Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Динамичность организации гетерохроматина вполитенных хромосомах Drosophilamelanogaster (цитогенетический аспект)

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Динамичность организации гетерохроматина вполитенных хромосомах Drosophilamelanogaster (цитогенетический аспект)"

РГЬ од

С В ВНЗ 1ЭЭ*

На правах рукописи УДК 576.315.42:576.316.352:595.773.4

^ / .

Моряков Дмитрий Евгеньевич

Динамичность организации гетерохроматина в иолитенных хромосома\Drosophila те1апо%а&иг (цитогенетический аспект).

Генетика - 03.00.15

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 1997

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

доктор биологических наук И.Ф. Жимулев

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук Л.В. Высоцкая

Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск

кандидат биологических наук Л.В. Омельянчук Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Кафедра генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета, г. Санкт-Петербург.

Защита диссертации состоится.

М

Ук

ПО 3

1998 г.

на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д - 002.11.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН

Автореферат разослан

1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

4

г

/

А .Д. Груздев

Введение

Актуальность проблемы. В геноме эукариотических организмов выделяют два типа организации хроматина: деконденсированный в интерфазе эухроматин, в котором расположена основная часть генов, и гетерохроматин, который представлен в виде компактных сильно окрашивающихся блоков на протяжении всего клеточного цикла.

Данное исследование посвящено гетерохроматину. Наиболее полным, по-видимому, является определение, данное ему A.A. Прокофьевой-Бельговской, согласно которому гетерохромаин - это "...специфические участки хромосом, ДНК которых сформирована кластерами высоко- и средне-повторяющихся, часто сателлитных, нетранскрибируемых последовательностей нуклеотидов. Обязательным свойством гетерохроматина является конденсированное состояние на протяжении всего клеточного цикла, поздняя репликация входящей в него ДНК и положительная окраска С-методом". К этому также следует добавить, что гетерохроматин исключительно обеднен генами, а так же сильно недопредставлен в политенных хромосомах.

Исследование гетерохроматина цитологически связано с рядом трудностей. Метафазные хромосомы, где с помощью дифференциальных окрасок обнаружена гетерогенность гетерохроматина, являются неактивными, тогда как в интерфазных политенных хромосомах, которые имеют значительные преимущества перед метафазными своими гигантскими размерами и постоянной активностью, гетерохроматин всех плеч в слюнных железах (СЖ) слит в общий хромоцентр, в котором можно выделить 2 типа: компактный а, и рыхлый ß. Очень удачным в этом смысле оказалось открытие мутации otu, вызывающей стерильность самок. У самок, гомозиготных по данной мутации, в полиплоидных псевдопитающих клетках (ППК) ооцитов имаго возникают политенные хромосомы. Гетерохроматин в данной ткани политенизирован и структурирован в значительно большей степени, чем в СЖ. Это позволяет исследовать его более детально и сравнить гетерохроматиновые районы в хромосомах двух типов тканей: СЖ (соматические клетки) и ППК (клетки зародышевого пути). Интересную проблему представляет собой исследование зоны перехода между эу- и гетерохроматином в политенных хромосомах,

то есть той зоны, которая разделяет эти принципиально разные типы хроматина.

Цель данной работы. Целью данной работы является сравнительный цитогенетический анализ организации гетерохроматиновых районов в политенных хромосомах СЖ и ППК ОгозорЫ1а melanogaster.

В связи с этим были поставлены следующие конкретные задачи:

• Исследовать прицентромерный гетерохроматина СЖ на предмет наличия а-гетерохроматина.

• Детально исследовать прицентромерный гетерохроматин хромосом 2 и X в ППК , т.е. построить его цитогенетические карты и выявить соответствие между разными районами гетерохроматина в политенных и метафазных хромосомах.

• Определить индивидуальный вклад хромосом в образование а- и р-гетерохроматина в политенных хромосомах как псевдопитающих клеток ооцитов, так и слюнных желез.

• Охарактеризовать район политенных хромосом, соответствующий зоне перехода митотического эу-гетерохроматина, используя перестройки, затрагивающие данный район, и клоны ДНК, локализованные в этой зоне.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые построена цитогенетическая карта гетерохроматина второй и X политенных хромосом в ППК ИгозорЬИа теЫпо^гег. Показано, что разные районы гетерохроматина дифференциально политенизируются в хромосомах соматических и зародышевых тканей. Гетерохроматин хромосомы 2 представляет собой цепь блоков а- и Р-гетерохроматина, тогда как в АТ-хромосоме прицентромерный район имеет дисковый рисунок, который превращается в р-гетерохроматин под влиянием модификаторов эффекта положения . Зона митотического эу-гетерохроматинового сочленения в политенных хромосомах находится в дисковом эухроматине. На основе данных выводов была предложена модель динамичной организации гетерохроматина в политенных хромосомах. Суть ее заключается в том, что гетерохроматин в политенных хромосомах состоит из цепи дифференциально нолитснизированных блоков. Одни и те же районы политенизируются по-разному в разных тканях. Степень

политенизации определяется функциональной нагрузкой данного района в определенной ткани в определенный период развития. Апробация работы. Основные результаты этой работы были представлены в докладе на Второй международной конференции по гетерохроматину Drosoph.Ua, 4-7 января 1995 г., Гонолулу, Гавайи, США. и в стендовом сообщении на XII Всероссийском симпозиуме по структуре и функциям клеточного ядра, 22-24 октября 1996 г., Санкт-Петербург, Россия.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы, в который входит 313 ссылок. Работа изложена на 90 страницах машинописного текста, содержит 26 рисунков. Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Материалы и методы

Линии Р. те!апоаа8Хег. Для получения мух с генотипом необходимым для цитологического анализа, синтезировали линию, несущую ош" и хромосомную перестройку, например: оШ"/ РМЗ; 1п(2К)Ь\\!У1)е'/ СуО & зп3 ош"/ У; 1п(2ЮЬкУО"/ Су О. Самок данной линии скрещивали с самцами у ч> $п3 ош" у* У' У5, в результате в потомстве получались самки хп* ош"/ у и/ хгс* ош" у* У^Р; 1п(2К)Ьмт'!/+, которых и использовали для анализа. Дополнительная У-ромосома "улучшает" цитологическое качество хромосом. Препараты политенных хромосом для цитологического анализа. Для приготовления давленных препаратов политенных хромосом использовали яичники 4-х дневных самок и СЖ личинок конца третьего возраста. Самки проходили полное развитие при +16°С. Личинки развивачись при +18°С. Из яичников предварительно вручную выделяли яйцевые камеры с ППК, находящимися на 9-11 стадиях. Препараты СЖ для исследования а-гетерохроматина выдерживали 2-7 дней при комнатной температуре. За время выдерживания эухроматиновые части хромосом становились бесструктурными и бледными, тоща как а-гетерохроматин оставался компактным и выглядел как плотное темное тело под фазовым контрастом.

Препараты политенных хромосом для гибридизации in situ. Для приготовления препаратов яйцевые камеры с ППК отделяли с помощью препаровальных игл и раздавливали в 45% уксусной

кислоте. Остальные процедуры стандартны. Гибридизация in situ. Клоны ДНК метили биотином с помощью набора для мечения и по методике фирмы BRL (США). Гибридизацию проводили в стандартных условиях. Цитохимические окраски. Окрашивание проводили по методике и с использованием реактивов и антител фирм BRL и Vector Laboratories (США).

Митотические хромосомы. Препараты митотических хромосом готовили по стандартной методике Sumner [1972].

Результаты и обсуждение

g-гетерохроматин в хромосомах слюнных желез.

В связи с притиворечивостью данных о наличии а-гетерохроматина в хромосомах СЖ D. melanogaster мы проанализировали на световом уровне хромосомы СЖ разных генотипов: ХО, XY, XYY, XX и XXY с использованием новой техники выявления а-гетерохроматина (см. Материалы и Методы).

Во всех генотипах а-гетерохроматин был обнаружен как одно или несколько небольших плотных телец в средней части хромоцентра. Более того, мы не увидели заметных различий в размерах этих телец между генотипами. Это указывает на то, Y-хромосома не вносит решающего вклада в образование данной структуры, а все хромосомы участвуют в этом, однако, возможно, в разной мере. Для выяснения индивидуального вклада плеч в образование 2-х типов прицентромерного гетерохроматина мы провели цитогенетический анализ хромосом 2 и X из ППК.

Цитогенетический анализ прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2

В хромосоме 2R гетерохроматин между районами 40С и 41D, который в хромосомах СЖ выгладит как однородная бесструктурная масса, в хромосомах ППК образует линейную последовательность блоков: небольшой компактный блок phA (PNC heterochromatin), схожий по структуре с а-гетерохроматином и диффузные блоки

4

a Roma-..

35 36 37

38 3940 41 42 43 44 43 46

С А В V ЛА4-

б

в

г

phA. phB phC

Рис. 1. Схема организации гетерохроматина хромосомы 2 в ППК. Линиями соединены гомологичные районы. рЬА, рКВ и рЬС - обозначение блоков гетерохроматина. а - делении, штриховые линии обозначают неточность картирования; б - районы митотического гетерохроматина (Ь35 - И46) (А, В - части района Ь42, С - центромера); в - использованные инверсии и клоны ДНК; г - схема гетерохроматина хромосомы 2 в

phB и phC, имеющие морфологию Р-гетерохроматина. Между блоками находятся перетяжки в виде небольших протных зерен (Рис. I).

Для определения соответствия районов митотического гетерохроматина блокам и перетяжкам, мы прокартировали ряд перестроек и клонов ДНК, с известной локализацией в гетерохроматие.

Гибридизация in situ ДНК локусов It и Rsp и картирование делеции Df(2L)SD-Roma1'5 показали, что дистальная часть гетерохроматина 2L соответствует району 40D-F, тогда как проксимальная часть гетерохроматина 2R соответствует проксимальной части блока phB (Рис. 1). Центромера хромосомы 2 расположена, по-видимому, проксимальнее блока phB, в перетяжке между phA и phB. Это означает, что районы h36-h37, образующие большую часть гетерохроматина 2L, в хромосомах ППК образуют лишь небольшой phA блок.

Соответствие гетерохроматиновых структур в хромосоме 2R с митотическими блоками было установлено картированием

ППК.

инверсий. Ы^ЩЬу/0'1 имеет проксимальную точку разрыва между митотическими блоками Ь44 и Ь45. В хромосомах ППК она прокартирована в средней части блока рЬС. Инверсия 1п(2Н)ЬмУ1>е2 имеет проксимальную точку разрыва между гетерохроматиновыми районами Ь42 и 1)43. В хромосомах ППК проксимальная точка разрыва данной инверсии расположена между блоками рЬС и рЪВ. Следовательно, блок рЬВ почти полностью образован районами Ь39 - Ь42В, а проксимальная часть блока рЬС - районами Ь43 - Ь44. Это означает, что в хромосомах ППК проксимальный гетерохроматин хромосомы 2 образован как не политенизированными фрагментами а-гетерохроматина, так и политенизированными фрагментами (3-гетерохроматина, причем последний преобладает.

Цитогенетический анализ районов 19-20 Х-хромосомы.

Известно, что температура и количество гетерохроматина в ядре влияет на некоторые свойства политенных хромосом, такие как протяженность компактизации участка хромосомы и степень недорепликации ДНК при мозаичном эффекте положения, на частоту разломов в сайтах интеркалярного гетерохроматина и частоту соматической конъюгации [см. 2Ыши1еу, 1997]. В свете данных исследований было бы интересно проанализировать влияние этих условий на морфологию прицентромерного гетерохроматина в СЖ личинок с разными генотипами: ХО, ХУ, ХУУ и XX.

Подавляющее большинство хромосом из личинок ХО не имеют четкого дискового рисунка проксимальнее 20А1-2, и район 20 имеет морфологию гранулярного (3 гетерохроматина. У самцов ХУ можно видеть уже несколько новых типов морфологии. "Пояатяется" четкий диск в районе 20В-С, и с небольшой частотой диски района 200-Р". У самок XX можно выявить те же классы, но хромосомы с дисковым рисунком до района 2(Ю-Р встречаются чаще. Наибольшее же количество хромосом с четким рисунком дисков в районе 200-1' можно наблюдать у самцов ХУУ при 25°С.

Таким образом, приведенные результаты ясно указывают, что морфология прицентромерных районов в хромосомах СЖ подвержена влиянию температуры и количества гетерохроматина в ядре, и при этом район, обычно имеющий морфологию Р-гетерохроматина может образовывать дисковый рисунок.

б

Рис. 2. Обобщенная схема организации района 20 в политенных хромосомах. Линии соединяют гомологичные районы, а - райны митотического гетерохроматина (1126-1134); б - использованные клоны и перестройки; в - схема района 20 в политенных хромосомах.

В Х-хромосоме из ППК четко видны многие диски, которые обычно отсутствуют в хромосоме из СЖ: тонкий диск в районе 20А, один плотный блок или два диска с разломом между ними, либо блок, имеющий морфологию а-гетерохроматина в районе 20В-С, район 20D-F представлен тремя плотными, близколежащими дисками. Проксимальнее этих дисков иногда можно видеть небольшое плотное тельце, которое, вероятно, является наиболее проксимальной частью Х-хромосомы. Во всех исследованных случаях в данном районе отсутствует соматическая конъюгация.

Для определения соответствия дискового рисунка на хромосомах ППК и блоков митотического гетерохроматина мы прокартировали in situ на политенных хромосомах ряд локусов.

При гибридизации in situ клона рДНК, сайг интенсивной гибридизации был обнаружен в проксимальной части района 20D-F, который, следовательно, соответствует району h29 миготических хромосом.

Далее, был использован клон aDm23-24, содержащий сателлит

359-пн. Согласно современным данным этот сателлит имеет единственный сайт локализации в районе h31-h32 Xh, между ЯО и центромерой [Lohe et al., 1993]. Однако, наша гибридизация in situ данного клона с хромосомами ППК выявила несколько сигналов гибридизации: плотное тельце проксимальнее 20F, 2 четких сигнала в виде дисков в проксимальной части хромосомы 3L и слабый сигнал в районе 40C-F хромосомы 2L.

Данные по гибридизации позволяют заключить, что большая проксимальная часть Xh (районы h31-h33) не политенизируется в хромосомах ППК. Районы с дисковым рисунком (20B-F) соответствуют дистальной трети митотического Xh (h26-h28) (Рис. 2).

Для визуализации правого плеча Х-хромосомы нами была использована хромосомная перестройка In(lLR)pn2b. На политенных хромосомах данная инверсия в районе 2Е несет небольшой плотный блок, который, по-ввдимому, является правым плечом, окруженный материалом, имеющим морфологию теломеры, в виде рыхлого светлого "облачка". Таким образом, можно заключить, что правое плечо Х-хромосомы, в СЖ не политенизируется, как в норме, так и при перестройке In(lLR)pn2b, но в последнем случае политенизируется теломера правого плеча и становится различимой на препаратах.

Таким образом, приведенные выше результаты цитогенетического анализа хромосом 2 и X, говорят о том, что прицентромерный гетерохроматин политенизируется дифференциально и существует тканеспецифичность в степени политенизации гетерохроматина. Кроме этого, налицо различный вклад хромосом в образование разных типов гетерохроматина в политенных хромосомах. Так, в ППК данный район хромосомы 2 образует цепь блоков, имеющих морфологию а- и ß-типов, тогда как Х-хромосома образует дисковый рисунок, и плотные блоки, по-видимому, а-гетерохроматина, при отсутствии ß-типа.

Зона эу-гетерохроматинового перехода в политенных хромосомах.

Для определения зоны эу-гетерохроматинового (ЭГ) перехода в хромосоме 2R мы прокартировали набор делеций, затрагивающих данный район. Картирование показало, что делеция Df(2R)MS2"'

удаляет район 41С - 41Е1-2. Деления Df(2R)MS24 имеет проксимальную точку разрыва в митотическом сегменте h46, а дистальную - в эухроматине, т.е. удаляет саму зону ЭГ перехода [Dimitri, 1991]. Наше картирование показало, что деления удаляет район 41С - 42А1-2. Деления Df(2R)MS28 генетически близка к делении MS24, и наше картирование показало, что она удаляет район хромосомы между 41С и 41F8-9. Но остается неизвестной точная локализация дистальных точек разрыва использованных делений, не известно, находятся ли они в прокимальном эухроматине или в дистальном гетерохроматине или в зоне перехода, таким образом, с уверенностью можно обсуждать лишь проксимальные точки разрывовов делений MS24 и MS2S. Эти данные указывают, что дистальный гетерохроматин (Ь4б) соответствует дискам района 41С, а зона ЭГ перехода расположена дистальнее, в участке хромосомы, имеющем нормальный рисунок дисков.

Определить зону ЭГ перехода в хромосоме 2L можно, используя результаты картирования делении Df(2L)SD-Romal,s и гибридизации in situ ДНК гена It. Данные результаты позволяют заключить, что зона, соответствующая ЭГ переходу хромосомы 2L расположена в районе 40D-E.

Для Х-хромосомы мы прокартировали in situ ДНК гена su(f), который, как считается, является наиболее проксимальным в X-хромосоме и расположен в зоне митотического ЭГ перехода. Сильный сигнал гибридизации был обнаружен в районе 20С. Это означает, что исследуемая зона расположена в эухроматине, дистальнее данного сайта.

Приведенные выше результаты по трем плечам свидетельствуют, что район, содержащий митотическую зону перехода эу-гетерохроматин в политенных хромосомах расположен в эухроматине, имеющем дисковый рисунок. Для Х-хромосомы это дистальнее 20С, для хромосомы 2L - дистальнее 40Е, для хромосомы 2R - дистальнее 41С.

Проблема ЭГ перехода в Х-хромосоме обсуждалась достаточно долгое время, но к единому мнению исследователи так и не пришли. Полагали, что зона перехода в политенных хромосомах расположена в районе 19Е или в районе 20D. Возможно, что в районе 20 не существует одной зоны ЭГ перехода, а гетерохроматиновые

последовательности перемежаются эухроматиновыми.

Согласно нашему картированию, зона перехода расположена дистальнее района 20В-С, где дисковый рисунок обычно хорошо различим, что подтверждает данные для хромосомы 2. Если предположить, что блоки в районе 20В-С и проксимальнее 20F образованы а-гетерохроматинаом, то действительно, в районе 20 можно видеть как минимум 3 зоны ЭГ перехода: дистальнее и проксимальнее 20В-С и дистальнее 20F

Таким образом видно, что проблема ЭГ перехода сложна как в смысле картирования, так и в смысле интерпретации результатов. Уверенно можно назвать лишь районы политенных хромосом, являющиеся проксимальной возможной границей такого перехода, и эти районы расположены в эухроматине, имеющем четкий дисковый рисунок.

С картированием ЭГ перехода тесно связан вопрос локализации на политенных хромосомах наиболее проксимального, по генетическим данным, локуса. В Х-хромосоме таковым является suffi.

Мы установили положение гена su(f), и, как следствие, проксимальную границу "обычных" (т.е. не перекрываемых Y-хромосомой) генов в Х-хромосоме - 20С. Однако, в этом случае остается неясным, чем образованы диски районов 20C-F, соответствующие сегментам Ь2б и h27 митотических хромосом, отчетливо видимые в хромосомах ППК, и, при определенных условиях, в СЖ. Данный район содержит последовательности ABO, er и Sie, но не содержит обычных генов. Из этого можно предположить, что либо данные последовательности функционируют в политенной Х-хромосоме, либо в данном районе присутствуют еще неизвестные гены, которые не могут быть обнаружены традиционными генетическими методами.

Организация "глубокого" гетерохроматина.

Расположенные проксимальнее ЭГ перехода районы "глубокого" гетерохроматина содержат различные последовательности ДНК, такие как высоко-, среднеповторенные и уникальные. Естественным было бы предположить, что эти последовательности будут как по-разному реплицироваться в

хромосомах политенных тканей, так и формировать разные морфологические структуры.

Схема, обобщающая результаты анализа хромосомы 2 показана на Рис. 1. Видно, что гетерохроматин хромосомы 2 представляет собой цепь, состоящую из крупных р-гетерохроматиновых блоков (рЬВ и рЬС) и небольших блоков а-гетерохроматина (рЬА и перетяжки). Картирование инверсий ЬкЮе1 и Ьч?те2 демонстрирует тканеспецифичность репликации районов И43-Ь44 в разных политенных тканях, поскольку данный район в хромосомах ППК образует крупный блок, а в хромосомах СЖ он не политенизируется вовсе.

Интересно организован прицентромерный район X-хромосомы. Наши иследования показали, что изменение температурного режима и количества гетерохроматина в ядре клетки СЖ позволяет увидеть диски до района 20Р, а в ППК дисковый рисунок на протяжении всего района 20 является практически нормой. Таким образом, в Х-хромосоме практически весь митотический гетерохроматин представлен лишь небольшим блоком, имеющим морфологию а-гетерохроматина, а дистальная часть митотического гетерохроматина имеет дисковый рисунок.

Мы построили синтетическую карту основания Х-хромосомы вплоть до теломеры правого плеча (Рис. 2). В районе 20В-С можно видеть 2 плотных диска со слабой точкой между ними, либо блок с морфологией а-гетерохроматина. Район 20Э-Р образован 3-мя близкорасположенными дисками, проксимальнее которых находится ЯО. Проксимальнее этих структур находится блок плотного материала, содержащий сателлит 359 пн. Данный блок через центромеру соединен с еще одним плотным блоком, ограниченным рыхлой теломерой правого плеча.

Сравнение морфологии прицентромсрных районов хромосом X, 2Ь и 2Н в ППК демонстрирует различия в общей схеме их организации. В хромосоме 2И можно видеть чередование блоков а-и Р- гетерохроматина, в хромосоме 2Ь практически весь митотический гетерохроматин представлен лишь небольшим блоком, имеющим морфологию а-гетерохроматина, а в Х-хромосоме в прицентромерном районе можно видеть дисковый рисунок и один-два небольших плотных блока хроматинового материала при полном отсутствии р-типа.

123456 78

Политенная хромосома в СЖ

Гетерохроматин Эухроматии Митотическая 123456 78 1 хромосома —*"'

В -> 1

12 3456 78

Политенная хромосома г в ППК

Рис. 3. Схема организации прицентромерного гетерохроматина в митотических (а), и политенных хромосомах из СЖ (б, в) и ППК (г), иллюстрирующая модель динамичной организации гетерохроматина. Объяснения в тексте.

Модель динамичной организации прицентромерного гетерохроматина в политенных хромосомах.

Обобщая наши и литературные данные, мы предлагаем модель динамичной организации гетерохроматина в политенных хромосомах.

Основные положения модели следующие:

• Гетерохроматин в политенных хромосомах состоит из цепи дифференциально компактизованных и дифференциально политенизированных блоков.

• Одни и те же районы политенизируются по-разному в разных тканях, и существуют переходы: дисковый рисунок - р-гегерохроматин, или а-тип - Р-тип в разных тканях или при разных условиях.

• Степень политенизации определяется функциональной ролью данного района в определенной ткани в определенный период развития.

Схема данной модели представлена на Рис. 3. Здесь митотический гетерохроматин представлен цепью блоков, пронумерованных 1-8 (Рис. За). В хромосомах СЖ блоки 1, 3, 5 и 7 остаются недопредставленными и компактными. Блок 8 образует зону перехода, формируя основания политенных плеч (районы 20, 40 и 41). Недопредставленные блоки соединяются вместе. Образуя а-гетерохроматин (Рис. 36, в), тогда как частично политенизированные выпетливаются образуя рыхлый Р-гетерохроматин (как было предложено Traverse и Pardue [1989]). В хромосомах ППК (Рис. Зг) некоторые районы (номер 5 на схеме), которые являются компактными в хромосомах СЖ, реплицируются частично и становятся диффузными. Таким образом один и тот же район может образовывать a-тип в одной ткани и Р-тип в другой.

Близкие взгляды уже выражали другие авторы [Traverse, Pardue, 1989; Devlin et al., 1990b; Berghella, Dimitri, 1996]. Но, они предполагали, что а-гетерохроматин образуется из недопредставленных сателлитов, а Р-тип из политенизированных уникальных и среднеповторенных последовательностей ДНК. Мы предлагаем другое разделение, и более корректно будет разделять последовательности по способности к политенизации, а не на сателлиты - несателлиты.

Действительно, в хромосомах СЖ не политенизируются некоторые несателлитные последовательности (мобильные элементы MDG1, aurora, гетерохроматиновые копии гена Ste). И наоборот, сателлиные последовательности реплицируются в полиплоидных питающих клетках D. virilis или в шелковой железе Bombyx mori. Некоторые Р-элементные инсерции в прицентромерный гетерохроматин политенизируются до уровня эухроматина.

Одна и таже последовательность может политенизироваться по-разному, в разных местах генома. Так, сателлит 359-пн, как оказалось имеет несколько новых сайтов выявленных на политенных хромосомах, и не обнаруженных ранее на метафазных. Вероятно, сайты в хромосомах 2L и 3L "не видны" на метафазных пластинках из-за небольшого количества единиц повтора в них. При этом в районе 80 образуются 2 четких диска, а длинный тандемный повтор, занимащий около трети длины Xh, недопредставлен в ППК, образуя лишь небольшой блок, проксимальнее 20F.

Причина, вызывающая дифференциальную политенизацию гетерохроматина остается неясной и требует дальнейших исследований. Мы со своей стороны полагаем, что свойства гетерохроматина (компактность, степень политенизации и др.) определяются не столько конкретной последовательностью нуклеотидов, сколько функциональными свойствами.

Однако, под термином "функциональные свойства" можно подразумевать очень широкий спектр вопросов. В первую очередь можно думать, что политенизацию определяют генетические свойства, т.е. транскрипция. Действительно, для некоторых генов, локализованных в гетерохроматине охарактеризованы РНК-продукты {и, г1, ¡иф). Как считается, районы Ь36 - Ь37 не содержат генов, и, по нашим данным этот район не реплицируется в хромосомах ППК. В тоже время районы Ь39 - И41 содержат гены 1(2)41Аа, 1(2)41 АЬ и г/, и именно эти районы формируют крупный блок рЬВ. Однако, данное правило, по-видимому, не выполняется для Х-хромосомы, поскольку ген материнского эффекта 2кг, который обязан функционировать в питающих глетках, и картированный в районе Ь32, в политенных хромосомах ППК вероятно локализован в плотном блоке, проксимальнее 20Б.

Кроме генетических свойств политенизацию могут определять цитологические свойства некоторых районов, такие, например, как наличие сайтов мейотического спаривания илг. центромеры. Но ППК являются интерфазными и не участвуют ни в одном из типов делений, и, как было показано, данные сайты далеко не всегда связаны с прицентромерным гетерохроматином. Однако, можно было бы предположить, что сайты участвующие в столь важном событии в жизни клетки, как деление, могут иметь некий "следовой эффект".

Одним из самых замечательных свойств гетерохроматина является его способность инактивировать эухроматиновые гены при переносе последних к гетерохроматину перестройками, так называемый мозаичный эффект положения.

Обобщая данные разных авторов можно заключить, что любой фрагмент гетерохроматина Х-хромосомы, от зоны ЭГ соединения до правого плеча, способен вызывать инактивацию. Следовательно, таким свойством обладают и районы, которые можно видеть в виде дисков в районе 20 как в хромосомах СЖ, так и в ППК. Однако, не

стоит забывать что в хромосомах СЖ эти диски видны лишь при определенных условиях, а в ППК практически всегда, но при этом частота и сила инактивации в ППК значительно снижена [МаГсеуа «Л, 1997].

Анализ инверсий 1п(2Я)Ьи 1п(2Л)Ьмте2 показал, что районы, вызывающие сильную компактизацию формируют проксимальную часть блока рЬВ и дистальную часть блока рЬС, т.е. достаточно сильно политенизированные районы. Таким образом, можно предполагать, что степень политенизации каким-то образом связана с инактивирующей способностью участков гетерохроматина при эффекте положения. Но с полной уверенностью можно констатировать лишь то, что эта связь не прямая, а чем-то опосредована, т.к. инактивация происходит не в политенных клетках, а в их предшественниках.

Вероятными кандидатами в посредники являются белки, влияющие на мозаичность и участвующие в формировании хроматина. Но, в результате исследования ряда генов-модификаторов оказалось, что структурным является белок лишь одиного из них, Би(\>аг)205 - НР1. Будучи продуктом гена-супрессора, этот белок обнаруживается как в хромоцентре, так и в районах эухроматина, компактизованных в результате эффекта положения, что не противоречит нашему предположению, однако, нельзя сделать однозначного заключения о влиянии специфических белков на степень политенизации гетерохроматина.

Вышеизложенные рассуждения говорят о том, что на данный момент мы не знаем конкретного фактора, который всецело бы определял степень репликации прицентромерного гетерохроматина в политенных хромосомах. Но, возможно, такого фактора и не существует, и данные свойства определяются комплексом причин, что требует дальнейших разработок в данной области.

Выводы

Проведено цитогенетическое исследование прицентромерных районов хромосом X и 2 в СЖ и ППК ооцитов ОгозорИНа melanogaster.

1. Продемонстрировано наличие а-гетерохроматина в политенных

хромосомах слюнных желез и показано, что число У-хромосом

не является определяющим для размера блока а-гетерохроматина, и каждое плечо вносит вклад в формирование гетерохроамтина а- и (3- типов.

2. Показано, что прицентромерный гетерохроматин политенной

хромосомы 2 в ППК образует цепь блоков с разной степенью политенизации, и блоки а-типа чередуются с блоками (3-типа.

3. Показано, что прицентромерный гетерохроматин политенной

Х-хромосомы в ППК не образует Р-типа, и а-гетерохроматин чередуется с эухроматином. Определено соответствие морфологических структур гетерохроматина политенных хромосом и блоков гетерохроматина митотических хромосом хромосом 2 и X.

4. Гибридизацией in situ и картированием перестроек показано,

что в политенных хромосомах митотическая зона перехода эу-гетерохроматин расположена в эухроматине с дисковым рисунком, дистальнее 40E-F в хромосоме 2L, дистальнее 41С в хромосоме 2R, дистальнее 20С в Х-хромосоме.

5. Уточнено положение точек разрывов делеций Df(2R)MS24,

Df(2R)MS28, Df(2R)MS2'° и локусов stw, ар, 1(2)4IAe и 1(2)41Ah хромосомы 2R. Определено положения ядрышкового организатора Х-хромосомы - район 20F.

6. Показано, что морфология прицентромерного гетерохроматина

в СЖ зависит от внешних условий. У самцов ХО при 16°С район 20 имеет морфологию Р-гетерохроматина, у самцов Х1Т при 25°С данный район образует дисковый рисунок.

7. Предложена модель динамичной организации гетерохроматина

в политенных хромосомах, согласно которой степень политенизации каждого конкретного района зависит от его функциональных особенностей в конкретной ткани и в конкретный период развития. Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1 Кйряков Д.Е., Жимулев И.Ф. Частичная политенизация al-рЬа-гетерохроматина второй хромосомы в псевдопитающих клетках ооцитов мутантов otu Drosophila melanogasterl! Докл. Акад. Наук. 1995. Т. 344. С. 568-571.

2 Жимулев И.Ф., Беляева Е.С., Семешин В.Ф., Похолкова Г.В., Кокоза Е.Б., Козлова Т.Ю., Демаков С.А, Мальцева Н.И.,

Демакова О.В., Баласов M.JI., Коряков Д.Е., Макунин И.В., Белоусова Н.В. Молекулярно-генетическая организация политенных хромосом// Известия Акад. Наук. Серия химичесая. 1995. N 9. С. 1622-1638.

3 Koryakov D.E., Belyaeva E.S., Alekseyenko А.А., Zhimulev I.F. Alpha- and beta-heterochromatin in polytene chromosome 2 of Drosophila melanogaster/l Chromosoma. 1996. V. 105. P. 310-319.

4 Koryakov D.E., Zhimulev I.F. Mapping of deficiencies and loci in the chromosome 2R eu-heterochromatin juncton point in Drosophila melanogasterII DIS. 1996. V. 77. P. 123-124.

5 Коряков Д.Е., Алексеенко А. А., Беляева E.C., Жимулев И.Ф. Модель динамичной организации гетерохроматина в политенных хромосомах дрозофилы// Цитология. 1997. Т. 39. С. 72.

6 Belyaeva E.S, Koryakov D.E„ Pokholkova G.V., Demakova O.V., Zhimulev I.F. Cytological study of the brown dominant position effect// Chromosoma. 1997. V. 106. P. 124-132.

Подписано к печати 21.10.97 г.

Формат бумаги 60x90 1/16. Печ. л. 1. Уч.-изд. л. 0,7.

Тираж 100 экз. Заказ 89.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, проспект академика М.А. Лаврентьева, 10.