Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Динамика морфофункциональных показателей разнополых куриных эмбрионов в процессе развития

ВАК РФ 06.02.01, Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации по теме "Динамика морфофункциональных показателей разнополых куриных эмбрионов в процессе развития"

БЛАЖНОВА Галина Николаевна

ДИНАМИКА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ РАЗНОПОЛЫХ КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ В ПРОЦЕССЕ РАЗВИТИЯ

06.02.01 - диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 и 2014

005553930

Ставрополь - 2014

005553930

Работа выполнена в ФГАОУ ВПО «Северо-Кавказский федеральный университет»

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор

Тимченко Людмила Дмитриевна

Официальные оппоненты: Зайцева Елена Владимировна - доктор биологических наук,

профессор, ФГБОУ ВПО «Брянский государственный университет имени академика ИГ. Петровского», профессор кафедры биологии, заместитель директора Естественно-научного инспггута

Баймишев Хамидулла Балтуханович - доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Самарская государственная сельскохозяйственная академия», заведующий кафедрой «Анатомия, акушерство и хирургия»

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Ивановская государственная сельскохозяй-

ственная академия имени академика Д.К. Беляева»

Защита диссертации состоится « 18 » декабря 2014 г. в 10 00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.062.02 при ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет» по адресу 355017, г. Ставрополь, пер. Зоотехнический 12.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет» и на сайте http://wvvw.stgau.ru.

Автореферат разослан «Д^ » 2014 года и размещен на сайтах:,

ВАК Минобразования и науки РФ Ьйр://(\ту. vak.ed.gov.ru « ^ » 014 г.

ФГБОУ ВПО «Ставропольский ГАУ» http://www.stgau.ru « & » 014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Дьяченко Юлия Васильевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность и степень разработанности тематики исследований. Эталонной моделью для изучения закономерностей пренаталыюго онтогенеза является куриный эмбрион, благодаря исследованию которого раскрыты особенности гисто- и органогенеза, изучены механизмы онтогенеза, получены данные о функциональных преобразованиях (Рагозина М.Н., 1961; Задарновская Г.Ф., 1966; Рольник В.В., 1968; Токин Б.П., 1970; Шмальгаузен И.И., 1984; Бессарабов Б.Ф., 2006; Трунова А.П., 2008; Черников C.B., 2012).

Опираясь на принцип «минимальных различий» на практике чаще экспериментальные группы формируются с учетом традиционных критериев: породность, идентичность условий инкубации, размер и масса яиц, целостность и окраска скорлупы, вероятность инфицирования и пр. (Сахер А-А.И., 2001; Долгорукова A.M., 2007; Голубцова В.А., 2008; Хохлов Р.Ю., 2009). Однако в биологии уже доказано, что одним из определяющих факторов, который потенциально может изменить результаты эксперимента, является пол (Маляренко Т.Н., Кураев Г.В, Маляренко Ю.Е., 2000; Таов И.Х., 2004; Арешидзе Д.А., Тимченко Л.Д., Сивакова H.H. и др., 2006; Тагиров М.Т., 2010). Так, признано, что половая дифференцировка обеспечивается половыми гормонами - стероидами, которые имеются как у мужских, так и у женских особей, но содержатся у них в различных пропорциях. Однако информация о количестве этих гормонов у разнополых куриных эмбрионов в литературе практически отсутствует.

При экспериментах в постнаталыюм онтогенезе учет половых различий давно является одним из традиционно используемых критериев отбора животных в экспериментальную группу. Однако, в пренатальном периоде развития изучение показателей у разнополых особей очень сложный, трудоемкий и не всегда выполнимый процесс, связанный с этическими и методическими проблемами. А что касается куриных эмбрионов, то следует отметить отсутствие четких рекомендаций по достоверному определению их пола.

Имеются единичные данные по изучению отдельных показателей у разнополых куриных зародышей в конкретные сутки развития (Шредер В.Н., 1965; Гром A.M., 1966; Рольник В.В., 1968; Будиков О.М., 1971). В то же время подавляющее количество разносторонних исследований онтогенеза куриного эмбриона проведены без учета половой дифференцировки.

В свете изложенного представляет интерес изучение у разнополых эмбрионов кур ряда параметров, которые общепризнанны в качестве информативных для оценки интенсивности развития организма в пренатальном периоде онтогенеза. К их числу относится уровень апоптоза и альфа-фетопротеина, интегративно и ярко демонстрирующие интенсивность формообразовательных процессов в развивающемся эмбрионе (Шмагель К.В., Черешнев В.А., 2002).

Важнейшим критерием нормального развития является степень сформированности скелета и физического развития, полноценность которых тесно связана с гормональным фоном организма, в том числе уровнем половых гормонов (Фисинин В.И., Журавлёв И.В., Ай-динян Т.Г., 1990). К сожалению, для куриного эмбриона, данные о размерах отдельных костей единичны, устаревшие и не отражают посуточной динамики в пренатальном онтогенезе, а для разнополых особей вообще отсутствуют. Отсутствуют также сведения о половых отличиях индексов физического развития.

В связи с вышеизложенным получение новых сведений о морфофункциональных особенностях куриного эмбриона, в том числе в соответствии с его половой дифференцировкой, представляется крайне актуальным.

Цель: изучить динамику морфофункциональных показателей куриных эмбрионов разного пола в процессе развития.

Задачи:

1) на основе оценки эффективности различных методов дифференцировки по полу сформировать экспериментальные группы куриных эмбрионов с учетом половых различий;

2) уточнить уровень половых гормонов у разнополых куриных эмбрионов в процессе развития;

3) исследовать морфометрические показатели роста и развития куриных эмбрионов разного пола и оценить их физическое развитие;

4) изучить закономерности изменчивости размеров осевого скелета и костей конечностей в пренатальном онтогенезе кур в зависимости от половой принадлежности;

5) исследовать динамику апоптического индекса и апьфа-фетопротеина у куриных эмбрионов-самцов и эмбрионов-самок.

Научная новизна. Впервые в пренатальном онтогенезе кур проведена сравнительная оценка методов отбора эмбрионов в экспериментальную группу (взвешивание яиц перед инкубацией, визуальная оценка половых желез) с указанием эффективности каждого из методов.

Выявлены закономерности динамики уровня тестостерона, эстрадиола, апоптоза и альфа-фетопротеина, морфометрических и остеометрических параметров разнополых куриных зародышей в онтогенезе. Для куриных зародышей обоего пола кросса Родонит 3 установлены нормативные значения перечисленных критериев в процессе инкубации.

Впервые установлены достоверные различия длины осевого скелета, грудной и тазовой конечностей у разнополых куриных эмбрионов в процессе инкубации. В пренатальном онтогенезе разнополых кур выявлена слабая коррелятивная взаимосвязь между апоптическим индексом и уровнем альфа-фетопротеина. Доказано, что ген р53, отвечающий за физиологическую гибель клеток присутствует у куриных эмбрионов обоего пола на протяжении инкубации.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты исследований динамики апоптоза, альфа-фетопротеина, половых гормонов, а также показателей физического развития и размеров костей грудной и тазовой конечностей куриных эмбрионов обоего пола в процессе инкубации, углубляют и расширяют представления о морфофункциональных особенностях куриного эмбриона в онтогенезе и могут быть использованы в фундаментальных, хозяйственных, и биотехнологических целях.

Данные о динамике тестостерона, эстрадиола и альфа-фетопротеина могут быть учтены при разработке технологии и получении биологически активных субстанций из эмбриональных тканей кур и препаратов на их основе, в том числе, гормон-содержащих и АФП-содержащих.

Результаты работы использованы в процессе патентного поиска по заявке № 2013144527 от 03.10.2013 г «Поликомпонентный мелатонинсодержащий препарат для регенерации тканей ротовой полости и способ его получения».

Результаты исследования внедрены и используются в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторных занятий по дисциплине «Биология размножения и развития» Северо-Кавказского федерального университета; по дисциплине «Анатомия и физиология» Ставропольского государственного педагогического института; по дисциплинам «Анатомия животных», «Цитология, гистология и эмбриология», «Физиология и этология животных» Донского государственного аграрного университета.

Материалы диссертации внедрены и используются в научно-исследовательской деятельности отдела инкубации Всероссийского научно-исследовательского и технологического института птицеводства г. Сергиев-Посад; проблемной научно-исследовательской лаборатории экспериментальной иммуноморфологии, иммунопатологии и иммунобиотехнологии НИИ прикладных биотехнологий Института живых систем Северо-Кавказского федерального университета.

Полученные результаты внедрены и используются в практической деятельности ООО «Ставропольский птицекомплекс», ООО НПО «БиоМодуль» г. Ставрополь, а также при производстве косметических средств из эмбриональных тканей птиц в производственную деятельность ООО НПО «СайТЭК» г. Ставрополь.

Результаты морфофункциональных показателей разнополых эмбрионов кур использованы в базовой части государственного задания №2014/216 по теме: «Разработка технологий комплексных ветеринарных биопрепаратов на основе экологически чистого регионального сырья животного, растительного и микробного происхождения» в 2014 году.

Методология и методы исследования. Методологическая основа представлена принципиально новым подходом к организации эксперимента при работе с куриным эмбрионом, заключающимся в целесообразности формирования экспериментальных групп эмбрионов с учетом половых различий, что обеспечивает достоверность полученных результатов. В работе применен комплекс методов: морфометрические, остеометрические, метод индексов, специальные методы обработки эмбриона для оценки костного остова, выявления уровня апоптоза и АФП, а также методы анализа, сопоставления и статистики.

Положения, выносимые на защиту:

1) формирование экспериментальных групп куриных эмбрионов с учетом пола обеспечивает минимальный диапазон стандартного отклонения средней (m) исследуемых показателей в сравнении с группой эмбрионов, сформированной без учета половых различий;

2) динамика всех морфометрических, остеометрических показателей, индексов физического развития, уровня эстрадиола, тестостерона, апоптоза, АФП имеет особенности в зависимости от половой принадлежности эмбрионов кур;

3) уровень апоптоза, АФП, половых гормонов, индексы физического развития, длина осевого скелета и костей грудной и тазовой конечностей у разнополых куриных эмбрионов на протяжении всего пренатального онтогенеза отличается.

Степень достоверности. Представленные в работе исследования выполнены в лабораторных условиях на откалиброванном сертифицированном оборудовании с использованием стандартизированных реактивов и общепринятых методик. В работе использовано 6180 куриных эмбрионов одного кросса - Родонит 3. Полученные результаты обработаны с помощью программы Primer of Biostatistics (Version 4.03).

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на VI Международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (г. Астрахань, 2008), XIII Международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий» (г. Новосибирск, 2008), научно-методических конференциях «Университетская наука - региону» (г. Ставрополь, 2011-2013), научной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр ЮНЦ РАН (г. Ростов-на-Дону, 2009, 2010, 2011), при этом доклады были отмечены почетными грамотами первой и третьей степени; международных научно-практических конференциях «Современные проблемы теории и практики инновационного развития АПК» (г. Нальчик, 2011), IV и V «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (г. Ростов-на-Дону, 2011, 2013), где доклады были отмечены дипломами третьей степени, а так же на XI межвузовской научно-практической конференции «Молодежь и образование XXI века» (г. Ставрополь, 2014).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 6 из них изданы в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 140 страницах компьютерного набора, иллюстрирована 22 рисунками, в том числе 10 микрофотографиями, 13 диаграммами, 13 таблицами. Работа состоит из введения, глав обзора литературы, организации этапов работы и собственных исследований, а также заключения, выводов, практических рекомендаций, списка сокращений и условных обозначений и приложения. Список использованной литературы содержит 235 источника, в том числе - 57 зарубежных авторов.

ОРГАНИЗАЦИЯ ЭТАПОВ РАБОТЫ

Исследования по диссертационной работе проводились в период с 2008 по 2014 гг. на кафедре ботаники, зоологии и общей биологии, на базе проблемной научно-исследовательской лаборатории экспериментальной иммуноморфологии, иммунопатологии и иммунобиотехнологии НИИ прикладных биотехнологий Института живых систем СевероКавказского федерального университета.

Все эксперименты проводились в соответствии с правилами защиты позвоночных животных, используемых в научных целях.

Материалом для исследований служили эмбрионы кур на разных этапах развития, количество которых в эксперименте за весь период работы составило 6180. Выращивание эмбрионов, используемых в процессе работы, осуществляли в инкубаторе ИЛБ-0,5 (Россия) с автоматическим регулированием параметров инкубации. Ежедневные манипуляции с куриными эмбрионами осуществлялись в одно и то же время суток.

На всех этапах работы перед инкубацией формировали поэтапно партии оплодотворенных яиц по принципу максимальной аналогии, учитывая следующие требования:

- генетическое происхождение птицы, для чего использовали сертифицированные оплодотворенные яйца кур яичного направления продуктивности кросса Родонит 3 (родительская форма породы белый леггорн), полученные на Кумской птицефабрике;

- идентичность формы, целостность, цвет, внутренняя топография внезародышевых структур яйца, для чего до инкубации яйца оценивали по внешним признакам визуально и с помощью овоскопа ПКЯ-10 (Россия); яйца отбирали правильной формы, без видимых дефектов, шероховатость отсутствовала, «мраморность» скорлупы слабовыраженная, пуга расположена на тупом конце яйца;

- половая принадлежность, для чего разделили куриные эмбрионы по полу двумя взаимодополняющими методами.

Первый метод разделения по полу - доинкубационное взвешивание каждого яйца с учетом рекомендаций В.В. Рольник (1968). Взвешивание осуществляли с помощью весов ВЛТЭ-150 (Россия). Укомплектованные группы куриных яиц с зародышами разного пола помещали в инкубатор, где инкубировали с 8-х по 19-е сутки пренатального развития.

Второй метод разделения по полу заключался в отборе яиц, на каждые из указанных суток, для препаровки с целью визуальной оценки половых желез (семенники, яичники). Дифференцировку половых желез проводили под стереомикроскопом МС-2 фирмы JIOMO.

Всех эмбрионов на разных этапах работы делили на три части, в одной из которых проводили морфометрию и расчет индексов физического развития. Из этих же эмбрионов выборочно формировали подгруппы эмбрионов, у которых определи уровень половых гормонов. У эмбрионов второй части проводили оценку скелета. В третьей части эмбрионов определяли уровень апоптоза и АФП, ген р53. При этом каждая часть была представлена экспериментальными группами разнополых эмбрионов и группами эмбрионов, не разделенными по половому признаку, сформированными на различных этапах исследования в соответствие с поставленными задачами.

Морфометрические исследования куриных эмбрионов разного пола осуществляли на 8-, 9-, 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17-, 18- и 19-е сутки инкубации.

Массу тела измеряли с помощью электронных весов ВЛТЭ-150 (Россия). Длину тела и окружность грудной клетки измеряли при помощи сантиметровой ленты и штангенциркуля. За длину тела эмбриона принимали размер от клюва до конца хвоста.

Индексы физического развития: Кетле I, Кетле II и ИГМР рассчитывали по адаптированным к куриному эмбриону формулам, изложенным в работах А.П. Труновой (2008), C.B. Черникова (2012).

Уровень тестостерона и эстрадиола в супернатанте зародышей определяли методом ИФА на анализаторе марки Stat fax 303 Plus (США).

Особенности формирования костной системы зародышей исследовали с 12-х по 19-е сутки инкубации по методике Доусона, модифицированной в отделе эмбриологии НИИЭМ АМН СССР (Дыбан А.П., и др., 1970). Тотальные препараты разнополых куриных эмбрионов изучали под настольной лупой ПРОТЕХ 8608D-D Х8 (Китай) при увеличении в 8 раз. Измеряли общую длину скелета эмбрионов при помощи сантиметровой ленты и длину костей грудной и тазовой конечностей с использованием электронного штангенциркуля ЩЦЦ-110-250 0,01 (Россия).

Вычисление абсолютной и относительной разницы проводили в соответствие с рекомендациями, изложенными в работах И.И. Шмальгаузена (1984); А.П. Труновой (2008).

Изучение апоптоза проводилось путем расчета апоптического индекса (АИ) M.D. Logsdon, et. al. (1999). Подсчет количества апоптических клеток в гомогенатах разнополых куриных зародышей осуществляли по методу A.A. Абдувалиева, М.С. Гильдиевой (2006).

Выявление гена р53 осуществлялось в гомогенате тканей куриных эмбрионов мужского и женского пола с 8-х по 19-е сутки инкубации. Методика складывалась из гомогенизации эмбрионов, центрифугирования гомогенатов с использованием центрифуги «Hettich» Universal 320 (Германия) при 4000 об/с в течение 10 минут и замораживания проб при температуре минус 18...20°С в морозильной камере. При транспортировке замороженных проб использовался теплоизолирующий контейнер из пенопласта, в который были помещены охлаждающие элементы.

Все последующие манипуляции выполнялись в НИИ биологии Южного федерального университета (г. Ростов-на-Дону). Выделение ДНК проводили двумя способами (сорбентный и термокоагуляционный) из супернатанта зародышей кур с использованием наборов реагентов фирмы «Литех». Амплификацию фрагментов ДНК проводили методом ПЦР с использованием многоканального амплификатора «Терцик» (Россия). Детекцию продуктов амплификации осуществляли методом горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле, с применением бромистого этидия. Полученный гель помещали на фильтр трансиллюминатора Gel Doc (Bio Rad) (США).

Уровень АФП определяли методом ИФА на приборе Stat fax 303 Plus (США), с учетом инструкции по использованию набора реагентов АФП-ИФА-БЕСТ (Россия).

Результаты экспериментов подвергали вариационно-статистической обработке с использованием программы Primer of Biostatistics (Version 4.03).

Микрофотографирование осуществлялось при помощи комплекса визуализации изображения, состоящего из микроскопа «Микмед-2» (Россия) и цифровой фотокамеры «Olympus-5060» (Япония). Выбор методов микроскопирования осуществлялся согласно рекомендациям, изложенным в учебном пособии Л.Д. Тимченко, В.Н. Вакулина (2005). Фиксация результатов исследования осуществлялась при помощи цифровой фотокамеры «SONY DSC-W50» (Китай).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИИ

Сравнительная оценка эффективности разделения куриных эмбрионов по полу методами взвешивания яиц перед инкубацией и визуальной оценки гонад

В процессе работы по разделению разнополых эмбрионов вначале отобрали 2100 яиц, которые поделили по массе (первый метод). Установлено, что средняя масса одного яйца составила 63,3±0,12 г. При этом выявлено 1134 яйца (54%), масса которых, являлась ниже средней, то есть с условно женскими куриными эмбрионами и 966 яиц (46%) выше средней массы - с предположительно мужскими эмбрионами.

На этапе визуальной оценки половых желез, с 8-х по 19-е сутки инкубации, проводили вскрытие эмбрионов, условно разделенных по полу первым методом.

В результате установлено, что из 1134 эмбрионов, 42 эмбриона (3,7%) подверглись выбраковке, которая приходилась на предплодный период пренаталыюго онтогенеза кур. В итоге количество эмбрионов-самок с учетом выбраковки в эксперименте составило 1092.

В процессе использования указанных методов имеются несовпадения результатов. Так, при вскрытии 1092 эмбрионов, которые в соответствии с первым методом считались самками, визуально установлено, что с 8-х по 12-е дни инкубации, 62 эмбриона являлись эмбрионами-самцами, что на 5,66% не совпало с результатами, полученными первым методом. При этом больше половины несовпадений (45 эмбрионов) приходиться на 8-, 9- и 10-е сутки развития. Это подтверждает ошибку при использовании метода доинкубационного взвешивания яиц. В то время как с 13-х но 19-е сутки развития КЭ несовпадений не обнаружено, следовательно, вероятность ошибки исключена.

В группе эмбрионов-самцов (966), разделенных по полу первым методом, 24 эмбриона (2,5%) подверглись выбраковке. Поэтому итоговое количество эмбрионов, которые использованы в эксперименте, заключающемся в визуальной оценке гонад, составило 942. После препарирования на разные сроки инкубации эмбрионов, условно принятых за мужские, и визуальной оценке гонад, установлено, что семь из них являлись эмбрионами-самками, что на 0,7% не совпало с результатами, полученными первым методом.

В результате перегруппировки по половому признаку в процессе взаимодополняющего использования двух описанных методов, установлено, что от общего числа зародышей (2100), выбранных изначально для эксперимента, в итоге выявлено 1037 эмбрионов женского пола и 997 - мужских эмбрионов, что в процентном соотношении составляет 49,4% и 47,4% соответственно. Благодаря этому сформированы с высокой степенью достоверности группы разнополых куриных эмбрионов, на которых и проводилась серия дальнейших исследований согласно поставленным задачам.

Сопоставляя эффективность метода визуальной оценки гонад и метода взвешивания инкубационных яиц с целью половой дифференцировки эмбрионов, можно отметить достаточно низкий процент несовпадений полученных результатов, суммарно по обеим половозрастным группам, разделенным в процессе эксперимента, не превышает 6,36%.

Таким образом, для разделения куриных эмбрионов по полу возможно самостоятельное использование обоих методов. Однако, учитывая вероятность наличия несовпадений, для исключения ошибки, предпочтительно использование указанных методов в комплексе.

Уровень половых гормонов (тестостерон, эстраднол) у экспериментальных куриных эмбрионов в онтогенезе

Установлено, что с 8-х по 19-е сутки инкубации тестостерон в подгруппе эмбрионов-^1 (таблица 1) и эстраднол в подгруппе эмбрионов-9 выявляются методом ИФА.

У эмбрионов-самцов уровень тестостерона с восьмых по девятнадцатые сутки прена-тального онтогенеза достоверно увеличивается с 2,61±0,006 нмоль/л до 6,88±0,006 нмоль/л. Минимальная концентрация отмечена на 8-е сутки, а максимальная - на 19-е сутки развития.

При посуточном сравнении уровня тестостерона в подгруппе мужских эмбрионов зафиксировано, что различие значения на 9-е сутки в сравнении с предыдущими сутками инкубации недостоверно. В период с 10-х по 19-е сутки инкубации наблюдается посуточная достоверная разница уровня тестостерона в подгруппе.

В группе куриных эмбрионов, сформированной без учета пола, на протяжении прена-талыюго онтогенеза, средние значения тестостерона характеризуются посуточной сменой возрастания и убывания. При этом на 15-, 16- и 17-е дни в этой группе отмечены достоверные различия уровня тестостерона в сравнении с предыдущими сутками.

Диапазон статистических различий (т) в группе, где учет пола не осуществлялся на каждые сутки инкубации значительно шире, чем в подгруппе эмбрионов-самцов.

При сравнении уровня тестостерона в двух группах куриных эмбрионов выявлено, что в подгруппе эмбрионов-самцов и в группе эмбрионов без учета половых различий средние значения количества гормона показателя на каждые изучаемые дни развития зародышей отличаются (таблица 1).

В целом динамика тестостерона изменчива и различна в зависимости от этапов прена-тального онтогенеза в группах куриных эмбрионов-самцов и сформированной без учета пола. Зафиксировано, что с 8-х по 11-е, с 12-х по 13-е, с 14-х по 16-е и с 18-х по 19-е сутки развития, динамика исследуемого показателя в двух указанных выше группах куриных эмбрионов совпадает. С 11-х по 12-е и с 13-х по 14-е сутки инкубации динамика показателя противоположна, а с 16-х по 18-е дни развития динамика гормона в обеих группах зародышей имеет значительный разнонаправленный характер.

У эмбрионов-самок уровень эсградиола достоверно увеличивается в процессе пренаталь-ного онтогенеза с 27,10±0,14 pg/мл (8-е сутки инкубации) до 59,70±0,06 pg/мл (19-е сутки). Эта значения являются минимальным и максимальным значениями показателя (таблица 2).

Достоверная посуточная разница уровня гормона (эстрадиол по отношению к предыдущим суткам) в подгруппе эмбрионов-самок установлена на 10-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17-, 18- и 19-е сутки.

Таблица 1 - Средние значения уровня тестостерона на протяжении эмбриогенеза в подгруппе куриных эмбрионов-самцов в сравнении с группой эмбрионов, сформированной без учета половых различий (М±ш)

Сутки развития Уровень тестостерона, нмоль/л

Куриные эмбрионы - S, п = 30 Группа куриных эмбрионов, сформированная без учета половых различий, п = 30

8 2,61 ±0,006 2,42±0,1

9 2,65±0,01 2,64±0,08

10 3,28±0,008* 2,83±0,29

11 3,73±0,005*' 3,16±0,16

12 3,91±0,003*' 2,92±0,18

13 4,15±0,004*' 3,13±0,18

14 4,49±0,003*' 2,67±0,16

15 5,01±0,004*' 4,62±0,09*

16 5,85±0,006*' 5,67±0,08*

17 6,17±0,003*" 2,77±0,22*

18 6.36±0,003** 2,66±0,23

19 6,88±0,006*' 3,33±0,37

п - количество эмбрионов на каждые исследуемые сутки инкубации; * (Р <0,05) - сравнение с предыдущими сутками инкубации;

" (Р <0,05) -сравнение с группой КЭ, сформированной без учета половых различий.

Таблица 2 - Средние значения уровня эстрадиола на протяжении пренатального онтогенеза в подгруппе куриных эмбрионов-самок в сравнении с группой эмбрионов, сформированной без учета половых различий (М±ш)

Сутки развития Уровень эстрадиола, pg/мл

Куриные эмбрионы -?> п = 30 Группа куриных эмбрионов, сформированная без учета половых различий, п = 30

8 27,10±0,14 25,82 ±0,76

9 27,30±0,04" 26,51±0,15

10 30,31±0,03*' 15,11±1,14*

11 30,20±0,04" 13,41±1,31

12 34,90±0,03*' 17,70±2,18

13 33,41±0,03*' 22,32±1,94

14 35,52±0,05*' 18,04±1,11

15 41,70±0,04*' 33,70±1,87*

16 42,80±0,04*" 17,52±1,72*

17 45,61±0,04*' 21,81±2,15

18 52,41±0,05*' 28,91±3,26

19 59,70±0,06*" 22,21 ±2.42

п - количество эмбрионов на каждые исследуемые сутки инкубации; * (Р <0,05) - сравнение с предыдущими сутками инкубации; " (Р <0,05) - сравнение с группой КЭ без учета половых различий.

В группе куриных эмбрионов без учета половых различий, уровень эстрадиола с 8-х по19-е сутки пренатального онтогенеза имеет посуточный волнообразный характер, со сменой пиков подъема и пиков спада. В этой группе, по сравнению с подгруппой эмбрионов, где

главным критерием отбора особей являлся учет пола, на каждые сутки инкубации отмечен широкий разброс статистических различий уровня гормона.

В группе куриных эмбрионов, сформированной без учета пола, на 10-, 15- и 16-е сутки пренатального онтогенеза, в сравнении с предыдущими сутками инкубации, зарегистрированы достоверные изменения уровня эстрадиола.

На каждые исследуемые сутки инкубации средние значения уровня эстрадиола отличаются в подгруппе женских куриных эмбрионов в сравнении с группой, сформированной без учета половых различий зародышей. При этом достоверная разница уровня эстрадиола зарегистрирована на все исследуемые сутки инкубации, за исключением восьмых, где различия недостоверны.

При анализе уровня эстрадиола установлено, что в подгруппе женских эмбрионов уровень гормона отличается в зависимости от суток инкубации в сравнении с группой эмбрионов, сформированной без учета пола. Так, с 8-х по 9-е, с 11-х по 12-е, с 14-х по 15-е и с 16-х по 18-е сутки развития, динамика исследуемого показателя в двух группах куриных эмбрионов совпадает. А в интервалах между 9-ми и 11-ми, 12-ми и 14-ми, 15-ми и 16-ми, 18-ми и 19-ми сутками инкубации динамика уровня эстрадиола в обеих группах противоположна.

Дополнительно уделено внимание исследованию уровня гормонов эмбрионов (п=69), у которых данные об их половой принадлежности не совпали при определении методом визуальной оценки гонад и методом доинкубационного взвешивания яиц. При этом на 8-, 9-, 10-, 11- и 12-е сроки пренатального онтогенеза у каждого в отдельности мужского и женского эмбриона определяли уровень противоположного гормона (эстрадиол и тестостерон соответственно). Проведенные исследования позволили подтвердить достоверность вышеуказанных методов разделения по полу КЭ в процессе эксперимента.

Таким образом, с помощью ИФА установлены средние нормативные показатели предела онтогенетической изменчивости уровня тестостерона и эстрадиола у разнополых куриных эмбрионов с 8-х по 19-е сутки инкубации.

Зарегистрированы достоверно отличающиеся результаты исследований уровня эстрадиола с 9-х по 19-е сутки инкубации в подгруппе женских эмбрионов и уровня тестостерона с 11-х по 19-е сроки развития в подгруппе мужских эмбрионов в сравнении с уровнем одноименных показателей групп эмбрионов, пол которых не учитывался.

На разных этапах инкубации четко зафиксирован разнонаправленный характер динамики каждого исследуемого гормона в сравнении с группой эмбрионов, сформированной без учета половых различий.

Оценка физического развития куриных эмбрионов-самцов и эмбрионов-самок

Основными критериями, характеризующими пропорциональность и гармоничность физического развития, являются масса, длина тела и окружность грудной клетки, изменение которых зависит от многих факторов, в том числе и пола. Однако количественных данных в соответствии со спектром указанных критериев для разнополых куриных зародышей на протяжении инкубации недостаточно, а для эмбрионов кросса «Родонит 3» вообще отсутствуют.

Средние значения абсолютной массы тела, длины и окружности грудной клетки в зависимости от пола куриных эмбрионов на все сутки инкубации достоверно отличаются с преобладанием значений каждого указанного показателя в группе мужских эмбрионов на всех этапах пренатального онтогенеза. При сравнении каждой однополой группы эмбрионов, с группой эмбрионов, сформированной без учета половых различий, значения массы, длины и окружности грудной клетки имеют достоверные отличия на отдельные этапы развития.

Установлено, что с 8-х по 19-е сутки инкубации во всех трех группах куриных эмбрионов (эмбрионов-самцов, эмбрионов-самок, без учета половых различий) масса, длина тела и окружность грудной клетки достоверно возрастает, а их динамика имеет линейный характер.

Выявлен минимальный разлет стандартного отклонения средней (ш) значений всех указанных показателей на каждые сутки инкубации в группах разнополых куриных эмбрионов по сравнению с эмбрионами в группе, пол которых не учитывался.

На каждые сутки инкубации в сравнении с предыдущими сутками во всех трех группах куриных эмбрионов масса, длина и ОКГ достоверно отличается. Исключение составляет ОГК в группе эмбрионов, сформированной без учета пола на 14-е сутки инкубации, когда различие с предыдущими сутками недостоверно.

Полученные значения морфометрических показателей позволяют провести индексацию физического развития разнополых куриных эмбрионов в процессе инкубации с помощью Кетле I, Кетле II и индекса гармоничного морфологического развития в сравнении с группой эмбрионов, сформированной без учета пола. Индексы физического развития в трех группах куриных эмбрионов представлены в таблице 3.

На протяжении инкубации зафиксировано, что индексы физического развития во всех трех группах куриных эмбрионов отличаются и характеризуются конкретными числовыми значениями. Установлено, что разнополые куриные эмбрионы на протяжении инкубации развиваются по-разному, о чем свидетельствует полученные результаты оценки массы, линейных размеров тела и индексов физического развития. При этом у эмбрионов-самцов и эмбрионов-самок выявлены общие черты, проявляющиеся в возрастании с 8-х по 19-е сутки инкубации массы, длины, окружности грудной клетки и индекса Кетле I, значения которых на протяжении эксперимента достоверно отличаются между группами. Еще одной общей чертой является то, что в группах обоего пола зафиксирован минимальный разрыв статистических различий при исследовании всех изученных критериев развития по сравнению с группой эмбрионов, сформированной без учета половых различий. Имеются и особенности в развитии разнополых КЭ, которые отражены в разнонаправленном характере посуточного прироста Кетле II для эмбрионов-самцов и эмбрионов-самок. Также установлено, что ИГМР достоверно не изменяется на протяжении эксперимента в двух разнополых группах зародышей, что свидетельствует об одинаковом уровне гармоничности мужских и женских куриных эмбрионов.

При сравнении изучаемых критериев каждой однополой группы эмбрионов с одноименными критериями в группе эмбрионов, сформированной без учета пола, установлено, что на большинство суток исследования имеющиеся различия достоверны. Исключение составляет ИГМР, который в каждой однополой группе эмбрионов на все сутки исследования достоверно не отличается от значений этого критерия в группе эмбрионов, сформированной без учета пола.

Морфометрпческие показатели осевого скелета и костей грудной и тазовой

конечностей у куриных эмбрионов в зависимости от половой принадлежности

Для эмбрионов-самцов, эмбрионов-самок и эмбрионов в группе без учета половых различий определены средние значения длины осевого и периферического скелета (плечевая, лучевая, локтевая, пястная третья кость, бедренная, большеберцово-заплюсневая, цевка) с 12-х по 19-е сутки инкубации. Морфометрию осуществляли на цельных и фрагментиро-ванных тотальных препаратах, образцы которых представлены на рисунках 1, 2, 3. Между абсолютными величинами длины костей осевого скелета и периферического скелета (таблица 4) разнополых эмбрионов, в онтогенезе выявлены достоверные, незакономерно изменчивые отличия. Отмечено четкое превышение абсолютных значений измеряемых костей у эмбрионов-самцов по сравнению с эмбрионами-самками на все сутки инкубации.

В группах эмбрионов-с? и эмбрионов-? диапазон статистических различий (гп) для всех изученных костей скелета на каждые сутки инкубации ниже по сравнению с эмбрионами в группе, сформированной без учета половых различий.

Таблица 3 - Индексы физического развития у куриных эмбрионов обоего пола в сравнении с группой эмбрионов,

сформированной без учета половых различий

Сутки инкубации КЭ-$,п=60; КЭ-с5,п=60 Кетле I Кетле I в группе КЭ, сформированной без учета пола, п=60 Кетле 11 Кетле II в группе КЭ без учета пола, п=60 ИГМР ИГМР в группе КЭ без учета пола, п=60

8 с? 0,418±0,001" 0,336±0,014 0,178±0,001* 0,165±0,005 104,7±0,09 104,7±0,11

0,384 ±0,002" 0,193±0,029 104,9±0,18

9 в 0,520±0,001*" 0,419±0.013*** 0,199±0,001* 0,208±0,005* 102,2±0,27* 101,9±0,34***

2 0,507±0,001**' 0,233±0,025 101,6±0,19**

10 с? 0,620±0,002*" 0,581±0,016*** 0,185±0,0006* А' 0,171 ±0,002* 103,1 ±0,25* 103,2±0,49***

0,610±0,002** 0,204±0,0006' 103,3±0,21**

11 с? 0,828±0,002*А 0,842±0,022*** 0,220±0,0009*" 0,246±0,006* 103,9±0,27* 103,7±0,52

2 0,819±0,002** 0,238±0,0008** 101,6±1,36

12 с? 0,959±0,007* * 0,953±0,020*** 0,191±0,001*А" 0,206±0,007* 101,4±0,22* 101,4±0,74***

2 1,015±0,001**' 0,237±0,001" 101,2±0,21

13 с? 1,181±0,0009*" 1,134±0,012*** 0,213±0,001*А" 0,236±0,008* 100,1±1,34 100,9±1,52

2 1,171±0,001**" 0,226±0,0007** 101,4±0,18

14 6 1,509±0,001*" 1,408±0,018*** 0,256±0,0008*" 0,24040,007 99,54±0,56 99,56±0,91

2 1,487±0,001**" 0,270±0,0008**" 99,26±0,46**

15 с? 1,629±0,001*" 1,568±0,014*** 0,243±0,0007*А 0,299±0,038 99,25±0,54 99,19±0,81

2 1,635±0,001**" 0,264±0,0006** 99,17±0,54

16 с? 1,938±0,012*ж" 2,006±0,021*** 0,265±0,0007*А" 0,287±0,006 99,83±0,64 99,99±1,106

2 1,978±0,001** 0,279±0,0008** 99,09±0,66

17 с? 2,375±0,001*А' 2,289±0,016*** 0,309±0,0007*А 0,302±0,007 100,9±0,17 99,86±1,178

2 2,354±0,001**" 0,323±0,002**" 99,59±0,44

18 <? 2,898±0,012*А 2,879±0,035*** 0,365±0,0006*А 0,368±0,007* 99,60±0,45* 99,54±1,039

2 2,979±0,001**" 0,382±0,0009**" 99,42±0,46

19 с? 3,338±0,001*" 3,186±0,045*** 0,391±0,0009* А 0,404±0,007* 99,70±0,54 99,31±1,631

2 3,377±0,009**' 0,415±0,001** 99,04±0,53

п - количество эмбрионов на каждые исследуемые сутки инкубации; * (Р <0,05) -в сравнении с предыдущими сутками инкубации (эмбрионы-самцы), ** (Р <0,05) - в сравнении с предыдущими сутками инкубации (эмбрионы-самки); ***(Р <0,05) - с предыдущими сутками инкубации (группа без учета пола); (Р <0,05) -сравнение двух разнополых групп КЭ;" (Р <0,05) - сравнение каждой однополой группы с группой КЭ, сформированной без учета половых различий.

При сравнении абсолютных величин изучаемых костей разнополых куриных эмбрионов с аналогичными показателями костей в группе эмбрионов, пол которых не дифференцировался, на каждые сутки инкубации установлены в разной степени выраженные различия.

В то же время по всем исследуемым костям динамика абсолютной разницы между значениями у куриных эмбрионов-с? и эмбрионов-? на всем протяжении исследования незакономерна, не постоянна и характеризуется числовыми максимумами и минимумами в разные сутки инкубации.

Рисунок 1 - Общий вид тотального препарата скелета свободной грудной конечности куриного эмбриона-самца на 15-е сутки инкубации. Окраска ализарином красным.

Рисунок 2 - Общий вид тотального препарата скелета свободной тазовой конечности куриного эмбриона-самки на 15-е сутки инкубации. Окраска ализарином красным.

Рисунок 3 - Тотальные препараты скелета куриного эмбриона-самца (слева), эмбриона-самки (справа) на 16-е сутки инкубации. Окраска ализарином красным.

Критерий относительной разницы длины всех исследуемых костей на каждые изучаемые сутки исследования между эмбрионами разного пола для различных костей не одинаков, незакономерно изменчив и представлен его числовыми максимумами и минимумами. При этом относительный критерий является ярким подтверждением преобладания размера всех указанных костей самцов, по сравнению с костями самок.

Для осевого скелета и большеберцово-заплюсневой кости относительное различие длины этих костей у самцов по сравнению с самками закономерно возрастает с 12-х по 14-е сутки развития. При этом числовые максимумы (в 1,155; 1,346 раза соответственно) разницы показателя совпали, и приходятся на 14-е сутки развития.

Для костей грудной конечности, кроме пястной третьей кости, при сравнении разнополых эмбрионов, зафиксировано закономерное нарастание относительной разницы их длины с 12-х по 15-е сутки инкубации.

Таблица 4 - Средние значения линейных размеров костей грудной и тазовой конечностей разнополых куриных эмбрионов в сравнении с группой КЭ, сформированной без учета половых различий в процессе развития

Сутк и разви тия Группы КЭ: эмбрионы -$; эмбрионы- (5; без учета пола, п=50 Ц осевого скелета, мм Ц плечевой кости, мм и лучевой кости, мм Ь, локтевой кости, мм Ц пястной третьей кости, мм ь, бедренной кости, мм и большеберцов 0- заплюсневой. кости, мм и цевки, мм

12 9 81.Ш0.331*' 4,04±0,04* 3.91±0,07* 3.31±0,05* 2,78±0,097*' 5,92±0,142* 8,06±0,042*' 5.37±0.08*'

в 86.21±0,371' 4,53±0,03" 4,43±0,03" 4,08±0,04" 3,71±0,03' 6.57±0.047' 9,44±0,03' 6,45±0,05"

без учета пола 87.93±0.665 3,97±0,11 4,08±0,11 3.58±0,16 3,11±0,10 6,05±0,13 8,991:0,19 6,06±0,17

13 9 83,33±0.327*' 4.35±0,09*' 4,19±0,04* 3,65±0,03*' 3,3±0,03*' 6,4ЙЮ,13*" 8,73±0,14*' 6,18±0,02*'

3 92,63±0,415' 5,03±0,14 4,73±0,03" 4,45±0,03 4,31 ±0,02" 7,15±0,04" 11,05±0,24' 7,05±0,03"

без учета пола 88.05±0,568 4,71±0,11 4,32±0,13 4,06±0,14 4,09±0,10 6,91±0,11 9,74±0,13 6,77±0,11

14 9 87,07±0,44*" 4,88±0,05* 4.63±0,06* 4,23±0,03*" 4,21±0,03*' 6,6&±0,08*' 9,7±0,05*' 6,52±0,02*'

3 100.6±0,432' 5,78±0,11" 5.55±0,03 5,16±0,04 5,1±0,02" 7.61±0,14 13,06±0,05' 7,41±0,03

без учета пола 90.95±0,201 5,09±0,16 5.26±0,13 4,93±0,18 4.53±0,12 7.30±0,12 12,53±0,11 7,05±0.21

15 96,11±0,457* 5.61±0,03*' 5,43±0,03*" 5,1±0,03*' 5,03±0.03*" 7.5±0,09*" 12,63±0,07*' 7,31 ±0,04*"

с? 10г2±0.818" 6,9±0.03' 6.73±0.03' 6,24±0,03 5,77±0,033 9,2±0,02" 15,12±0,10' 8,7±0,04

без учета пола 96.51 ±0.097 6,36±0,13 5,99±0,13 6,23±0,11 5,63±0,13 8,18±0,13 13,16±0,13 8,66±0,15

16 101,9±0,413*" 6,85±0,05* 6,65±0,03*' 6,17±0,03*" 5,52±0.04*" 9,14±0,03*' 14,91±0,04*" 8,6±0,02*"

с? 110,3±0.303" 7.64±0,03' 7,44±0.02 6,9±0,02' 6,23±0,03' 11,4±0,15" 16.4±0.02' 9,24±0,02

без учета пола 1033=0,112 7,09±0,19 7,11±0.21 6,76±0,07 5,85±0,10 10,74±0,13 15,67±0,11 8,95±0,15

17 109,4±0,309*' 7,4±0,04*' 7,31±0,04*' 6,87±0,03*' 6,15±0.05* 10,99±0,25*' 16,11±0,04*' 9,2±0,24*"

117,4±0,34Г 8,45±0,03 8,37±0,04 8,07±0,03" 7,32±0,04" 14,12±0,04" 17,65±0,03"1 10,5±0,16"

без учета пола 113Д±0,166 8,24±0,15 8,17±0,16 7,62±0,21 6,21±0,Ю 13,П±0,23 17,96±0,12 Ю,02±0,12

18 9 116,4±0,319*' 8,21±0,03*" 8,13±0.03*' 7,77±0,03*' 6М0.03*' 13,23±0,042*' 17,44±0,0"*' 9,8±0,04*"

с? 124,3±0,396" 9,56±0,03 9,4±0.04 8,89±0,03" 8,14±0,03" 14,75±0,034' 19,8±0,033' 13.26tQ.Q3'

без учета пола 118,3±0,110 9,38±0,16 9,39±0,12 8,19±0,14 6,83±0,10 13,99±0,21 18,35±0,11 12,11±0,16

19 9 119,4±0.319*" 9,22±0,03*' 9,04±0,04*" 8,72±0,03*' 7,86±0,04*' 14,65±0,034*" 19,63±0,02*' 13,42±0,17*'

с? 129,1 ±0.278' 13,3±0,16 12,97±0.23" 11,4±0,06' 9.31 ±0,14' 17,15±0,034" 24,55±0,03" 16,42±0,18"

без учета пола 127,8±0,090 12,69±0,15 12,01±0,13 10.2±0,19 8.51±0Л1 16.37±0,14 21,05±0,11 14,12±0,25

п - количество эмбрионов на каждые исследуемые сутки инкубации; * (Р <0,05) -сравнение двух разнополых групп КЭ;

" (Р <0,05) - сравнение каждой однополой группы зародышей с группой КЭ, сформированной без учета половых различий.

Отмечено совпадение числовых максимумов относительного различия длины костей (плечевой, локтевой и лучевой) на 19-е сутки инкубации (в 1,442; 1,434; 1,307 раза соответственно). Оценивая интенсивность относительного различия между мужскими эмбрионами и женскими для пястной третьей кости, выявили противоположную плечевой, лучевой и локтевой костям тенденцию этого параметра. При этом числовой максимум относительной разницы приходится на 12-е сутки развития (в 1,334 раза).

Относительное различие длины бедренной кости куриных эмбрионов-самцов по сравнению с эмбрионами-самками характеризуется его закономерным возрастанием с 12-х по 17-е сутки развития, с максимумом на 17-е сутки инкубации (в 1,284 раза).

Относительное различие для длины цевки эмбрионов-самцов по сравнению с эмбрионами-самками, четко зафиксировано незакономерное, волнообразное его изменение на протяжении всего периода исследования. Числовой максимум (в 1,353 раза) относительного различия между разнополыми эмбрионами приходится на конец плодного периода, то есть на 18-е сутки развития.

Динамика относительной разницы длины осевого скелета и костей свободной грудной и тазовой конечностей в онтогенезе для разнополых эмбрионов отличается и характеризуется неодновременной сменой периодов возрастания и убывания.

Динамика уровня апоптоза н альфа-фетопротенна в онтогенезе разнополых куриных эмбрионов

С помощью количественного метода изучения запрограммированной гибели клеток установлено, что она присутствует у разнополых куриных эмбрионов на протяжении всех исследуемых этапов пренатапьного онтогенеза. Установлено, что апоптический индекс на всех изучаемых сутках развития куриных эмбрионов обоего пола отличается (таблица 5).

Таблица 5 - Апоптический индекс у куриных эмбрионов разного пола и эмбрионов в группе, сформированной без учета половых различий в процессе развития (М±ш)

Сутки инкубации Апоптический индекс, %

Куриные эмбрио-ны-cj, п=50 Куриные эмбрионы . п=50 Группа куриных эмбрионов, сформированная без учета половых различий, п=50

8 30,90±0,09*' 29.30t0.08" 30,25±0.25

9 35.40±0.08*" 31.30±0.07" 34,20±0.21

10 29.60±0,05*' 34.80±0.03" 31,80±0.23

11 28,30±0,05*' 28,80±0.2Г 23,80±0,16

12 23,02±0.02* 24,01 ±0.04" 23,03±0,17

13 9,86±0,01*' 10.78±0,01 10,82±0,13

14 23,10±0.03*' 20,40±0.04" 22,40±0,18

15 24.80±0.03*" 25,03±0.06' 23,70±0,29

16 30.60±0.05*" 33,10±0,06" 32, КЫШ

17 26,90±0,03*' 29.80±0,05" 30,4±0.22

18 15.80±0,02*' 17.30±0.04' 16,70±0,27

19 9,35±0.01 * 8,42±0,01" 9.11 ±0.28

п - количество КЭ на каждые исследуемые сутки инкубации; * (Р <0,05) -сравнение двух разнополых групп КЭ;

" (Р <0,05) - сравнение каждой однополой группы зародышей с группой КЭ, сформиро-

ванной без учета половых различий.

На все сутки исследования выявлен низкий диапазон значений статистических различий (ш) у куриных эмбрионов обоего пола по сравнению с группой эмбрионов, где половые различия не учитывались.

В период с 8-х по 19-е сутки инкубации выявлены достоверно отличающиеся значения апоптического индекса между куриными эмбрионами-самцами и эмбрионами-самками.

При сравнении АИ каждой г руппы КЭ противоположного пола с одноименным показателем в группе эмбрионов без учета половых различий, зафиксированы достоверные отличия на все сутки изучения, за исключением 12-х и 19-х суток в группе эмбрионов-самцов, и 13-х у эмбрионов-самок, где различия индекса недостоверны.

Характер динамики исследуемого индекса на протяжении инкубации в группах эмбрионов кур обоего пола и без учета половых различий, не всегда совпадает. Она не постоянна и характеризуется незакономерной сменой пиков подъема и спада.

По-нашему мнению такая динамика апоптического индекса на протяжении эксперимента связана с различной интенсивностью формообразовательных процессов у куриных эмбрионов разного пола на разных этапах развития.

Дополнительно в процессе работы провели исследование по выявлению гена р53. Этот ген является центральным компонентом механизма, обеспечивающим генетический контроль апоптической гибели у человека (Чумаков П.М., 2000). Что касается птиц, то сведения о наличии гена р53 отсутствуют. С помощью ПЦР-метода установлено, что ген р53 присутствует у куриных эмбрионов разного пола на всем протяжении исследования, а сам метод является вполне адекватным для выявления гена в пренатальном онтогенезе птиц. При этом результаты работы подтверждают предпочтительность использования для этой цели метода, основанного на сорбентном способе выделения ДНК.

Выявлено, что альфа-фетопротеин, обеспечивающий нормальное течение пролиферации, дифференцировки и апоптоза, присутствует у разнополых куриных эмбрионов на всех этапах исследования в пренатальном онтогенезе (таблица 6).

Таблица 6 - Уровень апьфа-фетопротеина у куриных эмбрионов разного пола и в группе эмбрионов, сформированной без учета половых различий (М±ш)

Сутки инкубации Уровень альфа-фетоп ротеина, МЕ/мл

Эмбрионы-самцы, п=50 Эмбрионы-самки, п=50 Группа КЭ, сформированная без учета половых различий, п=50

8 2,61±0,002*' 1,91±0,002" 1,54±0,02

9 1,78±0,002*'А 1,21±0,002"А 1,18±0,01

10 2,18±0,003*'А 1,91±0,002"А 3,18±0,11

И 1,22±0,003*'а 1,11±0,006,А 3,89±0,11

12 41,20±0,07*"а 38,30£0,05'А 40,50±0,17

13 1,75±0,004*'а 2,18±0,001"А 7,88±0,10

14 9,19±0,002*'а 8,16±0,004'а 12,30±0,13

15 19,10±0,04*'а 17,20±0,02"а 23,80±0,12

16 8,44±0,008*'а 7,15±0,003'а 11,70±0,13

17 3,18±0,002*'А 2,32±0,002"а 4,44±0,11

18 15,09±0,007*'а 12,32±0,003'а 11,40±0,14

19 3,1 1±0,009*'а 3,02±0,006'а 2,52±0,14

п - количество КЭ на каждые исследуемые сутки инкубации; * (Р <0,05) -сравнение двух разнополых групп КЭ;

' (Р <0,05) - сравнение каждой однополой группы эмбрионов с группой КЭ, сформиро-

ванной без учета половых различий;

А (Р <0,05) - сравнение с предыдущими сутками развития в каждой группе КЭ.

Установлено, что в каждые сутки развития (с 8-х по 19-е) уровень АФП достоверно отличается как у эмбрионов обоего пола, так и при сравнении этого показателя каждой однополой группы с группой эмбрионов, сформированной без учета пола. При этом на каждые исследуемые сутки инкубации отмечено количественное преобладание уровня АФП у эм-

брионов-самцов по сравнению с эмбрионами-самками, за исключением 13-х суток инкубации, где преобладание АФП в пользу эмбрионов-самок.

Выявлено, что в группе, где пол куриных зародышей не учитывался, статистические различия на каждые сутки инкубации имеют больший разлет по сравнению с этими различиями в группах эмбрионов, разделенных по полу.

Анализируя динамику апьфа-фетопротеина, можно отметить, что на всех экспериментальных этапах пренаталыюго онтогенеза она во всех трех группах КЭ изменяется волнообразно. При этом характер посуточной динамики апьфа-фетопротеина на протяжении инкубации у эмбрионов-самцов и эмбрионов-самок совпадает. А что касается группы эмбрионов, сформированной без учета половых различий, то характер динамики показателя отличается от динамики в разнополых группах КЭ.

При сопоставлении динамики апьфа-фетопротеина и апоптического индекса, у эмбрионов-самцов и у эмбрионов-самок отмечен разный характер взаимосвязи.

Так, в группе эмбрионов-самцов п эмбрионов-самок с 8-х по 9-е сутки развития зафиксирован разнонаправленный характер взаимосвязи показателей. С 9-х по 10-е сутки инкубации, у эмбрионов-самцов выявлено падение АИ и незначительное увеличение АФП. В эти сутки инкубации в женской группе эмбрионов отмечен противоположный эмбрионам-самцам характер взаимосвязи показателей, выражающийся в увеличении обоих показателей.

В интервале между 10-ми и 11-ми сутками развития динамика АИ п АФП в обеих группах разнополых зародышей характеризуется тенденцией к снижению.

Между 11-ми и 12-ми сутками инкубации в группах эмбрионов разделенных по полу вновь отмечен разнонаправленный характер взаимосвязи показателей. При этом апоптиче-ский индекс снижается, а уровень альфа-фетопротеина резко увеличивается.

С 12-х по 13-е сутки развития эмбрионов-самок и эмбрионов-самцов выявлено падение сопоставляемых показателей. Зафиксировано, что с 13-х по 15-е сутки инкубации динамика апоптического индекса и альфа-фетопротеина одновременно нарастает в обеих группах зародышей.

В отдельные сутки инкубации плодного периода пренатального онтогенеза кур женского и мужского пола отмечен ярко выраженный разнонаправленный характер взаимосвязи АИ и уровня АФП. Так, в промежутке между 15-ми и 16-ми сутками инкубации АИ увеличивается, а уровень АФП снижается в обеих группах КЭ. В интервале между 17-ми и 18-ми сутками развития зафиксирован противоположный характер взаимозависимости показателей в двух группах эмбрионов, где апоптический индекс снижается, а уровень АФП повышается.

В промежутке между 16-ми и 17-ми сутками п на завершающем этапе развития эмбрионов-самок и эмбрионов-самцов (18-е и 19-е сутки) зарегистрирована динамика спада как АФП, так и АИ.

Оценивая коррелятивную зависимость динамики альфа-фетопротеина и апоптического индекса, выявлена разнонаправленная (положительная и отрицательная) посуточная как у эмбрионов-самцов, так у эмбрионов-самок корреляция (0 - 0,3).

Таким образом, на каждые исследуемые сутки инкубации установлены достоверные отличия как апоптического индекса, так и альфа-фетопротеина у эмбрионов-самцов по сравнению с эмбрионами самками.

С 8-х по 19-е сутки инкубации установлен минимальный диапазон статистических различий (ш) при исследовании апоптического индекса и уровня альфа-фетопротеина в группах раздельнополых эмбрионов по сравнению с эмбрионами группы без учета половых различий.

Полученные результаты уровня апоптического индекса и альфа-фетопротеина для куриных эмбрионов разного пола кросса Родонит 3 на протяжении инкубации, по-нашему мнению можно считать нормативными.

выводы

1. Для половой дифференцировки куриных эмбрионов с экспериментальной целью наиболее целесообразно совместное использование методов доинкубационного взвешивания яиц и визуальной оценке гонад, что исключает вероятность методической ошибки, заключающейся в несовпадении результатов, полученных обоими методами и составившей 6,36% от числа яиц, отобранных для эксперимента.

2. Уровень тестостерона у куриных эмбрионов-самцов и эстрадиола у эмбрионов-самок достоверно увеличивается с 8-х по 19-е сутки развития. Минимальное и максимальное количество тестостерона для эмбрионов-самцов (2,61±0,006 нмоль/г; 6,88±0,006 нмоль/г), а эстрадиола для эмбрионов-самок (27,10±0,14 pg/мл; 59,70±0,06 pg/мл) отмечено на 8-е и 19-е сутки инкубации соответственно.

3. Абсолютные значения массы, длины, окружности грудной клетки, индекса Кетле I у куриных эмбрионов разного пола имеют достоверные отличия с 8-х, а Кетле II - с 10-х по 19-е сутки пренатального онтогенеза. У эмбрионов-самцов и эмбрионов-самок при общей тенденции возрастания всех показателей, отсутствует четкая закономерность посуточной динамики Кетле II. Количественные значения показателей физического развития, за исключением индекса гармоничного морфологического развития, в большинство из суток исследования у разнополых куриных эмбрионов достоверно отличаются от значений идентичных показателей у эмбрионов группы, сформированной без учета половых различий.

4. С 12-х по 19-е сутки инкубации длина различных костей осевого и периферического скелета разнополых куриных эмбрионов достоверно отличается, с четким превышением абсолютных величин и значений относительной разницы у самцов по сравнению с самками. Динамика абсолютной и относительной разницы длины этих костей в онтогенезе для разнополых эмбрионов отличается и характеризуется неодновременной сменой периодов возрастания и убывания.

5. Уровень апоптического индекса у эмбрионов разного пола с 8-х по 19-е сутки инкубации достоверно отличается. Максимальное значение АИ у эмбрионов-самцов (35,40±0,08%) приходится на 9-е сутки, у эмбрионов-самок (34,80±0,03%) на 10-е сутки. Минимальное значение АИ для разнополых куриных эмбрионов приходится на 13-е сутки развития и составляет для эмбрионов-самцов и самок 9,86±0,01%; 10,78±0,01% соответственно.

6. В тканях разнополых куриных эмбрионов на всем протяжении инкубации с 8-х по 19-е сутки выявлен альфа-фетопротеин, уровень которого у эмбрионов-самцов достоверно превышает этот показатель у самок. Динамика АФП эмбрионов разного пола совпадает и характеризуется наличием трех ярко выраженных пиков подъема (12-е; 15-е; 18-е сутки инкубации). Максимальное значение у эмбрионов-самцов и самок приходится на 12-е сутки 41,20±0,07 МЕ/мл; 38,30±0,05 МЕ/мл соответственно, а минимальное - на 11-е сутки 1,22±0,003 МЕ/мл; 1,11±0,006 МЕ/мл соответственно.

7. На всех этапах исследования стандартное отклонение средней (ш) уровня тестостерона, эстрадиола, апоптического индекса, альфа-фетопротеина, морфометрических и остео-метрических параметров, ниже в экспериментальных группах куриных эмбрионов, разделенных по полу, по сравнению со значениями идентичных критериев эмбрионов в группе, сформированной без учета половых различий.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Результаты исследования могут быть использованы в научно-исследовательской, практической и образовательной деятельности учреждений биологического, ветеринарного, сельскохозяйственного, биотехнологического профиля в качестве вспомогательной информации, характеризующей пренатальный онтогенез кур.

2. Для куриных эмбрионов-самцов и эмбрионов-самок кросса Родонит 3 полученные значения уровня стероидных гормонов, массы, длины, окружности грудной клетки, индексов Кетле 1, Кетле II, гармоничного морфологического развития, остеометрических показателей, апоптического индекса и альфа-фетопротеина в процессе инкубации, а также наличие гена

р53 можно рассматривать как нормативные, использовать для создания оценочных таблиц и учитывать в селекционной работе, а также при диагностике различных патологических процессов и нарушений развития.

3. Метод доинкубационного сексинга по массе яиц и визуализации гонад целесообразно использовать в одновременном сочетании при комплектации экспериментальных групп в эмбриологическом эксперименте на птице.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в рецензируемых научных журналах и изданиях

1. Тимченко, Л.Д. Динамика уровня апоптоза в гомогенате куриного зародыша во взаимосвязи с абсолютным приростом массы тела в процессе эмбриогенеза / Л.Д. Тимченко, Г.Н. Блажнова, А.П. Пономаренко // Вестник Московского государственного областного университета. Серия «Естественные науки». - 2010. -№ 1. - С. 66-70.

2. Тимченко, Л.Д. Взаимосвязь уровня а-фетопротеина и апоптоза в процессе развития куриного эмбриона / Л.Д. Тимченко, C.B. Черников, Г.Н. Блажнова // Аграрная Россия. -2010. -№ 5 -С. 53-54.

3. Тимченко, Л.Д. Показатели физического развития куриного эмбриона / Л.Д. Тимченко, Д.А. Арешидзе, C.B. Черников, Г.Н. Блажнова // Вестник Московского государственного областного университета. Серия «Естественные науки». — 2011, —№ 3. — С. 98-101.

4. Блажнова, Г.Н. Длина осевого и периферического скелета разнополых куриных эмбрионов в процессе развития / Г.Н. Блажнова, Л.Д. Тимченко // Аграрная Россия. - 2013. - № 1 -С. 25-28.

5. Блажнова, Г.Н. Сравнительная оценка эффективности дифференцировки куриных эмбрионов по полу методами доинкубационного взвешивания яиц и визуальной оценки гонад / Г.Н. Блажнова, Л.Д. Тимченко, И.В. Ржепаковский, А.П. Пономаренко // Современные проблемы науки и образования [Электронный ресурс] - 2014. - № 4; URL: http://www.science-education.ru/! 18-13996 (дата обращения: 21.07.2014).

6. Тимченко, Л.Д. Физическое развитие разнополых куриных эмбрионов в онтогенезе / Л.Д. Тимченко, Г.Н. Блажнова // Современные проблемы науки и образования [Электронный ресурс] - 2014. - № 4; URL: http://www.science-education.ru/118-14183 (дата обращения: 06.08.2014).

Статьи в зарубежных изданиях

7. Блажнова, Г.Н. Статистическая характеристика уровня апоптоза у разнополых куриных эмбрионов, и без учета половых различий в процессе развития / Г.Н. Блажнова, Л.Д. Тимченко // Perspektywiczne opracowania sq naukq i technikami - 2011: Materialy VII Miçdzynarodowej naukovvi-praktycznej konferencji. - Nauk biologicznych.: Przemysl. Nauka i studia. -Vol. 43.-S. 23-26.

Статьи в других научных изданиях

8. Тимченко, Л.Д. Содержание альфа-фетопротеина в гомогенате куриного эмбриона в процессе развития / Л.Д. Тимченко, А.П. Трунова, C.B. Черников, Р.В. Горбовский, Г.Н. Блажнова // Астраханский медицинский журнал (приложение): Мат-лы 6-й междунар. научно-практ. конф. «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (г. Астрахань). - 2008. - № 3. - С. 44-47.

9. Блажнова, Г.Н. Модификация метода исследования уровня апоптоза у эмбрионов кур в процессе развития / Г.Н. Блажнова// Экология России и сопредельных территорий: Мат-лы Х111-й междунар. экологической студенческой конференции. - Новосибирск, 2008. - С. 138.

10. Блажнова, Г.Н. Взаимосвязь массы куриного зародыша с количеством апоптических клеток на различных этапах развития / Г.Н. Блажнова, А.П. Пономаренко // Тезисы докладов Пятой ежегодной научной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр Южного научного центра РАН. - Ростов-на-Дону, 2009. - С. 8-9.

11. Блажнова, Г.Н. Морфометрические показатели интенсивности оссификации осевого скелета и костей верхних и нижних конечностей эмбрионов кур в процессе развития /

Г.Н. Блажпова // Тезисы докладов Шестой ежегодной научной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр Южного научного центра РАН - Ростов-на-Дону, 2010. - С. 9-10.

12. Тимченко, Л.Д. Выявление гена р53 методом ПЦР у куриного эмбриона / Л.Д. Тимченко, Г.Н. Блажнова, А.П. Пономаренко // Управление функциональными системами организма: Мат-лы междунар. научно-практ. интернет конф., посвященной 80-лгтию каф. физиологии СтГАУ. - Ставрополь, 2010. - С. 28-31.

13. Блажнова, Г.Н. Исследование уровня половых гормонов у кур на разных сроках эмбрионального развития / Г.Н. Блажнова // Тезисы докладов Седьмой ежегодной научной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр Южного научного центра РАН. - Ростов-на-Дону, 2011.-С. 11-12.

14. Тимченко, Л.Д. Динамика уровня апоптоза, тестостерона и эстрадиола у разнополых куриных эмбрионов в процессе развития / Л.Д. Тимченко, Г.Н. Блажнова // Современные проблемы патологической анатомии, патогенеза и диагностики болезней животных: Мат-лы 17-й Всероссийской научно-методич. конф. по патологической анатомии животных. - Москва, 2011. -С. 198-200.

15. Блажнова, Г.Н. Динамика уровня альфа-фетопротеина в куриных эмбрионах в зависимости от половой дифференцировки / Г.Н. Блажнова, Л.Д. Тимченко // Современные проблемы теории и практики инновационного развития АПК: Мат-лы междунар. науч.-практ. конф. посвященной, 30-летию КБГСХА им. В.М. Кокова. - Нальчик, 2011. - С. 100-101.

16. Тимченко, Л.Д. Комплексный подход к оценке признаков половых различий у куриных эмбрионов / Л.Д. Тимченко, Г.Н. Блажнова // Актуальные проблемы биологии, нанотех-нологий и медицины: Мат-лы IV междунар. научн.-практ. конф. - Ростов н/Дону, 2011. - С. 185.

17. Блажнова, Г.Н. Индекс гармоничного морфологического развития у разнополых куриных эмбрионов в онтогенезе / Г.Н. Блажнова, Л.Д.Тимченко, А.П.Пономаренко // Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины: Мат-лы V междунар. научн.-практ. конф. (г. Ростов-на-Дону, 3-5 октября 2013 г.). - Ростов н/Дону, 2013.-478 с.

Список сокращений и условных обозначений

АИ - апоптический индекс

АФП — альфа-фетопротеин

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИГМР - индекс гармоничного морфологического развития

ИФА - иммуноферментный анализ

КЭ - куриный эмбрион

КЭ-с? - куриный эмбрион-самец

KO-Ç - куриный эмбрион-самка

ME - международная единица измерения АФП, 1МЕ/мл (IU/ml) = 1,25 нг/мл ОГК - окружность грудной клетки ПЦР — полимеразная цепная реакция

БЛАЖНОВА Галина Николаевна

ДИНАМИКА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ РАЗНОПОЛЫХ КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ В ПРОЦЕССЕ РАЗВИТИЯ

06.02.01 - диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 03.10.2014 Формат 60x84 1/16 Усл. печ. л. 1,0 Уч.-изд. л. 0,7 Бумага офсетная_Заказ 348_Тираж 120 экз.

Отпечатано в Издательско-полиграфическом комплексе ФГАОУ ВПО «Северо-Кавказский федеральный университет» 355029, г. Ставрополь, пр-т Кулакова, 2