Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ДНК-маркеры хромосомы 13 человека: локализация, полиморфизм и использование для картирования

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "ДНК-маркеры хромосомы 13 человека: локализация, полиморфизм и использование для картирования"

РГ6 од

- 8 ОКТ 1996

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ им. Н. И. ВАВИЛОВА

ДНК-МАРКЕРЫ ХРОМОСОМЫ 13 ЧЕЛОВЕКА:

ЛОКАЛИЗАЦИЯ, ПОЛИМОРФИЗМ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ КАРТИРОВАНИЯ

Специальность - 03.С0.15 Генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биолог ических наук

На пранах рукописи УДК 575.1:509.9

А 11 Т ОВД

Москва 1996

Работа выполнена в лаборатории сравнительной генетики животных Института Общей Генетики им. Н.И.Вавилова РАН (зав. лабораторией д.б.н., проф. И.А.Захаров).

Научный руководитель кандидат биологических наук Г. Е. Сулимова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В. В. Носиков кандидат биологических наук Д. В. Муха

Ведущее учереждение - Кафедра генетики Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова

Защита состоится 1996 г. в_часов на засседании

диссертационного совета ( Д ¿02.49.01) при Институте Общей Генетики им. Н.И.Вавилова РАН по адресу: Москва, ул. Губкина,3

С диссертацией можно ознакомиться в бибилиотеке ИОГен РАН

Автореферат разослан 1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Г.Н.Полухина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Появление современных методов физического

картирования генома человека, позволяющих локализовьшать и выделять искомые гены, не только расширяет возможности фундаментальных исследовании, связанных с изучением структуры, функции и регуляции экспрессии этих генов, но, не в меньшей степени, играет существенную роль в разработке новых средств диагносшки заболеваний, связанных с изменениями генома человека, и создания исходного материала для коррекции таких заболеваний (гемотерапия), в тех случаях, где .но noipcoycica.

Общепринятым подходом к построению физической карты генома и его отдельных областей является создание контигов - наборов клонированных фрагментов ДНК, перекрывающих в известном порядке участки генома. Построение контигов начинают обычно с анализа крупных фрагментов ДНК, клонированных в составе искусственных хромосом дрожжей ( так называемые YAC-клоны). Этот метод облегчает задачу выделения генов, несущих мутации, приводящие к различным заболеваниям человека. На основе YAC-клонотек составлена физическая карта первого поколения генома человека, однако эта карта содержит пока большое количество брешей.

Ключевую роль при построении физической карты генома человека играют STS-маркеры (от scquensed tagged site) - относительно короткие последовательности ДНК с известной локализацией, представленные в геноме в виде уникальных копий. Такие маркеры создаются в настоящее время, как правило, на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) и служат ориентирами при анализе огромного числа хосмидных- и YAC-клонов. Более того, полиморфные STS-маркеры могут быть использованы для решения гюпу-ляционных задач, а также для создания на их основе диагностических средств к наследственным заболеваниям человека.

К участкам генома, представляющим наибольший интерес для физического картирования, на 13-й хромосоме человека можно отнести область 13q 14.3, расположенную в конце первой трети длинного плеча хромосомы и область 13q34. В первой из них локализован целый ряд генов, дефекты в которых приводят к наследственным заболеваниям человека ( ген рети-нобластомы - RBI (I3ql4.2) и ген болезни Вильсона-Коновалова - WD (13ql4.3-13q21). Недавно было показано, что область, расположенная между

локусами этих двух генов, подвержена множественным делециям и транслокациям, происхождение которых связывают с еще одним геном супрессии опухолевого роста. Потеря этого гена сопряжена с болезнью В-клеточной хронической лимфоцитарной лейкемии (B-CLL), являющейся одним из наиболее часто встречающихся заболеваний крови. Необходимость "насыщения" данной области хромосомы 13 человека STS-маркерами очевидна для создания физической карты, которая составит материальную основу тонкой локализации и выделения искомого супрессорного гена.

Другая, не менее важная область хромосомы 13 - область 13q34 - характеризуется тем, что в ней расположен целый ряд генов, выполняющих важную функцию в организме человека: среди них гены факторов VII и X свертываемости крови, гены коллагенов 4А1 и 4А2. Активированный фактор VII является витамин К-зависимой плазматической сериновой протеазой ( проконвертин), которая участвует в каскаде реакций, приводящих к свертыванию крови. Известно, что дефекты в структуре гена могут приводить к серьезным нарушениям процессов свертывания крови, а именно различным наследственным типам гемофилии. Кроме того, показана связь этого гена с развитием ишемической болезни сердца. Выявление и анализ полиморфизма гена фактора VII свертываемости крови позволит проводить медико-генетические исследования в различных популяциях человека и использовать созданные зонды для диагностики наследственных заболеваний человека, связанных с нарушением структуры данного гена.

В свете вышеизложенного, поиск и разработка молекулярно-генетических маркеров к данным областям хромосомы 13 человека, представляются весьма актуальными и перспективными в теоретическом и практическом плане. Все это определило цель и задачи настоящего исследования.

Цель и задачи работы. Целью работы было методом ПЦР получить ДНК-маркеры для хромосомы 13 человека, пригодные как для скрининга YAC и космидных библиотек, так и для проведения понуляционных и медико-генетических исследований.

Были поставлены следующие задачи:

1. На основе нуклеотидных последовательностей из области 13q 14.3 методом ПЦР получить STS-маркеры, пригодные для построения физической карты данной области.

2. Провести ПЦР-анализ УАС-клонотек для выявления клонов, несущих вставки хромосомы 13 человека из области 1 Зя ] 4, с использованием полученных и уже известных вТБ-маркеров.

3. Построение контига фрагментов геномной ДНК на основе мега- н миди-У АС-клонов, перекрывающих район 13ц 14.3.

4. Получение полиморфных ЗТБ-маркеров на основе минисателлитных повторов гена фактора VII свертываемости крови и изучение полиморфизма по этим маркерам в различных популяциях человека.

Научная новизна п практическая значимость работы. В настоящем исследовании методом ПЦР созданы п охарактеризованы 2 ноша. БТЕ-марксри-а а области Щ14.3 хромосомы 13 человека. При использовании вновь созданных и ранее описанных 8Т8-маркеров проведен анализ двух геномных УАС-клонотек, выявлен порядок мега- и минн-УАС-клонов, перекрывающих область 13ч 14.3, часто утрачиваемую при В-С1Х и определен размер минимальной области делеций при В-СЬЬ (680 тыс. п. н.). Полученные БТБ-маркеры используются для создания физической карты области 13ц 14.3 хромосомы 13 человека такого вида ( на основе космид и кДНК), который обеспечивает доступность каждого участка ДНК для исчерпывающего структурного анализа, что важно как для фундаментальных исследований генома человека, так и для создания средств диагностики хронической лимфоцитарной лейкемии.

При Г1ЦР-Г1ДРФ-анализе локуса 013825 на образцах ДНК из московской и талышской популяций человека обнаружено несколько мелких делеций в области пробы рН2-42 ( которая служила источником БТЯ-маркеров для данного локуса) но сравнению с соответствующими последовательностями геномных ДНК, что позволило уточнить первичную структуру данной области генома человека.

Впервые изучен полиморфизм гипервариабельной области гена факто--кгн

ра VII свертываем крови в образцах ДНК московской, талышской популяций человека и у представителей семей, полученных из Центра по исследованию полиморфизма человека (СЕРН, Франция). Описана вариабельность структуры данного гена как внутри отдельных популяций, так и на межпопу-ляционном уровне.

Полиморфные ДНК-маркеры гена фактора VII свертываемости крови могут быть рекомендованы для проведения популяционных и медико-генетических исследований человека.

Структура н объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы; экспериментальной части, включающей описание материалов и методов, изложение и обсуждение экспериментальных результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит Sí7 стр. машинописного текста, включает/^рисунков, ^таблиц.

Апробация работы. Материалы исследований докладывались на межлабораторном семинаре "Генетика животных " ИОГен им. Н.И.Вавилова РАН, на Пятой конференции " Геном человека - 96" ( г. Черноголовка, 1996) и на 2-м Международном совещании по картированию хромосомы 13 (

Терри-таун, США, октябрь 1995).

**********

Работа выполнена в рамках ГНТП РФ "Геном человека", проект "Картирование хромосомы 13 человека".

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали YAC-библиотеку генома человека, сконструированную в Фонде исследований рака (ICRF), Великобритания (средний размер вставок 620 т.п.н. ( Larin et al, 1991)), а также библиотеку миди- и Mera-YAC-клонов ( Albertsen et al., 1990, Chumakov et al., 1992) полученные в Центре по исследованию полиморфизма человека (СЕРН), Франция. Средний размер вставок в библиотеке миди- и мега-YАС-клонов соответственно около 350 т.п.н. и 1000 т.п.н., частота химеризма 30-40% в зависимости от региона, число клонов 52,922 и 23,808, соответственно.

Подвыборка клонов СЕРН библиотек, специфичная для хромосомы 13, была любезно предоставлена д-ром Руссо (Columbia Univ., N.Y., U.S.A). Клоны СЕРН 356Е10 и 65В10 выявлены ранее по маркеру D13S25 и предоставлены д-ром К. Петрухиным (Columbia Univ., N.Y., U.S.A).

Исследования полиморфизма локуса D13S25 и гена фактора VII свертываемости крови проводились на двух популяциях человека - московской и талышской. Выборка из Московской популяции представляет собой гетерогенную группу, без определенной возрастной структуры. Популяция та-лышей представлена жителями с. Пирасора, расположенного в Талышских

Рисунок 1. Схема стратегии двухступенчатого скрининга YAC -клонотеки генома человека. .-••

16-5 "суисрпула" - смесь 96 инднвидульных YAC-клонов,полученных с одной чашки

оооооооооооо оооооооооооо оооооооооооо оооооооооооо оооооооооооо оооооооооооо оооооооооооо оооооооооооо

оооооооооооо оооооооооооо оооооооооооо оооооооооооо оооооооооооо оооооооооооо оооооооооооо оооооооооооо

оооооооооооо оооооооооооо оооооооооооо оооооооооооо оооооооооооо оооооооооооо оооооооооооо оооооооооооо

оооооооооооо оооооооооооо оооооооооооо оооооооооооо оооооооооооо оооооооооооо оооооооооооо оооооооооооо

ПЦР-анализ каждого ¡п 4-х субпулов

.¿г""'"'

оооооооооооо оооооооооооо оооооооооооо оооооооооооо оооооооооооо оооооооооооо оооооооооооо оооооооооооо

OOOOOOOOOO0O

оооооооооооо

■оооооо&ооофо- ■

оооооооооооо

ОООООООООО0О

оооооооооооо

оооооооооооо

оооооооооооо

Вторая ступень скрининга ПЦР-аналт смеси ДНК из рядов и колонок YAC-клонов,

выратетплх па одной плашке

Положительный индивидуальным YAC-клон

Таблица I. STS-маркеры и соответсвтвукицие им олигоиуклеотидные праймеры, используемые в работе.

МАРКЕР ЛОКУС ПРАЙМЕРЫ ПРОДУКТА РЕАКЦИИ ИМЯ: НУКЛЕОТВДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ( 5"-3") ССЫЛКА

Н2-42 D13S25 1Н2-42: CACCATCCAATCCATTTCAGG 2Н2-42: CCCATGTCCAGCATACACACC Сулвмова в др., 1993

то же то же 3H2-2:TGTGGACCTGGAGCCnrTGTG 4Н2-42: TGGGGACCTCTGCnTATCGC Бродянский и др., 1995

тоже то же 1Н2-42: CACCATCCAATCCATTTCAGG 4Н2-42: TGGGGACCTCTGCnTATCGC Сулнмова н др., 1993

то же то же 5H2-42:TGGTCAAAGTCCGTATGTAGCC 242-42: CCCATGTCCAGCATACACACC Сулимова и др., 1993

тоже то же 5H2-42: TGGTCAAAGTCCGTATGTAGCC 4H2-42: TGGGGACCTCTGCnTATCGC Бродяпсгав! н др., 1995

то же то же 8H2-42: AACTCTATGCCTCrCACTCT 9H2-42: GTAGTGGTGTGTAGTCTGGA собственные данные

RBKpt A: CCACAAACCAATATCTCTC B: GTGGATGTATTGTCAAATG Lalande, персоиальное сообщение

MGG14 013S201 X: ATTCCATCCTGGTCCGATCT Z:CCTCCTTCTGGTGACCTTG Кооу, 1994

MGG15 D13S319 X.-CGAGCTGGAGTCCATCGTAT Y: CGTCGCTGCAGATCAAAGGA Кооу, 1994

AFM203xal D13S165 ca: GTTTCGCCAAGCCTGTT gt:GTrGACAATAAAATACGCCACA Gyapay, 1994

AFM058xd6 D13S1S3 ta: AGCATTGTrTCATGTTGGTG Et:CAGCAGTGAAGGTCTAAGCC Gyapay, 1994

AFM126za5 D13S273 ca: CTGNGGCAAAAACAACTCTT gt: ATCTGTATGTCCrCCITTCA ATG Gyapay, 1994

AFM120xa3 D13S272 ca: ATACAGACTTCCCAGTGGCT gt: AGCTATTAAAGTTCCCTGGATAAAT Gyapay, 1994

AFM303zg5 D13S284 ca: AAAATCAGGTGGAAACAGAAT gt: AAAGGCTAACATCGAAGGGA Gyapay, 1994

AFM301WB5 ATCAACATCACCTGTATTCAGCC CTGAGTGACTGCTACCGAGGC компьютерная баш-данпых СЕРН

745E3L D13S817 1: GGAAGGGACATTGACCTAGACA r: GGGCACCACCATATCTGCTAG Бродвпскин и

WI-6333 D13S1150 CTCTTGAGGGAAAAAAAAAATCA CCAGGCAACCAACCAGTC база данных Whitehead institut

WI-9598 D13S1168 AACCTCATTTAAATGTAAAGCATCA GTAATGTCATTGCTTTTGATTTGC база даппых Whitehead institut

GCT16C0S AAGGAATCAGAGAAATGGGG GCTGAGTCAGAGGGATTTGA база да!шы\ Whitehead institut

WI-5710 D13S912 ATATGTAGACATCCATGAGTTCGTG CAAACAAACAAAAAACTTCCCC база данных Whitehead institut

EST13G1 CTCAGAGCAGTAATCTTCC TGAAGATAATCCCTACCCC Bays, персона жнальнт сообщсш1с

EST13G2 D13S1150 AGTAAGGCAGTGAGCTAGG GGCATAAACATCTGCCTGC сообщение

EST13G3 D13S1168 TCAAGTGTTCCTACATGCCG AGGCATCCCTTTCCTGAGC Bays, персональпальвос сообщение

7KASH4U CGCCAATGTGGCACCCACAAA AGTGAAGGGTGGGACACTGACC собственные дапные

Таблт» 2. Условия проведения ПЦР дли использованных в работе олшонуклеотндных праймеров.

МАРКЕР пряймеры Условия ПЦР Размер продукта

темгература время ...... ("•"•)

" ммГ"" 1НЙ2 »2 " 1.......

2112-42 54 1.Л 252

72 1.5

то же 3112-12 92 1

4112-12 56 1.5 346

72 и

Тй жt 1112-42: »2 1

4112-12: 54 15 6.11

72 2

10 ж« '112-42: 92 1

5112-42: 54 1.5 «30

72 2

I» жу ......511? ¡2: 92 1

4112-42 : 54 1.5 1009

72 1

1*же 8112-42 92 1

»112-42 53 1.5 171

п 1.2

ИКг! А 94 ».5 234

Б 55 0.5

72 1.0

"" МСС14 X 95 ».5 1Я7-205 *

£ 55 0.5

72 1.0

МКГ.15 X 95 1.о .......... 168-202 » '

У 57 1.0

72 1.«

АКМ ея 95 05 131-143 *

120иЗ Е< 55

72 1.0

АИИ са 95 0.5 212-234 »

058*<И 55 0.5

__72_ _ 1.0

АГМ ся л5 0.5 Ш-Т«5 •

203\а1 К' 55 0.5

72 1.0

АКМ еа 95 0.5 2.15-259 »

12б7а5 »{ 54 0.5

72 1.0

АГМ са 95 0.5 197-227 »

3»3ц.5 55 0.5

72 1.0

АГМ (Л 95 0.8 213

301\\Н5 VI 58.5 0.«

72 1.0

7451.31, 1.: 95 0.8 144

К: 55 0.6

72 0.8

\VI-959S 93 0.« 17»

К: 59 оя

72 1.0

\\ 1-6131 I.: 91 08 131

К: 59 0.8

72 1.0

«13710 " Ь: 93 0.8 17»

Я: 59 ОД

72 1.0

ССМ6Ю5 и 93 0.8 180

Я: 59 0.8

72 1.0

1.1Г.1: 1.: 9.1 0.8 256

К: 56 0.«

72 1.0

!.: 91 0» 241

11: 56 0.8

72 1.0

1зсз Ь: 9.1...... 0.8 268

Я: 56 0.8

72 1.0

7KASn.nr Ь: »3 0.8 »8 .....

К: 59.5 0.8

72 1.0

Примечания: В графе "Условия ПЦР" температур» и время даны: в верхней строчке дня стадии денатурации, в стредней - отжига праймеров, в нижней - для страдип синтеза продукта; - ПЦР продукт содержит минисателлитные повторы.

горах на высоте 2300 м в Южной части Азербайджана. Популяция характеризуется расширенным воспроизводством и близкородственными браками (Раутиан и др., 1993).

Выделение ДНК и электрофоретический анализ проводили по стандартным методикам ( Маниатис и др., 1984).

Рестрикцию ДНК эндонуклеазами осуществляли при оптимальных для каждого фермента условиях: температуре и буфере. Электрофорез проводили в 2%-ном агарозном геле или в 6%-ном полиакриламидном геле в трис-боратном буфере ( Маниатис и др., 1984).

Полимеразную цепную реакцию проводили по Saiki et al. (1888), с модификациями. Условия реакции соответствовали описанным ранее ( Сулимо-ва и др., 1993 ). В ряде случаев для повышения специфичности реакции использовали "Hot Start" ( Бродянский и др., 1995).

Скрининг YAC-клонотек проводили с помощью ПЦР в соответствии с методикой, описанной ранее (Green et al., 1990), с использованием стратегии двухступенчатого анализа пулов ( Oison et al., 1989). Общая стратегия скрининга приведена на рис. 1. В качестве положительного контроля при скрининге использовалась геномная ДНК из ядер клеток крови человека. В качестве отрицательного контроля использовали тотальную дрожжевую ДНК и\ или деионизованную воду. Количество циклов при ПЦР не превышало 30-35.

Список использованных в работе прайыеров и условия ПЦР приведены в табл. 1 и 2.

Для подбора праймеров и выбора оптимальных условий полимеразной цепной реакции использовали компьютерную программу " Oligo".

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выявление, характеристика и картирование STS-маркеров и YAC-клонов в области хромосомы 13 человека (13ql4.3), часто утрачиваемой при хронической лимфоцитраной лейкемии (B-CLL).

1.1. Получение STS-маркеров к локусу D13S25.

Локусом D13S25 была обозначена проба рН2-42, выделенная из библиотеки, специфичной к хромосоме 13 человека. Проба рН2-42 представляет собой HindHI-HindIII-фрагмент уникальной последовательности 13-й хромо-

сомы человека, клонированный в pBR322 ( Lalande et al., 1984). Локус

D13S25, соответствующий данной пробе, локализован методом генетического картирования в районе 13ql4.2-ql4.3 ( Bowcock et al., 1991, Houwen et a., 1991). Данный локус тесно сцеплен с локусом, ответственным за развитие болезни Вильсона-Коновалова и находится на расстоянии 1,9 сМ от него ( Farrer et al., 1991). Позднее было показано также, что локус D13S25 располагается на границе области делеций при B-CLL (Chapman et al., 1994).

На основе нуклеотидной последовательности пробы рН2-42 были подобраны семь пар праймеров, позволяющих амплифицировать фрагменты ДИК, лрикишсскц полностью перекрывающие шхше.иОйа1ельнисгь данной пробы (Сулимова и др., 1993).

Использование в ПЦР подобранных праймеров в различных сочетаниях пар, обеспечивавших в каждом случае синтез единственного уникального фрагмента на матрице геномной ДНК человека, позволило нам получить STS-маркеры к локусу D13S25. Размеры амплифицируемых фрагментов для каждой пары праймеров, температурные режимы, которые оптимизиро-яались в ходе постановок ПЦР с каждой отдельной парой праймеров на геномной ДНК человека, представлены в таблице 2. Далее эти STS-маркеры, наряду с ранее описанными, были использованы для построения YAC-контига исследуемой области хромосомы 13 человека.

Т.2. Скрининг УАС-библиотекн ICRF генома человека по маркерам RBKpt, MGG15 и D13S25.

К началу исследований в области 13ql4.3, где наблюдались'делеции у

больных при B-CLL, были локализованы только три ДНК-маркера: RBKpt, расположенный на расстоянии 60-240 т.п.н. от З'-конца гена RBI (Lalande, персональное сообщение), MGG15 ( локус D13S319) (Кооу et al., 1994) и локус D13S25 ( Bowcock et al., 1991). Все вышеперечисленные три маркера были выбраны в качестве исходных точек для создания контига. Была известна последовательность маркеров на хромосоме: CEN - RBI - RBKpt - MGG15 -D13S25 -WD - TEL.

Скрининг YAC-пулов проводился методом ПЦР с использованием двухступенчатой стратегии ( рис.1).

Результаты скрининга представлены в таблице 3.

Таблица 3. Результаты ПЦР-анализа YAC-библиотеки ICRF по STS-маркерам RBkpt, MGG15 и по четырем STS-маркерам локуса D13S25.

YAC STS-МАРКЕРЫ

клонотека N размер RBKpt MGG15 D13S25

ICRF 61E12 510 + 0 0

ICRF 58E11 580 + 0 0

ICRF 25G5 450 + 0 0

ICRF 30D7 780 0 + 0

ICRF 32H5 810 0 + 0

ICRF 61C1 370 0 + 0

ICRF 66A8 380 0 + 0

ICRF 113C2 1800 0 + 0

ICRF 101D6 680 0 +==== = +

ICRF 102C6 150 0 0 +

I-1

680 т. п. н.

Примечания: здесь и далее "+" означает наличие специфичного ПЦР- продукта, "о" - отсутствие специфичного ПЦР-продукта .

В результате скрининга пулов в YAC-библиотеке ICRF были отобраны десять индивидуальных YAC клонов по трем маркерам (табл. 3). Среднее количество клонов на один проверенный маркер составляет около трех, что соответствует ожидаемому для библиотеки в три эквивалента генома (Larin et al, 1991).

Определение размеров YAC в отобранных клонах проводилось в лаборатории анализа генома ИОГен РАН с помощью пульс-электрофореза и последующей блот-гибридизацией. Средний размер YAC в исследованных клонах библиотеки ICRF составил 650 т.п.н., что подтверждает сделанную авторами библиотеки оценку (620 т.п.н. ( Larin et al, 1991)). Приведенные в табл. 3 размеры YAC-клонов можно считать практически равными размеру самой вставки, поскольку размер векторной части молекулы принебрежимо

мал по сравнению со вставкой. При многократных пассажах отобранных YAC-клоноз размеры вставок не изменялись, что указывает на стабильность структуры исследуемых YAC-молекул.

Результаты исследований позволили оценить расстояние между маркерами MGG15 и D13S25 менее, чем в 680 т.п.н. (по размеру YAC 101D6). Так как из всех исследованных YAC, содержащих одновременно эти два маркера, минимальный размер имел YAC ICRF I01D6.

1.3. ПЦР анализ мега- YAC- клонов из библиотеки СЕРН генома м мяркерчм RBKpt, iWGGIf» и ¡)13S2ñ.

В ходе выполнения данной работы появилась информация о мега-YAC-клонах, перекрывающих локус D13S25 ( Cohen et al., 1993). Однако данная информация была не полной, с точки зрения наших исследований, так как ни один из описанных YAC не достигал маркера в гене RB1 (AFM58xd5). Мы проанализировали пять 013825-содержащих мега-YAC-клонов (СЕРН745ЕЗ, 897G6, 922А8, 775С8, 857С6) на присутствие маркеров RBKpt и MGGÍ5 (табл. 4).

Таблица 4. Результаты ПЦР-эналюа индивидуальных .vera-YAC-клопов ¡ra библиотеки генома человека СЕРЯ по STS-марксрам RBKpt и 1Y2GGI5.

YAC STS-маркеры

клонотека N размер RBKpt MGG15 D13S25

СЕРН 745ЕЗ 1400 +=--- ----+--------+

СЕРИ 897G6 1420 0 +--------+

СЕРН 922А8 1740 0 +========+

СЕРН 775С8 1410 О +========+

СЕРН 857С6 1590 0 о +

-1

1400 т. п. н.

Три УАС-клона (СЕРН745ЕЗ, 897С6, 922А8) содержали одновременно локусы 013825 и МСС15, а один из клонов, СЕРН 745ЕЗ, содержал еще и маркер ЯВКр1. Таким образом, был обнаружен УАС-клон, перекрываю-

щий область между геном RB1 и локусом D13S25, размер которого, согласно базе данных СЕРН, составляет 1400 т.п.н. и, следовательно, расстояние между RB1 и D13S25 в хромосоме 13 не превышает эту величину (при условии интактности структуры вставки в этом YAC).

1.4. Создание STS-маркеров на основе отобранных YAC-клонов.

Для проведения дальнейших исследований необходимо было выявить перекрывание друг с другом вставок исследуемых YAC-клонов, что позволило бы сформировать из них контиг. С этой целью мы предприняли попытку создать STS-маркеры, которые бы соответствовали концам вставок в Y АС-клонах. В лаборатории анализа генома ИОГен РАН были субклониро-ваны и секвенированы 11 концов вставок из шести YAC-клонов : 101D6, 102С6, 25G5, 58ЕП.745Е5 (оба конца) и 61E12L (левый конец). Размер субфрагментов составил 200-400 п.н.; секвенировали по одному субклону от каждого из 11 концов YAC-клонов. В 6 из 11 случаев анализ нуклеотидной последовательности показал, что клонированный фрагмент содержал более одного Alul-сайта рестрикции, что может указывать на "химерность" исследуемого субфрагмента. В четырех случаях (58E11L, 101D6L, 102C6L, и 745E5R) секвенированный участок невекторной ДНК был слишком коротким и позволял подобрать лишь один олигонуклеотид уникальной структуры, который может в дальнейшем использоваться для гибридизационного анализа. В одном из случаев (YАС-клон СЕРН 745ЕЗ левый конец) нам удалось создать STS маркер (745E3L, зарегистрирован как локус D13S817). Структура олигонуклеотидных праймеров и условия ПЦР приведены в табл. 1 и 2.

С данной парой праймеров, кроме YAC-клона 745ЕЗ специфичный ПЦР-продукт присутствовал также в двух других исследованных клонах, что позволило определить положение и ориентацию вставки относительно других маркеров полученной карты (табл. 5) ( результат получен совместно с группой проф. Н.К.Янковского ИОГен РАН).

1.5. ПЦР-анализ девятнадцати YAC-клонов по десяти STS-маркерам »а области 13ql4.3 генома человека.

Согласно базе данных СЕРН, исследованные нами Mera-YAC-клоны содержат еще пять STS-маркеров (AFM: 58xd6, 203xal, 126za5, 120хаЗ, 303zg5) из интересующей нас области хромосомы 13, характеристики кото

Таблица 5. Первичная УАС-вТБ карта области 13ц 14.3, часто утрачиваемой при В-С1Х.

УАС !)-П1.ч< ;1 локуси и мжшлпне соотектяуюннто 8ТЯ -мярктра

Клоло1с|;а 1)12.4153 1)138818 0138465 1)134273 1)138319 11(38272 Ш31Н2Н4 (ШЬ25 0138262 013.4817

1'0М€]> рз1че1>

т.п.н. 58х«16 Г!ПКр| 203ха1 126/^5 МС015 120хаЗ 303^5 112-42 2«5УЬ2 745ЕЗЬ МСС14

Г'М'61Е12 510 0 0 О 0 о О Ы о о

»!> « О о + о Ы о о

СЕРН 917Г8 1740 пс Я<1 0 ш1 иЛ о п<1 о о

КИ 25С5 450 0 ===+== 0 0 о о о О п<1 о о

С..1Ч1745ЕЗ 1СЯР 301)7 1400 780 о »а

па О 0 О о па П<1

1СЖК32Н5 $10 ■и) п<| П<1 о

СГ.РН 8Ч7Г,<> С-:РН 'Л2А8 ( £РН 775С8 ига 1740 1410 [м1 к<1 п<1

а —=—пс=--

о П<1 0 о ш) «¡1 п.1 11(1

I! ¡М"61С1 370 П(1 0 0 (1 о и П,| [.<1 (К)

I! 'ИР 66Л8 ?80 11(1 " 0 0 о о 1»! »,1 II <1

К ЯР 113С2 1800 »Н 0 0 О ш! 11,1 »а

И ЙР 1(1106 6,II) о о ОС о о <1(1 о о

СьРН 85/С5 1590 п<1 ид »<1

к кг тсс 15!» пЛ п ПЙ ПЙ « ПС о

С-.£РНЛ5В10 $50 о (I 0 0 о о О (1 0

СЕРН356Е10 350 «л о (Н) п<! О П<1 О ===+=== «л о о

С'П,Н752Е1 13*0 пЛ 0 пЛ В(1 о пд ' П<1 о пЛ П(1 о

Применятся:

"===" - Символ участки ДНК содержащего маркер; "х" - положение маркера; "+" - ПЦР - положительный; "о" - ПЦР - отрицательный; "п(1" - нет данных; "пс" - данные не четкие; "*" - ГИДР - положительный по базе данных СЕРП

рых приведены в табл 1 и 2. Однако, порядок следования STS-маркеров внутри индивидуальных УАС-клонов в данной базе не представлен. Одновременно в работу был добавлен маркер MGG14 ( Buys СИ., Детский госпиталь, Бостон, США, личное сообщение). Принимая во внимание вышеперечисленную информацию, был проведен ПЦР-анализ УАС-клонов библиотеки ICRF , чтобы выявить присутствие этих маркеров и получить данные об их взаимной локализации. Кроме того, были проанализированы два мега-YAC-клона: СЕРН 917F8, перекрывающий ген RB1, и СЕРН752Е1, который по данным гибридизационного анализа из базы данных СЕРН, перекрываются практически со всеми исследуемыми в данной работе мега-УАС-клонаши. Однако, в результате наших исследований оказалось, что YAC-клон 752EI не содержит ни одного из маркеров данной области (см табл. 5).

Результаты анализа, представленные в таблице 5, позволили построить контиг из 18 перекрывающихся УАС-клонов и установить относительное расположение 10 исследованных STS-маркеров в области I3ql4.3. Следает отметить, что полученная нами первичная физическая карта данной области не противоречит данным СЕРН о присутствии шести АРМ маркеров в мега-УАС-клонах, однако данный контиг можно получить только при рассмотрении четырех дополнительных маркеров, ключевым из которых оказался RBKpt. Фланги сформированного нами хонтига перекрываются с обоими ранее описанными контигами (White et al., 1993, Ficher et al., 1994). Общая протяженность области хромосомы 13, содержащейся в составе объединенного контига, составляет около 8 миллионов п.н.

В приведенной нами в таблице 5 последовательности маркеров уточнения требуют положение маркеров AFM203xal и AFM303zg5. Маркер AFM203xal локализован только на одном из УАС-клонов - 745ЕЗ. Если этот УАС-клон является химерным или содержит .велецию маркера AFM58xd6 и заканчивается левее, то появятся дополнительные варианты для положения маркера AFM203xal. Положение маркера AFM303zg5 выбраню, исходя из предположения о внутренних делециях между маркерами MGG15 и D13S25 в трех УАС-клонах : 745ЕЗ, 897G6 и 101D6. Воз можно, этот маркер расположен левее AFM126zaS, в этом случае следует п редположить наличие внутренних делеций по маркеру AFM126za5 в составе другой комбинации из трех УАС-клонов : 745ЕЗ, 113С2 и 857С7. Положение остальных маркеров представляется достаточно прочно установленным.

1.6. ПЦР-анализ построенного коптнга YAC-клонов по WI-STS-

мяркерами маркеру AFM301WB5.

В ходе исследований через систему Internet было выявлено, что в интересующую нас область попадает ряд STS-маркеров , созданных в L.D.Stein Whitehead Institute (Бостон, США) ( так называемые WI-STS-маркеры). Кроме того, нами была получена информация о локализации в исследуемой области хромосомы 13 еще одного маркера серии АРМ - AFM301WB5A.

Анализ построенного нами YAC-контига на присутствие WI-STS-маркеров позволил бы уточнить наши данные но локализации STS-маркеров на карте области 13q14.3. После оптимизации условий ПЦР нами бт.тл проведен ПЦР-анализ YAC-клонов, входящих в построенный нами контиг, по WI-STS-маркерам ( табл. 6). Для проведения анализа по маркеру AFM301WB5 помимо оптимизации температурного режима для освобождения от неспеци-фичпых продуктов амплификации был использован модифицированный метод проведения ПЦР с использованием "Hot Start".

Полученные экспериментальные данные позволили установить точную ло";ьт1плии;о исследомгшых STS-млргсеров на физпчсской карте изучаемой области ( табл. 6). Данные по локализации WI-STS-маркеров, полученные с использование построенного нами YAC-контига, в основном совпадают с YAC-STS-картой, созданной в институте L.D. Stein Whitehead. Согласно полученным результатам ПЦР с YAC raoHaMnICRF30d7 и ICRF32h5 (табл. 6), расположение маркеров GCT16C05 и D13S912 поменялось на карте местами, по сравнению с данными WI-карты. Результаты проведенного 11ЦР-анализа позволили уточнить расположение маркеров AFM301WB5 и AFM303zg5. Ранее предполагалось, что маркер AFM301WB5 локализуется на STS-карте изучаемой области между макрерами GCT16COS и D13S25, но результаты, полученные нами при анализе индивидуальных YAC-клонов, составляющих контиг, позволили нам перенести расположение данного маркера ближе к центромере, и область между MGG15 и D13S912 ( табл. б). Локализация маркера AFM303zg5 отнесена дистальнее маркера D13S8I7.

1.7. Скрининг тотальной YAC-клонотски CEPII ( пулы миди-YAC- клонов СЕРН) по локусу D13S165 ( маркер AFM203xal)

Учитывая тот факт, что YAC-клон СЕРН745ЕЗ на левом фланге не содержит пять из шести STS-маркеров, расположенных подряд на карте, и, следовательно, расстояние между крайними маркерами RBKpt и D13S817

Таблица 6 STS-YAC карга области 13ql4.3, часто утрачиваемой при B-CLL.

YAC

D-номер локуса в название соответствующего STS -маркера

Клоно* раз- D12S153 D13S91S D13S818 D13S810 D13S1178 D13SU71D13S165 DI3S1185 D13S273 D13S11S0 D13S11Í8 D13S272 D13S319 D13S273 D13S273 D13S25 D13S262 D13S817 D132S284

тиса мер 58x46 WI6319 RBKpt W12379 WI3340 WI3224 203xal WI3960 126za5 WIÍ333 WI959S 120X3 3 MGG15 WI5710 GCT16- Н2-42 205vfa2 745E3L 303zgS

номер Т.П.Н aKBjMn нузшгав ввхаах sss Xм» M xsns «XS«JU »■X ■■»■«вхвя» eajBKBSx «Хвавшввхвк ÏS sx««"a BBXSSS bsxssssssxsssss Xsa=Œ ess X»* sss xa

СЕРН 1740 м+ю nd»== od nd od nc nd nd nd nd 0 9 nd nd 0 0 О 0

917F8

ICRF 580 aESSS+VHKSU ВС 0 0 0 0 0 0 0 0 0 о 0 о nd 0 ■+»

58Е11 nd

ICRF МО о 0 0 0 0 0 0 А о О 0 0 о О 0

61Е12 nd

ICRF 450 О +3EÄS3K ж+жомав »»ne 0 9 0 0 0 0 О 0 0 ss+ss ssss+s О • «

25G5

СЕРН 450 ni - О nd ПС BBMS+*S3= ss+sss SB+SSS "SS gSSS SBB+S D 0 nd nd О 0 nd nd nd nd

Î8G6

СЕРН 310 »а О nd ПС 0 О B+BSB asa 0== sss+я 0 О Dd nd в 0 nd nd nd nd

530С11

СЕРН 1400 О О ■=» в+ешю е 0 О sfss О О BK^SSSS ss+s «в 0 se+згв sss^ss ssss+sssss+ssss iSS+e*eae+sB 0

745ЕЗ

ICRF 780 nd О О о 0 о 0 гвв+ва* SSS43SSS e«+S BXSB+SSS xaa+saa ss+c« 0 • nd nd 0

30D7

ICRF «1« nd О О nt о О о sa+sss« tra+жв« Bissau ШВ+* ■BMtBBa a*»+ess о о 9 SBB+BS о

32H5 nd

ICRF 370 nd О О 0 0 о О 0 О BsM^KBsesat« ■sasfsK sssis О 0 О nd n

«ICI

ICRF 3*0 nd О О в 0 О О О О « aats+гявз SS+S SSSS+BSB BSS+B О о О nd nd e

ÎSA8

ICRF 1800 nd nd О nd nd nd О nd О nd nd БЯВ|ЗЯ1 3 nd nd О Dd nd ШЯ +s

пзсг

ICRF 680 0 О О ne 0 О ПС О 0 0 0 nc css <fes е reas »sa О 0 0

101D6

ICRF 150 nd О О ПС 0 О nd О nd 0 О ne . О 9 О BSB +SBSBSS nd»« SSB+SSS 0

102C6

СЕРН 550 0 О 0 О 0 О О О О 0 о 0 О 0 ess+в» «sa» nd sa sss+жя Ж о 0

C5B10

СЕРН 330 nd О О О 0 О nd о nd о о nd О О BSB+BS sssss+ss SSBSB+B BS 0 о

356Е10

СЕРН 1380 nd nd О nd nd nd nd nd nd nd nd nd О nd nd 0 nd nd 0

7S2E1

СЕРН 1410 nd nd О nd Dd od nd nd 0 nd nd гарева SS +s nd nd nd nd od 0

775C8

СЕРН 1590 nd nd о nd nd nd nd nd nd nd nd nd О nd nd ss+вже :ввв*ва BBB+S

857C5

СЕРН 1420 nd nd О nd nd nd в od BB+B bss rid nd nc*««" nd nd ■st«« BSSadSSBB+BS« ss so«

897G6

СЕРН 1740 nd nd О nd nd Dd nd nd BB+B sbws nd nd« »bb+s««s BB+SSSS =nd nd ss+ssss sss*ss BBS S0X BBSS + s

922А8

Примечания: "===" - Сютол участка ДНК содержащего маркер; "х" - положите маркера; - ПЦР - положительный; "о" - ПЦР - отрицательный; "шГ - нет данных; "вс" - данные не четкие; - ПЦР - положительный по базе данных СЕРН

предположительно несколько больше вставки этого УАС-клона (1400 т.п.н.), возникла необходимость заполнить этот пробел на карте. Поэтому, с целью уточнения локализации маркера АРМ203.ча1 и построения полного контига миди-У АС-клонов мы провели ПЦР-анализ доступной миди-УАС-клонотеки из СЕРН по вышеназванному маркеру. Как и в случае с библиотекой УАС-клонов 1СЯР, скрининг миди-УАС-клонотеки, специфичной для хромосомы 13, проводился в два этапа. На первом этане проводили ПЦР-скрининг пулов миди-УАС-клонов по маркеру АРМ203ха1 (локус Е)138165). Положи 1ельные сигналы были получены для пулов с номерами 8, 16 , 24, 30, 67, 78, 86.

Вторичный скрининг проводился непосредственно в СКРН ( Париж. Франция), откуда нами было получено 20 индивидуальных УАС-клонов: 622В5, 622В11, 622Р5, 622Р11, 623В5, 623В11, 623Р5, 623РП, 685СЗ, 58С6, 530С11, 23308, 23408, 23508, 23608, 23708, 23808, 23908, 24008, 24003.

Полученные клоны были проанализированы независимо от данных СЕРН на присутствие маркера АРМ203ха1 ( локус 13138165). Положительные сигналы по локусу 0135165 дали следующие УАС-клоиы : 58С6, 23408, 2371)8, 530С! I. 622П ¡. 623В5. 685СЗ. Дале: проводился ПЦР-анализ УАС-клонов, ответивших положительно на 0138165 по шести ЯТЬ-маркерам из зоны КВКр1-013Я25 : АГ\158хс16, ЯВКр^ АРМ127хаЗ, АНМ12б7а5, МС015, АГ-"М120\аЗ. Окончательные результаты скрининга представлены в таблице 7.

Таблица 7. Результаты ПЦР-аиализа индивидуальных УАС-клонов (СЕРН) на присутствие маркеров из зоны 1?ВКр1 - 013Б25.

уде номер I)- номер лок-уса и название соответсвующего БТЯ маркера 0138153 0135818 0138165 038273 0138319 ОШ272 58х(16 ИВКр! 127хаЗ 203ха1 126га5 ЛТСС15 120хаЗ

058С6 + 0 0 0

2341)8 + 0 0 ПС ПС

23708 + 0 0 ПС ПС

530СИ 0 0 0

622И1 + 0 0 + 0 ос ПС

623В5 + 0 0 + 0 0 ПС

685СЗ + 0 0 + 0 0 0

Полученные результаты были в дальнейшем использованы для отбора космид и построения островков космид и контига космид, перекрывающего исследуемую область, в лаборатории анализа генома ИОГен РАН;

I. 8. Анализ YAC-клопов по STS-маркерам, полученным на осиове кДНК, локализованных в области 13ql4.3.

Праймеры для трех STS-маркеров - EST13G1, EST13G2, EST13G3, созданных на основе нуклеотидной последовательности кДНК из интересующей нас области хромосомы 13, были получены от проф. Ch.Buys ( Детский госпиталь, Бостон, США). EST13G2 и EST13G3 картированы в области 13ql4.3 как D13SU50 и D13S1168 соответственно. Локализация маркера EST13G1 не была установлена, ко автор предполагал, что он локализуется на хромосоме дистальнее двух других маркеров.

Нами была проведена оптимизация условий ПЦР и проведен анализ индивидуальных YAC-клонов, составляющих наш контиг, по трем STS-маркерам - EST13G1, EST13G2, ESTI3G3.

Полученные в эксперименте результаты позволили локализовать данные маркеры на построенной нами YAC-STS-карте области 13ql4.3 и подтвердить данные проф. Ch. Buys о их взаимном расположении. Результаты представлены в табл. 8.

1.9. Создание STS-маркера на оспоае нуклеотидпой последовательности кДНК, локализованной в области хромосомы 13 человека, часто утрачиааемой при хронической лкмфоцитариой лейкемии.

При исследовании больных хронической лимфоцитарной лейкемией (B-CLL) нашими шведскими партнерами ( лаборатория Dr. S.Einhorn, Каролинский институт, Стокгольм) была получена информация, что ген В-CLL находится в непосредственной близости от STS маркера MGG15 в сторону теломеры. Этот маркер представлен в составе одного из космидных контигов, полученных в лаборатории проф. Н.К. Янковского ( ИОГен, РАН), содержащих, в частности космиду LANL 71al 1. Далее было показано, что у одного из больных B-CLL точка разрыва хромосомы 13 приходится на фрагмент геномной ДНК, клонированный в космиде LANL 71 all (Einhorn S., Каролинский институт, Стокгольм, Швеция, личное сообще-

Таблица 8. Фрагмент УЛС-ЯТЯ карты с локализацией трех ЯТ8-маркероя. полученных на основе кДНК из области 13ц14.3

УАС В-номер локуса и название соответствующего 8 Г8 -маркера

К.ИШОК'КЦ номер размер 1.11.11. 1)125319 1)1381168 1)1351150 --- ----- 1)132912 --- 1)13525 МСС15 ЕБТСЗСЗ ЕвТ13С2 ЕЭТ13С1 АКМ301\УВ5 \VI-5710 ССГ16С05 Н2-42

К'КЕ 25С5 450 о ПС О О —Н===-===+=—=----+-=- О

СЕРН 745ЕЗ 140«

(СИР 3007 780

1СТК 32Н5 810

1СЯК61С1 370

1СКГ 66А8 380

==+-=== п п ПС О О ==== +-=-==-+= они ПС (> о = := + = ООО О ') О — -------+ — о о о ~— = +---= — = +---= о = = = + _ = = =--+ -

К «Г 10106 ТснТШсб 68(1 ~15»

СЕРН 5ВК1 550

СЕ1Ч1356Е10 350

Примечания:

"===" - Символ участка ДНК содержащего маркер; 1'х" - положение маркера; "+" - ПНР - положительный; "о" - ПЦР - отрицательный;

"п<1" - пет данных; "пс" - данные не четкие; - ПЦР - положительный по базе данных

СЕРН

ние). Использование космиды LANL 71а11 в качестве зонда позволило д-ру Е.Забаровскому ( Каролинский институт, Стокгольм) из библиотеки кДНК человека выделить индивидуальный клон кДНК, который был передан в лаб.проф. Н.К.Янковского и секвенирован. Полученная нуклеотидная последовательность кДНК была использована нами для создания STS-маркера к области возможной локализации гена B-CLL. ( табл. 1 и 2). Был проведен ПЦР-анализ YAC-клонов, составляющих контиг, по данному STS-маркеру. В результате анализа были отобраны YAC-клоны 25G5, 32Н5, 101D6, 102С6, которые в настоящее время используются в экспериментах по дальнейшей локализации гена B-CLL.

1.10. Заключение.

Таким образом, результаты всех проведенных нами экспериментов позволили определить порядок 21 STS-маркера района 13ql4.3, часто утрачиваемого при хронической лимфоцитарной лейкемии. Восемь STS-маркеров дня этой области были получены нами и локализованы на предлагаемой карте. В результате ПЦР-скрининга двух Y АС-библиотек и данных, полученных в кооперации с сотрудниками группы проф. Н.К.Янковского ( ИОГена РАН) был построен окончательный контиг из миди- и мега-YAC-клонов, и объединены ранее опубликованные контиги проксимальнее RB1 и ди-стальнее D13S25 ( табл. 6). Впервые найден Mera-YAC-клон СЕРН745ЕЗ, соединяющий фланкирующие маркеры RBKpt HD13S25. Расстояние между этими маркерами оценено в 1400 т.п.н., по размеру YAC-клона, их обьеди-няющего. YAC-клоны CEPH58g6, ICRF61cl и ICRF101d6, расположенные "встык", формируют минимальный путь от маркера RBKpt до D13S25. Общая длина этого "моста" - не превышает 1560 т.п.н. ( суммарный размер трех выше указанных YAC-клонов), что согласуется с оценкой размера данной зоны. Полученные нами данные позволяют также оценить растояния между промежуточными маркерами в данной области хромосомы 13 человека. Для поиска гена супрессора B-CLL наиболее важной является оценка растояния между краевыми маркерами D13S319 ( MGG15) и D13S25, утрачиваемыми при делециях. По нашим данным, минимальный размер делеции, обнаруживаемой у больных, оценен пока в 680 т.п.н., в соответствии с размером миди-YAC -клона YAC101d6, соединяющего соответствующие маркеры.

2. Исследование полиморфизма отдельных районов хромосомы 13

с применением полимеразной цепной реакции.

2.1 П ЦР-РДРФ-анализ локуса »13825.

Как уже отмечалось в первой главе, проба рН2-42, обозначенная на хромосоме 13 как локус В13525 и локализованная в районе 13ц14.3, ранее изучалась в связи с болезнью Вильсона-Коновалова, как один из возможных полиморфных ДНК-маркеров.

Методом блот-гибридизации с пробой рН2-42 было показано наличие в локусе О! 3225 трехаллелыюго полиморфизма по рестрмктазе и предложен ПДРФ-маркер, сцепленный с локусом болезни Вильсона-Коновалова и использованный для его картирования на семьях больных из разных популяций человека (Вохусоск с1 а1., 1990, Раггег й а1., 1991). Было известно, что каждый из аллельных вариантов локуса 013825 содержит постоянный фрагмент размером 1,05 т.п.н. и один фрагмент переменной длины: 1,759 ( частота - 0,41), 1,60 ( частота - 0,58) или 1,8 т.п.н. (частота - 0,01) для аллелей А1, А2 н АЗ соответственно (Вогусоск е1 а!., 1990), что указывает на наличие в исследуемом локусе не менее четырех сайтов узнавания для эндонук-леазы йэр!, два из которых должны быть полиморфными.

Так как мы предполагали возможность получения высокополиморфного ГЩР-ПДРФ-маркера на основе нуклеотидной последовательности данной пробы, нас прежде всего интересовал полиморфный БзрЬсайт, определяющий наличие аллелей А1 и А2, встречающихся с высокой частотой. Однако локализация этого сайта была неизвестна, что не позволяло получить на его основе полиморфный ПЦР-маркер. Более того, анализ нуклеотидной последовательности пробы рН2-42 выявил наличие большею числа Бэр!-сайтов, чем ожидалось по данным Во\усоск е1 а1. ( 1990). Исходя из этого, было предложено два возможных варианта локализации БврТ-сайтов в пределах пробы рН2-42 (обуславливающих полиморфизм А1/А2) (Сулимова и др., 1993). Согласно первому варианту в локусе 013Я25 полиморфным является 8йр1-сант в 1240-м нуклеотиде от 5'-конца пробы рН2-42. В альтернативном варианте интересующий нас полиморфный БэрЬсайт располагается за пределами области пробы, а выявленный в нуклеотидной последовательности пробы дополнительный БэрЬсайт в положении 1240 является резуль-

татом перестройки при клонировании, и следовательно отсутствует в геномных ДНК.

В связи с изучением данного локуса, как потенциального полиморфного ДНК-маркера, пригодного для ранней диагностики болезни Вильсона-Коновалова и в целях устранения возникших различий в трактовке результатов, мы провели ПЦР-анализ БэрГ-полиморфизма локуса 013825 на образцах геномных ДНК человека московской и талышской популяций.

Методом ПЦР, при использовании праймеров 2Н2-5Н2 ( информация о праймерах в табл. 1 и 2) во всех 35 образцах геномной ДНК из московской популяции и 22 образцах геномной ДНК из популяции талышей амплифици-ровался уникальный фрагмент длиной 630 п.н. При расщеплении ПЦР-продуктов рестриктазой Бэр! получали три фрагмента размером 284, 178, 118 п.н., что позволило составить схему распределения БврХ-сайтов в анализируемом фрагменте локуса 013Б25 на основании полученных ранее данных ( Сулимова и др., 1993) и результатов настоящего исследования ( рис. 2).

И

ныш

тг

1240 1358

&р! &р!

1642

Л.

М.

¡3200 |

НЫ

5Н2-42

1062

178

| 118

| 248

2Н2-42

1692

50 |

Рис. 2 Локализация сайтов рестрикции в локусе 013в25 геномной ДНК.

Примечания: расположение БврЬеайтов определено с помощью рестрикционного гцоролиза ПЦР-продуктов образцов геномной ДНК человека с Нраймерамн 2Н2-42 и 5112-42. Фрагмент длиной в 50 н. п. на электофореграмме не выявляется, но его существование предполагается исходя нз разницы между длиной амплифицированного фрагмента ДНК ( 630 п.н.) и суммой длин рестрикционных фрагментов. Длины фрагментов приведены в п.н.

Таким образом, наши исследования подтвердили присутствие дополнительного Sspl-сайта рестрикции в области генома человека, соответ-ствующеГГположешио 1240 последовательности пробы рН2-42, который был обнаружен в пробе по данным секвенпрования ( Сулимова и др., 1993), ноне был упомянут ранее ( Bowcock ct а!., 1990). По результатам наших исследований, данный сайт присутствует во всех образцах геномной ДНК и, следовательно, не является полиморфным в обеих изученных популяциях. Это обстоятельство позволяет предположить, что наличие А1/А2 аллелей в данной области генома, описанных у Bowcock et al. (1990) определяется Sspl-сайтом, лежащим в области, непосредственно прилегающей v- иссчедуеадпаду <f>pat менту локуса D13S25.

Учитывая тот факт, что по результатам последних исследований (Chapman et al., 1994, Hawthorn et al., 1993), локус D13S25 попадает в область генома, часто утрачиваемую при B-CLL, перед нами встала задача более детального изучения данного локуса с примением ПЦР и последующего рестрикционного анализа.

При помощи шести пар нраймеров к локусу D13S25 ( информация содержится в табл.! и 2) были амг.лифицированны фрагменты геномной ДНК, почти полностью перекрывающие область пробы рН2-42. Анализ ачплифи-цированных фрагментов геномных ДНК с помощью эндонуклеаз Hint!, Sspl, Rsal показал отсутвствие полиморфизма по этим рестршстазам в данном ло-кусе на пеех 35 образцах геномных ДНК из московской и 22 образцах геномных ДНК из талышской популяций. Однако было установлено, что в первичной последовательности пробы рН2-42 имеются пять мелких делеций размером от 10 до 30 п.н., по сравнению с соответсвующими последовательностями в геномной ДНК ( рис. 3).

"12 20-30 10-15 »; . »16

. НтП НтП НтП

........Ч............. ..........> I________I I

1110 1052 1241 1351 ««« 1530 1142/11921121 17В5 1131 1ЯЗИ 21?

► -Г Т ► + ►«►*« 4

Р5 I Л Р1 ¿РЭР2 РЗ Р8 Р<

Рис. 3 Схема предполагаемых делеций в облает пробы рН2-42.

Примечания: размеры предполагаемых делеций указаны в пл.;

внизу обозначена локализация используемых в работе олигоиуклеотидных праймеров.

Не исключено, что выявленные делеции в последовательности данной пробы являются результатом перестроек при ее клонировании, что в свою очередь может указывать на особенности структуры данной области генома человека, способствующие возникновению делеций.

Нами был проведен анализ нуклеотидной последовательности пробы рН2-42, в результате которого было обнаружено избыточное количество три-, тетра- и пента(А)повторов, три- и тетра(Т)повторов, наличие микро-сателлитных повторов СТ. Существование таких повторов может способствовать появлению делеций в области генома человека, соответствующей локусу 013825 как у здоровых людей, так и у больных лейкемией.

Проведенный компьютерный анализ последовательности пробы рН2-42 с использованием программы "Аиювепе" показал наличие в ней предполагаемых функционально активных последовательностей: промоторов, экзо-нов, сайтов полиаденилирования, Это позволяет сделать предположение о возможной локализации в соответствующем локусе хромосомы 13 человека кодирующей последовательности. Этот факт представляет интерес как с точки зрения установления природы кодирующей последовательности, так

и в связи с возможной локализацией в данной области гена-супрессора В-CLL.

2. 2. Изучение полиморфизма гена фактора VII свертываемости крови.

К началу исследований в лаборатории сравнительной генетики животных с помощью dot-матричного анализа нуклсотидпой последовательности гена фактора VII свертываемости крови была выявлена гипервариабельная область, содержащая прямые и инвертированные повторы, в том числе и гандемные повторы с мономерными элементами от 14 до 37 п.н.. Были подобраны олигонуклеотнднн» пранмеры, почроляющче амштифинирояать всю рассматриваемую область (интрон G и экзон 8), а также первую ее половину, в которой сосредоточено максимальное количество повторов, и вторую, для которой отмечено незначительное присутствие инвертированных повторов. Присутствие минисателлитов в данной области гена фактора VII предопределяет полиморфизм, обусловленный различиями у аллельных вариантов в количестве копий мономерных элементов.

Данное исследование предпринято с целью отработки я оптимизации условий амплификации для детального изучения рассматриваемой гиперва-рилбельной области гена фактора VII свертываемости крови в различных популяциях человека.

Для исследования были выбраны праймеры: 7FGI ( 5'- TGCAATGCCAGAGGTTCCTTG -3) и 7FG2 (5'- GTGGAAGTGACAGCACGAAGC -3'),

позволяющие амплифицировать фрагмент длиной 489 п.н. (с 10027 по 10515 иуклеотид), включающий в себя участки экзона 8 и нитрона G, содержащие мшшеагеллитные повторы ( по 37 п.н. каждый) фактора VII.

ПЦР-анализ полиморфизма изучаемой области гена фактора VII проводили на выборках московской ( п= 26) и талышской ( п= 22) популяций че-лопека. Кроме того, для оценки уровня полиморфности исследуемого локуса был проведен ПЦР-анализ 6 образное геномных ДНК представителей семей, характеризующихся высоким уровнем полиморфизма по многим локусам, полученным из СЕРН (Париж, Франция). В результате ПЦР образцов ДНК из московской популяции были получены амплифицированные фрагменты разной длины: фрагмент ожидаемого размера в 489 п.н. и фрагмент меньшей длины - 230 п.н. ( частоты которых рав-

ны 0,609 и 0,391, соответсвенно). Возникновение аллельных вариантов по-видимому обусловлено делецией в области повторов гена фактора VII, приводящей к выпадению семи 37-нуклеотидных мономеров. Следует отметить, что данный район гена фактора VII свстрываемости крови ранее изучался с помощью полимеразной цепной реакции с другой парой праймеров. Авторами на выборке геномной ДНК из европейской популяции был обнаружен диаллельный полиморфизм, вызванный различиями в один мономерный элемент повтора (А1 = 443 н.п., А2 = 480 н.п.) (МагсЬеШ й а!., 1991).

При анализе полиморфизма гена фактора VII на талышской популяции в результате амплификации во всех образцах ДНК получается один фрагмент длиной 267 п.н., что соответствует делеции в размера шести мономеров, по 37 п.н. каждый. Отсутствие полиморфизма в исследуемой гипервариабельной области гена фактора VII на данной выборке можно было ожидать, поскольку популяция талышей характеризуется однородностью и большим распространением близкородственных браков. Однако, сравнение результатов ПЦР-анализа двух изученных популяций человека показывает существование межпопуляционных различий на уровне ДНК в изучаемой области гена.

В рамках данного исследования нами был проведен также ПЦР-анализ образцов геномной ДНК у представителей семей СЕРН. Результаты исследований показали наличие амплифицированных фрагментов разной длины. Амнлифицировался фрагмент ожидаемого размера ( 489 п.н.) и фрагмент меньшего размера - 452 п.н., что соответсвует возможной делеции в один 37-нуклеотидный мономер.

Таким образом изучение полиморфизма гена фактора VII свертываемости крови на образцах геномной ДНК человека из различных популяций выявило наличие нескольких аллелей, возникновение которых вероятно обусловлено существованием делеции в области тандемных повторов, расположенных в области нитрона в и захватывающих экзон 8. Изученный ДНК-маркер позволяет выявлять полиморфизм гена фактора VII как внутри популяции, так и на мсжпопуляционном уровне. Следовательно, данный полиморфный ДНК-маркер к гипервариабельной области гена фактора VII может использоваться для проведения генетических и популяционных исследований человека. Кроме того,учитывая важность данного гена с медицинской точки зрения, данный маркер также может служить информативным маркером гена

фактора VII при изучении различных наследственных заболеваниях, связанных в нарушениями структуры гена.

ВЫВОДЫ

1. При изучении области 13ql4.3, часто утрачиваемой при хронической лимфоцитарной лейкемии, установлена локализация известных 21 STS-марксра . Создано восемь STS-маркеров к этой области, из них шесть - на основе нуклеотидной последовательности локуса D13S25 ( маркеры Н2-42), одпп - па основе спквгнса копцотого фрагмента мидн-УЛС клоня СЕРН745БЗ ( локус D13S817), один - на основе нуклеотидной последовательности кДНК клона ( маркер 7KASH4U).

2. Проведен скрининг двух YAC-клонотек ( ICRF и СЕРН) с использованием 27 STS-маркеров, отобрано более 20 мега- и миди- YAC-клонов и на их основе создан контиг, перекрывающий район 13ql4.3 размером в 2000 т.п.н.

3. Методом ПЦР-ПДРФ, с использованием рестрикционной эндоиукле-азы Sspl, на образцах геномной ДНК из московской и талышской популяций исследован полиморфизм локуса D13S25, расположенного в области хромосомы 13, часто утрачиваемой при хронической лимфоцитарной лейкемии. В изученных популяциях не выявлено Sspl-полиморфизма по данному локусу. В пробе рН2-42 методом ИЦР-ПДРФ выявлено присутствие пяти мелких де-леций по сравнению с соответствующими нуклеотидиыми последовательностями геномных ДНК, что позволило уточнить нуклеотидную последовательность изучаемой области генома человека.

4. С помощью ПЦР разработаны условия анализа полиморфизма гипервариабельной области гена фактора VII в различных популяциях человека: обнаружен полиморфизм по числу минисателлитных повторов области экзо-на 8 и нитрона G гена фактора VII в случайной выборки московской популяции, выявлены межпопуляционнме различия по данной области гена при анализе выборки московской, талышской популяций и семей СЕРН.

5. Полученные в работе ДНК-маркеры являются STS-маркерами, пригодными для дальнейшего построения физической карты хромосомы 13 человека ( область 13ql4.3), могут быть рекомендованы как генетические маркеры для проведения популяционных и медико-генетических исследований,

особенно полиморфные ДНК-маркеры к гипервариабельной области гена фактора VII.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Аитова С.С., Сулимова Г.Е., Удина И. Г. К вопросу о характеристики ПДРФ-маркера локуса D13S25 13-й хромосомы человека: локализация Sspl-сайтов в пробе рН2-42. Молекулярная биология, 1995 т.29, N4, с.813-817.

2. Бродянский В.М., Сулимова Г.Е., Удина И.Г., Аитова С.С., Шайхаев Г.О., Шарикова O.A., Захарьев В.М., Федорова Л.И., Зеленин A.B., Эйнхорн С., Бауш Ч., Лаланд М., Росс М., Янковский Н.К. Скрининг YAC-клонов и создание контига, перекрывающего область хромосомы 13 человека, часто утрачиваемую при B-клеточном хроническом лимфоцитарном лейкозе. Молекулярная биология, 1995 т.29, N5, с.1126-1136.4.

3. V.M.Brodjansky, G.E.Sulimova, I.G.Udina, S.S.Aitova, A.V.Baranova, B.I.Kapanadzc, L.I.Fedorova, M.V.Kost-Alimova, A.V.Zelenin, V.M.Zakhariev, O.A.Serpinsky, Ch.Buys, E.R.Zabarovsky, S. Einhorn, N.K.Yankovsky. Making YAC and cosmid contig spanning 13ql4.3 region frequently lost in chronic lymphocytic leukemia. Abstr of the 3d Human chromosome 13 workshop. Tarrytown NJ USA, 30 Oct- 1 Nov 1995.

4. Аитова C.C., Мойсяк E.B., Сулимова Г.Е., Удина И. Г. Характеристика локуса D13S25 13-й хромосомы человека: ПЦР-ПДРФ и компьютерный анализ. Сб. трудов 5-й конференции "Геном человека-96", Черноголовка, январь 1996.