Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эпидемиологическое маркирование клебсиелл и энтеробактеров

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Эпидемиологическое маркирование клебсиелл и энтеробактеров"

*

На правах рукописи

УСАЕВА Яхита Саидовна

ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ МАРКИРОВАНИЕ КЛЕБСИЕЛЛ И ЭНТЕРОБАКТЕРОВ

03.00.07 - МИКРОБИОЛОГИЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

РОСТОВ-НА-ДОНУ 1995

Работа выполнена в Кабардино-Балкарском государственном университете

Научный руководитель: Член-корреспондент РАЕН, доктор биологических наук, профессор Габрилович И.М.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Васильева Л .И.

кандидат биологических наук, доцент Коган И.Б.

Ведущая организация: Ростовский научно-исследовательский противочумный институт

Защита состоится "«У " ^^¿УУ/1995 г. в часов на заседании диссертационного совета Д tfSU.53.6l яри Ростовском государственном медицинском университете (344022. г.Ростов-на-Дону, пер.Нахичеван-ский,29).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан "*&> " /¿¿-¿»Я/1995 г

Ученый секретарь диссертационного совета, доцент

Корганов Н.Я.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В современных условиях проблема госпитальных (внутрибольничных) инфекций полностью сохраняет свою актуальность. В лечебных учреждениях возникают заболевания, которые вызываются не только патогенными, но и условно-патогенными микроорганизмами. Эти микроорганизмы представляют опасность при поражении ослабленных людей, при попадании в обычно стерильные органы и ткани, при большой инфицирующей дозе возбудителя (Р.Х.Яфаев и Л.П.Зуева,1989).Множество сообщений о большом значении внутрибольничнои инфекции опубликовано в Англии, Франции, США и др. странах, где эти заболевания, нередко с летальный исходом, возникают у 5-12% госпитализированных лиц (Lewis и Klein,1979; Dascliner,1981).

Бактерии родов Klebsiella и Enterobacter относятся к условно-патогенным и являются частыми возбудителями внутрибольничнои инфекции /В.Д.Беляков и соавт.,1976; В.И.Покровский.1985/.

Клинические проявления вызываемых клебенеллами патологических процессов многообразны. Клебсиеллы, как и другие условно-патогенные микробы, поражают, как правило, люден со сниженной естественной резистентностью организма. Чаще всего это онкологические it постравматнческие больные, новорожденные и дети первого года жизни, беременные женщины, алкоголики. У таких больных клеб-сиеллезная инфекция принимает крайне тяжелое течение и часто заканчивается сепсисом с летальностью до 34-60%, особенно у детей первого года жизни и у новорожденных (В.Д.Беляковя соавт.,1976; Л.Д.Доновитц,1990; Л.А.Березина и соавт.,1993).

Бактерии рода Enterobacter рода выделяются из мочи,кала,крови, мокроты, спинно-мозговой жидкости, плевральной жидкости, с поверхности кожи, из желудочно-кишечного тракта и мочеполовой системы. Почти все представители энтеробактеров способны вызывать тяжелые заболевания у человека (В.И.Бршшс и соавт.,1986; В.М.Бонда-ренко и соавт.,1987; Gaston и Pitt.1984). Описаны случаи вспышек внутрибольничной инфекции, связанных с энтеробактерами.

Несмотря на значительный период изучения клебсиелл и энтеробактеров, их идентификация, внутриродовое и внутривидовое разграничение представляют известные трудности.

Используемые в настоящее время ■ методы., эпидемиологического маркирования бактерий сводятся к традиционным (классическим), включающим определение биоваров, бактериоцинотипнрование, фаго-типирование, резистенстипнрование, серотипирование, и нетрадиционным,основанным на молекулярных характеристиках бактерий. Последние требуют специального оборудования, реактивов, обученных специалистов, что ведет к значительным материальным затратам. Кроме

з

того, ии методы не всегда достоверно воспроизводимы.Исходя из этого, рациональным является совершенствование классических методов тииирования путем разработка новых типирующих систем с удовлетворяющей современным потребностям стандартностью и доступностью для практических лаборатории.Среди этих методов особое место принадлежит фаготипированию,оправдавшему себя при изучении многих бактерий. Схемы фаготипнрования бактерий требуют постоянного совершенствования в связи с происходящими изменениями в циркуляции бактерий. Это в полной мере относится к клебсиеллаи и энтеро-бактерам.

Цель и задачи работы. Исходя из сказанного выше, целью нашей работы являлось изучение эффективности маркирования бактерий родов Klebsiella и Enterobacter с помощью различных методов.

Для осуществления поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Исследовать возможности разграничения клебсиелл и энтербак-теров по биологическим свойствам: биохимическая активность, антибиоз нечувствительность, щшзмндныи профиль ДНК.

2. Изучить возможность разграничения этих бактерий по факторам иатогенности.

3. Усовершенствовать схемы фаготнпирования клебсиелл и энте-робактеров.

Работа проводилась в соответствии с основными направлениями НИР Кабардино-Балкарского государственного университета. Тема: "Разработка способов выявления и эпидемиологического маркирования условно-патогенных представителен энтеробактерий", зарегистрирована во ВНТИЦентре, № гос.регистации 01.91.0044705.

Научная новизна. Показано, что в качестве эпидемиологических маркеров клебсиелл и энтеробактеров может быть использовано определение факторов иатогенности бактерий, плаэмцдного профиля ДНК и множественной устойчивости к антибиотикам! Клебсиеллы и энтеро-бактеры могуг типироваться с помощью фагов Klebsiella и Enterobacter.

Практический ценность. Показана возможность типнрования клебсиелл Ii энтеробактеров на основании смочетания у них факторов па-гогенпости (патотипирование). Разработаны рабочие схемы фаготипнрования клинических штаммов клебсиелл и энтеробактеров с помощью фагов этих бактерий.

Апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 7 работах, из них 1 в центральной печати.

Полученные данные доложены:

1. На выездной сессии Президиума Академии естественных наук (Махачкала, 1993).

2. На научной конференции, посвященной 25-летию ветеринарного факультета КБАМИ (Нальчик, 1994).

3. На 2-ой Всероссийской научной конференции по программе "Университеты России" раздел "Медицина" (Нальчик, 1994).

4. На научной конференции молодых ученых "Достижения медицинской науки - практическому здравоохранению" (Нальчик, 1995).

Положения, пьшоскмыс на защиту.

1. Клинические штаммы клебсиелл и энтеробактеров могут разграничиваться на основании продуцируемых ими факторов патоген-ности, по плазмидному профилю ДНК, по множественной устойчивости к антибиотикам.

2. Типнропание клебсиелл и энтеробактеров может производиться как с помощью фагов Klebsiella, лак и с фагами Enterobacter.

3. Результаты фаготипирования клебсиелл и энтеробактеров показывают тесную связь этих бактерий.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста, иллюстрирована 44 таблицами, состоит из »ведения, обзора литературы, материалов и методов, 4 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, указателя литературы, состоящего из 231 источника, из которых 75 отечественных и 156 зарубежных.

ОСНОВНОЕСОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования. В работе использованы 136 штаммов клебсиелл и 161 штамм энтсробактера. Культуры клебсиелл по своему происхождению распределены в 4 группы.

I группу составили 33 музейных штамма, из которых IS являются типовыми культурами различных капсулышх серовэров клебсиелл и получены из Минского медицинского института, 2 штамма - индикаторные для фагов Нальчикской коллекции, а 13 - для фагов Английской коллекции. И группа клебсиелл представлена 36 культурами, выделенными из различного клинического материала (моча, мокрота, гной и др.). В Ш группу включены 39 штаммов, изолированных из испражнений больных со спорадическими случаями кишечных инфекций н при дисбактериозах в Москве,Вильнюсе, Дели (Индия). IV группу составили 27 штаммов, выделенных из различного клинического материала при вспышках внутрнбольничных- инфекщш в Москве в 1987 г. и в Вильнюсе в 1986 г.

Штаммы энтсробактера также составили 4 группы. I группа включала 21 музейный шгпмм, из которых 17 являются индикаторными для фагов Enterobacter Английской коллекции. Во И группу включены 33 культуры, выделенные из смывов с различных объектов внешней среды, аппаратуры, медицинского инструментария в больничных

учреждений Москвы, Нальчика .Черкесска. III группа состояла из 59 штаммоь, изолированных из различного клинического материала от больных в тех же стационарах. В IV группе представлены 48 культур эитеробактера, выделенных из испражнений людей с различными формами кишечных заболеваний.

В работе использовались 45 типовых фагов Klebsiella и Enterobacter, входящих в 4 коллекции: 2 коллекции фагов Klebsiella и 2 коллекции фагов Enterobacter. Нальчикская коллекция фагов Klebsiella состояла из 9 типовых фагов (И.М.Габрилович и соавт.,1990). Английская коллекция представлена 14 типовыми, фагами, полученными из лаборатории госпитальных инфекций Центральной лаборатории общественного здоровья в Лондоне от проф.Т.Pitt (Gaston и со-авт.,1987). Нальчикская коллекция фагов Enterobacter включала 5 типовых фагов (К.Ю.Лотиев и И.М.Габрилович, 1995). Английская коллекция фагов Enterobacter, описанная Gaston (1987), также получена от проф.Т.Pitt (Лондон).

Для культивирования бактерий и фагов применялись питательные среды, приготовленные из концентратов производства Дагестанского научно-производственного объединения "Питательные среды" (Махачкалу Использовались 1,5% и 0,7% питательный агар, а также пита-тел;,1ый бульон. Посевы выращивались в течение 18-24 часов при температуре 37°С.

Биохимические свойства бактерий бактерий изучались с использованием систем индикаторных бумажных (СИБ) производства Нижегородского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии для идентификации представителей семейства Entero-bacteriaceae (набор А). Определение чувствительности бактерий к антибиотикам проводилось методом диффузии в агаре с помощью стандартных дисков.

Профиль плазмидной ДНК определяли путем вертикального электрофореза в 0,7% агарозе (Eckhardt, 1978).

Адгезивную способность бактерий определяли по методике В.И.Брилиса и соавт.(1986). Гемагглютинирующую активность исследовали в реакции гемагглютинации с 3% взвесью свежих эритроцитов человека и барана. Для выявления D-маннозорезистентной гемагглютинации во взвесь эритроцитов добавляли 1,5% D-маннозы. Способность бактерий адсорбировать конго красный определялась на 1,5% питательном агаре с 0,02% казаминовых кислот и 0,01% красителя.

Атилпзоцимная активность изучалась по методике О.В.Бухарина и соавт.{1984). Определения проводили в диапазоне концентраций от 1 до 6 мкг/мл. Тест-культурой служил штамм Micrococcus luteus var. lysodeikticus № 2665.

Гемолитическую активность бактерий изучали на питательном агаре с 3-5% отмытых в растворе Хеикса эритроцитов кролика. Для

выявления тиолзависим'ых гемолизинов использовался питательный агар с 0,002% Ь-цистенна. Культуры засевались уколом, гемолиз учитывался через 24-48 часов.

При работе с фагами использовались общепринятые методики. Пассирование фагов проводили на индикаторных культурах в бульонной среде. Определение фагочувствителыюстн бактерий проводили путем нанесения фага петлей на газон исследуемого штамма, приготовленный двухслойным методом. Концентрация испытуемых фагов составляла 106 -107 /мл. Результаты учитывали после 18-24 часов инкубации. Результаты исследований подвергались статистической обработке согласно общепринятым методам. Вычисляли среднюю арифметическую, ошибку средней арифметической. В ряде случаев проводили обработку по альтернативной изменчивости и также вычисляли среднюю ошибку. Достоверность различий средних арифметических определяли по критерию Стыодента.

Результаты н их обсуждение

Биологические свойства клебсиелл. Исследованные штаммы клебсиелл обладали в основном типичными характеристиками этих бактерий. Биохимические свойства клебсиелл были типичными и соответствовали общепринятым критериям. Между отдельными штаммами клебсиелл имелись различия по ферментации лактозы, а также по утилизации цитрата и малоната. Однако, это не позволяет провести разграничение клебсиелл по биохимическим свойствам. По основным биохимическим свойствам заметных различий между выделенными группами клебсиелл не наблюдалось.

Определение чувствительности клебсиелл к антибиотикам проведено в отношении 18 препаратов, представляющих 9 групп антибиотиков по химической структуре. Результаты исследований показали, что клебсиеллм в основном устойчивы к большинству использованных препаратов антибиотиков. Наибольшую устойчивость они проявляли к беталактамным антибиотикам пенициллинового ряда (86,7-98,5%) II макролидам (92,6-93,3%). Наибольшая чувствительность изученных культур отмечена в отношении гентамнцина, рифампицнна, стрептомицина, полнмиксина. Следует отметить, что сравнительно меньше устойчивых штаммов клебсиелл было по отношению к аминогликозн-дам. Примерно такие же соотношения отмечены в отдельных группах культур клебсиелл.

Представляло интерес установить распространение среди изученных культур клебсиелл штаммов с множественной устойчивостью к антибиотикам. К таким штаммам мы относили культуры, устойчивые не менее чем к 6 группам использованных антибиотиков. Клебсиеллы, обладавшие множественной устойчивостью к антибиотикам, составляли 41,5% исследованных штаммов, причем среди культур I и И групп

таких штаммов было достоверно больше, чем в 111 группе (Р < 0,05). Следует отметить сравнительно низкую частоту обнаружения множественно устойчивых штаммов среди культур IV группы, изолированных при внутрибольнпчных вспышках. Изученные штаммы клебенелл характеризовались близкой чувствительностью к антибиотикам. Перечни антибиотиков, к которым были устойчивы клебсиеллы, т.е. их резистенс-типы, были практически близкими и разграничить бактерии по этим критериям не представляется возможным.

У исследованных штаммов клебенелл проведено определение факторов патогенное!и. Исследовались ряд факторов патогенности, представляющих разные типы по механизму их действия: обеспечивающие адгезнвность бактерий, их персистепцию и токсичность.

Об адгезивной способности бактерий судили по комплексу свойств: адгезивности на эритроцитах человека группы 0(l)Rh+, агглютинации эритроцитов человека и барана, способности адсорбировать краситель конго красный. При исследовании адгезии клебенелл на эритроцитах человека к адгезивноактивным были отнесены 34,8 - 4,1%. Меньше всего таких культур было среди музейных штаммов -12,1± 5,7%, что достоверно ниже, чем во 11 и 111 группах (Р < 0,0!).При этом высокоадгезнвные штаммы среди культур 1 группы не отмечены, а в остальных группах их было 2-4.

Способностью агглютинировать эритроциты человека обладали 48 штаммов, или 35,5%. Такие штаммы относительно чаще встречались среди культур 1 и 111 ipynn(45,47 - 8,6% и 48,7 ^ 8,0%), чю достоверно превышало показатели IV группы (14,2 i 6,8%) и недостоверно отличалось отданных, полученных по II группе клебенелл (27,1- 7,4%). Гемагглютинины клебенелл были большей, частью машюзочувствн-тельными (26 штаммов), причем в отдельных группах культур число штаммов с маннозочувстшпельными и манноюрезкелентиымн гемаг-глютипинами было близким.

Гемагглютинацнонпля способность клебенелл в отношении эритроцитов барана была примерно такой же. как в отношении эритроцитов человека. Эритроциты барана агглютинировали .52 ппамма клебенелл (38,5%). Такие культуры такле чище встречались среди штаммов 1 и 1U групп (54,5% и 41,0%), Однако, в IV группе культур, агглютинирующих эритроциты барана, были относи (ельпо больше, чем агглютинирующих эритроциты человека. У большинства циаммив клебенелл и эти гемагглютинины были маннозочувствительпыми ( у 34 культур из 52) Такие гемагглютинины преобладали у ьулмур i н Iii групп.

Способность адсорбировать краситель конго красный > клеоопелл была выражена слабо - таким свойством обладали лишь 28 ипаммои (20,7%), Лучше всего такая способность била выражена у куль typ !1 гру ппы - у 47,7%.

Определение антилизоцнмной активности 135 штаммов клебсиелл, проведенное на нашей кафедре В.Б 1>озиевым, показало, что такой способностью обладали 103 штамма (76,3%),причем в отдельных группах количество таких культур было близким - в I группе - 23 штамма (59,7%),во П - 30 (83,3%).в (К - 28 (71,8%), в IV - 22 (81,5%). Уровень ан-титмзоцимной активности у клебсиелл был в основном низким и сред: ним - у 86 штаммов - 3-6 мкг/мл, у 16 - 1-2 мкг/мл и лишь у I - 7 мкг/мл.

Способностью гемолизкропать эритроциты кролика обладали 27 штаммов клебсиелл, т.е. 20% исследованных культур. Из них у 14 штаммов выявлены а- гемолизины, а у 13 - тиолзависямые (тиол-амниируемые) гемолизины. Частота выявления а -гемолизинов у клебсиелл различных, групп была близкой - от 5,5% до 15,1%. В то же время тиолзавнеммые гемолизины чаше обнаруживались у штаммов II группы, выделенных из патологического клинического материала, тогда как у музейных штаммов такие гемолиз»ны не обнаруживались.

Результаты выявления у бактерий факторов патогенностн дают возможность их маркирования по этим критериям. Маркерами бактерий могут служить сочетания у них определенных факторов патогенностн. В зависимости от этих сочетаний можно выделить патова-рианты (патор.ары; бактерий. Согласно разработанной профессором И.М.Габриловичем схемы определения патоваров мы предприняли попытку такого тнпироиания.

Использовали факторы патогенностн. представляющие 3 различные группы по механизму их действия: факторы адгезнвности. перси-стенции и токсичности бактерий.

Адгезивность устанавливали на основании комплексного изучения показателей этого процесса. Показателем персистенции бактерий служила антилнзоцнмная активность не ниже уровня 3-4 мкг/мл. Критерием токсичности служила гемолитическая способность бактерий: продукция ими а- гемолизинов и тнолзависимых гемолизинов. При наличии тнолзависимых гемолизинов патовар выделялся знаком "t". Схема учитывает также множественную устойчивость бактерий к антибиотикам ( г или s). У клебсиелл выявлено 16 патоваров. Наиболее выраженными патогенными свойствами обладают штаммы, относящиеся к па-товару !, у которых имеются факторы патогенностн всех 3 групп. Таких штаммов было всего 4 (2.9%), причем 3 из них представляли культуры U группы. У 2 штаммов этого патовара выявлена множественная устойчивость к антибиотикам и они отнесены к па товару !г.

Патопары 2, 3 и 4 характеризовались наличием факторов патогенности 2 групп. Таких штаммов было 43 (31,8%).

Патояарь! 5, 6 н 7 обладали каким-либо одним фактором пагиген-ности. Сред»! щученных культур клебсиелл они составили 42,2% (57 штаммов). Наконец, патовар 8 включал штаммы, у которых не выявлены факторы патогенности - таких культур было 31 (22,9%).

Больше всего клебсиелл было отнесено к патовару 6 - 45 штаммов (31,1%), причем 18 штаммов обладали множественной устойчивостью к антибиотикам, а 27 не обладали этим свойством. Эти культуры характеризовались выраженной антилизоцимной активностью и составляли около 1/3 культур во всех 4 группах штаммов.

При определении плазмидного профиля ДНК культур клебсиелл гшазмиды выявлены у 62 штаммов (45,9%). Распространение ллазмидо-содержащих штаммов среди культур разных групп существенно варьировано. Чаще всего шшмиды обнаруживались у клебсиелл-Ш группы, выделенных из испражнений, - среди этих культур плазмидосодержа-щие составляли 76,9%, что достоверно выше, чем в остальных группах. Меньше всего плазмидосодержащих штаммов было среди музейных культур - всего 7 (21,2%). Также мало таких штаммов оказалось среди культур, выделенных при внутриболышчных вспышках - 25,9%.

Фаготипировиние бактерий рода Klebsiella. С помощью 4 наборов типовых фагов Klebsiella и Enterobacter проведено типирование 135 штаммов клебсиелл. В результате исследований фагочувствительным оказался 121 штамм, или 89,6%, причем среди культур I группы таких штаммов оказалось 31 из 33 (93,9^ 4,1%), II группы - 27 из 36 (75,0± 7,2%), 111 - 35 из 39 (89,7± 4,8%), а в IV группе все 27 культур лизирова-лись фагами. Эти результаты показывают, что между клебсиеллами различных групп существенных различий в способности лизироваться использованными фагами не наблюдается.

Фагами Klebsiella лизировались 111 культур (82,2- 3,3%), причем существенных различий в чувствительности клебсиелл к фагам Нальчикской и Английской коллекций не было (таблица 1).

Таблица 1

Чувствительность культур клебсиелл к типовым фагам

Группа

Фаги Klebsiella

Фаги Enterobacter

Число |

ммов [

Нальчикская коллекция

Английская коллекция

Нальчикская 1 коллекция i

Английская коллекция

(Х-гп)

*

(Х%)

!Х;т)

1 33 27 81,8i 6,7 25 75,Т- 7,4 22 66, 6- 8,2 23 69,71 7,9

II 36 19 52,7- 8,3 24 66,6- 7,8 6 16,6^ 6,2 6 16,6- 6,2

III 39 24 61,5; 7,8 30 76,9- 6,7 21 53, 8- 7, 9 19 48, V- 8,0

IV 27 22 81, 5' 7,5 25 92,61 5,0 11 40, V- 9, 4 10 37,0! 7,6

Все- 135 92 го:

68,Ii 4,0 104 77,0i 3,6 60 44,4J 4, 3 58 42, 9: 4,2

Различий в чувствительности клебсиелл разных групп к фагам. Klebsiella не отмечено. Однако, наблюдались различия в чувствительности клебсиелл разных группп к фагам Нальчикской и Английской коллекций (таблица 1).

Фагами Enterobacter лизировались 76 штаммов клебсиелл (56,3± 4,3%), что достоверно ниже,чем чувствительность к фагам клебсиелл. Различий в чувствительности клебсиелл к фагам Enterobacter обеих коллекций не было установлено (таблица 1).

Из 135 испытанных культур клебсиелл только фагами Klebsiella ' лизировались лишь 46 штаммов (34,0%), а только фагами Enterobacter - лишь 7 (5,2%).

Использованные фаги обладали различными спектрами действия. Фагами Klebsiella лизировались от 20 до 64 культур клебсиелл, тогда как фаги Enterobacter существенно уступали в .этом от 9 до 36 культур. Для удобства сопоставления фагов между собой по этому критерию вычислялся индекс спектра действия фага (ИСД), который представлял собой отношение числа фагочувствительных культур к числу испытанных. Использованные фаги по этому критерию можно разделить на 3 группы: фаги с узким спектром действия (ИСД < 0,2), фаги с широким спектром действия (ИСД =0,21-0,4) и фаги с очень широким спектром действия (ИСД > 0,4).

По этому показателю фаги Нальчикской коллекции принадлежали ко 2 и 3 группам(за исключением фага 8/88, обладавшего узким спектром действия). 2 фага (КЬ и Kin) обладали очень широким спектром действия, остальные фаги - широким спектром действия.

Клебсиеллезные фаги Английской коллекции, за исключением фага KF3, также обладали широким и очень широким спектром действия, причем у 3 фагов (К 0 I, {С 0 8 и К 0 44) отмечен очень широкий спектр действия.

Среди фагов Enterobacter Нальчикской коллекции у 2 ( Си и 98) выявлен широкий спектр действия в отношении культур клебсиелл, а у 3 - узкий спектр действия. Все фаги Enterobacter Английской коллек--ции обладали узким спектром действия в отношении испытанных штаммов клебсиелл (ИСД составлял от 0,05 до 0,19).

Различия в спектре действия фагов дают возможность разграничения культур по их чувствительности к фагам, т.е. проводить фаготи-пирование этих бактерий.

Учитывая, что для фаготипирования целесообразно использовать ограниченное число типовых фагов, были отобраны 7 фагов Klebsiella, из которых 3 представляли Нальчикскую коллекцию (фаги Юи, 318 и 3/85) и 4 - Английскую (фаги К 0 1, К 0 8, К 0 25 и К 0 44). Отбира- ' лнсь, в первую очередь, фаги, дотировавшие культуры, устойчивые к другиим фагам.

С помощью отобранных фагов из Ш фагочувствительных штаммов клебсиелл удалось типировать 109, или 80,7% исследованных культур этих бактерий(98,2% фагочувствительных культур). Ориентировочно выделены 13 фаговаров, а внутри 5 из них - подварианты, всего отмечено 50 различных образцов чувствительности бактерии к фагам. „

к

К каждому из установленных фаговаров относились от 2 до 24 штаммов, а подварианты включали от I до 5 культур. Штаммы 152, 155, 157, 162, 163, выделенные при внутрииольничной вспышке в Москве, отнесены к фаговару 5 подвариантам с и г, 3 других штамма нз это)! же вспышки (153, 154, 156) принадлежали к фаговарам 2 (подиариантс) и 6 (подвариант с), а еще 2 штамма (161 и !64) - к фаговару 3 (подварнантьг с и 0- Штаммы, выделенные в Вильнюсе, относились к разным фаговарам: 2 штамма (174 и 181) принадлежали к фаговару 2 (подвариант с), 1(175) - к фаговару 3(a). 1(178)- к фаговару 4(g), 2 (173 и 179) - к фаговару 5(к и ш). 2(171 и 177) - к фаговару 6 (Ь и g), I (172) - к фаговару 8. К отдельным фаговарам принадлежали культуры, относящиеся к разным группам и входящие в одну я ту же группу.

Исследованные культуры клебенелл оказалось возможным тнпн-ровать с помощью фагов Enterobacter, из которых в качестве типовых были отобраны фаги Сн. 131 из Нальчикской коллекции. В, ä, R из Английской коллекции.

С помощью 5 фагов Enterobacter типировалиеь 66 штаммов клебенелл, или 48,8% исследованных культур (86,8% чувствительных к этим фагам штаммов). Выявлены 22 фаговара, которые включали от \ до 10 штаммов. В ряде случаев результаты гнпирорания клебенелл фагами Klebsiella и Enterobacter совпадали. Так, штаммы 60 и 6! относились к одному фаговару о обоих случаях. Однако, отмечались и различия. В частности, штаммы 403. 406 н 407, выделенные в Черкесске, при тнпнровашш фагами Enterobacter принадлежали к одному фаговару, тогда как при типирошпши фагами Klebsiella они относились к разным фаговарам.

Биологические свойства бактерий рода Ешсп>Ьааег, Использованные в работе культуры энтеробактеров в основном соответствовали общепринятым характеристикам этих бактерий. По морфологии и культуральным свойствам они мало отличались от клебенелл - слизистый рост энтеробактеров в целом был менее ¡пораженным по сравнению с клебенелламп. По биохимическим tuoiicruau исследованные штаммы энтеробактеров в основном соотвектвовали приводимым в литературе характеристикам. Так же.как и у клебенелл,не представляется возможным провести какое-либо разграничение энтеробактеров по их биохимической активности. Между культурами отдельных групп заметных различий по биохимическим свойствам не обнаружено.

Определение чувствительности энтеробактеров к антибиотикам проведено с теми же 18 препаратами, с которым)! исследовались клебенелл ы. Полученные результаты свидетельствуют, что исследованные культуры энтеробактеров в основном устойчивы к использованным антибиотикам.

; Изученные штаммы -энтеробактеров были наиболее устойчивыми к* пенициллину и оксациллнну, а также к макролидам (91,9-95,6%). В то

же время среди этих культур было значительно меньше устойчивых к ампициллину и карбеиицнллину (55,2°о и 42,8%), чем среди клебсиелл. Наибольшую чувствительность энтеробактеры проявляли к амино-глнкозилам. особенно к гснтамищшу и каиамшшиу, к которым устойчивыми оказались лишь 19.4% исследотшых штаммов. Несколько' больше устойчивых культур эитеробактеров оказалось к стрептомицину, неомииину и канамнцину (соответственно 35,4%, 37,9%, 29,2%).

Между штаммами отдельных групп эитеробактеров отмечены определенные различия но чувствительности к антибиотикам. Так, в I группе культур все штаммы были устойчивыми к ампициллину, 95,2% - устойчивыми к .иефалскснпу.Штаммы этой группы были относительно мало устойчивыми к полимиксину -14,3%. Следует отметить различную чувствительность культур 1 группы к тетруциклшшм -число устойчивых к тетрациклину штаммов было значительно ниже, чем к докси-циклину -28.6% против 52,4%. Штаммы этой группы были мало устойчивыми к канамицину » гснтамицину, а также к мономшшну - 19%.

Множественно устойчивые к антибиотикам штаммы среди энте-робактеров составляли 36% - 58 культур. Особенно мало таких штаммов было среди музейных культур (1 группа) - всего 2 штамма (9,5%),' что достоверно ниже,чем среди штаммов II п 1Н групп. Следует обратить внимание на высокое содержание множественно устойчивых штаммов среди культур, выделенных из объектов внешней среды -66,6%, что достоверно выше, чем в остальных группах (Р < 0,05).

Частота распространения множественно устойчивых штаммов энтеробактерои была близкой к таковой у клебсиелл - 36,01 3,8% и 41,5 -4,2%.

Изученные культуры энтеробактерои характеризовались достаточно широкой гетерогенностью чувствительности к антибиотикам. Они проявляли чувствительность к ампициллину, карбеиицнллину, цефалексину, амнпогликозидам, рифамшщнну, рлстомицину, полимиксину, в меньшей степени к левомицетину. Наборы антибиотиков, к которым были устойчивы штаммы эитеробактеров, оказались весьма разнообразными и выделить какие-либо резистснс-тнпы этих бактерий не предетаилчдось возможным. Вместе с тем, среди 24 культур эн-'теробактерои. изолированных из объектов внешней Среды в отделении интенсивной терапии детской больницы, 18 обладали близкой чувствительностью к антибиотикам н могут рассматриваться как единый резистенс-гнп.

Определение факторов патогенности эитеробактеров проведено по тем же тестам, что и клебсиелл.

Из 161 изученного штамма эитеробактеров адгезнвноактивными в отношении эритроцитов человека оказались 84 (52,2 ~ 3,9%), что достоверно выше, чем у клебсиелл (Р < 0,05), у которых этот показатель был Э-1,8 4 3,7%.

Среди музейных культур оказалось всего 6 адгезивноактивных (28,6 i 9,8%), ниже, чем в других группах. Среди музейных штаммов энтеробактеров, как и клебсиелл,высокоадгезивных не было, а в остальных группах они составили: во Н группе 3, в IJI - 8 и в IV - 5, т.е.нссколько больше, чем у клебсиелл. Средние значения 1АМ для культур энтеробактеров в целом составили 2,86*0,11, что находится на уровне среднеадгезивных штаммов н достоверно выше, чем у клебсиелл (Р < 0,01).

Гемагглютннационная способность энтеробактеров была выражена примерно так же, как у клебсиелл. Эритроциты человека агглютинировали 34,8% штаммов энтеробактеров, в большинстве случаев гемагглютлнины были маннозочувствительными. Лучше всего те-магглютннационная способность отмечалась у музейных культур -61,91 Ю.5%.

Эритроциты барана агглютинировали 52 штамма энтеробактеров (32,3%), что также близко к показателям клебсиелл. У 36 таких штаммов выявлялись маниозочувствительные гемагглютииины. Более выраженной способностью агглютинировать эритроциты барана обладали культуры 1 и II группы, причем различия были достоверными (Р<0,05).

Способность адсорбировать краситель конго красный у энтеробактеров была более выраженной, чем у клебсиелл - ей обладали 45,3% штаммов, тогда рак у клебсиелл - лишь 20,7%. Наиболее высокой способностью к адсорбции конго красного характеризовались эитеробак-теры, выделенные из внешней среды - 78.8%.

Антилизоцимиая активность выявлена у 89 штаммов энтеробактеров (55,3%). Среди музейных штаммов такой способностью обладали 14 культур (66,6%), среди штаммов 11 группы - 16 (48.5%), 111 группы -29 (49,1%), IV группы - 30 (62,5%). Как и у клебсиелл, уровень антили-зоцимной активности был средним и низким - у 53 штаммов она составляла 1-2 мкг/мл, у 36 - 3-6 мкг/мл.

Гемолитическими свойствами обладали 17 штаммов энтеробактеров (17,4%) - примерно так же, как у клебсиелл. При этом а-гемо-лизины выявлены у 21 штамма (13,0i 2,6%), а тиолзависмые гемолизины - лишь у 7 культур (4,3- 1,6%). Если частота выявления а- гемолизинов у энтеробактеров и клебсиелл была близкой, то тиолзависимые гемолизины у энтеробактеров обнаруживались достоверно реже, чем у клебсиелл (Р < 0,05).

Согласно приведенным выше критериям было проведено патотн-пированне культур энтеробактеров. Исследованные культуры энтеробактеров принадлежали к 15 из 16 выделенных патоваров - не было ни одного штамма патовара Зг. Значительная часть культур энтеробактеров отнесена к патоварам 8г и 8s, для которых характерно отсутствие исследованных факторов патогенности. На долю таких культур 1

приходится 44i 3,9% имевшихся в нашем распоряжении штаммов эн-теробактеров.Среди клебсиелл таких культур было значительно меньше -22,9i 3,6%,что достоверно ниже,чем среди энтеробактеров(Р< 0,01). Наибольшее количество штаммов этих патоваров приходится на культуры II и IV групп, где они составляли соответственно 48,4% и 62,4%.' В I и III группах таких штаммов было соответственно 33,3% и 30,5%.

Больше всего культур энтеробактеров принадлежали к иатоварам 5г и 5s, которые Характеризовались наличием выраженной адгезивной активности - таких культур было 39 (24,3%). Они встречались прежде всего во II и III группах культур. Из других патоваров среди энтеробактеров было 13 штаммов патовара 6s, 10 - патовара 2s, 8 • патовара 4s. Остальные патовары насчитывали 1-5 штаммов.

Электрофорезом в агарозном геле плазмиды выявлены у 71 штамма энтеробактеров (44,1- 3,9%), т.е. с такой же частотой, как и у клебсиелл. Плазыидосодержащие штаммы чаше обнаруживались среди культур, выделенных из объектов внешней среды, - они составляли 60,6 - 8,5%, что превышало показатели остальных групп. Исследованные культуры энтеробактеров содержали большей частью по одной плазмиде - 81,7% пЛазмидосодержаших штаммов, у 12 штаммов выявлено по 2 плазмиды и у I • 3 плазмиды. Большинство штаммов энтеробактеров содержали крупные и средних размеров плазмиды с молекулярной массой 40-t00 МД. Как и у клебсиелл, у энтеробактеров преобладали плазмиды 60 МД, они обнаружены у 52 штаммов, или 73,2% плазмидосодержащих культур и наиболее часто выявлялись у штаммов, изолированных из внешней среды - из 33 таких культур 21 содержала плазмиду 60 МД. Из 24 штаммов энтеробактеров, выделенных в одном отделении, 17 содержали такие плазмиды.

Фаготипироваше бактерий рода Enterobacter. Типироваиие 161 штамма энтеробактеров проведено с использованием 4 коллекций фагов Enterobacter и Klebsiella. Среди исследованных культур фагочув-ствнтельными оказались 153,что составляет 95,0%, причем среди культур I и IV групп фагочувствительными были все испытанные, среди культур II группы - 32 из 33 (96,9 ± 3,0%), а Ш - 52 из 59 (88,1 -± 4,2%).

Фагами Enterobacter лнзировались 132 штамма (таблица 2).

Таблица 2

Чувствительность культур энтсробактера к типовым фагам

Фаги Enterobacter

фаги Klebsiella

Гру-1Чис-| Нальчикская | Английская i Нальчикская | Английская

ппа Jло | коллекция ! коллекция ! коллекция J коллекция

¡ымов; ! ъ ; ; i ; j s j ; %

. ! ! n ! (X: m) i n ! (X; m ) ; n; ( X1 m) ; n! ( X- Om)

I 21 11 53, ,4-10, 9 18 85, 7-7, 6 14 66, 6- 10,3 13 61, 9- 9, 4

XX 33 31 93, ,9-4,1 30 30, 0-6, 0 27 81, 8- 6,7 6 18, ,2' 6, 7

III 59 35 59, ,3-*6,4 39 66, 1-6, 1 40 67, 8- 6,0 33 55, , 9- 6, 5

IV 48 36 75, ,0-6,2 37 77, . 1-6, 0 33 68, 7* 6,7 36 75, , 0= 6, 2

Все- 161 113 70, 2-3, 6 124 77, 0=3, 3 114 t Q, 8-3, 6 88 54, , 6= 3, , 9

го!

Отмечены различия в чувствительности энтеробактеров разных групп к фагам Нальчикской и Английской коллекций. Так, штаммы I группы лизировались лучше фагами Английской коллекции, а штаммы II, Ш, IV групп обладали практически одинаковой чувствительностью к фагам обеих коллекций.

■ Культуры 1 группы были более устойчивыми к фагам Нальчикской коллекции, чем штаммы П и IV групп ( Р < 0,01), а штаммы II группы - более чувствительными но сравнению с остальными группами (Р < .0,05). Чувствительность энтеробактеров разных групп к фагам Английской коллекции была близкой.

Фагами Klebsiella лизировались 129 штаммов энтеробактеров (80,Ii 3,1%), что практически не отличается от чувствительности этих бактерий к фагам Enterobacter. Среди музейных культур (I группа) число штаммов, чувствительных к фагам Klebsiella, было таким же, как и чувствительных к фагам Enterobacter (18, или 85,7 ± 7,6%). Близким было число культур П. Ш и IV групп, чувствительных к фагам Klebsiella и Enterobacter ( соответственно 27 штаммов, или 81,8-6,7%, и 31 штамм, или 93,9 t 4,%; 46 штаммов, или 77,9 ± 5,4% и 43 штамма, или 72,9 г 5,8%; 39 штаммов, или 81,2 - 5,6%, и 40 штаммов, или 83,3 ¿5,4%).

Из 16J испытанной культуры энтеробактеров только фагами Enterobacter лизнровался 21 штамм (13,0%), а только фагами Klebsiella ■ 19 штаммов (11,8%).

Использованные фаги обладали различными спектрами действия. Фагами Enterobacter лизировались от 41 до 100 культур Enterobacter, тогда как фаги Klebsiella существенно уступали в этом -от 7 до 86 культур. Сопоставление фагов между собой по спектру действия проводилось с использованием индекса спектра действия фага (ИСД).

По величине ИОД фаги Enterobacter Нальчикской коллекции принадлежали к группе с очень широким спектром действия (ИСД>0,4), за исключением фага 121, обладавшего узким спектром действия (ИСД < 0,2), и фага 131 - с широким спектром действия (ИСД= 0,21-0,4). Фаги Английской коллекции обладали широким Н' очень широким спектром действия.

Фаги Klebsiella Нальчикской коллекции принадлежали к группам с узким и с очень широким спектром действия, за исключением фага 3/85 - с широким спектром действия. Фаги Klebsiella Английской коллекции обладали узким и широким спектрами действия в отношении культур Enterobacter и только фаг К 0 24 - очень широким спектром действия).

Различия в спектре действия фагов на штаммы энтеробактеров дают возможность проводить фаготипирование этих бактерий. С целью упрощения процедуры фаготипирования были отобраны типовые фаги Enterobacter использованные при работе с клебсиеллами.

С помощью этих фагов удалось типировать 120 штаммов энтеробактеров (75,5%), или 90,9% чувствительных к этим фагам культур. Исследованные культуры распределены в 21 фаговар из 27 отмеченных у клебсиелл и энтеробактеров. Отдельные фаговары включали от 1 до 24 штаммов.

Из 21 штамма 1 группы типнровались И (66,6%). Эти культуры входили в 10 фаговаров, причем к фагонару 21 отнесены 3 штамма, а к фаговарам 4 и 16 - по 2.

Культуры 11 группы были более чувствительными к фагам - из 33 штаммов типировались 30 (90,9%). Они принадлежали к 7 фаговарам, причем кфаговарам 16 и 17 отнесены 16 штаммов. К этим фаговарам принадлежали 13 из 24 культур энтеробактеров, выделенных их смывов с различных объектов детской больницы.

Штаммы III группы были более разнообразными по фаговарам -38 тнпировалных культур (64,4%) относились к 15 фаговарам.Больше всего таких культур принадлежало к фаговарам 1, 2 и 9 - 6-7 штаммов.

Также разнообразными оказались культуры IV группы, среди которых выявлено 14 фаговаров. Всего типировались 38 штаммов этой 'группы (79,2%). С л еду er отметить, что из 19 штаммов энтеробактеров, выделенных в 1986 г. в Москве, 8 принадлежали к фаговару I и по 3 штамма - к фаговарам 2 н 9.

Культуры энтеробактеров оказалось возможным типировать с помощью фагов Klebsiella согласно схемы, разработанной для культур клебсиелл (глава IV). Данными фагами удалось типировать прак-. тнчески такое же число культур энтеробактеров, как и фагами Knterobacter - 114 штаммов, или 70,8%. Из-13 выделенных фаговаров у энтеробактеров отмечены 12. В эти фаговары входили от 1 до 36

штаммов. Больше всего штаммов энтеробактеров принадлежало к фа-говару 13 - 36, или 31,6% типируемых культур.

Фагами Klebsiella типировались все музейные культуры, которые отнесены к 9 фаговарам - no I - 5 штаммов в каждом. Штаммы II группы типировались хуже (81,8%) и принадлежали лишь к 6 фаговарам, причем 22 из 27 типироваиных штаммов оказались одинаковыми по фаговару (7 ). Это были штаммы, выделенные в одном стационаре.

Из 59 культур 111 группы фагами клебсиелл типировались 41, или 49,5%! Эти культуры принадлежали к 9т фаговарам, причем фаговары 3,4,5 и 6 насч1гтывали по 6-7 штаммов.

Хуже всего фагами Klebsiella типировались штаммы энтеробактеров IV группы - 52,1%. Эти культурыбыли весьма разнообразными и относились к 10 фаговарам.

Результаты титрования энтеробактеров фагами Enterobacter и Klebsiella во-многом совпадали. Это касается, в первую очередь, культур, выделенных в одних и тех же стационарах.

ВЫВОДЫ

1. Исследование 135 клинических штаммов клебсиелл и 161 - энтеробактеров показало, что эти бактерии неоднородны по множественной устойчивости к антибиотикам, плазмидному профилю ДНК и наличию факторов патоген ности.

2. Определена чувствительность клебсиелл и энтеробактеров к 45 фагам Klebsiella и Enterobacter из 4 коллекции, на основании чего усовершенствованы рабочие схемы фаготипирования этих бактерий.

3. Схема фаготипирования клебсиелл и энтеробактеров фагами Klebsiella включает использование 7 типовых фагов, с помошью которых выделены 13 фаговаров с подвариэнтами. Согласно этой схемы тонированы 80,7% культур клебсиелл и 70,8% культур энтеробактеров.

4. Схема тонирования бактерий с использованием 5 типовых фа- • гов Enterobacter разграничивает 27 фаговаров и позволила типировать 75,5% штаммов энтеробактеров и 48,8% - клебсиелл.

5. Результаты фаготипирования клебсиелл и энтеробактеров подтверждают близкое родство этих бактерий.

6. В качестве эпидемиологических маркеров клебсиелл и энтеро-бактеров могут использоваться фаговары, множественная устойчивость к антибиотикам.плазмидный профиль ДНК,сочетания факторов патогенности бактерий. Комплексное использование эпидемиологических маркеров позволяет выявить госпитальные штаммы бактерий.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Исследование адгезивных свойств эшерихий и клебснелл/Накова Л.В., Габрилович МИ./- //Вопросы теоретической н клинической медицины". Материалы юбилейной конференции, посвященной 25-летию медицинского факультета.-Нальчик,1993.-С.№5.

2. Значение внутривидового типирования неотрицательных бактерий для решения эпидемиологических задач /Петрухина М.И., Ба-туро А.П., Лотнев К.10., Габрилович И.М./-//Актуальные вопросы инфекционной патологии.-Нальчик,1993.-C.I5-I6.

3. Адгезивные свойства некоторых представителей услонио-пато-генных энтеробактернй /Габрилович U.M., Блнева Л.З., Габрилович М.И., Накова Л.В., Пилиленко Т.Д., Темирова К.С./-//Фундамеиталь-ные основы жизнедеятельности организма в норме и патологии.-Нальчик, I994.-C.40-44.

4. Кликико-мнкробнологическое исследование роли некоторых энтеробактернй в развитии внутрнбольничиых инфекций / Габрилович М.И., Жетишев P.A., Гукасова А.Г., Накопи Л.В./-//Фундаментальные основы жизнедеятельности организма в норме и патологии.» Нальчик, I994.-C.45-49.

5. Гетерогенность антилизонимной активности в популяциях условно-патогенных энтеробактернй / Габрилович И.М., Возне» В.Б., Габрилович М.И„ Нагоев B.C., Накова Л.В./-// Ж.микробиол,-1994,август-сентябрь, приложение.-С.32-33.

6. Корреляционная зависимость между антилизоцимной активностью и другими факторами патогенности у энтеробактернй / Бозиеа В.Б., Бознев А,Б., Габрилович М.И., Ганрабеков Р.Х., Логиев К.Ю., Накова Л.В., Габрилович И.М./-//Вестник Кабардино-Балкарского государственного университета. Серия медицинские науки.- 1994,-Вып. I.-C.27-28.

7. Фаготипированне в контроле за внутрнбольннчными инфекциями, обусловленными условно-патогенными энтеробактериями / Габрилович И.М., Бакова Ф.Т., Блнева Л.З., Бозиев В.Б., Ганрабеков Р.Х., Жугова Т.Ч. и др./-// Фундаментальные и прикладные вопросы естественных наук (региональные проблемы).-Махачкала, 1994,* Т.1. - С.88-89.