Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия опухоль-супрессорного гена Р53 человека в дрожжах Saccharomyces cerevisiae

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия опухоль-супрессорного гена Р53 человека в дрожжах Saccharomyces cerevisiae"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ

рГ6 од

2 2 ад »35

На правах рукописи КУЧКАРТАЕВ Акбар Иристаевич .

ЭКСПРЕССИЯ ОПУХОЛЬ-СУПРВССОРНОГО ГЕНА Р53 ЧЕЛОВЕКА В ДРОЖЖАХ БассЬаготусао сёгеу!в1ае

Специальность 03,00.26 Молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент - 1993

Работа выполнена в Институте генетики Академии наук Республики Узбекистан, в Мармарскоы научно-исследовательском центре ГОВ1ТАК, Турция.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ/

член-корреспондент Академии наук Республики Узбекистан, доктор биологических наук, профессор абдукаримов а.а. philosophy doctor (PhD), professor ozturk M.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ!

доктор биологических наук, профессор МурВДОв М.М. кандидат биологических наук КАДЫРОВА Д.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт радиологии и онкологии Академии наук Республики Узбекистан.

1995 года в ■Я'

Защита состоится " " 1995 года в ' ~'

часов на заседании специализированного совета при Институте генетики Академии наук Республики Узбекистан по адресу; 702197, Ташкентская область, пос. Юкориюз.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института генетики Академии наук Республики Узбекистан.,

Автореферат разослан " ^«С " Л > 1995 г.

Ученый секретарь специализиронного совета

д.б.н. Юнусханов Ш.Ю.

общая характеристика работы актуальность темы. в течение последних 3-4 лет исследования опухоль-супрессорных генов показало, что в большинстве типов опухолевых клеток обнаруживаются нутационные изменения этих генов. Продукты данных генов экспрессирувтся иа очень низком ~ уровне, полнфункцнональны, что значительно затрудняет исследования функций белков в культуре, клеток гнвотннк. поскольку болыаинсво белков, кодируемых олухоль-супрессорннии генами участвуют в регуляции клеточного цикла, репарации ДНК и является транскрипционными активаторами, то применение дрожжей Saccharo-rayces ceravisiae, экспрессирующих данные гены в результате ген-но-иняенврния модификаций клеток позволяет более- успешно изучать такйё функции, как белок-белковые взаимодействия in vivo, •Функции транскрипционных активаторов, клонировать гены, продукты которых взаимодействует с опухоль-супрассорными белками, используя функциональные тесты в дрожках. В данной работе осуществлена экспрессия наиболее мутируеиого опухоль-супрессорного гена ps3 человека.

ЦЕЛЬ и ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Цель» исследования была экспрессия опухоль-супрессорного гена Р53 человека в клетках дрожжей saccharoayces coreviaiae. в связи с возможный токсичным эффектом гена Р53 на дрозжевые «легки такжа предполагалась сравнительная экспрессия двух мутаитных форм гена PS3. Для этого ставились следующие задачи! .

1. Сконструировать экспрессиоккые кассети в составе "дрожжевой промотор-ген рзз-дрожжевой терминатор", способные иидуцибельио экслрессировать белок р53.

2. Субклоцировать конструкции "дрожзсевой промотор-ген Р53-дрож-жевов терминатор" в дрожжевую векторную плазнйду для тестирования Экспрессии рекомбинантных генов в дрожжах.

3. интегрировать конструкции, успешно экспрассируюаие белок р53 в дрожжевые-хромосомы для их стабильной репликации в клетках. <

4. В связи с высоким уровнем эндопротеаз в клетках дрожжей, способных интенсивно деградировать синтезированные белки при приготовление клеточных экстрактов, делётировать'ген РВР4, ко» дирующий мажорную фракцию эндопротеаз в дрожжах.

5. Оценить уровни экспрессии аллелей рекомбйнантного гена Р5Э (дикого типа и двух мутаитных форм) в клетках дрожжей.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Показана возможность применения промотора гена РН05 дрокжей для экспрессии опухоль-супрессорныя генов. Сконструированы плазыиды, экспрессирующие гены р53 (дикого типа и две мутантнае формы) в дрожжах. Разработан оригинальный селекционный ыетод, позволяющий отбор трансформированных клеток с интегрированным в. хромосому рекоыбинантиыми генами, созданы штаммы дрожжей с интегрированными ь хромосому конструкциями, экспрессируазде белки р53. Сконструированы плазыиды, позволяющие делегировать ген РЕР4 (кодирует мажорную фракцию эндопроте-аз) дроетгей, используя простые селекционные метода.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Показана экспрессия гена Р5Э в клетках дрожяеЬ. Созданные плазыиды it штамма дооиаей, экснрес-сирующиа гони Р53 на высокой уровне позволяют изучать функции белков р53 (взаимодействие с другими белкаии клеточного цикла, участие в репарации ЛПК, транскрипционная активация экспрессии другиэ: генов). Разработанные метода интеграции рекомбинантных генов в промосому и двлецки гена, кодирующего мажорную фракцию эндопротеаз позволяет создавать различные штампы дрожжей для гетерологичкой экспрессии генов.

материал и методика исследований. Нуклеоткдныа последовательности генов были получены из банков данных GEH3AHK и EMBL через кокпагерную сеть хкхениет. Плазкидйая днк, содержащая гены Р53 (дикого типа и две мугантные фэриы) была любезно предоставлена Dr. liahmet Ozturk (Lab.Molecular Oncology, Centre Leon Berard, France). Олнгонуклеотидныэ праймеры для ПЦР были синтезированы в лаборатории молекулярной иммунологии центра TUBXТАК на олигонуклеотндаон синтезаторе саь'АСНЕМ (UK). Аннлифнкацию генов при nöäocu ПЦР, клонирование и субклонирование фрагментов днк, электрофорез днк в агарознок геле, секвенирование днк, выделение небольших количеств плазмидноЯ днк, крупномасштабное выделение плазлндной днк, PAGE-электрофорез и Western-blot анализ белков выполняли согласно Maniatis и др. (Maniatls et al., 1989). Извлочэкие фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы, приготовление клеточных экстрактов дрожжей выполняли согласно Maniatis и др. (Maniatis et al., 1989) со значительными модификациями . для выделение хромосомной ДНК дрожжей использовали метод Huibregtso Ь Engelke (Huibregtse J., & Engelke D.H.,1991). Трансформацию E.coli проводили по методу Inoue Н. и др. (Inoue Н. et al., 1990). Трансформацию дрояжей Saccharoraycea саге i-

siae осуществляли no Stearns и др. (Stearns et al., 1990). качественное определение активности кислих фосфг-таз выполняли по методу Сансоновой (Саксояова и.Г, 1979).

апробация работы. Материалы и результаты по теме диссертации докладовалксь на семинарах института генной инжинепии и биотехнологии Марыарского научно-исследовательского центра TUBITAIC (1993-1994), на заседании ученого совета института генетики (1994).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано одна работа, две работы находятся в печати.

структура и обьем РАБОТЫ. Содержание диссертации изложено на 1ЧБ страницах машинописного текста. Диссетацпя состоит из введения, шести глав, внеодов и предложений, списка литературы, •включающего Z00 научны:; работ. Работа иллюстрирована 4 таблицами, 15 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ В парвой главе -"опуколь-супрассорннЯ ген Р53"- дается характеристика гена Р53, как наиболее иутируешэга опухоль-супрес-сорного гена, как транскрипционного агстисатора, в функции которого входит индукция экспрессии ингибитора протркнкиназ клеточного цикла, как триггерного белка, запускающего апоптозиз, т.е генетически гапрограииированную гибель клеток, как белка-протектора следящего, за повреждение« ДНК, описываются взаимодействия с другиыи белкакт! (онкогенам:!, транскрипционными активаторами и т.д.), обосновывается необхояиыость индуцибельноП экспрессии генов Р53 в дрокжах и праиенение проиотора гена РН05 в этих целях.

Во второй главе - "материалы и методы" - лаются характеристики использованных в работе штаммов дрозсжей и бактерий, плазнид, содержания гены Р53, экспрессионноП кассеты pphos: : :kcs:! !tk»s' челночного вектора рЬЗ, плазниды pFL34, , олигонуклеотидных праймеров, приводятся ветоды, приманенные в экспериментах. .

Глава III.

КОНСТРУИРОВАНИЕ ПЛАЗМИД, ЭКСПРВССИРУЩИХ ГЕНЦ Р53, Сведение.

Экспрессия гена Р53 в дрожжевой клетке вояиаяна только а

то."., случае, если струг:';урлая чест'> гена Р53 ограничена проко-торкой о С.:; а с'п у лрок'жеиого гика с 5'-конца и териияатор!.сГ. областью дрочк'.иого ген;. с J'-".cnua. Для ккдуцибельно;! экспрессии генов Г 53 п: »дколдгр.лось чснолььсБать регуляторные кссяедопа-

телькосги гс-иа №05.

С . .

Конструировании плазккд, cüccojH'jk экспрессировгть гены

Р53 в дрожгах осуществляли по следушему принципу: конструирование 3i:ciiP'ícchohke;j; кассет 3-3Р11Э5: : :3:::Tpi-os к псреклокиро-вание паииет Р :::Р53:::Т и дрожжевые плазкиди.

r::u5 pilos г

3.1. Аипли-^якация генов Р53 (дихкЕ тип, 24Б:ССЗ->'1'СЗ и 245:Аса->ЛСТ) при г.олскн полтше»г;з;;ой цепиой реакгии (ПИР) .

б' качеств" матриц лля пплилсразнсй цепной реакции (ПЦР) были использоваш: плпзмсды для аиплифнкацин гена

Р53 (дикий тип} , рС!И"-240:СаС->ТС0 И рСПУ-249:АСО->ЛеХ ДЛЯ ам-пли^икацни иутанишх аллелей гена р53. структуры плаэикд пред-ставлспи в Приложении диссертационной работы, олигонуклаотидкне прайиерн "(РЗЗ-Псо'и) : СХаДАИСССЗОТСАС-ГСССЛТСВА И

П(?Г:3-аас1): ТСЗГ-ХТСС'Ю'.СТСТвЛаТСАСвС, сянтезирован-1- е

й1 м 'Л ^ ¿-йй,..

¡1 с: ^ ^ ^ с!

!■":■ ' ' "' Т £ -; •.

V ' ■ íí' '

ib¿VMtlXÁv .i

i г

Рисунок 1. Амплификация аллельных форм гена Р53 и их клонирование в нлаэнкду рН34б. Амплкфицированные аллели, гена Р53 . дипого типа (1), 248:CGU->TGG (2) И 249:AGG->AG? (3) обрабатывали эндокукл."лза1";! рестрикции Есо':"*! и SacI и лигировали г плазкидой рЛЗ-'З, предсарптвльпо обработанную теки kg эндонукле-азами (4). размнокашше в бактерия:: плазыиды p::sP53-WX(5), j>;!Sp53-?.4D(6) г. pi;.3p53-249 (7) тестировали рестрикцией энконук-лсвэвии r.colli и Sanl.

ш:е на олягонуклсогнднои сллтезаторр спилсих; fîJ") позьоляля создавать caiT.i рестрикции ПсоПХ в пологзнии -17 от стартового колона лтя и Eaci d положенгм -15 от стсп-кодона Дашша

о;:лгону!:леотид:ш<: праГ:'Я;ы били уиизпрсаль^шыи для амплификации всех тре*: аллелей гэла Р53.

.М!тлн.;.!1!;яц!;и гзяоз Pri3 пополняли по програике 55 С - 4 пин.; ["<•? С - 1 ;п!К, ЬС с - 1 а'Ш, 72 С - 2,5 нм]г35 циклов; 12 С - 1Г. утаи. на тэрнр.ль^о;.; циклере îochr.e VHC-3. Результата пролсталленц ял рисунке 1.

s.Z. Кэнстсунров£Ш5е йактеряальгйхх плазкнд pM3P53-W?, p»iSp53-2-:3 И r.:H-p5i-21-3.

ир л к^аструцрованик рякок'.шлантпн:: 1лез::ид jir,>: гетероло- • гь'шоь экспрессии л дрожжах вакно учнтклать то, что излцзш-шзо ¡-:ол:;чяо сайтов рестргкци:; хвяяу п,>оиоторьг1& область» а структурной *;йстьа присоединяемого гена является одной из предносило:; очтянальной экспрессии. У-гитип-гя это обстоятельство била синто jïîpoEauH пгайкара, »пссяшю рестрякцкотгьв сайти SccBI >t 8»ul в акллг'биаироэаян:;з гони.

плегиядвас вектор рг.'Л43 (структуре. представлена и глава "млллъ'л.ли г. методы" диссертационной рсбота) япллется баптерл-альксл !!ЛаЗ!.!ИДОГ. PBR322, В ЛОТОВУЮ КЛО.трСВЕ'Ш! промоторпйя (541 - -17) и теуаннаторяая (377 п.о.) области гена FH05, разделенных последовательностью полилинкера, клонирование аллелйЯ гена Р5Г. в рестрккциснине сайты ЕссРЛ и SacT допускает сохранение только едипстьснного сайта рестрикции EcoîîX нейду пропаторон гена PHOS и геном Р53.

Для локструировапня плазмпд pHSP53-WT,pMCp53-248 и piiSp53-2'î9, плазмиду pMS46 и продукты ПЦР обрабатывали эндсну-клеаза«к рестрикции EcoTÎX и Cacl, лигировали и аиплифицировалц в бактердяя. Достоверность сконструировал::!.»: плаэгшд тестировали обработкой тени же зидонуклеазаии рестрикции (результаты представлены нр рис.1). Структура плазмид p43P53-lîT, pMSp53-243 п pKSp53-249 показана на рисунке 2.

3.3. конструирование дроетевыя плазиид pLP53-v)T, pLp53-240 И рЬр53-249.

Плазанда pL3, способная реплицироваться как в дровяаз, так и в бактериях, состоят из 3.35 т.п.о. фрагмента. рВК322, 2.0+0.2

т.п.о. фрагмента 2ыикрониой ДНК дровзеП (обеспечивазт репдиза-

fi *<

пив в дро. ках) и 2.2 т.п.о. фрагнента гена LEVZ, чзобхааччуег"

Hmd!!t.Spht -Pitl(20-32)

BmHI2 ISS

^Sphl2331 -s.ll 2421 Hir«ilil.SpM PsttC20r

Sspl 3941 Seal 5621 Prtl 5131 \

\J.

T pto5 678

8)

pMSp33-248

tisotp

\V\

\ aphl 2331

SiSl5?41^ Sell 5421.__

Tpho5n.[/^-,AGG->*OTeTS

1>MSf33-2«9 4i

DRf ^

" Ppho3

. tcoRU65<

^illl«*

\\рМ2П1 5«ll 2421

Рисунок 2. структура плазмид pMSP53-WT (a), pMSp53-248 (6), pMSp53-249 (в); сконструированных в данной работе. Плазми-ду pMS46 и продукты ПНР обрабатывали эндону.слеазани рестрикции EcoRI и SacI, Лкгаровали и полученные ллазмиды pMSP53-MT, pMSp53-24S и pMSp53-249 амплифнцировалн в бактерии. Достоверность сконструированных плазмид тестировали обработкой т^ми же эндонуклеазами рестрикции..

для селекции трансформированных'' клеток. Структура плазкндц pL3 представлена в главе "материала и методы" диссертационной работы.

экспресснонные кассеты, содержащие аллельние формы гена Р53,получали рестрикцией плазчид PHSP53-W1, pMSp53-243 и pMSp53-249 при помощи эндонуклеаз Ball и Hindlll, электрофорезом в геле из легкоплавкой агарозы (ЛПА) и последующей экстракцией 2.4 кв фрагмента ДНК.. Векторнуо плазмнду pL3 обрабатывали теми хе эндонуклеазами рестрикции, что позволяло интегрировать конструкции в tatR-ген бактериальной части плазккди. Достоверность сконструированных пдазмид проверяли при помояи эндонуклеаз рестрикции Sali н HindllI. структуры плаэмид,pLP53-WT, pLp53-24B и рьр53-249 представлены в главе "Идтериалц и методы" диссертационной работы.

Глава IV.

АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ Р53 В ДРОЖЖАХ.

Введение.

Белок р53 принимает активное участие во многих клеточных процессах в клетках животных, что может обуславливать некоторый токсичный эффект на клетку в результате. экспрессии гена р53 в дрожках. Данный эффект можно выявлять при сравнительной экспрессии аллельных форм гена Р53.

4.1. Тестирование токсичного эффекта экспрессии гена Р53 в клетках дрожжей.

Токсичный эффект экспрессии гена Р53 в клетках дрожжей определяли, сравнивая частоты трансформации клеток дроасей плаз-мидами pLP53-WT, pLp53-248 и pLp53-249. Результаты трансформации приведены в таблице 1.

Как видно из результатов оценки частоты трансформации дрожжей, трансформация плазмидой pLP53-WT, содержащей аллель дикого типа гена Р53 обуславливает токсичный эффект на клетку.

4.2. Western blot анализ экспрессии аллельных форм гена ,

Р53.

Промотор гена РН05 позволяет осуществлять нндуцибельную экспрессию чужеродных генов на средах, не содергаиих неорганн-ческийфосфат. выращенные на минимальной среде с фосфатом (Ur.tt-+Р) клетки дрожжей переносили на индуцибелькуо среду, после чего в течение 4-5 часов экспрессироаали аллелыше форм« гена р53. клет> чные экстракты дрожаей приготавливали согласно ието-

ТАБЛИЦА 1.

Результаты оцэнки частот трансформации штамма дрожжей 1-GRF18 плазыидами pLP53-HT, pLp53-248 и pbp53-249.

Плазмида ' частота трансформации

pL3(контроль) рЬР53-ИГ pLp53-248 pLp53-249 з 5.56+0.04x10 3 3.88+0.05x10 3 5.60+0.09x10 з . 5.82+0.07x10

Примечание. частоты трансформации представлены а виде количество трансформантов/микрограмм ДНК.

дике, изложенной в главе "Материалы и методы" диссертационной работы. Предварительно очищенные клеточные экстракты белков > разделяли при помощи РАЗЕ-электрофог-^еза. Далее белки переносили на нитроцеялюлазиые мембраны. Для визуализации белков р53 использовали ноноклональные антитела РаЬ 240, РаЬ 122 и РаЬ 317А9. в качестве вторичных антител использовали имиу! оконьюга-. ты анти-1дО+иелочная фосфатаза. данные Western blot анализа белков представлены на рисунке 4.

Как видно, из рисунка 4 (б), существенных количественных различий в экспрессии между аллеляии дикого типа и мутантных форм не наблюдается, это говорит о том, что конструкции с генами Г53 мокко использовать для исследования функций белка р53.

Глава V.

СОЗДАНИЕ ШТАММОВ ДРОЖЖЕЙ, СОДЕРЖАЩИХ КОНСТРУКЦИИ

Р„,„ ! :SP53 ::;Т В СОСТАВЕ ХРОМОСОМЫ.

pii05 рн05

введение.

• Плазмида рЬЗ является мультиког.икной в дрожжах, что вызывает высокий лозовый эффект рекомбннантного гена в клетках. Низкую копийлость гена можно обеспечить, используя либо центро-мер'-содержаиу» плазниду, либо интегрировать рекокбинантный ген в хромосому дрожжей. Последний способ является более преимущественным, поскольку приводит к более стабильной репликации в

priW)

A.P5-V pt-pSi- ^.tfS-S

£ pLPSB'iVf

5 ' &(t S><ГЗ Pit} i vv ац& 2HJ

a- a c- a.

■ST + _ I -<-" ч -T ■ ' • _ : : TT'i i if-.

: imiiiSB

j г» i:f.|i.s v «. a

" iTI p-' ~ ■ Jr.- re!^ »!Й? "-¿¡3 1ГК Ыогп.^ . i i 4

iyr * **

) . . • 4 Л" It

f

t. twMif»v

. .......1 я гу ■■■ ^ л i.j. j

Г

i -•f ** *

'i jt

4 «« f

i v.vr : жi-' " ^ ^""...ч

« if-^-s.«.- «Г« -"fs-icf'

. * »V !l *

J* t. *

> 1

„

i *?T * 1 2 3 ^ С

»nn

Рисунок 3. western blot анализ экспрессии вллельнык фора гена Р53. Клеточные экстракты белков, разделенные PAGS-элвкт-рофорезом (а) переносили иа иитрсцеллюлознце фильтры и белки р53 визуализировали при помощи антител РвЬ 240, РьЬ 122, РаЪ 317А9 и вторичных антител аити-хдо+шелочная фосфатаза (б).

клетке и позволяет культивировать клетки дрояжей не только в селективных для плазмид условиях, но и в кесёлективных богатых средах.

Интеграцию конструкций с рекоибинантныии генами в дрожжевые хромосомы осуществляют гомологичной рекомбинацией в заранее предполагаемый локус хромосом. Дли этих целей используют дрожжевые интегративные гиазыиды иди .конструкции, в которых ревои-бинантные гены ограничены нуклеотидными последовательностям, имеющими такие же гомологичные последовательности в дрйязхевиа хромосомах, второй способ интеграции более предпочтителен, поскольку исключает потерю конструкций из хроцосоиы в результате обратной гомологичной рекомбинации между повторами, обраэугяи-мися в результате интеграции ннтегративных плазкид (первый спо-

соб интеграции). Более подробное описание вышеуказанных способов интегрирования чужеродных генов в дрожжевые хромосомы приводиться в главе V диссертационной работы.

5.1. Метод выявления трансформированных клеток дрожжей с интегрированными в локус РН05 хромосомы II генами.

В клетках дрожжей синтез изозимов кислых фосфатаз происходит как конститутивно (иэоэимы кодируются геном РНОЗ), так и репрессируется наличием неорганического фосфата в культуральной среде. Более 80% репрессибельных кислых фосфатаз кодируются геном РН05. синтезированные кислые фосфгтазы секретируются на поверхность клеток, т.е. в культуральную среду, что позволяет регистрировать экспрессию генов, кодирующих кислые фосфатазы непосредственно на поверхности колоний (на средах с агаром) бла-годарч колориметрической реакции:

кислая фосфатаза

a -Naphtyl Phosphate + H О----------------->а -Naphtol + Pt

2

oij-Maphtyl + Fast BlueB TR-----------------> Diato Dye,

фиолетовая окраска.

В штамме дрожжей, имеющем мутацию в гене РНОЗ, происходит экспрессия только генов репрессибельных кислых фосфатаз. в де-репресснрованнаг, условиях инактивация гена РН05 приводит к резкому уменьшению-синтеза кислых фосфатаз'. Данную гипотезу подтверждали, сравнивая реакции окрашивания штаммов 1-GRF18 и n31-l-GRF18, различающихся делециеВ гена РН05 в штамме П31-1-СН?18. оптимальный уровень различий в окрашивании тестировали варьированием концентрации a-Waphtyl Phosphate (O.lmg/ ml; 0.5mg/ml; 1ид/ml; 2mg/ml; 3mg/ml) в реакционной среде . (a-l'aphtyl Phosphate(Xrag/ml) + Fast BlueB ТВ (2ng/ml) в 0.0SM цитратном буфере, pH;4.5). Наибольшие визуальные различия в окраске штаммов били выявлены при применений реакционной среда v (a-Naphtyl Phosphate(lmg/ml) + Fast BlueB TR(2mg/ml)).

Структура конструкции Ppho5»isMCSîî:Tpho5 позволяет интегрировать клонированные в MCS чужеродные гены а локус РН05 хромосомы II. В результате направленной при помощи промоюрной н герминаторной последовательности гена РН05 интеграции конструкций в хромосому посредством гомологичной рекомбинации ген РН05 будет делетирован и скрининг интегрантов будет заключеться в обнаружении колоний со слабым окрашиванием.

5.2. Интеграция конструкций P„_s t :P53s: ¡т , содержа-

PHOS PHOS

щих аллельные формы гена Р53 в хромосому II дрожжей.

Конструкции Рр,,^: s :Р53:: ¡Тр,^ способны интегрировать в локус гена РН05 только в линеаризованной форме. Поэтому плазми-дн pMSP53-WT, pMSp53-248 и jpMSp53-249 обрабатывали эндонуклеа-замн рестрикции Sali н Hindlll, фрагменты ДНК разделяли в ага-розном геле из легкоплавкой агарозы и конструкции pptos: ! :р53: s :tphos с аллельинми формами гена Р53, представленных Sali-Hindlll фрагментом ДНК, экстрагировали из легкоплавкой агарозы. очищенными фрагментами ДНК (1-5 мхДНК) н плезмидой pL3 ^трансформировали штамм 1-GRF18. Плазкида рЬЗ была необходима для селекция трансформированных клеток дрожкей. Поскольку частота котрансфорнации составляет 0.01-5%, то колоний трансформантов переносили на богатую среду без фосфата методом реплик, подращивали и далее тестировали активность кислых фосфатаз непосредственно на поверхности колоний. В результате данного эксперимента были отобраны-по три клона для каждой аллели гена Р53 со слабой окраской. Наличие интеграции конструкций проверяли при помощи полимеразной цепной реакции.

5.3. Подтвервдение интеграции конструкций Pp^s :?53::! Трно5' удержам* аллельные формы гена Р53 в хромосому дрожжей.

Как правило,, интеграции генов в хромосомы доказывают Southern blot анализом, т.е. гибридизацией ДНК. Однако при отсутствии гомологии между интегрируемым геном и хромосомной ДНК акт интеграции можно успешно выявлять при полови полимеразной цепной реакции.

Выделенную и тщательно очищенную хромосомную ДНК из трансформантов с интегрированными аллелями гена Р53 амплифицировали олигонуклеотидными праймерами F(P53-EcoRI) и R(P53-SacI) по программе, изложенной в главе in. Амплификация фрагмента ДНК величиной в 1.2 т.п.о. во всех отобранных трансфориантах доказывает интеграцию конструкций Ррко5:! ¡P53s s «T^j в хромосому дрожжей.

глава vi.

ВВЕДЕНИЕ ДЕЛЕЦИОННЫХ МУТАЦИИ В ГЕН РВР4, КОДИРУЮЩИМ МАЯГОРНУЮ ФРАКЦИЮ ЭНДОПРОТЕАЗ В ШТАММАХ ДРОЖЖЕЙ.

Введение.

Успешная экспрессия чужеродного гена предполагает наряду с конструированием рекомбинантного гена, транскриппионяо активно-

го в дрожжах, защиту синтезируемого белка от протеолитического расщепления протеазами дрожжей.

. Дрожжи S«ccharomyces serevisiae содержат большое количество протеаз, локализованных в различных компартаментах (цитозо-ле, вакуолях, митохондриях, эндоплазматическом ретикуле, ком-, плексе Гольджн) и мембранах (плазматической мембране, вакуолях, эндоплазматическоы ретнхуле, Комплексе Гольдхи}. Это эндох^о-теиназы, карбоксипептидазы, амннопептидазы и дипептидилаыино-пептидазы.

Наибольшим источником проблем среди клеточных протеаз являются вакуоляркые протеазы: эндопротеиназы лив (РгА и РгВ), карбоксипептидазы У и S(CpY и Cps), аыинопептидаза I(600kDa) и аыинопептидаза уасСо(АрСо). структурные гены, кодирующие большинство протеаз, генетически изучены. Полипептидные ингибиторы этих пептидаз локализованы в ццтозоле, что приводит к немедленной активации протеаз при приготовлении клеточных экстрактов. Почти все перечисленные протразы ингибнруются такими ингибиторами протеаз,- как PHSF ч EDTA. Исключение составляет эндопро- • теиказа А (РгЛ), кодируемая геном РЕР4. Данная протеаза ингиби-руется только пепстдтинон. другая проблема, связанная с РгА заключается в отсутстэие пряных тестов оценки уровня протеазы в клетках. Поэтому предполагалось инактивировать ген РЕР4 делеци-ей.

Введение делециП в ген РБР4 дрожжей осуществляли по следующему принципу! сначала конструировали штамм с мутацией в гене UBA3, позволяющий использовать интегративную плазмиду pFL34; далее создавали па базе pFL34 плазмиду с делетированным в 5'- и 3'-положении геном pep4-D; наконец интегрировали сконструированную плазмиду в локус РВР4 штамма дрожжей с мутацией игаЗ при помощи гомологичной рекомбинации. Метод введения делений в ген РВР4 дрожжей представлен на рисунке 4.

6.1. Создание штамма дрожжей 71F-1-GRF18, несущего мутацию > гене UHA3.

6.1.1. Конструирование интегративной плаэмиды, содержащей "fгам shift" мутацию в гене URA3.

Специальные минимальные среды, в состав которых входит 5-fluoroorotic acid позволяют отбор мутантов дрожжей с мутацией В генах иалз и UKA5. поэтому предполагалось создать мутантную «медь гена UXA3 в составе плаэмиды и интегрировать ее в хромо-

у/

5-гоа

- илл.

Гисунок 4. Методика введения делений' в ген РЕР4'дроккей. для использования интегратнвной плазкнды рН|34 конструировали штами с мутацией а геке ШМЗ. Далее сЪздавали на базе рРЬ34 плазмиду с дэлетированиы* в 5'- в З'-полохенйи геноц рер4-0. Наконец интегрировали сконструированную алазмиду в локус РЕР4 штамма дрожжеЯ, несущего мутацию игаЗ при помощи гомологичной рекомбинации.

соку дрожжей. Для этого использовали плазмиду pD210 (производную pFL34; структуры плазмид приведены в диссертационной работе).

Плазмиду pD210 обрабатывали эндонухлеазой Hcol, вносящей "острые концы" в место разрыва ДНК (положение 65 кодона гена UK&3), достраивали концы ДНК-полимеразой и лигировали. сконструированная плазмида p71F содержала аллель ura3-71F с "frame qhift" мутацией в гене URA3. данная мутация приводила к образа ванию ноисенс-кодона в положении, соответствующего 71 кодону гена ЦЛАЗ.

6.1.2. Введение мутации ura3-7lF в локус URA3 хромосомы дрожжей.

Мутирование гена ОВДЗ выполняли заменой аллели дикого типг аллелью ura3-7lF с'"frame shift" мутацией при помощи гомологичной рекомбинации (более подробное описание метода замены аллелей приводиться в диссертационной работе). Для этого аллель ura3-71F вырезали из плазмиды р71Р эндонуклеазами рестрикции EcoRl и Bglll и трансформировали дрожжевые клетки штамма 1- . GRFlfl. Позитивную селекцию мутантов осуществляли высевом трансформированные клеток' на минимальную среду с 5-fluoroorotic acid. Генотип отобранных мутантов, условно названных '71F-1-GRF18 проверяли классическими генетическими методами иа минимальных средах.

6.2. Делегирование гена РЕР4 дрожжей.

делетироваииз гена в дрожжах можно осуществить интеграцией плазмиды в данный ген, если интегративная плазмида содержит укороченную с 5'- и 3'- концов последовательность делетируемого гена, имеется внутри гена уникальный сайт рестрикции, ограниченный 150-200 нуклеотидами с каждой стороны и трансформацию дрожжей выполнять линеаризованной плазмидой по уникальному сайту. Данные условия приводят к направленной интеграции в локус делетируемого гена и образованию двух последовательно расположенный копий гена с делоциями 5'-части в одной, и с делецией 3'-части в другой копии гене.

6.2.1. Амплификация фрагмента ДНК, содержащего укороченную форму гена FEP4.

Нуклеотидная последовательность гена РЕР4 была получена из банка генов DffiL через компьютерную сеть IHTERHET. в кодирующей части гена РЕР4 был идентифицирован уникальный сайт рестрикции

Hirdlli, относительно которого на расстоянии в 200 нуклеотидов по обе стороны определяли структуру олигонуклеотидных прайме-ров. Амплификацию гена рер4 выполняли при поиопи праймероз ?(PEP4-ECORI): GTGAATTCTAGGGAGCATCCTTTC И П(РЕР4-Хрп1):

ggaggtaccaccttatclacag. Результатом амплйфикации бил фрагмент ДНК величиной в 400 п.о.

6.2.2. Конструирование интегратрвной плазнидн pPep4-D, содержащей делетированиый ген рер4.

В связи с тем, что сайт рестрикции Hindlll должен быть уникальным в интегративной плазмиде для линеаризации, плазмиду PFL34 модифицировали делацией BamHl-BglXl фрагмента, величиной в 210 п.о. Полученную плазмиду pD2lo и аиплифицированный ген pep4-D обрабатывали эндонуклеазами рестрикции Ecolil и КрШ, ли-гировали И далее аыплифицировали в бактериях. Структуры сконструированных плазмнд pP°p4-D и pD210 представлены в дкссерта-ционной работе.

6.2.3. Интеграция плазмиды pPep4-D в локус РЕР4 хрэкосомы дрожжей.

Плазмиду pPep4-D линеаризовали эндонуклеазой HindXIX, экстрагировали смесью фенол-хлороформ, осавдали этанолом и ДНК растворяли в концентрации 1мкг/мкл. клетки штанка 71F-1-GHF18 трансформировали 1-5 мкг. линеаризованной плазкидной ДНК и высевали на полную синтетическую среду без урацнла. В результате интеграции плазмиды pPep4-D в хромосому происходит одновременная интеграция плазмидного гена URA3 в тот же локус, что приводит к восстановлению прототрофности по урацилу. Таким образом, на.полной синтетической среде без урацила нарастают только трансформанты с делетпрованным геном рер4.

ВЫЗОДЫ.'

1. дллельнае формы (дикий тип, MyTaHTHüe-248:CGG->fGG и 249:agg->agt) опухоль-супрессорного гена Р53 человека способны экспрессироваться в клетках saccharomyceo sereviaiae под контролем регуляторных элементов гена РК05 дроякей. При этом осуществляется индуцибельная экспрессия аллэлбй гена Р53.'

2. Сконструированы плазмиды pMSP53-t?T,pMSp53-243 и pMSp53-249, позволяющие интегрировать конструкции Ppnoj:s:?53:

: :Тр1|05 в локус РН05 хромосомы II дротясей. Селекция трансформированных клеток дрожжей с интегрированными генами Р53 выполнена оригинальным методой, разработанный в данной работе.

3. Созданы штамын дрожжей с интегрированными в хромосому аллелями гека Р53, способные индуциоелыю экспрессировать белки р53.

•1. Сконструированы мультикопийные дрсж/.евке плазмиды pLP53-¡5T, pLp53-2-18 и pLp53-249, содержащие ре.-омбинанткыь гены F :::Р53:::Г с аллелышми Формами гена Р53. При оценка

PHOS mos • с г

частоты трансформации дрожжей данными плазмпдами выявлен слабый токсичный эффект экспрессии аллели дикого типа гена Р53, однако существенных количественных различий в експрессии разных белков р53 не наблюдали.

5. Для защита белкоз, синтезируем™ при экспрессии чуие-родшнс рекомбкнантныя генов от действия протеаз, созданы сэрнл плазкид, позволяющих делегировать ген РЕР4, который кодирует мажорную фракцию вакуолярншг эндопрэтеаз в клетка:: дробей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ÍÍPE Д ЛОИЕ ЙИЯ

1. Регуляторные элементы гена РН05 дрсижей ыо.-ут быть использованы для гетерологичной экспрессии опуяоль-супрессорных генов в клетках дрожгей. При том экспрессия даика^ генов .может осуществляться как с мультнкоиийноЯ плаэмиды, обеспечивая высокий дозовий эффект гена, так и с хромосом«, позволяющая стабильную репликацию в дрожжах н низкую копийность гена.

2. Серия рекоцб.чнактных плазкид, обеслечнлаашнэ дебетирование гена РЕР4 и таким образом, уменьшенную деградацию синтезировании:: балков позволяет вводить мутации в другие штамын дрожжей, в которых предполагается гетеролэгичная экспрессия генов. Такой способ делегирования ;шеет неоспарииое преимущество по сравнению с традиционными генетическими мотодани.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Самбук Е.Е., Кучкартаев А.И., Падкина М.В., Смирнов к. Н. (1991). картнровамне генов, регулирующих экспрессию синтеза кислых фосфатаз в дрожжах Saccharoayces serevisiae.// генетика .-т .4 .-с .11-lß.

2. Kuchkartayev A.I., Abdukarinov A.A., Ozturk И. (1995). Expression of huaan tunor-supprensor gone P53 in yeast Saccha-rcaycen coraviolaa.(in preraration).

3. Kuchkartayov A.I., Abdukarimov A.A., Ozturk M. (1995). Construction of yoant otraino expressed the huaan tucor-oup-pre зог gene P53.(in preparation).

Кучкортоев Акбарак-.лГ биология фанлари нонзодн плний дара-жасгаш одни учун тайерданган "Ачигки Saccharomrces aerevl-.siaeca одам,.ллг ::2иарпк-сулрессор Р53 гек>шл экспре .слъсл" мавзуичаги .тпссертацкяслшгаг КПСК'."А. ИЛЗИУНИ диссертация кир'-в, 5 боб. гулоса, ^опдала;1ган адабяо^яар ргйхати, илоЕаяан иборат булнб, 4 та жадвал ва 15 та раскни как уз ичига о,пали. Ушгнг унупшЧ хз^-.чи 145 бет ■.

P5S гени опи'льжг узгарэтЕга энг куп учралдиган. каварпк су-прессор генларк оипаспга киради. Кейииги паятларда энг куп тек-ширилаетган Р53 ген:; тоиспиааи кодластЕРИладиган Р53 оксшгл транскрипцион активатор :с:соблаигаи. К/.танра такрорида тстирок этадиган протеиназлар икгпзитсги гепшишг эксирэссиясн к зла iry оксил тоионидал богякариладп. Ху.-сайра такрорикн тзртисга солга билан бир каторда РЗЗ оксяли ¡суп гчимлилик хусусиятвга эгадир, б у кусусият ху'жайрачинг гепэтик тонондан pexanax'sn улик;' (апо-птоз1х)ни келтьрнб чшсаради.

ДНК ни бУЗУЕЧИ агентлар т£:ъси?1:ка яужапра ичида Р53 шшг пипшгаи ва Р53 -лжопидан GADD'i5 генпшшг боЕцарнлиз: Р53 нипг ДНК-репараштасадз iectkpok этишши курсг.тадп деб уйдаймиз. рзз гони паст даражада яаракат килгди, зузайра ичкдаги оксилларшшг куп сопли бирлалмаязрда иятпроч стали. бу кол пайвои ¡кужайрала-ридан Р53 оксилиш: ургакишш кийнклаштираяи.

Тадкикотда ачиткгсан Фойяалзкгал оксилки ургаяикда цулаялик тугдиради. Ачиткида муза Заклят силаи куллгкган функционал тестлар ердамида Р53 оксклгапкг бсска скс:кларга алокаск, гон-ларнинг транскрипцион актиелигини оаирнл за репараспяда штирок этшигаи текширип осонлаютзи маьлум булди.

Уибу таяки:;отда ачиткида Р53 гешишнг экспресснясинн урга-н;пз натижалари келткрилади. РЗЗ нинг ^ухайрага закарли таьсири яка нкки Р53 нутзнт Форнасининг (246:CGG->TGG and 249:AGG->AGT) таьсири билан киёслаб текЕирилди. Р53 шгнг захарли таьснрюш яг-котка учун бу ген экспрессилскни яаракатга келтирип наксашша ачиткини рноэ гени пронотори билан тартибга солинади. бу проно-тор кужаяра ташкаридаги суньий нукитда анорганик фосфат билан активлаптирилади. •

Ачиткида Р53 гени бирлашналаршш экспрессиясшга текзнрнш учун улаг ачитци векторйга киритилди. . К у бярлаачалгр иппгрокида ачитки тган.т^орнапияси аналга оиириллн ва табии« Р53 генияинг

захарли таьсири унинг мутант турларига киеслаб аникланди.

Рекомбинакт Р53 гени ¡^аракатонинг western blot тацлили Р53 генининг турли формалари харакатида жиддий Фарцлар иу^лигини курсатди.

Такмалар (интегрантлар) селекцляга тагнган махеус метод б ил an Ppiio :: :Р53:: :Трно бирлашмалар ачитки хромосомаларга та-килди. Бирлашмаларнинг хрсиосоналарга та^илшии занжирли полиме-раз реакцияси ёрдаиида исботланди.

Протеазпарнинг «ужайрадаги гксак дарахаси генларнинг гете-рологик экспрессияси учун тусик; булади, Бу тусик;ни йукотига учун протеазларнинг кодлаштирилган генларини б/зшя талаб цилинади. Ачитки ^ужайраларда 80Х протеазлар PäiP4 гени билан кодлаштири-лади. Ачитки 5?у5хайраларидаги. РЕР4 гешши мутант цолига келтириш учун янги штанмларни класс ж генетика методлари билан у,осил я;ц-линади еки бу ген генлар инжинерлигп методлари бклан бузнлади. Биринчи нетодлар куп вак;т ва куч талаб .%иладиган булгани учун биз иккинчи нетодлардан ^ойдалаиишни афзал курдкк. Бир канча танка плазнидлар ^осил пилиниб. бузил учун мзхсус селектив иущгглар шшатьлдк.

Уибу тад^кк;от курсатдики. РН05 гени проиотори ердамида Роз навариц-супрессор гени гчиткияа муваФФаКият билан ¡^аракатга кел-ткрилапи. Ачкткининг хоснл эт^лган янги пгаммларй ва плазмидала-ри р53 отепли функпияларкии ургаяшп учун ва ^осиласи p53 ок-сили билан алоцага киришадиган генларни клонлаштириш учун кала-тилади. Шплаб чикилган таккалар селекпияси нетоди ёрдаиида ан-органик фосфатларга хавобан х.аракатга келузчи генларнинг Ероносоиаларга такмлган ^олда янги штанмларни ¡$осил этишда г,уп-данади.

petp-t генини бузит учун косил килинган плазмидалпр ачитцида генлар гетерологик экспрессиясини урганишаа кулланадиган атанм-дарга РЕР4 геняки тез ва кулай бузил шпини таышнлайди.

ХУяоса килиб айтганда. каварик-супрессор генларининг функ-пияларини ачиткзша урганшл учун керакли шарт ва плазмидалар иш-даб чикилди.

SIJKMARY

of the thesis "Expression of the human tu.nor-supre3i.or P53

gene in yea3t. Saccharonyces serevisiae" submitted by Akbar

Kuchkartayev for the degree of Candidate? of Biology.

The thesis consists of introduction, six chapters, conclusions and reccmir.erclations. It io typewritten on lt(&pages and includes 4 tables, 15 drawings. There are £0owork3 in the list of references.

A P53 is' the most frequently mutated tuir0r-3upres30r gene in huraan cells. The product of gene P53, p53 protein, has been studied vast during last three years is a transcriptional activator starting the expression of inhibitor call cyclo protein-kina^es. Besides the participation in the regulation of cell division protein p53 appears the trigger function able to raise genetically programmed cell death (apeptosio). The accumulation of p53 in cells under treating by DîiÂ-danuiging agents point to the participation of p53 in reparation of DRA. Thé low level expression and multifunction of p53 lead to difficulties in study functions of p53 in cell culture» For this reason the application of yeast Saccharomyces serevisiae proir,ote3 significantly the study such functions as- interaction with other proteins, transcriptional activating of gene3, participation in_ reparation of DKA because of the functional assays in yeaat have been elaborated well.

In this study the investigation of expression of P53 gene in yeast has been showed. There is possibility for toxic effect of p53 to cell so the comparible expression of two mutated forms of p53 (248:CGG->TGG and 249;AGG->AGT) have been investigated. To avoid such effect the expression of P53 under inducible promoter of PHOS'gene activated in response to inorganic phosphate in medium ha3 been considered.

The constructions able to express P53 genes in yeast have been tented after siibcloning its in shuttle vector pL3.

The transformation of yeast cells with constructed plas-mids has been showed that there is some toxic effect of P53 gene (wild type) comparing with mutated forms. However Western blot analysis of the expression of recombinant gene3 ha3 been demonstrated that there are no differences between the expression of all P53 genes.

Tested constructions have been integrated into yeast chromosome by method allowing selection of integrative forms. The integration into chromosome has been proved by polymerase chain reaction (PCR).

.The significant trouble in heterological expression of genes in yeast are high level of proteinases in cells. This evidence could be dissolved by deletion of genes coding proteinases. Gene PKP4 codes the major fraction of proteinases (80*) in yeast cells. There are possibilities to introduce mutation in PEP4 gene either by traditional genetlcal methods or to Realize vgene disruption by genetlcal ingeneering methods. As first methods are routine gene PEP4 has been deleted by using some plasmids constructed in this work, and special selected mediums.

This work has been demonstrated that the application of PH05 promoter allows successfully to express tumor-supressor genes in yeast« The plasmids and yeast strains constructed will use for study of functions of p53 protein, cloning genes coded proteins which are interacted with p53. The method for selec- . tion of integrative transformants allow to construct yeast strains expressed any genes in response to inorganic phosphate in cultural medium. Plasmids constructed for' deletion of PEP4 gene will be used for thé fast introduction of deletions in yeast strains in which the iieterological expression of genes is -proposed.