Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Диазотрофы содовых солончаков

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Диазотрофы содовых солончаков"

/

На правах рукописи

Сорокин Иван Дмитриевич Диазотрофы содовых солончаков

Специальность 03 00 07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2008

003168363

Работа выполнена в Институте микробиологии им С Н Виноградского РАН

Научный руководитель кандидат биологических наук

И.К. Кравченко

Официальные оппоненты доктор биологических наук

Т.Н. Жилина

доктор биологических наук А.Л. Степанов

Ведущая организация Институт биохимии и физиологии

микроорганизмов им. Г.К Скрябина РАН

Защита диссертации состоится «12 » мая 2008 г в 14-00 ч

на заседании Диссертационного совета Д 002 224 01 в Институте микробиологии им СН Виноградского РАН по адресу 117312, г Москва, Проспект 60-лет Октября, д 7, к 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им СН Виноградского РАН

Автореферат разослан «с?» апреля 2008 г

Ученый секретарь ^

Диссертационного совета, <~7/~~* 'Я*

кандидат биологических наук СУ'Ь • С™'*1/ т В Хижняк

ОБЩ4Я ХАРАЮEPIIC1 JIIfA РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Азотфиксация (АФ) является важнейшим звеном в глобальном цикле азота и наряду с фиксацией углекислоты обеспечивает продуктивность биосферы в целом Многие природные экосистемы лимитированы по доступным соединениям азота, что придает процессу азотфиксации особое значение в круговороте биогенных элементов Традиционно основное внимание исследователей было направлено на изучение симбиотической азотфиксации в связи с ее значимостью для сельского хозяйства Однако за последние годы было убедительно показано, что диазотрофия широко распространена среди прокариот, и микроорганизмы, способные фиксировать молекулярный азот, присутствуют практически во всех экосистемах, не связанных с агрокультурой (Zehr, 2003) Именно способность к азотфиксации дает возможность прокариотам существовать в эконишах с крайне низким содержанием азота, а также обогащать окружающую среду азотными соединениями

Исследования процесса азотфиксации в засоленных почвах выполнены главным образом, в таких странах как Пакистан, Индия, Египет, где большие территории возделываемых земель подвержены засолению (Rai, 1991, Zahran et al, 1995, Abd-Alla, 1999). Однако они не распространяются на почвы содовых солончаков, характерной особенностью которых является высокая щелочность В нашей стране почвы содового засоления можно отнести к экзотическим местообитаниям за исключением Юго-Западной Сибири и Забайкалья В то же время они представляют уникальный природный объект для изучения галоалкалофильных микроорганизмов - экологической группы, которая обладает рядом физиологических особенностей, обусловленных средой обитания Изучение процесса азотфиксации важно также для агрономии, которая пытается решить проблемы увеличения плодородия в этих почвах

В отличие от содовых солончаков, микроорганизмы содовых озер активно исследуются микробиологами в течение последних 10-15 лет (Жилина и др, 2001, 2005, Jones et al, 1998, Baumgarte, 2003, Sorokm and Kuenen, 2005) Благодаря исследованиям, выполненным сотрудниками ИКМИ РАН, получена достаточно полная картина основных компонентов галоалкалофильного сообщества и их взаимодействий (Заварзин и др, 1999) В то же время, сведения о процессе АФ и составе диазотрофных сообществ в содовых местообитаниях остаются весьма ограниченными (Herbst, 1998, Steward etal, 2004)

В связи с изучение активности и биоразнообразия азотфиксирующих диазотрофов в почвах содовых солончаков, для которых характерно как высокое содержание солей, так и высокая щелочность, представляет научный и практический интерес В контексте настоящей работы представлялось важным выяснить, существуют ли отличия в диазотрофной микрофлоре содовых солончаков от того, что известно для содовых озер

Целью данной работы являлось изучение процесса АФ и характеристика диазотрофных микроорганизмов в почвах содового засоления В задачи исследования входило:

1 Определение потенциальной АФ в содовых солончаках различной географической принадлежности

2 Изучение влияния различных факторов на АФ микробных популяций содовых солончаков

3 Выделение и исследование накопительных культур азотфиксирующих бактерий из образцов содовых солончаков

4 Выделение, характеристика и таксономическое описание чистых культур диазотрофов из содовых солончаков

5 Изучение структуры диазотрофных сообществ в накопительных культурах методом молекулярного анализа гена пфЛ

Научная новизна. Впервые установлено наличие потенциальной способности к АФ в почвах содового засоления различных географических регионов С помощью культуральных и молекулярных методов установлено преобладание в диазотрофных накопительных культурах, выделенных при pH 10, грамположительных бактерий с низким ГЦ, относящихся к бациллам и сульфидогенным клостридиям Из содовых солончаков Центральной Азии и Египта выделены 11 чистых культур галоалкалофильных азотфиксирующих бацилл РНК групп 1 и 6, в которых АФ не была известна На основании физиологических и филогенетических признаков восемь изолятов описывается как новый род и новый вид "Natronobacillus azotifixans", два изолята классифицированы как новый вид "Amphibacillus diazotrophicus" и один изолят как новый вид "Bacillus alkalidiazotrophicus" Все выделенные чистые культуры являются облигатными бродилыциками, рост и АФ активность которых возможны только в щелочных условиях с оптимумом pH 9-10 АФ активность клеток подавлялась уже умеренными концентрациями солей натрия (> 2 М Na+) Практическая значимость Полученные данные свидетельствуют о том, что, при наличии благоприятных условий (увлажнение и частичное рассоление) содовые солончаки могут осуществлять одну из важнейших функций плодородных почв -фиксацию атмосферного азота

Апробапия работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на следующих конференциях Всероссийская молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии» 2005, Москва, Россия, III Международная молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии» 2007, Москва, Россия, Second International

Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (MicroBioWorld), 2007, Севилья, Испания

Публикации Основные материалы, обсуждаемые в диссертации, содержатся в 2 статьях и 3 тезисах конференций 2 статьи сданы в печать

Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, описания методов и объектов, экспериментальной части, выводов и списка литературы Текст включает 98 страниц, 13 таблиц, 22 рисунка, список литературы включает 138 наименований, из них 13 на русском и 125 на английском языке Место проведения работы и сотрудничество. Микробиологическая часть работы выполнялась в Институте микробиологии им С.Н Виноградского РАН под руководством к б н И К Кравченко Молекулярно-биологическая часть работы выполнена в Центре «Биоинженерия» РАН при содействии к б н Е С Булыгиной Образцы содовых солончаков были собраны как в ходе собственной экспедиции в Кулундинскую степь, так и предоставлены дбн Д Ю Сорокиным

Молекулярный анализ гена nifll был выполнен в сотрудничестве с кбн Е С Булыгиной и асп Е В Задориной, сиквенс-знализ генов 16S-rRNA- с кбн Т.В Колгановой Филогенетический анализ был выполнен кбн Т П Туровой, ДНК-ДНК гибридизация -кбн AM Лысенко, анализ жирных кислот -дбн ГА. Осиповым Автор выражает глубокую благодарность всем упомянутым участникам данной работы

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследований. В работе было использовано 56 образцов содовых солончаков (верхний горизонт 0-5 см), отобранных в б регионах, из которых 5 находились в Центральной Азии и 1 - в Северной Африке Величина рН водной вытяжки варьировала от 9 2 до 10 7, содержание водорастворимых солей - от 1 до 38%, а величина растворимой щелочности - от 20 до 1740 ммол/кг (Табл. 1)

Измерение потенциальной активности азотфнксашш (АФ) проводили с помощью ацетиленового метода Образцы почв образцы увлажняли и выдерживали 2 суток, после этого добавляли раствор глюкозы и вводили 10% ацетилена в газовую фазу При анализе накопительных и чистых культур ацетилен вводили после видимого прироста биомассы В газовой фазе периодически измеряли методом газовой хроматографии накопление этилена как индикатора нитрогеназной активности

Таблица 1 Характеристика образцов содовых солончаков

Регион Количество образцов Характеристика образцов

рН водной вытяжки (15) Растворимые соли (%) Щелочность ммоль/кг

Араратская долина 8 9 7-10 2 0 9-38 8 20-190

(Армения)

Кункурская степь

(Читинская 5 9 2-9 9 2 5-7 6 20-90

область)

Барабинская степь

(Новосибирская 9 9 8-10 7 2 5-6 0 10-120

область)

Кулундинская

степь (Алтайский 7 9 6-10 21 5 3-38 5 230-1410

край)

Северо-Восточная 24 9 7-10 8 1 2-12 85 10-1140

Монголия

Вади Натрун 3 10-10 3 8 5-10 2 750-1740

(Египет)

Выделение накопительных и чистых культур диазотрофов. Для получения активных азотфиксирующих культур использовали минеральную среду на основе карбонатного буфера с содержанием общего натрия 0 6,20и40Мс максимальной буферной емкостью в диапазоне рН от 9 5 до 10 2 Преимущество данной среды состоит в том, что даже при низкой ее концентрации значения рН остаются стабильным в щелочном диапазоне значений как после стерилизации, так и в ходе длительной инкубации В качестве субстрата в основном добавляли глюкозу. При выделении накопительной культуры среда не содержала связанного азота, а для чистых культур вносили 10 мг/л дрожжевого экстракта Выделение накопительных культур проводили из образцов почв различных регионов с наивысшей потенциальной АФ Чистые культуры диазотрофов выделяли та накопительных культур с устойчивой АФ с использованием сред, содержащих 0 6 - 2 0 М общего Ыа+ Из накопительных культур производили десятикратные разведения, выбирали максимальное разведение, где была зарегистрирована АФ, и делали из него высев на агаризованные среды Колонии различных морфотипов отбирали под контролем бинокуляра и переносили в соответствующую жидкую среду без азота После проверки на АФ активные культуры повторно проводили через твердую среду до тех пор, пока не достигали однотипности колоний Конечную чистоту выделенных культур проверяли путем секвенирования гена 168 гРНК

Работа с чистыми культурами Для оценки влияния концентрации на рост чистых культур использовали карбонатный буфер (рН 10), а для оценки влияния рН использовали буфер НЕРЕ5/КаС1 (рН 6-8) и КаНСОз/Ыа2СОз/НаС1 (рН 8-11 5) В опытах по влиянию рН обязательно регистрировали его изменения в ходе роста и в разделе «Результаты» представлены конечные значения Влияние рН и

солености на АФ изучали в «острых» опытах с отмытыми клетками в анаэробных условиях в присутствии 1 мМ сульфида Активность дыхания измеряли на отмытых клеточных суспензиях с помощью кислородного электрода Каталазную активность определяли с помощью нодометрического метода

Молекулярно-биологические методы Геномную ДНК выделяли с помощью стандартной процедуры щелочного гидролиза с незначительными модификациями, а ее очистку проводили с помощью Wizard-технологии фирмы Promega (США) Фрагмент гена 16S rRNA амнлифицировали с использованием универсальных прайм еров 11F и 1492R, а фрагмент гена mjН с помощью пары вырожденных праймеров F1-R6 (Марусина и др 2001 Продукты ПЦР очищали в легкоплавкой агарозе с применением набора PCR-Preps (Promega, США) ПЦР-фрагменты mfi\ гена клонировали согласно протоколу фирмы Promega "pGEM-T и pGEM-T Easy vector systems technical manual" (1997) В качестве векторной системы использовали вектор pGEM-T Easy Vector System I (Promega, США) Рестрикционный анализ плазмидной ДНК осуществляли с помощью фермента XapI (Apol) Денатурирующий градиентный гель-электрофорез фрагментов гена 16S rPHK (DGGE) проводили согласно протоколу (Schäfer and Muyzer, 2001) с использованием денатурирующего градиента 30-70% под напряжением 100 В в течение 16 ч при 60 °С Сиквенс генов 16S гРНК и mjН проводили в Центре «Биоиженерия» РАН с использованием автоматического капиллярного секвенатора (Silver Sequence d/ddNTP Mixes, Promega, США) Для предварительного анализа полученных нуклеотидных последоватеотностей генов 16S гРНК и «i/H использовали программу BLAST Транслирование нуклеотидных последовательностей осуществляли с помощью программы ORF Finder, а выравнивание последовательностей - с помощью программы Clustal W 1 75 Построение дендрограмм осуществляли с помощью алгоритма "neighbor-joining" (NJ) в программе TREECON

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Потенциальная АФ содовых солончаков различных регионов.

Потенциальная АФ была зарегистрирована в 47 из 56 исследованных образцов и варьировала в широком диапазоне от 0 01 до 47 1 мкг N г1 сут'1 (Табл. 2) В наиболее активных образцах процесс начинался либо немедленно, либо после короткой лаг-фазы (менее суток) после внесения глюкозы, однако в большинстве случаев активность проявлялась лишь после длительной лагфазы

(2-3 сут), что может свидетельствовать либо о незначительным исходном количестве диазотрофов, либо о их нахождении в виде глубоко покоящихся форм (спор)

Таблица 2 Потенциальная АФ в содовых солончаках__

Регион Количество образцов Количество образцов с АФ = [мкг N (г сут)"1!

0.1-10 10-20 20-30 30-40 40-50

Армения 8 0 0 3 0 0

Кункурская степь 5 1 0 0 0 0

Барабинская степь 2 0 2 0 0 0

Кулунда-север 7 3 2 2 0 0

Кулунда-юг 7 6 1 0 0 0

Монголия 24 16 5 1 1 1

Египет 3 3 0 0 0 0

Зональные 0 0 0 0

(контроль) 3 3

Зональные (незаселенные) почвы дерново-подзолистая, серая лесная, чернозем выщелоченный (рН от 5 5 до 7 2)

В целом можно констатировать угнетение АФ высокой соленостью и щелочностью, хотя для нескольких образцов с достаточно высокими показателями была выявлена значительная величина АФ Специальный эксперимент с одним из образцов Кулундинской степи с высокой соленостью показал, что популяция диазотрофов находилась в неактивном состоянии до момента разбавления солевого пула в несколько раз Аналогичный эксперимент с низкосоленым образцом почвы Барабинской степи (рН 11) показал, что диазотрофы содовых солончаков успешно выживали в условиях с высоким рН среды и оптимум для АФ составлял рН 9 5-9 8

2. Выделение дназотрофных накопительных культур из образцов содовых солончаков.

Для получения накопительных культур диазотрофов использовали образцы почв содового засоления юга Кулундинской степи, Монголии и Египта, которые, с одной стороны, характеризовались высокой щелочностью а, с другой стороны, обладали существенной потенциальной АФ Всего в работе было использовано 5 образцов содовых солончаков 3 образца из Кулундинской степи (13КБ, 22КБ, 24КБ), 12МЭ - из Монгольской степи и ЕБ 3 - из Египта Наиболее активные накопительные культуры со стабильно поддерживаемой АФ были получены в статических условиях культивирования с соотношением среда/воздух 3 1 и глюкозой в качестве субстрата При этом активность сохранялась и при замене воздуха на аргон, что свидетельствовало о селекции диазотрофов-бродилыциков Рост всех культур происходил до насыщения среды содой (4 М Иа+), однако при

этом АФ резко снижалась при увеличении солености выше 2 М Na+ за исключением накопительной культуры из наиболее соленого образца 22KS, где слабая АФ была зарегистрирована даже при насыщении содой. Эти данные позволили предположить доминирование в накопительных культурах умеренно галофильных алкалофильных диазотрофов. Микроскопия культур указывала на преобладание грам-положительных, эндоспор-образующих форм, что было подтверждено DGGE анализом 16S гРНК трех накопительных культур (Рис.1). Идентифицированные ампликоны были отнесены к РНК группе 6-7 рода Bacillus, для представителей которой диазотрофия неизвестна. Однако данный анализ не дал ответ на вопрос, кто из этих компонентов может быть диазотрофом. По современным представлениям все диазотрофные виды группы бацилл сосредоточены в роде Paenibacillus (Achouak et al., 1999). Данный род включает и алкалофильные виды, однако они не обладают диазотрофной активностью (Coelho et al., 2003). В наших накопительных культурах присутствие бактерий этой группы не обнаружено.

13KS 24 KS 12 MS

-21

В. arseniciselenaiis 13 KSDGGE Bandl 24 KS DGGE Band4

•В. Modurans DSM 8718

B. halodurans AH-10 t B. alcaliinulinus

-B. alcalophilus YB380

-B. alcalophilus DSM 485 Iflnj B. pseudofirmus DSM 8715

1B. pseudofirmus OF4

-Ш

В. vedderi

13 KS DGGE Band2

,--B.selenaiireducens

i—121 ¡1-

24 KS DGGE Band5 12 MS DGGE Band6

B. agaradhaerens

Mnnj-

- B. carboniphilus JCM9731

— B. sporothermodurans M215

- B. subtilis

B.fumarioli LMG 18435 B. methanolicus C1

0.02

Рис.1 ОйвЕ-анализ накопительных диазотрофных культур и результаты филогенетического анализа ампликонов 168 гРНК гена накопительных культур полученных с помощью ОвОЕ. Полосы 3 и 7 реамшшфицировагь не удалось. '

3. Выделение чистых культур анаэробных диазотрофных галоалкалофилов из накопительных культур.

Анализ предельные разведений накопительных культур, проведенный на средах с глюкозой при 0.6 М-2.0 М Ыа+ (13 КБ, 24 Кв, 12 МБ) и 2-4 М Ыа+ (22 О)

в микроаэробных условиях, показал, что диазотрофный компонент составляет не более 0 1% от общего количества клеток, вырастающих на безазотистой щелочной среде Чистые культуры выделяли путем многократных рассевов серийных разведений на твердые агаризованные среды и всего было получено 23 культуры, способные к росту на безазотистой жидкой среде с глюкозой Из них только 11 штаммов при пересеве в жидкую среду обладали нитрогеназной активностью до б нмоль КУ(мг белка ч), которая была также подтверждена детекцией т/Н гена (Табл. 3) Все изоляты представлены подвижными грам-положительными перитрихами, образующими эндоспоры. Доминировал морфотип 1-1 с удлиненными клетками и обильным спорообразованием (8 штаммов), а два штамма морфотипа 1-2 из высокосоленого образца 22К8 отличались укороченными клетками, редким спорообразованием и отсутствием полисахаридов, образуемых доминирующим морфотипом 1-1. Наконец, единственный штамм М8 6 морфотипа 2 из Монгольского образца имел клостридиальную форму клеток, явно отличаясь от остальных штаммов (Рис. 2)

Таблица 3 Чистые культуры диазотрофных бактерий, выделенные из микроаэробных

№ штамма Источник Соленость среды, М Na+ Морфотип* ГЦ моль% вдпк

13KS-1 13KS 06 1-1 -

24KS-1 24KS 06 1-1 36 1

24KS-2 I 3 1-1 37 0

22KS-2 22KS 20 1-2 39 0

22KS-4 40 1-2 38 8

MS4-1 06 1-1 38 5

MS 5 MS 1 3 1-1 38 0

MS 6 06 2 37 1

ESI 06 1-1 37 2

ES2 ES 13 1-1 36 3

ES3 20 1-1 37 1

4. Идентификация диазотрофов из содовых солончаков.

Филогенетический анализ последовательностей гена 16S гРНК показал, что все выделенные штаммы попадают в кластер бацилл с низким ГЦ в 16S гРНК группах 1 и 6, в которых гало- и алкалофилия весьма распространены (Рис. 3) Анализ выявил три филотипа, совпадающих с морфотипическим делением Доминирующий морфотип 1-1, включающий 8 штаммов, образует отдельную ветвь, кластирующуюся с галоалкалофильным бродилыциком из содовых озер Amphibacillus tropicus (Жилина и др, 2001). Подтип 1-2 этой группы близок к другому галоалкалофильному виду рода Amphibacillus - Amphibacillus fermentum, описанному в той же работе Штаммы группы 1-1 между собой имели высокий процент сходства последовательностей, указывающий на принадлежность к одному геновиду, что также подтверждается сходством тотальных белков и

уровнем ДНК гибридизации (>70%). В то же время уровень сходства с ближайшим родственником A. tropicus (95% сходства нуклеотидных последовательностей, 30-35% ДНК-ДНК гомологии) предполагает различие на уровне далеких видов или даже близких родов. Штаммы морфотипа 1-2 также очень близки между собой (85% ДНК гомологии) и образуют кластер видового уровня в группе A. fermentum-A.xylanus. ДНК гомология с группой 1-1 - менее 30%.

ИДЕ» ' - / 1 Г , Ж ' О' J в J }, ', v, N \ 1 Ч / ; - - N - ~ - • ' N 1Sf™ 22KS-4

тш • ■ • > щ ' Hk Тип '-1 S W 24KS-I

Рис. 2 Морфология чистых культур диазотрофных бактерий из содовых солончаков, выращенных в микроаэробных условиях с глюкозой при рН 10.

Таким образом, стало очевидным, что род Amphibacillus требует ревизии. В его основе находятся типовой вид A.xylanus, образующий монофилетическую группу с A. fermentum и диазотрофные штаммы 22KS-2 и 22KS-4. Напротив, вид A. tropicus и группа 1-1 диазотрофных штаммов из содовых солончаков образуют независимую ветвь родового уровня. В пользу необходимости такой реорганизации свидетельствует и факт недавнего описания нового рода Halolactibacillus внутри кластера "Amphibacillus" (Ishikawa et al., 2005). Наше предложение по таксономической реорганизации группы "Amphibacillus", с

учетом вновь выделенных диазотрофных представителей из содовых солончаков, сводится к следующему

1 - в род Amphibacillus sensu stricto входят типовой вид A xylanusT, вид А feimentum из содовых озер и новый вид "Amphibacillus diazotrophicus" sp nov, включающий штаммы 22KS-2 и 22KS-4 из содовых солончаков (морфотип 1-2)

2 - диазотрофные штаммы доминирующего морфотипа 1-1 из содовых солончаков (24 KS-1, 24 KS-2, 13KS-1, MS5, MS4-1, ESI, ES2, ES3) предлагается выделить в новый род и вид "Natronobacillus azotiflxans" gen nov sp nov со штаммом 24 KS-1 в качестве типового

3 - вид Amphibacillus tropicus следует реклассифицировать в качестве новой комбинации "Natronobacillus tropicus'''' comb nov

Несмотря на значительную филогенетическую дистанцию низкий уровень ДНК гомологии, фенотипически A tropicus достаточно близок изолятам группы 1-1 из содовых солончаков, поэтому логично объединить их в один род

Наконец, морфотип 2, представленный штаммом MS 6, попадает в РНК-группу 6 бацилл с В arsemciselenatis в качестве ближайщего родственника (Рис. 3) Именно этот филотип и был обнаружен нами методом DGGE в накопительных культурах из Кулундинских образцов (см рис. 1) Штамм MS 6 сильно отличается от В arsemciselenatis фенотипически и его филогенетическая дистанция также позволяет описать его в- качестве нового вида "Bacillus alkalidiazotrophicus" sp nov Уровень ДНК гомологии с В arsemciselenatis = 60%

Таким образом, результаты анализа изолятов не совпадали с данным молекулярной детекции В первом случае доминирующий филотип относится к группе "Amphibacillus", не детектируемым ни в одной из накопительных культур молекулярным методом Во втором - один из "доминирующих" филотипов представлен лишь одной культурой из 11 выделенных Для прояснения ситуации была применена параллельная детекция ключевого функционального гена азотфиксации mfií

5. Характеристика чистых культур диазотрофных алкалофилов.

Все 3 морфо/фило-типа диазотрофов являются облигатными анаэробами с бродильным типом метаболизма По этому признаку группы 1-1 и 1-2 сходны с ближайшими родственниками среди амфибацилл, описанными как «аэротолерантные бродилыцики» (Жилина и др, 2001) В то же время штамм MS

6, несмотря на филогенетическую близость к Bacillus arsemciselenatis, в отличие от этого необычного анаэроба, устойчив к кислороду и является облигатным бродилыциком, подобно представителям групп 1-1 и 1-2 Наши штаммы, в противоположность амфибациллам из содовых озер, могли расти в условиях усиленной аэрации. Однако при этом потребление кислорода клетками было

рудиментарным (1-2 нмоль/(мг белка мин) и, скорее всего, сводилось к флавиновому дыханию

OOS

г 'N aiotilxans' 13KS-1, EU143Ü83

I -i\

SO

-4* azcmfixans' 24K.S-2, ГЛЛ43082

Я

л о с о и

а Z

Л

-"■X azotifixans' ESI, EU143t>86 ■'N azohfumns'MS4-l,EU143685 'N azotifixans' ES2, EU143687 'N azottfïxaas* MS5, EU 143684 -N azotifixaiu' ES3, EU 143688 'N aiotifixaBs'î4KS-lr,EU1436Sl -'N tropicia' Z-7792T, AF418602 J

EHaïolactibaciUas xiariensis H-5T, ЕГ554593 ialolactibacillus halophilus M2-2T, AB196783 Jalolactibacillus miureims M23-1T, AB1967S4 -A sedimims', 4B243866 •Amphibacillus sp \IM-kkn> 10, AY121435 •Amphibacillus sp YLM-Un>6, AY121432 -i xylanus JCM 7361T, DS2065 ■A fermentum Z-7984T, AF418603 A haojicnsis' T2, AF275708 100 [l'A diazotrophicus' 22KS-4T, EUl43690 lOoT'A diwotrophicus'22KS-2, EU 143689 J

Kjracihbacitlus halololeram DSM 118051, AF036922

Gracilibacillus dipsosauri NCFB 3027т X82436

ы Virgibacilhispantothenticus IAM 110S1T, D16275

^-Virgibacilhis proomu LMG 12370T, AJ012667

HalobaciUus halophilus NCIMB 2269т, X62174

Halobacillus htoralis DSM 1040tr, X94558

Bacillus aisemciselenaiis DSM 15340T, AJ865469

'Bacillus alkalidiazotrophicus" MS 6T, EU143680

•Bacillus pseudofirmus DSM 8715т, X76439

•Bacillus haloduratis DSM 497T, AJ302709

•Bacillus alcalophilus DSM 485T, X76436

Рис.3 Филогенетическое дерево, построенное на основе анализа сиквеисов 16S гРНК гена, показывающие положение диазотрофных штаммов из содовых солончаков среди представителей РНК группы 1 и 6 бацилл с низким ГЦ

I

J

Последнее как раз и приводит к образованию перекиси водорода, активно разлагаемой каталазой Количественные измерения каталазной активности у выделенных штаммов показали, что их уровни близки к таковым у микроаэрофилов и составили следующие величины, нмоль Н202/(мин мг белка) MS 6 (400), 22 KS-4 (120), MS 5 (220) В то же время диазотрофные бродилыцики из содовых солончаков обладают экстраординарной устойчивостью к сульфиду, которую можно объяснить только снижением ингибирующего эффекта данного высокотоксичного соединения в условиях высокого рН При росте на среде с глюкозой при рН 10 рост представителей группы 1-1 и 1-2 существенно ингибировался при концентрации сульфида более 120-150 мМ Такие концентрации известны лишь для одного местообитания - содового озера Soap Lake в штате Вашингтон (Sorokrn et al, 2007) Среди продуктов брожения глюкозы при рН 10 у представителей всех 3 групп в качестве основных продуктов были обнаружены этанол, ацетат и формиат и в качестве минорных - пируват и лактат Состав основных продуктов идентичен описанному для амфибацилл из содовых озер (Жилина и др, 2001) Сравнение субстратного профиля представителей группы 1 диазотрофных бродилыциков с родственными видами амфибацилл показало их существенное сходство (Табл. 4) В то же время штамм MS 6 явно отличался от группы "Amphibacillus"

Таблица 4 Сравнительные характеристики аэротолерантных сахаролитических

алкалофильных диазотрос юв из содовых солончаков

Свойства "Bacillus "Natronobacillus "Amphibacillus Amphibacillus

alkalidiazo- azottfixans" diazotrophicus" 22KS-4 tropicus Z-7792T imphibacillus

trophicus" 24KS-11 (Жилина и др, fermentum

MS 6T /ES1/13KS-1 2001^"Natronobacillus tropicus" г-7984т

Морфология овоиды палочки палочки палочки палочки

Размеры, 0 8-1 0x2-3 0 4-0 5x2 0-6 0 0 4-0 5x2 0-4 0 0 4-0 5x2 0-6 0 0 5-0 75x1 5-

мкм 40

Подвижно- перитрих перитрих перитрих перитрих субтерми-

сть нальный жгутик

Эндоспоры + + + +

Желтый - + + н о но

пигмент

Катал аза + + + + +

Ыа+М, 0 1-1 2(0 3) 0 2-4 0 (1 0-1 5) 0 2-4 0(1 0) 0 17-3 6(1 0-1 87) 0 17-3 3

(оптимум) (1 87)

Зависимость - - - - -

отС1

рН, 7 8-104 8-10 5 (9 5-Ю) 8-10 5 (9 5-10) 8 5-11 5(9 5-9 7) 7 0-10 5

(оптимум) (9 5-10) (8 0-9 5)

Т°С 32 35-38 35-38 38 36-38

Сбраживаемые субстраты

Э-рибоза - \У - -

Б-ксилоза - + + - -

О-арабиноза - УУ - +

П-глюкоза + + + +

О-фруктоза + + + - +

О-манноза - УУ + - +

О-галактоза - + - - -

Глицерин - - - - -

Маинит + - + - -

Ь-1Ш03ИТ - -/-Ду - + -

Мезо- - - - н О Н О

эритрит

Сахароза + + + + +

О-мальтоза + + + -

Б-лактоза w + - -

Мелибиоза + -АУЛУ + + -

Мелицитоза + -ЛУЛУ - н О но

Трегалоза + - + + +

Б- + + + + -

целлобиоза

Рафиноза + - н О но

Крахмал + + + + +

Гликоген + +ЛУ 1ч1 \У + +

Ксилан - № + +

О- + - - - -

глюкозамин

Конечные Ацетат, Ацетат, этанол, Ацетат, этанол, Ацетат, этанол, Ацетат,

продукты этанол, формиат формиат формиат этанол,

брожения формиат формиат

йтах (Ч ') 0 50 0 15 0 16 0 07 0 13

Г+Ц, МОЛ % 37 1 37 2/37 0/36 6 36 5 39 2 42 1

Место Содовые солончаки Содовые оз Магади, оз Нижнее

выделения Северо-Восточная Монголия, солончаки Кения Белое,

Юго-Западная Сибирь, Египет Кулундинская Забайкалье

степь

w - слабый рост, н о - не определено

По составу жирных кислот штаммы из содовых солончаков групп 1-1 и 1-2 ближе между собой, чем с реперными видами амфибацилл Это может служить свидетельством того, что состав липидов (по крайней мере у данной группы) более отражает экофизиологический статус клетки, чем таксономию

Описание новых диазотрофных галоалкалофилов, выделенных из содовых солончаков.

1. Amphibacillus diazotrophicus sp. nov.

(di a 20 tro 'phi cus M L mase adj diazotrophicus ассимилирующий газообразный азот)

Клетки - палочки, одиночные или в парах, 0 4-0 5х 1 5-3 мкм Подвижны и имеют несколько перитрихальных жгутиков Клеточная стенка -грамположительного типа Образует терминальные круглые эндоспоры с невысокой частотой Облигатный анаэроб, но устойчив к кислороду и обладает высокой каталазной активностью При анаэробном росте сбраживает глюкозу, ксилозу, маннозу, маннит, фруктозу, сахарозу, мальтозу, трегалозу, целлобиозу, метабиозу, лактозу, в слабой степени - рибозу и арабинозу Продуктами брожения глюкозы являются формиат, ацетат и этанол Гндролизует крахмал и в слабой степени гликоген и катан. Нуждается в дрожжевом экстракте. Высокая сульфидотолерантность Способен к азотфиксации Облигатный алкалофил с пределами роста при рН 7 5-10 6 и оптимумом 9 0-9.5 Рост не зависит от ионов хлора Облигатно зависит от иона натрия с ростом в пределах от 0 2 M до 4 M и оптимумом около 1 M Na+ Мезофил с оптимумом при 35-38°С Содержание Г+Ц пар в ДНК 36 5-37 мол % Выделен из содового солончака Кулундинской степи (Алтайский край) Типовой штамм 22KS-4T депонирован в DSMZ (DSM18269) и в Коллекции культур ИНМИ (UNIQEM) под номером U381

2 Natronobacillus azotifixans gen. nov. sp. nov. Natronobacillus gen nov.

(Nat ro no ba cil 'lus L n natron сода, карбонат ьатрия, L. n bacillus палочка, M L mase n Natronobacillus предпочитающая соду палочка)

Длинные, часто искривленные тонкие палочки с перигрихальным жгугикованием Грамположительные, с терминальной эндоспорой Тип метаболизма -бродильный Каталазо-положительные Высоко аэро- и сульфидо-толерантные Характерна диазотрофная активность и содо-алкалофилия Представитель I6S гРНК группы 1 бацилл с низким ГЦ Местообитание - содовые солончаки Типовой вид - N azotifixansa3om

Natronobacillus azotifîxans sp nov

(a zo ti fi 'xans Fr n azot азот, M L. часть adj fixons связывающий, N.L adj azotifixans азотфиксирующнй )

Клетки - палочки, одиночные или в парах, 0 4-0 5x2-6 мкм. Подвижны и имеют несколько перитрихальных жгутиков. Клеточная стенка - грамположительного типа Образует терминальные круглые эндоспоры с невысокой частотой Облигатный анаэроб, но устойчив к кислороду и обладает высокой каталазной

активностью При анаэробном росте сбраживает глюкозу, ксилозу, маннозу, маннит, фруктозу, сахарозу, мальтозу, целлобиозу, мелибиозу, лактозу и в слабой степени рибозу, арабинозу и мелицитозу Некоторые штаммы используют раффинозу Продуктами брожения глюкозы являются формиат, ацетат и этанол Гидролизует крахмал, гликоген и ксилан Нуждается в дрожжевом экстракте Обладает высокой сульфидотолерантностью Способен к азотфиксации Облигатный алкалофил с пределами роста при pH 7 5-10 6 и оптимумом 9 0-10 Рост не зависит от ионов хлора Облигатно зависит от иона натрия с ростом в пределах от 0 2 М до 4 М и оптимумом около 1 М Na+ Мезофил с оптимумом при 35-38°С Содержание Г+Ц пар в ДНК 36-37 5 мол% Местообитание - содового солончаки Включает близкородственные штаммы, полученные из солончаков Центральной Азии и Африки. Типовой штамм 24KS-11 депонирован в DSMZ под номером DSM 18273 и в Коллекции культур ИНМИ РАН (UNIQEM) под номером U378 Выделен из содового солончака Кулундинской степи Алтайского края

3 Bacillus alkalidiazotrophicus sp. nov.

[al ka Ii di a zo tro'phi cus NL at n alkali (from Arabic al qaliy soda ash), ML mase adj diazotrophicus ассимилирующий молекулярный азот), M L adj alkalidiazotrophicus алкалофил, фиксирующий азот]

Клетки - палочки с заостренными концами, 0 6-12 х 3-8 мкм, подвижные с помощью нескольки перитрихальных жгутиков, часто собирающиеся в агрегаты Клеточная стенка грамположительного типа Образует терминальные и субтерминальные овальные эндоспоры, слегка раздувающие клетку Облигатный анаэроб, но устойчив к кислороду и обладает высокой каталазной активностью При анаэробном росте сбраживает глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, целлобиозу, мелибиозу, мелицитозу, раффинозу, трегалозу, маннит и в слабой степени лактозу Продуктами брожения глюкозы являются формиат, ацетат и этанол Гидролизует крахмал и гликоген В дрожжевом экстракте не нуждается Высокая сульфидотолерантность Способен к азотфиксации Облигатный алкалофил с пределами роста при pH 7 8-10 6 и оптимумом 9 5 Рост не зависит от ионов хлора Облигатно зависит от иона натрия с ростом в пределах от 0 1 М до 1 2 М и оптимумом около 1 М Na+ Мезофил с оптимумом при 35°С Содержание Г+Ц пар в ДНК 37 1 мот % Местообитание - содовые солончаки Типовой штамм - MS 6Т депонирован в DSMZ (DSM18275) и в Коллекции культур ИНМИ РАН (UNIQEM) под номером U377 Выделен из содового солончака Северо-восточной Монголии

6. Влияние pH и солей на рост

Все выделенные штаммы относятся к иатронофилам, что означает независимость от ионов хлора с оптимальным ростом в растворах соды. Данное свойство весьма характерно для изолятов из содовых озер Однако почвенные организмы с

подобным предпочтением до сих пор не описаны. При анаэробном росте с глюкозой в содовых рассолах при рН 10 штаммы группы 1 имели высокую солетолерантность, сходную с описанной для амфибацилл из содовых озер, в то время как штамм МБ 6 относится к разряду низко солетолерантных организмов (Рис. 4 а). Штаммы группы 1 оптимально росли в пределах 0.5-1.5 М общего содержания натрия и были способны к росту до насыщения содой. Однако резкое снижение как скорости роста, так и урожая биомассы при концентрации натрия более 2 М свидетельствовало о стрессовой ситуации. Брожение не является эффективным типом метаболизма, следовательно, выделенные штаммы должны обладать особыми механизмами, позволяющими использовать высокое содержание натрия в щелочной среде в свою пользу. В литературе известен факт обнаружения у АтрЫЬасШия эр. Ма+-АТФазы. Следовательно, группа амфибацилл является интересной моделью для изучения элементов натриевой энергетики у галоалкалофилов. По отношению к рН штаммы, выделенные нами из содовых солончаков, можно отнести к облигатным алкалофилам (Рис. 4 Ь).

1.5 2 2.5

7.5 8 8.5 9 9.5 10 10.5 11 Конечный рН

Рис. 4. Влияние концентрации соды (а) при рН 10 и рН (Ь) при содержании общего 0.6 М на рост галоалкалофильных диазотрофов из содовых солончаков. Символы: А- штамм МБ 6; »-группа 1-1; о- группа 1-2.

7. Диазотрофная активность и влияние на нее рН и солей.

Диазотрофная активность была зафиксирована в культурах при почти полном отсутствии связанного азота в среде. Группы 1-1 и 1-2 облигатно зависели от дрожжевого экстракта, который не мог быть заменен на витамины, метионин или цистеин. Поэтому минимальная среда для этих штаммов содержала 10 мг/л д дрожжевого экстракта до 50 мг/л фиксация азота блокировалась. В то же время нам не удалось определить АФ для типовых штаммов АтрЫЬасШш - АЛгорисиз иА./егтеШит. Данные бактерии не росли при концентрации дрожжевого экстракта менее 20 мг/л и в этих условиях не фиксировали азот. Штамм МБ 6 не нуждался в дрожжевом экстракте, хотя его рост значительно увеличивался в его присутствии, а АФ блокировалась в присутствии 50 мг/л .

Измерение нитрогеназной активности отмытых клеток осложнила быстрая инактивация при центрифугировании, несмотря на использование анаэробных буферов для отмывки от среды Это удалось преодолеть добавкой к культурам и в буферы сульфида, который в концентрации до 20 мМ не только не ингибировал, но даже стимулировал нитрогеназную активность Нитрогеназа является внутриклеточным ферментным комлексом, так же как и система сбраживания глюкозы, обеспечивающая нитрогеназу восстановителем и энергией Поскольку внутриклеточная среда у гапоалкалофильных эубактерий поддерживается на уровне нейтральных значений рН, а ионы натрия активно откачиваются за счет антипортеров, можно было ожидать угнетения бродильной и нитрогеназной активностей при высоких рН и солености у изученных диазотрофов Однако при работе с отмытыми клетками были получены результаты, аналогичные полученным в ростовых экспериментах (см выше) По отношению к рН клетки вели себя так, как ее пи бы обе системы - нитрогеназная и сбраживающая -являлись внеклеточными с явным оптимумом в щелочной области и с высокой толерантностью к экстремально высоким значениям рН среды (Рис. 5а-Ь) В то же время солевой стресс был гораздо сильнее выражен с резким снижением нитрогеназной активности при содержании общего натрия свыше 10-15 М для группы 1 и свыше 0 5 М для MS 6 (Рис. 5с) У большинства штаммов группы 1 нитрогеназная активность полностью блокировалась при содержании общего натрия свыше 3 М, в то время как рост продолжался при 3-4 М Таким образом, именно высокая концентрация солей, а не высокие значения рН, являются тем экстремальным фактором, который ограничивает ключевые реакции метаболизма изученных штаммов

8. Детекция т/Я в чистых и накопительных культурах диазотрофов из содовых солончаков и у референтных культур.

Чистые культуры

С помощью пары вырожденных праймеров F1-R6 (Марусина и др 2001) наличие ключевого функционального гена нитрогеназы mfti было подтверждено у всех 11 штаммов из содовых солончаков, обчадающих диазотрофной активностью, а так же у референтной культуры В arsemciselenatis, но не у Л tropicus iiAfermentum (Рис. 6) Присутствие диазотрофов в этих группах бацилл (РНК группы 1 и 6) ранее не было показано

Таким образом, штаммы из содовых солончаков представляют новую ветвь диазотрофных грамположительных бактерий. Филогенетический анализ полученных частичных сиквенсов nifH гена показал что, обнаружена новая филогенетическая ветвь данного гена внутри кластера грамположительных бактерий родственная Paenibacillus и цианобактериям Полученные сиквенсы образуют 2 подгруппы штаммы групп 1-1 ("Natronobacillus azotifixans") и 1-2 ("Amphibacilhis diazotrophicus") образуют независимый кластер, а штамм MS 6

("ВасШия аНшИсИагсНгорЫсия") В.агзетаяекпаИз (Рис.7)._

кластируется с ближайшим

20

родственником

конечный рН

Рис. 5. Влияние рН (а-Ь) при содержании общего №+ 0.6 М и концентрации соды (с) при рН 10 на активность отмытых клеток галоалкапофильных диазотрофов из содовых солончаков. Символы: Д-штамм М8 6; «-группа 1-1; о- группа 1-2.

М г7792 221Й-2 22К&4 МЭ 6 Мв-Ы 13КБ-1 +К Ев 2 Ев 3 +К

450 п( -

Рис.6. ПЦР-детекция гена т/Н у галоалкалофильных диазотрофов из содовых солончаков

tu

100r Bacillus mmkhikmtii E1H, EU204960

Sex ¡Hin dktöäiazotropbkus MStf, EU2G4<>59 24KS, MS, ES, 22KS

РагяЪкШы dum АТССЗЯШ. ABIS»» PaevbeciUssmasÜlmss T7, AW121M ТпсШгятт еп'Фтшт IMS101. YP72351? Cmothice sp.CCYOUO. ZP0I7277S5 »Лет чяШЬ ATCC2M13. YBM553 m» аветрЫяв ATCC334« »:77S 7203

- ОоягШт basimn ATCC350i УГОМЙЯМ

ECtöstrmtm eonih*

— С kli

— /)йсn!iittth/irti

-Ci»BäB kSuymi DSM555. YPC0139:844

- Desulflvbacternm к$я»шЪСЪ-\ ZP0137< Л0ЩШ ¡ШШмйр* QVMF, YP001321310

- ОяягШт ЩштсШ КСШВ8052, УШ1309125 -С.а$яШм <ё1'оЫорбг,т АТСС18532. С59414 Рис.7. Филогенетическое дерево на основе транслированных аминокислотных последовательностей гена т/Н, показывающее положение новых галоалкалоАильных бактеоий из содовых солончаков соеди диазотеоАов. Клонирование тШ гена в микроаэробных накопительных культурах из содовых солончаков. Как уже отмечалось, молекулярный анализ (БООЕ) гена 168 гРНК в накопительных культурах выявил только одну из подгрупп диазотрофов (группа 2), представленную лишь одной из 11 выделенных чистых культур. Чтобы понять, являлась ли группа 1 диазотрофов, доминирующим диазотрофным компонентом, клонировали фрагмент гена т/Н из 5 накопительных культур. В общей сложности было получено 256 положительных клонов (около 50 на каждую культуру), разделившихся согласно рестрикционному анализу на 10 подгрупп (рис. 8).

Т5 Т6

Рис. 8. Рестрикционные типы клонов nifli гена, обнаруженные в накопительных культурах из содовых солончаков, имеющие отличия в последовательности nifli. В.а. - nifli из чистой культуры Bacillus aresiniciselenatis.

Рис.9. Численное распределение типов клонов гена т/Н полученных из диазотрофных накопительных культур из сопояых солпнчякоп Пйитее количество кнопок—256

Распределение клонов по группам показано на Рис. 9. Абсолютное большинство клонов (73%) представлено группой Т1, анализ которой показал высокую гомологию (вплоть до полной идентичности) с nifli генами изолятов группы 1-1. Это подтверждает результат культурального исследования о их доминировании среди диазотрофного компонента накопительных культур, В этот же кластер вошла минорная группа клонов Т9 и близкие группы Т2 и Т6. 4 группы клонов, включая вторую по численности группу Т5, которая образуют второй крупный кластер, родственный штамму MS6 и B.arseniciselenatis. Два типа клонов имели сиквенсы ni/H гена, не представленные чистыми культурами. Они принадлежали кластеру облигатно анаэробных клостридий. Интересно, что помимо явно доминирующих типов, идентичных двум культивируемым группам диазотрофов, в составе накопительных культур присутствовали родственные, но не идентичные, группы, такие, как например группа клонов Т7. Судя по относительно высокой степени дивергенции гена nifli, эта группа может представлять еще один неизученный диазотрофный таксон. Результаты филогенетического анализа ni/H гена клонов показаны на Рис. 10, а распределение типов клонов по накопительным культурам - в таблице 5.

Таблица 5 Распределение типов клонов т/Н гена в накопительных культурах

Тип клона Количество клонов в накопительных культурах

13KS 24KS 22KS ES MS

Т-1 37 41 41 30 38

Т-2 2 0 2 1 0

Т-3 0 0 1 1 0

Т-4 0 0 0 2 1

Т-5 0 3 10 8 6

Т-6 2 10 3 0 3

Т-7 0 2 6 0 0

Т-8 0 0 2 0 0

Т-9 0 0 0 3 0

Т-10 3 0 0 0 0

Таким образом, результаты молекулярного анализа т/Н гена накопительных культур из содовых солончаков показали, что доминирующую фракцию диазотрофной популяции в них составляют аэротолератные бродилыцики, также доминирующие в составе чистых культур, которые, тем не менее, составляют минорный компонент накопительных культур по численности Кроме аэротолерантных диазотрофов с бродильным обменом, микроаэрофильные накопительные культуры также содержат небольшую фракцию облигатно анаэробных сульфидогенных диазотрофов, которые нам не удалось выделить в чистую культуру Это неудивительно, поскольку для выделения использовали невосстановленные среды в микроаэробных условиях Тем не менее, данный факт представляет интерес с точки зрения изучения анаэробного галоалкалофильного сообщества, так как Оези1/гПЬас(егшт и йе.чи!/оЮтаси!ит никогда не обнаруживали среди культивируемых и некультивируемых бактерий в содовых озерах Общее доминирование эндоспоробразующих грамположительных форм, в отличие от содовых озер, по-видимому, является отличительным признаком содовых солончаков, большую часть времени года находящихся в состоянии иссушения Кроме того, следует отметить, что азотфиксация в группе грамположительных бактерий не так хорошо изучена (судя по известным чистым культурам и базе данных т/Н гена) как у протеобактерий, поэтому дальнейшие исследования зучение таких экстремальных обитаний как содовые солончаки безусловно расширит наши знания о таксономической структуре галоалкалофилов прокариот, и механизмах выживания и осмоадаптации прокариот в ээкстремальных местообитаниях

99 г Т5

100

Н

[ ' ВасМич аШйи^пгоиорЬит МХ6, Е11204959 ВасМш; апетшекпаш П1Н, ЕЦ204960

Т9 Т1

ЕБ-МЗ-КБ РаетЬааНт тимфетк Т7, АУ9Ш09 Шпо ЛкМгор/.юи АТСС33466, 7717203 РастЬаа11ш Липа ЛТСС35681, АЛ515294 Тги 1шг!с,ут: ит егу Лги сип 1М3101, УР723617 СуапоЛесе 5р ССУ0110, гР01727765

АнаЬааш тпяЫп АТСС29413, УР324553 86

■ Т10

• Т8

100

аохО-икит ЬоШПгшт А ГСС3502, УРОО1253231

-СШпйшт ЦщгЫ П5М555, УР001395844

--ОетУМас/епит ¡т/тспче ОСБ-2, 2Р01370853

- СЬлГлЛшл Ьетгтски ХТС1МВМ52, УР001309125

- Л&аЬркйич тШаШгакрст ОУМК, УР001321310 - ОохШшт 1с11оЫорагит АТСС18542, 1159414

н

Рис.10 Фичогенетическое дерево на основе нуклеотидных последовательное!';;! гена шМ, показывающее положение диазотрофных кчонов в накопительных культурах из содовых солончаков Шкала=Ю замен на 100 нуклеотидов

Выводы

1 Для содовых солончаков Южной Сибири, Северо-Восточной Монголии и Египта показано наличие потенциальной азотфиксирующей активности в микроаэробных-анаэробных условиях, зависящей от степени увлажнения и глюкозы в качестве органического донора электронов В целом величины нитрогеназной активности отрицательно коррелировали с содержанием растворимых солей и карбонатной щелочностью Тем не менее, ряд солончаков обладал сравнительно высокой активностью при умеренных значениях щеточности и солености

2 Культуральными и молекулярно-биологическими методами установлено, что группа грамположительных аэротолерантных бродильщиков из РНК групп 1 и 6 бацилл с низким ГЦ обуславливает диазотрофную активность содовых солончаков Ранее способность к фиксации азота у этих бактерий не была известна

3 Из 11 диазотрофных изолятов 10 относятся к РНК группе 1 бацилл Преложено описать 8 штаммов в качестве нового рода и вида "Natronobacillus azoüftxans" и 2 штамма в качестве нового вида рода Amphibacillus "Л diazotrophicus" Один штамм, относящийся к РНК группе б бацилл, предложено выделить в новый вид рода Bacillus "В alkalidiazotrophicus"

4 Все диазотрофные бактерии, выделенные из содовых солончаков, отличаются облигатной алкалофилией, натронофилией (предпочтение соды вместо NaCl) и от умеренной ("В alkalidiazotrophicus") до экстремальной (изоляты группы 1) солетолерантностью Диазотрофная активность у изученных галоалкалофилов также имела четко выраженный алкалофильный pH профиль, в то время как ее солетолерантность была значительно ниже ростовой

5 У всех выделенных из содовых солончаков диазотрофов обнаружен ключевой функциональный ген азотфиксации mfii, который по данным филогенетического анализа образует новую ветвь среди кластера грамположительных бактерий с низким ГЦ Результаты клонирования гена mfli в накопительных культурах подтвердили доминирование представителей РНК групп 1 и б в диазотрофном сообществе содовых солончаков, а также выявили присутствие облигатно анаэробных сульфидогенных клостридий в качестве минорного компонента

СПИСОК ПУБЛИКАЦИИ

Экспериментальные статьи

1) Сорокин И.Д, Кравченко И К Оценка потенциальной азотфиксирующей активности в почвах содового засоления //Агрохимия 2008. №2 С 43-49

2) I. D. Sorokin, 1 К Kravchenko, Т Р Tourova, Т V Kolganova, Е S Boulygina and D Yu Sorokin (2008) Bacillus alkaltdtazotrophicus sp nov, a diazotrophic, low salt-tolerant alkaliphile isolated from Mongolian soda soilHint J Syst Evol Microbiol (accepted)

3) I. D. Sorokin, I К Kravchenko, E V Doroshenko, T V Boulygina T P,Tourova and D Yu Sorokin (2008) Nitrogen fixation m soda solonchak soils//' FEMSAficiob Ecol (submitted FEMSEC-08-03-0118)

4) I. D. Sorokin, I К Kravchenko, T. P. Tourova, Т. V Kolganova, E S Boulygina and D Yu Sorokin (2008) Natronobacillus azotifixans gen nov sp nov, diazotrophic haloalkaliphile from soda solonchak soils, and reclassification of Amphibacdlus tropicus as Natronobacillus tropicus comb nov // Int J Syst Evol M/crofefo/(submitted no IJS/2008/002196).

Тезисы конференций

1) Сорокин ИД, Дорошенко Е В , Кравченко И К Азотфиксация в содовых солончаках В сборнике Тезисы Всероссийской молодежной школы-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» Москва Макс Пресс, 2005 С 59

2) Сорокин И.Д Диазотрофные галоалкалофилы содовых солончаков В сборнике III Международная молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии» Тезисы Москва Макс Пресс2007 С 101

3) Sorokin I.D , Kravchenko IК , Doroshenko Е V, Boulygina Е S. Sorokin D Yu, Nitrogen fixation in soda solonchak soils Second International Conference of Environmental, Industrial and Applied Microbiology (MicroBioWorld), Sevilla, Spain, 28 Nov-1 Dec 2007 (Book of Abstracts) P 240

Подписано в печать 02 04 2008 Печать трафаретная

Заказ № 234 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сорокин, Иван Дмитриевич

ВВЕДЕНИЕ.4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.8

1.1. Общие сведения о почвах содового засоления.8

1.2. Значение биологической фиксации атмосферного азота.10

1.3. Общие сведения об азотфиксации. 11

1.4. Влияние солей и щелочности на активность азотфиксации (АА) в природных местообитаниях. 15

1.5. Влияние ионов натрия на АА чистых культур.16

1.6. Галотолерантные и галофильные свободноживущие диазотрофы из засоленных почв.18

1.7. Азотфиксирующие бактерии соленых водоемов.19

1.8. Микробные сообщества содовых озер и сведения о галоалкалофильных диазотрофах. 20

1.9. Механизмы адаптации бактерий к галоалкалофильным условиям.22

1.10. Гены нитрогеназного комплекса.25

1.11. Применение методов молекулярной экологии для изучения диазотрофии.27

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.30

2.1. Объекты исследования.

2.2. Определение химических параметров почвенных образцов. 30

2.3. Измерение потенциальной АА ацетиленовым методом.

2.4. Получение накопительных и чистых культур галоалкалофильных диазотрофов. 33

2.5. Фенотипическая характеристика-чистых культур.т. 35

2.6. Эксперименты с клеточными суспензиями.

2.7. Молекулярно-биологические методы. 37

2.8. Аналитические методы.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.42

3.1. Потенциальная АА содовых солончаков различных регионов.42

3.2. Влияние различных факторов на потенциальную АА природной диазотрофной популяции содовых солончаков. . 45

3.3. Получение диазотрофных накопительных культур из образцов содовых солончаков . 50

3.4. Определение состава диазотрофных накопительных культур. . 51

3.5. Выделение чистых культур анаэробных диазотрофных галоалкалофилов из накопительных культур.55

3.6. Идентификация диазотрофов из содовых солончаков. 60

3.7. Характеристика чистых культур диазотрофных алкалофилов.64

3.7.1. Отношение к кислороду и сероводороду.64

3.7.2. Продукты брожения и метаболический профиль.65

3.7.3. Влияние рН и солей на рост. 68

3.7.4. Диазотрофная активность и влияние на нее рН и солей. 69

3.7.5. Описание новых таксонов диазотрофных галоалкалофилов, выделенных из содовых солончаков. 74

3.8. Детекция nifHв чистых и накопительных культурах диазотрофов из содовых солончаков и у референтных культур.76

3.8.1. Чистые культуры. 76

3.8.2. Клонирование фрагмента гена nifH в микроаэрофильных накопительных культурах из содовых солончаков. 78

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Диазотрофы содовых солончаков"

Азотфиксация (АФ) является важнейшим звеном в глобальном цикле азота и наряду с фиксацией углекислоты обеспечивает продуктивность биосферы в целом. Многие природные экосистемы лимитированы по доступным соединениям азота, что придает процессу азотфиксации особое значение в круговороте биогенных элементов. Традиционно основное внимание исследователей было направлено на изучение симбиотической азотфиксации в связи с ее значимостью для сельского хозяйства. Однако за последние годы было убедительно показано, что диазотрофия широко распространена среди прокариот, и микроорганизмы, способные фиксировать молекулярный азот, присутствуют практически во всех экосистемах, не связанных с агрокультурой (Zehr, 2003). Именно способность к азотфиксации дает возможность прокариотам существовать в эконишах с крайне низким содержанием азота, а также обогащать окружающую среду азотными соединениями.

Исследования процесса азотфиксации в засоленных почвах выполнены главным образом, в таких странах как Пакистан, Индия, Египет, где большие территории возделываемых земель подвержены засолению (Rai, 1991; Zahran et al., 1995; Abd-Alla, 1999). Однако они не распространяются на почвы содовых солончаков, характерной особенностью которых является высокая щелочность. В нашей стране почвы содового засоления можно отнести к экзотическим местообитаниям за исключением Юго-Западной Сибири и Забайкалья. В то же время они представляют уникальный природный объект для изучения галоалкалофильных микроорганизмов - экологической группы, которая обладает рядом физиологических особенностей, обусловленных средой обитания. Изучение процесса азотфиксации важно также для агрономии, которая пытается решить проблемы увеличения плодородия в этих почвах.

В отличие от содовых солончаков, микроорганизмы содовых озер активно исследуются микробиологами в течение последних 10-15 лет (Жилина и др., 2001, 2005; Jones et al., 1998; Baumgarte, 2003; Sorokin and Kuenen, 2005). Благодаря исследованиям, выполненным сотрудниками ИНМИ РАН, получена достаточно полная картина основных компонентов галоалкалофильного сообщества и их взаимодействий (Заварзин и др., 1999). В то же время, сведения о процессе АФ и составе диазотрофных сообществ в содовых местообитаниях остаются весьма ограниченными (Herbst, 1998; Steward et al., 2004).

В связи с изучение активности и биоразнообразия азотфиксирующих диазотрофов в почвах содовых солончаков, для которых характерно как высокое содержание солей, так и высокая щелочность, представляет научный и практический интерес. В контексте настоящей работы представлялось важным выяснить, существуют ли отличия в диазотрофной микрофлоре содовых солончаков от того, что известно для содовых озер.

Целью данной работы являлось изучение процесса АФ и характеристика диазотрофных микроорганизмов в почвах содового засоления. В задачи исследования входило:

1. Определение потенциальной АФ в содовых солончаках различной географической принадлежности.

2. Изучение влияния различных факторов на АФ микробных популяций содовых солончаков.

3. Выделение и исследование накопительных культур азотфиксирующих бактерий из образцов содовых солончаков.

4. Выделение, характеристика и таксономическое описание чистых культур диазотрофов из содовых солончаков.

5. Изучение структуры диазотрофных сообществ в накопительных культурах методом молекулярного анализа гена nifii.

Научная новизна. Впервые установлено наличие потенциальной способности к АФ в почвах содового засоления различных географических регионов. С помощью культуральных и молекулярных методов установлено преобладание в диазотрофных накопительных культурах, выделенных при рН 10, грамположительных бактерий с низким ГЦ; относящихся к бациллам и сульфидогенным клостридиям. Из содовых солончаков Центральной Азии и Египта выделены 11 чистых культур галоалкалофильных азотфиксирующих бацилл РНК групп 1 и 6, в которых АФ не была известна. На основании физиологических и филогенетических признаков восемь изолятов описывается как новый род и новый вид "Natronobacillus azotifixans", два изолята классифицированы как новый вид "Amphibacilhis diazotrophicus" и один изолят как новый вид "Bacillus alkalidiazotrophicus". Все выделенные чистые культуры являются облигатными бродилыциками, рост и АФ активность которых возможны только в щелочных условиях с оптимумом рН 9-10. АФ активность клеток подавлялась уже умеренными концентрациями солей натрия (> 2 М Na+).

Практическая значимость. Полученные данные свидетельствуют о том, что, при наличии благоприятных условий (увлажнение и частичное рассоление) содовые солончаки могут осуществлять одну из важнейших функций плодородных почв - фиксацию атмосферного азота.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на следующих конференциях: Всероссийская молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии» 2005, Москва, Россия; III Международная молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии» 2007, Москва, Россия; Second International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (MicroBioWorld), 2007, Севилья, Испания.

Публикации. Основные материалы, обсуждаемые в диссертации, содержатся в 2 статьях и 3 тезисах конференций. 2 статьи сданы в печать.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, описания методов и объектов, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Текст включает 98 страниц, 13 таблиц, 22 рисунка; список литературы включает 138 наименований, из них 13 на русском и 125 на английском языке.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Сорокин, Иван Дмитриевич

Выводы

1. Для содовых солончаков Южной Сибири, Северо-Восточной Монголии и Египта показано наличие потенциальной азотфиксирующей активности в микроаэробных-анаэробных условиях, зависящей от степени увлажнения и глюкозы в качестве органического донора электронов. В целом величины нитрогеназной активности отрицательно коррелировали с содержанием растворимых солей и карбонатной щелочностью. Тем не менее, ряд солончаков обладал сравнительно высокой активностью при умеренных значениях щелочности и солености.

2. Культуральными и молекулярно-биологическими методами установлено, что группа грамположительных аэротолерантных бродилыциков из РНК групп 1 и 6 бацилл с низким ГЦ обуславливает диазотрофную активность содовых солончаков. Ранее способность к фиксации азота у этих бактерий не была известна.

3. Из 11 диазотрофных изолятов 10 относятся к РНК группе 1 бацилл. Преложено описать 8 штаммов в качестве нового рода и вида "Natronobacillus azotifixans''' и 2 штамма в качестве нового вида рода Amphibacillus "A.diazotrophicus". Один штамм, относящийся к РНК группе 6 бацилл, предложено выделить в новый вид рода Bacillus - "B.alkalidiazotrophicus".

4. Все диазотрофные бактерии, выделенные из содовых солончаков, отличаются облигатной алкалофилией, натронофилией (предпочтение соды вместо NaCl) и от умеренной ("B.alkalidiazotrophicus") до экстремальной (изоляты группы 1) солетолерантностью. Диазотрофная активность у изученных галоалкалофилов также имела четко выраженный алкалофильный рН профиль, в то время как ее солетолерантность была значительно ниже ростовой.

5. У всех выделенных из содовых солончаков диазотрофов обнаружен ключевой функциональный ген азотфиксации nifH, который по данным филогенетического анализа образует новую ветвь среди кластера грамположительных бактерий с низким ГЦ. Результаты клонирования гена nifH в накопительных культурах подтвердили доминирование представителей РНК групп 1 и 6 в диазотрофном сообществе содовых солончаков, а также выявили присутствие облигатно анаэробных сульфидогенных клостридий в качестве минорного компонента.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сорокин, Иван Дмитриевич, Москва

1. Базилевич Н.И. Геохимия почв содового засоления. М., Наука. (1965). 351 стр.

2. Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Марусина А.И., Турова Т.П., Кравченко И.К., Быкова С.А., Колганова Т.В., Гальченко В.Ф. Изучение нуклеотидных последовательностей nifH генов у представителей метанотрофных бактерий. Микробиология. 2002. Т.71. С. 500-508.

3. Жилина Т.Н., Гарнова Е.С., Турова Т.П. Amphibacillus fermentum sp.nov., Amphibacillus tropicus sp.nov. новые алкалофильные и факультативно анаэробные сахаролитические бациллы из озера Магади. Микробиология. 2001. Т. 70. С. 825-837.

4. Жилина Т.Н., Кевбрин В.В., Турова Т.П., Лысенко A.M., Кострикина Н.А., Заварзин Г.А. Clostridium alcalicellum — облигатно алкалофильная целлюлолитическая бактерия из содового озера Забайкалья. Микробиология 2005. Т.74. С.556-567.

5. Заварзина Д.Г., Колганова Т.В., Булыгина Е.С., Турова Т.П., Заварзин Г.А. Geoalkalibacter ferrihydtiticus, первый алкалофильный представитель семейства Geobacteraceae из содового озера. Микробиология. 2006. Т.75. С.673-682.

6. Ковда В.А. Основы учения о почвах. Общая теория почвообразовательного процесса. Книга вторая. М.: Наука. 1973. 467 с.

7. Кондорская Н.И. Географическое распространение почв содового засоления в СССР. Почвоведение 1965. №9.10-16.

8. Кравченко И.К., Калининская Т.А. Азотфиксирующие бактерии сильнозасоленной такыровидной почвы. Микробиология. 1988. V.57. С. 279-283.

9. Львов Н.П. Молибден в ассимиляции азота у растений и микроорганизмов. 43-е Баховское чтение. М.: Наука. 1989. С. 87.

10. Марусина А.И., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Турова Т.П., Кравченко И.К., Гальченко В.Ф. Система олигонуклеотидных праймеров для амплификации генов nifH различных таксономических групп прокариот. Микробиология 2001. Т.70. С. 86-91.

11. Меняйло О.В. Особенности процесса денитрификации в засоленных почвах. Канд. Дисс. МГУ. 1996. С. 117.

12. Слободова Н.В. Изучение биоразнообразия азотфиксирующих прокариот кислых торфяных почв на основе анализа последовательностей генов niJR. Канд. Диссерт. МГУ. 2006. 150 с.

13. Заварзин Г.А., Жилина Т.Н., Кевбрин В.В. Алкалофильные микробные сообщества и их функциональное разнообразие. Микробиоология 1999. Т.68. С.503-521.

14. Abd-Alla М.Н. Nodulation and nitrogen fixation of Lupinus species with Bradyrhizobium (lupin) strains in iron-deficient soil. Biol. Fertil Soils. 1999. V. 28. P. 407- 415.

15. Achouak W., Normand P., Heulin T. Comparative phylogeny of rrs and nifH genes in the Bacillaceae. Int. J. Syst. Bacteriol. 1999. V.49. P.961-967.

16. An, S.-Y., Ishikawa, S., Kasai, H., Goto, K. & Yokota, A. (2007). Amphibacillus sediminis sp. nov., an endosporeforming bacterium isolated from lake sediment in Japan. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. V.57 P.2489-2492.

17. Apte S. K., Joseph T. Sodium is required for nitrogenase activity in cyanobacteria. Curr. Microbiol. 1980. V. 6. P. 291-293.

18. Argandona M., Fernandez-Carazo R., Llamas I., Martinez-Checa F., Caba J.M., Quesada E. and del Moral A. The moderately halophilic bacterium Halomonas maura is a free-living diazotroph. FEMS Microbiol. Lett. 2005. V. 244. P.69-74.

19. Bagwell C.E., La Rocque J.R., Smith G.W., Poison S.W., Friez M.J., Longshore J.W. and Lovell C.R. Molecular diversity of diazotrophs in oligotrophic tropical seagrass bed communities. FEMS Microbiol. Ecol. 2002. V.39. P.l 13-119.

20. Baumgarte S. Microbial diversity of soda lake habitats. PhD thesis. 2003. Carolo-Wilhelmina University, Braunschweig.

21. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucl. Acids Res. 1979. V.7. P.1513-1523.

22. Boussiba S., Schleizenger P., Belkin S. Sodium sustains the growth of Spirulina platensis in extreme alkaline enviorements. 8th Int. Symp. Phototrophic Prokaryotes. 1994. Urbino. 10-15 Sept. V.l. P.183.

23. Brown I.I., Fadeyev S.I., Kirik I.I., Severina 1.1., Skulachev V.P. Light-dependent delta mu Na-generation and utilization in the marine cyanobacterium Oscillatoria brevis. FEBS Lett. 1990. V. 270. P.203-206.

24. Brown M.M., Friez M.J., Lovell C.R. Expression of nijYL genes by diazotrophic bacteria in the rhizosphere of short form Spartina alterniflora. FEMS Microbiol. Ecol. 2003. V.43. P.411-417.

25. Burgess B.K. and Lowe D.J. Mechanism of molybdenum nitrogenase. Chem. Rev. 1996. V. 96. P. 2983-3012.

26. Cannon F.C., Riedel G.E., Ausubel F.M. Overlapping sequences of Klebsiella pneumoniae nifDNA cloned and characterized. Mol. General Genetics 1979. V. 174. P. 59-66.

27. Chen Y.B., Dominic В., Mellon M.T. and Zehr J.P. Circadian rhythm of nitrogenase gene expression in the diazotrophic filamentous nonheterocystous cyanobacterium Trichodesmium sp. strain IMS 101. J. Bacteriol. 1998. V.180. P. 3598-3605.

28. De Ley J., Caffon H. & Reinaerts A. The quantitative measurements of hybridisation DNA from renaturation rates. Eur. J.Biochem. 1970. V.12 P.133-140.

29. Dibrov V. A. The role of Na ion transport in E. coli energetics. Biochem. Biophys. Acta 1991. V. 1056. P.209-224.

30. Dicker H., Smith D.W. Effects of salinity on acetylene reduction (nitrogen fixation) and respiration in a marine Azotobacter. Appl. Environ. Microbiol. 1981. V.42. P.740-744.

31. Doolittle W.F. Lateral genomics. Trends Cell Biol. 1999. V.12. P.5-8.

32. Dromgoole F.I., Silvester W.B. and Hicks B.J. Nitrogenase activity associated with Codium species from New Zealand marine habitats. New Zealand J. Marine Freshwater Res. 1978. V.12. P. 17-22.

33. Duckworth A.W., Grant W.D., Jones B.E. and van Steenbergen R Phylogenetic diversity of soda lakes alkaliphiles. FEMSMicrob. Ecol. 1996. V.l9. P. 181-191.

34. Durrant M.C. An atomic-level mechanism for molybdenum nitrogenase. Part 1. Reduction of dinitrogen. Biochemistry 2002. V.41. P.13934-13945.

35. Elsheikh E.A. and Wood M. Nodulation and N2- fixation by soybean inoculated with salt-tolerant rhizobia or salt-sensitive bradyrhizobia in saline soil. Soil Biol. Biochem. 1995. V. 27. P.657-661.

36. El-Shnnawi M.M. and Frankenberger W.T. Salt inhibition of free-living diazotroph population density and nitroginase activity in soil. Soil Science. 1988. V. 146. P. 176-184.

37. Foti M. Microbial ecology of haloalkaliphilic sulfur bacteria. PhD thesis, 2007. TU Delft, Delft, The Netherlands.

38. Galinski E.A. and Trueper H.G. Microbial behavior in salt-stressed ecosystems. FEMS Microbiol. Rev. 1994. V.15. P. 95-108.

39. Grant W.D., Jones B.E. and Mwatha W.E. Alkaliphiles: ecology, diversity and applications. FEMS Microbiol. Rev. 1990. V.75. P.255-270.

40. Halbleib С. M. and Ludden P.W. Regulation of biological nitrogen fixation. J. Nutr. 2000. V.130. P. 1081-1084.

41. Humayoun S.B., Bano V. and Hollibaugh J.T. Depth distribution of microbial diversity in Mono Lake, a meromictic Soda Lake in California. Appl. Environ. Microbiol. 2003. V.69. P.1030-1042.

42. Hardy R.W., Knight E.Jr., D'Eustachio A.J. An energy-dependent hydrogen-evolution from dithionite in nitrogen-fixing extracts of Clostridium pasteurianum. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1965. V.20. P. 539-544.

43. Hartmann A., Prabhu S.R. and Galinski E.A. Osmotolerance of diazotrophic rhizosphere bacteria. Dev. Plant. Soil Sci. 1991. V. 48. P. 243-247.

44. Herbst D.B. Potential salinity limitations of nitrogen fixation in sediments from Mono-Lake. Int. J. of Salt Lake Res. 1998. V. 7. P. 261-274.

45. Home A.J. and Galat P.L. Nitrogen fixation in an oligotrophic, saline desert lake, Pyramid Lake, Nevada. Limnol. Oceanogr. 1985. V. 30. V. 1229-1239.

46. Igarashi R.Y. and Seefeldt L.C. Nitrogen fixation: the mechanism of the Mo-dependent nitrogenase. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2003. V.38. P. 351-384.

47. Imhoff J.F. Osmoregulation and compatible solutes in eubacteria. FEMS Microbiol. Rev. 1986. V. 39. P. 57-66.

48. Izquierdo J. A. andNusslein K. Distribution of extensive nifH gene diversity across physical soil microenvironments. Microb. Ecol. 2006. V.51. P.441-452.

49. Jacobitz S. and Bishop J. Regulation of nitrogenase-2 in Azotobacter vinelandii by ammonium, molybdenum, and vanadium. J. Bacteriol. 1992. V. 174. P. 3884-3888.

50. Jenkins B.D., Steward G.F., Short S.M., Ward B.B. and Zehr J.P. Fingerprinting diazotroph communities in the Chesapeake Bay by using a DNA macroarray. Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 3. P. 1767-1776.

51. Jones B.E., Grant W.D., Duckworth A.W., Owenson G.G. Microbial diversity of soda lakes. Extremophiles 1998. V.2. P. 191-200.

52. Kaieda N., Wakagi Т., Koyama N. Presence of Na(+)-stimulated V-type ATPase in the membrane of a facultatively anaerobic and halophilic alkaliphile. FEMS Microbiol. Lett. 1998. V.167. P.57-61.

53. Kessler P.S., Blank C. and Leigh J.A. The nif gene operon of the methanogenic archaeon ethanococcus maripaludis. J. Bacteriol. 1998. V.180. P. 1504-1511.

54. Kim K., Zhang Y.P. and Roberts G.P. Correlation of activity regulation and substrate recognition of the ADP-ribosyltransferase that regulates nitrogenase activity in Rhodospirillum rubrum. J. Bacteriol. 1999. V.181. P. 1698-1702.

55. Krulwich T.A., Hicks D.B., Seto-Young D. and Guffanti A.A. The bioenergetics of alkaliphilic bacilli. CRC Crit.Rev.Microbiol. 1988. V.16. P.15-36.

56. Krulwich T. A., Ito M., Guffanti A.A The Na-dependence of alkaliphily in Bacillus. Biochim. Biophys. Acta. 2001. V. 1505. P.158-168.

57. Lai M.C., Sowers K.S., Robertson D.E., Roberts M.F. and Gunslus R.P. Distribution of compatible solutes in the halophilic methanogenic archaebacteria. J. Bacteriol. 1991. V.173. P. 5352-5358.

58. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970. V. 227, 680-685.

59. Lane D.J. 16S/23S rRNA sequencing. In: Nucleic acid techniques in bacterial systematics (Eds. Stackebrandt, E. & Goodfellow, M.). Chichester, UK: John Wiley & Sons) 1991. P. 115-177.

60. Lippert K. and Galinski E. Enzyme stabilization by ectoine-type compatible solutes: protection against heating, freezing and drying. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1992. V.37. P. 61-65.

61. Lovell C.R., Piceno Y.M., Quattro J.M., Bagwell C.E. Molecular analysis of diazotroph diversity in the rhizosphere of the smooth cordgrass, Spartina alterniflora. Appl. Environ. Microbiol., 2000. V.66. P.3814-3822.

62. Lyons E.M. and Thiel T. Characterization of niJB, ni/S, and nif\J genes in the cyanobacterium Anabaena variabilis. NifB is required for the vanadium-dependent nitrogenase. J. Bacteriol. 1995. V. 177. P. 1570-1575.

63. Malik K. A., Bilal R., Rasul G., Mahmood K. and Sajjad M.I. Associative N2-fixation in plants growing in saline sodic soils and its relative quantification based on 15N natural abundance. Dev. Plant. SoilSci. 1991. V. 48. V. 211-218.

64. Marmur J. A procedure for isolation of DNA from microorganisms. J. Mol. Biol. 1961. V.3. P. 208-214.

65. Martin D.D., Ciulla R.A., Roberts M.F. Osmoadaptation in Archaea. Appl. Envir. Microbiol. 1999. V. 65. P. 1815-1825.

66. McClung C.R. and Patriquin D.G. Isolation of a nitrogen-fixing Campylobacter species from the roots of Spartina alterniflora Loisel. Can. J. Microbiol. 1980. V.26. P. 881-886.

67. Mehta M.P., Butterfield D.A. and Baross J.A. Phylogenetic diversity of nitrogenase (nifH) genes in deep-sea and hydrothermal vent environments of the Juan de Fuca Ridge. Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 960-970.

68. Miller A. G. and Canvin D. G. Prediction cation ratios in corn from saline solution composition. J. Exp. Bot. 1987. V.202. P. 605-612.

69. Murata Т., Kawano M., Igarashi K., Yamoto I. and Kakinuma Y. Catalytic properties of Na+-translocating V-ATPase in Enterococcus herai. Biochem. Biophis. Acta. 2001. V. 1505. P.75-81.

70. Nedwell D.B. and Azni S. Heterotrophic nitrogen in an intertidal saltmarsh sediment. Estuarian Coastal Marine Science. 1980. V. 10. P. 699-702.

71. Ni S., Boone J. E. and Boone D.R. Potassium extrusion by the moderately halophilic and alkaliphilic methanogen Methanolobus teylorii GS-16 and homeostasis of cytosolic pH. J. Bacteriol. 1994. V.176. P.7274-7279.

72. Niimura, Y. et al. A hydrogen peroxide-forming NADH oxidase that functions as an alkyl hydroperoxide reductase in Amphibacillus xylanus. J.Bacteriol. 2000. V. 182. P. 5046-5051.

73. Oliver В., Caumette P., Garcia J-L. and Mah R.A. Anaerobic bacteria from hypersaline enviroments. Microbiol. Rev. 1994. V. 58. P.27-38.

74. Oremland R.S. Nitrogen fixation of two diazotrofic communities in Mono-Lake Appl. Environ. Microbiol. 1990. Y.56. P.614-622.

75. Oren A. Bioenergetic aspects of halophilism. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. V.63. P.334-348.

76. Oren A., Heldal M., Svein N., Galinski E.A. Intracellular ion and organic solute concentrations of the extremely halophilic bacterium Salinibacter rubber. Extremophiles 2002. V.7. P.491-498.

77. Pace N.R. A molecular view of microbial diversity and the biosphere. Science 1997. V. 276.- P. 734-740.

78. Padan E., Bibi E., Ito M. and Krulwich T.A. Alkaline pH homeostasis in bacteria: New insights. Biochim. Biophys. Acta 2006. V.1717. P.67-88.

79. Pathak H. and Rao D.L.N. Carbon and nitrogen mineralization from added organic matter in saline and alkaline soil. Soil Biol. Biochem. 1998. V.30. P.695-702.

80. Pfennig, N., & Lippert, K. D. Uber das Vitamin B12 -bediirfnis phototropher Schwefel bacterien. Arch. Microbiol. 1966. V.55. P.245-256.

81. Piceno Y.M., Noble P.A. and C.R. Lovell. Spatial and temporal assessment of diazotroph assemblage composition in vegetated salt marsh sediments using denaturing dgadient gel electrophoresis analysis. Microb. Ecol. 1999. V.38. P. 157-167.

82. Poly F., Monrozier L.J. and Bally R. Improvement in the RFLP procedure for studying the diversity of nifii genes in communities of nitrogen fixers in soil. Res. Microbiol. 2001a. V. 152. P. 95-103.

83. Poly F., Ranjard L., Nazaret S., Gourbiere F. and Monrozier L.J. Comparison of nifii gene pools in soils and soil microenvironments with contrasting properties. Appl. Environ. Microbiol. 2001b. V. 67. P. 2255-2262.

84. Prakash R.K., Schilperoort R.A. and Nuti M.P. Large plasmids of fast-growing rhizobia: homology studies and location of structural nitrogen fixation (nif) genes. J. Bacteriol. 1981. V. 145. P. 1129-1136.

85. Rai R. Strain-specific salt tolerance and chemotaxis of Azospirillum brasilense and their associative ^-fixation with finger millet in saline calcareous soil. Dev. Plant. Soil Sci. 1991. V. 48. P. 155-159.

86. Rai A.K., Tiwari S.P. Response to NaCl of nitrate assimilation and nitrogenase activity of the cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120 and its mutants. Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 87. V. 877-883.

87. Raza S., Jorusgard В., Abou-Taleb H., Christiansen J.L. Tolerance of Bradyrhizobium sp. (Lupini) strains to salinity, рН, СаСОз and antibiotics. Lett. Appl. Microbiol. 2001. V.32. P.379-383.

88. Raymond J., Siefert J.L., Staples C.R. and Blankenship R.E. The natural history of nitrogen fixation. Mol. Biol. Evol. 2004. V. 21. P. 541-554.

89. Rees, D.G. In: Essential Statistics. 3d Edition. London: Chapman & Hall, 1995. P.189-200.

90. Robertson D., Noll D., Roberts M. F., Menaia J., Boone R. D. Detection of the osmoregulator betaine in methanogens. Appl. Environ. Microbiol. 1990. V. 56. P. 563-565.

91. Rudulier D., Yang S., Csonka L.N. Nitrogen fixation in Klebsiella pneumoniae during osmotic stress effect of exogeonus proline or a proline overproducing plasmid. Biochim. Biophis. Acta. 1982. V. 719. P. 273-283.

92. Sambrook J., Fritsch E.F., Manniatis A. Molecular cloning: a laboratory manual. Ed.: C. Nolan, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

93. Schafer H., Muyzer G. Denaturing Gradient Gel Electrophoresis in Marine Microbial Ecology. In: Methods in Microbiology. 2001. V.30. P.425-468, Academic Press, London.

94. Short S.M. and Zehr J.P. Quantitative analysis of nifH genes and transcripts from aquatic environments. Methods Enzymol. 2005. V.397. P. 380-394.

95. Singh D.V., Tripathi A.K., Kumar H.D. Isolation and characterization of salt resistant mutant of a nitrogen-fixing cyanobacterium, Anabaena doliolum. Appl. Bacteriol. 1991. V. 71. P. 207-210.

96. Skulachev V.P. Chemoosmotic concept of the membrane bioenergetics: What is already clear and what is still waiting for elucidation? // J.Bioener. Biomembr. 1995. V. 26. P.67-80.

97. Smith. C.J., Chalk P.M., Noble C.H., Prendergast J.B., Robertson F. Nitrogen fixation a white clover-grass pasture irrigated with saline groundwater. Irrig. Sci. 1993. V. 13. P. 189-194.

98. Smith LT, Smith GM, D'Souza MR, Pocard J-M, LeRudulier D, Madkour MA Osmoregulation in Rhizobium meliloti: mechanism and control by other environmental signals J. Exp. Zool. 1994. V. 268. P. 162-165.

99. Sorokin D.Yu. Is there a limit for high-pH growth? Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. V. 55. P. 1405-1406.

100. Sorokin D.Y. and Kuenen J.G. Alkaliphilic chemolithotrophs from soda lakes. FEMS Microbiol. Ecol. 2005. V.52. P.287-295.

101. Sorokin D. Y., Foti M., Pinkart H.C. and Muyzer G. Sulsur-oxidizing bacteria in Soap Lake (Wash-ington, USA), a meromictic, haloalkaline lake with an upprecedent high sulfide content. Appl. Environ. Microbiol 2007. V. 73: 451-455

102. Steward G.F., Jenkins B.D., Ward B.B. and Zehr J.P. Development and testing of a DNA macroarray to assess nitrogenase {nifH) gene diversity. Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70. P. 1455-1465.

103. Tan Z.Y., Wang E.T., Peng G.X., Zhu M.E., Martinez-Romero E. and Chen W.X. Characterization of bacteria isolated from wild legumes in the north-western regions of China. Int. J. Syst. Bacteriol 1999. V.49. P.1457-1469.

104. Taroncher-Oldenburg G., Griner E.M., Francis C.A. and Ward B.B. Oligonucleotide microarray for the study of functional gene diversity in the nitrogen cycle in the environment. Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 1159-1171.

105. Thiel T.J. Characterization of genes for an alternative nitrogenase in the cyanobacterium Anabaena variabilis. J. Bacteriol. 1993. V. 175. P. 6276-6286.

106. Tokuda H., Unemoto T. The Na+-motive respiratory chain of marine bacteria. Microbiol. Sci. V.2. P. 65-71.

107. Van de Peer Y., & De Wachter R. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment. Comput. Applic. Biosci. 1994. V.10. V.569-570.

108. Widmer F., Shaffer B.T., Porteous L.A., Seidler R.J. Analysis of nifH gene pool complexity in soil and litter at a Douglas fir forest site in the Oregon cascade mountain range. Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 374-380.

109. Wiemken A. Trehalose in yeast, stress protectant rather than reserve carbohydrate. Antonie van Leeuvenhoek. 1990. V. 58. P. 209-217.

110. Wohlfarth A., Severin J, Galinski E. Identification of N-cetylornithine as a novel osmolyte in some Gram-positive halophilic eubacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993. V. 39. P. 568-573.

111. Yannarell А.С., Steppe T.F. and Paerl H.W. Genetic variance in the composition of two functional groups (diazotrophs and cyanobacteria) from a hypersaline microbial mat. Appl. Environ. Microbiol. 2006. V.72. P. 1207-1217.

112. Zahran H.H. Conditions for successful Rhizobium-legume symbiosis in saline environments. Biol. Fertile Soils. 1991. V. 12. P. 73-80.

113. Zahran H.H. Diversity, adaptation and activity of the bacterial flora in saline environments. Biol. Fertil. Soils. 1997. V. 25. P. 211-223

114. Zahran H.H., Ahmad M.S., Afkar E.A. Isolation and characterization of nitrogen-fixing moderate halophilic bacteria from saline soils of Egypt. Basic Microbiol. 1995. V. 4. P. 269-275.

115. Zahran, H. H., Sprent J. I. Effects of sodium chloride and polyethylene glycol on root hair infection and nodulation of Vicia faba L. plants by Rhizobium leguminosarum. Planta 1986. V.167. P. 303-309.

116. Zehr J.P., Jenkins B.D., Short S.M., Steward G.F. Nitrogenase gene diversity and microbial community structure: a cross-system comparison. Environ. Microbiol. 2003. V.5. P. 539-554.

117. Zehr J.P., Mellon M., Braun S., Litaker W., Steppe Т., Paerl H.W. Diversity of heterotrophic nitrogen fixation genes in a marine cyanobacterial mat. Appl Environ Microbiol. 1995. V. 61. P. 2527-2532.

118. Zehr J.P., Mellon M.T. and Zani S. New nitrogen-fixing microorganisms detected in oligotrophic oceans by amplification nitrogenase (nifll) genes. Appl. Environ. Microbiol. 1998. V.64. P. 3444-3450.

119. Zhilina T. N., Zavarzin G. A Extremely halophilic, methylotrophic, anaerobic bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 1990. V. 87. P. 315-322.

120. Zon N., Dart P.J., Marcar N.E. Interaction of salinity and rhizobial strain and growth and N2-fixing by Acacia ampliceps. Soil Biol. Biochem. 1995. V. 27. P. 409-413.