Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экологические и молекулярно-биологические характеристики лиссавирусов, циркулирующих на территории, стационарно неблагополучной по рабической инфекции

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Экологические и молекулярно-биологические характеристики лиссавирусов, циркулирующих на территории, стационарно неблагополучной по рабической инфекции"

Зайковская Анна Владимировна

ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ И М О Л Е КУЛ Я Р Н О - 5 И О Л О Г и Ч Е С К И Е ХАРАКТЕРИСТИКИ ЛИССАВИРУСОВ. ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ, СТАЦИОНАРНО НЕБЛАГОПОЛУЧНОЙ ПО РАБИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИИ

03 00 06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

ИТ1/»Ла№РОТТТ1Г» ттп ППТГЛТ^ПТТТШ 1т/1ГГЛТг ЛДЩТТлш.! , 1, ч чч-^р I чипп | и.1 ^ V/ и \_1\а ■ ; V -1\,и\Л1 V. ; я

кандидата биологических наук

□0306622В

Кольцово - 2007

003066228

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России

Научный руководитель

кандидат биологических наук Шестопалов Александр Михайлович

Официальные оппоненты

доктор ветеринарных наук, профессор Димов Сергей Константинович

кандидат биологических наук Булычев Леонид Егорович

________ __ _

ииеипизицшь

ФГУН Государственный институт стандартизации и контроля им Л А Тарасевича (Москва)

Защита состоится 26 октября 2007 года в 11 часов на заседании диссертационного совета при Государственном научном пентре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559, тел (8-383) 33674-28

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ ВБ «Вектор. Автореферат разослан Т _ 2007года

Ученый секретарь диссертационного совета

Малыгин Э Г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Бешенство (Rabies) - инфекционное заболевание природно-очагового типа, опасное для человека и многих видов диких и домашних животных Для него, как и для многих других зоонозных инфекций, характерно циклическое течение и наличие резервуара в дикой природе

По оценке Всемирной организации здравоохранения, бешенство входит в пятерку инфекционных болезней, общих для человека и животных, наносящих наибольший социальный и экономический ущербы. Инфекция является острой, абсолютно летальной болезнью, представляющей серьезнейшую проблему современного здравоохранения. В настоящее время бешенство регистрируется на территории более 80 стран мира, в которых ежегодно свыше 10 млн человек получают различные повреждения от животных и около 4 млн человек -специфическую антирабическую помощь Затраты на текущую профилактику и контроль за бешенсааом людей и животных в регионах, где наблюдается бешенство, превышают 400 млн. долларов США Ежегодно от 55000 до 70000 человек погибают после укусов животных, больных бешенством, половина из которых приходится на детей [Smith A, et al 2005, Aral YT. et al 2005]

Учитывая приведенные факты, большое значение имеет разработка национальных и межгосударственных программ, направленных на борьбу с бешенством, основанных на всестороннем изучении современных особенностей этой инфекции Вместе с тем, научно обоснованная система контроля рабической инфекции должна быть разработана на основании знания биологических свойств вируса бешенства, изучении особенностей его экологии

Территории Новосибирской области и Алтайского края являются стационарно неблагополучными по рабической инфекции, они характеризуются регулярным проявлением эпизоотий бешенства в популяциях диких и домашних животных. Оценивая современное состояние проблемы бешенства, следует комплексно рассмотреть закономерности эпизоотического процесса и его особенностей в конкретных условиях, а также выявить экологические предпосылки к возникновению и распространению рабической инфекции.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы явилось изучение экологических и молекулярно-биологических характеристик лиссавирусов, циркулирующих на территории стационарно неблагополучной по рабической инфекции Для достижения поставленной цели нужно было решить следующие задачи1

1 Изучить динамику проявления рабической инфекции в Новосибирской области в период 1997 - 2005 гг;

2. Выявить носительство лиссавирусов в популяции летучих мышей, обитающих в Новосибирской области и Алтайском крае,

3 Изучить спонтанное носительство вируса бешенства в популяции диких плотоядных в межэпизоотический период;

4 Молекулярно-генетическая характеристика лиссавирусов, выделенных от различных видов животных на территории стационарно неблагополучной по рабической инфекции

Положения выносимые на защиту.

1 Данные об экологических особенностях рабической инфекции на территории юга Западной Сибири

2 Определены молекулярно-генетические характеристики изолятов вируса бешенства, циркулирующих в Новосибирской области и Алтайском крае.

3 Получены данные, указывающие на циркуляцию лиссавирусов генотипа 1 у насекомоядных летучих мышей, отловленных на территории Западной Сибири

Научная новизна работы.

Получены новые данные об экологических особенностях вируса бешенства на территории Новосибирской области

Впервые показана циркуляция лиссавирусов в популяции летучих мышей, обитающих ма территории юга Западной Сибири, определена их принадлежность к лиссавирусам генотипа 1

Проведено молекулярно-генетическое изучение лиссавирусов, циркулирующих в Новосибирской области и Алтайском крае.

Теоретическая и практическая значимость.

Получены современные данные об экологических особенностях вируса бешенства, циркулирующих на стационарно неблагополучной территории, которые могут быть использованы для совершенствования мероприятий по борьбе с бешенством. Создана рабочая коллекция изолятов вирусов бешенства, циркулирующих на территории Новосибирской области, подготовлены проекты паспортов для депонирования в коллекции культур микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» По результатам работы в международной базе данных СепВапк зарегистрированы 12 нуклеотидных последовательностей, которые в дальнейшем могут служить базой для конструирования праймеров для диагностики бешенства Материалы, изложенные в диссертационной работе, были использованы для издания учебного пособия

Апробация работы и публикации.

Материалы исследований были представлены на международной научной конференции «Современные проблемы эпизоотологии», (Новосибирск, 2004), сибирской международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы ветеринарной медицины"» (Новосибирск, 2004), международной научно-практической конференции «Современные проблемы охотничьего собаководства», (Киров, 2004), всероссийской конференции «Сибирская

зоологическая конференция» (Новосибирск, 2004), межрегиональном совещании по вопросам профилактики особо опасных инфекций и дезинфектологии (11-15 октября 2004 года, г Новосибирск), межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы здоровья здоровья населения Сибири гигиенические и эпидемиологические аспекты» (Омск, 2004), сибирской международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы ветеринарной медицины» (Новосибирск, 2005), 3-ей российской научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2006)

По теме диссертации опубликовано 6 статей, 3 из них в отечественных реферируемых журналах

Структура и объём диссертации.

Диссертация изложена на 179 страницах машинописного текста и состоит из 4 глав, введения, выводов и списка литературы (194 ссылки), содержит 8 рисунков и 14 таблиц

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе были использованы образцы патологического материала от диких и домашних животных из Новосибирской области, Красноярского и Алтайского края Для диагностики бешенства исследовали головной мозг павших или вынужденно убитых животных с подозрением на заболевание бешенством.

Анализ эпизоотической ситуации по бешенству был проведен на основе отчетных данных ТУ Роспотребнадзора по НСО за период с 1995 ПО 2005 и Новосибирской межобластной ветеринарнои лаборатории (1997 — 2005гг)

Сбор образцов первичного материала.

Пробы головного мозга поступали в вирусологические отделы Новосибирской областной ветеринарной лаборатории в течение 1997 - 2006 годов, в центр государственного санитарно-эпидемиологического надзора в Алтайском крае (2004 г), а затем были переданы в ГНЦ ВБ «Вектор» для подтверждения диагноза и молекулярно-генетического анализа Также в работе был использован вируссодержащий материал от человека, погибшего от бешенства в 2001 году, который был передан из Муниципальной инфекционной клинической больницы №1 в НИИ "Коллекция культур микроорганизмов "ФГУП ГНЦ ВБ "Вектор" Работа с этим материалом была одобрена этическим комитетом ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»

Для сбора материала от летучих мышей за период с 2002 по 2006 годы было проведено 9 экспедиционных выездов Животных собирали в двух пещерах на территории Маслянинского района Новосибирской области, в 4 пещерах Алтайского района Алтайского края, на Телецком озере в окрестностях поселка Артыбаш Республики Алтай

Основные методы.

Работы по диагностике бешенства проводились на базе вирусологического отдела Новосибирской межрегиональной ветеринарной лаборатории согласно ГОСТ 26075-84, материал исследовали в реакциях иммунофлюоресценции, иммунопреципитации в агаровом геле и биологической пробы на беспородных белых мышах, также при постановке диагноза учитывались анамнестические данные Диагноз считали установленным при получении положительного результата хотя бы в одном из тестов

Параллельно выборочные пробы материала тестировали в ОТ-ПЦР с использованием праймеров на районы генов нуклеопротеина и гликопротеина вируса бешенства У 19 полученных ПЦР-продуктов были определены нуклеотидные последовательности и выведены аминокислотные последовательности фрагмента гена нуклеопротеина Определение нуклеотидной последовательности выделенного ПЦР фрагмента проводили на «ßeckman CEQ2000XL DNA Analysis System» («Beckmari Coulter, Inc>>) по методу Sanger et al, согласно инструкции к «Beckman sequencing Kit» Нуклеотидные и выведенные аминокислотные последовательности были анализированы с использованием программы MEGA (PSU, США) и DNASTAR (DNAStar Ine, США)

Ссздакнс рабочей коллекции изолятов вирусов бешенства, выделенных на территории Новосибирской области

Для создания рабочей коллекции изолятов вирусов бешенства были выбраны образцы материала, поступившего из разных районов Новосибирской области от различных видов диких и домашних животных с учетом анамнестических данных и выраженности клинических проявлений болезни Выделение изолятов было проведено на беспородных белых мышах массой 6 -8 г Сбор материала проводили на пике заболевания лабораторных животных, при ярком проявлении клинических признаков, не допуская их гибели. Для каждого образца головного мозга заболевшей мыши при проведении биопробы, подтверждали наличие вируса МФА Для каждого изолята был заполнен паспорт коллекционного штамма микроорганизма для депонирования в Коллекция культур микроорганизмов Федерального Государственного Учреждения Науки Государственного Научного Центра Вирусологии и Биотехнологии «Вектор» (приложения)

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Изучение экологических характеристик вирусов бешенства в

Новосибирской области Новосибирская область считается неблагополучной по бешенству с конца 1997 года В динамике эпизоотического процесса бешенства в Новосибирской области можно выделить два основных подъема эпизоотии с пиками в 1998 и 2002 годах (рис 1) Самый высокий и резкий подъем эпизоотии рабической

инфекции в 1998 году возник, в основном, в результате инфицирования бешенством сельскохозяйственных и домашних животных. Среди диких животных наибольшее количество случаев заболевания бешенством зарегистрировано в 2002 году. Несмотря на постепенное снижение заболеваемости в 2003 году количество заболевших бешенством животных в

2004 год>' оказалось лишь на 11 % ниже, чем в 2002 год}'. В 2005 году снова наблюдалось угасание эпизоотии, но несмотря на это в начале 2006 года эпизоотическая ситуация по бешенству в Новосибирской области оставалась напряженной. Па территориях, где основным источником заболевания являются лисицы, для бешенства характерно циклическое течение с подъемами эпизоотии с интервалами в 3 — 5 лет. Анализ статистических данных по заболеваемости бешенством за период 1997 - 2005 гг. указывает на Периодичность проявления эпизоотии, характеризующийся подъемами и спадами. Высокий и резкий подъем заболеваемости в 1998 году сменяется резким спадом в 2000 году, а затем постепенное повышение заболеваемости к 2002 году поддержи вдетая на высоком уровне до 2004 года. В период 2000 -

2005 гг. в Новосибирской области наблюдается волнообразное изменение уровня заболеваемости с преобладанием бешенства диких животных, но в целом, сложившуюся ситуацию можно оценить как закономерное проявление эпизоотии, характеризующееся 3 — 5-ти летней периодичностью.

□ Бешенство домашних животных й Бешенство диких животных

Рисунок 1. Динамика эпизоотического процесса бешенства в Новосибирской области.

За период с конца 1997 по 2005 годы в Новосибирской области зарегистрировано 1399 случаев заболевания бешенством у разных видов диких и домашних животных.

Сезонность заболевания бешенством среди лисиц, сельскохозяйственных и домашних животных имеет общую динамику. В первые 4 месяца года за изучаемый период было зарегистрировано 62 % всех случаев заболевания бешенством в Новосибирской области. Минимальный уровень заболеваемости наблюдается в летний период. Анализируя данные рисунков (приложение) Можно сказать, что в осенне-зимний периоды наблюдается тенденция к повышению эгш зоэтического процесса бешенства.

Большинство учтенных случаев заболевания животных в Новосибирской области приходится на долю диких плотоядных (39 %). На втором месте по количеству случае® заболевания после диких хищников находятся сельскохозяйственные животные, в основном это крупный рогатый скот (18 %), уровень заболеваемости животных этого вида зависит от заболеваемости лисиц И четко отражает подъем эпизоотии.

142

(18%)

И Дикие хищные животные В Дикие не хинные животные

И Сельскохозяйственные животные В Категория домашних любимцев

■ Домзиние грызуны Е Собаки

Ш Коцки |

Рисунок 2, Видовая структура заболеваемости бешенством животных в Новосибирской области (1997 - 2005).

Как правило, на неблагополучных территориях в период подъема эпизоотии в эпизоотические цели вовлекаются дикие животные, не входящие в разряд хищников. В частности, в Новосибирской области бешенство диагностировано у барсуков (12 случаев), у диких травоядных (диких коз, косуль). Следует заметить, что при этом среди диких травоядных животных наблюдался массовый падеж (по 9-10 животных одновременно), однако, для экспертизы в лабораторию обычно отправляют по одному образцу.

Интересными представляются случаи лабораторного подтверждения бешенства у мышевидных грызунов, зайцев, сурков, бобра

Несмотря на обширный круг животных, вовлеченных в эпизоотический процесс рабической инфекции в Новосибирской области, лисицы играют главную роль в резервации и распространении инфекции При анализе видовой структуры заболеваемости бешенством среди диких животных на долю лисиц за период 1997 - 2005 гг приходится 94 %. Другие дикие животные, по-видимому, не поддерживают бешенство в своих популяциях при отсутствии заболевания у основного хозяина, но они могут играть важную роль наряду с лисицами в передаче болезни диким травоядным и домашним животным, а также человеку.

На долю городского бешенства приходится 18,5 % от общего количества случаев, зарегистрированных в Новосибирской области за укачанный период В пределах города бешенство было диагностировано у кошек, собак и домашних грызунов (комнатных хомяков, белых мышей и крыс)

При анализе эпизоотической ситуации следует ошетигь значительный удельный вес бешенства кошек, особенно, в 1998 - 1999 годы, причем, он не является экзотическим только для Новосибирской области [Балдина И.В., 2003] На долю животных этого вида приходится 16 % от общего количества случаев бешенства животных за изучаемый период

2. Анализ организации мероприятий по контролю бешенства в Новосибирской области

Одновременно с подъемом эпизоотии бешенства с 1998 года в Новосибирской области произошел значительный рост количества лиц, укушенных животными В период с 1995 по 2005 годы 100311 человек обратились с укусами за медицинской помощью Наибольшее количество укусов по области было зарегистрировано в 1998 году (11775 случаев) одновременно с максимальным подъемом эпизоотии бешенства среди животных, показатель на 100 тыс. населения составил 428,9. До этого времени среднее количество лиц, пострадавших от укусов животными, составляло около 7,5 тыс человек в год, до настоящего времени этот показатель держится выше уровня 9 тыс. в год и коррелирует с уровнем заболеваемости бешенством животных

Ежегодно за антирабической помощью в лечебно-профилактические учреждения обращается от 5878 (1997г.) до 9832 (1998г), пострадавших от укусов животными, общее количество обратившихся за изучаемый период составило 86081 В среднем, процент обратившихся за антирабической помощью от количества лиц получивших травмы от животных по Новосибирской области в период с 1995 по 2005 годы составляет 82,14 %

Наибольшее число обратившихся лиц получили повреждения от собак (73,63 %). При этом от укусов домашними собаками за изучаемый период пострадало в 3,5 раза больше людей, чем от укусов бродячими На долю кошек приходится 8,56 % от всех зарегистрированных случаев укусов людей в Новосибирской области С укусами, полученными от сельскохозяйственных

животных, за антрабической помощью люди обращаются достаточно редко (0,48 % от общего числа укусов) Наибольшее значение в этом плане имеет крупный рогатый скот

Чрезвычайно опасными для людей являются укусы диких животных, особенно диких лисиц. В Новосибирской области ежегодно от 0,17 до 1,27 % случаев обращения за антирабической помощью связаны с укусами дикими плотоядными

Курсы вакцинно-сывороточной профилактики бешенства пострадавшим от укусов животными, проводятся вакциной КОКАВ В период с 1995 по 2005 годы профилактическое лечение было назначено в 143952 случаях Отказались от прививок или самовольно прекратили курс лечения в целом по области 6307 человек, что составило 15,6% от числа назначенных Несмотря на это, за изучаемый период в Новосибирской области был зарегистрирован только один случай заболевания бешенством человека в мае 2001 года Пострадавший был инфицирован в результате укуса дикой лисой

Борьба с jutijóo Шей бешенства в Новосибирской области включает в себя следующие мероприятия контроль режима содержания домашних животных, отлов бродячих животных и регуляция численности диких плотоядных, массовую профилактическую иммунизацию и оральную вакцинацию лисиц.

Известно, что распространение эпизоотии бешенства горолского типа находится в прямой зависимости от численности и режима содержания собак и кошек Всего за изучаемый период было отловлено и утилизировано 134474 собак и кошек Утилизация трупов павших животных проводится на Сокурском заводе по утилизации трупов и на скотомогильниках

Общее количество вакцинированных против бешенства собак и кошек за период с 1995 по 2005 годы в Новосибирской области составило 987721 голов, в том числе 270478 в городе Новосибирске. Кроме этого, за изучаемый период было вакцинировано 2141949 голов сельскохозяйственных животных (крупного и мелкого рогатого скота, лошадей, свиней)

Наиболее эффективным способом борьбы с бешенством природного типа является ликвидация очагов этой инфекции в популяции диких плотоядных, являющихся резервуаром инфекции В Новосибирской области, начиная с 1998 года, проводится отстрел диких лисиц За последние 8 лет было уничтожено 14842 голов лисиц. Наряду со снижением численности популяции диких хищников, практически действенным способом профилактики бешенства среди диких животных является оральная иммунизация. Пероральная вакцина против бешенства в Новосибирской области была применена в 1998-99 годах в Баганском, Купинском, Чистоозерном, Здвинском районах. Для иммунизации диких плотоядных использовали вакцины «ЛИС-ВУЛЫ1ЕН>> и «СИНРАБ» производства ВНИИ защиты животных (г Владимир).

Таким образом, можно сказать, что в Новосибирской области проводится достаточно эффективная система мероприятий по борьбе с бешенством, которая позволила значительно уменьшить заболеваемость бешенством домашних и сельскохозяйственных животных, однако, в отношении бешенства

диких плотоядных она оказалась низкоэффективной В Новосибирской области с 2001 года наблюдается преобладание бешенства диких животных при значительном уменьшении заболеваемости домашних животных. В период с 1997 - 2000 гг доля бешенства диких животных составила 35,5 % от общего числа случаев заболевания, в то время как в период второго подъема эпизоотии (2001 - 2005 гг.) этот показатель составил 69,9 % Вероятно, что при отсутствии профилактических мероприятий, подъем эпизоотии в 2002 году мог бы быть намного интенсивнее за счет заболевания поголовья сельскохозяйственных животных. Иммунизация лисиц в Новосибирской области проводится только в отдельных районах, стационарно неблагополучных по бешенству Возможно, она будет более эффективной при одновременном проведении таких мероприятий в приграничных территориях. Для этого необходима разработка комплексного плана проведения организации пероральной иммунизации, не только на областном, но и на региональном уровне

3. Изучение м&л£1^улярнс-гён£тич£скнх особенностей вирусов бешенства, циркулирующих на территории Новосибирской области. Для молекулярно-генетического исследования были выбраны образцы материала, полученного от животных из удаленных друг от друга районов Новосибирской области с ярко выраженными типичными клиническими проявлениями бешенства

Сравнительный анализ полученных аминокислотных

последовательностей фрагмента гена нуклеопротеина со штаммами, представленными в базе данных GenBank, показал, что в Новосибирской области циркулируют близкородственные генетические варианты вируса бешенства Различие нуклеотидных последовательностей выделенных нами фрагментов не превышает 1 - 7 %, все исследованные варианты вируса бешенства относятся к генотипу 1 Вирусы бешенства генотипа î распространены повсеместно и циркулируют в популяциях различных видов теплокровных животных, ранее на территории России были выявлены вирусы только этого генотипа [Селимов и соавт., 1983, 1984 , А Е. Metlm et al, 2004, Kuzmin I.V, et al 2003 ]

Среди выделенных нами штаммов вируса бешенства можно выделить три основные группы. К первой относятся изоляты вирусов, выделенные от человека, барсука, лисицы и летучей мыши (MAN-44, BADG-4983, FOX-3728, BAT-BN1), они характеризуются двумя общими консервативными заменами Lys -» Arg (102 а о) и Asp Asn (106 а о.), Последняя из этих замен характерна для изолятов, полученных от летучих мышей в Канаде и от людей в США Варианты BADG-4983, MAN-44, FOX-3728 имеют замены Phe Leu (126 а о ) и Glu —> Lys (117 а о ), которые свойственны только этим штаммам Вирусный штамм, выделенный от барсука из Здвинского района, является наиболее близким по генетической структуре к человеческому варианту MAN-44 Эти вирусы имеют еще одну общую аминокислотную замену Тгр —> Gly (197 а о) Аналогичную замену имеет штамм BAT-BN1, полученный от

летучей мыши из Маслянинского района Следует заметить, что эти изоляты получены из материала поступившего из граничащих между собой районов Можно предположить, что в данном случае мы наблюдаем результат передачи вируса по пищевой цепи - от летучей мыши к барсуку

Во вторую группу входят два изолята от диких хищников и один от домашней кошки из сельской местности (FOX-41135, FOX-51093, CAT-41979). Эти штаммы имеют общие аминокислотные замены Asp —» Ser (101 а о) и Ala —» Glu (207 а. о). Привлекает внимание значительная гомология штаммов вируса бешенства полученных от домашней кошки из Искитимского района и дикой лисицы из Купинского района Эти изоляты несмотря на значительную отдаленность районов, из которых поступил материал, имеют 5 общих замен: Asp -» Ser (101 а. о.), Ala -> Glu (207 а о ), Try -» Asn (133 а о ), Ala Thr (138 а о ), Met -» Leu (126 а о ) При сравнении этих данных с прототипными вариантами, можно отметить, что все эти замены, за исключением последней, у вариантов, приведенных для сравнения, не встречаются Замена Met -» Leu (126 а о ) зарегистрирована только у вируса Khujand, выделенного от летучей мыши в Таджикистане. Однако, замены в указанной позиции встречаются у летучих мышей в Бразилии и Киргизии.

Для группы изолятов вирусов бешенства, которые мы в дальнейшем отнесли к третьей группе, были получены более короткие аминокислотные последовательности длиной 204 п н (572 - 776 а. о ) (рис ) Эт изоля1ы были выделены от сельскохозяйственных животных HOR-19549, COW-38442, и от домашних собак DOG-33650, DOG-35093, DOG-39142, они имеют общую замену Ile Met (217 а о ), эта замена присутствует и у изолята от лисы FOX-41135, ранее отнесенного ко второй группе Вирусные варианты COW-38442 и HOR-19549, характеризующиеся наличием еще одной уникальной аминокислотной замены Thr —» Asn (228 а. о ), характерной только для этих штаммов, в зтой позиции встречается аминокислотная замена Thr —> lie у фиксированного штамма ERA, автором которого является Prehaud С J, et al, 2001 (Франция).

Таким образом, можно сделать вывод о том, что на территории Новосибирскои области циркулируют близкородственные штаммы вируса бешенства, которые формируют три группы в пределах генотипа 1. Большинство из выявленных аминокислотных замен характерны только для изолятов, выделенных на указанной территории

При филогенетическом анализе было выявлено, что все вирусы бешенства, выделенные нами в Новосибирской области и Алтайском крае, группируются в одну филогенетическую группу На рисунке 3 представлено филогенетическое дерево, построенное на основании сравнения фрагмента гена нуклеопротеина, выделенных нами изолятов лиссавирусов, со штаммами, представленными в базе данных Gene Bank

Построенное нами филогенетическое дерево подтверждает теорию географического распределения вирусов бешенства, показанную многими авторами [Груздев К H и др, 2001, Arai Y.T, 1997, Ito N 1999, Nadm-Davis

S A., 1993, Hyun BH, et al 2005, Park YJ, et al 2005, Mansfield KL, et al 2006, Кузьмин ИВ и др. 2004] Вирусы, имеющие происхождение с отдельных территорий, кластеризуются с высокими показателями бутстреп-индекса

Среди выделенных нами изолятов лиссавирусов можно выделить три основных кластера, в первый из них входят лиссавирусы от летучих мышей, барсука, лисицы и человека (BAT-YN1, BAT-BN1, ВАТ-ВА, BAT-PA, BADG-4983, MAN-44, FOX-3728) Эти вирусы были получены в 2001 - 2002 годах В эту же группу входят фиксированные штаммы вирусов бешенства CVS разных авторов (Inoue S. 2001, Hememann M.N et al, 2001, Tordo N, et al, 1986) и HEP-Flury

Второй кластер представлен изолятами вирусов бешенства, выделенных только в Новосибирской области в течение 2003 года, от трех собак, лошади и быка (DOG-33650, DOG-35093. DOG-49142, HOR-19549, COW-38442). Эти два кластера имеют достоверный бутстреп-индекс. На основании филогенетического анализа наиболее близкими к выделенным нами вирусам являются фиксированные вакцинные ииаммы вирусов Ni-CE, SR.V9, Nishigahara, поддерживаемые в культурах клеток, а также вирусы, выделенные в Японии, и Эфиопии В третий кластер можно отнести вирусы, которые были выделены от диких хищников, кошки и коровы (FOX-41135, САТ-41979, FOX-49355, FOX-51093, FOX-52099, FOX-1153, COW-2502), заболевание которых

ПСОИЗОШЛ" п TYYnv Тпртий к-цж-Tfn не имеет лостолепного 6vTCTr>en-

I ------------rv; Г -------г 1-1 1 v j

индекса В него также входят вирусы, анализированные Кузьминым ИВ. (2001), имеющие происхождение из европейской части России и один вирусный пггамм, автором которого является Bourhy Н 1998 (Франции), однако изолят вируса им был получен из России

Среди выделенных нами лиссавирусов наблюдается тенденция к родству в зависимости от хозяинной принадлежности изолята, все лиссавирусы, выявленные у летучих мышей, располагаются в кластере 1, а изоляты вирусов бешенства, полученные от собак - к кластеру 2 Наибольшее количество изолятов вирусов бешенства, выделенных от диких хищников, находятся в кластере 3. Проводить сравнительный анализ родственных связей между выделенными нами изолятами и штаммами вирусов, составляющими третий кластер, нецелесообразно по причине низких бутстреп-индексов этой группы По данным литературных источников родство между вирусами бешенства, в зависимости от вида животных, от которых выделяли изоляты вирусов, определено во многих странах мира [Schaefer R, et al 2005; Shoji Y et al., 2006, Bordignon J. Y. et al, 2004, Cunha E.M. et al 2005, Kobayashi Y et al 2005; Sato G, et al 2005, Mayen F et al 2003, Shankar V et al. 2005, Nadm-Davis S. A. et al., 2001]

Следует обратить особое внимание на группирование вирусов, выделенных в период до 2003 года в один кластер Вирусы бешенства, имеющие более позднее происхождение, кластеризуются отдельно от них

Близость, выделенных нами вирусов фиксированным штаммам вирусов бешенства доказывает их принадлежность к генотипу 1

IАУ352468 51 Ьс0\«-2502 АУ352467 — АУ352471 [г- РОХ-1153 РОХ-52099

-АУ352481

АУ352482

-АУ352456

АУ352469 АУ352470 -АУ352474

- АУ352479 АУ352465 АУ352464 АУ352483 АУ352492 - АР045664 АУ352491 I IАУ352472 62 П-АУ352473 г] (АУ352466 ВЗ- ЯОХ-49355

(г-АУ352489

АУ352490

РОХ-5тОЭЗ |_Г АУ352463

^-САТ-41979

РОХ-41135 I— 000-33650

J-СО\Л/-38442

811 |—НСЖ-19549

¿дЬ-006-35093

661 006-49142 931 Ni.CE

(\lishiaara 721-аепо^лзе 1 □аоап!

НЕР-Р1ип/ (- РгАУЯАВСУ ^ РОХ-3728 5А|-т'М СУЭ-И СУЭ

IВАОС-4983 Г ВАТ-ВШ 55|г МАИ-44

531_|-ВАТ-ВА

851-ВАТ-РА

аепоЬ/пе 1 (Сапайа ивА! аепоЫое 1 (Вгаг/П аепоЪлзе 1 (\nd\a Эп 1_апса1 аепо^ое 1 (1пс)опез1а1 аепоЪ/ве 1 ГТЬа|1апс11

■ Еигооеап Ьа1 Ыэзауниз -1гки1 унив

- Агауап шгия

- КЬшапс! У1гин

- 1_аао£ Ьа{ у[гия

- West Саисавгап Ва1

аепоЬ/пе 1 (ВгагЛ иЭА СапасЫ

005

Рис 3 Филогенетическое дерево, построенное на основании сравнения нуклеотидных последовательностей гена нуклеопротеина авторских изолятов лиссавирусов со штаммами, представленными в базе данных ОолВапк

4. Лиссавирусы у летучих мышей, обитающих на юге Западной Сибири

Лиссавирусы, связанные с рукокрылыми, вызывают повышенный интерес исследователей во всем мире. Если на Американском континенте они принадлежат только к генотипу 1, хотя имеют ряд устойчивых генетических и антигенных особенностей, отличающих их от штаммов, циркулирующих среди других видов животных, то на других континентах от рукокрылых выделены лиссавирусы генотипов 2, 4, 5, 7 [Кузьмин И. В и др, 2001]

Нами были проведены работы по изучению носительства лиссавирусов у рукокрылых. В выборе образцов материала для работы мы в основном ориентировались на экологические особенности данного вида животных Наибольший интерес для нас представляли животные, обитающие на территориях стационарно неблагополучных по рабической инфекции

Для сбора материала от летучих мышей за период с 2002 по 2006 годы было проведено 9 экспедиционных выездов Животных собрали в двух пещерах на территории Маслянинского района Новосибирской области, в 4 пещерах Алааиского района Алтайского края, на Телецком озере в окрестностях поселка Артыбаш Республики Алтай

В зимний период летучих мышей собирали в зимовочных укрытиях, животные находились в состоянии зимней спячки и были собраны вручную Все манипуляции проводили максимально бережно, чтобы не травмировать

■«•wratumy w up иоопйлить плт/ттаттгш ТТпи атт* лтйтапотп! ллпоЯтгоиш rv

nuwv 'i »»v «amvj^/v,Цд;«. ¿iviii^ tfi/u^ixit» л. v i v/хтх vivu|/uviu vvjmvjivxti^uxa

животных, преимущественно самцов, которые имели пониженную упитанность и наиболее сильно были поражены эктопаразитами Кроме этого, в одной из пещер был обнаружен свежий труп летучей мыши вида водяная ночница, который также был использован для исследований Материал от животных, собранных с отдаленных территорий, транспортировали в жидком азоте в сосуде Дъюара С территории Новосибирской области летучих мышей транспортировали в лабораторию живыми в индивидуальных тряпичных мешочках

Для поимки рукокрылых в летний период пользовались стандартными методиками отловы над руслами речек и на лесных полянах с помощью паутинных сетей (5x12 м), и активный отлов с использованием мобильной ловушки Борисенко [Борисенко А В, 1999] Для обнаружения рукокрылых и первичной видовой идентификации использовался ультразвуковой детектор Pettersson Elektronik D-100 Большинство отловленных животных после снятия регистрируемых морфологических параметров индивидуально метили и выпускали для последующего изучения их миграционной активности и продолжения долговременных популяционных мониторинговых исследований Для вирусологических исследований были отобраны летучие мыши, которые имели какую-либо патологию, пониженную упитанность, шрамы, переломы, сыпь на коже

Всего за весь указанный период было собрано 186 образцов головного мозга от летучих мышей 5 видов, водяная ночница (Myotis daubentonn), прудовая ночница (Myotis dasycneme), ночница Брандта (Myotis brandtii), бурый ушан (Plecotus auritus) сибирский трубконос (Murina leucogaster).

Первичный анализ мозга летучих мышей на наличие антигена лиссавирусов проводили методом флюоресцирующих антител. В 52 пробах (27,96 %) были обнаружены типичные для вируса бешенства мелкие многочисленные флюоресцирующие включения, расположенные очагами

При исследовании материала методом ОТ-ПЦР фрагменты РНК, специфичные для лиссавирусов, удалось выявить в 34 образцах (18 27 %) У трех полученных ПЦР-продуктов (578 пар нуклеотидов) были определены нуклеотидные последовательности и выведены аминокислотные последовательности.

Обращают на себя внимание результаты биологической пробы. Для начала нами была предпринята попытка, выделить изоляты лиссавирусов традиционным методом из семи проб материала, положительного при ПЦР-анализе Было проведено 3 пассажа на беспородных белых мышах массой 6-8 г На 5 - 21 день после заражения у 1 - 2 мышей из группы развивалось заболевание с паралитическими проявлениями Появлялись вялость, отказ от корма, взъерошенность шерсти, своеобразная горбатость спины, нарушение координации движений Однако все эти проявления на каждом следующем пассаже были выражены слабее и наблюдались всего у 1 - 3 животных из группы, в некоторых группах клинические проявления болезни полностью отсутствовали Таким образом, к третьему пассажу остался материал только одного образца На третьем пассаже у трех мышей мы наблюдали приступы тонических судорог в ответ на звуковые раздражения (при постукивании по стенкам садка)

На пике клинических проявлений заболевания у животных брали головной мозг и делали мазки-отпечатки для подтверждения диагноза в МФА Во всех случаях результат был положительным Однако при исследовании головного мозга подопытных животных методом ОТ-ПЦР выделить РНК лиссавирусов не удалось Мы решили использовать более чувствительную модель для выделения изолятов лиссавирусов - 3-х дневных мышей-сосунов Однако, несмотря на наличие у животных специфических клинических признаков и положительные результаты в МФА, ОТ-ПЦР-анализ дал отрицательный результат

Тем не менее, нами показано носительство лиссавирусов у летучих мышей, обитающих в Новосибирской области и Алтайском крае Лиссавирусы были выявлены в пробах материала, полученных от животных, отловленных во всех исследованных пещерах Наибольшее количество положительных проб было получено от летучих мышей вида водяная ночница Myotis daubentonii, этот вид является самым распространенным в Новосибирской области, нами для исследований было отобрано 83,3 % летучих мышей именно этого вида

При сравнительном анализе аминокислотных последовательностей выявленных нами штаммов лиссавирусов и штаммов, депонированных в международной базе данных GenBank, мы выявили, что варианты ВАТ-РА и ВАТ-ВА, которые получены от летучих мышей, отловленных в Алтайском крае, имели аминокислотные замены: Glu -> Lys (117 а о ), Ile —» Met (217 а о ), отличающие их от лиссавирусов, выявленных у летучих мышей в

Новосибирской области. Кроме того, все проанализированные нами варианты от рукокрылых характеризуются заменой Trp -» Gly (197 а о ) В то же время, несмотря на высокое сходство аминокислотных последовательностей обнаруженных вариантов лиссавирусов со штаммом CVS, они имеют аминокислотные замены, которые являются типичными только для этих вирусов.

Новосибирская область в течение последних лет является неблагополучной по бешенству Учитывая это, несомненный интерес для нас представлял сравнительный анализ генотипов лиссавирусов, выделенных от летучих мышей и других видов животных, у которых было диагностировано бешенство. Нами были получены изоляты вирусов бешенства от лисы и барсука, отловленных в различных районах Новосибирской области в 2002 году Филогенетический анализ показал принадлежность этих вирусов и лиссавирусов, выявленных от летучих мышей, к одному кластеру Выше описанные замены в аминокислотных последовательностях фрагмента гена нуклеопротеина лиссавирусов. полученных от летучих мышей, характерны и для этих вирусов. Таким образом, в популяции летучих мышей, отловленных в Новосибирской области и Алтайском крае, циркулируют лиссавирусы генотипа 1, генетически близкие штаммам, вызывающим заболевание бешенством у диких плотоядных на данной территории.

Циркуляция лиссавирусов генотипа 1 у насекомоядных летучих мышей характерна для Американского континента В Евразии от летучих мышей в основном выделяют European bat lyssavirus 1 (EBLV1) и 2 (EBLV2) В средней Азии, выделенные вирусы Aravan и Khujand, не принадлежащие к генотипу 1, они не имеют аналогов среди известных серотипов. Что касается Сибири, ранее здесь регистрировались лишь единичные случаи изоляции лиссавирусов от этих животных без изучения генотипа

Таким образом, с помощью ОТ-ПЦР нами впервые в головном мозге летучих мышей обнаружены фрагменты гена нуклеопротеина генома лиссавируса генотипа 1, для которых определены нуклеотидные и выведены аминокислотные последовательности. Полученные данные указывают на циркуляцию лиссавирусов генотипа 1 у насекомоядных летучих мышей, отловленных на территории Западной Сибири

5. Изучения спонтанного носительетва вируса бешенства в популяции диких плотоядных в межэпизоотический период

Ранее в популяции летучих мышей, не имеющих клинических признаков заболевания, было показано наличие лиссавирусов, принадлежащих к генотипу 1, и являющихся низкопатогенными для лабораторных животных В связи с этим особый интерес для нас представляло исследование популяции диких лисиц, которые являются основным резервуаром вируса бешенства в природе, на носительство вируса бешенства в межэпизоотический период

Было проведено исследование образцов головного мозга лисиц, отстреленных на охоте на территории Алтайского края. Клинических

признаков заболевания бешенством ни у одного животного, от которого был отобран материал, не наблюдалось

В результате исследования 302 образцов головного мозга от диких лисиц методом МФА, было выявлено 3 образца, положительных на наличие антигена вируса бешенства.

При проведении биологической пробы материала, положительного в МФА, для 2 образцов был получен положительный результат Гибель наблюдалась у 30 % подопытных мышей в период с 10 по 21 сутки Специфичность результата была подтверждена МФА. Полученный результат говорит о низкой степени инфекционности выделенных вирусов, так как при проведении биологической пробы они имели низкий процент инфицирования и инкубационный период более длительный, чем для эпизоотических вирусов, выделенных от этого же вида животных

Таким образом, нами было выявлено, что 2,3 % диких плотоядных, отстреленных на территории Алтайского края, являются носителями вируса бешенства в межэпизоотический период. При окончательном заключении о наличии вируса бешенства в исследованных образцах головного мозга мы учитывали только положительные результаты МФА

Результаты наших исследований показали, что в популяции летучих мышей, обитающих на территории Новосибирской области и Алтайского края, согласно результатам МФА вирусоносительство в 12 раз превышает наличие вируса бешенства в головном мозге диких плотоядных, отстреленных на территории Алтайского края в межэпизоотический период Однако, вирусы, выделенные из головного мозга здоровых плотоядных, более патогенны для лабораторных животных, чем лиссавирусы, циркулирующие у летучих мышей в Новосибирской области и Алтайском крае.

ВЫВОДЫ

1 При анализе динамики эпизоотического процесса бешенства в Новосибирской области за период с 1997 по 2005 годы можно выделить два основных подъема эпизоотии с пиками в 1998 и 2002 годах.

2 Эффективная система контроля рабической инфекции в Новосибирской области позволила более чем в 2 раза уменьшить удельную долю заболевания бешенством домашних и сельскохозяйственных животных, по отношению к доле бешенства диких животных.

3 Главную роль в резервации и распространении рабической инфекции играют дикие плотоядные, при этом, выявлено, что в межэпизоотический период 2,3 % клинически здоровых лисиц являются носителями вируса бешенства

4 Впервые у насекомоядных летучих мышей отловленных на территории юга Западной Сибири с помощью ОТ-ПЦР обнаружены лиссавирусы генотипа 1

5. Показано, что в популяции летучих мышей согласно результатам МФА вирусоносительство в 12 раз превышает наличие вируса бешенства у диких плотоядных в межэпизоотический период

6 Установлено, что вирусы, выделенные из головного мозга клинически здоровых плотоядных, более патогенны для лабораторных животных, чем лиссавирусы циркулирующие у летучих мышей

7. На территории Новосибирской области циркулируют близкородственные штаммы вируса бешенства, которые формируют три группы в пределах генотипа 1.

8 Группирование вирусов в кластеры зависит от времени выделения изолята, а также наблюдается тенденция к родству в зависимости от хозяинной принадлежности изолята

Основные публикации по теме диссертации.

] Зайковская А В, Терновой В А.. Аксенов*В И., Рассадкин Ю Н., Шестопалов А М Молекулярно-генетическая характеристика изолятов вируса бешенства, выделенных на территории западной Сибири Журнал инфекционной патологии, Иркутск, том 12, № 3 -4,-2005,-с 90-91

2 Зайковская А В , Терновой В А, Аксенов В И, Рассадкин Ю IL, Молекулярно-генетическая характеристика изолятов вируса бешенства, выделенных на территории Западной Сибири. Вестник РАМН, № 2,2005, с 31 - 35

3 Зайковская А. В , Аксенов В И, Рассадкин Ю. Н, Шестопалов А М Эпизоотическая обстановка по бешенству в Новосибирской области в период 1997 - 2003 гг ЖМЭИ, № 4,2005, - с 37 - 40.

4 Терновой В. А. Зайковская А В , Томиленко А. А., Рассадкин Ю Н, Аксенов В И, Scharf, В Шестопалов А М Лиссавирусы у летучих мышей, обитающих на юге Западной Сибири. Вопросы вирусологии, № 1,2005, с. 31 - 35

5 Зайковская А В , Васеньков Д А, Першикова Н Л, Терновой В А, Шестопалов А М, Донченко Н А, Потапов М А Изучение участия рукокрылых (Mammalia, Chiroptera), обитающих в Западной Сибири, в циркуляции возбудителей зоонозов потенциально опасных для человека // Вестник КрасГУ, 2006 - с 98-104

6 Барышников П И., Грязин В Н., Зайковская А В Совремннные проблемы бешенства животных. -М, КолосС, 2007 — 81 с

Подписано в печать 04 09 2007 Формат 60x84 1/16 Печ л.1.6

Заказ № 75 Бумага офсетная, 80 гр/м Тираж 100

Отпечатано в типографии Института каталиса им Г К Борескова СО РАН