Экспериментальное обоснование разработки и усовершенствования селективных питательных сред для диагностики листериоза

Исаева, Роза Изитдиновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экспериментальное обоснование разработки и усовершенствования селективных питательных сред для диагностики листериоза
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Экспериментальное обоснование разработки и усовершенствования селективных питательных сред для диагностики листериоза"

На правах рукописи

Исаева Роза Изитдиновна

Экспериментальное обоснование разработки и усовершенствования селективных питательных сред для диагностики листериоза

03.02.03 - микробиология

4844762

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 8 АПР 2011

Ставрополь-2011

4844762

Работа выполнена

в ГОУ ВПО «Дагестанская государственная медицинская академия» и НПО «Питательные среды» филиале ФГУП «НПО «Микроген» МЗ СР РФ.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Омарова Салидат Магомедовна.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Терентьев Александр Николаевич;

кандидат медицинских наук Одинец Алексей Васильевич.

Ведущая организация:

ФГУН «Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии» Роспотребнадзора.

Защита диссертации состоится сА&^ХлВС/_2011 г.

в 4$.1 00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.256.09 при Ставропольском государственном университете по адресу: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина, д. 1, корп. 2, комн. 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета.

Автореферат разослан СЫ^ЬгиОяА^ЭС^_2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Ржепаковский И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В современных условиях на фоне успешной борьбы с инфекционными заболеваниями значимость микробного фактора в патологии человека не только не снижается, но и проявляет тенденцию к росту (Черкасский Б.Л., 1995; Покровский В.И., 2000; Онищенко Г.Г., 2002). На передний план выдвигаются новые, относительно недавно открытые, малоизученные инфекции. К ним относится и листериоз, частота осложнений и высокий процент летальных исходов, при котором общеизвестны. Наибольшую опасность заболевание представляет для беременных женщин, новорожденных, лиц с пониженной иммунологической реактивностью, а также больных, подвергающихся гемодиализу и химиотерапии (Черкасский Б.Л., 1995; Тартаков-ский И.С., Малеев В.В., Ермолаева С.А., 2002; Зайцева Е.А., Сомов Г.П., 2006; Зайцева Е.А., 2009; Arum K.Bhunia, 2008).

Медицинские проблемы листериоза определяются возрастающей ролью листерий в перинатальной и неонатальной патологии. Снижение уровня клеточного иммунитета во время беременности, особенно в поздние сроки, обусловливает повышение восприимчивости к листериозу у беременных, вызывая выкидыши, мертворождение, пороки развития плода и т.д. Достоверных сведений об истинной распространенности листериозной инфекции среди беременных и новорожденных в России нет, а число выявленных случаев невелико. Однако согласно данным ряда исследователей несмотря на своевременную ан-тибиотикотерапию, смертность при перинатальном и неонатальном листериозе достигает 30-50%, в том числе при внутрибольничных вспышках в роддомах (Тартаковский И.С., 2002; Зайцева Е.А., 2009; Kaufman S.H.E., 1993; Lorber В., 1997; Arum KLBhunia, 2008).

Рост этиологической значимости листерий в структуре инфекционной патологии человека диктует необходимость совершенствования качества диагностики, профилактики и санитарно-эпидемиологического надзора за листериозной инфекцией. В тоже время проблема требует усовершенствования существующих и создания новых, применяемых для этих целей иммунобиологических препаратов, необходимых для реализации современных схем выделения и идентификации L. monocytogenes в соответствии с международными стандартами (Тартаковский И.С., 2002; Омарова С.М., 2007).

Создание комплекса иммунобиологических препаратов значительно улучшит диагностику и профилактику листериоза, а включение в нормативные документы Минздрава и использование сухих селективных питательных сред отечественного производства взамен дорогостоящих сред зарубежных фирм значительно расширит возможности практической бактериологии по диагностике листериозной инфекции.

В настоящее время в связи с развитием молекулярно-генетических методов диагностики (ПЦР, ЛЦР и др.) становится целесообразным обследование беременных женщин наряду с известными инфекциями и на листериоз, особенно для женщин с отягощенным акушерским анамнезом.

Однако надежным «золотым стандартом» при диагностике инфекционных заболеваний остается классический бактериологический метод с выделением

чистой культуры и идентификацией возбудителя. Применение селективных питательных сред и тест-систем позволят решать сложные задачи микробиологической диагностики, профилактики и контроля за санитарно-эпидемиологическим состоянием в стране по листериозу. Задачи пополнения номенклатуры питательных сред для бактериологической службы страны качественными отечественными диагностическими препаратами и внедрение их в медицинскую практику, не теряют значимости и в настоящее время.

Принимая во внимание указанное выше, остается актуальным создание стандартных отечественных высокочувствительных селективных питательных сред для выделения листерий, применение которых позволит получать стабильные воспроизводимые результаты исследований и с высокой степенью надежности повысит качество микробиологического мониторинга за листериоз-ной инфекцией в России.

Цель. Экспериментальное обоснование разработки и усовершенствования селективных питательных сред для диагностики листериоза.

Задачи исследований.

1. В эксперименте изучить характеристики различных отечественных белковых гидролизатов и определить возможность их использования в качестве основ при разработке селективных питательных сред для выделения листерий.

2. Экспериментально обосновать разработку рецептуры питательной среды для селективного выделения листерий с учетом их биологических особенностей.

3. Изучить влияние стимуляторов роста на биологические показатели питательной среды для селективного выделения листерий.

4. Модифицировать среду Оксфорд-агар для первичной изоляции листерий из патологического материала различного происхождения. Определить физико-химические и биологические показатели среды, гарантирующие качество препарата.

5. Апробировать разработанные препараты в эксперименте и на клиническом материале. Изучить влияние составов созданных сред для селективного выделения на стабильность сохранения основных биологических свойств бактерий рода Listeria.

6. Определить диагностическую эффективность разработанных сред и целесообразность их применения при бактериологическом исследовании клинического материала от беременных и новорожденных. Предложить схему бактериологической диагностики листериозной инфекции с использованием новых препаратов.

Научная новизна. Научно и экспериментально обоснованы составы новых отечественных сухих питательных сред для селективного выделения листерий. Впервые на основании сравнительной оценки культуральных, физико-химических свойств и аминокислотного состава предложена комбинированная белковая основа - панкреатический рыбный гидролизат с пептоном ферментативным. Экспериментально доказана возможность и экономическая целесообразность использования питательной основы при создании сред для выделения листерий. УстаЕЮвлена и обоснована питательная ценность комбинированной

основы и парааминобензойной кислоты, обеспечивающих высокие показатели чувствительности разработанных сред и скорости роста культуры при минимальных количествах Listeria spp. в исследуемом материале.

Разработаны и экспериментально обоснованы требования к основным показателям качества питательных сред при их серийном выпуске, доказана высокая диагностическая эффективность разработанных препаратов и отработаны методы их контроля. Установлена стабильность физико-химических и биологических свойств разработанных сред в процессе хранения, определены требования к чувствительности, ингибирующим и дифференцирующим свойствам на расширенном наборе музейных штаммов и свежевыделенных культур.

На основании экспериментальных данных о физико-химических и биологических свойствах разработанной и усовершенствованной питательных сред для селективного выделения разработана технология производства препаратов в промышленных условиях.

Теоретическая и практическая значимость. Разработаны и внедрены на предприятии НПО «Питательные среды» отечественные диагностические препараты для селективного выделения листерий из патологического материала и продуктов питания.

На основании экспериментальных данных разработана промышленная технология получения препаратов в производственных условиях. По результатам исследований составлена нормативно-техническая документация (НТД): технические условия (ТУ), регламенты производства (РП), инструкции по применению, на основе которых будет осуществляться промышленный выпуск разработанных препаратов.

Разработанные питательные среды для селективного выделения листерий апробированы в специализированных лабораториях: научно-консультативной лаборатории «Клинической микробиологии», лаборатории Перинатального центра и Муниципального родильного дома № I, а также в бактериологической лаборатории РЦИБ г. Махачкала (Акты внедрения МЗ РД № 10-319 и № 10-320 от 17.09.10). Внедрение разработанных селективных питательных сред целевого назначения существенно пополнит спектр диагностических препаратов для практического здравоохранения и лабораторной службы страны.

По результатам проведенных исследований разработаны методические рекомендации «Усовершенствование методов микробиологической диагностики листериозной инфекции». Материалы диссертации используются преподавателями в лекциях и на практических занятиях для студентов, аспирантов, ординаторов, врачей-бактериологов и слушателей курсов повышения квалификации Дагестанской государственной медицинской академии.

На защиту выносятся:

1. Сухая питательная среда для селективного выделения листерий на комбинированной основе из панкреатического рыбного гидролизата и пептона ферментативного, обеспечивающая высокие ростовые свойства и диагностическую эффективность препарата. Разработанная питательная среда по биологическим показателям не уступает зарубежным аналогам.

2. Состав модифицированной питательной среды (типа Оксфорд-агар) для изоляции листерий из клинического материала различного происхождения, обеспечивающая полноценный рост и биохимические реакции возбудителя листериоза, а также стабильность основных свойств среды и выделенной культуры.

3. Результаты изучения биологических показателей разработанного и усовершенствованного препаратов. Определение диагностической ценности разработанных сред.

Апробация материалов диссертации. Материалы по теме диссертации доложены и обсуждены на Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» Санкт-Петербург, 2008 г.; IV международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», Санкт-Петербург, 2008 г.; 2-й Всероссийской Научно -практической конференции «Антибиотикорезистентность и антимикробная химиотерапия», Махачкала, 2008 г.; на XV, XVI и XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2009-2010 гг.

Публикации. Основные положения диссертации отражены в 19 печатных работах, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 143 страницах, содержит 76 отечественных и 136 иностранных источника, иллюстрирована 44 таблицами, 10 рисунками и состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических предложений и приложения.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. В исследованиях изучено 85 штаммов рода Listeria, из них 14 типовых музейных и 71 свежевыделенных штаммов, из коллекции музейных штаммов ГИСК им. Л.А. Тарасевича и лаборатории легионеллеза НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (Москва).

В качестве сред сравнения использованы отечественные и зарубежные питательные среды: ПАЛКАМ и Оксфорд агар фирмы Bio-Rad (Франция), питательные среды для выделения и накопления листерий, а также микротестсисте-мы для биохимической идентификации (ФГУП «НПО» Микроген» НПО «Питательные среды», г. Махачкала, Россия).

В работе использовали физико-химические и микробиологические методы в соответствии с МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред», а также инструкции по применению производителя на коммерческие питательные среды и микротестсистемы.

Контроль качества основ и образцов питательных сред по физико-химическим показателям осуществляли в соответствии с действующими нормативными документами ФС 42-3874-99 и требованиями Государственной

фармакопеи, XI изд. [1, с. 113]. рН экспериментальных образцов сред определяли с помощью универсального ионометра ЭВ-74 (ЗИП, г. Гомель, Белоруссия).

Изучение специфической активности питательных сред проводили путём определения следующих характеристик: чувствительности среды, скорости роста, дифференцирующих свойств, ингибирующих свойств и показателя сохранения стабильности основных биологических свойств среды.

Учёт результатов и подсчёт колоний производили визуально через 18, 24, 36 и 48ч инкубации посевов при температуре (37± 1)°С.

Сроки годности препаратов определяли в соответствии с Методическими рекомендациями «Определение сроков годности сухих питательных сред и питательных основ методом «ускоренного старения» при повышенной температуре» (М., 1986).

Реакцию агглютинации на стекле, РНИФ, РПГА, ИФА и ПЦР выполняли по общепринятым методикам согласно инструкции производителя тест-систем ООО НПФ «Гентех» (Москва, Россия) и Вектор-Бест (г. Ростов, Россия). Для ПЦР исследований использовали амплификатор «Терцик» (ЗАО НПФ ДНК-Технология, Россия). Иммуноферментный анализ проб проводили на анализаторе иммуноферментных реакций «Униплан» (ЗАО «Пикон», Россия).

Забор и посев исследуемого материала проводили по приказу МЗ СССР №535 от 22.04.85 «Об унификации микробиологических методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений».

Статистическую обработку материала осуществляли с помощью программы Microsoft Excel (7,0).

Результаты исследований и их обсуждение. В качестве питательных основ, разрабатываемых селективных сред для выделения листерий были изучены рыбный панкреатический гидролизат, пептон ферментативный Семипалатинский (ПФ), пептон ферментативный экспериментальный (НПО «Питательные среды», г. Махачкала, Россия) и пептон HiMedia (Индия). По результатам проведенных исследований оттитрованы оптимальные концентрации компонентов комбинированной основы, в состав которой входят рыбный панкреатический гидролизат (СПБ - 11,5 г/л) и пептон ферментативный (ПФ - 11,5 г/л), с содержанием аминного азота (1,7±0,2)% и величиной рН 7,4±0,2. Сочетанная основа по показателям скорости роста, чувствительности и размерам выросших колоний превосходила остальные образцы.

Дальнейшие исследования по оптимизации компонентного состава разрабатываемых сред были направлены на подбор стимуляторов роста - витаминов, аминокислот, пуриновых и пиримидиновых оснований. Так, например, потребность микроорганизмов в витаминах группы «В» в питательных средах удовлетворяется за счет экстракта кормовых дрожжей (ЭКД).

Для роста микроорганизмов существенное значение имеет и параамино-бензойная кислота (ПАБК), участвующая в биосинтезе фолиевой кислоты, функции которой в метаболизме бактерий связаны с синтезом аминокислот, пуриновых и пиримидиновых оснований (Герхард Ф.,1983). ПАБК также является специфичным и активным антагонистом сульфаниламидов, вследствие че-

го добавление ее в среду снижает токсичность лекарственных препаратов, и как следствие, стимулирует рост бактерий.

В качестве факторов роста использовали глюкозу, витаминный препарат «ЭКД», а также ПАБК - вещество, которое ранее не использовалось в рецептурах сред для выделения и культивирования листерий. В работе были определены оптимальные концентрации этих компонентов. Культивирование проводили в жидких образцах среды в пробирках (9,0 мл жидкого образца среды и 1,0 мл культуры), наличие роста фиксировали по появлению помутнения в бульоне. Посевы производили из взвеси суточных культур листерий из разведения 10'6, 10"7, 10"\ Максимальную интенсивность роста листерий наблюдали в опытных образцах с 1,0 г/л глюкозы и 5,0 г/л - ЭКД.

В экспериментах установлено, что внесение в среду 0,01 г/л ПАБК повышало физиологическую активность листерий, в результате чего показатель чувствительности испытуемых образцов увеличился до разведения 10"8 (таблица 1).

Таблица 1. Определение оптимального количества ПАБК в образцах экспериментальной среды для выделения листерий (время инкубации-18i2 4,t=37±l" С)

Состав образца среды, г/л Тест-штаммы листерий

L. monocytogenes 56 L. monocytogenes NCTC 10527

СПБ -11,5 ПФ - 11,5 глюкоза ЭКД ПАБК разведение культуры

10"6 10 10"8 10"6 10'' 10"8

23,0 1,0 5,0 - ++ - - ++ - -

23,0 1,0 5,0 0,0025 ++ - - ++ - -

23,0 1,0 5,0 0,005 ++ + ± ++ + ±

23,0 1,0 5,0 0,01 +++ ++ + +++ ++ +

23,0 1,0 5,0 0,02 +++ ++ + +++ ++ +

Для создания селективных свойств в состав среды ввели в оттитрованных концентрациях налидиксовую кислоту (0,04 г/л) - действующую на грамотри-цательную флору и акрифлавина гидрохлорид (0,005 г/л) - для подавления грамположительной микрофлоры. В модельных опытах путем высева смесей чистых культур листерий и микробов-ассоциантов Р. vulgaris (10 6), E.coli (10 2) и S. aureus (Ю"1). Рост посторонней микрофлоры на испытуемой и контрольной средах полностью подавлялся (таблица 2).

Однако при подавлении роста E.coli и S.aureus отмечался рост Е. faecalis, который, как правило, часто присутствует в исследуемом материале. Для инги-биции энтерококка в состав среды ввели хлорид лития в оттитрованной концентрации - 5,0 г/л (таблица 3).

В состав экспериментальной среды также входят индикатор феноловый красный и маннит, позволяющие выявлять и дифференцировать рост Listeria spp. Листерии не способны гидролизовать маннит вследствие чего ореол вокруг темно-серых колоний остается темно-коричневого цвета. Энтерококки в отличие от патогенных листерий в состоянии метаболизировать маннит, что приводит к смене индикатором цвета ореола вокруг колоний в желтый цвет.

Таблица 2. Изучение ингибирующих свойств экспериментальных серий селективной среды ___

Тест-штаммы Раз- Контрольная сре- Экспериментальные образцы среды

веде- да образец без инги- образец с ингиби-

ние биторов торами

размер кол-во размер кол-во размер кол-во

мм М±т мм М±т мм М±ш

L. monocytogenes 56 10"6 1,0±0,2 18±4 1,9±0,2 71±3 1,7±0,3 64±3

L. monocytogenes NCTC 10527 10'6 0,8±0,2 16±3 1,8±0,2 69±4 1,6±0,2 67±4

L.monocytogenes 21 10'6 0,7±0,1 17±3 2,2±0,4 72±4 1,8±0,3 6б±5

L. monocytogenes NCTC 5348 10'6 0,9±0,2 14±2 1,8±0,2 67±3 1,7±0,2 59±6

E. coli 168/59 10J -II- -II- газон газон -II- -II-

S.aureus FDA 209-P 10"' 0,2±0,1 до 10 газон газон -II- -II-

P. vulgaris HX19 222 10"4 -II- -//- роится роится -II-

Таблица 3. Определение концентрации хлорида лития в экспериментальной среде__

Состав в г/л Рост тест-штаммов

навеска хло- L. mono- L. mono- L. inno- Е. coli Su S. aure- E.fae-

базового рид cytogenes cytogenes cua 3379 3912/41 us FDA calis 775

образца ли- 56 21 (055:К59) 209-P

среды тия разведение культуры

САЛ-1 10"' ю-' 10'2 ю-' 10"6

43,07 3,5 ++ ++ ++ - - ++

43,07 4,0 ++ ++ ++ - - +

43,07 4,5 ++ ++ ++ - - +

43,07 5,0 ++ ++ ++ - - -

43,07 5,5 + + + - - -

Лабораторно-экспериментальные образцы среды для селективного выделения листерий (CAJI-1) испытывали с целью определения чувствительности к минимальным посевным дозам путем посева тест-штаммов по 0,1 мл из разведения 10"6, 10"7 и 10", что соответствует 100, 10 и 1 м.к. листерий. Установлено, что экспериментальная среда не уступает контрольной по количеству колоний, сформированных на чашке через (18±2) ч инкубации, обладая высокой чувствительностью (10 8) и позволяет обнаружить рост листерий при посеве единичных микробных клеток. Так, из 10 м.к. посеянных на экспериментальной среде вырастало в среднем 8,3±1,3 темно-серого цвета колонии с коричневым ореолом (d=l,8±0,2 мм), на контрольной среде соответственно вырастало 4,3±1,8 колонии (р < 0,05) (таблица 4).

Результаты изучения эффективности экспериментальной селективной среды при посеве тест-штаммов рода Listeria представлены в таблице 5. Как видно, показатель эффективности разработанной среды для выделения листерий CAJI-1 составил в среднем (1,44±0,2) х 109 м.к./мл.

Таблица 4. Чувствительности экспериментальной среды для выделения листе-рий САЛ-1__

Наименование Экспериментальная среда Контрольная среда

тест-штаммов степень разведения тестируемой культуры листерий

10"6 10"' 10" Ю-6 ю-7 10"8

ЮОм.к. Юм.к. 1м.к. ЮОм.к. Юм.к. 1м.к

L. monocytogenes 56 70±6 10±1 2±1 38±5 4±2 -

L. monocytogenes NCTC 5348 67±4 8±2 1±1 37±4 5±2 -

L. monocytogenes NCTC 55/43 66±2 7±1 1±1 43±4 5±2 -

L. monocytogenes NCTC 7973 73±5 9±1 lit 43±4 4±2 -

L. monocytogenes NCTC 19117 69±2 8±1 2±1 35±5 3±1 -

M±m 68,1±3,5 8,3±1,3 1,3±0Д 38,8±4,1 4,3±1,8 -

Таблица 5. Изучение показателя эффективности среды для выделения листерий САЛ-1

№ Название штаммов Посевная доза культур листерий Кол-во листерий, выросших через (18±2) ч инкубации, (КОЕ)

1 L, monocytogenes 7973 50 ± 2 млн. 1, 2 млрд.

2 L. monocytogenes 21 -II- 1, б млрд.

3 L. innocua SLCC 3374 -II- 1, 3 млрд.

4 Lseeligery SLCC 18/100 -II- 1,4 млрд.

5 L. ivanovii ATCC 19119 -II- 1,5 млрд.

6 L. welshimeri ATCC 3597 -II- 1, 5млрд.

7 L. grayi 437/144 -II- 1,6 млрд.

М±т 1,44 ±0,2 млрд.

В процессе конструирования среды проводили подбор буферной системы. Наименьшее снижение значений рН в период интенсивного роста листерий наблюдали при внесении в среду натрия углекислого, который поддерживал и стабилизировал величину рН в узком интервале (7,5-7,0), наиболее благоприятном для роста и размножения изучаемой культуры.

В работе установлены физико-химические показатели экспериментально-производственных серий сухой питательной среды САЛ-1: раствор после кипячения и фильтрации прозрачный, красного цвета. Физико-химические свойства среды: рН ~ 7,3±0,2; хлориды - 25,0±3,0; аминный азот - 2,7±0,2; прочность студня среды - 330±30г.

Следующей задачей исследований было усовершенствование состава известного препарата Оксфорд-агар, с целью создания отечественного аналога среды. Для повышения ростовых свойств, в составе базового образца увеличили концентрацию ЭКД до 7,0 г/л, а также ввели тиамин-бромид (0,003 г/л), как дополнительный источник витамина группы «В», что повысило чувствительность среды до 10"8, в сравнении со средой сравнения - Оксфорд-агар фирмы Вю11ас1. Установлено, что на модифицированной среде колонии листерий вырастали больше в диаметре в сравнении с контрольной средой, 1,6±0,2 мм и 0,8±0,2 мм соответственно (р < 0,05) (таблица 6).

Таблица 6. Рост тест-штаммов листерий на модифицированном селективном агаре

Состав в г/л L. monocytogenes NCTC 7973 L. monocytogenes NCTC 55/43 Е. faeca-lis 775 Контроль

1. комбинированная основа - 23,0 2. агар микробиологический - 12,0 3. ЭКД-7,0 4. тиамин-бромид - 0,003 5. эскулин - 0,8 6. цитрат железа аммонийного - 0,5 7. хлорид лития - 3,0 8. налидиксовая кислота - 0,04 9. акрифлавина гидрохлорид - 0,005 типичные блестящие колонии серого цвета, окруженные коричнево-черным ореолом, d=l,8±0,2 мм типичные блестящие колонии серого цвета, окруженные коричнево-черным ореолом, d=l,7±0,2 мм нет роста колонии серого цвета, окруженные коричнево-черным ореолом, с!=0,8±0,2мм

ДиффереЕЩиацию патогенных листерий от роста микробов-ассоциантов в модифицированной среде, как и в среде сравнения, обеспечивает сочетанное применение эскулина (0,8 г/л) и цитрата железа аммонийного (0,5 г/л).

Экспериментальные серии модифицированного селективного агара (САЛ-2) испытывали в модельных опытах при различной микробной нагрузке.

Выделенные на агаре САЛ-2 листерии были типичными по основным биологическим характеристикам, что подтверждает сбалансированность качественного и количественного состава препарата (таблицы 7, 8).

Таблица 7. Характеристика роста листерий на модифицированной и контрольной средах____

Изученные штаммы Время инкубации, ч Модифицированная среда, M±m Контрольная среда, М±т

посевная доза посевная доза

10 s 10е 10 10 s ю-3 106 1С' 10"8

L. monocytogenes NCTC 7973 18±2 сплош ной рост 75±8 11±4 3±1 235±35 35±4 4±2 нет роста

L.monocytogenes 56 18±2 ф 71±7 9±3 2±1 275±40 38±7 4±2 Ф

L. monocytogenes 21 18±2 ф 69±6 11±2 3±2 230±40 35±4 4±2 Ф

L. monocytogenes 5348 18±2 ф 75±7 10±2 3±1 245±30 40±б 5±1 Ф

L. monocytogenes 55/43 18±2 ф 79±8 11±3 2±1 235±35 35±5 3±1 Ф

L. innocua SLCC 3379 18±2 ф 70±7 9±3 4±2 215±40 42±7 5±2 Ф

L.ivanovii 19119 18±2 ф 67±7 10±3 3±1 225±35 37±6 4±2 Ф

L. welshimeri 3597 18±2 ф 63±6 9±2 4±2 240±25 39±5 3±1 Ф

Как видно из таблиц 7 и 8, экспериментальная модифицированная селективная среда для изоляции листерий обладает высокой чувствительностью (Ю8) и превосходит по этому показателю контрольную среду (Oxford agar-BioRad), а также полностью ингибирует рост микробов-ассоцантов. На модифицированной среде листерии растут в S-форме, в виде блестящих колоний темно-серого цвета, окруженных коричнево-черным ореолом, диаметром 1,7±0,2 мм.

Таблица 8. Сравнительная характеристика культуральных свойств модифицированной и контрольной сред для изоляции листерий

Тест-штаммы По- Эксперимектная среда Контрольная среда

сев- время 18±2 ч время 24-48ч

ная размер кол-во размер ко- кол-во

доза, колонии колоний лоний, колонии

0,1 мл (d) мм (КОЕ) М±т (d) мм (КОЕ) М±ш

L. monocytogenes NCTC 7973 10"' 1,8±0,1 9±2 1,0±0,2 5±1

L.seeligeri SLCC 18/100 10"' 1,6±0,2 9±1 0,9±0,1 6±1

L.ivanovii 19119 10"' 1,7±0,2 12±3 0,8±0,1 5±1

L. welshimeri 3597 10"' 1,8±0,2 9±2 1,0±0,2 4±1

S. aureus Wood 46 ю-1 нет роста нет роста нет роста нет роста

E.coli ATCC 25922 10* -II- -II- -//- -II-

P. vulgaris HX19222 10"6 -II- -II- -II-

E.faecalis 775 10"6 -II- -II- -II-

Определены физико-химические свойства модифицированной среды САЛ-2 для изоляции листерий: рН 7,3±0,2; хлориды - 25,0±3,0; аминный азот -2,7±0,2; прочность студня агара - 330±30 г.

В работе были изучены биохимические свойства штаммов листерий, выращенных на экспериментально-производственных сериях разработанных сред САЛ-1 и САЛ-2, с использованием микротест-системы МТС-5Л. Тест-штаммы листерий, пассированные на разработанных средах для выделения, сохраняли характерные ферментативные свойства культуры (таблица 9).

Таблица 9. Биохимические свойства листерий, выращенных на средах САЛ-1 и

САЛ-2

Тесты утилизации L. monocytogenes 56 L. seelige-ri 18/100 L. ivanovü 19119 L. innocua 3379 L. welshimeri 3587 L. grqyi 473

мапнита - - - - - +

маннозы + - - + + -

ксилозы - + + - + -

рамнозы + - - - - -

рибозы - - + - - +

Примечание: (+) положительная реакция; (-) отрицательная реакция

Клинические испытания сред САЛ-1 и САЛ-2 проводили на исследуемом материале от беременных женщин. Изучены мазки и соскобы из цервикалыюго канала, а также кровь. В исследовании использовали комплекс лабораторных методов - бактериологический, серологический и молекулярно-генетический (ПЦР), что способствовало повышению процента положительных находок.

Для выделения Ь.топосу^епез бактериологическим методом в схемы исследования были включены разработанные среды САЛ-1 и САЛ-2 (рисунок 1).

При посеве исследуемого материала на разработанную среду САЛ-1 на поверхности агара через 18±2 ч инкубации вырастали типичные серого цвета колонии с черным центром в Б-форме диаметром 1,7±0,2 мм, окруженные темно-коричневым ореолом (рисунок 2/1). На модифицированном агаре САЛ-2 через

18±2 ч инкубации отмечался рост колоний темно-серого цвета, блестящих, в Б-форме диаметром 1,6±0,2 мм, окруженных коричнево-черным ореолом (рисунок 2/2). Рост посторонней микрофлоры отсутствовал.

Исследуемый материал

(18-24 ч)

среда для накопления лпст^рцй

среда для выделения лпстерин

среда САЛ-1

среды для выделения ластерин

САЛ-1

САЛ-2

ООО

24-48 ч

Л ¿ТС-12 Л МТС/-5Л

Рисунок 1. Схема выделения листерий из клинического материала

Рисунок 2. Рост L.monocytogenes на разработанных средах выделения CAJT-l (1) и САЛ-2 (2) при посеве клинического материала от беременных

Из патологического материала от беременных женщин и рожениц выделено и идентифицировано до вида 19 культур L.monocytogenes (17,2%). Листерии выделялись, как со слизистой оболочки влагалища (67,4%), так и из цервикаль-ного канала (23,3%) и были типированы в РА как серовары - 4в,1/2а, 1/2с.

Принадлежность 19 изолятов к виду L.monocytogenes подтверждена в ПЦР с видоспецифическими праймерами в 98-100%, в 96% - бактериологическим

методом и в 68% РПГА. Сравнительные данные по использованию различных методов при диагностике листериоза беременных показали, что процент совпадений всех использованных методов составил от 98 до 100%.

В работе установлено, что штаммы, выращенные на предлагаемых средах для селективного выделения листерий, сохраняли свои характерные культу-рально-морфологические свойства: грамположительные мелкие палочки, неподвижные при инкубации в температурном режиме (37±1)°С (таблица 10).

Таблица 10. Характеристика биологических свойств выделенных штаммов

Выделен- Проис- Серо- Морфол., тинк- Подвиж- Чувствите- Гемо- Лецити-

ные хож- вар тор., физиоло- ность льность к лити- назная

штаммы дение гические, био- при фагам ческие актив-

штамма химические свойства 23±1°С Л-2а Л-2с св-ва ность

L.mono- соскобы Ул типичные по (++)- + - узкая зона по-

cytogenes из цер- морфологи- 17шт. зона в мутне-

п=19 викаль- ческим, тинк- гемо- ния во-

ного ториальным, (±)- лиза круг ко-

канала физиологическим и биохимическим свойствам 2 шт. вокруг колоний лонии (++)

Бактериологическим методом кроме листерий была выявлена сопутствующая микрофлора, посевом на коммерческие среды: Эндо, Кандида-агар, желточно-солевого агара (ЖСА) и кровяной агар. Энтеробактерии выделяли в 73,5%; грибы рода Candida в 6,5%. Бактерии других родов обнаруживались в 12,8%.

Методом ПЦР выявлялись специфические фрагменты ИППП: в 31% случаев цитомегаловирус (HCMV'), С.trachomatis в 25%, HPV (16 и 18 типов) в 11%, Т.vaginalis в 11%, U.urealyticum -в 6% и HSV{\ и 2 типов) в 14%.

Как видно, наряду с листериями у обследованных женщин выявляли условно-патогенные бактерии и специфические инфекции, обладающие факторами, определяющими возможность их участия в патогенезе заболевания.

В группе обследованных, с лабораторно установленной листериозной инфекцией, в анамнезе чаще выявлялась угроза прерывания беременности по сравнению с контрольной группой (соответственно - у 11 и 0%; р < 0,002) и в общем акушерская патология проявлялась чаще, чем в контрольной (соответственно - у 17 и 0%; р < 0,05). Установлено, что воспалительные процессы и нарушения в ходе течения беременности, вызванные листериями, отрицательно сказывались на исходе беременности.

Таким образом, в результате проведенных исследований, разработаны рецептурные составы и технология промышленного получения селективных питательных сред для микробиологической диагностики листериоза. Предлагаемые препараты для выделения листерий обладают высокой диагностической эффективностью и чувствительностью, обеспечивая рост тест-штаммов и свежевыде-ленных культур листерий при посеве из максимальных разведений (Ю-7 и 10"8).

выводы

1. Экспериментально обоснована и определена возможность использования панкреатического рыбного гидролизата и пептона ферментативного в качестве питательной основы селективных сред для выделения листерий. Сочетанное применение этих субстратов в оттитрованных концентрациях позволяет получить полноценную сбалансированную основу по составу аминокислот, витаминов и микроэлементов.

2. Разработана рецептура сухой селективной питательной среды для выделения листерий. Среда обладает преимуществом перед традиционно используемыми средами зарубежного производства по чувствительности и срокам выделения листерий при минимальном исходном содержании возбудителя в посевном материале. Разработанная среда стандартна и обеспечивает стабильность биологических свойств листерий.

3. Установлена зависимость интенсивности роста листерий на разработанной среде для селективного выделения от концентрации ростостимулирующих добавок - ЭКД (5,0 г/л), глюкозы (1,0 г/л) и парааминобензойной кислоты (0,01 г/л). Определены оптимальные количества указанных ингредиентов, позволяющие увеличить чувствительность среды в отношении роста культур листерий до 10'8.

4. Усовершенствована рецептура сухого селективного агара для изоляции листерий типа Оксфорд-агар на комбинированной отечественной питательной основе, обеспечивающая высокую эффективность роста микроба и чувствительность среды. Оптимальные селективные свойства в отношении широкого спектра микроорганизмов, при минимальном влиянии на рост и размножение листерий, достигнуты при внесении в среду 0,04 г/л - налидиксовой кислоты и 0,005 г/л - акрифлавина гидрохлорида.

5. Созданы отечественные питательные среды для селективного выделения листерий - САЛ-1 и САЛ-2. Экспериментально установлена стабильность со-храЕ1ения биологических свойств культуры при выращивании на разработанных препаратах, обеспечивающих высокие ростовые и ингибирующие свойства при выделении листерий из исследуемого материала различного происхождения.

6. Определена диагностическая эффективность разработанных питательных сред при бактериологическом исследовании клинического материала от беременных женщин и новорожденных. Предложена схема микробиологического исследования на листериоз с применением предлагаемых препаратов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Внедрение разработанных селективных питательных сред существенно пополнит спектр отечественных диагностических препаратов лабораторной службы страны и значительно повысит эффективность микробиологических исследований клинического материала при диагностике листериозной инфекции.

2. Материалы диссертационной работы могут быть использованы в научных целях, при составлении учебных и справочных пособий, чтении лекций, ведении лабораторно-практических занятий по курсу микробиологии и биотехнологии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Исаева, Р.И. Биохимическая идентификация листерий выделенных из пищевых продуктов / Р.И. Исаева, С.М. Омарова // Антибиотикорезистентность и антимикробная химиотерапия: Материалы II научно-практической конференции. - Махачкала, 2008. - С. 78-79.

2. Исаева, Р.И. Изучение диагностической эффективности питательных сред для индикации и идентификации листерий / Р.И. Исаева, С.М. Омарова // Антибиотикорезистентность и антимикробная химиотерапия: Материалы II научно-практической конференции. - Махачкала, 2008. - С. 76-78.

Ъ. Исаева, Р.И. Определение чувствительности к антибиотикам листерий и ассоциативной микрофлоры, выделенных у женщин с акушерской патологией / Р.И. Исаева, С.М. Омарова // Антибиотикорезистентность и антимикробная химиотерапия: Материалы II научно-практической конференции. — Махачкала, 2008.-С. 16-17.

4. Исаева, Р.И. Листериоз как инфекция с пищевым путем передачи / Р.И. Исаева, С.М. Омарова, З.М. Нурмагомедова, Э.М. Ахмедова, П.М. Муртуза-лиева, Г.М. Тагирова // Вестник Российской военно-медицинской академии.

- Санкт-Петербург, 2008. - Приложение (ч. 2). - С. 556-557.

5. Исаева, Р.И. Микробиологическая диагностика листериоза / Р.И. Исаева, С.М. Омарова, З.М. Нурмагомедова, Э.М. Ахмедова, П.М. Муртузалиева, Г.М. Тагирова // Идеи Пастера в борьбе с инфекциями: Материалы Международной конференции. - Санкт-Петербург, 2008. - С. 149.

6. Исаева, Р.И. Изучение диагностической эффективности питательных сред для микробиологической диагностики перинатального листериоза / Р.И. Исаева, С.М. Омарова, Э.М. Ахмедова // Человек и лекарство: Тезисы материалов XV Российского национального конгресса. - М., 2008. - С. 629.

7. Омарова, С.М. Питательные среды для выделения, накопления и идентификации листерий в лабораторной диагностике микст-инфекций у женщин с акушерско-гинекологической патологией / С.М. Омарова, Р.И. Исаева, Э.М. Ахмедова, П.М. Муртузалиева // ЖМЭИ. - 2008. - № 6.

- С. 88-90.

8. Исаева, Р.И. К вопросу диагностики перинатального листериоза / Р.И. Исаева, С.М. Омарова // Проблемы современной эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики и профилактики актуальных инфекций: Всероссийская научная конференция. - Санкт-Петербург, 2009. -С. 117.

9. Исаева, Р.И. Антибиотикочувствительность L.monocytogenes, выделенных у женщин с акушерской патологией / Р.И. Исаева, С.М. Омарова // Человек и лекарство: Тезисы материалов XVI Российского национального конгресса. -М., 2009.-С. 116-117.

10. Исаева, Р.И. Характеристика штаммов Listeria monocytogenes, выделенных от беременных женщин в Республике Дагестан / Р.И. Исаева, С.М. Омарова // Лабораторная медицина в свете Концепции развития здравоохранения России до 2020 года: Труды научно-практической конференции. Москва, 2830 сентября 2009 г. - М.: Лабора, 2009. - С. 228-229.

П.Омарова, С.М. Методы биохимической идентификации листерий / С.М., Омарова, Р.И. Исаева // Человек и лекарство: Тезисы материалов XVI Российского национального конгресса. - М., 2009. - С. 712.

12. Исаева, Р.И. Селективные питательные среды для выделения листерий из различного материала / Р.И. Исаева, С.М. Омарова, Д.Ш. Меджидова // Человек и лекарство: Тезисы материалов XVII Российского национального конгресса. - М., 2010. - С. 628.

13. Омарова, С.М. Разработка индикаторной среды для селективного выделения микроорганизмов рода Listeria из патологического материала различного происхождения (ИСС-1) / С.М. Омарова, Р.И. Исаева, Э.М. Ахмедова, П.М. Муртузалиева, З.М. Нурмагомедова // Успехи современного естествознания. -2010.-№9.-с. 122.

14. Исаева, Р.И. Совершенствование методов микробиологической диагностики листериоза беременных и новорожденных / Р.И. Исаева, С.М. Омарова, Д.У. Абсерханова, Ф.С. Акаева, Д.Ш. Меджидова // Успехи современного естествознания. - 2010.-№ 12.-С. 102-104.

15. Омарова, С.М. Результаты клинического испытания селективного агара для выделения листерий в перинатальном центре г. Махачкала / С.М. Омарова, Р.И. Исаева, Д.У. Абсерханова, Э.М. Ахмедова, П.М. Муртузалиева, З.М. Нурмагомедова, Д.Ш. Меджидова // Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней: Тезисы Всероссийской научно-практической конференции. - М., 2010. - С. 91.

16. Омарова, С.М. Клинико-этиологическая значимость Listeria monocytogenes в развитии патологий беременных и новорожденных / С.М. Омарова, Р.И. Исаева, Д.Ш. Меджидова, Д.У. Абсерханова // Молекулярная диагностика: Сборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Москва, 24-26 ноября 2010 г. - М., 2010. - Т. III. -С. 342-343.

17. Омарова, С.М. Микробиологическое исследование санитарного состояния Перинатального центра г. Махачкала / С.М. Омарова, А.И. Алиева, Д.У. Абсерханова, Д.Ш. Меджидова, Р.И. Исаева, В.Г. Горелова II ЖМЭИ. - 2010. - № 5. - С. 77-80.

18. Омарова, С. М. Новый селективный агар для выделения микроорганизмов рода Listeria / С.М. Омарова, Р.И. Исаева, Э.М. Ахмедова, П.М. Муртузалиева, З.М. Нурмагомедова, Д. Ш. Меджидова // Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней: Тезисы Всероссийской научно-практической конференции. - М., 2010. - С. 92.

19. Омарова, С.М. Биологические свойства штаммов L. monocytogenes, выделенных на новых отечественных селективных питательных средах из клинического материала при диагностике листериоза беременных и новорожденных / С.М. Омарова, Р.И. Исаева // Астраханский медицинский журнал. - 2011. - Т. 6. - № 1. - С. 150-154.

Подписано в печать 05.04.2011. Тираж 100 экз. Объем 1,0 печ.л. Формат 60x84/16. Заказ № 27. Отпечатано в типографии ООО «А-4» г. Махачкала, ул. Пушкина, 46.

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Исаева, Роза Изитдиновна

СОКРАЩЕНИЯ ПО ТЕКСТУ ДИССЕРТАЦИИ.

ВВЕДЕНИЕ.;.

ГЛАВА 1. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ЛИСТЕРИОЗА. (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1. Листерии и их роль в инфекционной патологии беременных и новорожденных.

1.2. Современные методы микробиологической диагностики листериоза.

1.3. Питательные среды для культивирования листерий.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Сырьё и реактивы.

2.1.2. Штаммы микроорганизмов.

2.1.3. Питательные среды.

2.2. Методы.

2.2.1. Физико-химические методы.

2.2.2. Биологические методы.

2.2.3. Методы статистической обработки результатов.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ РАЗРАБОТКИ И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ СЕЛЕКТИВНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЛИСТЕРИОЗА.

3.1. Определение оптимальных белковых гидролизатов, как основы питательных сред для выделения листерий.

3.2. Разработка рецептуры сухой селективной питательной среды для выделения листерий.

3.2.1. Изучение действия различных стимулирующих факторов на рост листерий в экспериментальной среде.

3.2.2. Определние действия селективных компонентов на рост микробов-ассоциантов в экспериментальной среде.

3.2.3. Определение оптимальной буферной системы разработанной среды для селективного выделения листерий - CAJI-1.

3.2.4. Характеристика экспериментально-производственных серий сухой питательной среды для селективного выделения листерий -САЛ-1.

3.3. Разработка селективного агара для изоляции листерий из исследуемого материала различного происхождения.

3.3.1. Усовершенствование рецептуры среды Оксфорд-агар для изоляции листерий из клинического материала и продуктов питания.

3.3.2. Изучение стабильности сохранения свойств модифицированной среды CAJI-2 в процессе хранения.

ГЛАВА 4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ СРЕД САЛ-1 И САЛ-2 ДЛЯ СЕЛЕКТИВНОГО ВЫДЕЛЕНИЯ ЛИСТЕРИЙ.

4.1. Сравнительная характеристика показателей чувствительности и скорости роста разработанных сред САЛ-1 и САЛ-2 при выращивании бактерий рода Listeria.

4.2. Оценка качества сред САЛ-1, САЛ-2 по показателям ингибиции микробов-ассоциантов и эффективности роста штаммов L.monocytogenes в модельных опытах.

4.3. Изучение ростовых свойств разработанных селективных сред для выделения листерий.

ГЛАВА 5.0. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ РАЗРАБОТАННЫХ СЕЛЕКТИВНЫХ СРЕД ПРИ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ОТ БЕРЕМЕННЫХ И НОВОРОЖДЕННЫХ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспериментальное обоснование разработки и усовершенствования селективных питательных сред для диагностики листериоза"

Актуальность проблемы. В современных условиях на фоне успешной борьбы с инфекционными заболеваниями значимость микробного фактора в патологии человека не только не снижается, но и проявляет тенденцию к росту (Черкасский Б.Л., 1995; Покровский В.И., 2000; Онищенко Г.Г., 2002). На передний план выдвигаются новые, относительно недавно открытые, малоизученные инфекции. К ним относится и листериоз, частота осложнений и высокий процент летальных исходов, при котором общеизвестны. Наибольшую опасность заболевание представляет для беременных женщин, новорожденных, лиц с пониженной иммунологической реактивностью, а также больных, подвергающихся гемодиализу и химиотерапии (Черкасский Б.Л., 1995; Тартаковский И.С., Малеев В.В., Ермолаева С.А., 2002; Зайцева Е.А., Сомов Г.П., 2006; Зайцева Е.А., 2009; Arum K.Bhunia, 2008).

Медицинские проблемы листериоза определяются возрастающей ролью листерий в перинатальной и неонатальной патологии. Снижение уровня клеточного иммунитета во время беременности, особенно в поздние сроки, обусловливает повышение восприимчивости к листериозу у беременных, вызывая выкидыши, мертворождение, пороки развития плода и т.д. Достоверных сведений об истинной распространенности листериозной инфекции среди беременных и новорожденных в России нет, а число выявленных случаев невелико. Однако согласно данным ряда исследователей несмотря на своевременную антибиотикотерапию, смертность при перинатальном и неонатальном листериозе достигает 30-50%, в том числе при внутрибольничных вспышках в роддомах (Тартаковский И.С., 2002; Зайцева Е.А., 2009; Kaufman S.H.E.,1993; Lorber В.,1997; Arum K.Bhunia, 2008).

Рост этиологической значимости листерий в структуре инфекционной патологии человека диктует необходимость совершенствования качества диагностики, профилактики и санитарно-эпидемиологического надзора за листериозной инфекцией. В тоже время проблема требует усовершенствования существующих и создания новых, применяемых для этих целей иммунобиологических препаратов, необходимых для реализации современных схем выделения и идентификации L.monocytogenes в соответствии с международными стандартами (Тартаковский И.С., 2002; Омарова С.М., 2007).

Однако надежным «золотым стандартом» при диагностике инфекционных заболеваний остается классический бактериологический метод с выделением чистой культуры и идентификацией возбудителя. Применение селективных питательных сред и тест-систем позволят решать сложные задачи микробиологической диагностики, профилактики и контроля за санитарно-эпидемиологическим состоянием в стране по листериозу. Задачи пополнения номенклатуры питательных сред для бактериологической службы страны качественными отечественными диагностическими препаратами и внедрение их в медицинскую практику, не теряют значимости и в настоящее время.

Задачи исследований.

В эксперименте изучить характеристики различных отечественных белковых гидролизатов и определить возможность их использования в качестве основ при разработке селективных питательных сред для выделения листерий.

Экспериментально обосновать разработку рецептуры питательной среды для селективного выделения листерий с учетом их биологических особенностей.

Изучить влияние стимуляторов роста на биологические показатели питательной среды для селективного выделения листерий.

Модифицировать среду Оксфорд-агар для первичной изоляции листерий из патологического материала различного происхождения. Определить физико-химические и биологические показатели среды, гарантирующие качество препарата.

Апробировать разработанные препараты в эксперименте и на клиническом материале. Изучить влияние составов созданных сред для селективного выделения на стабильность сохранения основных биологических свойств бактерий рода Listeria.

Определить диагностическую эффективность разработанных сред и целесообразность их применения при бактериологическом исследовании клинического материала от беременных и новорожденных. Предложить схему бактериологической диагностики листериозной инфекции с использованием новых препаратов.

Научная новизна. Научно и экспериментально обоснованы составы новых отечественных сухих питательных сред для селективного выделения листерий. Впервые на основании сравнительной оценки культуральных, физико-химических свойств и аминокислотного состава предложена комбинированная белковая основа - панкреатический рыбный гидролизат с пептоном ферментативным. Экспериментально доказана возможность и экономическая целесообразность использования питательной основы при создании сред для выделения листерий. Установлена и обоснована питательная ценность комбинированной основы и парааминобензойной кислоты, обеспечивающих высокие показатели чувствительности разработанных сред и скорости роста культуры при минимальных количествах Listeria spp. в исследуемом материале.

РП), инструкции по применению, на основе которых будет осуществляться промышленный выпуск разработанных препаратов.

Разработанные питательные среды для селективного выделения листерий апробированы в специализированных лабораториях: научно-консультативной лаборатории «Клинической микробиологии», лаборатории Перинатального Центра и Муниципального родильного дома №1, а также в бактериологической лаборатории РЦИБ г. Махачкала (Акты внедрения МЗ РД № 10-319 и 10-320 от 17.09.10). Внедрение разработанных селективных питательных сред целевого назначения существенно пополнит спектр диагностических препаратов для практического здравоохранения и лабораторной службы страны.

По результатам проведенных исследований разработаны методические рекомендации «Усовершенствование методов микробиологической диагностики листериозной инфекции».

Материалы диссертации используются преподавателями в лекциях и на практических занятиях для студентов, аспирантов, ординаторов, врачей-бактериологов и слушателей курсов повышения квалификации Дагестанской государственной медицинской академии. На защиту выносятся:

4. Существует зависимость между частотой выделения возбудителя из патологического материала, чувствительностью используемой питательной среды и выбранным методом для диагностики листериоза. Апробация материалов диссертации. Материалы по теме диссертации доложены и обсуждены на Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» Санкт-Петербург, 2008; IV международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», Санкт-Петербург, 2008; 2-й Всероссийской Научно - практической конференции «Антибиотикорезистентность и антимикробная химиотерапия», Махачкала, 2008; на XV, XVI и XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2009-2010 гг.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Исаева, Роза Изитдиновна

выводы

3. Установлена зависимость интенсивности роста листерий на разработанной среде для селективного выделения от концентрации ростостимулирующих добавок - ЭКД (5,0г/л), глюкозы (1,0г/л) и парааминобензойной кислоты (0,01 г/л). Определены оптимальные количества указанных ингредиентов, позволяющие увеличить чувствительность среды в отношении роста культур листерий до 10~8.

4. Усовершенствована рецептура сухого селективного агара для изоляции листерий типа Оксфорд-агар на комбинированной отечественной питательной основе, обеспечивающая высокую эффективность роста микроба и чувствительность среды. Оптимальные селективные свойства в отношении широкого спектра микроорганизмов, при минимальном влиянии на рост и размножение листерий, достигнуты при внесении в среду 0,04 г/л -налидиксовой кислоты и 0,005 г/л - акрифлавина гидрохлорида.

5. Созданы отечественные питательные среды для селективного выделения листерий - САЛ-1 и САЛ-2. Экспериментально установлена стабильность сохранения биологических свойств культуры при выращивании на разработанных препаратах, обеспечивающих высокие ростовые и ингибирующие свойства при выделении листерий из исследуемого материала различного происхождения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Листериозная инфекция является тяжелым заболеванием, частота осложнений и высокая летальность, при которых общеизвестны. Многочисленные наблюдения специалистов различного профиля позволили определить группы риска по заражению листериозом. Это беременные женщины, новорожденные, лица с пониженной иммунологической реактивностью, пожилые люди, больные, подвергающиеся гемодиализу. Однако число выявленных больных листериозом невелико, что, вероятно, связано с отсутствием эффективной системы эпидемиологического контроля и как правило, неудовлетворительным состоянием лабораторной диагностики инфекции.

Возрастание этиологической роли листерий в инфекционной патологии человека диктует необходимость совершенствования качества санитарно-эпидемиологического надзора, диагностики и профилактики этой инфекции, требует серьезного отношения к задачам усовершенствования существующих и созданию новых, применяемых для этих целей иммунобиологических препаратов, необходимых для реализации современных схем выделения листерий из исследуемого материала различного происхождения.

На Международном симпозиуме по пищевых зоонозам в Москве (1995) было подчеркнуто, что задачи, стоящие перед практическим здравоохранением по профилактике листериоза, в первую очередь, связаны с быстрой и точной диагностикой, своевременным выявлением возбудителя в очагах инфекций. Значительное место в этой работе занимает не только выделение возбудителя, но и его идентификация в пищевых продуктах, позволяющая выявлять эпидемически значимые штаммы листерий. В связи с этим, в 2002г в Российской Федерации введены Методические указания МУК 4.2.1122-02. Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах и ГОСТ Р51921-2002. «Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes». Эти документы регламентируют качество и количество микробиологического контроля пищевых продуктов на обсемененность листериями, для чего предлагается ряд питательных сред зарубежных фирм -изготовителей.

Для решения этих вопросов исследователи позиционируют ряд предложений, среди которых основным является обеспечение лабораторной службы страны высокочувствительными селективными питательными средами целевого назначения отечественного производства, стандартных и гарантированного качества, которые по основным биологическим показателям не будут уступать зарубежным аналогам. Как известно только производственные среды отвечают требованиям стандартности, что дает возможность получения сопоставимых результатов исследования.

В связи с этим, исследования по разработке новых и усовершенствованию существующих селективных питательных сред для микробиологической диагностики листериоза актуальны и требуют дальнейшего изучения. Это актуальное направление способствовало выбору темы диссертационной работы.

Целью настоящего исследования явилось экспериментальное обоснование разработки и усовершенствования селективных питательных сред для выделения листерий.

Анализ литературных данных по проблеме листериоза в нашей стране позволил сформулировать основные задачи, которые предстояло решить в настоящей работе для достижения поставленной цели исследований.

Набор тест-штаммов, необходимый для разработки сред (всего 85 штамма), получен из ГИСК им. JI.A. Тарасевича (Москва), коллекции типовых музейных и свежевыделенных штаммов лаборатории легионеллеза НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (Москва) и лаборатории клинической микробиологии НПО «Питательные среды» (ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и CP РФ).

В диссертационных исследованиях изучен 71 свежевыделенный штамм бактерий различных токсономических групп, выделенных из клинического материала различного происхождения.

Всего было приготовлено 190 образцов питательных сред для выделения и культивирования листерий. На тест-штаммах было проведено 768, а на клиническом материале 352 исследования.

В ходе изучения физиологических потребностей L. monocytogenes установлено, что наиболее благоприятными условиями для максимального роста и размножения изучаемой культуры является значение рН среды 7,4±0,2 и температурный режим инкубации (37±1)° С. Инкубация листерий при (23±1)° С обеспечивала подвижность микроорганизма, обнаруживаемую при росте на полужидких средах и микрокопировании.

При конструировании микробиологических питательных сред необходим подбор оптимального состава среды, удовлетворяющий физиологическим потребностям изучаемого микроорганизма свободного от балластных веществ органического и неорганического происхождения (7, 8).

Одним из факторов, определяющим качество питательных сред является наличие в их составе стандартных основ, в частности белковые гидролизаты, которые являются богатыми источниками аминокислот, пептидов, витаминов, органических кислот.

В настоящее время основным белковым сырьем в промышленном производстве питательных сред является каспийская килька (35, 36).

В работе в качестве питательных основ нами были изучены рыбный панкреатический гидролизат, пептон ферментативный Семипалатинский (ПФ), пептон ферментативный экспериментальный (НПО «Питательные среды», Махачкала) и пептон HiMedia (Индия).

Оценку качества исследуемых основ проводили путем испытания лабораторных образцов, имеющих следующие физико-химические показатели: 1,5 до 2,0 % аминного азота, рН 7,2 - 7,5. Образцы подвергались стерилизации в течение 20 минут при 1 атм.

По результатам сравнительных опытов, как наиболее оптимальная, отвечающая ростовым требованиям листерий, была выбрана комбинированная основа - сухой питательный бульон из рыбного панкреатического гидролизата (СПБ -11,5 г/л) и пептон ферментативный (ПФ - 11,5 г/л) с содержанием аминного азота (1,7±0,2) % и величиной рН 7,4±0,2.

В настоящих исследованиях при разработке сред для культивирования листерий в качестве контрольных сред, были использованы среды ПАЛКАМ и Оксфорд агар (производства фирмы BioRad, Франция).

Известно, что потребность микроорганизмов в витаминах группы «В» в питательных средах промышленного изготовления удовлетворяется в основном за счет экстракта кормовых дрожжей (36).

Для роста микроорганизмов помимо витаминов группы «В» существенное значение имеет парааминобензойная кислота (ПАБК), участвующая в биосинтезе витамина В9 - фолиевой кислоты, функции которой в метаболизме бактерий связаны с синтезом аминокислот, пуриновых и пиримидиновых оснований (Герхард Ф., 1983, Гостев B.C., 1951). Парааминобензойная кислота также является наиболее специфичным и весьма активным антагонистом сульфаниламидов, вследствие чего добавление ее в питательную среду обезвреживает токсичность лекарственных препаратов, и как следствие, стимулирует рост бактерий (Гостев B.C., 1951). Существующие среды для выделения листерий, регламентируемые действующими нормативными документами, не имеют в своем составе парааминобензойной кислоты.

Для подавления сопутствующей микрофлоры, обильно присутствующей в исследуемом материале, питательные среды содержат селективные компоненты, которые в свою очередь будут угнетать рост и индикацию искомого возбудителя. Отсюда возникает необходимость не только в полноценной питательной основе, но и в дополнительных стимуляторах роста листерий. Сопоставляя данные литературы с результатами предыдущих исследований, решено было использовать глюкозу, витаминный препарат «ЭКД», а также вещество, которое ранее не использовалось в рецептурах сред для культивирования листерий - ПАБК. Для этого были приготовлены жидкие образцы среды с стимуляторами роста. Культивирование проводили в пробирках (9,0 мл жидкого образца среды и 1,0 мл культуры), наличие роста фиксировали по появлению помутнения в бульоне. Посевы производили из расчета взвеси суточных культур тест

5 6 7 штаммов листерий из разведения 10" , 10" , 10" , вносили по 0,1 и 0,5 мл в образцы питательных сред.

По нашим наблюдениям стимулирующее влияние ЭКД в концентрации 5,0 г/л приводило к увеличению размера колоний. Введение глюкозы (1,0г/л) в сочетании с основой в составе среды обеспечивает усвоение углерода взамен мышечного сахара, который содержится в мясной воде, тем самым рыбный гидролизат с глюкозой, как и триптический бульон Дифко, заменяет мясную воду.

Внесение в среду 0,01 г/л ПАБК увеличивало чувствительность среды с 10"6 до 10"8. Несмотря на то, что в ЭКД содержится комплекс водорастворимых витаминов группы В, существенное значение имеет введение в состав среды ПАБК, участвующей в биосинтезе витамина В9 -фолиевой кислоты.

Для достижения изотонических условий в разрабатываемую среду внесли натрия хлорид в количестве 5,0 г/л, что в совокупности с питательным бульоном обеспечивало в среде 1,2% хлоридов и стабильно сохраняло рН среды в процессе культивирования в оптимальных пределах (7,2±0,2) .

В результате изучения показателя чувствительности селективной и контрольной сред установлено, что среды сравнения независимо от используемого тест-штамма листерий, обеспечивали в опытных пробирках через (18±2) ч инкубации равномерное помутнение при засеве 1 мл культуры листерий из разведения 10"7. Инокуляция листерий из разведения 10"8 в экспериментальных средах также приводила к помутнению бульона в разработанной среде, тогда как пробирки с контрольной средой сравнения через (18±2) ч инкубации оставались прозрачными.

Исследование ингибирующих свойств экспериментальных серий селективной среды для выделения листерий, определяли в модельных опытах высевом смесей чистых культур листерий и микробов-ассоциантов {P. vulgaris, E.coli, S. aureus и E.faeclis).

Трудности при выделении листерий из клинического материала, как правило, связаны с содержание контаминантов в исследуемых образцах при низком количестве искомого патогена. Особенно важную роль при этом играет энтерококк, который препятствует идентификации листерий, так как приобретает цвет среды и колоний схожий с листериями, в виду способности в процессе роста гидролизовать эскулин.

Для подавления энтерококка в состав среды входит хлорид лития, концентрация которого оттитровывалась согласно рекомендациям по содержанию этого компонента в селективных средах для листерий.

Результаты сравнительных опытов показали, что образец с 5,0 г/л хлорида лития полностью подавлял рост всех ассоциантов, в том числе и энтерококка.

Для обеспечения дифференциации патогенных листерий от ассоциантов в среду ввели эскулин в количестве 0,8 г/л в соответствии с рекомендациями МУК, а также определили оптимальное количество цитрата железа аммонийного (0,5 г/л). Сочетанное использование этих компонентов позволяет с высокой степенью надежности дифференцировать L.monocytogenes от посторонней микрофлоры.

Кроме ростовых факторов и ингибиторов сопутствующей микрофлоры данная среда содержит индикатор-краситель феноловый красный и маннит, позволяющие выявлять и дифференцировать колонии Listeria spp. за исключением L.grayi и L.marrayi (эти виды не вызывают заболеваний у людей). Листерии не способны гидролизовать маннит вследствие чего не происходит окисления среды, и ореол вокруг темно-серых колоний остается темно-коричневого цвета. Готовая среда с индикатором имеет красный цвет с характерным перламутровым отливом, на фоне которого отчетливо отмечается рост листерий. Энтерококки в отличие от патогенных листерий в состоянии метаболизировать маннит. В результате этого метаболизма происходит окисление среды, что приводит к смене индикатором цвета ореола вокруг колоний в желтый.

Экспериментальные образцы среды для селективного выделения листерий испытывали с целью определения чувствительности среды к минимальным посевным дозам. Установлено, что среда не уступает контрольной по количеству колоний, сформировавщихся на чашке через о

18±2) ч инкубации посевов и обладает высокой чувствительностью (10" ), поскольку позволяет обнаружить рост листерий при посеве единичных микробных клеток. Через (18±2) ч инкубации при температуре (37±1)° С из 100 посеянных микробных клеток на экспериментальной среде вырастало в среднем 67,8±3,8 темно-серого цвета с коричневым ореолом, круглых колонии диаметром 1,8±0,2 мм, на контрольной среде соответственно вырастало 38,9±4,1 (р=0,05). При определении морфологии листерий в мазках отмечали типичные мелкие грамположительные палочки. Жизнеспособность выращенных на селективной среде выделения листерий (CAJI-1) составила 65,5±0,5%.

Экспериментальная среда позволяет обнаружить рост всех видов листерий через (18±2) ч инкубации при температуре (37±1)° С и полностью подавляет рост микробов-ассоциантов: S.aureus из разведения 10"1, E.coli из у S разведения 10 , P.vulgaris и E.faecalis из 10" ; при минимальном содержании селективных компонентов в составе, не уступая по ингибирующим свойствам, определяющим качество питательной среды, среде сравнения. В тоже время диаметр выросших колоний на экспериментальной среде больше, чем на контрольной среде 1,6±0,1мм и 1,0±0,2 мм соответственно (р<0,05).

Показатель эффективности разработанной питательной среды для селективного выделения листерий составил в среднем (1,6±0,3) х109 м.к/мл.

В результате проведенных экспериментов определили состав среды для выделения, который отвечал ростовым требованиям листерий и не уступал по основным биологическим показателям среде сравнения.

Выделенные на экспериментальной среде культуры сохраняли характерные для листерий морфологические, тинкториальные, культуральные, биохимические и серологические свойства.

Определены физико-химические показатели сухой питательной среды для выделения листерий (CAJI-1): цвет - раствор препарата после кипячения и фильтрации прозрачный, красного цвета. Физико-химические свойства среды: рН - 7,3±0,2; хлориды - 25,0±3,0; аминный азот - 2,7±0,2; прочность студня среды - 330±30 г.

Учитывая тот факт, что в существующих Методических указаниях по диагностике листериоза рекомендовано использование зарубежных препаратов целевого назначения в частности Оксфорд агара, нами была поставлена задача модификации известного препарата, с целью создания отечественного препарата аналогичного назначения.

Для стимуляции роста листерий в составе базового образца среды увеличили концентрацию ЭКД от 5,0 до 7,0 г/л и дополнительно ввели в состав среды тиамин-бромид (источник витамина В) - 0,003 г/л.

Дифференциацию патогенных листерий от ассоциантов в среде обеспечивает комбинация эскулина и цитрата железа аммонийного. Оптимальным для роста тест-штаммов оказался вариант среды с 1,0 г/л эскулина и 0,5 г/л цитрата железа аммонийного, что обеспечивало полную ингибицию E.faecalis. Энтерококк, как известно, обладает способностью в процессе своего роста гидролизовать эскулин, что приводит к появлению темно окрашенных колоний на поверхности среды и препятствует их дифференциации. В тоже время на модифицированной агаре формировались колонии листерий значительно больше в диаметре, чем на поверхности контрольной среды, 1,7±0,2 мм и 0,8±0,2 мм соответственно (р<0,05).

Модифицированный вариант среды для выделения листерий обладает высокой чувствительностью (10" ) в отношении наиболее часто выделяемых культур листерий и превосходит по этому показателю контрольную среду (Oxford agar - BioRad), а также обладает выраженными ингибирующими свойствами, обеспечивая через (18±2) ч инкубации при температуре (37±1)° С полное подавление роста микробов-ассоциантов: S.aureus из разведения 10"1,

2 6 Е. coli из 10" и P.vulgaris и E.faecalis из разведения 10" . Выделенные на экспериментальной среде культуры сохраняли характерные для листерий морфологические, тинкториальные, культуральные, биохимические и серологические свойства.

Физико-химические свойства модифицированной среды: pH - 7,3±0,2; хлориды - 25,0±3,0; аминный азот - 2,7±0,2; прочность студня среды -330±30 г.

ПолученыЗ экспериментально-производственных серии разработанных препаратов, путем смешивания сухих гостированных ингредиентов в мельнице-смесителе, составлены регламенты производства и проекты фармакопейных статей.

В микробиологической практике для биологической оценки качества питательных сред существуют методы, рекомендованные для этих целей. В первую очередь, это характеристика чувствительности и эффективности плотных и жидких сред, величина и морфология клеток, количество S- и R-форм, скорость роста тест-штаммов на плотных и жидких средах. При этом питательная среда не должна изменять морфологию, тинкториальные и физиолого-биохимические свойства культивируемого микроорганизма.

В эксперименте были изучены биологические свойства разработанных сред CAJI-1 и CAJI-2 для селективного выделения листерий на расширенном наборе штаммов L. monocytogenes, а также поставлены модельные опыты с искусственным инфицированием мазков из зева культурами листерий.

При определении чувствительности и скорости роста сред из 20 штаммов, посеянных из разведения 10"7 через (18±2) ч инкубации при температуре (37±1)° С, регистрировали рост всех засеянных штаммов листерий. В среднем на испытуемых средах вырастало 17,0±2,0 колоний, по количеству выросших колоний среды были идентичны (р=0,05). Сравниваемые препараты не различались и по размеру выросших на них колоний. На экспериментальных средах колонии в среднем имели размер 1,8±0,2 мм.

По показателю прорастания при высеве на среды САЛ-1 и САЛ-2 листерий из разведения 10~6 через (18±2) ч инкубации регистрировали рост всех засеянных штаммов листерий, в среднем на обеих средах вырастало (65±6,0) колоний (р=0,05) в Б-форме.

Результаты модельных опытов по искусственному инфицированию мазков из зева листериями (из 10 м.к./мл и 10 м.к./мл) через (18±2) ч инкубации при температуре

37±1)° С показали идентичность экспериментальных сред для выделения листерий САЛ-1 и САЛ-2 по показателю диагностической эффективности. При посеве 10 м.к. L.monocytogenes на экспериментальных средах в среднем вырастало 15-12 колоний, из 100 м.к. 69-62 колонии. Различий между экспериментальными средами не установлено (р=0,05).

Выделенные на модифицированном селективном агаре САЛ-2 культуры листерий были типичны по своим основным биологическим характеристикам, что подтверждает сбалансированность качественного и количественного состава предлагаемого препарата.

Клинические испытания разработанных сред для селективного выделения листерий проводили путем посева патологического материала от беременных женщин с акушерской патологией и новорожденных с целью оценки диагностической эффективности новых препаратов.

С помощью культурального метода, РПГА, ИФА и ПЦР обследовано 352 беременных, рожениц и родильниц, находившихся на учете в кабинете бесплодия женской консультации №2 и 132 новорожденных Перинатального центра г. Махачкала.

Все случаи листериоза были подтвержденными: в 96% -бактериологическим методом, в 68 % серологическим методом (в РПГА) и в 98-100 % случаях в ПЦР. Листерии выделялись достоверно чаще (р=0,001) со слизистой оболочки влагалища (67,4 %), чем из цервикального канала (23,3 %); реже из зева (1,3 %).

У 39% обследованных женщин диагностировано вторичное бесплодие с привычными выкидышами и мертворождаемостью. У 61 % обследованных женщин установлены диагнозы: пиелонефрит, нефропатии, токсикозы беременных, патология шейки матки, кольпиты различной этиологии, эндометриты, вагинальный кандидоз.

У 16% обследованных женщин отмечалась, микст-инфекция бактериально-вирусного характера и в 2,4% инфекции неустановленной этиологии. У всех этих женщин в акушерском анамнезе отмечено невынашивание беременности.

Во всех случаях клинического проявления инфекции неустановленной этиологии при посеве исследуемого материала на среду САЛ-1 на поверхности красного агара через 18±2 ч вырастали типичные серовато-зеленые колонии с черным центром в S-форме, d=l,7±0,2 мм. Колонии были окружены характерным черным ореолом. На модифицированном селективном агаре САЛ-2 через 18±2 ч отмечался рост колоний серого цвета, блестящих в S-форме, d=l,8±0,2 мм, окруженных коричнево-черным ореолом. Рост посторонней микрофлоры, в том числе энтерококка отсутствовал.

Из патологического материала от беременных женщин и рожениц выделено и идентифицировано до вида 19 культур L.monocytogenes (17,2%).

Изолированные штаммы L.monocytogenes были типированы в РА и отнесены к сероварам: 4в, 1/2а и 1/2с. Принадлежность 19 изолятов к виду L.monocytogenes подтверждена в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с видоспецифическими праймерами.

Колонии листерий, выросшие на предлагаемой селективной среде для выделения при испытании их биохимических свойств с помощью разработанной MTC-JI, показали соответствие полученных результатов паспортным данным для каждого штамма.

Так, все штаммы L. monocytogenes ферментировали с образованием кислоты без газа глюкозу, маннозу, рамнозу, эскулин, не ферментировали маннит, ксилозу, лактозу, арабинозу.

Исследования сохранения факторов патогенности листериями после культивирования на предлагаемых средах осуществляли путем определения (З-гемолитической и лецитиназной активности.

Сравнительное изучение Р-гемолитической активности, являющейся показателем вирулентности, проводили с использованием в качестве контроля штаммов листерий обладающих гемолитической активностью (положительный контроль) и не обладающих ею (отрицательный контроль).

Таким образом, в результате обобщенных данных, полученных на всех этапах исследований, впервые разработаны рецептурные составы и технологии промышленного изготовления комплекса питательных сред и микротест-систем для микробиологической диагностики листериоза.

Предлагаемые среды для выделения листерий обладают высокой эффективностью и чувствительностью, обеспечивая рост тест-штаммов возбудителей листериоза при посеве из максимальных разведений (10"7-10"8).

Разработанные питательные среды для селективного выделения листерий CAJI-1 и CAJI-2 освоены на предприятии НПО «Питательные среды» ФГУП «НПО «Микроген» (г. Махачкала).

Предложена схема бактериологической диагностики листериоза, позволяющая в более ранние сроки провести выделение и индикацию возбудителя листериоза, что будет способствовать проведению адекватных терапевтических и противоэпидемических мероприятий.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Исаева, Роза Изитдиновна, Ставрополь

1. Ашмарин, И. А. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.А. Ашмарин, А.А Воробьев. Л.: Медгиз. - 1962. - С. 179.

2. Бакулов, И.А. Биохимические свойства листерий / И.А. Бакулов, Цыганова А.А., В.М. Котляров // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии, эпизоотологии. 1983. - С. 189-190.

3. Бакулов, И.А. К вопросу таксономии бактерий рода Listeria / И.А. Бакулов//Ветеринария. 1983. - №7. - С. 31-34.

4. Бакулов, И.А. Листериоз как пищевая инфекция / И.А. Бакулов, Д.А. Васильев //Вопросы диагностики и профилактики. Ульяновск. - 1991. -48 с.

5. Бакулов, И.А. Листерии обживают холодильник / И.А. Бакулов // Ветеринарная газета. 1992. - №9. - С. 4.

6. Бакулов, И.А. Эпидемиологические и эпизоотологические аспекты листериоза / И.А. Бакулов, В.М. Котляров, Т.И. Шестиперова // Журнал микробиологии. 1994. - №5. - С. 100-105.

7. Баснакьян, И.А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами / И.А.Баснакьян. М.: Медицина. - 1992.- 124 с.

8. Баснакьян, И.А. Стресс у бактерий / И.А. Баснакьян. М.: Медицина. -2003. - С. 50-52.

9. Воробьев, А.А. Полимеразная цепная реакция и ее применение для диагностики в дерматологии / А.А. Воробьев. М., 2004. - С. 69.

10. ГОСТ Р 51921-2002. Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes. М., 2002.

11. Диденко, Л.В. Ультраструктурное иммуноцитохимическое изучение Listeria monocytogenes с различным уровнем продукции факторов патогенности / Л.В. Диденко, С.А. Ермолова, Н.Д. Константинова, Н.А.

12. Варфоломеева, И.С. Тартаковский // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1988. - №4. - С. 18-22.

13. Ермолаева, С.А. Изменение уровня экспрессии факторов вирулентности Listeria monocytogenes под влиянием внешних условий. / С.А. Ермолаева, Ю.Ф. Белый, И.С. Тартаковский // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2000. - №1. - С. 17-19.

14. Ермолаева, С.А. Регуляция экспрессии факторов вирулентности у Listeria monocytogenes / С.А. Ермолаева, И.С. Тартаковский // Журнал микробиологии. 2003. - №3. - С. 106-110.

15. Ермолаева, С.А. Генетические механизмы вирулентности Listeria monocytogenes / С.А. Ермолова // Генетика. 2001.- № 37. - С. 286-293.

16. Зайцева, Е.А. Микробиологическая характеристика Listeria monocytogenes, изолированных из различных источников в Приморском крае / Е.А. Зайцева, Г.П. Сомов // Журнал микробиологии. 2006. - № 2. - С. 3-6.

17. Зайцева, Е.А. Ускоренный метод дифференциации бактерий рода Listeria / Е.А. Зайцева, Т.А. Глазырина, Г.П. Сомов // Клиническая лабораторная диагностика. 2009. - №6. - С. 46-47.

18. Каталог: реактивы для биохимии и исследований в области естественных наук. 2002-2003 гг. // Sigma. 2003. - С. 61.

19. Карпова, А.А. Очистка и характеристика листериолизина О Listeria monocytogenes. / А.А.Карпова, Ю.Ф. Белый, И.С. Тартаковский, С.В. Прозоровский // Журнал микробиологии. 1994. - №4. - С. 3-7.

20. Карпова, А.А. Очистка и частичная характеристика белков клеточной стенки Listeria monocytogenes / JI.A. Карпова, Ю.Ф. Белый, И.С. Тартаковский, С.В. Прозоровский // Журнал микробиологии. 1995. -№2.-С. 15-18.

21. Карпова, А.А. / Т.И. Карпова, Н.М. Шустрова, А.Е. Снегирева, С.А. Шевелева, И. Куваева, И.С.Тартаковский // Журнал микробиологии. -2001.-№1.- С. 80-81.

22. Карпова, А. А. Новые методы идентификации Listeria monocytogenes / Т.И. Карпова, С.А. Ермолаева, И.В. Лопырев, Н.С. Бродинова, И.С. Тартаковский Х.А. Васкез-Боланд // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2001. - № 3. - С .66-273.

23. Карпова, А.А. Эффект конститутивной активности ионов патогенности у Listeria monocytogenes / Т.И. Карпова, Б.И. Маракуша, Т.П. Сапенко и др. // Журнал микробиологии. 2005. - № 3.- С. 3-8.

24. Котляров, В.М. Проблема листериоза на рубеже тысячелетий / В.М. Котляров // Листериоз на рубеже тысячелетий: сборник. Покров, 1999.-С. 48-52.

25. Красовский, В.В. Разработка и апробация метода полимеразной цепной реакции для детекции возбудителя листериозной инфекции / В.В .Красовский, С.И. Похил, А.П. Лиманский и др. // Клиническая лабораторная диагностика. 2000. - №6. - С. 37-40.

26. Кривоносова, О.В. К определению вирулентности листерий / О.В.Кривоносова, И.А. Бакулов // Ветеринария. 1973. - № 3. - С. 4446.

27. Лабораторная диагностика листериоза животных и людей, меры борьбы и профилактика: методическое пособие / Госагропром, МЗ СССР. -М., 1987.-20 с.

28. Листериоз, передаваемый через продукты питания // Бюллетень ВОЗ. -1988. № 66 (4). - С. 1-10.

29. Листериоз: методические рекомендации Комитета Здравоохранения (№11) г.Москвы.-М., 2001.

30. Маракуша, Б.И. Характеристика штаммов Listeria monocytogenes, с помощью пульс-электрофореза / Б.И. Маракуша, К. Дарвиш, И.С. Тартаковский // Журнал микробиологии. 1996. - № 3. - С. 60-64.

31. Меджидов, М.М. Использование непищевого сырья в производстве микробиологических питательных сред / М.М. Меджидов, 3.3. Султанов. Махачкала. - 1986. - 71 с.

32. Меджидов, М.М. Использование концентрата кормового лизина в получении питательных сред / М.М. Меджидов, 3.3. Султанов, JI.C. Кулакова и др. // Журнал микробиологии. 1987. - №7. - С. 102.

33. Меджидов, М.М. Состояние и перспективы развития производства отечественных питательных сред / М.М. Меджидов, Ш.М. Меджидов, С.М. Омарова // Материалы V съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А.Овчинникова. М., 2008. - С. 277-278.

34. Меджидов, М.М. Микротест-системы в лабораторной диагностике инфекционных болезней / М.М. Меджидов, Ш.М. Меджидов, С.М.Омарова. М.: Медицина, 2006. - 70 с.

35. Меджидов, М.М. Справочник по микробиологическим питательным средам / М.М. Меджидов. М.: Медицина, 2003. - 208 с.

36. Мейнелл, Дж. Экспериментальная микробиология / Дж. Мейнелл, Э. М. Мейнелл . М.: Мир, 1967.

37. Методические рекомендации по бактериологическому контролю пищевых продуктов на наличие листерий. Ульяновск, 1992. - 24 с.

38. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах: МУК 4.2.1122-02.

39. Омарова, С.М. Питательная среда для выделения и накопления листерий / С.М. Омарова, Э.М. Ахмедова, Ш.М. Меджидов, Г.М. Тагирова//Журнал микробиологии. 2000. - №1. - С. 45-48.

40. Омарова, С.М. Питательная среда для накопления листерий / С.М. Омарова, Э.М. Ахмедова, Ш.М.Меджидов, Г.М. Тагирова; Патент № 2158758, 2000.

41. Омарова, С.М. Питательная среда для идентификации листерий / С.М. Омарова, Ш.М. Меджидов, Э.М. Ахмедова; Патент № 2201957, 2001.

42. Омарова, С.М. Питательные среды для изучения биологических свойств листерий / С.М. Омарова, Э.М. Ахмедова, П.М. Муртазалиева // Журнал микробиологии. 2007. - №3. - С. 95-97.

43. Омарова, С.М. Биологические свойства листерий культивируемых на новых средах для накопления и выделения / С.М. Омарова // Журнал микробиологии. 2007. - №3. - С. 90-92.

44. Омарова, С.М. Современные препараты для диагностики листериоза // Журнал «Успехи современного естествознания». 2007. - №3. - С.97-98.

45. Омарова, С.М. Листериозная инфекция в патологии человека и методы микробиологической диагностики: монография /С. М. Омарова.-Махачкала, 2007. 100 с.

46. Омарова, С.М. Разработка питательных сред и микротестсистемы для накопления, выделения и идентификации листерий: автореферат дис. . докт. биол. наук / С.М. Омарова. Махачкала, 2007.

47. Омарова, Э.Б. Способ получения стимулятора роста микроорганизмов из кормовых дрожжей / Э. Б. Омарова, М. М. Меджидов, 3. 3. Султанов; Патент на изобретения, БИМП. 2004. - №2227158/11, 3 : 516.

48. Онищенко, Г. Г. Контроль за инфекционными заболеваниями -стратегическая задача здравоохранения России в XXI веке / Г.Г. Онищенко // Журнал эпидемиологии и инфекционных болезней. 2002. - №6. -С. 4-16.

49. Онищенко, Г.Г. Эпидемиологическая обстановка в России в 1991-1996 г.г. по заболеваемости социально обусловленными инфекционными заболеваниями / Г.Г. Онищенко // Журнал микробиологии. 1998. - №1. - С. 24-35.

50. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. МУК 4.2.1890-04.

51. Покровский, В.И. Листериоз / В.И. Покровский, Б.А. Годованный // Инфекционные болезни. М.: Медицина, 1996. - С. 291-296.

52. Покровский, В.И. Актуальные направления совершенствования профилактики инфекционных болезней / В.И. Покровский, Г.Г. Онищенко, Б.И. Черкасский // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2000. - №1. - С. 4-8.

53. Прозоровский, C.B. Лабораторная диагностика листериоза в России: проблемы и перспективы / C.B. Прозоровский, Л.Г. Подунова, И.С. Тартаковский и др. // Материалы Международного Симпозиума. М., 1995. - С. 90-100.

54. Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных // Сборник санитарной ветеринарии. М., 1996.

55. Рахманова, А.Г. Листериоз / А.Г. Рахманова, В.К. Пригожина // Справочник по инфекционным болезням. СПб., 1999. - С. 172-174.У

56. Родина, Л.В. Состояние эпиднадзора за листериозом в г. Москве / Л.В. Родина, Г.М. Маненкова, Н.В. Степанова и др. // Листериоз на рубеже тысячелетий: сборник. Покров, 1999. - С. 129-131.

57. Сахаров, П.П. Листериозная инфекция / П.П. Сахаров, Е.И. Гудкова. -М.: Медгиз, 1959.

58. Сомов, Г.П. Сапрофитизм и паразитизм патогенных бактерий / Г.П. Сомов, В.Д. Литвин. Новосибирск: Наука, 1988. - 136 с.

59. Тартаковский, И.С. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика / И.С. Тартаковский // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2000. -№2 (2).-С. 20-30.

60. Тартаковский, И.С. Листерии: Роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика / И.С. Тартаковский, В.В. Малеев, С.А. Ермолаева. М. ¡Медицина для всех, 2002. - 198 с.

61. Тартаковский, И.С. Листериоз / И.С.Тартаковский // Частная эпидемиология. М., 2002. - С. 355-359.

62. Черкасский, Б.Л. Инфекционные и паразитарные болезни человека / Б.Л. Черкасский //Медицинская газета. 1994. - С. 320.

63. Черкасский, Б.Л. Теоретические аспекты проблемы надзора за пищевыми зоонозами / Б.Л. Черкасский // Международный симпозиум «Пищевые зоонозы». М., 1995.

64. Черкасский, Б.Л. Пищевые зоонозы людей в России / Б.Л. Черкасский // Международный симпозиум «Пищевые зоонозы». М., 1995.- С. 37-41.

65. Шарма, Р.К. Совершенствование бактериологического анализа для индикации листерий в продуктах импортируемых в Россию: автореферат дис. . канд. мед. наук / Р.К. Шарма. М., 1999. - 24 с.

66. Adams, T.J. Listeria monocytogenes iron acquisition systems of Listeria monocytogenes / T.J. Adams, S. Vartivarian, R.E. Cowant // Infec and Immun. 1990. - V. 58, №8. - P. 2715-2718.

67. Audurier A.Phage typing of Listeria monocytogenes /А. Audurier, C. Martin С // Int. J. Food Microbiol. 1989. - V. 8. - P.251-257.

68. Bakardjiev, A.I. Listeria monocytogenes trafficsfrom maternal organs to theplacenta and back / A.I.Bakardjiev, J.A. Theriot, D.A. Portnoy // PLoS Pathogens. 2006. -V. 2. - P. 623-631.

69. Bal, N.The Cad A A.T. Hase from Listeria monocytogenes: Abstr 3 rd

70. European Biophysics Congress, Munchen Sept. 9-13, 2000 / N.Bal, E. Mintz, Wu Clen Chou, F. Guillain, P. Catty // Eur. Biophys J. 2000. - V.29.- № 4-5. P. 326.

71. Bhunia, A.K. Antibodies to Listeria monocytogenes. / A.K. Bhunia // Crit.

72. Rev. Microbiol. 2008. - V. 23. - P. 77-107.

73. Belyi, Y.E. Intracellular parasitism of microorganisms / Y.E. Belyi // Springer- Verlag Gmbh and Co. KG. 1996.

74. Bille, Y. Epidemilogy of human listeriosis in Europe, with special referenceto the Swiss outbreak / Y. Bille // A J.Miller, J.L.Smith, and G.A.Somkuti (ed), Foodborn Listeriosis. New York: Elsevier, 1990. - P. 71-74

75. Bille, J.Apl Listeria, a new and promising One Day System to identify > Listeria isolates / J. Bille, B. Catimel, E. Bannerman et al. // Appl. Environ

76. Microbiol. 1992. - V. 58. - P. 1857-1860.

77. Bonnemain, C. Differential roles of multiple signal peptidases in the virulenceof Listeria monocytogenes / C. Bonnemain, C. Raynaud, H. Reglier-Poupet, F. Dubai 1 et.al. // Mol. Microbiol. 2004. - V. 51, № 5. - P. 1251-1266.

78. Borucki Monica, K. Listeria monocytogenes seratype identification by PCR /

79. K. Borucki Monica, R. Call Douglas // J.Clin.Microbiol. 2003. - V. 41. - № 12. - P. 5537-5540.

80. Bojsen-Moller, J. Human Listeriosis: diagnostic, epidemiologie and clinical studies / J. Bojsen-Moller // Acta Pathol Microbiol. Scand. Sect. B Suppl. 1972. V.229. - P.72-92.

81. Bortolussi, R. An ongoing problem: perinatal infection due to Listeria monocytogenes an old pathogen reborn / R. Bortolussi // Clin and Invest. Med. 1984. - V. 7. - №4. - P. 213-215.

82. Breer, C. Listeria and food / C. Breer, K. Schopfer // Lancet. 1988. - V. 11. - P. 1022.

83. Cabanes, D., Auto, a surface associated aytolisin of Listeria monocytogenes reguiret for entry into eukaryotic cells and virulence / D. Cabanes, O. Dussurget, P. Dehoux, P. Cossart // Mol. Microbiol. 2004. - V.51, № 6. - P. 1601-1614.

84. Cain, D.B. An unusual case of cutaneous listeriosis / D.B. Cain, V.L. Mc Cann // Y.Clin. Microbiol. 986. - V. 23. - P. 976-977.

85. Carvajal, A. endocarditis due to Listeria monocytogenes / A. Carvajal, W.Fatal Frederiksen // Rew. Intect. Dis. 1988. - V. 10. - P. 616-623.

86. Cassiday, P.K., Evaluation of ten selective direct plating media for enumeration of Listeria monocytogenes in hams and oysters / P.K. Cassiday, R.E. Brackett, L.R . Beuchat // Food Microbiol. 1989. - V. 6. - № 2. - P. 113-125.

87. Christie, R. A note on lytic phenomenon shown by group B streptococcus / R. Christie, N.E. Atkins, E. Munch-Petersen // J. Exp. Biol. Med. Sci. -1994. V. 22, № 8. - P. 197-200.

88. Chirgwin, K. Listeria monocytogenes osteomyelitis / K. Chirgwin, S. Gleick // Arch. Intern. Med. 1989. - V. 149. - P. 931-932.

89. Ciesielski, C.A. Listeriosis in the United States: 1980-1982 / C.A. Ciesielski, A.W. Hightower, S.K. Parsons, C.V. Broome // Arch.Intern. Med. 1988. -V. 148.-P. 1416-1419.

90. Cordon, S. Listeria monocytogenes cholecystitis (letter) / S. Cordon, C. Singer // J. Infect. Dis. 1986. - V. 154. - P. 918-919.

91. Cossart, P. The actin-based motility of the facultative intracellular pathogen Listeria monocytogenes / P. Cossart, C. Kocks // Molecular Microbiol. -1994. V. 13. - P. 395-402.

92. Curtis G.D.W. A selective differential medium for the isolation of Listeria monocytogenes/G.D.W.Curtis, R.G. Mitchell, A.F.King, E.Y.Griffin IILett. Appl. Microbiol. -1989. V. 8. P. 95-98.

93. Del Corral, F. Evaluation of the API-ZYM system for the identification of Listeria 1990 / F. Del Corral, R.L. Buchanan // Food Microbiol. 1990. - V. 7.-P. 99-106.

94. Domingo, P. Pneumonia due to Listeria monocytogenes (letter) / P. Domingo, Y. Serra, M.A. Sambeat, V. Ausina // Clin. Infect. Dis. 1992. -V. 14. - P. 787-789.

95. Dominguez.New methodology for the isolation Listeria monocytogenes from heavily contaminated environments / L. Domínguez Rodriguez, G.S. Fernandes, Y.F. Garayzabal, E.R. Ferri // Appl. Environ. Microbiol. 1984. - V. 47. - P. 1188-1190.

96. Donnelly, C.W. Method for flow cytometric detection of Listeria monocytogenes in milk / C.W. Donnelly, G.Y. Baigeat // Appl. Environ. Microbiol. 1986. - V. 52. - P. 689-695.

97. Donnelly,C.W.Comparison of heat resistance of Listeria monocytogenes in milk as determined by two methods / C.W. Donnelly, L.S. Donnelly // J. Food Prot.-1987. V. 50. - P. 14-17.

98. Donnelly, C.W. Listeria monocytogenes: a continuing Challenge / C.W. Donnelly // Nutr. Rev. 2001.

99. Donker-Voet, J. Listeria monocytogenes: some biochemical and serological spectrs / J. Donker-Voet // Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. -1972. V. 10. -P. 287-291.

100. Doyle, M.P. Comparison of procedures for isolating Listeria monocytogenes in soft surfaceripened cheese / M.P. Doyle, J.L. Schoeni // J. Food. Prot. -1987. V. 50. - P. 4-6.

101. Durand, M.L. Acute bacterial meningetidis in adults: a review of 493 episods / M.L. Durand, S.B. Calderwood, D.Y. Weber et al. // N. Engl. J. Med. 1993. - V. 328. - P. 21-28.

102. Dumont, J. Bacille semblable a celui du rouget du pore rencontri dans le L.C.R. d' un miningitique / J. Dumont, L. Cotoni // Ann. Inst. Pasteur. -1921.-V. 35.-P. 625-633.

103. Dussurget, O. Molecular determinants of Listeria monocytogenes virulence / O. Dussurget, J.Pizarro-Cerda, P. Cossart // Annu. Rev. Microbiol. 2004. -V.58.-P. 587-610.

104. Edgcomb, M. Electron paramagnetic resonance studies of the membrane fluidity of the foodborn pathogenic psychrotroph Listeria monocytogenes / M. Edgcomb, S. Sirimanne, B.J. Wilkinson, P. Drocein, Morse R. 2000. -V. 1463.-P. 31-42.

105. Ermolaeva, S. A sample method for the differentiation of Listeria monocytogenes based on induction of lacithinase activity by charcoal. Int. / S. Ermolaeva, T. Karpova, S. Novella et al. // J. Food Microbiol. 2003. -V. 82. - P. 87-94.

106. Farber, Y.M. Neonatal listeriosis due to cross infection confirmed by isoenzyme typing and DNA fingerprinting (letter) / Y.M. Farber, Peterkin P.J., A.O. Carter, P.V. Varughese, F.E. Ashton, E.P. Ewan // J.Infect. Dis. - 1991. -V. 163.-P. 927-928.

107. Fuzi, Miklos. Erysipelothrix rhusiopathiae es Listeria monocytogenes diferencialasa antibiotikum korongokkal / Fuzi Miklos // Kiserl orvostud. -1983. V. 35, № 3. - P. 289-291.

108. Fraser, Y.A. Rapid defection of Listeria spp. in food and environmental samples by esculin hydrolysis / Y.A. Fraser, W.H. Sperber // J.Food. Prot. -1988.-V. 51.-P. 762-765.

109. Frehel, C. Capacity of ivanolysin O to replace listerilysin O in phagosomal escape and in vivo survival of Listeria monocytogenes / C. Frehel, M-A. Lety, N. Autret, J.-L. Beretti, P.Berche, A.Charbit // Microbiology. 2003. -V. 149.-№3.-P. 611-620.

110. Jersek, B. Repetitive element seguencebaced PCR for species and strain discrimination in the genus Listeria.Lett. / B. Jersek, E. Tcherneva N.Rijpens, L.Herman // Appl. Microbiol. 1996. - V. 23. - P. 55-60.

111. Hamon, M.I. Listeria monocytogenes: a multifaceted model / M.I. Hamon, H.Bierne, P.Cossart//Nat. Rev. Microbiol. 2006. - V. 4. - P. 423-434.

112. Hayes, P.S. Isolation of Listeria monocytogenes from raw milk / P.S.Hayes, Y.C. Feeley, L.M. Graves et al. // Appl. Environ. Microbiol. -1986. V. 51. - P. 438-440.

113. Hitchins, A.D. FDA Bacteriological Analytical Manual, Listeria monocytogenes / A.D. Hitchins. 8 th edition. - 1995.

114. Holoshitz, Y. Listeria monocytogenes pericarditis in a chronically hemo dialyzed / Y. Holoshitz, M. Schnider, A.Yaretzky, Y.Berncheim, A.Klajman: patient. 1984. - V. 228. - P. 34-37.

115. Garcia, Y.A. Revision of antigenic structure of the genus Listeria FEMS Lett. / Y.A. Garcia, L. Dominquez, V. Briones et al. // Microbiol. 1990. -V. 67.-P. 113-120.

116. Gellin, B.G. Listeriosis Study Group. The epidemiology of listeriosis in the United States 1986. / B.G. Gellin, C.V. Broome, W.T. Bill et al. // Am. J.Epidemiol. - 1991. - V. 1133. - P. 392-401.

117. Gahan, C.G.M. Gastrointestinal phase of Listeria monocytogenes infection / C.G.M. Gahan, C.Hill // J. Appl. Microbiol. 2005. - V. 98. - P. 1345-1353.

118. Gholizadeh, Y. Serodiagnosis of listeriosis based upon detection of antibodies against recombinant truncated of listeriolysin / Y. Gholizadeh, C. Poayrt, M. Livin et al. // O. J. Clin. Microbiol. 1996. - V. 34. - P. 13911395.

119. Goulet, V. Epidemic de listeriosis en France: bilan final et resultants de 1, ingukte epidemiologiqeu / V. Goulet, A.Lepoutre, Y.Rocourt et al. // Bulle. Epidemiol. Hebdom. 1993. - V. 4. - P. 13-14.

120. Gouin, E. The virulence gene cluster of Listeria monocytogenes is also present in Listeria ivanovii an animal pathogen, and Listeria seeligeri; a nonpathogenic species / E. Gouin, Y. Mengaud, P. Cossart // Infect. Immun. 1994.-V. 62.-P. 3550-3553.

121. Greene, Sonya L. Negative regulation of Pfr A the key activator of Listeria monocytogenes virulence gene expression is dis-pensable for bacterial pathogenesis / L.Greene Sonya, E. Freitag Nancy // Microbiology. 2003. -V. 149, №1.-P. 111-120.

122. Guin, E. The virulence gene cluster of Listeria monocytogenes is also present in Listeria ivanovii an animal pathogen, and in Listeria seeligeri, a nonpathogenic species / E. Guin, Y. Mengaud, P. Cossart // Infect. Immun. -1994.-V. 62.-P. 3550-3553.

123. Lammerding, A.M. Evalution of enrichment procedures for recovering Listeria monocytogenes from dairy products / A.M. Lammerding, M.P. Doyle // Int. J. Food Microbiol. 1989. - V. 9. - P. 249-268.

124. Lammerding, A.M. Неселективный бульон обогащения (PE/FSIS) / A.M. Lammerding, M.P. Doyle // Int. J. Food Microbiol. 1991. - V. 9. - P. 249.

125. Lee, W.H. Improved Listeria monocytogenes selective agar / W.H. Lee, W.H. D. McClain // Appl. Environ. Microbiol. 1986. - V. 52. - P. 12151217.

126. Leighton, I. Use of selective agents for the isolation of Listeria monocytogenes / I. Leighton // Med. Lab. Sci. 1979. - V. 36, № 3. - P. 283-288.

127. Lennon, D. Epidemic perinatal Listeriosis / D. Lennon, B. Lewis, C. Mantell et al. // Pediat. Infec. Dis. 1984. - V. 3, № 1. - P. 30-34.

128. Linnan, M.J. Epidemic Listeriosis associated with Mexicanstyle cheese / MJ. Linnan, L. Mascola, X.D. Lou et al. // N. Engl. Y. Med. 1988. - V. 319.-P. 823-828.

129. Lou, Y. Adaptation to sublethal environmental stresses protects Listeria monocytogenes against lethal preservation factors / Y. Lou, A.Youset // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63. - P. 1252-1255.

130. Lovie, M. Comparison of ribotyping, arbitrarily primed PCR, and Pulsed-field gel electrophoresis for molecular typing of Listeria monocytogenes / M. Lovie, P. Iayarathe, J. Luchsinger et al. // J.Clin.Microbiol. 1996. -V. 34.-P. 15-19.

131. Lovett, Y. Listeria monocytogenes in raw milk: detection, incidence, and patogenicity / Y. Lovett, D.W. Francis, Y.M. Hunt // Y.Food Prot. 1987. -V. 50.-P. 188-192.

132. Lovett, Y. Isolation and identification of Listeria monocytogenes in dairy products / Y. Lovett // J.Assoc. Off. Anal. Chem. 1988. - V. 71. - P. 658660.

133. Lovett, Y. High temperature short-time pasteurization inactivates Listeria monocytogenes / Y. Lovett, J.V. Wesley, M.Y. Vandermaaten et al. // J.Food. Prot. - 1990.

134. Lukinmar, S. Listeria monocytogenes isolates from invasive infections variation of sero and genotypes during an 11-year period in Finland / S. Lukinmar, M. Micttinen, U.-M. Nakari et al. // J.Clin Microbiol. - 2003. -V. 41, № 4. - P. 1694-1700.

135. Kaufmann, S.H.E. immunity to intracellular bacteria / S.H.E. Kaufmann // Annu. Rev. Immunol. 1993. - V. 11. - P. 129-163.

136. Katharion, S. Levels of Listeria monocytogenes hemolysin are not directly proportional to virulence in experimental infection in mice / S. Katharion, Y.Rocourt, Y. Hof, W. Goebel // Infect. Immun. 1988. - V. 56 P. 534-536.

137. Kempton G. Listeria monocytogenes: a protocol for rapid identification / G. Kempton // Med. J. Austr. 1989. - P. 150-607.

138. Kerr, K.G. Evaluation of the Mast ID and API 50CH systems for identification of Listeria spp. / K.G. Kerr, N. A. Rotowa, P.M. Hawkey, R.W. Lacey // Appl. Environ. Microbiol. 1990. - P. 657-660.

139. Klinger, Y.D. Comparative studies of nucleic acid hybridization assay for Listeria monocytogenes in foods / Y.D. Klinger, A. Johnson, D. Croan et al. // J.Assoc. Anal. Chem. 1988. - V. 71. - P. 669-673.

140. Klinger, Y.D. Heat resistance of Listeria: strain difference and effects of meat type and curing salts. Lett. / Y.D. Klinger, C. Pritchet, A. Norris, G.C. Mead // Appl. Microbiol. 1990. - V. 10. - P. 251-255.

141. Mazzulli, T. Pleural fluid infection caused by Listeria monocytogenes: case report and review / T. Mazzulli, I.E. Salit // Rev. Infect. Dis. 1991. - V. 13. - P. 564-570.

142. Mc Bride, M.E. A selective medium for the isolation of Listeria monocytogenes from mixed bacterial populations / M.E. Mc Bride, K.F.Girard // J.Lab. Clin. Med. 1960. - V. 55. - P. 153-157.

143. Mc Clain, D. Development of USDA-FSIS method for isolation of Listeria monocytogenes from raw meat and poultry / D. Mc Clain, W.H. Lee // J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1988. - V. 7. - P. 660-664.

144. Mc Lauchlin, J. Human listeriosis in Britain, 1967-1985, a summary of 72 cases. I. Listeriosis during pregnancy and in the newborn / J. Mc Lauchlin // Epidemiol. Infect. 1990. - V. 104. - P. 181-189.

145. Millohanic, E. Transcription tome analysis of Listeria monocytogenes identifies three groups of genes differently regulated by Prf A. / E. Millohanic, P. Glasser, Y.-Y. Copper // Mol. Microbiol. 2003. - V. 47, № 6.-P. 1613-1625 (b).

146. Milohanic, E. Identification of new loci involved in adhesion of Listeria monocytogenes to eukaryotic cells / E. Milohanic, B. Pron, P. Berche et al. // Microbiology. 2000. - V. 146, №3. - P. 731-739.

147. Monnier, A.L. Invasion of the placenta during murine listeriosis / A.L. Monnier, O.F. Join-Lambert, F.Jaubert et al. // Infect. Immun. 2006. -V. 74. - P. 663-672.

148. Neiman, R.E. Listeriosis in adults: a changing pattern. Report of eight cases and review of the literature, 1968-1978. / R.E. Neiman, B. Lorber // Rev. Infect. Dis. 1980. - V. 2. - P. 207-227.

149. Nyfelt, A. Etiologic de la mononuncliose / A. Nyfelt // C.R.Soc.Biol. -1979. -V. 101.-P. 590-591.

150. Olive, M. Prnciples and application of methods for DNA-based typing of microbial organisms / M. Olive, P.Bean //1. Clin. Microbiol. 1999. -V. 37. -P. 1661-1669.

151. Ooi, S.T. Gastroenteritis due to Listeria monocytogenes / S.T. Ooi, B. Lorber // Clin.Infect. Dis. 2005. - V. 40. - P. 1327-1332.

152. Paoli, G.C. Listeria monocytogenes /G.C. Paoli, A.K. Bhunia, D.O. Bayleset al. // Foodborne Pathogens: Microbiology and Molecular Biology; edited by P. Fratamico, A.K. Bhunia, J.L. Smith, Caister Academic. -Norfolk. 2005. - P. 295-325.

153. Peel, M. Temperature-dependent expression of flagella of Listeria monocytogenes studied by electron microscopy, SDS- PAGE and Western blotting / M. Peel, W.Donachie, A. Shaw // J.Gen. Microbiol. 1988. - V. 143. - P. 2171-2178.

154. Piffarite, Y.C. Genetic characterization of clones of the bacterium Listeria monocytogenes causing epidemic disease. 1989. / Y.C. Piffarite, Y. Kressebuch, M. Aeschbacher et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. 1989. - V. 86. -P. 3818-3822.

155. Pine L., Physiological studies on the growth and utilization of sugars by Listeria species / L. Pine, B. Malcolm, Y.B. Brooks, M.J. Daneshvar // Con. I. Microbiol. 1989. - V. 35. - P. 245-254.

156. Pizarro-Cerda, J. Subversion of cellular functions by Listeria monocytogenes / J. Pizarro-Cerda, P. Cossart // J. Pathol. 2006. - V. 208. - P. 215-223.

157. Ralovich, B. Listeriosis Research: Present Situation and Perspective / B.Ralovich; Akademiai Kiado. Budapest, 1984.

158. Ralovich, B. Detection and epidemiological typing of Listeria strains diagnostic methods for Listeria infection / B. Ralovich // Acta. Microbiol. Hung. 1993. - V. 40, № 1. - P. 3-38.

159. Roberts, A.J. Pathogen, host and environmental factors contributing to the pathogenesis of listeriosis / A.J. Roberts, M.Wiedmann // Cell. Mol.Life Sci. 2003. - V. 60. - P. 904-918.

160. Rocourt, J. Listeria monocytogenes: the state of the art. / J. Rocourt // Dairy Food Environ Sanitation. 1994. - V. 14. - P. 70-82.

161. Rocourt, J. The genus Listeria and Listeria monocytogenes: phylogenetic position, taxonomy and identification / J.Rocourt // E.T. Ryser and E.H. Marth (ed) Listeria, listeriosis and food safety. 2nd ed. Marcel Dekker Inc. -New York. -1999. - P. 1-20.

162. Rodriguez, L.D. Microplate technique to determine hemolytic activi ty for routine typing of Listeria strains / L.D. Rodriguez, Y.A. Vazguez-Boland, Y.F.D. Garayazabae et al. // J. Clin. Microbiol. 1986. - V. 24. - P. 99103.

163. Sallen, B. Comparative analysis of 16S and 23S rRNA seguences of Listeria species. Int. / B. Sallen, S. Rajoharison, S. Desverenne et al. // J. Syst. Bacteriol. 1996. - V. 46. - P. 669-674.

164. Schid, M.W. Evalutionary history of the genus Listeria and its virulence genes. Syst. / M.W. Schid, Y.W. Ng Eva., R. Lampidis et al. // Appl. Microbiol. 2005. - V. 28, № 1. - P. 1-18.

165. Schuchat, A. Epidemiology of human listeriosis / A. Schuchat, B. Swaminathan, C.V. Broome // Clin. Microbiol. Rev. 1991. - V. 4. - P. 169183.

166. Seeliger, H.P.R. Genus Listeria / H.P.R. Seeliger, D Jones // P.H.A. Sneath, N.S. Mair, M.E. Sharpe, J.G Holt: Bergey's manual of Systematic bacteriology. Williams and Wilkins, Co., M.D. Baltimore. -9th Ed., V. 2. -1986.-P. 1235-1245.

167. Seeliger, H.P.R. Listeriosis history and actual development. 1988 / H.P.R. Seeliger // Infection. - 1988. - V. 16. - P. 80-84.

168. Seeliger, H.P.R. Listeriosis History and actual developments / H.P.R. Seeliger // Infection. 1988. - V.2, Suppl. 16. - P. 80-84.

169. Sheehan, B. Molecular and Genetic Determinants of the Listeria monocytogenes infections process / B. Sheehan, C. Kocks, S. Dramsis // Current Topics in microbiology and immunology. 1994. - V. 192. - P. 187216.

170. Skalka, Boris. Selective diagnostic medium for pathogenic Listeria spp. / Boris Skalka, Juri Smola // J. Clin Microbiol. 1983. - V. 18, № 6. - P. 1432-1433.

171. Siragusa, G.R. Petite colony formation by Listeria monocytogenes and Listeria species grown on esculin-containing agar / G.R. Siragusa, L.A. Elphingstone, P.L. Wiese et al. // Can. J. Microbiol. 1990. - V. 36, № 10. - P. 697-703.

172. Slutsker, L. Listeriosis / L. Slutsker, M.C. Evans, A. Schuchat // Emerging Disease 4. W.M. Scheld, W.A. Craig, Y.M. Hughes (ed). ASM Press, Washington D.C. - 2000. - P. 83-106.

173. Smith, A.R.B. Listeriosis and pregnancy / A.R.B. Smith, B.A. Liebermann, L. Allen, A.Y. Barson // Lancet. 1983. - V. 11. - P. 1364.

174. Smola, Y. Possibilities of differentiation of listerial hemolysins by synergistic hemolytic reactions (CAMP reaction) / Y. Smola // Int. J.Food Microbiol. 1989. - V. 8. - P. 265-267.

175. Swaminathan, B. Sampling isolation and rapid detection / B. Swaminathan, P.S. Hayes // Isolation and identification of Listeria monocytogenes 1989, US Department of Health and Human Services, CDC. Atlanta, 1989. - P. 21-37.

176. Tham, W. Listeriosis patient infected with two different Listeria monocytogenes strains / W. Tham, J. Alden, H. Enicsson et al. // Epidemiol and. Infec. 2001. - V. 128, № 1. - P. 105-106.

177. Tienungoon, S. Growth limits of Listeria monocytogenes as a function of temperature, pH, NaCl, and lactic acid / S. Tienungoon, D.A. Ratkowky T.A. McMeekin, T.Ross // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66, № 11. - P. 4979-4987.

178. U. S. Food and Drug Administration. Bacteriogical analytical manual, chapter 29- Listeria isolation, revised methods of analysis: notice. / U.S. Food // Fed. Registr. 1988. - V. 53. - P. 44147-44153.

179. Yn, V.L.Disseminating Listeriosis presenting as acute hepatitis: case reports and review of hepatic involvement in Listeriosis / V.L. Yn, W.P. Miller, E.Y. Wing et al. // Am. J. Med. 1982. - V. 73. - P. 773-777.

180. Van-Netten, P. Liquid and solid media for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes and other Listeria spp. / P. Van-Netten, J. Perales, A. Van-de-Moosdijk et al. // Int. J.Food. Microbiol. 1989. - V. 8. - P. 299-316.

181. Van-Netten, P. Liquid and solid media for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes / P. Van-Netten, Y. Perales, A. Van-de-Moosdijk // J. Food Microbiol. R. 1989. - P. 299-316.

182. Vazguez-Boland, Y.A. Listeria monocytogenes CAMP reaction / Y.A. Vazguez-Boland, L. Dominguez, Y.F. Fernandez-Garayzabal, G. Suarez // in Microbiol. Rev. 1992. - V. 5. - P. 343.

183. Vazguez-Boland, Y.A. Patogenicity island and virulence evolution in Listeria / Y.A. Vazguez-Boland, G. Dominguez-Bernal, B. Gonzalez-Zorn et al. // Microb. Int. 2001. - V. 3. - P. 571-584.

184. Vazguez-Boland, Y.A. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants / Y.A. Vazguez-Boland, M. Kuhn, P. Berche et al. // Clin. Microbiol. Rev. 2001. - V. 14. - P. 584-640.

185. Varabioff, Y. Listeriosis human / Y. Varabioff // J. Food Prof. 1990. - V. 53. - P. 555.

186. Weaver, R.F. Morphological, physiological, and biochemical characterization / R.F. Weaver // Yames G.L. (ed.). Isolation and identification of Listeria monocytogenes; US Department of Health and Human Services, CDC. Atlanta, 1989. - P. 39-43.

187. Welshimer, H.Y. Isolation of Listeria monocytogenes from vegetation / H.Y. Welshimer // J. Bacteriol. 1968. - V. 95. - P. 300-303.

188. Welshimer H.J. Listeria monocytogenes in nature / H.J. Welshimer, Y. Donker-Voet//Apl. Microbiol. 1971. - V. 21. - P. 516-519.

189. Wesley, J.V. Restriction enzyme analysis of Listeria monocytogenes stra ns associated with food-born epidemics / J.V. Wesley, F. Ashton // Appl. And Environ. Microbiol. -1991. V. 57, № 4. - P. 969-975.

190. Winslow, D.L. Listeria bacteremia and peritonitis associated with a peritoneovenous shunt: successful treatment with sulfa methoxazole and trimethoprim / D.L. Winslow, M.L. Steele // J. Infect. Dis. 1984. - V. 149. - P. 820.

Информация о работе

Исаева, Роза Изитдиновна
кандидата медицинских наук
Ставрополь, 2011
ВАК 03.02.03

Диссертация

Экспериментальное обоснование разработки и усовершенствования селективных питательных сред для диагностики листериоза - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Экспериментальное обоснование разработки и усовершенствования селективных питательных сред для диагностики листериоза - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы