Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ДНК-гидролизующие аутоантитела и их влияние на рост клеток in vitro

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Темников, Дмитрий Алексеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. АУТОАНТИТЕЛА К ДНК

И ИХ БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ.

1.1. Аутоантитела.

1.1.1. Аутоиммунитет.

1Л .2. Разнообразие аутоантител.

1.1.3. Аутоантитела при различных аутоиммунных заболеваниях (АИЗ).

1.2. Аутоантитела к ДНК.

1.2.1. Общая характеристика аутоантител к ДНК.

1.2.2. Происхождение аутоантител к ДНК.

1.2.3. Структура аутоантител к ДНК.

1.3. Системная красная волчанка (СКВ).

1.3.1. СКВ: общая характеристика.

1.3.2. Люпус-нефрит.

1.3.3. Разнообразие аутоантител при СКВ.

1.3.4. Определение уровня аутоантител к ДНК.

1.4 Патогенные аутоантитела к ДНК.

1.5. Механизмы действия аутоантител к ДНК на клетки.

1.6. Каталитические антитела.

1.6.1. Открытие новых функций антител.

1.6.2. Механизмы каталитического действия антител.

1.6.3. Природные каталитические антитела.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Оборудование и реактивы.

2.2. Буферные растворы и питательные среды.

2.3. Объекты исследования.

2.3.1. Кровь.

2.3.2. Клеточная линия СПЭВ.

2.4 Получение высокоочищенных препаратов IgG из сыворотки крови.

2.4.1. Выделение белковой фракции.

2.4.2. Фракционирование белков сыворотки крови методом ионообменной хроматографии.

2.4.3. Очистка белковых фракций методом аффинной хроматографии.

2.5. Анализ состава белковых фракций.

2.5.1. Электрофоретический анализ белковых фракций в полиакриламидном геле.

2.5,2,. Иммуноферментный анализ.

2.6. Изучение ДНК-гидролизующих свойств AT к ДНК.

2.6.1. Гидролиз плазмидной ДНК рВР-322 антителами к ДНК.

2.6.2. Электрофоретический анализ плазмидной ДНК в агарозном геле.

2.7. Изучение влияния антител к ДНК на рост клеточной культуры.

2.7.1. Культивирование клеточного монослоя с AT к ДНК.

2.7.2. Культивирование клеток с AT к ДНК с момента пересева.

2.8. Статистическая обработка результатов измерений.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ.

3.1. Получение высокоочищенных фракций IgG, содержащих антитела к ДНК.

3.1.1. Гель-фильтрация и ионообменная хроматография.

3.1.2. Аффинная хроматография.

3.2. Изучение дезоксирибонуклеазной активности ААТ к ДНК.

3.2.1. Количественная оценка результатов электрофореза.

3.2.2. Храктеристика плазмидной ДНК.

3.2.3. Влияние прединкубации антител на их ДНКазную активность.

3.2.4. Зависимость ДНКазной активности AT к ДНК от рН реакционной смеси, концентрации ионов двухвалентных металлов и АТФ.

3.2.5. Гидролиз плазмидной ДНК аутоантителами.

3.3. Влияние ААТ к ДНК на рост клеток линии СПЭВ.

3.3.1. Зависимость прироста клеток от концентрации IgG.

3.3.2. Рост клеток линии СПЭВ при внесении AT к ДНК в суспензию клеток и в монослой.

3.3.3. Влияние гормональной терапии на рост стимулирующую способность фракций AT к ДНК.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "ДНК-гидролизующие аутоантитела и их влияние на рост клеток in vitro"

Актуальность проблемы

Выяснению роли аутоантител (ААТ) в системе иммунного ответа при аутоиммунной патологии и в норме посвящено много исследований в области биохимии, иммунологии, аллергологии. На сегодняшний день идентифицировано большое число антигенов, к которым чаще всего обнаруживаются ААТ - энзимы основных метаболических путей, рецепторы различных клеток, внутриклеточные компоненты, нуклеиновые кислоты и нуклеопротеиды, фосфолипиды и др (Габибов и др., 1991; Насонова, 1995).

При многих вариантах системных аутоиммунных заболеваний (ревматоидном артрите, синдроме Шегрена, антифосфолипидном синдроме и, особенно при системной красной волчанке) у больных наблюдается гиперпродукция аутоантител с ДНК-гидролизующей активностью (Шустер, Гололобов, Габибов, 1991).

Системная красная волчанка - тяжелое хроническое рецидивирующее воспалительное заболевание соединительной ткани. Клинические проявления зависят от остроты болезни и локализации поражений. Возможны изменения со стороны кожи, суставов, легких, сердца, ЦНС. Более чем в 50% случаев СКВ развивается тяжелое поражение почек -люпус-нефрит. При длительном течении болезни возникают необратимые изменения со стороны внутренних органов. В особо тяжелых, запущенных, поздно распознанных случаях волчанка может приводить к смертельному исходу в короткие сроки. В многочисленных исследованиях было показано, что важное значение в патогенезе этого заболевания играют аутоантитела. Отмечено, что одним из характерных клинических признаков данного заболевания является появление так называемых анти-нуклеарных антител (Чучалин, 1997; Pisetsky, 1998). Однако, биологическая роль аутоантител к ДНК при СКВ остается до конца не ясной, в частности, не выяснено их действие на ткани почки при люпус-нефрите.

Полученные разными авторами (Vlahakos, Foster, 1992; Reichlin, Hahn, Koren, 1995) данные свидетельствуют о том, что AT к ДНК, обнаруживаемые у больных СКВ, способны действовать на живые клетки, связываясь с их поверхностью или проходя внутрь клеток. Результатом этого может быть повреждение и последующее разрушение клеток.

Известно, что ААТ к ДНК могут иметь прямое отношение к развитию патологического процесса при люпус-нефрите. Поэтому всесторонние исследования ААТ к ДНК при СКВ необходимы как для диагностики и понимания патогенеза данного заболевания, так и для постоянного контроля за эффективностью проводимого лечения. Исследования ферментативной активности ААТ к ДНК несомненно будут способствовать расширению наших познаний о биологической роли каталитических антител и при нормальном развитии организма.

До сих пор не существует общепринятого способа выделения ААТ к ДНК из крови, что является одной из причин противоречивости результатов о содержании ААТ к ДНК у больных СКВ, получаемых разными авторами (Ермекова, 1981; Козырь, 1996). Актуальной также является разработка методов оценки ДНК-гидролизующей активности аутоантител. Как показали наши исследования, данный иммунологический показатель может быть использован как для наблюдения за динамикой патологического процесса, так и для оценки эффективности проводимого лечения.

Целью данной работы является исследование влияния ДНК-гидроли-зующих аутоантител из крови больных системной красной волчанкой на рост клеток in vitro. При этом необходимо решить следующие задачи:

• получение из сыворотки крови больных СКВ высокоочищенных фракций IgG, содержащих аутоангитела к ДНК;

• определение ДНК-гидролизующей способности полученных фракций IgG; в характеристика ДНК-гидролизующей активности фракций ААТ к ДНК;

• исследование влияния фракций ААТ на рост клеток in vitro.

Научная новизна

Установлено, что популяция аутоантител к ДНК у больных СКВ гетерогенна: существуют по крайней мере два типа (субклона) ААТ к ДНК, различающихся по способности связываться с анионообменником. Показано, что аутоантитела к ДНК, аффинно связывающиеся с ПротеинА-сефарозой являются каталитическими антителами с дезоксирибо-нуклеазной активностью. Установлено, что ДНКазная активность аутоантител к ДНК при СКВ термостабильна, является металлозависимой и имеет оптимум рН - 7,5. Впервые показано, что ААТ к ДНК при СКВ обладают рост стимулирующей активностью в отношении клеток линии СПЭВ в условиях in vitro. Аутоантитела предотвращают гибель клеточного монослоя в бессывороточной среде, стимулируют деление клеток и рост клеточной культуры в среде со стандартным содержанием сыворотки. Установлена корреляция между степенью ДНК-гидролизующей активности аутоантител и их способностью стимулировать рост клеток in vitro. При ремиссии СКВ у больных, прошедших краткий курс гормональной терапии, ДНКазная активность AT снижается и антитела теряют способность стимулировать пролиферацию клеток.

Практическая значимость

Разработан метод многоступенчатой очистки аутоантител к ДНК из сыворотки крови больных СКВ. Метод позволяет получать две фракции антител, различающиеся по способности связываться с анионообменником и содержанию ДНК-гидролизующих антител. Показано, что ферментативная активность аутоантител к ДНК, в отличие от активности ДНКазы сыворотки крови, термостабильна. При инкубации сыворотки крови больных СКВ при в течение 40 минут ДНКазная активность аутоантител к ДНК сохраняется, что может иметь диагностическое и прогностическое значение для медицины. Разработана методика и соответствующее программное обеспечение для анализа электрофореграмм с использованием компьютерного сканера. Методика оценки ДНК-гидролизующей активности антител может быть использована при наблюдении за течением болезни и ходом проводимого лечения.

Апробация работы

Основные результаты исследования докладывались на III Республиканской научно-технической конференции молодых ученых и специалистов (г. Казань, 1997); IX Международной конференции молодых ученых «Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений», (г. Казань, 1998); III Пущинской конференции молодых ученых (г. Пущино, 1998); Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (г. Санкт-Петербург, 1998); V Международной конференции «Биохимия здоровья и болезней» (г. Иерусалим, Израиль, 1998); XIII Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (г.Санкт-Петербург, 1999); I научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века" (г. Казань, 2000); Международной научно-практической конференции «Современная техника и технологии в медицине и биологии» (г. Новочеркасск, 2001), а также на ежегодных итоговых научных конференциях Казанского государственного университета в 1997-2000 гг.

По материалам диссертации опубликовано 12 работ.