Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эколого-микробиологические аспекты биоремедиации нефтезагрязненных экосистем и угольных карьеров

ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Эколого-микробиологические аспекты биоремедиации нефтезагрязненных экосистем и угольных карьеров"

На правах рукописи

"Тсу^

Писарчук Анна Дмитриевна

ЭКОЛОГО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ БИОРЕМЕДИАЦИИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ЭКОСИСТЕМ И УГОЛЬНЫХ КАРЬЕРОВ

03.02.08 — Экология (биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

005555379

2 П НОЯ 2014

Томск-2014

005555379

Работа выполнена в федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего образования «Национальный исследовательский Томский государственный университет», на кафедре экологической и сельскохозяйственной биотехнологии, и в государственном научном учреждении «Сибирский научно-исследовательский институт сельского хозяйства и торфа» Российской академии сельскохозяйственных наук, в лаборатории биотехнологии.

Официальные оппоненты:

Гродницкая Ирппа Дмитриевна, доктор биологических наук, доцент, федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт леса им. В.Н. Сукачева Сибирского отделения Российской академии наук, лаборатория микробиологии и экологической биотехнологии, старший научный сотрудник

Карташев Александр Георгиевич, доктор биологических наук, профессор, федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники», кафедра радиоэлектронных технологий и экологического мониторинга, профессор

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кемеровский государственный сельскохозяйственный институт», г. Кемерово

Защита состоится 24 декабря 2014 года в 10-00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.267.10, созданного на базе федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Национальный исследовательский Томский государственный университет», по адресу: 634050, г. Томск, пр. Ленина, 36 (корпус НИН ББ).

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке и на сайте федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Национальный исследовательский Томский государственный университет» www.tsu.ni.

Автореферат разослан « Об » /¿¿^¿^¿3014 года.

Материалы по защите диссертации размещены на официальном сайте ТГУ: http://w^л^^tsu.гu/content/news/amolmcement_of_the_dissertations_in_the_tsu.php

Научный руководитель:

доктор биологических наук, Терещенко Наталья Николаевна

Ученый секретарь диссертационного совета

Просекина Елена Юрьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. С увеличением масштабов и интенсивности своей деятельности человечество в целом превратилось в мощную геологическую силу. Вся история человечества - это история экономического роста и последовательного разрушения биосферы. В современных условиях интенсивность преобразующего антропогенного воздействия на природные ландшафты достигла уровня, на котором инициируются процессы полного разрушения почвенного покрова и, как следствие, среды обитания человека (Кураков и др., 2006; Маганов и др., 2006).

Техногенные ландшафты, образующиеся на территории угле- и нефтедобычи, как правило, обладают очень слабой способностью к самовосстановлению, что обусловливает необходимость разработки технологий их ускоренной ремедиации (Алексеева и др., 2000; Давыдова, 2006). Постоянное увеличение площади техногенно нарушенных земель, усиление их отрицательного влияния на прилегающие территории включили проблемы рекультивации земель в число важнейших национальных программ в области природопользования и защиты окружающей среды (Шорохов, 2013; Киреева и др., 2002; Пиковский и др., 2003; Колесников и др., 2007).

Мировая практика проведения рекультивационных работ располагает различными методами восстановления почвенных и водных экосистем. На сегодняшний день предпочтение отдается механическим и биологическим способам очистки, наиболее приемлемым с экологической точки зрения (Габбасова и др., 2004;). Несмотря на технологические сложности микробиологических методов и противоречивость получаемых результатов, в целом следует признать, что только микроорганизмы могут выступать в качестве значимого фактора ускорения биодеградации углеводородов. Эффективность метода, как правило, зависит от глубины анализа микробиологических процессов, протекающих в загрязненной почве и водных объектах, а также факторов, обуславливающих интенсивность течения этих процессов (Писарчук и др., 2014).

Цель работы: изучить эффективность экологически безопасных мелиорантов на основе возобновляемых и невозобновляемых природных ресурсов для биоремедиации техногенно-загрязненных экосистем.

Задачи исследования:

1. Исследовать влияние природных глинистых минералов (цеолита, глауконита, вермикулита) на скорость микробиологических процессов биодеградации нефти в почве и на водной поверхности.

2. Установить зависимость эффективности глинистых минералов от размера используемой фракции.

3. Оценить эффективность совместного применения глинистых минералов и активных углеводородкисляющих культур для очистки почвы и водной поверхности от нефти.

4. Установить микробиологические факторы повышения фитотоксичности нефтезагрязненной почвы в процессе биоремедиации и исследовать эффективность применения бактериальных культур, устойчивых к ксенобиотикам, для фиторемедиации.

5. Исследовать эффективность использования торфяных мелиорантов, созданных на основе продуктов глубокой переработки торфа, для рекультивации угольных отвалов.

Научная новизна исследования. Впервые изучено комплексное влияние природных глинистых минералов на скорость микробиологической деградации нефти в почве, а также приема интродукции углеводородокисляющих микроорганизмов, адсорбированных на глинистых минералах, на интенсивность и глубину биодеградации нефтяной пленки на водной поверхности, и скорость очистки нефтезагрязненной почвы. Впервые установлены микробиологические факторы повышения фиготоксичности нефтезагрязненной почвы и предложены биотехнологические способы ее снижения. В многолетнем полевом эксперименте показана эффективность применения торфяного мелиоранта и оксигума-та для рекультивации отвалов угольного разреза.

Теоретическое п практическое значение работы. Полученные результаты исследований вносят вклад в разработку теоретических основ рекультивации нефтезагрязненных почв и территорий, нарушенных вследствие угледобычи Предложен прием предпосевной обработки семян бактериальными культурами рода Pseitdomoms, устойчивыми к ксенобиотикам, для снижения уровня остаточной фитотоксичности почвы в зоне ризосферы, обеспечивающий повышение эффективности метода фиторемедиации, осуществляемого в рамках биоремедиации нефтезагрязненных почв. Разработан способ ускорения процессов биодеградации нефтяной пленки на поверхности водоемов путем распыления на водной поверхности мелкой фракции цеолита и вермикулита с адсорбированными УВ-окисляющими микроорганизмами. Обоснована перспективность использования торфяных мелиорантов и оксигумата для стимулирования процессов формирования эмбриозема на поверхности вскрышных пород отвала угольного разреза в Кемеровской области.

Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались на Всероссийской научной конференции, посвященной 15-летаю биологического факультета Сургутского государственного университета, «Современные проблемы биологических исследований в Западной Сибири и на сопредельных территориях» (Сургут, 2-4 июня 2011); на V Всероссийской конференции с международным участием «Современные проблемы генезиса, географии и картографии почв» (Томск, 1-5 октября 2011); на 14 международной научно-практической конференции «Аграрная наука - сельскохозяйственному производству Сибири, Монголии, Казахстана и Болгарии» (Красноярск, 25-28 июля 2011); на XII всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Химия и химическая технология в XXI веке» (Томск, 11-13 мая 2011); на Всероссийском симпозиуме «Экология мегаполисов: фундаментальные основы и инновационные технологии» (Москва, 21-25 ноября 2011)" на VII Международной научно-практической конференщш «Аграрная наука'- сельскому хозяйству» (Барнаул, 2-3 февраля 2012); на 9 Международной конференции «WasteECo-2012 Сотрудничество для решения проблемы отходов» (Харьков, 28-29 марта 2012); на Международной научной школе «Пищевые технологии и биотехнологии» (Томск, 18-22 июня 2012); на Международной научно-практической конференции «Современное общество, образование и наука» (Тамбов, 31 июля 2013).

Декларация личного участия автора. Автор принимал непосредственное участие в планировашт экспериментов, сборе данных, начиная с 2010 г. и анализе отечественных и зарубежных информационных источников, а также аналитической обработке данных, предоставленных лабораторией физико-химических исследований ГШ' СибНИИСХиТ Россельхозакадемии за 2007-2010 гг., НТО «Приборсервис» (г. Томск).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Комплексное применение мелких фракций (0,02-0,2 мм) цеолита, глауконита и вермикулита обеспечивает почти 50%-е ускорение микробной деградации нефти в почве. Использование цеолита и вермикулита в качестве сорбента нефти и носителя для УВ-окисляющей микробной культуры Pseudomonasри-tida способствует заметному ускорению очистки водной поверхности от нефти и увеличению глубины микробной деградации углеводородов нефтяной пленки.

2. Одним из основных факторов повышения фитотоксичности нефтезаг-рязненной почвы в процессе биоремедиации являются метаболиты, продуцируемые в условиях нефтяного загрязнения почвенными бактериями и микроскопическими грибами. Эффективным приемом локального снижения уровня фитотоксичности почвы в зоне ризосферы может стать предпосевная обработка семян растений накопительными культурами устойчивых к ксенбиотикам бактерий Pseudomonas putida и Pseudomonas sp. штамм В-6798.

3. Эффективным способом стимулирования процессов формирования первичного эмбрнозема на породах отвалов угольных разрезов в почвенно-климатнческих условиях Кемеровской области является внесение в грунт отвала 25-50 т/га торфяного мелиоранта - продукта глубокой переработки торфа совместно с высевом зернобобовых смесей, что способствует усилению микробиологической и ферментативной активности грунта, а также увеличению в составе органического вещества формируемого эмбрнозема доли легкоразлагае-мых лабильных фракций.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, из них — 4 в рецензируемых журналах перечня ВАК.

Структура и объем диссертации

Материал изложен на 119 страницах, состоит из введения, пяти глав, выводов и списка литературы, который включает 164 источников (из них 21 зарубежных). Работа содержит 28 рисунков и 10 таблиц.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.б.н., профессору кафедры экологической и сельскохозяйственной биотехнологии БИ ТГУ H.H. Терещенко за всестороннюю помощь в проведении исследования, терпение и понимание. Автор также благодарит коллектив ГНУ СибНИИСХиТ Россельхозакадемии за возможность совместных исследований, а также сотрудников кафедры экологической и сельскохозяйственной биотехнологии Е.Е. Акимову, О.М. Минаеву, н.с. ИХН СО РАН И.В. Русских, генерального директора НТО «Приборсервис» С.В. Лушникова за помощь в выполнении работы.

Работа выполнена в рамках НИР (02.10) «Разработка способов восстановления плодородия деградированных земель в районах угледобычи Западной Сибири» тематического плана Россельхозакадемии РФ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1 Техногенно нарушенные экосистемы: проблема и методы ее решения

1.1 Рекультивация нефтезагрязпепных экосистем. В разделе приводится описание негативного воздействия нефти на природные экосистемы, причины возникновения фитотоксичности почвы, а также перечень рекультивационных мероприятий с применением природных глинистых минералов, направленных на создание оптимальных условий жизнедеятельности почвенных микроорганизмов, на стимуляцию их деятельности и повышение метаболической активности.

1.2 Восстановление почвенпого покрова иа территориях угледобычи. В разделе приводится описание воздействия горного производства на природные ландшафты, которое непосредственно связано с нарушением почвенного покрова. Кроме того, приводится обзор современных технологий рекультивации угольных отвалов, направленных на воссоздание продуктивных и устойчивых биогеоценозов.

Глава 2 Объекты и методы исследований

2.1 Объекты исследований. Основными объектами исследований являются: грунт отвальной породы Краснобродского угольного разреза Кемеровской области, торфяно-болотная почва Усинского района республики Коми, комплекс мелиорирующих субстратов и материалов, штаммы устойчивых к ксенобиотикам микробных культур (бактериальная культура Ps. putida предоставлена НТО «Приборсервис», бактериальная культура Ps. sp. штамм В-6798 - кафедрой экологической и сельскохозяйственной биотехнологии БИ ТГУ), апробированных в условиях лабораторных и полевых экспериментов с целью изучения микробиологических процессов очистки почвы и водной поверхности от нефти и нефтепродуктов, а также восстановления земель, нарушенных при угледобыче.

2.2 Методы исследований

2.2.1 Методы исследования эффективности применения природных глинистых минералов и бактериальных культур для ускорения очистки нефтезагрязненной почвы и водной поверхности. Эффективность использования глинистых минералов, а также приема адсорбции на их поверхности бактериальной культуры Pseudomonas putida для ускорения очистки нефтезагрязненной почвы и водной поверхности изучали в модельных лабораторных экспериментах. В эксперименте 1 исследовали эффективность применения разных фракций цеолита и глауконита для ускорения очистки нефтезагрязненной почвы. Дозы использованных глинистых минералов соответствовал! 2 т/га. В эксперименте 2 изучали эффективность комплексного внесения в нефтезагрязен-ную почву 3 т/га цеолита, глауконита и вермикулита. Эффективность различных фракций цеолита и мелкой фракции вермикулита, а также приема адсорбции на глинистых минералах бактериальной культуры Ps. putida при очистке водной поверхности от нефти оценивали в экспериментах 3 и 4 соответственно.

2.2.2 Методы исследования эффективности торфяного мелиоранта и оксигумата для рекультивации угольных отвалов. Эффективность применения продуктов глубокой переработки торфа для стимулирования процессов первичного почвообразования в грунте угольного отвала (Кемеровская область) исследовали в 4-летнем полевом опыте, заложенном на делянках площадью 1 м2 в 4-кратной повторности. Торфяной мелиорант вносили в 2-х дозах (25 и 50 т/га). Все варианты полевого опыта были выровнены по минеральному фону.

Дозы минеральных удобрений (1,8 ц/га аммиачной селитры, 3 ц/га суперфосфата и 1,5 ц/га калия сернокислого), внесенных как в чистом виде, так и в составе торфяного мелиоранта, рассчитывались, исходя из потребностей высеваемых многолетних трав. Оксигумат в концентрации 0,005% по гуминовьш кислотам применяли путем предпосевного замачивания семян многолетних трав и опрыскивания растений в фазу цветения.

23 Методика определения фитотоксичности почвы. Уровень фитоток-сичности микробных метаболитов в нефтезагрязненой почве изучали в биотесте путем 30 мин. замачиваши семян пшеницы в накопительной культуре бактерий на МПБ (мясопептонный бульон), выделенных из исследуемой почвы. Эффективность применения устойчивых к ксенобиотикам Ps. putida и Ps. sp. штамм В-6798 для снижения фитотоксичности нефтезагрязненной почвы и грунта отвала угольного разреза оценивали путем 1 часа замачивания семян пшеницы в накопительной культуре бактерий на МПБ. Наличие признаков фитотоксичности определяли по разнице всхожести, зеленой массы и массы корней проростков в опытных вариантах и контроле (МПБ), выраженной в процентах.

2.4 Методика проведения микробиологического анализа. Микробиоло-гичесыш анализ нефтезагрязненной почвы и воды, а также грунта отвала угольного разреза включал в себя определение численности микроорганизмов следующих систематических и физиологических групп: аммонификаторов (аэробов) - на ГРМ-бульоне (питательный бульон для культивировашм микроорганизмов сухой); микроорганизмов, усваивающих минеральный азот и актино-мицетов - на крахмало-аммиачный агаре (КАА) (Практикум по микробиолопш, 1976); микромицетов - на картофельно-глюкозном агаре (КГА); целлюлозоли-тических микроорганизмов - на среде Гетчинсона-Клейтона (Методы почвенной микробиологии, 1980); углеводородокисляющих микроорганизмов - на модифицированной среде Мюнца (Терещенко, 2011). Систематическую принадлежность микромицетов определяли по общепринятой методике (Литвинов, 1967).

2-5 Статистическая обработка результатов исследований. Для обработки результатов экспериментов был использован пакет программ Statistica 6.0, а также Microsoft Excel (2003) для Windows ХР. Результаты экспериментов представлены в виде среднего значения с доверительным интервалом с учетом t-критерия Стьюдента для 95% уровня значимости.

Глава 3 Эффективность применения природных глинистых минералов для биоремедиацин нефтезагрязненных экосистем 3.1 Эффективность применения природных глинистых минералов для ускорения очистки нефтезагрязненных почв

3.1.1. Влияние разных фракций цеолита и глауконита на скорость очистки нефтезагрязненной почвы. Результаты исследования эффективности разных фракций цеолита показали, что наибольшую степень деградации нефти спустя 7 месяцев после начала опыта обеспечили мелкие фракции цеолита и глауконита (39,7% и 36,0% соответственно) (табл. 1).

Как известно количественный состав микроорганизмов отражает интенсивность, дозу и характер нефтезагрязнения (Коновалова, 2009). Микробиологический анализ численности углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ) в контрольном и опытных вариантах показал, что максимум УОМ спустя 7 месяцев после начала опыта был обнаружен в вариантах с внесением мелких фракций чистого цеолита и глауконита, что служит дополнительным под- '

тверждением большей эффективности мелких фракций по сравнешпо с крупными. Численность УОМ в контроле была почти в 3 раза ниже, чем в вариантах с применением глинистых минералов и соответствовала минимальным показателям по опыту (табл. 2).

Таблица 1 - Влияние исследованных фракций глинистых минералов на интенсивность биодеградации нефти спустя 7 месяцев после начала опыта (исходное содержание нефти - 347,2 г/кг)

Вариант опыта

1. Контроль - (почва + нефть)

2. Фон - (почва + нефть + NPK)

3. Фон + цеолит (крупная фракция)

4. Фон + цеолит (крупная фракция) + Pseudomonas putida

5. Фон + цеолит (мелкая фракция)

6. Фон + цеолит (мелкая фракция) + Pseudomonas pulida

7. Фон + глауконит (мелкая фракция)

Содержание НП, г/кг

339.11 ±33,91

235.79 ± 23.58

233,34 ± 23,33

229,80 ± 22,98

204,39 ± 20,44*

239.39 ± 23.94

217.08 ±21.71*

Интенсивность биодеградации НИ % к контролю

30.5 ± 3,05

31,2 ±3,12

32,2 ± 3,22

39,7 ± 3,97

29.4 ± 2,94 36.0 ± 3,60

8. Фон + глауконит (мелкая фракция)+-Pseudomonas putida

252.96 ± 25.30

25.4 ± 2,54

Примечание. * - данные статистически значимо отличаются от контроля (р<0,05).

Преимущество мелких фракций по сравнению с крупными может быть обусловлено увеличением площади контакта веществ загрязнителей и агентов их биодеградации (УОМ). Как известно, наиболее активно процессы разрушения нефти в почве идут на границе раздела фаз, т.е. на поверхности почвенных агрегатов (Киреева, 2001). Следовательно, внесение в почву мелкой фракции глинистых минералов способствует формированию большего количества центров активной микробной деградации нефти по сравнению с внесением более крупных фракций.

Таблица 2 - Динамика численности УОМ в нефтезагрязненной почве на

Вариант опыта Численность УОМ; lg КОЕ/1г а.с.в. почвы

10 суток 7 месяцев 12 месяцев

1. Контроль - (почва + нефть) 4,58 ± 0,05 3,24 ± 0,01 2,64 ±0,19

2. Фон - (почва + нефть + NPK) 3,22 ±0,11** 3,28 ± 0,47 2,16 ±0,05

3. Фон + цеолит (крупная фракция) 3,25 ± 0,03** 3,46 ±0,02* 1,90 ± 0,01

4. Фон + цеолит (крупная фракция) + Pseudomonas putida 3,55 ±0.06** 3,51 ±0,04* 2,28 ±0,11

5. Фон + цеолит (мелкая фракция) 3.89 ±0,03** 3,56 ±0,05* 2.08 ±0.10

6. Фон + цеолит (мелкая фракция) + Pseudomonas putida 3,59 ±0,02** 3,28 ± 0,04 1,95 ±0,02

1. Фон + глауконит (мелкая фракция) 3,20 ± 0,03** 3,55 ±0,02** 2,10 ±0.10

8. Фон + глауконит (мелкая фракция) + Pseudomonas putida 3,29 ±0,12** 3,40 ± 0,07 1,91 ± 0,29

цуилн^чипиъ. 11 ----------------

(р<0,05); ** - данные статистически значимо отличаются от контроля (р<0,01).

Изучение интродукции в нефтезагрязненную почву Ps. pulida на поверхности природных глинистых минералов выявило низкую эффективность данного приема. В вариантах с использованием мелких фракций цеолита и глауконита

совместно с микробной культурой степень деградации нефти были заметно ниже, чем в вариантах с внесением чистых минералов (табл. 1).

Меньшая эффективность применения минералов, обогащенных УОМ, по сравнению с чистыми минералам! может быть обусловлена снижением сорб-ционной активности минералов в результате их увлажнения при обработке жидкой накопительной культурой микроорганизмов. Возможно, именно это обстоятельство и привело к снижению эффективности глинистых минералов, поскольку влажные минералы не смогли обеспечить необходимой степени контакта углеводородов (УВ) нефти и нефтеокисляющих микроорганизмов, причем как из числа адсорбированных на его поверхности из микробного препарата, так и аборигенных (Терещенко, 2007).

Микробиологический анализ численности УОМ спустя 12 месяцев после начала опыта показал резкое уменьшение количества УОМ в почве всех вариантов. По-видимому, это обусловлено сокращением в составе нефти легкодоступных низкомолекулярных парафинонафтеновых УВ и исчерпанием биогенных элементов. При этом отмеченная в данный период максимальная численность УОМ в контроле может быть обусловлена меньшей скоростью процессов биодеградащш и, как следствие, большим количеством остаточной нефти в почве контрольного варианта.

Изучение структуры микробного сообщества почвы спустя 12 месяцев после начала опыта показало, что при внесении в нефтезагрязненную почву глинистых минералов популяция микроскопических грибов в опытных вариантах увеличилась с 2,4-2,5 до 3,0-4,1 lg КОЕ/1 г а.с.в. почвы.

Тем не менее, несмотря на то, что дрожи активно разрушают нефть, их метаболиты могут быть токсичными для растений, о чем свидетельствовало отмеченное в модельном опыте возрастание фитотоксичности исследованной нефте-загрязненной почвы. Биотесты с семенами пшеницы, в течение 30 мин. замоченных в накопительных культурах дрожжей, выделенных из почвы вариантов опыта, показали, что большинство изолированных видов дрожжей снижает всхожесть семян пшеницы в среднем на 16-20%.

Таким образом, результаты модельного лабораторного опыта свидетельствуют об эффективности применения мелких фракций глинистых минералов для ускорения очистки нефтезагрязненной почвы. Вместе с тем, следует отметить, что возрастание в составе микробного сообщества доли микроскопических грибов, в основном дрожжей, способствует увеличению фитотоксичности почвы.

3.1.2 Влияние комплексного применения природных глинистых минералов на интенсивность биодеградации нефти в почве. Результаты исследования эффективности комплексного применения глинистых минералов в дозе 3 т/га показали, что совместное использование цеолита, глауконита и отличающегося слоистым типом строения кристаллической решетки вермикулита способствовало почти 2-кратному ускорению биодеградации нефти в почве по сравнению с раздельным применением только вермикулита или только глауконита, обеспечив максимальную степень деградации нефти по опыту — 46,3% (табл. 3).

Таблица 3 - Влияние глинистых минералов на интенсивность биодеградации

нефти в почве (исходное содержание нефти - 100 г/кг)

Вариант опыта Содержание НП, г/кг почвы Интенсивность биодеградации НП, % к контролю

1. Контроль - (почва + нефть) 56.15+5.16 —

2. Фон - (почва + нефть + ЫРК) 41,84±4.18 25,5+2,55

3. Фон + вермикулит 44,45±4,44 21,0+2.10

4 Фон + вермикулит + Л. рнНЛа 44,51+4,45 21,0+2.10

5. Фон + глауконит 41,53+4,15 26,0+2.60

6 Фон + [вермикулит + глауконит + цеолит! 30.18+3,02* 46,3+4,63

7. Фон + [вермикулит+глауконит + цеолит!+Л. Р'И^а 43,50+4.35 22,5±2,25

Примечательно, что также как и в предыдущем опыте с цеолитом и глауконитом, нанесение УОМ на вермикулит не оказало дополнительного эффекта на скорость деградации нефти в почве. В вариантах с адгезией бактерий было отмечено более чем 2-кратное снижение степени биодеградации нефти по сравнению с использованием чистых глин (табл. 3).

Данные микробиологического анализа почвы показали, что во всех вариантах опыта с использованием глин на всем протяжении периода наблюдений, как общая численность микроорганизмов, так и численность УОМ была заметно выше, чем в контроле (рис. 1а, б).

- i 5,5

120

150

—♦—Контроль - Ъ - Фон + вермикулит

Фон + глауконит —i- - Фон + комплекс + Ps putiíla

30 90

Период наблюдений, сут. -»-Фон

фон + вермикулит + Ps. putida -фон + комплекс

14 30 90 120 1S0

Период наблюдений, cvr. ■Контроль -»-Фон

Фон + вермикулит ~ ^ - Фон + вермикулит * Pe. pulida

■Фом + глауконит фон + комплекс

■фон «комплекс + Ps. pulida

б

а

Рисунок 1 - Динамика общей численности микроорганизмов (а) и численности УОМ (б) в нефтезагрязненной почве

Таким образом, результаты модельного лабораторного опыта с применением комплекса природных глинистых минералов и УОМ свидетельствуют об эффективности применения комплекса глинистых минералов для биоремедиа-ции нефтезагрязненной почвы.

3.2 Эффективность применения природных глинистых минералов для ускорения очистки водной поверхности от нефти

3.2.1 Влияние различных фракций цеолита на интенсивность биодеградации нефти на водной поверхности. Результаты модельных исследований показали, что внесение цеолита способствовало заметному ускорению деградации нефтяной пленки не только по сравнению с контролем, но и по сравнению с внесением минеральных удобрений, т.е. фоном (табл. 4). Несмотря на то, что различия в эффективности средней и мелкой фракций цеолита оказались

незначительными, в опыте прослеживается тенденция к ускорению процессов деградации нефти при использовании мелкой фракции цеолита.

Таблица 4 - Содержание остаточной нефти на поверхности воды спустя 4 месяца после начала опыта (исходное содержание нефти — 23,7 г/л)

Вариант опыта Степень биодеградащш нефти, % Разница с контролем, % Кол-во НП в воде, мг/л

1. Контроль - нефть 25,7±2.57 — 6.40 ± 1,53

2. Фон - (нефть + ЫРК) 29,3±2.93 4,83±0.48 22,06 ± 5.50

3. Фон +- цеолит (мелкая фракция) 32,5±3.25 9,1 ±0.91 91.41 ±9,14*

4. Фон + цеолит (мелкая фракция) + Ра. рнНс!а 35,0±3,50 12,40±1,24 110,15± 11,01 *

5. Фон + цеолит (средняя фракция) 32,3±3.23 8.80±0.88 88,37 ±8,84*

6. Фон + цеолит (средняя фракция) + Л. риЧс/а 33,5±3,35 10,51±1,05 86,03 ± 8,60*

7. Фон + Рз. рши1а 30.613.10 6.53±0.65 10.31 ±2,47*

Интродукция в воду нефтеокисляющих бактерий рШи1а на поверхности обеих фракций цеолита способствовала еще большему стимулированию биодеградации нефти в воде. В вариантах с совместным использованием цеолита и бактерий были достигнуты максимальные показатели биодеградации нефтяной пленки на поверхности воды, составившие для вариантов с мелкой и средней фракцией цеолита 35,0% и 33,5% соответственно. По сравнению с фоновым вариантом, где использовались только минеральные удобрения, ускорение биодеградации нефти в вариантах с применением мелкой и средней фракций цеолита совместно с микроорганизмами составило 8% и 6% соответственно (табл. 4).

Данные ПК-спектрометрического определения концентрации растворенных нефтепродуктов в воде в целом соответствуют показателям интенсивности биодеградащш нефтяной пленки в вариантах опыта. Количество растворенных в воде нефтепродуктов вполне логично находится в обратной зависимости от содержания остаточной нефти на водной поверхности. При этом минимальное содержание растворенных нефтепродуктов в воде контрольного варианта обусловлено минимальной степенью окисления нефтяной пленки в данном варианте (табл. 4).

Наибольшее содержание растворенных в воде нефтепродуктов было отмечено в вариантах с применением мелкой фракции цеолита. Адсорбция бактериальной культуры Л. рийёа на поверхности обеих исследованных фракций цеолита привела к увеличению концентрации растворенных в воде нефтепродуктов в результате усиления в данных вариантах опыта интенсивности микробной биодеградащш нефтяной пленки на поверхности воды.

Данные микробиологического анализа воды показали, что во всех вариантах опыта на всем протяжении периода наблюдений численность УОМ была заметно выше, чем в контроле (рис. 2). Повторное внесение минеральных удобрений спустя 1,5 месяца после начала опыта не обеспечило повторного увеличения численности УОМ, однако способствовало поддержанию плотности популяции нефтеокисляющих микроорганизмов на довольно высоком уровне. Во всех вариантах с применением цеолита, независимо от использованной фракции, численность УОМ оставалась максимально высокой вплоть до окончания периода наблюдений.

Согласно данным, представленным на рисунке 2, адгезия клеток Рб. риПс\а на цеолите как мелкой, так и средней фракций обеспечила протекторное

воздействие на микроорганизмы. Это выразилось как в увеличении абсолютных показателей плотности бактериальной культуры в данных вариантах, так и в более длительном сохранении этих высоких показателей на всем протяжении периода наблюдений.

Примечательно, что в отличие от вариантов с применением бактерий на цеолите, в варианте с использованием жидкой бактериальной культуры численность УОМ резко сократилась уже к концу второго месяца опыта (Терещенко и др., 2011).

Для более детального анализа характера биодеградации углеводородов в образцах остаточной нефти были рассчитаны спектральные коэффициенты. В соответствии

Длительность опыта, суг.

—•— Контроль

—■-Цеолит мелкий

—А— Цеолит средний —в— Ps. putida

Фон

—1>— Цеолет Men*.+Ps. --ir — Цеолит средн.+Ps.

Рисунок 2 - Динамика численности УОМ в вариантах модельного опыта

со спектральным коэффициентом Сь характеризующим соотношение ароматических и алифатических УВ, наибольшей степенью окисления углеводородов алифатического ряда отличаются все варианты с применением цеолита (0,8230,863). При этом в фоновом варианте внесение только минеральных удобрений на соотношении ароматических и алифатических УВ сказалось незначительно (С,=0,716). Использование Ps. putida без цеолита (Q=0,823-0,850) также оказало весьма слабое влияние на изменение данного коэффициента по сравнению с контролем (0,735).

Коэффициент С2, отражающий количество кислородсодержащих соединений в УВ, возрастает по сравнению с контролем только в вариантах с применением средней фракции цеолита (0,059-0,060) и уменьшается в варианте с добавлением мелкой фракции цеолита и культуры Ps. putida (0,048). Снижение количества кислородсодержащих соединений в составе остаточной нефти в вариантах с применением бактерий, по-видимому, объясняется более глубокой степенью биодеградации остаточных УВ, в результате чего промежуточные продукты окисления превращаются в высокомолекулярные соединения, либо в конечном итоге в С02 и Н20 (Мокрушина, 2006).

Варианты с цеолитом, а также вариант с применением культуры Ps. putida без цеолита отличаются максимальными значениями коэффициента С3 (0,568), отражающего соотношение нафтенов и алифатических УВ в остаточной нефти. Этот факт свидетельствует о преобладании нафтеновых УВ над парафиновыми, что объясняется большей устойчивостью нафтенов к биодеструкции. Какие-либо четкие закономерности в распределении спектральных коэффициентов С; и С3 в вариантах опыта с применением мелкой фракции цеолита и внесением минерального удобрения не установлены.

Таким образом, на основании проведенных исследований можно сделать заключение о том, что использование цеолита способствует заметному jCKope-нию процессов микробной деградации углеводородов нефти в водной среде. При этом эффективность цеолита возрастает при увеличении степени его раз-

мола. Прием нанесения микробной нефтеокисляющей культуры Ps. pulida на поверхность цеолита способствует увеличению ее численности в воде и продлевает период активности бактерий.

3.2.2 Влияние вермикулита на интенсивность биодеградации нефти на водной поверхности. Результаты исследований показали, что в целом внесение 1,0 г/л вермикулита, также как и цеолита, способствовало заметному ускорению деградации нефтяной пленки не только по сравнению с контролем, но и по сравнению с внесением минеральных удобрений, т.е. фоном (табл. 5).

Таблица 5 - Влияние мелкой фракции вермикулита и Ps. pulida на интенсивность биодеградации нефтяной пленки на водной поверхности (исходное содержание нефти - 8 г/л)

Вариант опыта Остаточные НП, г/л Степень биодеграда-пии НП. % к контролю

1. Контроль - (вода + нефть) 6.1 —

2. Фон - (вода + нефть + М>К) 5,11 16.2

3. Фон + вермикулит (мелкая фракция) 4,34 28.8

4. Фон +вермикулит (мелкая фракдия) + Р$. рнПс1а 4,09 33,0

Интродукция в очищаемую воду бактерий Ps. pulida на поверхности вермикулита способствовала еще большему стимулированию биодеградации нефти в воде. В варианте с совместным использованием вермикулита и бактерий достигнут максимальный показатель биодеградации нефтяной пленки на поверхности воды - 33,0% по сравнению с контролем. При этом в сравнении с фоновым вариантом, где использовались только минеральные удобрения, ускорение биодеградации нефти составило 16,2% (табл. 5).

Данные микробиологического анализа воды показали, что во всех вариантах опыта на всем протяжении периода наблюдений численность как аммони-фикаторов, так и УОМ была заметно выше, чем в контроле (рис. 3).

■ Контроль Ш Фон + вермикулит

14 90

Перпол наблюдений, суг. □ Фон

@ фон + вермикулит -í- Ps. pnlídn

а

■ Контроль Ю Фон ^-вермикулит

Период наблюдений, сут.

□ Фон

В Фон + вермикулит + Ps. putida

Рисунок 3 - Динамика численности аммонификаторов (а) и численности УОМ (б) в воде

В соответствии со спектральным коэффициентом С, наибольшей степенью окисления УВ алифатического ряда отличаются варианты с применением чистого вермикулита и в комплексе с бактериальной культурой (1,50 и 1,43 соответственно). Значения коэффициента С2 во всех опытных вариантах по сравнению с контролем также увеличиваются почти в 2 раза. Увеличение значения коэффициентов Сл и Сг обусловлено снижением содержания насыщенных н-алканов, наиболее доступных для микробиологического окисления (Шага-биева, 2012). Кроме того, максимальные значения С2 в вариантах с вермикули-

том (1,50) могут свидетельствовать об активном «размыкании» ароматических структур за счет внедрения атомов кислорода в молекулы УВ.

Таким образом, на основании проведенных исследований можно сделать заключение о том, что использование вермикулита, также как и цеолита способствует заметному ускорению микробной деградации углеводородов нефти в водной среде и увеличению глубины данного процесса. Применение микробной культуры Ps. pulida на поверхности вермикулита способствует увеличению ее численности в воде и продлевает период активности бактерий.

Глава 4 Проблема фитотоксичности нефтезагрязненной почвы и способы ее снижения

4.1 Микробиологические факторы токсичности нефтезагрязненной почвы. В процессе рекультивации торфяной нефтезагрязненной почвы (Усин-ский р-он респ. Коми) был установлен факт увеличения фитотоксичности очищаемой почвы, что выразилось в снижении всхожести семян пшеницы в опытных вариантах (с внесением глинистых минералов) по сравнению с контролем. Несмотря на более чем двукратное снижение содержания нефтепродуктов в почве под воздействием глинистых минералов, стимулирование активности УОМ способствовало накоплению в почве продуктов деградации нефти, а также метаболитов бактерий и почвенных грибов. Причем, согласно данным A.B. Назарова и С.А. Иларионова (2005), наибольшей токсичностью обладают именно продукты жизнедеятельности микроорганизмов, а не остаточные нефтепродукты.

Для оценки вклада микроорганизмов в формирование токсичного фона из нефтезагрязненной почвы путем посева на питательные среды (ГРМ-бульон и КГ А) были выделены в чистую культуру бактерии и дрожжи соответственно. С изолированными чистыми культурами микроорганизмов проводили биотесты с семенами пшеницы сорта Иргина (см. п. 2.3).

Согласно данным микробиологического анализа в исследуемой почве доминировали бактерии рода Bacillus. Сообщество микроскопических грибов в почве было представлено в основном дрожжевыми формами. Биотесты с чистыми культурами выделенных бактериальных и дрожжевых доминант показали, что большинство изолированных из почвы видов бактерий и дрожжей снижает всхожесть семян пшеницы в среднем на 21 %.

При этом максимальную степень ингибирования всхожести (90,3%) обусловил один из изолятов рода Bacillus. В целом было установлено, что метаболиты почвенных бацилл оказывают более выраженное подавление всхожести семян пшеницы, чем продукты жизнедеятельности почвенных дрожжей.

Среди четырех доминант рода Bacillus три оказали ингабирующее воздействие на зеленую массу и все - на корни проростков пшеницы. Изолят с максимальным ингибирующим воздействием обусловил 87,0%-ое снижение^зеленой массы проростков и 97,1 %-ое уменьшение массы корней. В среднем обработка семян накопительными культурами почвенных бацилл обеспечила 2,3 %-е снижение показателей зеленой массы проростков и 13,7 %-е - массы корней.

Метаболиты всех выделенных из почвы видов дрожжей заметно снижают массу корней, а четыре изолята - также и зеленую массу. Согласно данным биотеста средние показатели ингибирования проростков пшеницы по отношению к

холостому опыту для зеленой массы и массы корней составили соответственно 3,3 и 3,5%.

Таким образом, результаты биотеста с чистыми культурами микроорганизмов, выделенными из торфяной почвы, свидетельствуют о том, что причиной снижения всхожести семян в нефтезагрязненной почве может быть не только увеличение гидрофобности почвы, заполнение нефтью почвенных капилляров и накопление токсичных продуктов полураспада углеводородов, но также и метаболиты, продуцируемые в условиях нефтяного загрязнения почвенными бациллами и микроскопическими грибами.

4.2 Биотехпологические способы снижения фптотоксичности

4.2.1 Эффективность приема предпосевной обработки семян растений бактериальными культурами, устойчивыми к ксенобиотикам. В исследованиях использовали торфяную почву с остаточным содержанием нефтепродуктов - 253 г/кг и высоким уровнем фитотоксичности. Для компенсации нарушения водно-воздушного режима нефтезагрязненной почвы семена пшеницы предварительно замачивали на сутки в дистиллированной воде и высаживали на поверхность почвы, что давало возможность оценить непосредственное токсическое воздействие. В двух опытных вариантах семена перед высевом дополнительно замачивали на 30 мин. в накопительных культурах, устойчивых к ксенобиотикам Ps. pulida и Ps. sp. штамм В-6798.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что использованные бактерии способны частично нейтрализовать токсическое действие нефтезагрязненной почвы, способствуя повышению всхожести и зеленой массы проростков пшеницы по сравнению с контролем. При этом максимальное положительное воздействие на всхожесть оказала обработка семян накопительной культурой Ps. sp. штамм В-6798. По влиянию на прирост зеленой массы обе бактериальные культуры достоверно не различались (рис. 4).

а б

Рисунок 4 - Влияние бактериальных культур на всхожесть (а) и зеленую массу проростков пшеницы (б) в нефтезагрязненной почве

Предварительно проведенный биотест с семенами пшеницы, обработанными накопительной культурой Ps. pulida, показал наличие ростостимулирую-шего эффекта, как на зеленую массу (5,5 мг против 5,0 мг в контроле), так и на корни проростков (5,9 от против 5,4 мг в контроле). Согласно данным О.М. Минаевой (2008), использованный в экспериментах штамм Ps. sp. штамм В-6798 также проявляет ростостимулирующую активность.

Как известно, одними из основных продуцентов токсинов в нефтезагряз-ненной почве являются микроскопические грибы (Ягафарова, 2001). Поэтому обнаруженные в модельном опыте положительные эффекты от применения исследованных бактериальных культур могут быть обусловлены свойственной бактериям высокой фунгистатической активностью. Согласно данным О.М. Минаевой (2008), штамм Ps. sp. В-6798 проявляет фунгистатическую активность.

Таким образом, прием предпосевной обработки семян исследованными бактериальными культурами рода Pseudomonas может быть рекомендован для повышения эффективности фиторемедиащш нефтезагрязненных почв путем снижения фитотоксичности почвы в зоне ризосферы.

4.2.2 Оценка эффективности использования «Биопасты» и бактериальных культур для снижения фитотоксичности нефтезагрязненной почвы. В целях снижения фитотоксичности нефтезагрязненной почвы и повышения эффективности биоремедиащш исследовали целесообразность применения в качестве детоксиканта «Биопасты» - порошкообразного сорбента на основе модифицированного вермикомпоста (ООО «Родник-композит», г. Пермь) в сравнении с активной углеводородокисляющей культурой Ps. putida. Согласно данным Пахалина Ю.А. (2012), «Биопаста», полученная на основе биогумуса дождевых червей, может быть использована в различных областях экобиотех-нолопш, в том числе для целей биоремедиации.

В исследованиях использовали торфяную почву с остаточным содержанием нефтепродуктов - 253 г/кг и высоким уровнем фитотоксичности. Порошком «Биопасгы» в количестве 1% от веса почвы опудривали поверхность почвы в вегетационных сосудах. Накопительной культурой бактерий Ps. putida с титром 106 клеток/1 л опрыскивали почву с интервалом 2-3 дня в течение 3 недель. Семена пшеницы сорта Иргана после предварительного замачивания в течение 30 мин. в дистиллированной воде помещали на поверхности почвы. Наличие фитотоксического эффекта почвы в вариантах опыта оценивали по разности сухой зеленой массы проростков в вариантах и контроле.

Результаты обработки показали, что «Биопаста» и бактерии способны частично нейтрализовать токсическое действие микробных метаболитов, способствуя увеличению всхожести семян в опытных вариантах по сравнению с контролем. Максимальный показатель (62%) был отмечен в варианте с «Биопастой». Всхожесть в варианте с использованием бактерий составила 54% против 38% в контроле.

Положительный эффект от применения «Биопасты» и бактерий также проявился в статистически достоверном 89 и 67 %-ном увеличении зеленой массы проростков пшеницы по сравнению с контролем соответственно. При этом различия между опытными вариантами оказались статистически не достоверными (рис. 96) (Писарчук и др., 2011).

Таким образом, результаты лабораторных испытаний свидетельствуют о целесообразности применения Ps. putida и порошка «Биопасты» для снижения уровня фитотоксичности нефтезагрязненной почв и, как следствие, повышения эффективности биоремедиации в целом.

Глава 5 Эффективность использования торфяпого мелиоранта и оксигумата для рекультивации угольных отвалов

В модельном полевом опыте нами было исследовано влияние торфяного мелиоранта и оксигумата на характер и интенсивность процессов первичного почвообразования в грунте отвала угольного карьера Краснобродского разреза. Полевой опыт включал следующие варианты: 1. грунт отвала - контроль; 2. грунт отвапа + ЫРК; 3. грунт отвала + торфяной мелиорант, 25 т/га; 4. грунт отвала + торфяной мелиорант, 50 т/га; 5. грунт отвала + №>К + предпосевная обработка семян и вегетирующих растений препаратом оксигуматом.

Предварительное исследование агрохимических свойств пород отвала показало, что в верхнем 20-ти см слое профиля практически все проанализированные агрохимические показатели не имеют явно выраженной дифференциации (табл. 8). Значительные колебания агрохимических показателей в верхней части профиля грунта обусловлены в большей мере неоднородностью слагающих отвалы грунтосмесей, а также незначительным периодом времени воздействия гипергенных и биогенных факторов на материал отвалов. Реакция среды исследованных образцов в основном нейтральная, с небольшими отклонениями в ту или иную сторону.

Таблица 8 - Агрохимические свойства грунта отвала Краснобродского разреза

Глубина отбора пробы, см рНвоДЯ. Сорт., % N0®,,% Робщ, % Кобш. %

0-5 7,4 4,51 0,113 0.205 2,52 39,9

5-10 7,8 6,36 0,101 0,276 1,95 63,0

10-20 7,5 5.08 0,078 0.197 2,76 65,1

Незначительное по сравнению с зональными почвами содержание в породах и грунтосмесях отвалов азота сдерживает развитие основных видов культурных растений. По содержанию валового и подвижного фосфора вскрышные породы можно отнести к слабо- и среднеобеспеченным.

Таким образом, проведенные агрохимические исследования показали, что, несмотря на удовлетворительные в целом агрохимические характеристики грунта отвала Краснобродского разреза даже после 20 лет его естественного восстановления, на поверхности отвала не сформировался ни растительный, ни почвенный покров. Это позволило сделать вывод о наличии лимитирующих факторов, препятствующих развитию процессов естественного самовосстановления нарушенной экосистемы, и необходимости проведения рекультивацион-ных мероприятий, направленных на ускорение биогенных и педогенных процессов на поверхности отвала.

Как известно, одним из ведущих факторов инициации первичных почвообразовательных процессов на поверхности отвалов является накопление и трансформация оргашщеского вещества. Поскольку органическое вещество исследуемого грунта представлено в основном углистыми частицами, дополнительное образование органического вещества на поверхности отвала возможно только за счет разложения растительных остатков. В полном соответствии с данным положением, в полевом опыте спустя 4 года с момента его закладки устойчивый травостой на поверхности отвала сформировался только в вариантах с использованием торфяного мелиоранта. В контрольном варианте без применения торфяного мелиоранта многолетние травы, высеваемые каждую весну, всходили и погибали.

Из-за отсутствия растительности достоверных изменений в содержании углерода лабильного органического вещества (Слов) в грунте контрольного варианта на всем протяжении периода наблюдений отмечено не было. В вариантах с использованием торфяного мелиоранта, напротив, было отмечено достоверное увеличение содержания Сяов. При этом наибольшее количество СЛОв (15,5% от Собщ) было обнаружено в варианте с использованием максимальной дозы торфяного мелиоранта уже в конце 1-го вегетационного периода (табл. 9). В варианте с использованием ЫРК и в варианте с совместным применением №К и оксигумата содержание С'лов в этот период незначительно отличалось от контрольного варианта и составило 2,9 % и 2,5 % от Собщ соответственно. Однако к концу 2-го года из-за выраженного стимулирующего воздействия на растения ЫРК. и оксигумата в данных вариантах наблюдалось заметное увеличение доли Сдав от общего количества органического вещества в грунте (Писарчук и др., 2014).

Образующееся на поверхности угольного отвала органическое вещество претерпевало также и качественные изменения. Через 4 года наблюдений в вариантах с использованием торфяного мелиоранта по сравнению с вариантом, где использовался оксигумат, суммарная доля легкоокисляемой и среднеокис-ляемой групп органического вещества оказалась заметно выше (68,6-54,4% против 46,0%), а трудноокисляемой, напротив, ниже (31,0-45,0% против 54,0%). Это связано, по всей вероятности, с активным разложением растительных остатков в вариантах с использованием торфяного мелиоранта и частичной деградацией углистых частиц, приводящим к накоплению первичных структур гумуса.

Согласно данным В.Г. Двуреченского (2009), в процессе развития первичного почвообразования в составе органического вещества эмбриоземов, формирующихся на отвалах угольных разрезов, наблюдается закономерное уменьшение доли негидролизуемого остатка и возрастание количества лабильного гумуса. В соответствии с этим, более заметное уменьшение доли трудноокисляемых фракций органического вещества грунта отвала в вариантах с применением торфяных мелиорантов и возрастание доли лабильного гумуса свидетельствует о более активном, по сравнению с контролем и вариантами без торфяного мелиоранта, протекании процессов первичного почвообразования.

Полученные закономерности подтверждаются результатами микробиологического анализа: максимальная численность микроорганизмов, потребляющих как органические, так и минеральные источники азота, на протяжении всего периода наблюдений отмечалась в вариантах с внесением торфяного мелиоранта. Причем, как видно из рисунка 5, численность аммонификаторов напрямую обусловлена внесением доступного органического вещества в составе торфяного мелиоранта. Минимальная численность данных групп микроорганизмов на протяжении всего периода наблюдений фиксировалась в контроле. В варианте с использованием оксигумата и минеральных удобрений численность данных групп микроорганизмов была несколько ниже, но, все же значительно выше, чем в контроле (рис. 5).

Несмотря на то, что внесение торфяного мелиоранта способствовало 4-6 кратному росту численности аммонификаторов и почти 10-15 кратному увеличению количества микроорганизмов, усваивающих минеральные формы азота, уже к концу 3-го года наблюдений было отмечено резкое снижение микробиологической активности, что, очевидно, обусловлено исчерпанием ресурса вне-

сенного в грунт органического вещества в составе торфяного мелиоранта, и для дальнейшего стимулирования микробиологических процессов необходимо повторное внесение торфяного мелиоранта.

g

2007 200« 2009 2010

Период наблюдений, гол -Коштроль И Фои —*-ТМ 251?т»

~ ТМ 50 ! (а - \ - Окшумят

2007 2008 2009 2010 Период наблюдения, гол Ковтроль " Фон 1м 25111

ТМ 50 т/гя - * - Оксвтумат

а б

Рисунок 5 - Влияние различных доз торфяного мелиоранта, а также оксигумата на динамику численности аммонификаторов (а) и микроорганизмов, усваивающих минеральные формы азота (б), в грунте вариантов опыта

В целом, все исследуемые варианты опыта отличались невысокой численностью разрушителей целлюлозы (рис. 6а). Особенностью исследуемой почвы является доминирование в составе целлюлозолитического микробного сообщества акпгаомицетов, составляющих до 98% от общей численности (рис. 66). Низкая доля в составе целлюлозолитического сообщества миксобактерий — наиболее активных деструкторов целлюлозы, вероятнее всего, связана как с недостатком в грунте минерального азота, так и с дефицитом легкодоступного органического вещества. Не случайно максимальные значения численности разрушителей целлюлозы на всем протяжении наблюдений фиксировшшсь именно в вариантах с внесением источников азота, как в составе 50 т/га торфяного мелиоранта, так и в составе полного минерального удобрения. Тем не менее, нужно отметить, что во все сроки наблюдений численность миксобактерий в вариантах с использованием торфяного мелиоранта (7,1-11,4 тыс. КОЕ/1г грунта) была выше, чем в контроле (1,2-4,0 тыс. КОЕ/1г грунта).

2010

- Контроль

- ТМ 50 Т/Г1

2005 2009

Период наблюдешш, гол

-•-Фо» -й-ТМ25т/п

- * • Оксмучят

Г 2007 2008 2009 2010

Период наблюдении, год —♦-Контроль -«-Фои —-ТМг"тя

- Окгатумят

а б

Рисунок 6 - Динамика по годам общей численности целлюлозоразрушаюпшх микроорганизмов (а) и численности актиномицетов (б) в грунте вариантов опыта Примечательно, что пик численности разрушителей целлюлозы пришелся на 3-й год наблюдений, тогда как максимум активности аммонификаторов и

микроорганизмов, усваивающих минеральный азот, - на 2-й год после внесения торфяного мелиоранта. Данный факт является дополнительным подтверждением ранее высказанного предположения о тесной зависимости между активностью микробной деградации лигноцеллюлозиого комплекса поступающих в грунт растительных остатков, а также органического вещества самих торфяного мелиоранта и аммонифицирующей микрофлорой, являющейся основным поставщиков доступного для разрушителей целлюлозы азота (рис. 5а, 6а).

Как известно, почвообразовательные процессы протекают при обязательном участии ферментов, значительно увеличивающих скорость течения биохимических реакций. При этом, среди различных классов ферментов важное место принадлежит окислительно-восстановительным, которые участвуют, в том числе, и в процессах «самоочищения» почв от экзогенных веществ, трансформируя, нейтрализуя, разрушая не свойственные почвам вещества, которые могут быть токсичными на начальных этапах трансформации органических веществ (Исмаилов, 1988).

Активность каталазы во всех исследуемых вариантах опыта на протяжении 4-х вегетационных периодов находилась на низком уровне (1-1,7 мл 02/2 мин). Однако если по окончании 1-го и 2-го вегетационных периодов она незначительно различалась по вариантам опыта, то к окончанию 3-го и 4-го оказалась достоверно выше в вариантах с использованием торфяных мелиорантов (2,93,4 мл Ог/2 мин против 0,5-0,7 мл СЬ/2 мин в контроле). Активность дегидроге-н'азы в конце 1-го вегетационного периода была также низкой, а более высокие ее значения в вариантах с использованием торфяного мелиоранта можно объяснить присутствием в составе мелиоранта низкомолекулярных органических соединений, способных к дегидрированию. В конце последующих вегетационных периодов на контрольном варианте дегвдрогеназная активность по-прежнему оставалась на минимальном уровне, в вариантах же с использованием торфяного мелиоранта она значительно выросла.

Максимальные значения полифенолоксидазной и пероксидазной активности в 1-й и 2-й вегетационные периоды были отмечены в контрольном варианте без использования мелиорирующих композита!, что свидетельствует о процессе деградации самой угольной фракции, находящейся в грунте отвальной породы с образованием веществ фенольной природы, которые являются субстратом для данных ферментов. Более низкая в сравнении с контрольным вариантом активность этих ферментов в вариантах с использованием торфяного мелиоранта может быть связана с адсорбцией ферментов на частицах грунта при нарушении состояния равновесия в системе грунт-фермент, имеющем место при перекопке, внесении удобрений и торфяного мелиоранта (рис. 7).

К окончанию 3-го вегетационного периода во всех вариантах опыта было отмечено значительное снижение полифенолоксидазной активности. Активность пероксидазы также снизилась, что может быть обусловлено значительной ролью пероксидаз в активировании перекисей, участвующих в окислении полифенолов. Поэтому низкая активность каталазы в этот вегетационный период на всех вариантах опыта обуславливает также невысокую активность пероксидазы (Терещенко и др., 2013).

К окончанию 4-го года наблюдений пероксидазная активность, как и ранее, оставалась практически одинаковой как в вариантах с использованием торфяного мелиоранта, обеспечивающих рост и развитие растений, так и в контроле,

где высеваемые травы гибли. Поэтому можно предположить, что пероксидазная активность не связана напрямую с ростом и развитием растений и единственным источником субстрата для пероксидазы являются, вероятно, включения угля, присутствующего в отвальной породе, который подвергается деградации под действием внешних факторов (температура, влага, солнечная радиация) с образованием полифенолов.

2007

2010

2008 2009

Период ваблюдгнив, год -Калроаь —•— Фов ТМ25т/г»

" У Окгатмят

— ТМ 50 т/г*

- Контроль

- 1М ГЦ

2007 2008 2009 2010

Псряол наблюдений, год

-А-ТМ 25Т/П1

а б

Рисунок 7 — Динамика полифенолоксидазной и пероксидазной активности

в вариантах опыта

Высокая дегидрогеназная, полпфенол- и пероксидазная активность грунта в вариантах с использованием торфяных мелиорантов создают условия для активного течения реакций полпконденсации окисленных фенольных соединений и продуктов дегидрирования органических соединений с образованием первичных структур гумуса (Александрова, 1980).

Таким образом, отмеченное в течение нескольких лет наблюдений увеличение микробиологической и ферментативной активности грунта, а также качественные изменения в составе органического вещества формируемого эмбрио-зема, в частности, увеличите доли легкоразлагаемого лабильного органического вещества, свидетельствует о перспективности применения торфяных мелиорантов для повышения эффективности биоремедиащш грунта отвала угольных карьеров.

ВЫВОДЫ

1. Комплексное применение цеолита, глауконита и вермикулита в дозе 3 т/га обеспечивает 2-кратное ускорение биодеградации нефти в торфяно-болотной почве в условиях модельного опыта. Интродукция нефтеокисляющей культуры Рз. ршШа в нефтезагрязненную почву на поверхности глинистых минералов не способствует дополнительному ускорению процесса очистки почвы.

2. Примените цеолита и вермикулита в дозе 1 г/л способствует заметному ускорению и возрастанию глубины микробной деградации углеводородов нефти в водной среде. Применение микробной нефтеокисляющей культуры Л. рШИа на поверхности цеолита и вермикулита способствует увеличению ее численности в воде, продлевает период активности бактерий и обеспечивает дополнительный эффект в деградации углеводородов нефтяной пленки по сравнению с применением чистых глинистых минералов.

3. Эффективность применения глинистых минералов при очистке почвы и водной поверхности от нефти возрастает при уменьшении размера фракции используемых минералов.

4. Одним из основных факторов возрастания фитотоксичности почвы в процессе ее очистки от нефти является накопление в ризосфере растений метаболитов почвенных микроорганизмов, в частности бацилл и микроскопических грибов, снижающих всхожесть семян пшеницы в среднем на 21%.

5. Увеличение в составе ризосферного микробного сообщества доли устойчивых к ксенобиотикам микроорганизмов рода Pseudomonas за счет приема предпосевной обработки семян накопительными культурами бактерий способствует снижению уровня фитотоксичности нефтезагрязненной почвы, которое выражается в 54%-м и 67%-м увеличении всхожести и зеленой массы проростков пшеницы соответственно по сравнению с контрольным вариантом.

6. Применение в условиях 4-летнего полевого опыта торфяного мелиоранта в дозах 25 и 50 т/га, а также приема предпосевной обработки семян многолетних трав 0,005 %-м раствором оксигумата способствовало стимулированию микробиологической и ферментативной активности 1рунта, увеличению в составе органического вещества доли легкоразлагаемых лабильных фракций и, как следствие, инищшрованию в грунте отвала угольного разреза процессов первичного почвообразования.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в журналах, включенных в перечень репетируемых научных изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук:

1. Терещенко H.H. Очистка водной поверхности от нефти при помощи углеводородокисляющих микроорганизмов, адсорбированных на цеолите / H.H. Терещенко, C.B. Лушников, И.В. Русских, А.Д. Писарчук // Вода: химия и экология. - 2011. -№ 12. - С. 67-71. - 0,5 / 0,25 п.л.

2. Писарчук А.Д. Эффективность применения углеводородокисляющих бактерий Pseudomonas putida и сорбента на основе модифицированного верми-компоста для детоксикации нефтезагрязненной почвы / А.Д. Писарчук, H.H. Терещенко, C.B. Лушников // Вестник Томского государственного университета. Биология. - 2011. - № 3 (15). - С. 180-182. - 0,33 / 0,25 п.л.

3. Терещенко H.H. Биоремеднация угольных отвалов Кузбасса при помощи продуктов комплексной переработки торфа / H.H. Терещенко, А.Д. Писарчук, Т.П. Алексеева, Т.П. Бурмистрова // Фундаментальные исследования. -2013. - № 11 (часть 9). - С. 1866-1872. - 0,65 / 0,25 пл.

4. Писарчук А.Д. Перспективы использования торфяных мелиорантов для рекультивации угольных отвалов / А.Д. Писарчук, Т.П. Алексеева, Л.Н. Сысоева, Н.М. Трунова, Т.Н. Бурмистрова // Экология и промышленность России. - 2014. - № 4. - С. 53-57. - 0,5 / 0,2 п.л.

Публикации в других научных изданиях:

5. Писарчук А.Д. Эффективность использования бактериальных культур при фиторемедиации нефтезагрязненных почв // Экология Южной Сибири и сопредельных территорий : материалы XV междунар-науч. школы-конф. студентов и молодых ученых. — Абакан, 2010. - С. 22—23. — ОД пл.

6. Писарчук А.Д., Терещенко H.H. Стимулирование микробиологических процессов в нефтезагрязненной почве под воздействием различных фракций цеолита // Современные проблемы биологических исследований в Западной

Сибири и на сопредельных территориях : материалы Всерос. научн. конф., посвященной 15-летию биологического факультета Сургутского государственного университета. - Сургут, 2011. - С. 259-260. - 0,5 / 0,2 п.л.

7. Писарчук А.Д., Терещенко H.H. Влияние активных микробных культур, цеолитов и продуктов глубокой переработки торфа на скорость очистки нефтезагрязненных почв // Современные проблемы генезиса, географии и картографии почв : материалы V Всерос. конф. с междунар. участием. - Томск 2011.- С. 276-279. - 0,5 / 0,35 п.л.

8. Писарчук А.Д., Терещенко H.H. Влияние микробного сообщества нефтезагрязненной почвы на уровень ее фитотоксичности // Аграрная наука -сельскохозяйственному производству Сибири, Монголии, Казахстана и Болгарии : материалы 14 Междунар. науч.-практ. конф. - Красноярск, 2011. - С. 356-359.-0,5/0,35 п.л.

9. Писарчук А.Д. Эффективность использования активных микробных культур, цеолитов н продуктов глубокой переработки торфа для детоксикации и биоремедиашш нефтезагрязненных почв и воды // Химия и химическая технология в XXI веке : материалы XII Всерос. науч.-практ. конф. студентов и молодых ученых с международным участием. - Томск, 2011. - С. 188-190 -0,2 п.л.

10. Писарчук А.Д., Терещенко H.H. Эффективность использования бактериальных культур для восстановления городских газонов // Экология мегаполисов: фундаментальные основы и инновационные технологии : материалы докладов всерос. симпозиума. -Москва, 2011. -С. 110.-0,5 / 0,2 пл.

11. Писарчук А.Д., Терещенко H.H., Алексеева Т.П., Бурмистрова Т.Н. Влияние торфяных мелиорантов на процессы первичного эмбриогенеза в грунте отпала угольных карьеров // Аграрная наука - сельскому хозяйству : материалы VII Междунар. науч.-практ. конф. - Барнаул, 2012. - С. 188-189 - 0 25 / 0,2 пл.

12. Писарчук А.Д., Терещенко H.H., Алексеева Т.П., Бурмистрова Т.П. Эффективность применения торфяных мелиорантов для биоремедиации грунта отвала угольных карьеров [Электронный ресурс] // WasteECo-2012 Сотрудничество для решения проблемы отходов : 9 Междунар. конф. - Харьков, 2012. - 1 CD-ROM. - 0,35 / 0,25 п.л.

13. Кравец A.B., Терещенко H.H., Писарчук А.Д., Николаева Д.Л., Юну-сова Т.В. Влияние бактериальных препаратов на урожайность и качество зерновых культур /У Пищевые технологии и биотехнологии : материалы Междунар. науч. школы. - Томск, 2012. - С. 43^18. - 0,55 / 0,2 п.л.

14. Писарчук А.Д., Терещенко H.H. Влияние вермикулита на интенсивность биодеградации нефти на водной поверхности // Современное общество, образование и наука : материалы Междунар. науч.-практ. конф. - Тамбов, 2013. -С. 107-108.-0,5/0,2 пл.

15. Терещенко H.H., Лушников C.B., Писарчук А.Д. Перспективы использования природных глинистых минералов и УВ-окисляющих бактерий для очистки почвы от нефти И Современное общество, образование и наука : материалы Междунар. науч.-практ. конф. - Тамбов, 2013. - С. 142-143. - 0 33 / 0,2 пл.

Тираж 100. Заказ 832. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники

634050, г. Томск, пр. Ленина, 40 Тел. 533018.