люциферазы транслировали в бактериальной бесклеточной системе при 16, 20, 25, 30, 35 и 40°С. Скорость синтеза фермента оценивали по времени появления люминесценции в реакционной смеси, поскольку в начале инкубации активный фермент отсутствует в транслирующей системе. Как следует из рис. 9, увеличение температуры инкубации приводит к более быстрому появлению активной люциферазы в системе. Так, люциферазная реакция наблюдается уже после 2 минут инкубации при 40°С, в то время как при 16°С - только после 20 минут. При всех значениях температуры инкубации, опробованных в опыте, появление люциферазной активности коррелирует по времени с появлением полноразмерных молекул фермента в трансляционной системе (рис. 9, радиоавтографы гелей ДСН-электрофореза в полиакриламидном геле). Можно заключить, что скорость синтеза полипептидной цепи возрастает с увеличением температуры.

Чтобы установить, зависит ли эффективность котрансляционного сворачивания люциферазы от температуры, при которой происходит её синтез, определяли удельную активность фермента, синтезированного при разной температуре. Удельную активность белка подсчитывали как отношение ферментативной активности люциферазы, измеренной при 25°С, к количеству полноразмерного меченого белка (рис. 10). Видно, что зависимость эффективности котрансляционного сворачивания белка от температуры, при которой происходит его синтез, имеет "колоколообразный" вид. Самые большие значения удельной активности люциферазы наблюдаются в интервале температур от 25 до 30°С, а самые низкие - при 16°С и 40°С.

1 в°с и™-.....

^^У^ 2 о°с ......

5°С . . ы щ *

со 0°С I . . ... <" У» V

3 —,—,—,—,—,—.—I 5°С I.....,,,,...,

4 , , , А . .. «,,■ о°с I ..,,.,, , И »4 Г* з*

О 10 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 70 1 2 3 4 5 7 10 13 1520 30 405060

время, мин. время, мин.

Рис.9 Бесклеточный синтез люциферазы при разной температуре. Синтез белка проводили в присутствии [14С]лейцина при указанной температуре. Аликвоты отбирали из транслирующих систем в указанное под радиоавтографом время и разбавляли их буферным раствором, содержащим АТФ, люциферин и тиострептон. Активность люциферазы в аликвотах измеряли с помощью люминометра при 25°С (графики представлены слева). Радиоактивно меченые продукты трансляции в аликвотах анализировали с помощью ДСН-электрофореза в 10% полиакрипамидном геле и радиоавтографии (радиоавтографы представлены справа). Положение полосы полноразмерной люциферазы указано стрелкой.

16 20 25 30 35 40 10 15 20 25 30 35 40 45

температура, "С

Рис.10 Зависимость удельной активности люциферазы от температуры, при которой происходил синтез фермента, (а) удельная активность люциферазы, синтезированной при определённой температуре (указана на оси абсцисс, под соответствующей группой слитых столбцов). Отдельный столбец в группе (в порядке слева направо) представляет величину удельной активности, измеренной на 30, 40, 50 и 60 минутах трансляции, соответственно, (б) Усреднённая по времени синтеза удельная активность в зависимости от температуры, при которой синтезировали фермент.

4.2 Влияние скорости синтеза люциферазы на эффективность её

котрансляционного сворачивания

Зависимость эффективности котрансляционного сворачивания люциферазы от температуры может быть объяснена не только влиянием скорости синтеза полипептидной цепи на её сворачивание. Как было показано выше, люцифераза является термолабильным белком. Поэтому низкая удельная активность фермента, синтезируемого при высокой температуре, может быть обусловлена его тепловой денатурацией. Низкие же температуры должны приводить к снижению гибкости полипептидной цепи и замедлению её сворачивания, что также может сказаться на удельной активности люциферазы.

Для того чтобы установить, зависит ли эффективность котрансляционного сворачивания именно от скорости синтеза белка, была разработана бесклеточная система трансляции, в которой скорость элонгации полипептидной цепи можно варьировать при постоянной температуре. Скорость элонгации зависит от многих факторов, и, в частности, от активности фактора элонгации G (EF-G), белка, катализирующего рибосомную транслокацию. В группе М.Г. Бубуненко (National Cancer Institute, USA) для нас был создан штамм NB5 Е. coli, в котором ген EF-G удалён из хромосомы одновременно с введением в клетки плазмиды, содержащей ген мутантного фактора. Последовательность мутантного белка снабжена С-концевым

гексагистидиновым трактом, что позволяло избирательно удалять фактор из клеточного экстракта. Ожидалось, что снижение концентрации EF-G в системе трансляции должно замедлить элонгацию полипептидной цепи.

Для удаления фактора G из S30 экстракта клеток штамма NB5 использовали металл-хелатную хроматографию на №2+-сефарозе. Связанный с носителем белок элюировали буферным раствором, содержащим 0.5 М имидазол. Элюат, а также не связавшийся с носителем тотальный белок | экстракта, анализировали с помощью ДСН-электрофореза в полиакриламидном геле (рис. 11). Видно, что обработка 1чЦ2+-сефарозой вызывает обеднение экстракта по единственному белку, электрофоретическая подвижность 1 которого соответствует подвижности EF-G (молекулярный вес 80 кДа). В то же время обработка хелирующей сефарозой экстракта клеток штамма А19, содержащих EF-G дикого типа, не приводила к удалению белков из экстракта ■ (рис. 11).

Рис.11 Белковый состав S30 экстрактов, подвергнутых металл-хелатной хроматографии. Экстракт клеток Е. coli штамма NB5 или А19 инкубировали в присутствии М2*-сефарозы, носитель отделяли центрифугированием и связанный белок элюировали буферным раствором, содержащим 0.5 М имидазол. Аликвоты экстракта после обработки (1), и элюата (2) анализировали с помощью ДСН-электрофореза в полиакриламидном геле. Приведена фотография геля, окрашенного кумасси голубым. Положение полосы попноразмерного EF-G указано стрелкой. Положение маркеров молекулярной массы и величины их масс указаны слева от электрофореграммы.

В S30 экстракте клеток NB5, обеднённом по EF-G, транслировали мРНК люциферазы. Синтез белка вели при 25°С в присутствии субстратов люциферазы, непрерывно измеряя интенсивность свечения в реакционной смеси. Видно, что обеднение экстракта по фактору G существенно снижает скорость синтеза белка (рис. 12). Время, необходимое для появления активных I молекул люциферазы при этом увеличивается с 6 минут в исходном экстракте

(содержащем EF-G в исходной концентрации) до 30 минут в экстракте, обеднённом по EF-G. Также следует отметить, что в обработанном Ni2+-сефарозой экстракте количество синтезируемого активного фермента снижено.

Для проверки предположения, что замедление трансляции связано именно со снижением концентрации EF-G, синтез люциферазы проводили, добавляя в обеднённый экстракт высокоочищенный препарат фактора. Как видно на рис.

12 12

■ EF-G

А19 NB5

12, добавление в систему трансляции очищенного ЕР-в увеличивает скорость синтеза и количество синтезированной активной люциферазы. Так, добавление в экстракт ЕБ-О до концентрации 1 мкМ и 10 мкМ уменьшает время, необходимое для появления люциферазной активности в системе трансляции, с 30 минут до 12 и 7 минут, соответственно. Можно заключить, что наблюдаемое замедление синтеза белка в экстракте, обработанном №2+-сефарозой, обусловлено снижением концентрации только ЕР-в. В дополнительных экспериментах было показано, что снижение концентрации ЕБ-О не изменяет скорости других стадий трансляции - инициации и терминации (данные не приведены). Таким образом, именно замедление элонгации вызывает снижение скорости синтеза белка.

Рис.12 Синтез люциферазы в бесклеточной системе трансляции при разных концентрациях ЕР-С. Синтез белка проводили при 25°С в системе трансляции, содержащей

необработанный БЗО экстракт клеток N¡35 (1), экстракт, обеднённый по ЕР-в с помощью №2*-хелатной хроматографии (4), или обеднённый экстракт, к которому был добавлен очищенный ЕР-в до концентрации 1 мкМ (3) и 10 мкМ (2). На врезке вверху представлен фрагмент того же графика в увеличенном масштабе.

время, мин.

Далее была измерена удельная активность люциферазы, синтезированной с разными скоростями. Синтез вели при температуре 30°С в присутствии [14С]лейцина. В заданное время из системы трансляции отбирали аликвоты. Активность фермента и радиоактивность, включившуюся в его полноразмерную цепь, измеряли, как описано выше (главы 2.2 и 4.1). Оказалось, что замедление синтеза белка вызывало снижение эффективности сворачивания синтезируемого фермента (рис. 13). Увеличение скорости синтеза с помощью добавления к обеднённому экстракту фактора элонгации приводило к восстановлению удельной активности люциферазы до уровня, наблюдаемого в необработанном экстракте.

На рис. 136 представлена зависимость удельной активности белка от скорости его синтеза. Скорость, выраженную в аминокислотных остатках в секунду, рассчитывали как отношение количества аминокислотных остатков в люциферазной цепи (550) ко времени, необходимому для её синтеза. Видно, что

максимальное снижение концентрации ЕИ-С, достигнутое в опыте, приводит к 2-кратному снижению удельной активности синтезируемого белка. Таким образом, выявлена зависимость эффективности котрансляционного сворачивания белка от скорости элонгации его полипептидной цепи. В случае люциферазы снижение скорости приводит к ухудшению сворачивания. Вероятно, этой же причиной обусловлено снижение удельной активности люциферазы, синтезируемой при низкой температуре.

Рис 13 Удельная активность люциферазы, синтезируемой в бесклеточных системах трансляции с разными концентрациями ЕР-С. (а) Удельная активность фермента, измеренная в процессе работы системы в указанное время. Системы трансляции содержат исходный экстракт клеток ЫВ5 (I), экстракт, обеднённый по ЕР-в с помощью Ыр'-сефарозы (4) или обеднённый экстракт, к которому добавлен ЕР-в до концентрации 1 мкМ (3) и 10 мкМ (2). Синтез фермента проводили при 30°С. (б) Зависимость усреднённой по времени удельной активности люциферазы от скорости элонгации (в аминокислотных остатков в секунду).

выводы

1. Молекулярные шапероны семейства Нзр70, необходимые для эффективного сворачивания денатурированной люциферазы светлячка РкоИпш руга1не участвуют в котрансляционном сворачивании этого белка.

2. Иммобилизация С конца люциферазы на массивной частице (гранула сефарозы или рибосома) увеличивает эффективность сворачивания этого белка из денатурированного состояния, препятствуя межмолекулярной агрегации.

3. Иммобилизации С конца растущего полипептида на рибосоме недостаточно для обеспечения высокой скорости котрансляционного сворачивания.

4. Эффективность котрансляционного сворачивания люциферазы зависит от температуры: её оптимальное значение лежит между 25 и 30°С.

5. Эффективность котрансляционного сворачивания зависит от скорости элонгации полипептидной цепи на рибосоме. В случае люциферазы замедление элонгации приводит к снижению удельной активности синтезированного фермента.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Светлов М.С., Колб В.А., Коммер А. и Спирин А.С. (2005) Эффективное котрансляционное сворачивание светлячковой люциферазы не зависит от шаперонов Hsp70. Тезисы докладов XIIмеждународной конференции студентов, аспирантов а молодых ученых «Ломоносов - 2005», Москва, 12 -15 апреля.

2. Svetlov M.S., Kommer A., Kolb V.A. and Spirin A.S. (2006) Effective cotranslational folding of firefly luciferase without chaperones of the Hsp70 family. Protein Sci., 15, 242-247.

3. Светлов M.C., Колб B.A. и Спирин А.С. (2007) Сворачивание полипептидной цепи светлячковой люциферазы с иммобилизованным С-концом. Мол. биология, 41, 96-102

Заказ № 158-а/09/09 Подписано в печать 25.09.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таН: info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Светлов, Максим Сергеевич

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава I. КОТРАНСЛЯЦИОННОЕ СВОРАЧИВАНИЕ БЕЛКОВ.

1.1. Гипотеза котрансляционного сворачивания белка.

1.2. Скорость и эффективность котрансляционного формирования дисульфидных связей.

1.3. Скорость и эффективность котрансляционного формирования нативной структуры.

1.4. Котрансляционная олигомеризация белков.\

Глава II. ФАКТОРЫ КОТРАНСЛЯЦИОННОГО СВОРАЧИВАНИЯ БЕЛКА.

2.1. Вклад векторности синтеза белка на рибосоме в его котрансляционное сворачивание.

2.2. Влияние скорости синтеза белка на его котрансляционное сворачивание.

2.3. Вклад фиксации С конца растущего полипептида на рибосоме в его котрансляционное сворачивание.

2.4. Влияние рибосомного окружения растущей полипептидной цепи на её котрансляционное сворачивание.

2.4.1. Стартовая конформациярастущего полипептида, задаваемая в пептидил-трансферазном центре рибосомы.

2.4.2. Путь растущей цепи от пептидил-трансферазного центра к выходу из рибосомы.

2.4.3. Сворачивание растущей полипептидной цепи внутри рибосомы.

2.5. Вклад молекулярных шаперонов в котрансляционное сворачивание белка.

2.5.1. Молекулярные шапероны семейства Hsp70 • • •

2.5.2. Молекулярные шапероны семейства Hsp60.

Глава III. ЛЮЦИФЕР АЗА СВЕТЛЯКА PHOTINUS PYRALIS.

3.1. Свойства фермента.

3.2. Люцифераза как объект исследований сворачивания белков.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава I. ЭФФЕКТИВНОСТЬ КОТРАНСЛЯЦИОННОГО СВОРАЧИВАНИЯ ЛЮЦИФЕР АЗЫ В БАКТЕРИАЛЬНОЙ БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ ТРАНСЛЯЦИИ.

Глава II. ВЛИЯНИЕ ШАПЕРОНОВ НА КОТРАНСЛЯЦИОННОЕ

СВОРАЧИВАНИЕ ЛЮЦИФЕРАЗЫ.

2.1. Активность шаперонов Hsp70 в бактериальной бесклеточной системе трансляции.

2.2. Эффективность котрансляционного сворачивания люциферазы в присутствии шаперонов Hsp70.

2.3. Длительность пост-трансляционного сворачивания люциферазы, синтезируемой в присутствии шаперонов Hsp70.

2.4. Длительность пост-трансляционного сворачивания люциферазы, синтезируемой в присутствии триггер фактора.

Глава III. СВОРАЧИВАНИЕ ЛЮЦИФЕРАЗЫ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМ НА МАССИВНОЙ ЧАСТИЦЕ С КОНЦОМ.

3.1. Сворачивание полипептидной цепи люциферазы, иммобилизованной на гранулах сефарозы.

3.1.1. Иммобилизация С конца люциферазы на гранулах хелирующей сефарозы.

3.1.2. Сворачивание полипептидной цепи люциферазы на гранулах сефарозы.

3.1.3. Зависимость эффективностиренатурации люциферазы от концентрации белка.

3.1.4. Ренатурация иммобилизованной люциферазы при разной ионной силе.

3.2. Ренатурация люциферазы, иммобилизованной на рибосоме в виде пептидил-тРНК.

3.2.1. Иммобилизация С конца люциферазы на 70S рибосоме.

3.2.2. Ренатурация люциферазы, иммобилизованной на

70S рибосоме.

3.2.3. Влияние триггер фактора наренатурацию связанной с рибосомой люциферазы.

Глава IV. ВЛИЯНИЕ СКОРОСТИ СИНТЕЗА ПОЛИПЕПТИДНОЙ ЦЕПИ ЛЮЦИФЕРАЗЫ НА ЕЁ КОТРАНСЛЯЦИОННОЕ СВОРАЧИВАНИЕ.

4.1. Влияние температуры на котрансляционное сворачивание люциферазы.

4.2. Влияние скорости синтеза люциферазы на эффективность её котрансляционного сворачивания.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Факторы, влияющие на скорость и эффективность котрансляционного сворачивания белка"

Сворачиванием (фолдингом) белка называется процесс приобретения полипептидной цепью уникальной для этого белка пространственной структуры (конформации). Способность линейного полимера принимать устойчивую, долгоживущую конформацию, называемую также правильной или нативной, является важнейшим свойством белковой молекулы, без которого было бы невозможно осуществление белком его биологической функции в клетке.

Поскольку полипептидная цепь является полимером, состоящим из множества (как правило, нескольких сотен) аминокислотных остатков, число теоретически возможных конформаций белка огромно. Если бы сворачивание полипептидной цепи происходило путём случайного перебора всех возможных конформаций и поиска энергетически наиболее выгодной, то, в соответствии с парадоксом Левинталя (Levinthal, 1969), цепи длиной в 100 аминокислотных остатков потребовалось бы 10й лет для достижения нативного состояния. В действительности же приобретение белком в живой клетке единственной, строго определённой пространственной структуры происходит быстро и с высоким выходом правильно свёрнутого белка. Механизм этого процесса, а также факторы, определяющие скорость и эффективность его протекания в клетке, остаются невыясненными.

Подходы к исследованию сворачивания белка разнообразны и многочисленны. Однако подавляющее большинство этих исследований относится к сворачиванию полноразмерных полипептидных цепей в нативную структуру, когда в качестве исходного состояния цепи выступает полностью или частично денатурированный белок. К настоящему времени установлено, что сворачивание белков в клетке происходит котрансляционно, начинаясь задолго до завершения их синтеза на рибосоме. Котрансляционное сворачивание отличается по ряду физико-химических параметров от сворачивания свободного развёрнутого полипептида в растворе. Так, при котрансляционном сворачивании С конец растущего полипептида не может диффундировать свободно, поскольку он иммобилизован на рибосоме, обладающей гигантской по сравнению с пептидом массой. Кроме того, длина сворачивающейся цепи не постоянна, а увеличивается по мере элонгации, добавляющей всё больше аминокислотных остатков к числу участников поиска "правильного" положения в пространстве и нативной конформации. Рост цепи происходит векторно: в процессе синтеза белка сначала появляется N-концевой сегмент растущего полипептида, и лишь затем - С-концевой. Очевидно, что сворачивание N-концевого участка может происходить в отсутствие С-концевой части молекулы, что также является отличительной чертой котрансляционного сворачивания. Поскольку при котрансляционном сворачивании синтез и сворачивание сопряжены по времени, можно ожидать, что скорость роста полипептидной цепи также может влиять на результат формирования третичной структуры синтезируемого белка. Кроме того вероятно, что растущая полипептидная цепь начинает сворачиваться из "стартовой" а-спиральной конформации, возникающей в пептидилтрансферазном центре рибосомы. Помимо перечисленных физико-химических параметров, на сворачивание синтезируемых в клетке белков могут влиять молекулярные шапероны и другие "катализаторы фолдинга".

По всей видимости, результат совместного или индивидуального действия упомянутых факторов проявляется в том, что сворачивание синтезируемого на рибосоме белка происходит быстро и эффективно в отличие от сворачивания белка из развёрнутого состояния, как это было показано при изучении сворачивания шоциферазы светлячка Photinus pyralis. Известно, что ренатурация этого белка из полностью развёрнутого состояния происходит чрезвычайно медленно (в течение нескольких часов) и сопровождается его агрегацией, значительно снижающей эффективность процесса (Herbst et al., 1997; Herbst et al., 1998). В то же время синтезируемая de novo люцифераза завершает сворачивание и приобретает структуру активного фермента за чрезвычайно короткий промежуток времени (секунды или менее того) после освобождения из рибосомы (Kolb et al., 1994; Kolb et al., 2000).

В настоящей работе предпринята попытка оценить индивидуальный вклад некоторых из перечисленных выше факторов в обеспечение быстрого и эффективного сворачивания растущей полипептидной цепи люциферазы. Так, предполагалось выяснить, как скорость и эффективность котрансляционного сворачивания люциферазы зависят от активности шаперонов Hsp70 в системе трансляции, а также определить, как скорость элонгации полипептидной цепи и температура, при которой происходит синтез люциферазы, влияют на эффективность сворачивания этого белка. Кроме того, целью работы было выяснить, ускоряется ли сворачивание денатурированной люциферазы, если её С конец иммобилизован на массивной частице, как это имеет место при котрансляционном сворачивании. В изложении результатов работы под эффективностью сворачивания подразумевали выход правильно свёрнутого (и, следовательно, ферментативно активного) белка. Количественной мерой для этого параметра служила удельная ферментативная активность люциферазы.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Светлов, Максим Сергеевич

выводы

1. Молекулярные шапероны семейства Hsp70, необходимые для эффективного сворачивания денатурированной люциферазы светлячка Photinus pyralis, не участвуют в котрансляционном сворачивании этого белка.

АА

АТФ

БСА

ГТФ

Да

ДЕАЕ

ДМСО

ДСН

ИПТГ

Ки

МБА об./мин

ПСА

ПЦР

ПЭГ

ТЕМЕД

Трис

УТФ

ЦТФ

ЭДТА

CPS

GFP HEPES MOPS PMSF

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В опытах по синтезу люциферазы в бактериальной бесклеточной системе трансляции показано, что котрансляционное сворачивание фермента происходит значительно быстрее и эффективнее, чем его спонтанное сворачивание из денатурированного состояния в буферном растворе. Цель настоящей работы состояла в оценке индивидуального вклада некоторых факторов в обеспечение быстрого и эффективного сворачивания растущей полипептидной цепи люциферазы.

В литературе бытует точка зрения, согласно которой высокая эффективность котрансляционного сворачивания белков в клетке обеспечивается молекулярными шаперонами. Для люциферазы светлячка показано, что ренатурация этого белка происходит эффективно только при участии шаперонов DnaK, DnaJ и GrpE семейства Hsp70 (Szabo et al., 1994). Участие этих белков в котрансляционном сворачивании также представлялось возможным, тем более что их физическое взаимодействие с растущей полипептидной цепью было обнаружено именно в случае люциферазы (Hendrick etal., 1993).

В настоящей работе было исследовано влияние бактериальных шаперонов семейства Hsp70 на котрансляционное сворачивание люциферазы, синтезируемой в бесклеточной системе трансляции. Полученные результаты показывают, что, в отличие от ренатурации, скорость и эффективность котрансляционного сворачивания люциферазы не зависят от активности молекулярных шаперонов семейства Hsp70. Участия этих белков в котрансляционном сворачивании не удалось обнаружить ни по изменению удельной активности синтезируемого фермента, ни по замедлению его сворачивания, являющемуся признаком участия шаперонов в этом процессе.

На независимость котрансляционного сворачивания люциферазы от шаперонов Hsp70 также указывают данные, полученные в работы (Hesterkamp & Bukau, 1998). Эти авторы обнаружили, что активность фермента, синтезированного в клетках Е. coli дикого типа и в клетках, лишённых гена dnaK, практически одинакова. Был сделан вывод о том, что шаперон DnaK не участвует в сворачивании синтезируемых de novo белков.

Однако необходимо отметить, что при нормальных температурных условиях белок DnaK в клетке играет роль негативного регулятора транскрипции генов белков теплового шока (в том числе своего собственного гена) (Tilly et al., 1983). Удаление гена dnaK приводит к нарушению этой регуляции. В результате при нормальной температуре в. клетках, лишённых DnaK, осуществляется активный синтез других белков теплового шока (большинство из которых являются шаперонами). Поэтому нельзя было исключить того, что высокая эффективность сворачивания люциферазы в: мутантных клетках, лишённых DnaK, могла быть обусловлена "компенсаторным" действием других, находящих в избытке, шаперонов. В настоящей работе синтез фермента происходил в бесклеточной системе, изменение белкового состава, которой возможно лишь по произволу исследователя, но не вследствие регуляции. Следовательно, "компенсаторное" действие других шаперонов было исключено, и неучастие шаперонов Hsp70 в котрансляционном сворачивании показано более надёжно. .

В литературе имеются указания на то, что в котрансляционном сворачивании синтезируемой полипептидной цепи участвует триггер фактор - бактериальный шаперон, обладающий сродством к рибосоме. В работе (Agashe et al., 2004) было заявлено, что добавление этого белка в бесклеточную систему трансляции увеличивает эффективность котрансляционного сворачивания синтезируемой люциферазы. При этом происходило существенное замедление приобретения ферментом нативной структуры, что выражалось в появлении длительной (длящейся десятки минут) посттрансляционной фазы его сворачивания. Эти данные были проверены нами. Оказалось, что добавление в бёсклеточную систему трансляции триггер фактора не привело к увеличению эффективности котрансляционного сворачивания люциферазы и не вызвало замедления этого процесса. Таким образом, заявленного в работе (Agashe et al., 2004) влияния триггер фактора на сворачивание синтезируемой de novo люциферазы обнаружить не удалось. Однако полностью исключить возможного участия этого шаперона в котрансляционном сворачивании: белков, нельзя; поскольку его присутствие в клеточном экстракте в наших опытах не контролировалось. Вероятно, что независимое от шаперонов котрансляционное сворачивание характерно для многих цитозольных белков. Так, ряд белков, (среди них . лизоцим и GFP) удалось синтезировать в. высокоактивной форме, используя так называемую "чистую" систему трансляции (the PURE System). Эта система состоит из компонентов бактериального белок-синтезирующёго аппарата, каждый, из которых был индивидуально выделен и очищен (Shimizu et al., 2001; Ueda et al., 2002). Молекулярные шапероны в такой системе гарантированно отсутствовали, что не помешало синтезируемым полипептидным цепям сворачиваться и с высокой эффективностью приобретать нативную конформацию. Таким образом, можно заключить, что для эффективного котрансляционного сворачивания многих белков (по крайней мере, для глобулярных моносубъединичных цитозольных) молекулярные шапероны и "катализаторы фолдинга" не требуются.

Очевидно, что различия между котрансляционным сворачиванием и ренатурацией должны определяться не только белковым составом окружения синтезируемой цепи, но и рядом физико-химических факторов. Одним из них является фиксация С конца синтезируемого полипептида на рибосоме, молекулярная масса которой на порядки превышает массу растущей цепи. Ранее вклад иммобилизации С конца растущего полипептида на рибосоме в его котрансляционное сворачивание оценивали только теоретически. Было высказано предположение, что иммобилизация должна ограничивать диффузию синтезируемого белка, уменьшая вероятность его агрегации с другими белками (Fedorov & Baldwin, 1997). Кроме этого, жёсткая фиксация С конца растущей цепи должна уменьшать количество степеней свободы растущего сегмента полипептидной цепи и приводить к большей стабильности промежуточных структур, формируемых ею при сворачивании, по сравнению с их стабильностью в растворе (Спирин, 1984). Из энтропийных соображений можно предположить, что такая стабилизация могла бы повлиять на скорость сворачивания синтезируемого белка и способствовать его эффективному котрансляционному сворачиванию.

Экспериментальная проверка вклада С-концевой иммобилизации белка на массивной частице в его сворачивание осуществлена в настоящей работе. Оказалось, что иммобилизация С конца полипептидной цепи люциферазы на грануле хроматографического носителя или рибосоме увеличивает эффективность, но не скорость её сворачивания. Показано, что высокая эффективность сворачивания связанного с носителем фермента обусловлена отсутствием его межмолекулярной агрегации. Этот результат подтверждает предположение, высказанное в работе (Fedorov & Baldwin, 1997). Также обнаружено, что выход нативной люциферазы при ренатурации иммобилизованного белка зависит от ионной силы буферного раствора: найдена оптимальная концентрация соли, при которой эффективность ренатурации максимальна. Из этого следует, что электростатические и гидрофобные взаимодействия между развёрнутым полипептидом и носителем влияют на эффективность его ренатурации. Можно предположить, что взаимодействие растущего полипептида с рибосомой также должно сказываться на эффективности его котрансляционного сворачивания, хотя влияния рибосомы, ускоряющего сворачивание связанного с ней полноразмерного денатурированного белка, в наших опытах обнаружено не было.

Ещё одним фактором, способным обуславливать высокую скорость и эффективность котрансляционного сворачивания белка, может быть скорость его синтеза на рибосоме. Легко допустить, что некоторые этапы сворачивания растущей полипептидной цепи медленны, и могут "не поспевать" за элонгацией, поставляющей новые аминокислотные остатки, и, соответственно, предоставляющей возможность новых нежелательных контактов внутри цепи. Столь же легко допустить и обратное. Так, при медленной элонгации определённые интермедиаты сворачивания могут слишком долго оставаться без аминокислотных остатков С-концевой части молекулы, являющихся их необходимыми партнёрами по взаимодействию при сворачивании. Это увеличивает вероятность осуществления таким интермедиатом неправильного, непродуктивного структурного перехода, приводящего к ошибочной конечной структуре. Кроме того, в печати была высказана гипотеза о том, что замедление трансляции должно приводить к увеличению эффективности котрансляционного сворачивания белка (Netzer & Hartl, 1997). Однако полученные нами данные говорят о том, что замедление скорости синтеза люциферазной цепи на рибосоме приводит к снижению её удельной активности. Вероятно, что котрансляционное сворачивание является эволюционно "оптимизированным" по скорости процессом, замедление которого чревато ошибками и потерей активности синтезируемого белка.

Следует отметить, что изученные нами физико-химические факторы влияли исключительно на эффективность котрансляционного сворачивания люциферазы, но не на скорость этого процесса. Очевидно, что высокая скорость сворачивания растущей полипептидной цепи люциферазы должна обеспечиваться иными (не проверенными в настоящей работе) физико-химическими факторами. Среди них можно выделить векторность роста полипептидной цепи на рибосоме, вынуждающую N-концевой сегмент растущего полипептида сворачиваться в отсутствие С-концевого. Кроме того вероятно, что растущая полипептидная цепь начинает сворачиваться из "стартовой" а-спиральной конформации, возникающей в пептидилтрансферазном центре рибосомы. Каждый из перечисленных факторов может вносить определённый вклад в увеличение скорости сворачивания синтезируемого рибосомой белка. Нельзя также исключить возможность того, что для котрансляционного сворачивания важен не единственный из перечисленных факторов, а их сочетание. Дальнейшие исследования позволят, как мы надеемся, ответить на эти вопросы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ

Использованные в работе ферменты и реактивы перечислены в таблице 1:

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Светлов, Максим Сергеевич, Москва

1. Anfinsen C.B., Haber E., Sela M. & White F.H. Jr. (1961) The kinetics of formation of native ribonuclease during oxidation of the reduced polypeptide chain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 47, 1309-1314.

2. Anfinsen C.B. (1973) Principles that govern the folding of protein chains. Science, 181,223-230.

3. Anfinsen C.B. & Scheraga H.A. (1975) Experimental and theoretical aspects of protein folding. Adv. Protein Chem., 29, 205 300.

4. Baird G.S., Zacharias D.A. & Tsien R.Y. (1999) Circular permutation and receptor insertion within green fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 96, 11241 -11246.

5. Baldwin Т.О. (1996) Firefly luciferase: the structure is known, but mystery remains. Structure, 4, 223 228.

6. Ban N. Nissen P., Hansen J., Capel M., Moore P.B. & Steitz T.A. (1999) Placement of protein and RNA structures into a 5 A-resolution map of the 50S ribosomal subunit. Nature, 400, 841 847.

7. Ban N. Nissen P., Hansen J., Moore P.B. & Steitz T.A. (2000) The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution. Science, 289, 905 920.

8. Bardwell J.C., Tilly K, Craig E., King J., Zylicz M. & Georgopoulos C. (1986) The nucleotide sequence of the Escherichia coli K12 dnaJ+ gene. A gene that encodes a heat shock protein. J. Biol. Chem., 261, 1782 1785.

9. Berg R.A., Schwartz M.L. & Crystal R.G. (1980) Regulation of the production of secretory proteins: intracellular degradation of newly synthesized "defective" collagen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77,4746 4750.

10. Bergman L.W. & Kuehl W.M. (1979 a) Formation of an intrachain disulfide bond on nascent immunoglobulin light chains. J. Biol. Chem., 254, 8869 8876.

11. Bergman L.W. & Kuehl W.M. (1979 b) Formation of intermolecular disulfide bonds on nascent immunoglobulin polypeptides. J. Biol. Chem., 254, 5690 5694.

12. Bernabeu C. & Lake J.A. (1982) Nascent polypeptide chains emerge from the exit domain of the large ribosomal subunit: immune mapping of the nascent chain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 3111 3115.

13. Beier G. & Engel J. (1966) The renaturation of soluble collagen. Products formed at different temperatures. Biochemistry, 5, 2744 2755.

14. Blobel G. & Sabatini D.D. (1970) Controlled proteolysis of nascent polypeptides in rat liver cell fractions. I. Location of the polypeptides within ribosomes. J. Cell Biol., 45, 130 145.

15. Blond-Elguindi S. & Goldberg M.E. (1990) Kinetic characterization of early immunoreactive intermediates during the refolding of guanidine-unfolded Escherihia coli tryptophan synthase P2 subunits. Biochemistry, 29, 2409 2417.

16. Bochkareva E.S., Lissin N.M. & Girshovich A.S. (1988) Transient association of newly synthesized unfolded proteins with the heat-shock GroEL protein. Nature, 336, 254-257.

17. Bochkareva E., Seluanov A., Bibi E. & Girshovich A. (1996) Chaperonin-promoted post-translational membrane insertion of a multispanning membrane protein lactose permease. J. Biol. Chem., 271, 22256 22261.

18. Bochkareva E.S., Solovieva M.E. & Girshovich A.S. (1998) Targeting of GroEL to SecA on the cytoplasmic membrane of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci USA., 95, 478-483.

19. Branchini B.R., Magyar R.A., Marcantonio K.M., Newberry K.J., Stroh J.G., Hinz L.K. & Murtiashaw M.H. (1997) Identification of a firefly luciferase active site peptide using a benzophenone-based photooxidation reagent. J. Biol. Chem., 272, 19359-19364.

20. Branchini B.R., Magyar R.A., Murtiashaw M.H., Anderson S.M. & Zimmer M. (1998) Site-directed mutagenesis of histidine 245 in firefly luciferase: A proposed model of the active site. Biochemistry, 37, 15311 15319.

21. Branchini B.R., Murtiashaw M.H., Magyar R.A. & Anderson S.M. (2000) The role of lysine 529, a conserved residue of the acyl-adenylate-forming enzyme superfamily, in firefly luciferase. Biochemistry, 39, 5433 — 5440.

22. Bruckner P., Eikenberry E.F. & Prockop DJ. (1981) Formation of the triple helix of type I procollagen in cellulo. A kinetic model based on cis-trans isomerization of peptide bonds. Eur. J. Biochem., 118, 607 613.

23. Buchberger A., Schroder H., Hesterkamp Т., Schonfeld H.J. & Bukau B. (1996) Substrate shuttling between the DnaK and GroEL systems indicates a chaperone network promoting protein folding. J. Mol. Biol., 261, 328 333.

24. Buchwalder A., Szadkowski H. & Kirschner K. (1992) A fully active variant of dihydrofolate reductase with a circularly permuted sequence. Biochemistry, 31, 1621 1630.

25. Chaney W.G. & Morris A J. (1978) Nonuniform size distribution of nascent peptides: the role of messenger RNA. Arch. Biochem. Biophys., 191, 734 741.

26. Chaudhuri Т.К., Farr G.W., Fenton W.A., Rospert S. & Horwich A.L. (2001) GroEL/GroES-mediated folding of a protein too large to be encapsulated. Cell, 107, 235-246.

27. Chekulaeva M.N., Kurnasov O.V., Shirokov V.A. & Spirin A.S. (2001) Continuous-exchange cell-free protein-synthesizing system: Synthesis of HIV-1 antigen Nef. Biochem. Biophys. Res. Commun., 280, 914 — 917.

28. Conti E., Franks N.P. & Brick P. (1996) Crystal structure of firefly luciferase throws light on a superfamily of adenylate-forming enzymes. Structure, 4, 287 — 298.

29. Cowie D.B. Spiegelman S., Roberts R.B. & Duerksen J.D. (1961) Ribosome-bound beta-galactosidase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 47, 114-122.

30. Crombie Т., Swaffield J.C. & Brown A J. (1992) Protein folding within the cell is influenced by controlled rates of polypeptide elongation. J. Mol. Biol., 228, 7-12.

31. Dalbow D.G. & Young R. (1975) Synthesis time of beta-galactosidase in Escherichia coli B/r as a function of growth rate. Biochem J., 150, 13 — 20.

32. DeLuca M. (1976) Firefly luciferase. Adv. Enzymol., 44, 37 68.

33. DeLuca M. & McElroy W.D. (1974) Kinetics of the firefly luciferase catalyzed reactions. Biochemistry, 13, 921 925.

34. DeLuca M. & McElroy W.D. (1978) Purification and properties of firefly luciferase. Methods Enzymol., 57, 3-15.

35. Denburg J.L. & McElroy W.D. (1970) Catalytic subunit of firefly luciferase. Biochemistry, 9, 4619 4624.

36. De Wet J.R., Wood K.V., DeLuca M., Helinski D.R. & Subramani S. (1987) Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells. Mol. Cell. Biol., 7, 725 -737.

37. Dice J.F. & Goldberg A.L. (1975) Relationship between in vivo degradative rates and isoelectric points of proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3893 3897.

38. Evans M.S., Ugrinov K.G., Frese M.A. & Clark P.L. (2005) Homogeneous stalled ribosome nascent chain complexes produced in vivo or in vitro. Nat. Methods, 2, 757 -762.

39. Ewalt K.L., Hendrick J.P., Houry W.A. & Hartl F.U. (1997) In vivo observation of polypeptide flux through the bacterial chaperonin system. Cell, 90, 491-500.

40. Epstein H.F., Schechter A.N., Chen R.F. & Anfinsen C.B. (1971) Folding of staphylococcal nuclease: kinetic studies of two processes in acid renaturation. J. Mol. Biol., 60, 499 508.

41. Fayet О. Ziegelhoffer Т. & Georgopoulos С. (1989) The groES and groEL heat shock gene products of Escherichia coli are essential for bacterial growth at all temperatures. J. Bacteriol., 171, 1379 1385.

42. Fedorov A.N. & Baldwin Т.О. (1995) Contribution of cotranslational folding to the rate of formation of native protein structure. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 1227 -1231.

43. Fedorov A.N. & Baldwin Т.О. (1997) Cotranslational protein folding. J. Biol. Chem., 272, 32715-32718.

44. Fedorov A.N. & Baldwin Т.О. (1999) Process of biosynthetic protein folding determines the rapid formation of native structure. J. Mol. Biol. 294, 579 586.

45. Forchhammer J. & Lindahl L. (1971) Growth rate of polypeptide chains as a function of the cell growth rate in a mutant of Escherichia coli 15. J. Mol. Biol., 55, 563 — 568.

46. Franks N.P., Jenkins A., Conti E., Lieb W.R. & Brick P. (1998) Structural basis for the inhibition of firefly luciferase by a general anesthetic. Biophys. J., 75, 2205 -2211.

47. Frydman J. (2001) Folding of newly translated proteins in vivo: The role of molecular chaperones. Annu. Rev. Biochem., 70, 603 — 647.

48. Garrett J.B., Mullins L.S. & Raushel F.M. (1996) Are turns required for the folding of ribonuclease Tl? Protein Sci., 5, 204 — 211.

49. Gautschi M., Lilie H., Fiinfschilling U., Mun A., Ross S., Lithgow Т., Rticknagel P. & Rospert S. (2001) RAC, a stable ribosome-associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs Sszlp and zuotin. Proc. Natl. Acad. Sci USA., 98, 3762 -3767.

50. Georgopoulos C.P., Hendrix R.W., Kaiser A.D. & Wood W.B. (1972) Role of the host cell in bacteriophage morphogenesis: effects of a bacterial mutation on T4 head assembly. Nature New Biol., 239, 38-41.

51. Georgopoulos C.P., Hendrix R.W., Casjens S.R. & Kaiser A.D. (1973) Host participation in bacteriophage lambda head assembly. J. Mol. Biol., 76, 45 — 60.

52. Georgopoulos С., Tilly К., Drahos D. & Hendrix R. (1982) The B66.0 protein of Escherichia coli is the product of the dnaK+ gene. J. Bacteriol., 149, 1175 1177.

53. Gething MJ. & Sambrook J. (1992) Protein folding in the cell. Nature, 355, 33 45.

54. Gilmore R., Coffey M.C., Leone G., McLure K. & Lee P.W. (1996) Co-translational trimerization of the reovirus cell attachment protein. EMBOJ., 15, 2651 2658.

55. Goldenberg D.P. & Creighton Т.Е. (1983) Circular and circularly permuted forms of bovine pancreatic trypsin inhibitor. J. Mol. Biol., 165, 407 — 413.

56. GoloubinoffP., Christeller J.T., Gatenby A.A. & Lorimer G.H. (1989) Reconstitution of active dimeric ribulose bisphosphate carboxylase from an unfoleded state depends on two chaperonin proteins and Mg-ATP. Nature, 342, 884-889.

57. Gould S.J. & Subramani S. (1988) Firefly luciferase as a tool in molecular and cell biology. Anal. Biochem., 175, 5 13.

58. Gurevich V.V., Pokrovskaya I.D., Obukhova T.A. & Zozulya S.A. (1991) Preparative in vitro mRNA synthesis using SP6 and T7 RNA polymerase. Anal. Biochem., 195, 207-213.

59. Hamlin J. & Zabin I. (1972) P-Galactosidase: Immunological activity of ribosome-bound, growing polypeptide chains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 412 416.

60. Hartl F.U. & Hayer-Hartl M. (2002) Molecular chaperones in the cytosol: from nascent chain to folded protein. Science, 295, 1852 1858.

61. Hartl F.U. & Hayer-Hartl M. (2009) Converging concepts of protein folding in vitro and in vivo. Nat. Struct. Mol. Biol., 16, 574 581.

62. Hendrick J.P., Langer Т., Davis T.A., Hartl F.U. & Wiedmann M. (1993) Control of folding and membrane translocation by binding of the chaperone DnaJ to nascent polypeptides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 10216 10220.

63. Herbst R., Schafer U. & Seckler R. (1997) Equilibrium intermediates in the reversible unfolding of firefly (Photinus pyralis) luciferase. J. Biol. Chem., 272, 7099 -7105.

64. Herbst R., Gast K. & Seckler R. (1998) Folding of firefly (Photinus pyralis) luciferase: aggregation and reactivation of unfolding intermediates. Biochemistry,37, 6586-6597.

65. Herendeen S.L., VanBogelen R.A. & Neidhardt F.C. (1979) Levels of major proteins of Escherichia coli during growth at different temperatures. J. Bacteriol., 139, 185 -194.

66. Hesterkamp Т., Hauser S., LUtcke H. & Bukau B. (1996) Escherichia coli trigger factor is a prolyl isomerase that associates with nascent polypeptide chains. Proc. Natl. Acad. Sci USA., 93, 4437 4441.

67. Hesterkamp T. & Bukau B. (1998) Role of the DnaK and HscA homologs of Hsp70 chaperones in protein folding in E.coli. EMBO J., 17, 4818 4828.

68. Horwich A.L., Low K.B., Fenton W.A., Hirshfield I.N. & Furtak K. (1993) Folding in vivo of bacterial cytoplasmic proteins: role of GroEL. Cell, 74, 909 917.

69. Huang G.C., Li Z.Y., Zhou J.M. & Fischer G. (2000) Assisted folding of D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase by trigger factor. Protein Sci., 9, 1254 -1261.

70. Hundley H., Eisenman H., Walter W., Evans Т., Hotokezaka Y., Wiedmann M. & Craig E. (2002) The in vivo function of the ribosome-associated Hsp70, Sszl, does not require its putative peptide-binding domain. Proc. Natl. Acad. Sci USA., 99, 4203 -4208.

71. Bcai A. & Tanford C. (1971) Kinetic evidence for incorrectly folded intermediate states in the refolding of denatured proteins. Nature, 230, 100 102.

72. Ilan J., Pierce D.R., Hochberg A.A., Folman R. & Gyves M.T. (1984) Increased rates of polypeptide chain elongation in placental explants from human diabetics. Proc. Natl. Acad. Sci USA., 81, 1366 1370.

73. Jenni S. & Ban N. (2003) The chemistry of protein synthesis and voyage through the ribosomal tunnel. Curr. Opin. Struct. Biol., 13, 212 219.

74. Kajiyama N. & Nakano E. (1991) Isolation and characterization of mutants of firefly luciferase which produce different colors of light. Protein Eng., 4, 691 693.

75. Kiho Y. & Rich A. (1964) Induced enzyme formed on bacterial polyribosome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 51, 111 118.

76. Kimchi-Sarfaty C., Oh J.M., Kim I.W., Sauna Z.E., Calcagno A.M., Ambudkar S.V. & Gottesman M.M. (2007) A "silent" polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity. Science, 315, 525 528.

77. Koike M., Reed L.J. & Carroll W.R. (1963) a-Keto acid dehydrogenation complexes. Resolution and reconstitution of the Escherichia coli pyruvate dehydrogenation complex. J. Biol. Chem., 238, 30 39.

78. Kolb V.A., Makeyev E.V. & Spirin A.S. (1994) Folding of firefly luciferase during translation in a cell-free system. EMBO J., 13, 3631 3637.

79. Kolb V.A., Makeyev E.V., Kommer A. & Spirin A.S. (1995) Cotranslational folding of proteins. Biochem. Cell Biol., 73, 1217 1220.

80. Kolb V.A., Makeyev E.V. & Spirin A.S. (2000) Co-translational folding of an eukaryotic multidomain protein in a prokaryotic translation system. J. Biol. Chem., 275,16597-16601.

81. Komar A.A., Kommer A., Krasheninnikov I.A. & Spirin A.S. (1993) Cotranslational heme binding to nascent globin chains. FEBS Lett., 326, 261 — 263.

82. Komar A.A., Kommer A., Krasheninnikov I.A. & Spirin A.S. (1997) Cotranslational folding of globin. J. Biol. Chem., 272, 10646 10651.

83. Komar A.A., Lesnik T. & Reiss C. (1999) Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding during in vitro translation. FEBS Lett., 462, 387 -391.

84. Kusukawa N. Yura Т., Ueguchi С., Akiyama Y. & Ito K. (1989) Effects of mutations in heat-shock genes groES and groEL on protein export in Escherichia coli. EMBOJ., 8, 3517 3521.

85. Kudlicki W., Chirgwin J., Kramer G. & Hardesty B. (1995) Folding of an enzyme into an active conformation while bound as peptidyl-tRNA to the ribosome. Biochemistry, 34, 14284 14287.

86. Langer Т., Lu C., Echols H., Flanagan J., Hayer M.K. & Hartl F.U. (1992) Successive action of DnaK, DnaJ and GroEL along the pathway of chaperone-mediated protein folding. Nature, 356, 683 — 689.

87. Levinthal C. (1969) How to Fold Graciously. Mossbauer Spectroscopy in Biological Systems: Proceedings of a meeting held at Allerton House, Monticello, Illinois, Editors: J.T.P. DeBrunner and E. Munck, University of Illinois, 22 — 24.

88. Lill R., Crooke E., Guthrie B. & Wickner W. (1988) The "trigger factor cycle" includes ribosomes, presecretory proteins, and the plasma membrane. Cell, 54, 1013 -1018.

89. Lim V.I. & Spirin A.S. (1986) Stereochemical analysis of ribosomal transpeptidation. Conformation of nascent peptide. J. Mol. Biol., 188, 565 — 574.

90. Luger K., Hommel U., Herald M., Hofsteenge J. & Kirschner K. (1989) Correct folding of circularly permuted variants of a beta alpha barrel enzyme in vivo. Science, 243,206-210.

91. Makeyev E.V., Kolb V.A. & Spirin A.S. (1996) Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide. FEBSLett., 378, 166 170.

92. Malkin L.I. & Rich A. (1967) Partial resistance of nascent polypeptide chains to proteolytic digestion due to ribosomal shielding. J. Mol. Biol., 26, 329 346.

93. Manukhov I.V., Eroshnikov G.E., Vyssokikh M.Y. & Zavilgelsky G.B. (1999) Folding and refolding of thermolabile and thermostable bacterial luciferases: the role of DnaKJ heat-shock proteins. FEBSLett., 448, 265 268.

94. Mendoza J.A., Rogers E., Lorimer G.H. & Horowitz P.M. (1991) Chaperonins facilitate the in vitro folding of monomelic mitochondrial rhodanese. J. Biol. Chem., 266, 13044-13049.

95. Min Jou W., Haegeman G., Ysebaert M. & Fiers W. (1972) Nucleotide sequence of the gene coding for the bacteriophage MS2 coat protein. Nature, 237, 82 88.

96. Minami Y., Hohfeld J., Ohtsuka K. & Hartl F.U. (1996) Regulation of the heat-shock protein 70 reaction cycle by the mammalian DnaJ homolog, Hsp40. J. Biol. Chem., 271,19617-19624.

97. Muto H., Nakatogawa H. & Ito K. (2006) Genetically encoded but nonpolypeptide prolyl-tRNA functions in the A site for SecM-mediated ribosomal stall. Mol. Cell, 22, 545 552.

98. Nicola A.V., Chen W. & Helenius A. (1999) Co-translational folding of an alphavirus capsid protein in the cytosol of living cells. Nat. Cell Biol., 1, 341 345.

99. Nakatsu Т., Ichiyama S., Hiratake J., Saldanha A., Kobashi N., Sakata K. & Kato H. (2006) Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. Nature, 440, 372 376.

100. Nelson R.J., Ziegelhoffer Т., Nicolet C., Werner-Washburne M. & Craig E.A. (1992) The translation machinery and 70 kd heat shock protein cooperate in protein synthesis. Cell, 71, 97 105.

101. Netzer WJ. & Hartl F.U. (1997) Recombination of protein domains facilitated by co-translational folding in eukaryotes. Nature, 388, 343 349.

102. Nimmesgern E. & Hartl F.U. (1993) ATP-dependent protein refolding activity in reticulocyte lysate. Evidence for the participation of different chaperone components. FEBSLett., 331, 25 30.

103. Nissen P., Hansen J., Ban N., Moore P.B. & Steitz T.A. (2000) The structural basis of ribosome activity in peptide bond synthesis. Science, 289, 920 930.

104. Раек К.Н. & Walker G.C. (1987) Escherichia coli dnaK null mutants are inviable at high temperature. J. Bacterid., 169,283 290.

105. Paul S., Punam S. & Chaudhuri Т.К. (2007) Chaperone-assisted refolding of Escherichia coli maltodextrin glucosidase. FEBSJ., 274, 6000 6010.

106. Peters TJr. & Reed R.G. (1980) The biosynthesis of rat serum albumin. Composition and properties of the intracellular precursor, prealbumin. J. Biol. Chem., 255, 3156 3163.

107. Peters TJr. & Davidson L.K. (1982) The biosynthesis of rat serum albumin. J. Biol. Chem., 257, 8847 8853.

108. Phillips D.C. (1967) The hen egg-white lysozyme molecule. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 57, 484-495.

109. Protzel A. & Morris A J. (1974) Gel chromatographic analysis of nascent globin chains. Evidence of nonuniform size distribution. J. Biol. Chem., 249, 4594 4600.

110. Purvis I.J., Bettany A.J., Santiago T.C., Coggins J.R., Duncan K., Eason R. & Brown A.J. (1987) The efficiency of folding of some proteins is increased by controlled rates of translation in vivo. A hypothesis. J. Mol. Biol., 193, 413 417.

111. Rakwalska M. & Rospert S. (2004) The ribosome-bound chaperones RAC and Ssbl/2p are required for accurate translation in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol., 24,9186-9197.

112. Rospert S., Dubaquie Y. & Gautschi M. (2002) Nascent-polypeptide-associated complex. Cell. Mol. Life Sci., 59, 1632 1639.

113. Saito H. & Uchida H. (1977) Initiation of the DNA replication of bacteriophage lambda in Escherichia coli K12. J. Mol. Biol., 113, 1 — 25.

114. Sala-Newby G., Kalsneker N. & Campbell A.K. (1990) Removal of twelve C-terminal amino acids from firefly luciferase abolishes activity. Biochem. Biophys. Res. Commun., 172, 477 482.

115. Sala-Newby G.B. & Campbell A.K. (1994) Stepwise removal of the C-terminal 12 amino acids of firefly luciferase results in graded loss of activity. Biochim. Biophys. Acta, 1206,155 160.

116. Sanchez I.E., Morillas M., Zobeley E., Kiefhaber T. & Glockshuber R. (2004) Fast folding of the two-domain semliki forest virus capsid protein explains co-translational proteolytic activity. J. Mol. Biol., 338, 159 — 167.

117. Schaffitzel C. & Ban N. (2007) Generation of ribosome nascent chain complexes for structural and functional studies. J. Struct. Biol., 158, 463 471.

118. Schagger H. & von Jagow G. (1987) Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem., 166, 368 — 379.

119. Shimizu Y., Inoue A., Tomari Y., Suzuki Т., Yokogawa Т., Nishikawa K. & Ueda T. (2001) Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat. Biotechnol., 19, 751 755.

120. Scholz C., Stoller G., Zarnt Т., Fischer G. & Schmid F.X. (1997) Cooperation of enzymatic and chaperone functions of trigger factor in the catalysis of protein folding. EMBO J., 16, 54 58.

121. Schroder H., Langer Т., Hartl F.U. & Bukau B. (1993) DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage. EMBO J., 12,4137 4144.

122. Seliger H.H. & McElroy W.D. (1960) Spectral emission and quantum yield of firefly bioluminescence. Arch. Biochem. Biophys., 88, 136 141.

123. Seliger H.H. & McElroy W.D. (1964) The colors of firefly bioluminescence: enzyme configuration and species specificity. Proc. Natl Acad. Sci USA., 52, 75 -81.

124. Sikorski A. & Skolnick J. (1990) Dynamic Monte Carlo simulations of globular protein folding. Model studies of in vivo assembly of four helix bundles and four member beta-barrels. J. Mol. Biol., 215, 183-198.

125. Smith W.P., Tai P.C. & Davis B.D. (1978) Interaction of secreted nascent chains with surrounding membrane in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 5922 5925.

126. Steitz T.A. (2005) On the structural basis of peptide-bond formation and antibiotic resistance from atomic structures of the large ribosomal subunit. FEBS Lett., 579, 955-958.

127. Stempfer G., Holl-Neugebauer B. & Rudolph R. (1996) Improved refolding of an immobilized fusion protein. Nat. Biotechnol., 14, 329 — 334.

128. Szabo A., Langer Т., Schroder H., Flanagan J., Bukau B. & Hartl F.U. (1994) The ATP hydrolysis-dependent reaction cycle of the Escherichia coli Hsp70 system DnaK, DnaJ, and GrpE. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 10345 10349.

129. Tabor S. & Richardson C.C. (1985) A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 1074-1078.

130. Tanford C., Aune K.C. & Ikai A. (1973) Kinetics of unfolding and refolding of proteins. Results for lysozyme. J. Mol. Biol., 73, 185 197.

131. Teale J.M. & Benjamin D.C. (1977) Antibody as immunological probe for studying refolding of bovine serum albumin. Refolding within each domain. J. Biol. Chem., 252, 4521-4526.

132. Teter S.A., Houry W.A., Ang D., Tradler Т., Rockabrand D., Fischer G., Blum P., Georgopoulos C. & Hartl FU. (1999) Polypeptide flux through bacterial Hsp70: DnaK cooperates with trigger factor in chaperoning nascent chains. Cell, 97, 755 — 765.

133. Tilly K, McKittrick N., Zylicz M. & Georgopoulos C. (1983) The dnaK protein modulates the heat-shock response of Escherichia coli. Cell, 34, 641 646.

134. Valent Q.A., Kendall D.A., High S., Kusters R., Oudega B. & Luirink J. (1995) Early events in preprotein recognition in E. coli: interaction of SRP and trigger factor with nascent polypeptides. EMBO J., 14, 5494 5505.

135. Varenne S., Knibiehler M., Cavard D., Morion J. & Lazdunski C. (1982) Variable rate of polypeptide chain elongation for colicins A, E2 and E3. J. Mol. Biol., 159, 57 70.

136. Varenne S., Buc J., Lloubes R. & Lazdunski C. (1984) Translation is a non-uniform process. Effect of tRNA availability on the rate of elongation of nascent polypeptide chains. J. Mol. Biol., 180, 549 576.

137. Veis A., Leibovich S.J., Evans J. & Kirk T.Z. (1985) Supramolecular assemblies of mRNA direct the coordinated synthesis of type I procollagen chains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 3693 3697.

138. Veis A. & Kirk T.Z. (1989) The coordinate synthesis and cotranslational assembly of type I procollagen. J. Biol. Chem., 264, 3884 3889.

139. Voss N.R., Gerstein M., Steitz T.A. & Moore P.B. (2006) The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel. J. Mol. Biol., 360, 893 906.

140. White E.H., McCapra F., Field G.F. & McElroy W.D. (1961) The structure and synthesis of firefly luciferin. J. Am. Chem. Soc., 83, 2402 2403.

141. White P.J., Squirrell D.J., Arnaud P., Lowe C.R. & Murray J.A. (1996) Improved thermostability of the North American firefly luciferase: saturation mutagenesis at position 354. Biochem. J., 319, 343 — 350.

142. Wright P.E., Dyson H.J. & Lerner R.A. (1988) Conformation of peptide fragments of proteins in aqueous solution: implications for initiation of protein folding. Biochemistry, 27, 7167 7175.

143. Woolhead C.A., McCormick PJ. & Johnson A.E. (2004) Nascent membrane and secretory proteins differ in FRET-detected folding far inside the ribosome and in their exposure to ribosomal proteins. Cell, 116, 725 736.

144. Xu Z., Horwich A.L. & Sigler P.B. (1997) The crystal structure of the asymmetric GroEL-GroES-(ADP)7 chaperonin complex. Nature, 388, 741 750.

145. Yan W., Schilke В., Pfund C., Walter W., Kim S. & Craig E.A. (1998) Zuotin, a ribosome-associated DnaJ molecular chaperone. EMBOJ., 17,4809 4817.

146. Yang Y.R. & Schachman H.K. (1993) Aspartate transcarbamoylase containing circularly permuted catalytic polypeptide chains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 11980-11984.

147. Yonath A. (2005) Ribosomal crystallography: peptide bond formation, chaperone assistance and antibiotics activity. Mol. Cells, 20, 1-16.

148. Zako Т., Deguchi H., Kitayama A., Ueda H. & Nagamune T. (2000) Refolding of firefly luciferase immobilized on agarose beads. J. Biochem., 127, 351 354.

149. Zhang Т., Bertelsen E., Benvegnu D. & Alber T. (1993) Circular permutation of T4 lysozyme. Biochemistry, 32, 12311 — 12318.

150. Zhang G., Hubalewska M. & Ignatova Z. (2009) Transient ribosomal attenuation coordinates protein synthesis and co-translational folding. Nat. Struct. Mol. Biol., 16,274-280.

151. Zipser D. & Perrin D. (1963) Complementation on ribosomes. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 28, 533 — 537.

152. Zubay G. (1973) In vitro synthesis of protein in microbial systems. Annu. Rev. Genet., 1, 267-287.

153. Zweig M. & Cummings DJ. (1973) Cleavage of head and tail proteins during bacteriophage T5 assembly: selective host involvement in the cleavage of a tail protein. J. Mol. Biol., 80, 505-518.

154. Крашенинников И.А., Комар А.А. и Аджубей И.А. (1988) Роль кластеров редких кодонов в определении границ участков полипептидной цепи с однотипной вторичной структурой в процессе ко-трансляционного сворачивания белка. ДАН СССР, 303, 995 999.

155. Крашенинников И.А., Комар А.А. и Аджубей И.А. (1989) Роль вырожденности кода в определении аути котрансляционного сворачивания белка. Биохимия, 54, 187-200.

156. Спирин А.С. (1984) Котрансляционное сворачивание, компартментализация и модификация белка. Молекуляр. Биология, 18, 1445 — 1460.

Информация о работе

Светлов, Максим Сергеевич
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Факторы, влияющие на скорость и эффективность котрансляционного сворачивания белка - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы