Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Две компоненты десенситизации никотиновых холинорецепторов нейронов моллюска

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Две компоненты десенситизации никотиновых холинорецепторов нейронов моллюска"

1 ^ ЦЕЛ «ЗВ

На правах рукописи

Андреев Алексей Алексеевич

ДВЕ КОМПОНЕНТЫ ДЕСЕНСИТИЗАЦИИ НИКОТИНОВЫХ ХОЛИНОРЕЦЕПТОРОВ НЕЙРОНОВ МОЛЛЮСКА

03. 00. 02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино 1998 г.

Работа выполнена в Институте биофизики клетки РАН, г. Пущино, Московской обл

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Доктор биологических наук, профессор Б. Н. Вепринцев

кандидат биологических наук Е. А. Вульфиус

Доктор биологических наук, член - корр. РАЕН М.Н. Жадин Доктор физико- математических наук B.C. Акатов

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, г. Москва

Защита состоится " " Зн Я 199 ^ г. в " ^ " часов на заседании Диссертационного совета Д 200.23.01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142292, г. Пущино Моск. обл., ИБКРАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБК РАН (г.Пущино)

Автореферат разослан " " ^ ¿¿¿.cet^&J) 199 S' г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Смолихина Т. И.

Общая характеристика работы. Актуальность проблемы. Никотиновые холинорецепторы (нХР) -мембранные белки из группы рецепторов, имеющих в своей структуре -юнные каналы. В эту группу входят также нейрональные рецепторы млекопитающих (рецепторы у-аминомасляной кислоты, глутамата, глицина, серотонина) и глутаматные рецепторы беспозвоночных (Karlin, \kabas, 1995). Функция нХР - участие в синаптической передаче. При длительном или частом ритмическом действии АХ проявляется :пецифическое свойство нХР - снижение проводимости мембраны, несмотря на присутствие медиатора, десенситизация (Katz, Thesleff, 1957). Кинетическая схема функционирования нХР, предложенная этими авторами, хорошо описывала все известные факты. Цесенситизация и выход из десенситизации в этой схеме соответствуют эдной экспоненте. Но с 1980 г. начали появляться данные о более сложном характере десенситизации нХР (Andreev, Vulfius, 1980, Feltz, Frautmann, 1980). Десенситизация представляет собой информационный переход молекулы рецептора в непроводящее :остояние с высоким сродством к агонистам (Barrantes, 1978, Heidemann, Changeux, 1980). На десенситизацию катионселективных нХР мышц оказывают влияние ионы Са2+ и Mg , температура, мембранный потенциал (Magazanik, Vyskocil, 1973, 1975), есть так же отдельные /казания на влияние структуры агониста. Нейрональные нХР млекопитающих и особенно анионселективные нХР нейронов эеспозвоночных исследованы значительно меньше. В основном исследованы катионселективные нХР мышц позвоночных и электрических органов рыб, в меньшей степени нХР нейронов (Karlin, 1980). В то же время изучение функционирования, в том числе и десенситизации, самых разных рецепторов очень важно для более "лубокого понимания процессов синаптической передачи и зозможностей эффективно влиять на эти процессы.

Цель и основные задачи исследования: Цель работы - изучить десенситизацию и выход из десенситизации анионселективных нХР нейрона моллюска, зависимость этих процессов от внешних факторов и }нутриклеточных регуляторных систем.

1

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

- изучить кинетику десенситизации и восстановления активности нХР в зависимости от концентрации агониста, структуры вещества вызвавшего активацию нХР, температуры и мембранного потенциала;

- определить, как влияют на ответ нейрона на АХ, десенситизацию и выход из десенситизации вещества, активирующие энергетический метаболизм клетки и синтез циклических нуклеотидов.

Научная новизна. В работе впервые получены следующие результаты:

- десенситизация анионселективных нХР нейрона моллюска - сумма двух компонент. Только первая, быстрая компонента десенситизации замедляется при понижении температуры Скорость десенситизации увеличивается при повышении концентрации АХ и агонистов;

- выход нХР из десенситизации - также сумма двух компонент, причем кинетика выхода не зависит от концентрации и структуры агониста, вызвавшего десенситизацию. Только вторая компонента выхода из десенситизации имеет высокую зависимость от температуры;

- в насыщающих концентрациях полных агонистов постоянные времени обеих компонент десенситизации приближаются к минимальным значениям. Только частичные агонисты вызывают дальнейшее падение амплитуды ответа и ускорение спада ответа нейрона на агонист после плато в области насыщающих концентраций;

- воздействия, вызывающие увеличение уровня цАМФ и/или возможную активацию окислительного фосфорилирования уменьшают ответ на АХ и замедляют выход из десенситизации нХР;

- данные по влиянию ПГЕг на нХР нейронов прудовика позволили предположить участие простагландинов в регуляции функций нейрональных рецепторов.

Практическое значение: В работе показана возможность регуляции чувствительности нейрона к АХ внешними факторами (температура, наличие в окружающей среде субстратов окислительного фосфорилирования, гормонов и медиаторов) и внутриклеточными ферментными системами (аденилатциклазной и окислительного фосфорилирования). Анионселективные нХР моллюсков-аналоги рецепторов у-аминомасля-ной кислоты и глицина в мозге млекопитающих (КагНп, АкаЬаэ, 1995).

2

Чувствительность нХР нейрона прудовика к внутриклеточным системам была использована для поиска эффективных биологически - активных производных простагландинов.

Апробация. Материалы докладывались на: совещании "Структура и функции холинорецепторов" Пущино-1979, Всесоюзной конференции "Физиология и биохимия медиаторных процессов" Москва-1980, Ш советско-шведском симпозиуме по физико-химической биологии Тбилиси-1981, I Всесоюзном биофизическом съезде Москва-1982, Всесоюзной конференции молодых ученых ВНИИФ Москва-1984, П Всесоюзном совещании "Прикладные и синтетические исследования простагландинов" Уфа-1984, V Всесоюзном симпозиуме "Циклические нуклеотиды и система регуляции ферментативных процессов" Рязань-1985, Ш Международной конференции "Колосовские чтения-97" Ст.-Петербург-1997.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методики, результатов работы и обсуждения, выводов и списка литературы. Содержание изложено на 137 стр. машинописного текста, включая 4 таблицы, 35 рисунков, список литературы содержит 309 источников.

По материалам диссертации опубликовано 22 работы и получено 1 а. с.

Список сокращений применяемых в автореферате:

АХ - ацетилхолин, АТФ - аденозинтрифосфат, НА - норадреналин, нХР — никотиновые холинорецепторы, ПГЕ2 - простагландин Ег, СДГ - сукцинатдегидрогеназа, цАМФ - циклический аденозинмонофосфат, цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат, тдс1,п - постоянные времени десенситизации, т,,1' 11 - постоянные времени выхода из цесенситизации, 10 - амплитуда тока на пике ответа, I1,111 - амплитуда соответствующей компоненты десенситизации или выхода из цесенситизации, 1СТ - стационарный уровень ответа нейрона на агонисты, 1оэ - стационарный уровень ответа нейрона на микроаппликацию АХ, устанавливающийся после полного выхода нХР из десенситизации, (^ю - температурный коэффициент, изменение жорости реакции при изменении температуры на 10°С .

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Объект и методы исследования: Объект исследования - нейроны брюхоногого моллюска прудовика Lymnaea stagnate L.

Все эксперименты проведены на изолированных идентифицированных гигантских нейронах. Активация нХР в этих нейронах увеличивает проводимость мембраны только для СГ (Chemeris et al., 1982). Нейроны выделяли по методу Костенко (Костенко и др., 1972) с модификациями. Нейрон помещали в экспериментальную камеру и прижимали к дну камеры двумя стеклянными микроэлектродами, которые вводили в клетку. Фиксацию мембранного потенциала и измерение тока осуществляли через микроэлектроды. Для ионофоретической микроаппликации применяли микроэлектрод, заполненный 1М раствором АХ. Растворы веществ подавали в проток через камеру или непосредственно на нейрон (микроперфузия). Микроперфузия позволяла полностью менять омывающий раствор за время около 20 мсек. Время нарастания ответа до пика в эксперименте было значительно больше (100-300 мсек). Температуру раствора регулировали системой термостабилизации. Аппаратура для фиксации мембранного потенциала и измерения тока - комплекс Аксон-1(СКБ БП АН СССР).

Постоянные времени десенситизации (тдс) и восстановления (тв) получали построением графиков изменения тока холинорецептивной мембраны нейрона в полулогарифмических координатах.

Концентрации циклических нуклеотидов определяли с помощью наборов cAMP Assay kit, и cGMP RIA kit ("Amersham") в целом мозге прудовика и в малых париетальных ганглиях. Иногда для определения цАМФ использовали протеинкиназу из мышц кролика и дважды меченый циклический нуклеотид 2,8-Н3-цАМФ (Ленинградская контора "Изотоп"), что значительно увеличило чувствительность метода. Определение проводили совместно с к.б.н. А.В. Лазаревой. Эффекты сукцината на нХР нейрона исследовали совместно с д.б.н. М.Н. Кондрашовой. Для оценки уровня активации энергетического метаболизма определяли гистохимическим методом активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) в отдельных нейронах. Определение проведено совместно с д.б.н. А.Ю. Буданцевым.

Десенситизация и выход из десенситизации.

Ответ нейрона на АХ состоит из быстрого нарастания тока через мембрану до максимума с последующим спадом до стационарного уровня (1ст ), обычно не равного нулю. Для изучения кинетики десенситизации строили график спада ответа в полулогарифмических координатах (рис. 1). Обычно процесс десенситизации можно представить в виде суммы двух экспонент.

Рис. 1. Пример ответа нейрона на микроперфузию АХ (А) и разложение на составляющие экспоненты (Б).

10 - ток через мембрану на пике ответа, 1ст - стационарный уровень ответа, I) - постоянная времени первой (быстрой) компоненты, т2 -постоянная времени второй (медленной) компоненты

десенситизации. За нулевую точку по времени взят пик ответа. Экстраполяция экспонент в нулевую точку отсчета дает пиковые значения амплитуды компонент I1,1".

1п1

4 3 2 1

К"-.

05Г:

П\

; ! : I >

12

Анализировали постоянные времени десенситизации тдс , т дс , отношение амплитуды быстрой компоненты к общей амплитуде ответа (1'/1о) и1„.С повышением концентрации АХ значения т'дс уменьшались (рис. 2) и приближались к минимуму (в среднем 1,4 сек) при насыщающих (вызывающих максимальный ответ) концентрациях.

т'с (сек)

Л

Л

Рис. 2. Концентрационная зависимость т дс

Даны средние значения и ошибка среднего арифметического полученные в экспериментах на 7 нейронах.

10

мкМ

Отношение 11/10 увеличивалось с повышением концентрации АХ и достигало максимума в концентрациях около 10 мкМ (рис. 3).

1

г

1 I Рис. 3. Доля первой компоненты десенситизации в общем процессе (|'/1о).

Шкала концентраций логарифмическая. Данные для 2 разных нейронов (• А) и средние значения для 16 клеток (м).

мкМ АХ

1

ю

100

Двухэкспоненциальный характер десенситизации был обнаружен одновременно с нами на концевой пластинке мышцы лягушки (Бе^, Тга1Мпапп, 1980). Встречались нейроны с десенситизацией, представленной только одной компонентой. На таких нейронах минимальные значения тдс в среднем 1,1 сек, т. е. близка к значениям х'дс, а 1ст=0. Постоянная времени второй компоненты десенситизации тоже уменьшается с ростом концентрации АХ, но зависимость слабая, для разных нейронов степень выраженности эффекта сильно вариирует. Десенситизация нХР нейронов при действии агонистов также состояла из двух экспонент, различие было только во временных параметрах и амплитуде. В насыщающих (вызывающих максимальный ответ) дозах, значения т'дс, т"дс, 11/1о достигают предельных значений, эти значения даны в табл. 1. Исключение составили частичные агонисты, увеличение их концентраций выше насыщающих вело к снижению 1о , "С1дс т"дс и 1'/10 (например ЭтСХ, КаХ, Суб.Х, Себ.Х в табл. 1). Влияние такого агониста на параметры ответа нейрона показано на рис. 4. на примере этоксисебацинилхолина.

Потенциал на мембране слабо влиял на т'дс, т"дс. Это можно отнести к особенностям десенситизации анионселективных нХР, т. к. для катионселективных нХР показана выраженная зависимость скорости десенситизации от потенциала мембраны (Ма§агашк, УузкосП, 1973, Р1ескегз ег а1., 1980), обусловленная входом ионов Са2+ через ионный канал активированного нХР (МНес1у, 1980).

Рис. 4. Зависимость параметров ответа нХР нейрона от концентрации этоксисебацинилхолина.

Показаны данные полученные на 2 нейронах. Шкала концентраций логарифмическая.

А. - амплитуда ответа (левая шкала для (а).

Б - доля первой компоненты в общем спаде.

В - постоянная времени первой компоненты. Г - постоянная времени второй компоненты. Мембранный потенциал : -50 мВ (а), -40 мВ (♦).

Охлаждение раствора вызывало небольшое уменьшение ответа нейрона на АХ и замедление десенситизации. Для т'дс значения Qm равно 2,8 ± 0,9 (п = 4), а для тпдс Qio = 1,3 ± 0,4 (п = 4). Понижение температуры снижает как относительную, так и абсолютную амплитуду первой компоненты в общем процессе десенситизации. Замедление десенситизации при понижении температуры было показано также на нХР мышцы лягушки (Magazanik, Vyskocil, 1975).

Выход нХР из десенситизации, изучали по ответам на микроаппликацию после отмывания кондиционирующей дозы АХ, вызывавшей десенситизацию нХР до установления 1er- (рис. 5). Частоту и амплитуду импульсов тока при микроаппликации АХ подбирали таким образом, чтобы они не вызывали снижения ответа нейрона. Вычисления проводили относительно стационарного уровня ответа на микроаппликацию АХ после полного восстановления из десенситизации (I«,). Строили график зависимости ln(I«> - It / Lo) от времени после начала отмывания. Первая компонента (т'в в среднем 11 сек) при комнатной температуре была незначительна по величине от общей амплитуды. Постоянная времени второй компоненты - 2+3 мин. Значения тпв не зависели от типа и концентрации агониста.

,з

U

9

:ек 4

3

2

1

0

ГнА

А

1мкА

/ * \ ^

/ 4 ^ m

L 1_I_I lJ

1 10 100 мкМ

100

50

0,5

Г/1„

t ' • *

J_L

J

1 10 100 мкМ

«

И- \

-чЛ.

40

20

■

J_I

сек ' \.V

1 10 100 мкМ

—1 I

Ч_I . ,1 , )

1 10 100 мкМ

Г

Таблица 1. Параметры десенситизации нХР нейронов прудовика при действии насыщающих концентраций агонистов.

Агонист (А) [А] (мМ) ' дс (сек) -Ьдс т дс АХ Т. дс (сек) 1'Яо

АХ 0,01-0,014 1,4±0,1 1 10±1,8 0,84±0,02

(п=П) (п=11) (п=7)

0,1-0,2 1,7±0,1 13,6±1,1 0,83±0,02

(п=17) (п=13) (п=13)

БуХ 0,1-1 1,6±0,2 0,96 ±0,04 11,1±6,3 0,85±0,02

(п=5) (п=4) (п=5) (п=5)

КаХ 1-2 1,5±0,1 1,13±0,08 12,9±1,8 0,75 ±0,02

(п=4) (п=4) (п=4) (п=4)

ЭтСХ 0,1 3,3±0,7 1,44±0,06** 22±3,8* 0,72±0,04**

(п=6) (п=3) (п=6) (п=4)

1 0,9±0,2 0,49±0,22** 5,8±1,4** 0,64±0,01**

(п=4) (п=2) (п=4) (п=3)

ТМА 1-2 1,2±0,1 0,99±0,12 8,1±2,5 0,75±0,04

• (п=9) (п=6) (п=8) (п=7)

ЭТМА 1 2,2±0,2 0,99±0,01 18,4±4,7 0,81 ±0,04

(п=4) (п=4) (п=4) (п=4)

БТМА 1-2 1,7±0,2 0,98±0,03 15,1±4,1 0,84±0,03

(п=5) (п=5) (п=5) (п=5)

ГТМА 1 3,0±0,6 1,44±0,1** 16,0±4,2 0,5±0,06**

(п=6) (п=6) (п=6) (п=6)

Сукц.Х 1 2,0±0,01 1,89 ±0,06** 11,2±2,6 0,79±0,04

(п=3) (п=3) (п=2) (п=2)

Суб.Х 0,05-0,1 2,1±0,2 1,47±0,02** 19,3±4,5 0,77 ±0,04

(п=4) (п=4) (п=4) (п=4)

0,5-2 1,6 ±0,01 1,11±0,08 8,7 ±1,8 0,67±0,09**

(п=6) (п=6) (п=6) (п=6)

Себ.Х 0,1 - 0,2 3,0±0,4 1,34±0,09** 18,1±2* 0,69±0,05**

(п=6) (п=4) (п=6) (п=6)

1 0,9±0,1 0,7±0,2 4,9±0,3 0,62±0,12

(п=3) (п=3) (п=3) (п=3)

БуХ-бутирилхолин, КаХ- каприлилхолин, ЭтСХ - этоксисебацинилхолин,

ТМА - тетраметиламмоний, ЭТМА - этилтриметиламмоний,

БТМА - бутилтриметиламмоний, ГТМА - гептилтриметиламмоний,

Сукц.Х- сукцинилхолин, Суб.Х - суберилхолин, Себ.Х - себацинилхолин.

Даны средние значения ± ошибка среднего арифметического.

Разница с данными для АХ достоверна: * - Р < 0,05; ** - Р < 0,01.

чш

Рис. 5. Выход нХР из десенситизации.

А. Слева ответ нейрона на перфузию кондиционирующей дозы АХ 50 мкМ, вызывавшей десенситизацию нХР до стационарного уровня. Справа ответы на

_ ^ _ ^ 1 микроаппликацию АХ после отмывания

кондиционирующей дозы, показано при Б Ч-М'а большом усилении. Начало отмывания

*«• т кондиционирующей дозы АХ показано

Л, тУ-79сек стрелкой. Даны первые 5 ответов, затем 11,

31, 51, 81 ответы. Калибровка 200 нА и 1 сек для левой части и 20 нА и 8 сек для правой части.

Б - выход из десенситизации нХР показан в полулогарифмических координатах с разложением на экспоненты. Амплитуда быстрой и медленной компоненты - 30% и 70% соответственно.

100 г

50 30

10

\ \

"1т' =14 сек

48 96

Снижение температуры замедляло выход из десенситизации (рис. 6), увеличивая т"в, а т'в менялось незначительно. При этом амплитуда 11в эосла, а 1пв, соответственно, уменьшалась. Для х1;, коэффициент <2м.= 1,1 Ь 0,1 (п=5), для тпв - Qlo = 3,0 ± 0,5 (п=6). Высокая температурная ¡ависимость десенситизации и выхода из десенситизации бьша показана также на нХР мышцы лягушки (Ма§агашк, УуэкосП, 1973, 1975).

= 87 сек

Рис. 6. Влияние температуры на выход нХР из десенситизации.

Снижение количества нХР в десенситизированном состоянии при отмывании кондиционирующей дозы АХ 20 мкМ. Выход из десенситизации представлен в виде двух экспонент. Температура 20°С (+) и 10°С (■). Доля второй, медленной компоненты, при 20°С -0,75, а при 10°С - 0,58. доля первой 0,25 и 0,42 при 20°С и 10°С. Значения постоянных времени даны на рисунке.

"аким образом кинетика как десенситизации так и выхода из ¡есенситизации нХР имеет сложный двухкомпонентный характер, "олько быстрая компонента десенситизации и медленная компонента

20

60

100

выхода нХР из десенситизации имеют высокую температурную зависимость, что указывает на существование энергозависимых стадий в процессах функционирования молекулы нХР. Концентрационная зависимость сильно отличается для полных и частичных агонистов, возможно что колоколообразная зависимость ответа на частичные агонисты обусловлена связыванием с аллостерическим участком нХР или взаимодействием с ионным каналом.

Влияние факторов, способных изменить метаболизм нейрона.

Высокая температурная зависимость десенситизации и выхода из десенситизации нХР позволяет предположить участие энергозависимых процессов, в том числе и биохимических реакций. Из литературы известно, что цАМФ-зависимое фосфорилирование с использованием АТФ в качестве донора фосфата приводит к ускорению десенситизации нХР (Huganir et al., 1986, Downing, Role, 1987). На нейронах прудовика наблюдали подавление ответов на АХ при повышении внутриклеточной концентрации цАМФ (Акопян, 1981) Поэтому мы исследовали влияние воздействий способных повысить уровень цАМФ и АТФ в нейронах. Норадреналин (НА), сукцинат, изоцитрат, применяли как вещества, для которых в литературе показано активирующее влияние на окислительное фосфорилирование в нейронах (Базанова и др., 1985). Для активации аденилатциклазы использовали НА (Seamon et al., 1981) и простагландин Ег (Vonvoigtlander, Losey, 1977). Оуабаин применяли в качестве вещества, способного специфически заблокировать Na-K-АТФ-азу, потребляющую значительное количество АТФ в клетке (Хухо, 1990). Исследовали влияние этих веществ на параметры ответа нейрона на АХ. Параллельно изучали влияние сукцината, НА и ПГЕ2 на уровень циклических нуклеотидов в мозге прудовика и на активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) в идентифицированных нейронах. По активности СДГ судили об уровне окислительного фосфорилирования в клетке.

Действие оуабаина: Ответ нейрона на микроаппликацию АХ снижался в присутствии оуабаина и в растворе без ионов К1". При отмывание оуабаина восстанавление ответов неполное. В растворе без ионов К+ оуабаин не оказывал влияния. С понижением температуры раствора,

10

влияние оуабаина на чувствительность к АХ уменьшалось и при 2+6°С исчезало. Оуабаин не влиял на скорость десенситизации при микроперфузии раствора АХ, но выход ХР из десенситизации замедлялся за счет значительного увеличения постоянной времени второй компонеты. Результаты экспериментов показывают, что эффекты оуабаина на нХР нейрона прудовика результат специфического ингибирования Иа-К-АТФ-азы, следствием этого является замедление выхода из десенситизации и задержка нХР в неактивном состоянии. Влияние сукцината. Сукцинат в низких концентрациях (2-^20 мкМ) снижал амплитуду ответов на АХ у одних нейронов и увеличивал у других. При действии высоких концентраций (2(Н1 ООмкМ) ответы увеличивались, клетки набухали и быстро погибали. Снижение ответа на АХ в присутствие сукцината было обратимо, выход нХР из десенситизации для таких нейронов в присутствии сукцината замедлялся. Двойственные эффекты сукцината описаны ранее на нейронах пиявки, характер эффекта зависел от состояния ключевых показателей энергетического метаболизма, на нейронах в плохом состоянии сукцинат усугублял это состояние (Базанова и др., 1985).

Действие сукцината и изоцитрата на фоне НА. Сукцинат в сочетании с НА (или после обработки нейрона НА) увеличивал мембранный потенциал и снижал проводимость мембраны нейрона, что можно расценивать как улучшение общего состояния клетки. На фоне сукцината в сочетании с НА, ответы на микроаппликацию АХ снижались даже в тех случаях, когда перфузия одним сукцинатом вызывала увеличение ответа (рис. 7). После удаления НА и сукцината восстановление ответов на АХ было неполным.

Рис. 7. Ответы нейрона на микроаппликацию АХ при действии сукцината и норадреналина.

Стрелками показано добавление веществ в перфузирующий раствор и отмывание из камеры. 1 - сукцинат 20 мкМ, 3 - НА 20мкМ, 4 - НА 20 мкМ + сукцинат 20 мкМ, 5 - сукцинат 0,2 мМ, 6 - НА 0,2 мМ + сукцинат 0,2 мМ, Я -отмывание сукцината и НА.

3 4

!

10 НА

Змян

I*

!||ЦЩЩ||1

Выход нХР из десенситизации в присутствии сукцината и НА замедлялся и был неполным. Эффект зависел от концентрации сукцината. Изоцитрат в сочетании с НА действовал подобно сукцинату.

По нашим результатам создается впечатление, что воздействия, вероятно повышающие уровень цАМФ и АТФ в клетке, снижают ответ нейрона на АХ. В то же время на диализованных нейронах прудовика в присутствии во внутриклеточном растворе АТФ показано увеличение амплитуды ответа и ускорение двух компонент десенситизации нХР (Ьогоуауа е1 а1., 1993). Возможно для модуляции ответа нейрона требуется повышение уровня как АТФ, так и цАМФ. Эффекты ПГЕ2. В присутствии ПГЕг или его производных ответ на микроаппликацию АХ медленно, в течении нескольких минут, уменьшался. Степень снижения ответа зависела от концентрации (рис. 8 А).

100

50

%

100

%

; ! I и

/

50

/ /♦

мкМ

0,1 1 10 100 1000

«\

\ ч \\

\

ч

1_

_1_

мкМ _I

1 10 100 1000

Рис. 8. Эффекты ПГЕг и его производных. А. Степень подавления ответа на АХ в зависимости от концентрации ПГЕ2 (ш), этилового эфира ПГЕ2 (х) и углеводного производного ПГЕ2 (♦). Б. Степень восстановления ответа после отмывания производных ПГЕ2 в зависимости от исходной концентрации.

Восстановление ответа после воздействия ПГЕ2 было полностью обратимо, тогда как после отмывания производных ПГЕ2 оно было неполным и зависело от использованной концентрации (рис. 8 Б).

Амплитуда ответов нейрона и кинетика десенситизации нХР, при микроперфузии растворами АХ и ПГЕ2, не отличались от контроля. Для производных ПГЕг наблюдали прогрессивное снижение ответов на АХ при последующих испытаниях, вероятно за счет задержки части нХР в неактивном состоянии. Значительное последействие производных ПГЕ2 можно объяснить тем, что они более длительное время удерживаются в мембране и/или более стабильны и медленнее инактивируются

Б

ферментными системами клетки. Эффекты простагландинов возможно :вязаны с активацией аденилатциклазы в нервной ткани. Сходство воздействий сукцината и НА, ПГЕг и его производных позволило предположить, что они действуют на нХР через одни и те же исполнительные системы. В связи с этим мы исследовали как меняется вровень цАМФ при действии норадреналина и сукцината, а так же ПГЕ2 л его производных.

/ровень циклических нуклеотидов. В предварительных жспериментах ПГЕ2 и его производные вызывали значительные вменения цАМФ как в мозге моллюска прудовика, так и в тканях млекопитающих. Так как целый мозг очень неоднородная структура, 1ровели более детальные эксперименты на изолированных малых 1ариетальных ганглиях, большую часть объема которых занимают 3 •игантских нейрона. Концентрация цАМФ в малых париетальных англиях в контроле 2,24±0,21 пмоль/мг веса (5 проб) или 96,7±9,3 шоль/мг белка (5 проб), цГМФ - 0,63 ±0,16 пмоль/мг веса или 24,8 ± 1,4 пмоль/мг белка (3 пробы). На одну пробу брали 80 ганглиев.

В малых париетальных ганглиях изменения уровня цАМФ были ярко (ыражены. Обработка НА или НА в сочетании с сукцинатом вызывала начительные, но кратковременные увеличение уровня цАМФ и (олговременное снижение цГМФ (рис. 9).

Рис. 9. Влияние сукцината и "•»Чя-бежш норадреналина на уровень

' циклических нуклеотидов.

[ \ Малые париетальные ганглии.

! ,* \ Каждая точка - среднее в 2 пробах

^а/ Л по 80 ганглиев.

: ___1_________„ь_ Уровень цАМФ (■ А) и цГМФ (о).

^_____——"** Эффекты НА 0,1мМ (■) и сочетания

___ _ . НА 0,1 мМ+ сукцинат 10 мкМ (о ▲ ).

___ МИН| Пунктир - контрольный уровень (в

0 10 20 30 40 ганглиях находящихся такое же

время в физиологическом растворе).

¡ремя, когда уровень цАМФ увеличен (первые 10 мин), коррелирует со нижением ответа на АХ изолированного нейрона в тех же условиях.

9,2

0,1

----

Активность СДГ. Кратковременная обработка (5 мин) ганглиев НА и сукцинатом вызывала неравномерную по объему гигантских нейронов активацию СДГ. Наиболее интенсивную окраску наблюдали по периферии клетки, обращенной к поверхности ганглия. Более длительная (30 мин) обработка ганглиев сукцинатом и НА дала следующие результаты:

- сукцинат (10 мкМ) активирует СДГ в одних нейронах и ингибирует в других. В среднем активность СДГ по сравнению с контролем снижалась, разница с контролем достоверна (Р < 0,02);

- обработка НА и сукцинатом приводит только к активации СДГ в нейронах, разница с контролем достоверна (Р < 0,01), разница с нейронами, обработанными только сукцинатом достоверна (Р < 0,005).

Результаты коррелируют с электрофизиологическими данными по двойственным эффектам сукцината: на одних нейронах он увеличивает ответ на АХ, при этом состояние клетки ухудшается (вероятно этому соответствует снижение активности СДГ и подавление окислительного фосфорилирования), на других снижает ответ (состояние нейрона стабильное, СДГ активирована). На нейронах, обработанных НА и сукцинатом, наблюдали только снижение ответа, можно предположить, что аналоги таких нейронов - клетки, в которых увеличены активность СДГ и продукция АТФ системой окислительного фосфорилирования.

Выводы

1. Впервые показано, что десенситизация анионселективных нХР нейрона моллюска прудовика представляет собой сумму двух компонент. Скорость десенситизации увеличивается при повышении концентрации агониста. Для АХ и полных агонистов постоянные времени компонент десенситизации приближаются к предельным, минимальным значениям в концентрациях вызывающих максимальный ответ. Только быстрая компонента замедляется при понижении температуры.

2. Впервые показано, что частичные агонисты вызывают дальнейшее снижение амплитуды и ускорение спада ответа нейрона после плато в области концентраций, вызывающих максимальный ответ.

3. Выход нХР из десенситизации также соответствует сумме двух компонент, причем кинетика выхода не зависит от концентрации и структуры агониста, вызвавшего десенситизацию. Первая, быстрая, компонента выхода из десенситизации увеличивается по амплитуде при охлаждении, постоянная времени при этом не меняется. Скорость и амплитуда второй компоненты выхода из десенситизации уменьшается при понижении температуры.

4. Показано, что амплитуда ответов клетки на АХ уменьшается при действии веществ, активирующих окислительное фосфорилирование клетки и синтез цАМФ, а также при действии ингибитора натрий-калиевого насоса - оуабаина. Восстановление амплитуды ответов на АХ при всех этих воздействиях неполное.

Таким образом как десенситизация, так и выход из десенситизации анионселективных нХР нейронов моллюска являются сложными двухкомпонентными процессами, обусловленными принципиально разными механизмами. Получены дополнительные данные в пользу того, что функционирование нХР нейрона может регулироваться внутриклеточными процессами, включающими цАМФ-зависимые реакции.

Список основных публикаций по теме диссертации.

Статьи.

1. Акопян А.Р., Чемерис Н.К., Андреев А.А., Вепринцев Б.Н. Постсинаптическая модуляция ацетилхолиновых ответов биогенными аминами. Роль цАМФ. studia biophysica, 1979, v. 77, 3, p. 213-220.

2. Andreev A.A., Vulfius E.A.

Two component of desensitization acetylcholine receptors in mollusc neurones, studia biophysica, 1980, v. 78, 2, c. 87-93.

3. Андреев А.А., Вульфиус E.A., Вепринцев Б.Н.

Два механизма десенситизации холинорецепторов нейрона прудовика. Докл. АН СССР, 1980, т. 253, с. 1490-1492.

4. Андреев А.А., Вульфиус Е.А., Кондрашова М.Н., Вепринцев Б.Н. Регуляция функционирования холинорецепторов нейронов моллюсков сукцинатом и норадреналином. Докл. АН СССР, 1981, т. 258, с. 14661469.

5. Andreev А.А., Veprintsev B.N., Vulfius С.А.

Two-component desensitization of nicotinic receptors induced by acetylcholine agonists in Lymnaea stagnalis neurones. J. Physiol., 1984, v.353, p. 375-391.

6. Тенцова А.И., Брагинцева JI.M., Устынюк Т.К., Осипов Г.А., Белова М.В., Андреев А.А.

Способ получения лецитиновых производных простагландинов. а.с, № 1264426, заявка № 3687399, от 30.12.1983 г.

7. Брагинцева Л.М., Андреева Л.А., Андреев А.А., Устынюк Т.К. Влияние простагландина Е2 и его производных на ответ изолированных нейронов моллюска на ацетилхолин. Фармакол. и токсикол., 1985, т. 48, 5, с. 39-42.

8. Андреев А.А., Вульфиус Е.А., Буданцев А.Ю., Кондрашова М.Н. Снижение ответов нейронов на ацетилхолин при активации окислительного фосфорилирования сукцинатом и норадреналином. Деп. ВИНИТИ, №5346-В86 от 21.07.1986 г.

9. Andreev А.А., Vulfius Е.А., Budantsev A.J., Kondrashova M.N., Grishina E.V.

Depression of neuron responses to acetylcholine by combined application of norepinephrine and substrate of the tricarboxylic acid cycle. Cell. Mol. Neurobiol., 1986, v. 6, n. 4, p. 407-420.

10. Лазарева A.B., Андреев A.A., Брагинцева Л.М., Устынюк Т.К., Андреева Л.А.

Исследование влияния препаратов простагландинов на уровень цАМФ в тканях мыши. Фармация, 1989, т. 38, 3, с. 42-46.

11. Pakhotin P.I., Pakhotina I.D., Andreev А.А.

Functional stability of hippocampal slices after treatment with cyclooxygenase inhibitors. Neuroreport, 1997, v. 8, p. 1755 - 1759.

Тезисы докладов.

1. Андреев А.А., Вульфиус E.A. Десенситизация и выход холинорецепторов из состояния десенситизации идет двумя путями. Сб. Физиология и биохимия медиаторных процессов. М., 1980, с. 11.

. Андреев A.A., Вульфиус ЕА., Ильин В.И.

Влияние оуабаина и понижения температуры на функционирование холинорецепторов нейрона прудовика. Там же, с. 12.

. Курчиков А.Л., Андреев A.A., Казаченко В.Н.

Сверхмедленные релаксации тока холинорецептивной мембраны нейронов прудовика. Сб. "Физиология и биохимия медиаторных процессов". М., 1980, с. 115.

. Курчиков A.JI., Андреев A.A., Казаченко В.Н.

Сверхмедленные релаксации тока холинорецептивной мембраны нейронов прудовика. Там же, с. 115.

. Андреев A.A., Вульфиус Е.А., Буданцев А,Ю., Кондрашова М.Н. Норадреналин и сукцинат меняют уровень циклонуклеотидов, активность сукцинатдегидрогеназы и ответ холинорецепторов нейрона моллюска. Там же, с. 135-136.

. Андреев A.A., Курчиков А.Л., Казаченко В.Н., Вульфиус Е.А. Блокирование ионных каналов холинорецептивной мембраны молекулами холиномиметиков. Тезисы III советско - шведского симпозиума по физико -химической биологии: Тбилиси 1981, с. 160-161. ,

. Андреев A.A., Вульфиус Е.А., Гришина Е.В., Тшценков В.Г. Влияние норадреналина и сукцината на чувствительность к ацетилхолину и уровень циклических нуклеотидов в нейронах моллюска. I Всесоюзный биофизический съезд. М., "Наука", 1982, т. 2, с. 103.

, Андреев A.A., Курчиков А.Л., Вульфиус Е.А., Казаченко В.Н. Взаимодействие молекул агонистов с ионными каналами, управляемыми холинорецепторами. Там же, с. 103.

Лазарева A.B., Брагинцева Л.М., Устынюк Т.К., Андреев A.A. Влияние производных Iii Ь2 на холинорецепторы нейрона и уровень цАМФ в мозге моллюска и тканях мыши. Сб. "Синтетические и прикладные исследования простагландинов", Уфа, 1984, с. 85-86.

). Андреев A.A., Белова М.В. Снижение ответа нейронов на ацетилхолин при действии производных простагланлдина Е2. Сб. "Молодые ученые-фармацевтической науке и практике", Деп. ВНИИМИ, 1985, Д-8747, с. 57-58.

I. Андреев A.A., Брагинцева Л.М., Лазарева A.B., Андреева Л.А. Уровень цАМФ в тканях мыши при действии препаратов простагландинов. Сб. "Циклические нуклеотиды и система регуляции ферментативных процессов", Рязань, 1985, с. 31.

!. Пахотин П.И., Пахотина И.Д., Андреев A.A., Павлик Л.Л. Увеличение структурно - функциональной стабильности срезов гиппокампа после краткой предобработки ингибиторами циклооксигеназ. "Колосовские чтения - 97", Ст.-Петербург, 1997, с. 70.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Андреев, Алексей Алексеевич, Пущино



л

7 О

ч/

российская академия наук

институт биофизики клетки

На правах рукописи

Андреев Алексей Алексеевич

ДВЕ КОМПОНЕНТЫ ДЕСЕНСИТИЗАЦИИ НИКОТИНОВЫХ ХОЛИНОРЕЦЕПТОРОВ НЕЙРОНОВ МОЛЛЮСКА

03. 00. 02 - биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор | Вепринцев Б.Н.

кандидат биологических наук, Вульфиус е.а.

Пущино 1998 г.

Сокращения принятые в диссертации

АХ - ацетилхолин

Ер - потенциал реверсии тока через мембрану нейрона нХР - никотиновые холинорецепторы ПГЕ2 - простагландин Е2

насыщающие концентрации - концентрации, вызывающие максимальный

для данного агониста ответ нейрона СДГ - сукцинатдегидрогеназа сукцинат - янтарная кислота изоцитрат - изолимонная кислота цАМФ - циклический аденозинмонофосфат цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат Тдс1'11- постоянные времени компонент десенситизации нХР Тц1'11 - постоянные времени компонент выхода нХР из десенситизации 10 - амплитуда тока на пике ответа нейрона на АХ и его аналоги ¡o/lo ах - отношение амплитуды ответа нейрона на агонист к амплитуде ответа на АХ

I1, I11- амплитуда соответствующей компоненты десенситизации или

выхода из десенситизации нХР нейрона 1СТ - стационарный уровень ответа нейрона на АХ или его агонисты

loo - стационарный уровень ответа нейрона на микроаппликацию АХ,

установившийся после полного выхода нХР из десенситизации Qio - температурный коэффициент, изменение скорости реакции при

изменении температуры на 10°С А - агонист (АХ или его аналоги) Р - рецептор (нХР) АР - комплекс агонист-рецептор

Содержание

Введение.

Глава 1. Обзор литературы. Десенситизация никотиновых

холинорецепторов 1.1. Общие представления о холинорецепторе. 1. 2. Ионный канал холинорецептора

10

13

1. 2.1. Свойства ионного канала

1. 2.2. Влияние заряженных ионов и молекул наружного раствора на функционирование канала

1. 3. Десенситизация и выход из десенситизации

1. 3.1. Десенситизация - общее свойство нХР. 1. 3.2. Зависимость от структуры агониста. 1. 3.3. Зависимость от концентрации агониста.

1. 3.4. Конформационные изменения нХР в процессе функционирования.

1. 3.5. Влияние ионного состава, окружающего клетку раствора, и мембранного потенциала на десенситизацию нХР.

1. 3.6. Влияние температуры.

1. 3.7. Эффекты веществ, непосредственно не взаимодействующих с

активным центром холинорецептора.

1.3.8. Кинетика десенситизации нХР и схемы возможного механизма функционирования.

1.3.10. Регулирование свойств нХР внутриклеточными процессами. 1.4. Заключение и постановка задачи. 30

Глава 2. Методика.

2. 1. Изолированные нейроны прудовика: Выделение. Методы

перфузии и аппликации веществ. Аппаратура. 32

2. 2. Исследование десенситизации и выхода

из десенситизации. 36

2. 3. Определение концентрации циклических нуклеотидов. 38

2. 4. Определение активности сукцинатдегидрогеназы. 39

2. 5. Биосинтез и выделение производных простагландина Е2. 41

2. 6. Использованные вещества. 42

холинорецепторов

16

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Глава 3. Кинетика десенситизации и восстановления

3. 1. Десенситизация нХР. 43

3. 1.1. Форма ответов нейрона на ацетилхолин.

3. 1.2. Зависимость кинетики десенситизации от концентрации агониста. 3. 1.3. Ответ на ацетилхолин при разных уровнях мембранного потенциала. 3. 1.4. Влияние температуры. 3. 1.5. Десенситизация при действии агонистов.

3. 2. Выход холинорецепторов из десенситизации. 60

3. 2.1. Кинетика восстановления активируемого состояния холинорецептора. 3. 2.2. Влияние температуры.

3. 3. Обсуждение. 64

3. 3.1. Кинетика десенситизации и выхода из десенситизации. 3. 3.2. Свойства двух компонент десенситизации и восстановления. 3. 3.3. Расчеты на основе полученных результатов.

Глава 4. Влияние факторов способных изменить энергетический метаболизм нейронов на функционирование холинорецепторов

4. 1. Влияние воздействий на метаболизм клетки на

функционирование нХР. 78

4. 1.1. Действие оуабаина.

4. 1.2. Влияние сукцината и изоцитрата на функционирование нХР. 4. 1.3. Действие сукцината и изоцитрата на фоне норадреналина. 4. 1.4. Влияние простагландина Е2 и его производных.

4. 2. Уровень циклических нуклеотидов в ганглях прудовика после обработки норадреналином и сукцинатом. 88

4. 3. Активность сукцинатдегидрогеназы в нейронах после

обработки янтарной кислотой и норадреналином. 94

4. 4. Обсуждение. 95

Возможные причины снижения ответов на ацетилхолин.

4. 4.1. Неспецифическое взаимодействие. 4. 4.2. Влияние ионов Са .

4. 4.3. Модификация нХР внутриклеточными системами.

4. 4.4. Возможные пути регуляции свойств нХР нейрона прудовика на стадиях десенситизации и выхода из десенситизации.

Выводы 106

Литература 108

Введение

Никотиновые холинорецепторы (нХР) - мембранные мембранные белки из группы рецепторов имеющих в своей структуре ионные каналы. К этой группе относятся также нейрональные рецепторы у-аминомасляной кислоты, глицина, глютамата и серотонина в мозге млекопитающих, анионселективные глютаматные рецепторы беспозвоночных (КагНп, АкаЬаБ, 1995). Субъединицы этих рецепторов имеют сходную последовательность сегментов расположенных в мембране.

Основная функция нХР - участие в синаптической передаче (увеличение ионной проницаемости клеточной мембраны в ответ на химический стимул - наличие в окружающей клетку среде молекул ацетилхолина). Связывание молекул АХ с узнающим участком нХР вызывает открывание ионного канала и как следствие - увеличение проводимости мембраны для ионов. Какие ионы будут проходить через мембрану, зависит от свойств управляемых нХР ионных каналов.

При продолжительном или частом ритмическом действии АХ проявляется специфическое свойство нХР - снижение проводимости мембраны несмотря на присутствие медиатора - десенситизация, впервые показанная на нХР концевой пластинки мышцы лягушки (КаХг, ТЪеБ^^ 1957). Изучение механизмов десенситизации позволяет отыскивать подходы к пониманию принципов функционирования и регуляции нХР и некоторых других рецепторных белков. На десенситизацию нХР могут оказывать влияние концентрации ионов Са2+ и снаружи клетки,

температура окружающей среды и мембранный потенциал. Возможно также влияние на десенситизацию нХР мембранных и цитоплазматических систем ферментов. Однако, значение тех или иных процессов в снижении чувствительности живой клетки к АХ до конца не выяснено. В основном исследованы катионселективные нХР мышц позвоночных и электрических органов рыб, в меньшей степени катионселективные и анионселективные

нХР нейронов. Функционирование нХР все еще нуждается во всесторонних исследованиях для более полного понимания механизмов, лежащих в основе работы медиаторных систем и способах регуляции этих процессов, что позволит эффективно воздействовать на медиаторные системы живых организмов.

До сих пор остаются неясными вопросы:

- какую роль играет десенситизация в синаптической передаче;

- десенситизация - конформационный переход нХР в неактивное состояние в результате связывания медиатора, определенного времени нахождения канала в открытом состоянии или сложный процесс отражающий несколько биохимических реакций или стадий;

- являются ли взаимосвязанными явлениями процесс открывания ионного канала и десенситизация нХР;

- чем определяется выход нХР из десенситизации;

- какие из возможных механизмов (изменение конформации рецептора, изменения ионного состава раствора около мембраны, регуляция функционального состояния нХР ферментными системами клетки) играют основную роль в снижении ответа;

- насколько функционирование нХР зависит от внешних условий (температуры, мембранного потенциала, состояния энергетического обмена клетки, веществ - регуляторов).

>

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

Изучить кинетику десенситизации и восстановления активности нХР в зависимости от концентрации агониста, структуры вещества вызвавшего активацию нХР, температуры, мембранного потенциала.

Определить, какой эффект на величину ответа на АХ, кинетику десенситизации и выход из десенситизации нХР оказывают вещества,

способные повлиять на энергетический метаболизм клетки и/или аденилатциклазную систему.

В работе получены следующие результаты:

- процесс десенситизации анионселективных нХР нейронов моллюска представляет собой сумму двух компонент. Только первая быстрая компонента десенситизации в значительной степени замедляется при понижении температуры;

- скорость десенситизации увеличивается при повышении концентрации АХ и полных агонистов. В насыщающих (вызывающих максимальный ответ) концентрациях АХ и полных агонистов постоянные времени обеих компонент десенситизации достигают минимальных значений;

- в концентрациях выше насыщающих частичные агонисты вызывают падение амплитуды ответа и дальнейшее ускорение спада ответа нейрона, после небольшого плато в области насыщающих концентраций;

- выход нХР из десенситизации также состоит из двух компонент, кинетика выхода не зависит от концентрации и структуры агониста, вызвавшего десенситизацию. Только вторая, медленная, компонента выхода нХР из десенситизации имеет высокую температурную зависимость;

воздействия, вызывающие увеличение уровня циклического адонозинмонофосфата (цАМФ) и активацию системы окислительного фосфорилирования уменьшают ответ нейрона на АХ и замедляют выход нХР из десенситизации.

Практическое значение:

- впервые показан сложный, двухкомпонентный характер процесса десенситизации анионселективных нХР нейронов моллюска прудовика;

- обнаружен новый механизм действия частичных агонистов - в высоких концентрациях они могут блокировать ответ клетки и ускорять десенситизацию нХР;

- показана возможность регуляции чувствительности нейрона к АХ как внешними факторами (температура, наличие в окружающей среде субстратов окислительного фосфорилирования, гормонов и медиаторов), так и внутриклеточными ферментными системами (аденилатциклазной и/или окислительного фосфорилирования);

- анионселективные нХР нейронов мозга моллюсков - аналоги рецепторов у - аминомасляной кислоты и глицина в мозге позвоночных, свойство нейронов мозга прудовика менять свою чувствительность к АХ в зависимости от внутриклеточных систем регуляции позволили использовать данную модель для поиска и определения эффективно действующих концентраций биологически - активных производных простагландинов для медицинской практики.

Глава 1. Обзор литературы. Десенситизация никотиновых холинорецепторов.

1.1. Общие представления об нХР.

Накопленные к 1970 г. сведения о основных свойствах нХР обобщены в книге Михельсона и Зеймаль (Михельсон, Зеймаль, 1970). Однако с тех пор получено много сведений, особенно о структуре и функционировании холинорецептивной молекулы. Особенно хорошо изучено строение нХР электрических органов рыб и мышц млекопитающих.

Электронномикроскопические исследования (Ross et al., 1977, Cartaud et al., 1978, Hauser, Salpeter, 1979, Wise et al., 1981) и данные, полученные методами дифракции рентгеновских лучей (Ross et al., 1977, Brisson, Unwin, 1984) и нейтронного сканирования (Wise et al., 1981) позволили вычислить размеры и форму молекулы нХР, которая представляет собой цилиндр с расширенными концами диаметром 9 нм снаружи и 6 нм с внутренней стороны мембраны, в центре проходит ионный канал. Устье канала широкое с наружной стороны мембраны и наиболее узкое в области липидного слоя. Исследования замороженных нХР обнаружили изменения конформации молекулы в присутствии АХ (Unwin, 1993, 1995).

Работы на солюбилизированных нХР и мембранных фрагментах из электрических органов угря Electrophorus electricus и скатов родов Torpedo и Narcina, позволили выяснить состав и свойства нХР и отдельных его субъединиц. По современным представлениям нХР - гликопротеиновый комплекс, молекулярного веса около 250.000 - 270.000 дальтон (Karlin, 1980, Raftery et al., 1980 Stroud, 1984, Karlin, Akabas, 1995, Rickert, Imperiali, 1995), белковая часть которого состоит из 5 субъединиц 4 типов: а, ß, у, 8. В нейронах а и ß субъединицы различаются по своему составу и свойствам и обозначаются как а2 - а9 и ß2 - ß4 субъединицы (McGehee, Role, 1995). Молекулярный вес субъединиц, вычисленный разными авторами, близок к 40, 50, 60, 65 тысячам дальтон для а, ß, у, 5 -субъединиц соответственно (Weill et al., 1974, Froehner et al., 1979, Raftery

et al., 1980). Все 5 субъединиц связаны между собой нековалентно, и поэтому могут диссоциировать под влиянием детергентов. В составе нХР показано присутствие углеводов (Raftery et al., 1980, Stroud, 1984, Rickert, Imperiali, 1995), также для функционирования нХР необходимо наличие липидов и холестерина (Heidemann et al., 1980, Criado et al., 1982, Ochoa et al., 1983, Jones et al., 1988). В клетке нХР могут фосфорилироваться, ацилироваться, гликозилироваться внутриклеточными ферментными системами (Teichberg, Changeux, 1976, Gordon et al., 1977, Teichberg et al., 1977, Gordon, Diamond, 1980, Kloog et al., 1980, Davis et al., 1982, Zavoico et al., 1984, Huganir et al., 1986, Merlie, Smith, 1986, Rickert, Imperiali, 1995). Наиболее изучен процесс фосфорилирования нХР и отдельных его субъединиц:

- а, у и Ô - субъединицы могут фосфорилироваться эндогенной мембранной цАМФ - зависимой протеинкиназой (Teichberg, Changeux, 1976, Gordon et al., 1977, 1980, Teichberg et al., 1977, Schibler et al., 1980, Saitoh, Changeux, 1981, Zavoico et al., 1984, Huganir et al., 1984, Merlie, Smith, 1986, Miles et al., 1987, Smith et al., 1987, Moss et al., 1996);

- P и ô - субъединицы может фосфорилировать кальций - зависимая протеинкиназа С (Smith et al., 1987),

- р, у и 5 - субъединицы может фосфорилировать эндогенная тирозинкиназа (Huganir et al., 1984, Miles et al., 1987);

- специфическая фосфопротеинфосфатаза дефосфорилирует нХР (Gordon etal., 1980).

Мономеры нХР при действии некоторых окислителей могут образовывать димеры и олигомеры путем формирования дисульфидных связей не только между ô но и у-субъединицами (Hamilton et al., 1977). В мембране электрического органа ската нХР сгруппированы в димеры с расстоянием между центрами димеров около 10 нм (Wise et al., 1981), сульфгидрильные группы 5-субъединиц участвуют в образовании дисульфидного мостика в димере нХР (Hamilton et al., 1977, Witzemann,

Raftery, 1978). Показано, что одно агоистсвязывающее место в нХР сформировано участками а и 5 субъединиц, второе а и у субъединиц (Karlin, Akabas, 1995). Есть данные, что 5-субъединица может служить также местом связывания местных анестетиков (Taylor et al., 1983, Karlin, 1980), и неконкурентных антагонистов (Francis, Papke, 1996), у-субъединица регулирует свойства ионного канала (Blatt et al., 1984, Francis et al., 1996). Удалось показать, что для формирования в мембране полноценных нХР необходимы все 4 типа субъединиц (Devillier-Thiery et al., 1983, Nöda et al., 1983, Guy, 1984, Mishina et al., 1985, Takahashi et al., 1985). Субъединицы нХР разных животных могут образовывать функционирующие химерные рецепторы при встраивании в мембрану (Takai et al., 1985, Yoshii et al., 1987). В структуре всех четырех субъединиц нХР много общего, имеются сходные аминокислотные последовательности и участки (Devillier-Thiery et al., 1983, Nöda et al., 1983, Karlin, Akabas, 1995). Субъединицы нХР и рецепторов у-аминомасляной кислоты, глицина и серотонина имеют сходную последовательность гидрофобных и мембранных фрагментов и гомологичных участков, вероятно эти рецепторы функционируют одинаковым образом (Karlin, Akabas, 1995): Методами генной инженерии удалось получить и клонировать ДНК, матричную и информационную РНК, кодирующую субъединицы ХР. Инъекция информационной РНК, кодирующей нХР ската, в ооциты лягушки, не содержащие эндогенных нХР вызывала появление в мембране ооцита полноценных нХР (Devillier-Thiery et al., 1983, Nöda et al., 1983). Ha основании результатов по определению аминокислотной последовательности нХР и направленного мутагенеза были представлены структурные модели нХР и агонистсвязывающего места (Guy, 1984,

» j" :___ -j. _i 1г\ол 1 лог ___1.; _1 1 nof 1 лог <____ тт__1__

ivnsiiiiia ei т., laKanasin ei tu., i^oj, vvmie iyoj, vjruy, nuno,

1987, Karlin, Akabas, 1995).

1. 2. Ионный канал холинорецептора. 1. 2.1. Свойства ионного канала.

Результаты рентгеноструктурных и электронномикроскопических исследований позволили представить строение ионного канала нХР: было показано, что канал - несимметричная водная пора, с наружной стороны мембраны имеется широкое, около 2,5 нм диаметром устье, глубина этой области примерно 5 нм, наиболее узкое место, диаметром 0,2 - 0,3 нм, расположено ближе к внутренней стороне мембраны (Horn, Stevens, 1980, Karlin, 1980, McNamee, Ochoa, 1982, Brisson, 1986, Karlin, Akabas, 1995, Unwin, 1993, 1995). В формировании ионного канала, вероятно, участвуют все субъединицы нХР (Devillier-Thiery et al., 1983, Nöda et al., 1983, Guy, 1984, Guy, Huho, 1987, Brisson, 1986, Mishina et al., 1985). Наиболее изучены свойства катионселективных каналов нХР мышц позвоночных. Обычно они имеют малую избирательность по отношению к проникающим ионам и высокую проводимость, по сравнению с высокоселективными электровозбудимыми каналами на тех же клетках (Dwayer et al., 1979, 1980, Edwards, 1982). Регистрация токов одиночных каналов нХР выявила возможность одновременного существования на мембране двух состояний, различающихся по проводимости почти в 2 раза, (Hamill, Sackmann, 1981, Деркач и др., 1985).

Хлорные каналы нХР моллюсков, имеют более высокую селективность и низкую проводимость по сравнению с каналами нХР позвоночных. Потенциал реверсии