Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Факторы культивирования in vitro и их влияние на рост и развитие растений земляники in vitro и in vivo

ВАК РФ 06.01.01, Общее земледелие

Автореферат диссертации по теме "Факторы культивирования in vitro и их влияние на рост и развитие растений земляники in vitro и in vivo"

На правах рукописи

Баулина Любовь Владимировна

ФАКТОРЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ IN VITRO И ИХ ВЛИЯНИЕ НА РОСТ И РАЗВИТИЕ РАСТЕНИЙ ЗЕМЛЯНИКИ IN VITRO И IN VIVO

Специальность 06.01.01 - общее земледелие АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных

наук

1 5 MA?

Москва-2012 г.

005011792

005011792

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства Российской академии сельскохозяйственных наук, г. Москва.

Научный руководитель:

доктор сельскохозяйственных наук, профессор Высоцкий Валерий Александрович

Официальные оппоненты:

доктор сельскохозяйственных наук, доцент кафедры плодоовощеводства Санкт-Петербургского

государственного аграрного университета Атрощснко Геннадий Парфёнович

кандидат сельскохозяйственных наук, доцент кафедры генетики, растениеводства и защиты растений Российского университета дружбы народов

Корпацкий Сергей Аркадьевич

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и селекции плодовых растений им. И.В. Мичурина

Защита состоится: " оъ » Скал <У 2012 г. в ' 0 час. io мин. на заседании диссертационного совета Д 220.043.01 при Российском государственном аграрном университете — МСХА имени К.А. Тимирязева.

Адрес: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49. Учёный совет РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (тел/факс 976-24-92; e-mail: kalinagitimacad.ru).

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.

Автореферат разослан, размещён на сайте университета www.timacad.ru и направлен на сайт Министерства образования и науки РФ по адресу référât vak@mon.gov.tu « ( » ajftftwi*/ 20 ItLs.

Отзывы на автореферат в 2-х экземплярах, заверенные и скрепленные гербовой печатью, просим направлять учёному секретарю диссертационного совета.

Учёный секретарь Диссертационного совета ЕЛ. Маланкина

доктор сельскохозяйственных наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Земляника садовая является наиболее рентабельной ягодной культурой, однако в настоящее время остро стоит вопрос закладки промышленных насаждений сертифицированным высокопродуктивным материалом в достаточном количестве. Как известно, важная роль в оздоровлении и тиражировании растительного материала в промышленных масштабах принадлежит биотехпологнческим методам, благодаря которым поддерживается современный сортимент земляники садовой.

Анализ литературных данных свидетельствует о том, что среди факторов культивирования наибольшее значение имеют: спектральный состава света, состав питательной среды (тип и концентрация углеводов, регуляторов роста и элиситоров), температура, которые оказывают влияние на рост и развитие растений в условиях in vitro и в период адаптации к нестерильным условиям.

Вместе с тем последействие этих факторов на поведение растений в полевых условиях изучено недостаточно, имеющиеся в литературе единичные сведения по этому вопросу не раскрывают взаимосвязи между факторами культивирования in vitro и дальнейшей продуктивностью растений в условиях in vivo.

Все вышесказанное обуславливает необходимость изучения влияния света различного спектрального состава, углеводов и элиситоров, применяемых in vitro, на рост и развитие растений земляники in vitro и их генеративную и вегетативную продуктивность в полевых условиях.

Перспективным направлением в области биотехнологии является создание «искусственных семян» и разработка оптимального состава оболочки, которая обеспечивала бы длительное хранение инкапсулированных эксплан-тов земляники в жизнеспособном состоянии.

Цель и задачи исследований. Цель исследований - изучение влияния различных факторов культивирования in vitro (спектрального состава света, элиситоров, различных концентраций сахарозы в питательной среде) на веге-

тативную и генеративную продуктивность растений земляники в полевых условиях; а также изучение возможности создания, хранения и высадки в нестерильные условия «искусственных семян» земляники.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1) выявить влияние спектрального состава света и элиситоров (эмистима, арахидоновой кислоты и Экоста 1/3) на жизнеспособность растений земляники на этапах пролиферации, укоренения и адаптации к нестерильным условиям;

2) изучить последействие спектрального состава света, элиситоров (эмистима, арахидоновой кислоты и Экоста 1/3) и сахарозы на вегетативную и генеративную продуктивность растений земляники в полевых условиях;

3) установить оптимальные параметры изучаемых факторов культивирования (спектрального состава света, элиситоров и концентрации сахарозы) для адаптации к нестерильным условиям и последующего роста и развития растений земляники в полевых условиях;

4) разработать методику инкапсулирования развившихся in vitro почек земляники, микропобегов и их фрагментов для создания «искусственных семян» и оценки их жизнеспособности.

Научная новизна результатов исследований. Впервые показано, что различные факторы культивирования in vitro (сахароза, спектральный состав света и элиситоры) оказывают существенное влияние на вегетативную и генеративную продуктивность растений земляники в полевых условиях.

Определены оптимальные параметры культивирования in vitro для ускорения выхода полноценных растений земляники различных сортов.

Впервые показана возможность инкапсулирования почек и микропобегов земляники в «искусственную оболочку», хранения полученных «искусственных семян» в условиях пониженных температур в течение месяца и высадки в нестерильные условия.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) влияние факторов культивирования in vilro (спектрального состава света, элиситоров, сахарозы) на жизнеспособность растений земляники in vitro и их продуктивность в полевых условиях;

2) влияние взаимодействия факторов культивирования in vitro на продуктивность растений земляники в полевых условиях;

3) экономическая оценка эффективности применения экспериментальных источников освещения эксплантов земляники in vitro на показатели вегетативной продуктивности растений в полевых условиях;

4) возможность создания «искусственных семян» земляники.

Практическая значимость результатов исследований. Освещение

эксплантов земляники на этапах культивирования in vitro лампами с преобладанием излучения в красной и синей областях спектра позволяет управлять процессами роста и развития, сократить продолжительность этапа ризогенеза и увеличить выход растений.

Использование элиситоров эмистима, арахидоновой кислоты и Экоста 1/3 повышает процент укоренения растений и сокращает длительность этапа ризогенеза.

Обогащение питательной среды повышенной концентрацией сахарозы (6%) способствует увеличению вегетативной продуктивности растений земляники в полевых условиях.

Разработанная модель создания «искусственных семян» земляники может являться основой для дальнейших исследований в данной области с целью увеличения периода хранения инкапсулированных почек и миропобе-гов и усовершенствования состава оболочки для непосредственного высева в полевых условиях.

Апробация работы. Основные положения работы были доложены на X и XI Молодежных конференциях «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (г. Москва, 7 апреля 2010 г. и 6 апреля 2011 г.), Ill Научно-практической конференции «Перспективы развития инноваций в биологии» (МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 11-13 но-

ября 2009 г.); представлены на IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (г. Звенигород, 8-12 сентября 2008 г.); II Всероссийской научно-практической конференции «Биология как инструмент биоразнообразия растительного мира» (г. Волгоград, 19-21 августа 2008 г.); на научно-практической конференции «Интенсификация и оптимизация продукционного процесса сельскохозяйственных растений» (г. Орел, 68 октября 2009 г.), научно-практической конференции «Актуальные проблемы размножения садовых культур и пути их решения» (ГНУ ВНИИС им. И.В. Мичурина, Мичуринск-Наукоград, 2010 г.), XIX Международном симпозиуме «Нетрадиционное растениеводство. Селекция и генетика. Эниоло-гия. Экология и здоровье» (г. Алушта, 12-19 сентября 2010 г.), Международном конгрессе «Биотехнология — состояние и перспективы развития» (г. Москва, 21-25 марта 2011 г.); на Международной научно-практической конференции «Использование биотехнологических методов и регуляторов роста в садоводстве» (г. Москва, 22-23 июня 2011 г.); на Международной научной конференции «Инновации в биологии для развития биоиндустрии сельскохозяйственной продукции» (г. Нижний Новгород, 4-10 июля 2011г., ННГУ им. Н.И. Лобачевского,); на VII Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (г. Минск, 26-28 октября 2011 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ, из них 6 - в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем я содержание работы: Диссертация изложена на 148 страницах и состоит из введения, обзора литературы по изучаемому вопросу, выводов и рекомендаций по практическому использованию, списка литературы из 231 наименования, в том числе 133 - зарубежных авторов, содержит 19 таблиц, 26 рисунков и 13 приложений.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы проведения исследований. Объектом исследования являлась земляника садовая (Fragaria х ananassa Duch.) сортов Аму-

лег, Дивная, Дочь Пурпуровой, Покахонтас, Профьюжен, Пурпуровая, Ред-гонтлет и Роксана. Лабораторные исследования проводили в 2007-2010 гг. на базе отдела биотехнологии ГНУ ВС'ГИСП Россельхозакадемии, полевые исследования - на лабораторном участке и на демонстрационном участке с использованием технологии капельного орошения на черной пленке. Изучаемые факторы - спектральный состав света, элиситоры (эмистим, арахидоно-вая кислота, Экост 1/3), сахароза, состав «искусственной» оболочки капсулы.

Последействие различных концентраций сахарозы на вегетативную и генеративную продуктивность растений земляники сортов Пурпуровая, Дочь Пурпуровой и Профыожен изучали в 2007-2009 гг. На последних этапах культивирования in vitro сахарозу в опытном варианте добавляли в питательную среду Мурасиге-Скуга в концентрации 6%, в контрольном - 3%. Растения земляники адаптировали к нестерильным условиям теплицы, а затем высадили в поле. В течение вегетации учитывали следующие показатели продуктивности растений: генеративная продуктивность:

1) число цветоносов,

2) высота цветоносов, см,

3) общее число генеративных образований,

4) среднее число генеративных образований на цветонос, вегетативная продуктивность:

1) число листьев,

2) число усов,

3) число розеток.

В качестве экспериментальных источников освещения в культуре тканей использовали люминесцентные лампы: ЛБ-65, излучающие белый свет; ЛБ-65-4 - люминесцентная лампа с усилением излучения в красной области спектра (87,5%, длина волны 611 нм; 12,5% - в области синего участка спектра, длина волны 420 нм); ЛЬ-65-5 - люминесцентная лампа с усилением излучения в синей области спектра - 75% (25 % - в области красного участка

спектра). Влияние света различного спектрального состава изучали на всех этапах культивирования in vitro (пролиферации, укоренения, адаптации к нестерильным условиям) и в полевых условиях, элиситоров - на этапах укоренения, адаптации и в поле. Использовали питательную среду Мурасиге-Скуга, обогащенную на этапе пролиферации 6-бензиламинопурином (БАП 0,5 мг/л) и р-индолилмасляной кислотой (ИМК 0,05 мг/л), на этапе укоренения - (3-индолилуксусной кислотой (ИУК 0,1 мг/л). На этапе укоренения в питательную среду добавляли эмисгим и арахидоновую кислоту в концентрации 10"7М, порошком препарата Экост 1/3 опудривали базальную часть экспланта. Экспланты земляники сортов Амулет, Профыожен и Пурпуровая, на которых испытывали действие элиситоров, освещали лампами белого света. С периодичностью 10 дней учитывали следующие биометрические параметры эксплантов земляники:

1) высота экспланта, мм;

2) число листьев;

3) число корней;

4) длина корней, мм;

5) процент укоренения.

Влияние взаимодействия спектрального состава света и препарата Экост 1/3 изучали на примере земляники сорта Редгонтлет. На этапе адаптации корни растений опудривали порошком препарата Экост 1/3, учитывали приживаемость расгений в следующих вариантах:

1) белый свет (контроль);

2) белый свет + обработка препаратом Экост 1/3;

3) красный свет;

4) красный свет + обработка препаратом Экост 1/3;

5) синий свет;

6) синий свет + обработка препаратом Экост 1/3.

Через 2 месяца после адаптации к нестерильным условиям теплицы растения земляники сортов Амулет, Профьюжен, Пурпуровая и Редгонтлет

высадили на демонстрационном участке ГНУ ВСТИСП с использованием технологии капельного орошения на черной пленке но схеме 20...25х40 см. Учитывали вегетативную и генеративную продуктивность растений. Полученные результаты обрабатывали методом дисперсионного анализа с использованием пакета программ Microsoft Office Excel 2007 и алгоритма дисперсионного анализа однофакторных комплексов для качественных признаков по методике Н.А. Плохинского (НА. Плохинский, 1970). Существенность различий оценивали по величине наименьшей существенной разности (НСР), также рассчитывали ошибку среднего значения.

При разработке методики создания «искусственных семян» земляники использовали два раствора для инкапсуляции: первый содержал 0,1М 20%-ного хлорида кальция, растворенного в бидистиллированной воде; в состав второго раствора входили соли по Мурасиге-Скугу (T. Murashige, P. Skoog, 1962), БАП в концентрации 0,25 мг/л, ИМК - 0,0025 мг/л, альгинат натрия -30 г/л. Для проращивания «искусственных семян» использовали питательную среду Мурасиге-Скуга, обогащенную 1 мг/л БАП, 0,01 мг/л ИМК, без сахарозы. Оценивали процент прорастания «искусственных семян» на питательной среде и непосредственно в почве.

Результаты исследований.

1. Влияние сахарозы на вегетативную и генеративную продуктивность растений земляники в полевых условиях. Как показали наши исследования, влияние сахарозы на вегетативную и генеративную продуктивность растений земляники наиболее отчетливо проявилось в первый год вегетации в поле (табл. 1), во второй год многие различия между опытным и контрольным вариантами нивелировались.

Таблица I. - Влияние сахарозы на вегетативную и генеративную продуктивность растений земляники в первый год вегетации в поле.

Сорт/вариант Пурпуровая Про< мьюжен Дочь Пу рпуровой

Опит Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль

Среднее число цветоносов 2,4±0,3* 2,6±0Д 2,6±0,2 3,2±0,3 3,4±0,3 4,6±0,4

Средняя высота цветоносов, см 14,3±1,3 16,4±0,5 6,5±0,3 5,9±0,4 9,2±1,2 8,9±0,5

Среднее количество генеративных образований на цветонос 10,3±1,0 9,9±0,8 6,3±0,2 6,3*0,3 8,7*0,6 8,2*0,3

Общее число генеративных образований 26,£¿3,8 25,2±2,2 15,4±1,2 19,5±1,3 31,8*2,7 37,7±2,9

Число листьев 27,5±1,4 25,7±0,8 24,0*1,0 24,9*0,8 22,7±1,5 25,9±2Д

Число усов 56,9±2,3 50,2±1,9 36,7±1,2 33,9±1,0 46,1 ±2,2 46,2*3,4

Число розеток 50,5±3,8 29,9*2,9 48,0*2,1 45,8*2,7 54,3±4,3 42,6*3,8

- в таблице представлены средние значения ± ошибка средней.

Их данных таблицы 1 видно, что цветоносы у растений земляники сорта Пурпуровая в опытном варианте были существенно ниже, чем в контроле, а число усов и розеток у опытных растений существенно превосходило контрольные показатели. Опытные растения земляники сортов Профьюжен и Дочь Пурпуровой существенно уступали контрольным по числу цветоносов и общему числу генеративных образований. Число усов у опытных растений земляники сорта Профьюжен было существенно больше, чем у контрольных. Растения земляники сорта Дочь Пурпуровой в опытном варианте образовывали больше розеток, чем в контрольном.

Во 2-й год у опытных растений сорта Профьюжен цветоносы были существенно выше, а число розеток - больше, чем у контрольных. Опытные растения земляники сорта Дочь Пурпуровой имели в 2,7 раза больше усов по сравнению с контролем.

Таким образом, на основании проведенных исследований можно сделать вывод, что повышение концентрации сахарозы в питательной среде на последних этапах культивирования in vitro способствовало увеличению вегетативной продуктивности растений земляники, этот эффект особенно отчетливо проявляется в первый год вегетации в поле.

2. Влияние света различного спектрального состава на развитие экс-плантов земляники на этапе пролиферации in vitro.

Изучали влияние света различного спектрального состава на развитие эксплантов земляники сортов Амулет, Профьюжен, Пурпуровая и Редгонт-лет. При этом была выявлена сортоспецифическая реакция на освещение лампами с усилением излучения в области определенного участка спектра.

Так, освещение эксплантов земляники сорта Амулет синим светом сдерживало их рост, аналогичный эффект оказывало освещение эксплантов земляники сорта Редгонтлет красным светом (табл. 2). Увеличение доли синего света стимулировало рост эксплантов земляники сорта Профыожен. Установлено, что преобладание красного участка спектра при освещении эксплантов земляники сортов Амулет и Профьюжен способствовало существенному увеличению у них числа листьев.

Таблица 2. - Влияние спектрального состава света на развитие эксплан-

тов земляники на этапе пролиферации in vitro.

Срок Варишгты

Сорт культивирования, дней Показатели Белый свет Красный свет Синий свет Существенность различий

10 Высота эксгоюн-та, мм 18,9 18,2 16,6 F факт^ F 05

Число листьев 2,2 4,0 2,2 НСР 01=1,0

s; ч >> 20 Высота эксплан-та, мм 30,3 32,9 23,7 НСР01(БСиСС)=5,9 НСР oi(KC и СС)=6,4

Число листьев 5,8 7,3 5,5 НСР oi=l,3

30 Высота эксплан-та, мм 46,9 50,7 38,3 НСР oi(EC и СС)=7,7 НСР о [ (КС и СС)=8,3

Число лисгьев 9,8 11,9 11,0 НСР 01 (БС и КС)=1,6

10 Высота эксплан-та, мм 23,2 16,7 23,4 НСР 01 =4,9

S3 1" о Число листьев 3,2 3,0 3,8 F фает.< F 05

20 Высота эксплан-та,мм 23,9 17,2 23,4 НСР 01=5,2

Число листьев 4,3 3,6 4,4 F факт.< F 05

Рч 30 Высота эксплан-та, мм 24,1 17,8 23,6 НСР 01=5,0

Число листьев 5,1 4,5 5,4 F Факт^ F 05

10 Высота эксплан-та, мм 15,3 17,2 18,9 НСР 01=3,1

Я Число лисгьев 1,5 3,3 2,1 НСР oi=0,9

а' 2 .я •е- а с 20 Высота эксплан-та, мм 23,8 24,7 25,6 F фил-"- F OJ

Число лисгьев 4Д 5,8 4,2 НСР 01=1Д

30 Высота эксплан-та, мм 36,9 39,8 34,3 F факт.< F 05

Число листьев 8,3 10,1 8,9 F фист^ F 05

3. Влияние света различного спектрального состава на развитие эксплантов земляннки на этапе укоренения in vitro.

Положительный эффект облучения эксплантов красным и синим светом на этапе укоренения in vitro был отмечен уже спустя 10 дней культивирования (табл. 3). У эксплантов земляники всех изучаемых сортов наблюдали существенное увеличение процента укоренения по сравнению с контрольным вариантом.

Таблица 3. - Влияние спектрального состава света на процент укорене-

ния микропобегов земляники на этапе ризогенеза in vitro.

Сорт Срок культивирования, дней Варианты Существенность различий

Белый свет Красный свет Синий свет

Амулет 10 30,0 50,0 73,3 FiaKi > F 05

20 66,7 63,3 83,3

30 100 76,7 93,3 Fikitr.< F 05

Профьюжен 10 20,0 90,0 90,0 F(J>aKT- > Fooi

20 100 93,3 93,3 Рфакг^ F 05

30 100 96,7 96,7 F(JMM.< F 05

Редгмгглет 10 82,8 96,7 100 FrlaK-r-5' F 05

20 100 100 96,6 Fi,ki<Fo5

Пурпуровая 10 80,0 100 90,0 F4aKi-<F 05

20 100 100 933 F,|hikt.< F 05

30 100 100 93,3 FIIIMCT-^ F 05

На основании данных таблицы 3 можно сделать вывод о том, что облучение эксплантов земляники сортов Амулет синим светом существенно повлияло на увеличение процента укоренения по сравнению с остальными вариантами уже через 10 дней культивирования (73,3%). При облучении эксплантов сорта Профьюжен красным и синим светом через 10 дней укоренилось 90% растений, а в контрольном варианте - только 20%. Существенно повысился процент укоренения после облучения эксплантов сорта Редгонт-лет красным (96,7%) и синим светом (100%) по сравнению с контрольным вариантом (82,8%). Выявленная тенденция говорит о существенном ускорении процесса корнеобразования в опытных вариантах и имеет важное практическое значение: освещение лампами с преобладанием излучения в красной и синей областях спектра позволяет ускорить момент массового укоренения микропобегов и, следовательно, сократить этап ризогенеза.

Результаты наблюдений за процессом укоренения позволили отметить, что освещение эксплантов земляники сортов Пурпуровая и Профьюжен красным и синим светом стимулировало рост корней и их количество (табл. 4). Таблица 4. - Влияние спектрального состава света на корнеобразоваиие у

микропобегов земляники на этапе ризогенеза in vitro.

Срок Варишпы

Сорт культивирования, дней Показатели Белый свет Красный свет Синий свет Существенность различий

5 д 10 Число корней 2,5 3,7 3,4 рфакг^ F 05

Длина корней, мм 5,6 13,1 13,7 НСР 01=4,3

о о. 20 Число корней 3,4 5,4 4,9 НСР oi=l,4

& Длина корней, мм 21,8 19,4 19,2 Filuucr^Foj

С 30 Число корней 4,7 6,9 6,0 НСР 05=1,5

Длина корней, мм 27,0 23,2 24,0 Fitact^ F о?

S 10 Число корней 1,5 4,9 5,9 НСР 05=3,2

2 20 Число корней 5,8 7,0 8,6 НСР oi=2,4

А Длина корней, мм 14,5 20Д 20,9 НСР ш=5,1

О О. 30 Число корней 7,1 8,5 9,6 FtaKT.<Fo5

С Длина корней, мм 22Д 27,1 28,2 Рфакт-*- F 05

4. Влияние элиситоров на развитое эксплантов земляники на этапе укоренения in vitro.

На этапе укоренения было установлено положительное влияние арахи-доновой кислоты на рост и развитие эксплантов земляники сорта Пурпуровая, а также рост корней в длину и их количество у сортов Пурпуровая и Профьюжен (табл. 5). Добавление арахидоновой кислоты в питательную среду для укоренения способствовало существенному ускорению роста и увеличению числа листьев у микропобегов земляники сорта Пурпуровая по сравнению с другими вариантами.

На основании полученных данных мы сделали вывод, что применение арахидоновой кислоты способствует процессу корнеобразования у испытанных сортов земляники.

Обработка растений земляники сорта Редгонтлет в варианте с белым светом порошком препарата Экост 1/3 на этапе адаптации к нестерильным условиям существенно повысила их приживаемость (до 100%) по сравнению

с контролем (78,6%). Освещение эксплантов красным и синим светом на этапах культивирования in vitro существенно повысило приживаемость адаптированных микрорастений (92,9% - в опытных вариантах, 78,6% - в контроле) (рис. 1).

Таблица 5. - Влияние элиситоров на корнеобразование у микропобегов

земляники на этапе укоренения in vitro.

Срок культивирования, дней Показатели Контроль Эмистим Арахидоновая кислота Экост Существенность различий

Пурпуровая

10 Число корней 2,5 2,4 2Д — Fdaicr^ F 05

Длина корней, мм 5,6 5,3 13,4 — НСР (»(контроль и АК*)=5,7 НСР оз(эмист. и АК)=5,9

20 Число корней 3,4 4,6 5,3 — НСР (s =1,4

Длина корней, мм 21,8 22,7 42,9 — НСР 05 =Ю,7

30 Число корней 4,7 5,8 6,4 _ Fèam-^FoS

Длина корней, мм 27,0 31,3 50,9 — НСР 05 =ю,9

Про( >ьюжен

10 Число корней 1,5 1,5 2,0 1,7 Filaicr< F 05

Длина корней, мм 5,0 3,5 9,3 6,6 НСР о;-(к01ггроль и АК; эмист. и АК)=3,3 НСР 05(эмисг. и экост)=2,9

20 Число корней 5,8 5,3 7,3 5,6 FéiiKT^ F 05

Длина корней, мм 14,5 20,8 27,9 18,8 НСР os (контроль и АК)=8,9

30 Число корней 7,1 6,6 8,0 7,8 F,baKT.< F 05

Длина корней, мм 22,2 26,7 43,9 21,6 НСР оКконгроль и АК; эмист. и АК)=14,2 НСР oi(AK и экост)=14,5

- сокращения: АК - арахидоновая кислота, эмист. - эмистим.

Белый Белый Красный Красный Синий Синий свет свег+экост свет свет+эхост свет светЯ-экост (контроль)

Рисунок 1. - Влияние спектрального состава света и Экоста 1/3 на приживаемость растений земляники сорта Редгонтлет на этапе адаптации.

5. Влияние спектрального состава света и элиситоров на генеративную и вегетативную продуктивность растений земляники в поле.

Результаты наблюдений за генеративной продуктивностью растений земляники в течение первого года вегетации в поле показали, что у растений сорта Профьюжен последействие освещения красным светом на этапах культивирования in vitro проявилось в увеличении общего числа генеративных образований и среднего числа генеративных образований на цветонос. У растений земляники copra Амулет после освещения красным светом существенно увеличилось общее число генеративных образований по сравнению с контролем.

Наблюдения за растениями земляники сорта Редгонтлет показали, что обработка препаратом Экост 1/3 растений в варианте с белым светом способствовала повышению генеративной продуктивности (табл. 6). Последействие освещения растений красным и синим светом без применения эяиситора проявилось в увеличении генеративной продуктивно era. Совместное воздействие светом с преобладанием красного или синего участков спектра и обработки адаптированных микрорастений препаратом Экост 1/3 сдерживало появление генеративных образований у растений в первый год вегетации в по-

Таблица 6. - Влияние спектрального состава света и Экоста 1/3 на генера-

тивную продуктивность растений земляники сорта Редгонтлет.

Показатели Фактор А-свет Фактор Б - элисигор Существенность различий

Без экоста С экостом

Среднее число цветоносов Белый свет 2,0 3,3 НСРо,АБ=1,0

Красный свет 3,0 2,0

Синий свет 32 2,0

Высота цветоносов, см Белый свет 11,6 16,4 НСР05АБ=2,8

Красный свет 16,1 13,7

Синий свет 15,1 14,9

Общее число генеративных образований Белый свет 13,3 25,9 НСРо1АБ=И,6

Красный свет 21,5 13,8

Синий свет 24,2 14,7

Среднее число генеративных образований на цветонос Белый свет 5,8 8,0 На>о5Бс=1,9; для других вариантов-Fjokt^ Fos

Красный свет 7Д 6,3

Синий свет 7,6 7,5

Результаты учетов вегетативной продуктивности растений земляники

сорта Профьюжен показали, что освещение красным и синим светом на этапах культивирования in vitro способствовало в дальнейшем существенному увеличению числа листьев у растений в поле по сравнению с контролем (рис. 2).

Наиболее значимый показатель вегетативной продуктивности для закладки маточника земляники - это число розеток. Проведенные нами исследования позволили выявить тенденцию к увеличению числа розеток у растений земляники сортов Профьюжен, Амулет и Пурпуровая, высаженных в поле после применения в культуре тканей препаратов эмистим и арахидоновая кислота (табл. 7).

Таблица 7. - Влияние элиситоров на число розеток у растений земляники

в полевых условиях.

Сорт Контроль Эмистим Арахидоновая кислота Экосг 1/3 Существенность различий

Профьюжен 33,4 38,4 38,8 29,6 F,JKICT.< FO5

Амулет 32,4 46,9 49,3 23,8 HCPO5=17,4

Пурпуровая 20,3 28,9 32,3 — НСРо5=11,6

60 50 я 40 и Й о » 30 о е. К 00 10 0 ___-■-л__т

1-й учет через 2 недели через 6 недель

-♦-Белынсвет 31,7 37,2 47,9

-•-Красный свет 44 51,6 52

-*-Сишшсвет 41,9 47,4 53,3

Пер поднчно сть учетов

Рисунок 2. - Влияние света различного спектрального состава на увеличение числа листьев у растений земляники сорта Профьюжен в течение вегетации. Значения НСР для каждого учета: 1-й учет: НСР05=8,4; 2-й учет: НСР05=9,2; 3-й учет: Рфа„.< Р05.

Совместное воздействие света различного спектрального состава и препарата Экост 1/3 на образование розеток растениями земляники сорта Редгонтлет в поле проявилось следующим образом.

Таблица 8. - Влияние спектрального состава света и Экоста 1/3 на число

розеток у растений земляники сорта Редгонтлет в полевых условиях.

Фактор А-свет Фактор Б - элисигор Существенность различий

Без Экоста 1/3 С Экосгом 1/3

Белый свет 15,5 43,9 НСР<иаб=17,7

Красный свет 26,8 22,1

Синий свет 32,5 30,6

После обработки растений с белого света Экостом 1/3 число образуемых розеток возросло в 2,8 раза по сравнению с контролем (табл. 8). Применение элиситора на растениях, освещенных красным и синим светом, суще-

ственно не повлияло на число розеток. В вариантах, где препарат Экост 1/3 не использовали, была отмечена тенденция к увеличению числа розеток у растений, освещенных красным и синим светом. У растений в варианте с белым светом, корни которых обрабатывали порошком препарата Экост 1/3, число розеток было достоверно больше по сравнению с обработанными растениями, освещенными красным светом.

6. Создание «искусственных семян» земляники.

Одной из целей настоящих исследований являлась отработка методики создания «искусственных семян» земляники, а также исследование возможности их хранения при пониженной температуре и проращивания на искусственной питательной среде и в почве.

Предметом исследования в рекогносцировочном опыте с эксплантами земляники сорта Роксана являлась сахароза, добавленная в раствор альгината натрия в концентрациях 3% (контроль) и 6% (опыт). Растения земляники подготавливали на агаризованной питательной среде Мурасиге-Скуга с пониженным содержанием цитокининов (БАП - 0,2 мг/л) и повышенной концентрацией сахарозы (6%). Перед инкапсулированием растения подвергли холодовой обработке в течение 14 дней при 6° С.

Таблица 9. - Приживаемость «искусственных семян» земляники сорта

Роксана на питательной среде Мурасиге-Скуга.

Варианты (концентрация сахарозы)

ЗУ» (контроль) 6% (опыт)

Общее число капсул 40 39

Число жизнеспособных 26 21

«искусственных семян»

% приживаемости 65 69

Как видно из данных таблицы 9, концентрация сахарозы существенно не повлияла на приживаемость «искусственных семян» земляники сорта Роксана на питательной среде Мурасиге-Скуга. В опытном и контрольном вариантах выжило и проросло приблизительно одинаковое количество инкапсулированных микропобегов, которые в дальнейшем нормально росли и развивались на питательной среде и были готовы к адаптации к нестерильным условиям.

В дальнейших экспериментах изучали возможность хранения полученных «искусственных семян» при пониженной температуре и проращивания их в почве. На основании разработанной методики были созданы «искусственные семена» земляники сортов Покахонтас и Дивная, которые поместили на хранение в холодильник при температуре +2...+4°С и через 30 дней высадили в почву для адаптации к нестерильным условиям. В течение этого времени регулярно отмечали состояние «искусственных семян», учитывали процент прорастания в условиях пониженной температуры и выживаемости на этапе адаптации. Изучали состав питательной среды, на которой эксплан-ты земляники готовили перед инкапсуляцией. В первом варианте растения культивировали на питательной среде Мурасиге-Скуга, обогащенной БАП (0,2 мг/л) и сахарозой (6%), во втором варианте в питательную среду добавили паклобутразол в концентрации 1 мг/л.

Таблица 10. - Влияние состава питательной среды на жизнеспособность «искусственных семян» земляники сорта Покахонтас в период хранения

при пониженной температуре и прорастание в почве.

1-й вариант 2-й вариант

Число "искусственных семян", помещенных на хранение при пониженной температуре 88 38

Число "искусственных семян", проросших в чашках Петри в холодильнике 14 5

Проце1гг прорастания "искусственных семян" в холодильнике 15,9 13,2

Число "искусственных семян", адаптированных к нестерильным условиям 88 37

Число выживших и проросших в нестерильных условиях "искусственных семян" 50 16

Процент прорастания "искусственных семян" в почве 56,8 43,2

Анализ данных таблицы 10 позволяет сделать вывод, что микрорастения земляники сорта Покахонтас были лучше подготовлены к инкапсуляции на питательной среде с повышенной концентрацией сахарозы (1-й вариант), благодаря чему процент прорастания «искусственных семян» в почве был выше, чем в варианте с паклобутразолом (2-й вариант).

Таблица II. - Влияние сортовых особенностей и паклобугразола на процент приживаемости и прорастание «искусственных семян» земляники.

Покахонтас Дивная

Число "искусственных семян", помещенных на хранение в холодильник 38 74

Число "искусственных семян", проросших в чашках Петри при пониженной температуре 5 24

Процент прорастания "искусственных семян" в холодильнике 13Д 32,4

Число "искусственных семян", адаптированных к нестерильным условиям 37 73

Число выживших и проросших в нестерильных условиях "искусственных семян" 16 56

Процент прорастания "искусственных семян" в почве 43Д 76,7

Установлено, что приживаемость и процент прорастания «искусственных семян» земляники зависят как от условий подготовки эксплантов перед инкапсуляцией и хранения капсул, так и от сортовых особенностей растений (табл. 11). Результаты опыта показывают, что при хранении инкапсулированных пропагул земляники сорта Дивная, подготовленных на питательной среде с паклобутразолом, процент прорастания их в чашках Петри через 30 дней составил 32,4%. У сорта Покахонтас этот показатель был в 2,5 раза ниже (13,2%). Процент прорастания «искусственных семян» земляники сорта Покахонтас, подготовленных на питательной среде с паклобутразолом, в почве составил 43,2%. У сорта Дивная проросло в 1,8 раза больше «синтетических семян» (76,7%) при тех же условиях подготовки микрорастений и хранения капсул.

Таким образом, в результате проведенных исследований были получены «искусственные семена» земляники, способные храниться в холодильнике при пониженной температуре в течение месяца и затем успешно прорастать в почве.

Экономическая эффективность.

Расчет экономической эффективности производства посадочного материала с использованием ламп с преобладанием излучения в красной и синей областях спектра проводили на примере земляники сорта Редгонтлет (табл. 12,13).

Таблица 12. - Калькуляция затрат на производство адаотированных

микрорастсний земляники (в ценах 2010 года).

Показатели Белый свет (стандартная технология) Красный свет Синий свет

Выпуск микрорастений (микрочеренков, укорененных т \itro), шт. 3000,0 3510,0 3630,0

Затраты на лабораторию, руб. 220 175,0 220 175,0 220 175,0

Себестоимость микрорастения, руб. 73,4 62,7 60,7

Выход растений после адаптации в теплице, % 78,6 100,0 100,0

шт. 2 358 3 510 3 630

Затраты на адаптацию в теплице (30 дней), руб., в том числе:

заработная плата за посадку 1 965,0 2 913,3 3 012,9

заработная плата за уход 3 886,2 5 791,5 5 989,5

начисления на заработную плату (26,2%) 1 533,0 2280,7 2 358,6

материалы 1 800,0 2 106,0 2 178,0

Прочие расходы 15 000,0 15 000,0 15 000,0

Накладные расходы, 45% 2 633,0 3 917,2 4 051,1

Итого затрат на адаптацию в теплице, руб. 26 817,2 32 008,7 32 590,1

Итого затрат на выращивание растений земляники с применением метода клонально-го микроразмножения, руб. 246 992,2 252 183,7 252 765,1

Себестоимость адаптированного микрорастения, произведенного способом клональ-ного микроразмножения, руб. 104,7 71,8 69,6

Из таблицы 12 видно, что при облучении эксплантов земляники in vitro красным и синим светом выход растений на этапе адаптации увеличился в 1,5 раза; при этом себестоимость одного микрорастения земляники после облучения красным светом снизилась на 14,6%, а себестоимость материала, полученного после адаптации в теплице, уменьшилась на 31,4% по сравнению со стандартной технологией. Использование в культуре тканей ламп с преобладанием излучения в области синего спектра позволило снизить себестоимость микрорастения на 17,3%, а себестоимость адаптированного микрорастения на 33,5% по сравнению с контролем.

Таблица 13. - Экономическая эффективность производства розеток

земляники.

Показатели Белый свет (стандартная технология) Красный свет Синий свет

Занимаемая площадь в поле, иг 1909,9 2843,1 2940,3

Затраты на уход за растениями в поле в течение одного вегетационного периода, руб. 101 680,9 151 363,3 156 538,2

Итого затрат на выращивание растений земляники с применением метода клональ-ного микроразмиожения и на уход за ними в полевых условиях, руб. 348 673,1 403 547,0 409 303,3

Количество розеток земляники, полученных в полевых условиях, с учетом потерь 5%, шт. 33602 50018 51728

Себестоимость розетки, руб. 10,4 8,1 7,9

Цена реализации розеток, руб. 30,0 30,0 30,0

Выручка от реализации, руб. 1 008 060,0 1 500 540,0 1 551 840,0

Прибыль от реализации, руб. 659 386,9 1 096 993,0 1 142 536,7

Уровень рентабельности, % 189,1 271,8 279,1

Из данных таблицы 13 следует, что использование экспериментальных источников освещения в культуре тканей способствовало увеличению количества розеток у растений земляники в поле в 1,5 раза по сравнению с контролем. В результате, себестоимость розеток земляники снизилась на 22% при освещении красным и на 24% при освещении синим светом по сравнению с белым спектром.

Расчет уровня рентабельности показал, что применение люминесцентных ламп с преобладанием излучения в красной и синей областях спектра в период культивирования эксплантов in vitro экономически выгодно и позволяет повысить прибыль от реализации розеток земляники в 1,4-1,5 раза по сравнению с общепринятой технологией.

Благодарность:

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю д.с.-х.н., профессору, заместителю директора по научной работе ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии Высоцкому В.А. за неоценимую помощь в постановке и проведении научных экспериментов, а также в подготовке мате-

риалов и написании диссертации. Автор выражает искреннюю благодарность к.с.-х.н., старшему научному сотруднику, заведующей отделом биотехнологии ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии Алексеенко JI.B. за неоценимую помощь в освоении методики клоналыюго микроразмножения, постановке и проведении экспериментов, рецензирование работы и ценные консультации; K.6.H., старшему научному сотруднику группы криосохранения ИФР РАН им. К.А. Тимирязева Высоцкой О.Н. за творческое сотрудничество, а также руководству ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии за предоставленную базу для проведения научных исследований.

Выводы:

1. Факторы культивирования in vitro - сахароза, спектральный состав света и элиситоры - оказывают существенное влияние на рост и развитие растений земляники в культуре тканей и в полевых условиях.

2. Выявлена сортоспецифическая реакция растений земляники на действие факторов в культуре in vitro и in vivo.

3. Наиболее отчетливо последействие факторов культивирования in vitro наблюдается в течение первого года вегетации растений земляники в поле. В дальнейшем это влияние ослабевает.

4. Показано, что облучение эксплантов земляники лампами с преобладанием излучения в красной и синей областях спектра на этапе ризогенеза in vitro способствует существенному увеличению числа листьев и процента укоренения.

5. Испытанные элиситоры - эмистим, арахидоновая кислота и экост 1/3 -обеспечивают высокий процент укоренения растений на этапе ризогенеза in vitro. Арахидоновая кислота способствует росту корней в длину у эксплантов земляники всех изучаемых сортов.

6. Повышение концентрации сахарозы в питательной среде (до 6%) увеличивает вегетативную продуктивность у растений земляники в полевых условиях на 21,5-40,7% по сравнению со стандартной технологией.

7. На примере сорта Редгонтлет показано, что взаимодействие света различного спектрального состава и препарата Экост 1/3 оказывает существенное влияние на показатели вегетативной и генеративной продуктивности растений в поле, повышая показатели генеративной продуктивности у растений, освещенных белым светом, в 1,4-1,9 раз, вегетативной продуктивности - в 2,8 раза.

8. Применение арахидоновой кислоты на этапе укоренения in vitro способствует увеличению числа генеративных образований у растений земляники сорта Амулет в первый год вегетации в поле. Для остальных изученных сортов влияние элиситоров на генеративную продуктивность растений в поле было несущественным.

9. Облучение красным светом растений земляники сортов Амулет и Про-фьюжен на этапах микроразмножения и укоренения in vitro способствует увеличению числа генеративных образований в поле. Облучение синим светом растений земляники сорта Пурпуровая на этапах микроразмножения и укоренения in vitro сдерживает появление генеративных образований в полевых условиях.

10. Показана возможность инкапсуляции почек и микропобегов земляники в «искусственную оболочку», хранения «искусственных семян» в условиях пониженных температур в течение месяца и проращивапия на питательной среде и в почве.

11. Показано, что себестоимость растений земляники, выращенных при освещении лампами с преобладанием доли красного и синего спектра, снижается на 22-24% по сравнению со стандартной технологией.

Рекомендации для практического использования:

1. Для повышения процента укоренения и сокращения этапа ризогенеза облучать экспланты земляники красным и синим светом на последних этапах культивирования in vitro.

2. Для ускорения роста корней в длину на этапе укоренения в питательную среду Мурасиге-Скуга слсдуег добавлять арахидоновую кислоту в концентрации 10"7М.

3. Для повышения вегетативной продуктивности растений земляники в поле на последних этапах культивирования добавлять сахарозу в питательную среду Мурасиге-Скуга в концентрации 6%.

4. Для повышения вегетативной и генеративной продуктивности растений земляники сорта Редгонтлет в полевых условиях перед высадкой в нестерильные условия онудривать корни растений порошкообразным экостом или облучать экспланты в течение культивирования in vitro лампами с преобладанием излучения в красной или синей областях спектра.

5. Для получения «искусственных семян» земляники подготавливать экспланты на питательной среде Мурасиге-Скуга, обогащенной 0,2 мг/л БАП, 6% сахарозы или добавлять паклобутразол в концентрации 1 мг/л. Для инкапсуляции использовать растворы альгината натрия (3%-ный) и хлорида кальция (0,1М, 20%-ный).

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. Алексеенко Л.В., Белякова JI.B., Высоцкая О.Н., Высоцкий В.А. Возможность восстановления пролиферирующих культур пробирочными растениями земляники садовой (Fragaria ananassa Duch.) после длительного хранения in vitro И Материалы II Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира», г. Волгоград, 19-21 августа 2008 г. - Белгород. - 2008. - С. 87-91.

2. Алексеенко JI.B., Белякова Л.В., Высоцкая О.Н., Высоцкий ВА. Влияние концентрации сахарозы в питательной среде на адаптацию растений земляники ел vitro к нестерильным условиям // Тезисы IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология», Звенигород, 8-12 сентября 2008 Г.-М.-2008.-С.12-13.

3. Алексеенко J1.B., Белякова Л.В., Высоцкий ВА. Влияние спектрального состава света на биометрические показатели эксплантов земляники в культуре in vitro // Плодоводство и ягодоводство России. Сб. научн. работ. -М. - 2009. -Т. XXII. -Ч. 1. -С. 183-188.

4. Высоцкий В.А., Белякова Л.В., Высоцкая О.Н. Эффект использования паклобутразола и различных концентраций сахарозы в питательных средах in vitro на развитие растений земляники в нолевых условиях // Плодоводство и ягодоводство России. Сб. научн. работ. - М. - 2009. -Т. XXII. - Ч. 1. - С. 241246.

5. Высоцкая О.Н., Белякова Л.В., Алексеенко JI.B. Подходы к созданию искусственных семян земляники // Плодоводство и ягодоводство России. Сб. научн. работ. - М. - 2009. -Т. XXII. -Ч. 1. - С. 236-240.

6. Алексеенко Л.В., Высоцкий ВА., Высоцкая О.Н., Белякова Л.В. Развитие растений земляники in vivo в зависимости от условий культивирования in vitro // «Интенсификация и оптимизация продукционного процесса сельскохозяйственных растений» (материалы науч.-практ. конф., 6-8 октября 2009). - Орел. - 2009. - с. 8-10.

7. Белякова Л.В. Влияние света различного спектрального состава на биометрические показатели эксплантов земляники в процессе клонального микроразмножения // Материалы X Молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», 7 апреля 2010 г.-М,-2010.-С. 10-11.

8. Белякова Л.В., Высоцкий В.А. Нанобиотехнологии для получения искусственных семян на примере земляники // Материалы III научно-практической конференции «Перспективы развития инноваций в биологии», 11-13 ноября 2009 г. МГУ им. М.В. Ломоносова. Биологический факультет. -М,- 2009. -С. 20-21.

9. Белякова Л.В., Высоцкий В.А., Алексеенко Л.В. Влияние некоторых факторов культивирования на развитие эксплантов земляники в процессе

клонального микроразмножения // Садоводство и виноградарство. - 2010. -N. 2.-С. 23-27.

10. Высоцкий В.Л., Алексеенко J1.B., Марченко JI.A., Донецких В.И., Белякова Л.В., Скачков М.В., Ревякин ЕЛ., Селиванов В.Г. Инновационные технологии возделывания земляники садовой // Научно-практическое издание под рук-вом акад. Куликова И.М. - М. - 2010. - ФГНУ «Росинформагро-тех». - С. 12-41.

11. Белякова JI.B., Высоцкий В.А., Алексеенко JI.B. Влияние спектрального состава света на биометрические показатели растений земляники в культуре in vitro // Актуальные проблемы размножения садовых культур и пути их решения. - ГНУ ВНИИС им. И.В. Мичурина. - Мичуринск - Наукоград. - 2010. - С. 39-42.

12. Высоцкий ВА., Высоцкая О.Н., Алексеенко JI.B., Белякова JI.B. Подходы к созданию «искусственных семян» земляники // Актуальные проблемы размножения садовых культур и пути их решения. - ГНУ ВНИИС им. И.В. Мичурина. - Мичуринск - Наукоград. - 2010. - С. 67-70.

13. Высоцкий В.А., Белякова JI.B., Алексеенко JI.B., Высоцкая О.Н. «Искусственные семена» - перспективный способ размножения ценных форм земляники // Материалы XIX Международного симпозиума «Нетрадиционное растениеводство. Селекция и генетика. Эниология. Экология и здоровье». - г. Алушта, 12-19 сентября 2010 г. - Симферополь. - 2010. - С. 368-369.

14. Белякова JI.B. Влияние элиситоров на развитие эксплантов земляники (Fragaria х ananassa Duch.) in vitro и последующую продуктивность полученных растений в полевых условиях // Материалы докладов «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» и Международная научная школа «Инновации в биологии для развитая биоиндустрии сельскохозяйственной продукции». 4-10 июля 2011г., ННГУ им. Н.И. Лобачевского. - Нижний Новгород. - 2011. - С.804.

15. Высоцкий В.А., Белякова Л.В., Алексеенко Л.В. Влияние спектрального состава света на развитие эксплантов земляники in vitro II Мате-

риалы докладов «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» и Международная научная школа «Инновации в биологии для развития биоиндустрии сельскохозяйственной продукции». 4-10 июля 2011г., ИНГУ им. Н.И. Лобачевского. - Нижний Новгород. - 2011. - С.163-164.

16. Белякова Л.В., Высоцкий В.А., Алексеенко Л.В. Применение элиси-торов при клональном микроразмножении земляники // Плодоводство и яго-доводство России. Биотехнология. Сб. научн. работ. - 2011. -Т. XXVI. - С. 194-200.

17. Куликов И.М., Алексеенко JI.B., Белякова JI.B., Высоцкая О.Н., Высоцкий В.А. Разработка приемов создания «искусственных семян» земляники садовой (Fragaria х ananassa Duch.) // Материалы VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Часть 1. - 21 -25 марта 2011 г. - Москва. - С. 241-242.

18. Белякова Л.В. «Искусственные семена» земляники: подходы к созданию и хранению // Материалы XI Молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», 6 апреля 2011 г.-Москва.-2011.-С. 10-12.

19. Алексеенко Л.В., Высоцкий В.А., Белякова Л.В. Изменение вегетативной и генеративной продуктивности земляники садовой под влиянием различных факторов культивирования in vitro // Материалы Vil Международной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений», 26-28 октября 2011 г. - Минск. - 2011. - С. 14.

20. Беликова H.A., Белякова Л.В., Высоцкий В.А., Алексеенко Л.В. Экономическая эффективность выращивания рассады земляники с использованием биотехнологических приемов // Садоводство и виноградарство. - 2011. -№5.-С. 45-48.

Подписано в печать:

29.02.2012

Заказ № 6755 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата сельскохозяйственных наук, Баулина, Любовь Владимировна, Москва

61 12-6/309

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВС^ОСС^ЙСКИЙ СЕЛЕКЦИОННО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИИ

ИНСТИТУТ САДОВОДСТВА И ПИТОМНИКОВОДСТВА

На правах рукописи

БАУЛИНА Любовь Владимировна

ФАКТОРЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ IN VITRO И ИХ ВЛИЯНИЕ НА РОСТ И РАЗВИТИЕ РАСТЕНИЙ ЗЕМЛЯНИКИ IN VITRO И IN VIVO.

Специальность 06.01.01 - общее земледелие.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Научный руководитель - доктор сельскохозяйственных наук, профессор Высоцкий В.А.

Москва - 2012.

СОДЕРЖАНИЕ.

4.4. Влияние света различного спектрального состава и элиситоров на генеративную и вегетативную продуктивность растений земляники в полевых условиях.

4.5. Создание «искусственных семян» земляники. 5. Экономическая эффективность.

Стр. 4 9

17

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Спектральный состав света как фактор, влияющий на 9 жизнеспособность растений in vitro.

1.2. Источники углеродного питания в питательной среде.

1.3. Влияние элиситоров на устойчивость растений к болезням и 22 вредителям.

1.4. «Искусственные семена»

2. Цель и задачи исследований.

3. Материалы, объект и методика проведения исследований.

4. Результаты экспериментов и обсуждение.

4.1. Влияние различных концентраций сахарозы на генеративную и вегетативную продуктивность растений земляники в полевых условиях.

4.2. Влияние света различного спектрального состава на развитие 52 эксплантов земляники в культуре in vitro на этапе пролиферации.

4.3. Влияние различных факторов культивирования in vitro на развитие эксплантов земляники на этапах укоренения и адаптации к нестерильным условиям.

4.3.1. Влияние света различного спектрального состава на развитие 56 эксплантов земляники на этапе укоренения in vitro.

4.3.2. Влияние элиситоров на жизнеспособность эксплантов 62 земляники при клональном микроразмножении in vitro.

30 45 47 51

51

56

66

86 99

6. Выводы.

7. Рекомендации для практического использования. 1°4

1 п^

8. Список использованной литературы.

132

Приложения.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность темы. Общеизвестно, что потребление свежих плодов и овощей необходимо для здоровья и поддержания нормальной жизнедеятельности человека, а также является профилактикой многих заболеваний. В настоящее время население России недостаточно обеспечено плодами и ягодами, поэтому очень важно

развивать их отечественное производство.

Земляника - наиболее рентабельная среди ягодных культур, она отличается высокой скороплодностью. Плоды земляники - одни из самых раносозревающих и открывают сезон потребления свежих ягод в средней полосе России.

Спрос на землянику на рынке очень велик. Ягоды обладают прекрасным вкусом и ароматом, содержат соли железа, фосфора, кальция, микроэлементы, витамины, органические кислоты, эфирные масла и другие биологически активные вещества, что и обусловливает их высокую питательную ценность для человека (А.Д. Бурмистров, 1985; В.И. Кашин, 1993).

В настоящее время в России разработана технология получения сертифицированного посадочного материала плодовых и ягодных культур (2009) и метод кло-нального микроразмножения играет важную роль в этом процессе. Экономическая эффективность и ряд других преимуществ метода культуры тканей, благодаря которым он повсеместно применяется на практике, доказаны отечественными и зарубежными учеными и не вызывают сомнений (И.В. Жаркова, 1988; О.П. Виницкая и др., 1987; W.D. Beversdor, 1984; T. Murashige, 1962,1976,1984; A. Donnan, 1986; Z.S. Wo-chok, 1987; Н.Т. Hartmann, 1989; Г.П. Атрощенко и др., 1998; B.S. Ahloowalia, 1999; C.B. Янушкевич и др., 2004, В.И. Деменко, 2007; B.C. Шевелуха и др., 2008).

В частности, для земляники метод клонального микроразмножения отработан и позволяет тиражировать посадочный материал в промышленных масштабах (Ш.М. Тутунова, 1979; авторское свидетельство № 1279082, В.Г. Трушечкин и др., 1983; Ф.Н. Хамукова, 1994; В.А. Высоцкий, 1978, 1998; Л.В. Алексеенко, 1998; Г.П. Атрощенко и др., 2001; Методические указания «Технология получения сертифицирован-

ного посадочного материала плодовых и ягодных культур», 2009; Методические указания «Производство и сертификация посадочного материала плодовых, ягодных культур и винограда в России», 2009 и другие). Так, 20-летние исследования, проведенные на опытной ягодной станции в Болгарии, показали, что у оздоровленного посадочного материала земляники, произведенного с использованием культуры in vitro, урожайность повышалась от 20% до 200% в зависимости от сорта (С. Стоянов и др., 1988). Однако при массовом производстве растений неизбежно встает вопрос о генетической стабильности посадочного материала, полученного в процессе микроразмножения, так как в ряде случаев было отмечено появление форм, отличающихся от исходных растений (Биотехнология сельскохозяйственных растений, 1987; D. Haisel etal., 2001).

В настоящее время уже накоплен значительный материал, свидетельствующий о том, что разные клоны одного и того же сорта земляники после микроразмножения могут вести себя по-разному. При этом важную роль играют сортовые особенности, продолжительность обработки микроразмноженных растений низкими температурами и число субкультивирований.

Генетическая стабильность получаемого in vitro материала зависит от модели размножения. Процесс размножения плодовых растений связан, в основном, с пролиферацией пазушных меристем. Генетическая стабильность меристемы может быть сохранена, если в процессе культивирования создать условия, ингибирующие формирование каллуса. Появление каллуса может привести к возникновению генетической вариабельности. Каллусообразование вызывают вещества из группы ауксинов, которые добавляют в питательные среды для увеличения коэффициента размножения. Известно, что комбинации цитокининов и ауксинов широко применяют для индукции органогенеза в каллусных тканях. В системе каллус-побег организованная структура побега может играть своеобразную роль «органа-няньки» и воздействовать на процессы органогенеза, стимулируя меристематизацию каллусных клеток, которые, в свою очередь, могут давать начало органам с измененными свойствами.

Изменение концентрации регуляторов роста в питательной среде для достижения

5

максимальной пролиферации клеток также может оказать влияние на генетическую

стабильность получаемого материала. (В.А. Высоцкий, 1995).

В настоящее время установлено, что практически все отклонения, возникающие у растений после культуры in vitro, связаны с изменением экспресии генов, контролирующих признаки, по которым растения отличаются от исходных культивируемых форм (В.А. Высоцкий, 1995; Л.И. Патрушев, 2000). Экспрессию генов регулируют различные факторы:

1) физические факторы: уровень освещенности, продолжительность освещения,

спектральный состав света, температура и влажность воздуха, содержание кислорода (оказывает воздействие на окислительно-восстановительный потенциал);

2) химические факторы: регуляторы роста (особенно препараты группы цитоки-нинов), элиситоры биотической и абиотической природы, источники углерода (сахара) (В. А. Высоцкий, 1995).

С.А. Корнацкий с коллегами изучал комплекс факторов, влияющих на жизнеспособность, рост и развитие микрорастений после культуры in vitro, и ему удалось выяснить причины, приводящие микрорастения к гибели на этапе адаптации. Ученый отмечает, что учитывая эти факторы, можно обеспечить успех технологии кло-

нального микроразмножения (С.А. Корнацкий, 1999).

Все вышеперечисленное указывает на необходимость вплотную заняться разработкой методов модификации продуктивности растений земляники, полученных путем микроразмножения, изменяя условия культуры in vitro, то есть гормональный баланс питательной среды или физические условия выращивания растений.

Научная новизна результатов исследований. Впервые показано, что различные факторы культивирования in vitro (сахароза, спектральный состав света и элиситоры) оказывают существенное влияние на вегетативную и генеративную продуктивность растений земляники в полевых условиях.

Определены оптимальные параметры культивирования in vitro для ускорения выхода полноценных растений земляники различных сортов.

Впервые показана возможность инкапсулирования почек и микропобегов земляники в «искусственную оболочку», хранения полученных «искусственных семян» в условиях пониженных температур в течение месяца и высадки в нестерильные условия.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) влияние факторов культивирования in vitro (спектрального состава света, эли-ситоров, сахарозы) на жизнеспособность растений земляники in vitro и их продуктивность в полевых условиях;

2) влияние взаимодействия факторов культивирования in vitro на продуктивность

растений земляники в полевых условиях;

3) экономическая оценка эффективности применения экспериментальных источников освещения эксплантов земляники in vitro на показатели вегетативной продуктивности растений в полевых условиях;

4) возможность создания «искусственных семян» земляники.

Практическая значимость результатов исследований. Облучение эксплантов земляники в течение культивирования in vitro лампами с преобладанием излучения в красной и синей областях спектра позволяет управлять процессами роста и развития, сокращало продолжительность этапа ризогенеза, повышало коэффициент

выхода растений.

Использование элиситоров эмистим, арахидоновая кислота и Экоста 1/3 повышает процент укоренения растений и сокращает длительность этапа ризогенеза. Обогащение питательной среды повышенной концентрацией сахарозы (6%) способствует увеличению вегетативной продуктивности растений в полевых условиях.

Разработанная модель создания «искусственных семян» земляники может являться основой для дальнейших исследований в данной области с целью увеличения периода хранения инкапсулированных эксплантов и усовершенствования состава оболочки для непосредственного посева в полевых условиях.

Апробация работы. Основные положения работы были доложены на X Молодежной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и вете-

ринарии» (Москва, 7 апреля 2010 г.), III Научно-практической конференции «Перспективы развития инноваций в биологии» (МГУ им. МБ. Ломоносова, биологический факультет, 11-13 ноября 2009 г.); представлены на IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (г. Звенигород, 8-12 сентября 2008 г.); II Всероссийской научно-практической конференции «Биология как инструмент биоразнообразия растительного мира» (г. Волгоград, 19-21 августа

2008 г.); на научно-практической конференции «Интенсификация и оптимизация продукционного процесса сельскохозяйственных растений» (г. Орел 6-8 октября

2009 г.), на научно-практической конференции «Актуальные проблемы размножения садовых культур и пути их решения» (ГНУ ВНИИС им. И.В. Мичурина, Мичуринск-Наукоград, 2010 г.), XIX Международном симпозиуме «Нетрадиционное растениеводство. Селекция и генетика. Эниология. Экология и здоровье» (г. Алушта, 12-19 сентября 2010 г.), Международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (г. Москва, 21-25 марта 2011 г.); на Международной научно-практической конференции «Использование биотехнологических методов и регуляторов роста в садоводстве» (г. Москва, 22-23 июня 2011 г.); на Международной научной конференции «Инновации в биологии для развития биоиндустрии сельскохозяйственной продукции» (г. Нижний Новгород , 4-10 июля 2011г., ННГУ им. Н.И. Лобачевского,); на VII Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (г. Минск, 26-28 октября 2011 г.).

По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ, в том числе 6 -в изданиях, рекомендованных ВАК (4 печатные статьи в сборнике научных работ «Плодоводство и ягодоводство России», Т. XXII, 4.1, 2009 г.; Т. XXVI., 2011 г.; 2 печатные статьи в журнале «Садоводство и виноградарство», № 2, 2010 г., № 5, 2011 г.); а также выпущено научно-практическое издание «Инновационные технологии возделывания земляники садовой» под руководством академика И.М. Куликова,

2010 г.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Спектральный состав света как фактор, влияющий на жизнеспособность растений in vitro.

Известно, что в среднем листья растений поглощают 80% энергии фотосинтетически активных лучей солнечного спектра (400-700 нм) и 25% энергии инфракрасных лучей, что составляет около 55% от энергии общей радиации. На фотосинтез расходуется 1,5-2% поглощенной энергии (В.В. Полевой, 1989). Обширные исследования влияния света разного спектрального состава на растения были проведены Н.П. Воскресенской. Полученные ею результаты указывают на то, что спектральный состав света может являться мощным регулятором обмена веществ и продуктивности высших растений, а также, создавая преимущественные условия для образования определенных метаболитов, влиять на морфогенез растений (Н.П. Воскресенская и др., 1965, 1975).

Следует отметить, что влияние спектрального состава света на показатели жизнеспособности растений в культуре in vitro, а также после высадки в нестерильные условия недостаточно изучено, а имеющиеся в литературе данные порой носят противоречивый характер. F. Loreti объяснял различие в морфогенетической реакции растений в культуре тканей на облучение определенным участком спектра в первую очередь степенью дифференциации тканей и органов (F. Loreti, 1991). Так, освещение синим светом вызывало образование побегов у каллуса табака (М. Seibert, 1975), а образование корней у топинамбура происходило интенсивнее при освещении красным светом (R. Letouze, 1969). Красный свет стимулировал образование корней у эксплантов табака при наличии ИУК в питательной среде (Т.Н. Константинова, 1987). Под влиянием синего света лучше всего развивалась надземная масса и корневая система вишни и голубики (В. Barkiwska, 1994). В опытах, проведенных на винограде, было показано, что при освещении

9

растений красным светом можно достигнуть высокого процента укоренения

микропобегов (R. Chee, 1989).

H.H. Протасова изучала влияние облучения люминесцентными

лампами с преобладанием излучения в области красного, синего и зеленого участков спектра на морфофизиологические параметры растений салата {Lactuca saliva L.), редиса {Raphanus sativus L.), перца сладкого {Capsicum annuum L.), подсолнечника {Helianthus annuus L.) и левзеи сафлоровидной {Rliaponlicum cariliamoides Wild.) в условиях фитотрона. Ею было показано, что облучение красным светом с максимумом излучения в области 640-670 нм способствовал интенсивному росту листьев и осевых органов у всех испытываемых растений. Синий свет сдерживал рост стебля и площадь листьев, что приводило к формированию растений с низкой продуктивностью. При облучении зеленым светом (максимум излучения 520-550 нм) формировались тонкие листья с меньшим числом клеток, хлоропластов, продуктивность растений была низкой. На основании полученных результатов автор рекомендовала следующее соотношение спектрального состава света в люминесцентных лампах: 25-30% - в синей области (380-490 нм), 20% - в зеленой (490-590 нм) и 50% - в красной области спектра (600-700 нм) (H.H. Протасова, 1987).

Исследования JI.B. Алексеенко, В.А. Высоцкого (2000), посвященные

влиянию спектрального состава света на ризогенез эксплантов земляники

нейтральнодневных и ремонтантных сортов показали, что реакция на

облучение светом различного спектрального состава носит

сортоспецифический характер. Так, у сорта Тристар количество корней у

эксплантов на синем свету было больше, чем на красном, зеленом и белом,

для сорта Трибьют предпочтительнее оказался красный свет, микропобеги

сорта Редгонтлет образовывали наибольшее количество корней на синем и

зеленом свету. Было выявлено, что культивирование побегов при облучении

красным и синим светом позволило существенно ускорить образование

10

корневой системы у сортов Тристар, Трибьют, Профьюжен и Редгонтлет. Авторы рекомендуют культивировать экспланты земляники на этапе укоренения на синем и красном свету для более быстрого перевода их в

нестерильные условия.

Опыты по изучению влияния красного люминесцентного излучения низкой интенсивности позволили сделать вывод о его регуляторном действии на состояние гормонального баланса растений. В свою очередь, изменения в соотношении гормонов, стимуляторов и ингибиторов роста, приводили к различиям в скорости ростовых реакций и продуктивности растений (A.C.

Минич и др., 2006).

Р.П. Евсеева, JI.B. Осипова (1998) изучали влияние состава питательной среды и когерентного излучения лазера на развитие эксплантов земляники in vitro и выявили, что лазерное излучение при экспозиции 15 и 240 секунд увеличивает облиственность эксплантов земляники на среде Уайта-Хеллера. На среде Уг Мурасиге-Скуга при экспозиции 15 секунд увеличивалась длина корней. Экспозиция 240 секунд способствовала дополнительной закладке корней на среде Уайта-Хеллера. При этом лазерное облучение не оказывало заметного влияния на среднюю длину побега.

В ходе многочисленных исследований установлено, что св�