Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Динамика белкового синтеза в онтогенезе особей гермафродитного поколения трематод рода MICROPHALLUS (TREMATODA, MICROPHALLIDAE)

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Динамика белкового синтеза в онтогенезе особей гермафродитного поколения трематод рода MICROPHALLUS (TREMATODA, MICROPHALLIDAE)"

московский ордена ленина, ордена октябрьской ееволхцш. :; ордена трудового красного знамени государственный университет имени М.в.ломоносова

Ш0Л01МЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

I

УДК 576.895.122:577.218 МИХАЙЛОВА Наталья Аркадьевна

' динамика белкового синтеза в онтогенезе особей гешафродитгого поколения трематод рода

' МЮВОРНАЬЫЙ (ТИЕЫАТОШи МХСйОРНАЬиПАЕ)

03.00.19, - паразитология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1991

Работа выполнена в лаборатории паразитологии Мурманского морского биологического инстгтута КНЦ АН СССР (Дальние Зеленцы) и в лаборатории стабильности хромосом и клеточной инженерии инотитута Цитологии АН СССР (Санкт-Петербург)

Научные руководители:

кандидат биологических наук, доцент А.А.Добровольский;

кандидат биологических наук 0.И.Подгорная

Официальные огпоненты:

доктор биологических наук, профессор П.В.Матекин;

кавддцат биологических наук С.Э.Спиридонов

Ведущая организация:

Зоологический институт АН СССР

Защита диссертации состоится Мб " 1991 года

в ^ часов на заседании специализированного Совета Д 053.05.34 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу 119899 ГСП, г.Москва, В-234, Ленинские горы, МГУ, Биологический ф. ::ультет

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им.А.М.Горького Московского государственного университета

Автореферат разослан " Я" " цре^/^с f

Учений секретарь специализированного Совета, кандидат биологических наук

.1991 года

. Л.И.Барсова

ОБДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темц. Устойчивое существование системы паразит -хозяин предполагает наличие специальных адаптацией как у паразита к жизни в хозяине (среде 1-го порядка), так и у хозяина, организм которого может весьма специфически реагировать на присутствие паразита. Многочисленные данные о морфологических приспособлениях паразитов, их поведении, физиологических реакциях организма хозяина на присутствие паразита иллюстрируют насколько глубоко и многообразно взаимодействие членов пары паразит - хозяин. Многоуровневость взаимоотношений в системе диктует необходимость привлечения, наряду с традиционными, новых методов исследования. Использование молекуляр-но-геь )тических и биохимических методов открывает широкие возможности для углубления наших знаний о сочленах пари паразит - хозяин. Первые полученные результаты свидетельствуют о том, что интеграция втой системы может осуществляться за счет тонких молекулярных механизмов и, возможно, включает в себя согласованную работу геномов паразита и хозяина,. Можно сказать, что проведение такого рода исследований свидетельствует о разработке нового направления в паразитология - характеристике паразит - хозяинных взаимодействий на молекулярном уровне. Именно это направление положено в основу нашего исследования.

Цель у задачи исследования. Основная цель работы - выяснить особенности белкового синтеза в жизненном цикле трематод рода aiic-rophailua при переходе от фазы метацеркарии к фазе мариты и в процессе развития гермафродитных особей. Достижение этой цели было бы невозможно без решения более частных проблем: оценка возможности культивирования марит микрофаллид группы * руешаеиэ " in vitro и их пригодности для последующего использования в биохимическом анализе; выявление отдельных белков, синтез которых претерпевает наибольшие изменения в онтогенезе и, наконец, расшифровка молекулярных механизмов работы отдельных генов, отвечающих за синтез этих белков. Для реализации этих целей были поставлены конкретные задачи. I) Подобрать условия для культивирования марит в искусственных средах а выяснить темпы их созревания и развития in vitro . 2) Получить марит в результата экспериментального заражения птенцов морских птиц и использовать их в качестве контроля. 3) Выяснить степень различая близких ВИДОВ рода Microphallus по белковому составу и хромосомным наборам, оценить пригодность применения метода белкового электрофо-

реза и наркологического анализа для систематики трематод. 4) Подобрать адекватные методы для изучения белкового состава червей на разных стадиях развития. 5) Изучить особенности синтеза белков теплового шока (БТШ). 6) Использовать метод ретардации для поисков Сэлковых факторов, участвующих в регуляции экспрессии генов БТШ. 7) Оценить роль БИВ в жизненном цикле микрофаллвд группы " р}^таеиа" и паразитических организмов в целом.

Научная новизна. С использованием методов белкового электрофореза и кариологтчеокого анализа подтверждена видовая самостоятельность четырех близких видов трематод рода шсгорЬаНив . Впервые

основе детального знания биологии микрофаллидных трематод, в искусственных условиях выращены мариты I .р^таеиа и м.р1г1Гопьев . Уточнены особенности морфогенеза особей гермафродитного поколения, темпы их да£ференцировки. Получены картины белкового состава червей на разных стадпх созревания и детально изучена система синтеза белков теплое го шока. Проведена работа по выявлению регуляторного механизма синтеза ШШ в онтогенезе марит, что может служить иллюстрацией паразит-г^зяинных взаимоотношений на молекулярном уровне.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследования позволили выявить наркологическое своеобразие микрофаллвд группы " рувтаеиа " и представить гипотезу об анцестрвльном ка-риотипе трематод и основных путях его принципиальной реорганизаций в прсдессе эволюции. Анализ белкового состава представителей разных видов микрофаллвд группы " рудтееив " дает возможность обосновать филогенетические связи внутри этой группы. Полученные данные по изменению белкового состава в онтогенезе особей гермафродитного поколения внос,.г вклад в решение двух теоретических проблем. Во-первых, это общебиологическая проблема выяснения механизмов смены онтогенетических программ в геноме организмов. Во-вторых, с паразитологичео-кой точки зрения, изменение белкового синтеза можно рассматривать кок адаптацию в паразито-хозяинной системе на молекулярном уровне. Исследование особенностей синтеза белков теплового шока в онтогенезе гормафродмтяых особей микрофаллвд группы "руетаеив " иллюстри-руот это положение. Высказано предположение, что появление Е1Ш у трематод - проявление диффоренцировки и смены базового белкового сгнтеза.

Патогенлость ряда видов трематод для своих хозяев придает большую практическую значимость детальным исследованиям их биологии и

жизненных циклов. Отработка методов культивирования трематод в искусственных средах позволит использовать их для проведения разляч- ' ного рода исследований. Гельминты, выращенные in vitro являются ценным материалом для поиска средств иммунизации животных, выделения и изучения антигенов, ферментов, аминокислот и других биологически активных веществ.

Материалы диссертации могут быть использованы при чтении курсов паразитологии, биохимии и молекулярной генетики.

Апробация рцбя_тд. Результаты исследований б ми доложены и об-оуидались на всесоюзной конференции "Экспериментальная биология плоских червей" (Пущино,1969), на научных отчетных сессиях молодых ученчх и специалистов Мурманского Морского биологического института (Дальние Зеленцы,1987,1989), на семинаре Морской биологичеокой стангии ЛГУ (Экибана,1967). Два доклада были сделаны на семинарах кафедры микробиологии и биохимии университета г.Баффало, США (Buffalo, New York, usa ) (ишь,август 1990). В полном объеме данные обсувдались на семинарах: кафедры зоологии беспозвоночных и кафедры цитологии и гистологии Санкт-Петербургского университета (1991), отдела экспериментальной гидробиологии ШЕИ (1991), кафедры зоологии беспозвоночных МГУ <1991).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, (два - в зарубежных изданиях), 6 из которых в соавторстве.

Ç?p7Krvca р объем диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературу, включающего отечественных я/6 е/ зарубе миг/ источников. Текст изложен на /^страницах. Работа содержит 17 рисунков (оригинальные фотографии и схемы) и I таблицу.

с0дер2ание работы

Глава I, Обзор литературы

Взаимодействия в системе паразит-хозяин сложны, многообразны и осуществляются на разных уровнях. Условно выделяют молекулярный,клеточный, тканевой, организменннй, популяционный и другие уровни. Интеграция системы паразит-хозяин происходит на всех уровнях взаимоотношений и выражается во взаимной адаптации сочленов пары пвраэит-хо-зяин. Поиск и расшифровка механизмов адаптация в паразит-хозяинной системе - одно из традиционных направлений в паразитологии. Однако, если адаптации на клеточном, тканевом, органиэмеаном, популяционном уровнях посвящено достаточное число работ, то молекулярный уровень

взаимодействий остается нр'-ленее разработанным к настоящему времени. В обзоре литературы изложены основные работы, посвященные ларе-зит-хоэяшшш взаимоотношениям на молекулярном (белковом) уровне,а также обоснованы задачи настоящей работы. Кроме того, уделяется внимание методам культивирования трематод in vitro . Наличие удобной лабораторной модели - необходимое условие для успешного проведения молекулярно-паразитологических исследований.

Глава 2. Материал и методы доследования

Работа выполнена на микрофаллвдах группы "pygmueua " ( Trema-toda : Micropi._.iiidae ) в течение 1986-1990 гг. В состав группы входят 4 морфологически и экологически близких вида: Microphallus pjgmaeus, Al.piriformes, K.peeudopygmaeue, Aí.triangulatue . Их жизненные циклы протекают по одной схеме и включают только двух хозяев. Взрослое гермафродигное поколение паразитирует в кишечнике морских птиц, партеногенетические поколения и личинки марит - в литоральных бовховогих моллюсках рода Xittorina . Заражение дефинитивного хозяина происходит при непосредственном поедании моллюсков,содержащих инвазионных метацеркарий, Предстакпенная система чрезвычайно удобна да. исследований по нескольким причинам: I) Моллюски рода Littorina живут в приливно-отливной зоне большими скоплениями и доступны для сборов на побережье Баренцева моря в любое время года. 2) Созревание метацеркарай в моллюсках происходит синхронно во всех спороадстах, что позволяет относительно легко получать достаточное количество однородного материала. 3) Подобраны условия для выращивания марит в искусственных средах, что дало возможность провести ср;зрительный биохимический анализ двух фаз жизненного цикла микрофалл вд, в также проследить изменения, происходящие при переходе от одного хозяина (моллюска) к другому (птице) и в процессе дифферен-цировки марит in vitro .

Для культивирования марит in vitro использовали 3 типа стерильных сред, применяемых для культивирования клеток млекопитающих: Иглв, ЕМЕМ, ДМЕ. Во всех трех случаях к средам добавляли 10? коровьей сыворотки, гентамицвн, глютамин. Инкубацию проводили во влажном С02-инкубаторе, при +37°С, под газовой фазой из 5% COg в воздухе. Наблюдение за ростом и развитием марит производили под ияверти-рованнш микроскопом.

В работе по экспериментальному заражению птиц использовали птенцов с о ребристой чайки, котори,. скармливали моллюсков ъ. eaaati-lia , содержащих спороиисты с инвазионными метацеркариями. Просле-

жено развитие марит на разных сроках созревания in vivo и проведена оценка их плодовитости.

Исследование кариотидав и морфологии хромосом микрофаллид проведено на маритах, выращенных in vitro , Взрослых червей помещали в дистиллированную воду на 40 мин, после чего фиксировали смесью этанол - ледяная уксусная кислота (3:1). Суспензию клеток готовили в 50^-ной уксусной кислоте с помощью шприца. Клеточную суспензию наносили на предметное стекло и высушивали на воздухе. Препараты окрашивали 2%-нт раствором Гимзы в фосфатном буфере, pH = 6,8.

Анализ белкового состава метацеркарий и марит проводился при помощи метода электрофореза с ДДС-Na в полиакриламидном геле (ПААГ), В трис-глициновой систеш Леммля (Laemoül ,1970). Для приготовления проб червей помещали в 1% раствор ДДС-Na , содержащий также Ъ% £-меркаптоэтанола и 10$ глицерина. Пробу тщательно перемешивали, инкубировали при 100°С на водяной бане в течение 3-4 минут. Полученные гели фиксировали (45$ спирта, 10% уксусной кислоты), окрашивали 0,25$ раствором красителя Кумасси бриллиантового синего в течение 1,5 часов а отмывали 1% уксусной кислотой. Пробы были выровнены по количеству червей. Для определения молекулярных масс полипептидов в качестве маркера использовали ацетоновый препарат миофибрилл кролика* Для выяснения особенностей включения метки во вновь синтезирующиеся белкя червей на разных стадиях развития высаживала в среду Игла без метионина (около 100 особей в 300 мкл среды). Животных инкубировали в присутствии з35-метиояила, в концентрации 1,0 мКп/ид в течение I часа. На полученном материале считали включившуюся метну в толуольном сцияцилляторе на счетчике фирмы " веск^ая " (США) и готовили алектрофоретические пробы. Гель с мечеными балками фиксировали а 7% уксусной кислоте о добавлением 5% глицерина, высушивали и экспонировали о усиливающим экраном.

Доказательство наличия белков теплового шока на злектрофорезных гелях было получено при помощи метода иммуноблоттинга о антителами (AT) против ЕШ 70 дрозофилы и человека. Белки из геля были перенесены на нитроцеллюлозу, о использованием техники злектроблоттпнга (ßooderhara ,I9ü4), на аппаратуре фирмы ¿кь . Использовали кроличьи поликлональные и мышиные моноклональные антитела, любезно предоставленные доктором Б.А.Маргулисоы (ЦИП АН СССР) я доктором Велчем { Dr. w.weich, Gold Spring Harbor, usa )» за что автор вырааает им свою глубокую признательность. Визуализация зон связывания с AT была проведена с использованием 1125-балка А, иодогенным методом. Окрашен-

- а -

ныв I*2^ йлоты экспонировали с рентгеновской пленкой и усиливающим экраном.

Исследовали специфику связывания ядерных белков микрофаллвд с ДНК, несущую промоторную область гена теплового шока, В основе ио-пользованной методики приготовления белкового экстракта го ядер ма-тацеркарий и марит лежат модифицированные методы из работ By ( tfu, I9b4; wu et ai. ,IS87). В работе использовали две плазмвды: pl/в, несущую человеческий промотор генов теплового шока ( Уое_хиу et al., 1985) и D88 с промотором генов 1Ш дрозофилы ч Amin et ai. ,1987, 1988). Плазмигч в соответствии с их картами были рестрицированы.кая-дая с использованием двух рестрыстаз. Величина полученных фрагментов составила 175 и 200 н.п. Фрагменты были помечены по концам ^Р и вставки ашоироваьы из геля методом здектроэлюции. Пробы готовили ПО описанному ранее методу ( Shuey, Parker ,1986; tooseer et al. , 1988). Они содержали меченый фрагмент, ядерный экстракт из червей на разных стадиях развития и возрастающие количества конкурентной ДНК. Эффиот связывания меченой ДНК со специфическим белком выявлялся по замедлению подвижности ДНК-белковых комплексов в геле. Электродный буфе^ и гель для ретардации готовили по методам Штраусов и Варшавского ( strauea, varshavBky ,1984). Использовали &% п^лиак-риламвдный гель.

Глава 3. Характеристика экспериментальной модели "метацеркарии - мариты" микрофаллидных трематод рода Kicropuailue

Определение видовой принадлежности микрофаллвд цушиГ pxynaeue" о помощью методов белкового электрофореза и хромосомного анализа.

Методом ДДС- к а -диск электрофореза исследован общий состав белков четырех ВИДОВ b.icrophallua: M.Pygmaeus, li.piriformes, It. peeudopy/imeeuo, w. tri anpuititua^ Анализ алектрофореграмм показал, что наиболее сходны по белковому составу виды w.pygmaeue и M.piri-fortneo. Для них характерны слабые качественные различия всего трех белковых зон, в областях 60 , 55 и 38 кД. Ввд M.peeudopygmaeue отличается от двух предыдущих более существенно. Для него характерно ослабление интенсивности целой группы белковых зон в области ыоле-кулярннх масс (м.м.) от 170 до 80 кД, слабые качественные отличия по белкам с м.м. 38-30 кД. По картине распределения зон о меньшими M.M., ВИД M.pseudopygtaaeue ближе К Id.pygmaeus Чем К Ы.piriforms . к' .trirxiguiatus отчетлиш отличается от всех остальных видов по группам балков с м.м. 35-33 кД, 31-29 кД, 27-25 кД.

Бкли исследованы хромосомные наборы трех видов рода мюгорыа-

lus : M.pygmaeua, M.piriformes и il.trlangulatus , КариотиДЫ BO0X трех видов сходны и состоят из девяти пар хромосом. Все элементы наборов двуплечие. По относительному размеру хромосомы можно разделять на две пары крупных гомологов, пары гомологов среднего размера в группу уменьшающихся по величине хромосом. Пары № I и 3 представлена метадентриками, пара И 2 - оубметацентриками. Морфология гомологов остальных пар не столь ясна. Очевидно, что у iupygmaeua хромосомы пары № 4 субметацентрические, в то время как у M.trianguia-tua и ¡¿.piriformes метацентрические. Пары № 7 и 8 у M.pygmaeua и M.piriformea состоят из субтелоцентриков, у M.triangulatua , скорее, из субметацентрихов, а пара № 9 у всех трех видов представлена иатацентрическими гомологами.

Обсуждение. Межвидовые отличия по белковому составу микрофал-лид обнаруживаются в основном на уровне разной интенсивности белковых зон и только в немногих областях выявляются несоответствия в распределении мажорных белков. Предполагается, что столь незначительные различия определяются сходством морфологии и схем протекания жизненных циклов изученных вгдов. На основе полученных данных обсуждается вопрос о филогенетических связях внутри группы "pygmaeua " в процессе эволюции, приведена гипотетическая схема.

Анализ литературы и полученные результаты свидетельствуют о кариологическом своеобразии микрофаллид: 2п=18, наличие двух пар. крупных двуплечих гомологов, отсутствие акроцентриков. Дискутируется вопрос об анцестральном кариотипе трематод и путях его принципиальной реорганизации.

Подтвервдена пригодность применения обоих методов для видовой диагностики трематод.

Темпы дифференцировки марит микрофаллядных трематод ln vitro и ln vivo

Для выращивания мврпт в лабораторных условиях были использованы среды для культивирования клеток млекопитающих. В ходе работы выяснено, что во всех трех средах - Игла, ЕМЕМ, ÍME - темпы роста и дифференцировки марит одинаковы. Развитие особей гермафродитного поколения в окончательном хозяине включает в себя два этапа. Первый из них, называемый маритогонией, непродолжителен по времени. Iq vitro он заканчивается через 2-3 суток после начала культивирования, что объясняется прогенетическим развитием личиночных стадий марит еще в промежуточном хозяине - моллюске. Во время маритогонии происходят интенсивнее морфогенетические процессы, заканчивающиеся формировани-

ем половозрелой особи. Появление первых, еще абортивных яиц в петлях матки взрослых червей знаменует завершение первого этапа. Второй этап жизни марит в окончательном хозяине - период интенсивного полового размножения. Он характеризуется показателем плодовитости червей на разных стадиях созревания. В лабораторных условиях для M.nygmaeus получены следующие средние значение плодовитости: на 4-е сутки число яиц достигает двух десятков, на седьмые - 50 шт./особь, на 9-е - 5-7, реже 10-20 яиц. Вымет яиц маргтами наружу зафиксирован на 6-е сутки, а его максимум - на 7-е сутки, на 9-е сутки петли матки остаютс практически пустыми. Необходимо отметить, что среди нормально сформированных яиц присутствует значительное количество абортивных. Максимальное время содержания марит ü.pygmaeus в искусственных средах составило 9 суток.

Особенности роста и развития марит м.piriformes в искусственных условиях прослежены на ранних этапах их развития, в течение первых трех сутск. На основе 'полученных данных можно утверждать, что темпы ма^итогонии у обоих видов одинаковы.

Для оценки сроков развития марит in vivo проведено экспериментальное зарг-оние окончательных хозяев микрофаллид - морских птиц. В эксперименте использовали птенцов серебристой чайки (Larus argen-tat ua ) и инвазионные метацеркарии M.pygraaeua и и.piriformes .Более полные результаты получены для ы.piriformes . Прослежено развитие марит йа следующих сроках: 6 и 16 часов; I; 1,5; 2; 3; 4 и5 су-тог. Выяснено, что через 24 часа в петлях матки червей появляются первые, еще абортивные яйца, среднее их количество - 3,1 шт./особь. Для остальных сроков получены следующие значения плодовитости: 1,5 суток - 14,2 ит./особь, 2-ое суток-- 30,7, 3-ое суток - 101,4¿ 4-о суток - 124,1,'5-о суток - 71,2. Таким образом маритогоняя »¿.piriformes в птенцах чайки заканчивается через сутки после заражения, а процосс полового размножения червей длится следующие четверо суток. M.pygíaaeua в чаечатах развивается медленнее, чем M.piriformee . Первые яйца появляются на стадии 28 часов в птенца, их среднее число 0,9 шт./особь.

Обсувдение. Сравнивая данные, полученные in vitro и in viro мн приходим к заключению, что мариты, развивающиеся в искусственных средах проходят все стадии нормального морфогенеза, однако медленное, чем в естественных условиях, а плодовитость половозрелых особей приблизительно в три раза ниже щ родной. Вместе-с тем, по нашему глекпю, разработанный катод вполне пригоден для получения гермафро-.вдтных особой трематод и их дальнейшего биохимического изучения.

Приводится обзор литературы по выращиванию микрофаллидных трематод in vitro и in vivo . Специально отмечено, что темпы созревания и плодовитость червей M.pygmaeus in vitro и в мышах оказались близкими. По всей видимости, искусственные питательные среды, используемые для культивирования клеток млекопитающих, при температуре +37°С хорошо имитируют условия жизни червей в мышах.

Глава 4. Особенное1!., белкового синтеза в онтогенезе особей гермафродитного поколения микрофаллдд группы " py&naeue "

Изменение белкового состава дифференцирующихся марит

Исследования метацеркарий и марит на разных стадиях созревания двух ВИДОВ микрофалляд группы " pygmaeua" - M.pygmaeus и M.piri-formee показало, что изменение белкового состава наблюдается уже у мэрит,находящихся в культуральной среде в течение 2-х часов. При более длительных сроках культивирования прослеживается определенная динамика изменения рисунка белковых зон. Некоторые белки появляются у марит на отдельных этапах существования в культуральной среде,затем исчезают в процессе дальнейшей дифференцировки. Количество других белков возрастает непрерывно. В пробе, приготоа энной из четырехдневных марит обнаружены белки, вероятно, являющиеся специфическими белками ~иц взрослых особей. Именно в это время начиняется массовое формирование яиц в петлях матки а белковый состав животных значительно меняется. Ввиду слабой изученности белкового состава трематод рода Microphallus , среди белкового спектра можно указать лишь отдельные, прис;:ствунцир в большинстве эукариотических клеток, хауз-кипинг белки, отличающиеся высокой консервативностью. Это гио-тоны и актин. Кроме того, у марит обоих видов, инкубированных в среде в течение суток, ярко выражено увеличение количества белка с молекулярной массой 70 кД. Соответствующей м.м. обладает основной белок теплового шока - БТШ 70, выявленный для многих исследованных видов животных и растений. При переводе метацеркарий в среду для культивирования одним из существенно меняющихся параметров является резкое повышение температуры (от +4°С до +37°С). Можно предположить, что увеличивается именно синтез БШ" 70, что является обычной реакцией клеток эукараот на тепловой шок. Не исключено, что белок о м.ы. 26 кД, синтез которого меняется в процессе маритогонии так же как 70 кД,относится к группе малых БТШ.

Опыты по включению 3^5 метионина,проведенные о маритвми м.руд-aaeua in vitro показали, что максимальный уровень включения метки

обнаруживают мариты, содержащиеся в среде в течение 2-х часов. В условиях эксперимента нам не удалось зарегистрировать лаг-период для червей, переведенных в культуру. Интенсивность включения метки на I и 3-ий дни соответствует 66,1% и 50,85?. На 5-е сутки уровень включения метки становится еще ниже - 30,9$. К этому времени, в оо-новном, заканчивается формирование яиц в петлях матки марит в наблюдаемое снижение включения метионина может косвенно говорить о снижении темпов синтеза у особей, культивируемых in vitro , в течение 5 дней,-

При сравнении картин разделения меченых белков марит можно видеть, что активность белкового синтеза различна для марит на разных стадиях дифференцирован. Наибольшее число включивших метку белков обнаруживается в первые часы инкубации в области молекулярных масс от 100 до 40 кД. Через сутки культивирования характер распределения включивших метку белков в этом участке меняется. Более очевидно величие подобного типа белков в области меньших молекулярных масс. Здесь выявляются белки, включение метки в которые идет после двух часов культивирования, а по подвижности эти зоны совпадают с зонами 26 и 26 кД. В области большое молекулярных масс обнаруживается аналогичная белковая зона - 70 кД.

Такие же исследования проведены и на маритах, полученных в результате экспериментального заражения птенцов чайки. В опытах использовали марит ы.piriformes. У метацеркарий этого вида выявляется базовый синтез белка с м.м. 70 кД. В течение первых двух часов нахождения марит в птенцах можно видеть довольно слабый рост белкового синтеза, а его макоимум обнаруживается к 4-м часам. Полученный результат можно объяснить изменением локализации марит во времени в пищеварительном тракте птиц. В течение 30-90 минут после заражения черви находятся в желудке с кислой оредой (рН=5,0-5,5), а к 4-м ча-оам - в заднем отделе двенадцатиперстной кишки и в верхних отделах средней (¡й=7,0-7,5). Мы полагаем, что низкая кислотность среды может служить причиной существования лаг-периода в белковом синтезе_ io vino по сравнению с in vitro ,

Для того, чтобы доказать, что белки, синтез которых максимально меняется на первых стадиях маритогонии являются именно БТШ, использовали метод имыуноблоттшга с антителами против БТШ человека, о молекулярными массами 70 и 73 кД. Фиксировали изменения количества синтезируемых белков. Интенсивность зоны БИВ 73 (мариты I сутки в J1ÍÍE,-при +37°С) считали максимальной. Интенсивность соответствующих вон на других дорожках сравнивали с этим максимумом. Увшшчцние ко-

личества белка с м.м. 70 кД наблюдается в ряду: мариты I сутки в растворе Хэнкса, при +4°С; мариты I сутки в ЛДЕ, при +4°С; мариты I сутки в Д£Е, при^З?^. Таким образом, мы видим, что на начальных этапах дифференцировки червей появление Б1Ш 70 стимулируется как температурой, так и средой. Анализ иммуноблота с моноклональными антителами показал! что на наблюдается существенных различий по количеству синтезируемых БШ у марит, инкубированных в течение 2-х часов в растворе Хэнкса, при +37°С, в теплой (+37°С) и холодной (+4°С) среде ЯМЕ. После 24 часов инкубации различия становятся более выражены. В этом случае количество БИЛ 70 увеличивается в ряду: мариты э раствора Хэнкса, при +37°С; в охлажденной среде ДМЕ (+4°С), в ДМЕ при +Э7°С. Радиоавтографы иммуноблотов, для которых визуализация зон связывания с AT была проделана с помощью -белок А, успешно демонстрируют эту количественную корреляцию. Приведенные результаты показывают, что для микрофаллид группы " pygmaeus " среда является более значительным триггером для синтеза ЕШ, чем температура.

Обсуждение. Смена онтогенетических стадий марит микрофаллид группы " pygmaeue " сопровождается активацией синтеза одних белков и накоплением других. Недостаточная изученность биохимических особенностей трематод не позволяет высказывать предположение о функциональной рох бе.:ков этих двух групп, за исключением двух тлучаев. Первый из них - предположение о появ-^нии специфических структурных белков зрелых яиц, в препаратах четырехдневных марит. Второй - предположение о функциональной роли и значении увеличения количества белка с м.м. 70 кД. Последние, по данным импульсной метки ведут себя так, как характерно для Вш.

Гены, отвечающие за синтез Б1Ш, обладают значительной эволюционной консервативностью, о чем свидетельствуют результаты сиквенса нуклеотидных последовательностей. Обнаруженные в паразитических организмах ЕШ оказались гомологичны таковым из клеток других организмов. Однако в большинстве работ обсуждается роль БТШ в стрессовых условиях. Паразитические организмы вызывают особый интерес, так как " их сложный жизненный цикл предполагает изменение сред обитания и резкую смену температурных условий; С другой стороны, повышение температуры при переходе от одной фазы паразитирования к другой - явление естественное и необходимое для продолжения жизни паразитов (нормальный онтогенез). Б1Ш могут играть важную роль в паразито-хозяин-ных взаимоотношениях, приобретая специфические функции. Например, белок с м.м. 75 кД морозойтбв плазмодия является мишенью для иммунной реакции организма хозяина ( Ardeshir et ai. ,1987). Белки с близ-

кш м.ц. играют важную роль при превращении промастигот в амасти-гот у паразитических жгутиконосцев ( Van der pioeg et ai. , 1985; Alclna, ireeno ,1988; Toye.tieaold ,1989).

Анализ литературы и полученные результаты приводят нас к заключению, что в случае с микрофаллидами группы " pygmaeue п семейство БШ и, в частности, БШ 70 синтезируются и принимают участие в диф-ференцировке марит, но при этом не являются ее первопричиной.

Возможный механизм регуляции экспрессии генов Б1Ш у трематод рода Microphallus

Следующим этапом работы была попытка понять возможный механизм цепи регуляции генов ЕПВ. Проблема представляется нам крайне важной, поскольку ее решение выводит, нас на новый уровень изучения даразит-хозяишшх взаимодействий - поиску регуляторных механизмов на молекулярном уровне.

В опытах по специфическому ДНК-балновому связыванию использовала белковые ядерные экстракты из клеток метацеркарий и марит u.pyg-»ввив (2 часа инкубации в культуральной среде), меченый фрагмент,несущий промотор гена БТШ и конкурентную ДНК. Обнаружено существование белковых факторов в ядрах клеток червей на обоих стадиях развития. С использованием метода ретардации выяснено, что эти фактора имеют ДНК-связываюедю активность, однако эта способное:ь проявляется лишь в клетках марит. Только здесь мы обнаруживаем эффект связывания меченой ДНК с этим специфическим белком, что выявляется по замедлению подвижности ДНК-белковых комдлоксов в геле. В то же время для ядерного экстракта метацеркарий ДНК - белкового связывания не обнаружено. Полученные данные позволяют предложить гипотетическую схему механизма экспрессии гена БТШ у микрофаллид группы " pyg-aaeua При переходе от метацеркарии к марите резко меняются условия среды (повышение температуры и изменение кислотностф По-видимому, в этих условиях белковые молекулы приобретают способность свя-зывитьоя с промоторной областью гена БТШ (выявлено методом ретардация) . В результате происходит экспрессия генов БТШ и обнаруживается продукт синтеза - белки теплового шока (показано методом белкового электрофореза).

Ыы считаем, что полученный результат может служить иллюстрацией механизма регуляции экспрессии генов в сложном жизненном цикле трематод.

шводц

I. Подобраны условия для культивирования марит микрофаллцц группы "pyguaau» " в искусственных средах, Проолежвно развитие к.ру^ыа-

eue в течение 9 суток ln vitro , Выяснено, что процесс маритогонии заканчивается через 2-3 суток, за это время мариты проходят все стадии нормального морфогенеза. Период полового размножения червей продолжается еще около 5 суток. Таким образом полный процесс дифферен-цировки и размножения марит in vitro заканчивается через 7-8 суток.

2. В результате экспериментального заражения птенцов серебристой чайки выяснено,что маритогония ы.piriformes заканчивается уже через сутки после заражения,а продолжительность жизни червей составляет 5-6 суток. Развитие M.pyemaeua в птенцах замедлено,по сравнению с темпами дяфференцировки особей M.plriformea .

3. Сравнение данных по особенностям развития микрофаллид группы "pygaaeus " la vitro и in vivo говорит о том,что мариты,развивающиеся в искусственных средах,проходят все стадии нормального морфогенеза, однако медленнее,чем в природе. Плодовитость половозрелых особей приблизительно в три раза ниже, чем в естественных условиях. Тем не менее,полученный материал, вполне пригоден для проведения биохимических исследований.

4. Методами белкового электрофореза и хромосомного анализа яод-тверадена видовая самостоятельность четырех представителей группы "pjgmaeus На основе данных по белковому электрофорезу составлена схема эволюционных взаимоотношений в группе близких видов. Хромосомный анализ и сделанный подробный литературный обзор данных позволили обсудить возможные пути принципиальной реорганизации кариотипов микрофаллид и трематод в целом в ходе эволюции.

5. При помощи метода детергентного диск-электрофореза пр~слежена динамика изменения синтез; белков у дифференцирующихся марит. Продемонстрировано изменение белкового состава, коррелирующее с происходящими морфоге;;зтическими процессами. Выделена группа белков, предположительно являющихся специфическими балками яиц.

6. Среди вновь синтезирующихся белков у марит M.pygmaeua и М. piriformes обнаружены белки теплового шока (БТШ) с молекулярной массой 70 кД. Доказательство наличия БШ было получено при помощи методов импульсного мечения и ишуноблота с антителами против БТШ 70 дрозофилы и человека. Выяснено, что не только температура, но и другие факторы среды способны вызывать синтез БТШ. Одним из возможных факторов для микрофаллад может служить кислотность среды обитания. .

7. Результаты работы не подтверждают распространенную в литературе точку зрения о ведущей роли БТТЯ при трансформации одних стадий паразитов в другие. Выдвинуто предположение, что появление НШ у микрофаллид - лишь проявление дифференцировки и признак происхо-

дящей смены программы синтеза,

8. Обнаружено существование белковых факторов, нэторыэ взаимодействуют' о проыоторной областью гена БИ1 70, В работе представлена возможная охема активации генов ЮТ1, которая демонстрирует один из вероятных механизмов регуляции переключения генетических программ в сложном жизненном цикле трематод.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Бирштейн В.Я., Михайлова Н.А. Кариотипы трех видов морских трематод рода Microphallus ( Mlorophaiildae) // Зоологический журнал. - 1989. - Т.68. - Вшт.1. - С,21-27.

2. Михайлова Н.А., Подгорная О.И. Изменение белкового синтеза при культивировании марит рода Microphallus { Treaatodai Microphalli dee в условиях in vitro J/ Онтогенез. - 1989. - Т.20. - * 4. -

С.423-430.

3. Михайлова Н.А., Подгорная О.И. Культивирование in vitro марит Mlorophallua pygmaeus (Trematodai Microphallidae ) // Лара-аитология. - 1969. - T.23. - Выл.5. - С.440-443.

4. Михайлова Н.А., Подгорная О.И., Галактионов К.В. Использование метода белкового электрофореза для видового определения микоо-фаллид группы "pygmaeus * ( Trematoda» tticrophallidae ) // Паразитология. - 1990. - Т.24. - Вып.I. - С. 12-17.

5. Birateln V.J a., Uikhailova И.A., Oa the karyology of trema-todee of the genua Microphallus.and their Intermediate gastropod» boat, Littoriaa eaxatilis. 1, Chromosome analysis of three ilicro-phollue apeciea // Oenetlca. - 1У90. - Vol.BO. - t.lW-165.

6. Birateln V.Ja,, Bikhallcva Ы.А. On the karyology of trematodes of the gecaa Microphallus end their intermediate gastropoda host, Littorlna saxatille. 2. Kai-yological study of littoriaa saxa-tilie (Gastropoda! Proeohranchi») // Oenetlca. - 19У0. - Vol.00. -P.167-170.

7. Михайлова Н.А. Экспериментальное заражение чаек метацорка-риями микрофаллидных трематод // Проблемы изучения, рационального использования и охрани природных ресурсов Белого моря: Тез.докл. -Архангельск. - 1990. - С.246-249.