Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Диагностико-терапевтический алгоритм при некрозе матки у беременных сук, вызванном Clostridium perfringens

ВАК РФ 06.02.06, Ветеринарное акушерство и биотехника репродукции животных

Автореферат диссертации по теме "Диагностико-терапевтический алгоритм при некрозе матки у беременных сук, вызванном Clostridium perfringens"

На правах рукописи

Ермакова Ирина Александровна

ДИАГНОСТИКО-ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ АЛГОРИТМ ПРИ НЕКРОЗЕ МАТКИ У БЕРЕМЕННЫХ СУК, ВЫЗВАННОМ CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

06.02.06 - ветеринарное акушерство и биотехника репродукции животных 06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005542282 * П£К 20,3

г. Новочеркасск-2013

005542282

Работа выполнена в Государственном научном учреждении СевероКавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт Российской академии сельскохозяйственных наук

Научные руководители:

доктор биологических наук Карташова Евгения Владимировна доктор ветеринарных наук Бутенков Александр Иванович

Официальные оппоненты:

Баймишев Хамидулла Балтуханович

доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой ФГБОУ ВПО Самарская ГСХА Паршин Павел Андреевич доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий кафедрой ФГБОУ ВПО «Воронежский госагроуниверситет им. императора Петра I

Ведущая организация:

ФГБОУ ВПО «Донской государственный аграрный университет», п. Персиановский

Защита состоится «24» декабря 2013 года в 1500 часов на заседании диссертационного совета Д 006.106.01 при Государственном научном учреждении Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт Российской академии сельскохозяйственных наук.

346421, Ростовская область, г. Новочеркасск, Ростовское шоссе, О

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ СевероКавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт Россельхозакадемии - 346421, Ростовская область, г. Новочеркасск, Ростовское шоссе, 0.

Автореферат разослан «^/»ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного сове:

А.М. Ермаков

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Одной из проблем, наносящих серьезный ущерб собаководству, являются дистоции (A.B. Лебедев с соавт,, 2000). Дистоции — распространенная патология, в среднем у собак они составляют 5 % от всех родов, но у некоторых пород собак, особенно ахондропластического типа, могут достигать 100 % случаев (А.Д. Белов, Е.П. Данилов, И.И. Белая и др., 1986; А.Д. Белов, 2001; А.Е. Баранов, 2003).

Среди всех нарушений родового процесса, выделяется малоизученная патология - некроз матки. В литературе имеются единичные сообщения о некрозе матки у сук, который развивается при нарушении родового процесса (A.Weber е. а., 1989; F.Werdeling е. а., 1991; С.Н. Карташов с соавт., 2004). При этом авторы не указывают этиологический фактор заболевания, называя его синдром некроза беременной матки у сук, указывая на то, что при нем всегда развивается септическое состояние, которое необходимо контролировать. (С.Н, Карташов с соавт., 2003, 2004). Учитывая стремительность

развития болезни, особенности возбудителя, сложность дифференциальной диагностики, оценки тяжести патологического процесса, неблагоприятный прогноз при запоздалом оперативном вмешательстве (В. Н. Кисленко, 2000; DM. Bueschel, е. а., 2003; С.И. Джупина, 2005; J. Е. Vidal е. а., 2008), целью наших исследований было: изучить особенности некротического метрита, вызванного Clostridium perfringens у сук, и разработать диагности-ко-терапевтический алгоритм при данной патологии.

Для реализации цели были поставлены следующие задачи:

изучить распространение, сезонность и предрасположенность различных пород к некрозу матки, вызванному Clostridium perfringens;

изучить особенности клинического проявления и изменения лабораторных показателей при некрозе матки, вызванном Clostridium perfringens;

разработать диагностический набор и провести генотипирование Clostridium perfringens, ассоциированных с различными патологиями у сук;

определить источник Clostridium perfringens при возникновении некроза матки у беременных сук;

разработать диагностико-терапевтический алгоритм при некрозе матки у беременных сук, вызванном Clostridium perfringens.

Объектом исследования были собаки различных пород с патологией родового процесса.

Предметом исследования служили клинические признаки, экскреты больных собак и патологический материал, содержащий CI. perfringens.

Научная новизна исследования. Впервые установлена этиологическая роль в возникновении синдрома «некроз беременной матки» у собак Clostridium perfringens, генотипа сра (токсинотип А), который детецируется в 91,7% всех случаев данной патологии. Определена сезонность заболевания. Установлено, что доля некроза матки у сук в общей патологии родов составляет 5,9%. Впервые выяснено, что 9,9 % всех здоровых собак являются носителями С/, perfringens, выделяя ее во внешнюю среду из желудочно-кишечного тракта, у 67,4% из них CI. perfringens является также частью микробиоценоза влагалища. Разработан эффективный метод ПЦР диагностики заболевания, достоверность которого составляет 100% против 60,6% при стандартном бактериологическом исследовании. На основании новых экспериментальных данных разработан диагностико-терапевтический алгоритм при некрозе матки у беременных сук.

Научно-практическая значимость исследования. Изучены теоретические аспекты и получены новые экспериментальные данные об этиологии, патогенезе и особенностях клинического течения синдрома «некроз матки» у беременных сук. Разработаны и успешно применяются на практике диагностико-терапевтический алгоритм при некрозе матки, эффективные схемы лечения, превентивная терапия и профилактика заболевания.

Реализация результатов исследований. Научные положения и результаты исследований внедрены в производство и служат руководством к практической деятельности ветеринарных клиник Ростовской области, ГБУ Ростоблветлаборатории, лаборатории функциональной диагностики болезней с.-х. животных ГНУ СКЗНИВИ Россельхозакадемии. Выводы и теоретические закономерности используются в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий на кафедре внутренних незаразных болезней и патофизиологии Дон ГАУ по курсу «Болезни мелких домашних животных».

Апробация полученных результатов. Основные результаты диссертационной работы обсуждены и одобрены на ежегодных заседаниях Ученого

совета ГНУ СКЗНИВИ Россельхозакадемии, Всероссийских научно-практических конференциях ГНУ СКЗНИВИ (2012-2013).

Публикации. Основные результаты диссертационной работы опубликованы в 5 работах, в том числе в 4 журналах, рекомендованных ВАК.

Личный вклад соискателя. Представленная работа является продуктом личных исследований автора. При этом часть научных трудов опубликована в соавторстве. Все соавторы в справках, предоставленных в диссертационный совет, не возражают против использования совместных данных.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 146 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов исследований, обсуждения, выводов и практических предложений. Список литературы включает 301 источник, из них 171 иностранных.

Основные положения, вынесенные на защиту:

- этиологическим фактором некротического эндометрита у собак является С1. рег/г^епя;

- выявление С/, рег/г^ет методом ПЦР является объективным, быстрым и точным методом для постановки диагноза на некротический эндометрит у собак, а количественная детекция ДНК возбудителя в крови позволяет строить прогноз на тяжесть течения заболевания;

- применение диагностико-терапевтического алгоритма ускоряет постановку диагноза, улучшает курабельность беременных сук при некрозе матки.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работу выполняли с 2009 по 2012 гг. в лаборатории функциональной диагностики болезней сельскохозяйственных животных ГНУ СКЗНИВИ Россельхозакадемии, в Ростовской областной ветеринарной лаборатории, а также в ветеринарных клиниках Ростовской области. Объектом исследования служили собаки различных пород, поступившие в клиники с диагнозом - патология родов.

Таблица 1. Объем проведенных исследований

№ п/п Вид исследования Всего проведено исследований

1 Исследовано животных клинически, гол. 958

2 Выявлено больных животных, гол. 57

3 Вскрыто павших собак, гол. 94

4 Бактериологических 2345

5 Проведено лабораторных Гематологических 67

6 исследований: Биохимических 67

7 ПЦР 625

Для обнаружения и идентификации Clostridium perfringens бактериологическим способом проводили высевы из паренхиматозный органов на МГТА, МПБ, среду Китга-Тароцци; из тонкого отдела кишечника - на среду Кигга-Тароцци, из матки - на среду Китга-Тароцци с пересевом на кровяной агар; при выделении Cl.perfringens получали крупные колонии с ровными краями, окружённые зоной неполного гемолиза; в последующем производили высев на молоко.

Диагностику Cl.perfringens посредством ПЦР производили с использованием видоспецифических праймеров, сконструированных для выявления генов сра, срЫ, срЫ, cpetx, cpi и сре. Для оптимизации проводимых исследований проводили мультиплексную ПЦР, позволяющую обнаружить несколько генов (сра, срЫ, cpetx и cpi) и двойную ПЦР для обнаружения генов cpetx и cpi. Изоляты для исследования суспензировали в микропробирках и сохраняли при -80°С. Для выделения ДНК использовали наборы «Рибо-Сорб» и «ДНК-Сорб-В» ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (г. Москва) в соответствии с инструкциями изготовителя. Нуклеотидные последовательности генов-мишеней для ПЦР были получены из баз данных NCBI GenBank. Анализ нуклеотидных полноразмерных геномов и участков генов CI. perfringens проводили с применением пакета прикладных программ «BioEdit 6.0».

Гематологические исследования включали определение числа эритроцитов и лейкоцитов, скорости оседания эритроцитов, выведение лейкограм-мы (по Кудрявцеву, 1948), концентрации гемоглобина (гемоглобинцианид-ным методом), гематокрита (по И. И. Архангельскому и Л. П. Сошенко, 1993).

Биохимические исследования включали: определение щелочной фос-фатазы (по ферментативному гидролизу n-нитрофенилфосфата, В.Г. Шмеле-

ва, 1997), активности аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы (по методу Райтмана-Френкеля, 1996), а-амилазы (по Каравею в соответствии с инструкцией диагностического набора, 2009, Биоконт), глюкозы (ор-то-толуидиновым методом Гультмана в модификации Хиваринена - Никил-ла, 1962), мочевины (с помощью био-лахема-теста), белка (биуретовой реакцией), билирубина (по методу Ендрашика-Грофа в соответствии с инструкцией диагностического набора, 2000, ЭКОлаб), альбумина (по реакции с бромкрезоловым зеленым в соответствии с инструкцией диагностического набора, 2000, ЭКОлаб), креатинина (методом Яффе в соответствии с инструкцией диагностического набора, 2010, АстроМЕД), С-реактивного белка (методом реакции преципитации в капилляре, 1976).

Статистическую обработку результатов исследований проводили по H.A. Плохинскому (1970), Хитоси Кумэ (1990) с использованием пакета прикладных программ MS Office 2007.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Распространение и этиология некроза матки у беременных сук, вызванного Clostridium perfringens За период с 2009 по 2011 гг. в ветеринарных клиниках Ростовской области был проведен клинический осмотр 958 сук. При этом у 13 % животных были выявлены тяжелые дистоции, потребовавшие оперативного вмешательства, включая 5,9% случаев с синдромом некроза матки. Было выявлено две группы причин дистоций, первая была связана с нарушениями со стороны плода, и вторая - с нарушениями со стороны матери (табл. 2). Отсюда следует, что те же причины, которые вызывают нарушение нормального родового процесса, могут провоцировать и развитие некроза беременной матки. Однако у 66,7% с развившимся некрозом матки при предоперационном исследовании и оперативном вмешательстве каких-либо морфологических причин выявлено не было.

Таблица 2. Причины тяжелых дистоций, потребовавших оперативного вмешательства (п=125)___

Причина дистоции Количество животных с патологией родов Количество животных с некрозом матки

гол. | % гол. | %

нарушения со стороны плода

заворот головы, неправильное положение, предав-' жание, членорасположение 36 28,8 8 14,0

вклинивание в родовые пути двух плодов 14 па И 19,3

нарушения со стороны матери

узость родовых путей 61 48,8 - 0

врожденные анатомические нарушения 2 1,6 - 0

слабость схваток и потуг, нарушения координации ; родов 12 9,6 38 66,7

итого 125 100 57 100

Следовательно, дистоции могут быть предрасполагающим фактором в развитии некроза матки, но не являются непосредственной причиной заболевания.

Для изучения носительства Clostridium perfringens и ее роли в возникновении некроза матки у беременных сук были проведены следующие исследования.

В первом исследовании от клинически здоровых собак (п=435) были отобраны пробы кала и мазки из влагалища для бактериологического исследования на CLperfringens. В результате исследований наличие С/, perfringens в кале было выявлено у 9,9 % собак (43 гол.), доля носителей CLperfringens в микробиоценозе влагалища составила 6,7% (23 гол.) от всех исследованных животных, при этом у 67,4% из них бактерия была обнаружена и в кале.

Следующее исследование было проведено на собаках (п=23) с клиническими признаками энтерита (все животные в установленные сроки были вакцинированы от основных инфекционных заболеваний - лептоспироз, вирусный энтерит, гепатит, чума плотоядных, бешенство). У этих собак также были отобраны фекалии для бактериологического исследования. В результате у семи из них (30,4 %) были выделены С/, perfringens.

В третьем исследовании был отобран патматериал от павших собак (п=94), имеющих в анамнезе признаки геморрагического гастроэнтерита. Бактериологические исследования показали наличие С/, рефт%епз у 28% животных.

В следующем исследовании у беременных сук (п=14) с синдромом некроза матки для бактериологического исследования были отобраны пробы кала и содержимого матки. При этом из содержимого матки 12 животных удалось выделить С1. реф{щет, то есть в 85,7% случаев развития данной патологии ее этиологическим агентом являлась клостридия. Кроме того, бактерия была выделена во всех случаях исследования кала.

Проведенные исследования дают основание предполагать, что в большинстве случаев причиной возникновения некроза беременной матки у собак являются С/. реф1щет, при этом источником возбудителя является либо собственная микрофлора влагалища, либо биоценоз кишечника.

Заболеваемость некрозом матки в зависимости от породы собак представлена в таблице 3.

Таблица 3. Выявление некроза матки у беременных сук различных пород____

№ п/п Породы собак Исследовано собак, гол. Из них с некрозом матки

гол. %

1 пудель 73 И 15,1

2 доберман 11 - -

3 стафордширский терьер 16 - -

4 питбультерьер 14 - -

5 немецкая овчарка 112 - .

6 спаниель 74 14 18,9

7 пекинес 97 7 12,3

8 лайка 17 1 5,9

9 ротвейлер 21 - -

.. 10 чау-чау 16 2 12,5

11 боксер 3 - -

12 сенбернар, московская сторожевая 6 - -

13 курцхаар 7 - -

-14 французский бульдог 17 1 5,9

15 той-терьер 5 1 20,0

!16 колли 10 1 10,0

17 болонка 6 2 33,3

18 кавказская овчарка 81 - -

19 среднеазиатская овчарка 124 - -

20 помесь 248 17 6,9

Во всех случаях заболевание диагностировали у собак мелких и средних пород. Согласно данным таблицы, на первом месте по предрасположенности к некрозу матки стоят болонки (33,3%), той-терьеры (20,0%), спаниели (18,9%).

Также была определена сезонность синдрома некроза матки. Заболевание встречается только в теплое время года (рис. 1), при этом пик приходится на август-сентябрь.

Известно, что во время родового процесса температура тела у суки снижается на 1-2 градуса, и это может играть защитную роль, то есть С1. реф^ет не размножается в родовых путях. Возможно, что при сильной жаре, рис. 1. Зависимость заболеваемости собак которая устанавливается в конце от сезона года (п=57}

лета - начале осени в Ростовской области, у мелких собак температура тела может не понижаться из-за высокой температуры окружающей среды, что и обуславливает более интенсивное размножение бактерий.

3.2. Особенности клинического течения некроза матки у беременных сук, выявление информативных маркеров для постановки диагноза

В результате клинического исследования собак с синдромом некроза матки и собак с нормальным течением родов (контрольная группа), больные животные соответственно тяжести заболевания были разделены на три группы: 1 степень заболевания - соответствовала легкой форме, 2 степень - средней и 3 степень - тяжелой форме заболевания (табл. 3).

Таблица 2. Гематологические показатели у сук с некрозом матки

Показатели, ед. измерения Клинически здоровые животные (и = 10), М±т Больные животные, М±т

степень тяжести заболевания

1 (п = 21) 2 (п = 25) 3 (п=11)

Эритроциты, х1012/л 8,14+0,16 5,12+0,21 4,84+0,15* 5,61+0,28*

Гемоглобин, г/л 175,56+13,19 120,86±11,89 77,14±8,30* 48,75+3,51*

Гематокрит 0,47±0,21 0,35±0,02 0,21±0,08* 0,12±0,02*

СОЭ, мм/ч. 20,05±1,1 38,07±2,48* 58,54+6,43* 96,77+7,73*

Примечание: * - Р<0,01 - Р<0,001 относительно контрольной группы

Таблица 3. Выраженность клинических признаков у сук при разной степени тяжести некроза матки__________________

Клцшюески Бальные животные

Пощите-ги здоройые степень тяжести некроза матки

животные 1 3

(п= 10) 0з = 21) (п = 25) (п=11)

Пулы;, уд./мшт До 1'0С» 100-1201161-180) 121-180(181-250) 180-250 и выше

Наполнение пульса Хорошее Удовпегзср! тельное Резко повышено Нитгвнлный, не педалируется

Астения 1-2 2-3 1 Более 5

Цвет глшисгык Ризоиде Розовые Яркобордового щвсгга Бледные

СНК, сек 1-2 2-3 А Более 5

Одыижа, частота ЦЫХЙЩЮ Нет 10-20 Есть, 50-40 Есть, 41-60 Есть, :зыше 60

Рвота, в час Нет I рат 2 р;йа Более 3

Наличие схваток И потуг при гтимуляшш Выраженные, на каж!ую стимуляцию Не на кэащпо стимуляцию Отсутствуют Отсутствуют

Вздутие яшвота Не-? Имеете^ гепшй тим-нанит при пфкусии Выраженное увеличение иниста хорошо определяемся тимпанит Жшют раздув и г анрежен

Циурда, мл><ч/кг 20 0 0

Стешжъ сбезцош (вания Нет Слабо выраженр Умеренно выражено Резко выражено

Темгизратура, С" 39,3 33,5 39,5-40 Ниже 36

От подопытных животных получали кровь и мочу для проведения ге-

магологичеких и биохимических исследований. Результаты представлены в таблицах 2-5.

___ Таблица 4. Лейкограмма у сук с некрозом матки____

Показцтели Клинически здоровые, №т (п=10) Больные животные. М±т

степень тяжести заболевании

1 ■!п = 21) 2 (л = 25) (п,= И)

ЛеИкоциты, хШ'/л 9,66±0,21 14,25±0,66* 29,66+1,23* 2,14±0,75*

Эозинофипы, % 5,55±0,07 3,63 ±0,07* 1,33±0,04* 0,22+0,03*

Юные, % - 1.,60±0,03 3,62±0,12 2,49±0,14

Палочюэядерные не1гфог(|Илы, % 4,84+0,14 7,69±0,18* 12,41 ±0,32* 14,47±0.4*

Сегментоядерные неГггрофилы, % 52,57±1,4 56,01±1,4 64ЛШДЗ* 70,51±1.2*

Лимфоциты, % 32,49±1Д 31,64±1,2 10,17+0,18* 7,35 ±0,23*

Моноциты, % 4,63+0,12 3,<54±0,12* 2,45±0,13* 1,56 ±0,11*

Примечание: * - Р<0,01 - Р<0,001 отаосительио контрольной группы

Согласно данным таблиц, гематологические показатели у животных с тяжелым и крайне тяжелым течением болезни были достоверно ниже в сравнении с клинически здоровыми животными. Однако в целом гематологические изменения носили неспецифический характер и отображали вторичные изменения в организме.

Таблица 5. Биохимические показатели у сук с некрозом матки

Показатели, ед. изм. Клинически здоровые, М±т (п= 10) Больные животные, М±т

степень тяжести заболеваши

1 (п = 21) 2 (п = 25) 3 (п = 11)

АлАТ, Е 74,76±2,56 180,53±6,7* 169,17±15* 204,69±12*

АсАТ, Е 60,45±5,45 120,43±4,1* 161,99±3,7* 220Д1±4,1 *

Мочевина, Мк/Моль 8,22±1,88 25,90±3,23* 31,64±4,34* 42,55±3,42 *

Креатинин, Мк/Моль 80,10±4,12 120,06±12,1* 180,12±4,6* 240.34±12, 1*

Натрий плазмы, М/'моль 145,75±9,15 138,97±15,3 151,00±12,6 158.05±13, 3*

Натрий мочи, М/Моль 10,76±8,24 6,13±0,01* 3,86+0,03* 0,15+0,01*

Экскретируемая фракция натрия, % 1,66±0,38 0,63±0,01* 0,33+0,01* 0,15±0,02

Спаловые кислоты м моль/л 2,41±0,16 2,82±0,05 3,82±0,06 7,22±0,08*

Фибриноген, г/л 3,24±0,18 7,55±0,29* 10,21±0,19* 1б,13±0,18 *

С-реактивный белок, +(1) - 1,47+0,01 2,69±0,02 3,6?±0,02

Примечание: * - Р<0,01 - Р<0,001 относительно контрольной группы

Согласно таблице, по сравнению со здоровыми животными, у больных собак существенно (до 60%) снизился уровень натрия в моче. Такой показатель, как концентрация натрия в плазме крови оказался незначимым, так как он практически не изменился по мере ухудшения состояния животного. По мере утяжеления симптомов существенно повышались показатели маркеров воспаления: в 2,6 раза - сиаловых кислот; в 3 раза - фибриногена; в 3,6 раза-С-реактивного белка. Также при экспрессии заболевания в 2,5 раза возрастал уровень АлАТ; в 3,6 раза - АсАТ; в 4,2 раза - мочевины; в 2,4 раза - креати-нина. Тяжесть течения также объективно отображала экскретируемая фракция натрия (ПЯЧа), показывающая нарушение перфузии почек; уровень данного показателя в сравнении с нормой при тяжелой форме заболевания упал в 10 раз. РЕЫа также является объективным показателем тяжести кардио-

депресивного синдрома и вместе с маркерами воспаления может быть основанием для постановки диагноза.

3.3. Разработка диагностикума для детекции ДНК CL perfringens в реакции ПЦР, генотипироваиие различных штаммов CL perfringens, выделенных от беременных сук с синдромом некроза матки

Разработка тест-системы. В результате выравнивания нуклеотидных последовательностей сре гена CI. perfringens было выявлено несколько протяженных районов 100%-ной идентичности нуклеотидной последовательности между всеми штаммами, которые и были избраны в качестве мишеней для отжига праймеров и проб. Дизайн праймеров, комплементарных данному участку, осуществляли таким образом, чтобы 3'-терминальные и/или субтерминальные нуклеотидные остатки были комплементарны родоспецифичным остаткам в последовательностях FtsJ гена и содержали гуанин или цитозин. Видоспецифичные праймеры ClpF (5'-GGTTCАТТАATTGAAACTGGTG-3') и ClpR (5'-GCTGGTAATTTATATGATTGGC-3') фланкировали участок в 599 пар нуклеотидов. Уникальность ПЦР-праймеров проверяли посредством поиска их последовательностей в базе данных GenBank при помощи алгоритма BlastN (рис. 2).

ence Algnrnent View Accessory Application RNA World Wide Web Option; Window Help

lew r JiT - В 7 tolal sequericea

Selection: 0 Sequence Made Nor» Start .

Poátion. Numbering Mask: Hone ruler at11

i a - -и втт if IMS^mm §Mii ? 3f ^'

20 3D 40 50 60 70 SO 50

per f tingens 8" '"29' ' 3 1 1 BCt■ tcLss teoetet.gg«ate ttatcoctt nctegcBtgtotactctagcn tetncatcacacttta

perfringens в...................... .................. .....................................

perf ringens s-........................................t............... . с......................

perfringens s- .......................................... ......................................

perfringens ............................................. . . .............с......................

perfringens ..........................................с................с......................

perfringens ..........................................-ь.................. . . ...................

Рис. 2. Выравнивание нуклеотидных последовательностей сре гена нескольких штаммов CL perfringens

Олигонуклеотиды были синтезированы амидофосфитным методом и очищены при помощи препаративного электрофореза в ПААГ.

Рассчитанные видоспецифичные праймеры для выявления ДНК имели высокую температуру отжига (68°С), это позволило значительно снизить время постановки реакции, но не повлияло на её специфичность и чувствительность. Постановку ПЦР проводили в реакционной смеси стандартного со-

става с использованием 10 пкМ каждого праймера, 5 мкл раствора ДНК с добавлением 3 мМ М§С12. Амплификацию проводили с использованием термостата «Терцик» (ЗАО «ДНК-технология», Москва) в режиме: предварительная денатурация при 95°С в течение 5 минут, затем 35 циклов, включающих этапы 1) денатурация при 95 °С - 10 секунд, отжиг праймеров при 68 °С - 10 секунд, 3) элонгация при 72 °С - 10 секунд.

В качестве положительного контроля использовали ДНК выделенной бактериологическими методами культуры. Детекцию продуктов амплификации проводили электрофорезом в 2% агарозном геле в растворе бромистого этидия (рис. 3).

Исследование эффективности ПЦР 1 г з 4 з и ок к-

диагностики. Диагностические характе-

ш

ристики разработанной тест-системы — Щ "иГьГ

изучали в сравнении с классическим «ш> ьР

бактериологическим методом, подразумевающим выделение чистых культур бактерий из исследуемого материала с использованием селективных питательных сред и последующую морфологи- РисХ Аете^ия продуктов амплификации в агарозном геле

ческую и биохимическую (либо серологическую) идентификацию выделенных культур. Всего было исследовано 89 клинических образцов (патологический материал, фекалии и выделения матки), среди которых 12 клинических образца представляли собой материал, полученный от собак с некрозом беременной матки.

В результате исследования было установлено, что метод ПЦР проявил большую чувствительность по сравнению с классическим бактериологическим методом. Так, методом ПЦР возбудитель был выявлен в 89 образце (100%), в то время как с использованием бактериологического метода лишь в 54 образцах (60,6 %).

Возможно, это связано с назначением антибактериальной терапии клинически больным животным. Поэтому в образцах, полученных от этих животных, присутствовали либо погибшие С]. perfringens, либо их некультиви-руемые формы, ДНК которых и определялась методом ПЦР.

Поскольку число бактерий CI. petflingens находится в прямой зависимости от количества выделенной из клинического материала ДНК, для опенки бактериальной нагрузки мы использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. С этой целью были разработаны видоспецифические праймеры (5'-TTAAATTTAACTGATGC АТТАА АСТ-3' и 5'-

TCTTCTAACTCATACCCTTGGAC-3') и зонд с флуоресцентной меткой на 5' конце и гасителем флуоресценции BHQ-типа на 3' конце (JOE-5'- TTGAT-TTAGCTG!CTGCTACAGAAA-3'-BHQ-l). Амплификацию проводили с использованием прибора Rotor-gene 6000 в следующем режиме:

1) 1 цикл 95° - 5 минут;

2) 10 циклов 95° - 15 сек; 60 ° - 25 сек; 72 ° - 25 сек.

3)35 циклов 95° -15 сек; 56 0 - 25 сек (детекция); 72 0 - 25 сек.

Каждый конкретный случай ПЦР-позитивного образца изучали с учетом клинических показателей, определяли степень тяжести течения заболевания, общее состояние собаки

В результате исследования была установлена высокая корреляция тяжести клинического течения и степени бактериальной нагрузки. Об этом свидетельствовало значение Ct (число раундов амплификации, необходимое для достижения порогового значения), которое имеет обратную зависимость от количества ДНК в исследуемом образце. Чем меньше стартовое количество копий ДНК-мишени, тем большее число циклов амплификации (Ct) необходимо для достижения порогового значения. Характеристики приборов, наиболее широко используемых в клинической диагностике для Real-Time PCR, таковы, что для детекции единичных копий ДНК-мишени в исследуемой пробе требуется 35-37 циклов амплификации. На основании проведенных исследований мы сопоставляли результат ПЦР с учетом того, что значение Ct обратно пропорционально количественному содержанию ДНК в исследуемом образце (таблица 6).

Таблица 6. О при детекции ДНК С рег/гшцепз (сра ген) у сук с некрозом матки разной тяжести клинического течения__

Число раундов амплификации Тяжесть клинического течения заболевания

1 2 3

а >30 >23 <23

Таким образом, была установлена высокая корреляция тяжести клинического течения и степени бактериальной нагрузки.

Генотипирование различных штаммов Clostridium perfringens. Поли-меразная цепная реакция позволяет определить наличие гена, ответственного за экспрессию того или иного токсина у конкретного изолята и установить токсинотип С/, perfringens. Основные токсины, продуцируемые Clostridium perfringens, отражены в таблице 7.

Таблица 7. Основные токсины, продуцируемые Clostridium perfringens (по Petit L.) ___

Токсинотипы, се- гены

ротипы сра срЪ cpetx cpitx срЬ2

токсины

а Ы Е 1 Ь2

А + - - - +/-

В + + + - +/-

С + + - - +/-

D + - + - +/-

Е + - - + +/-

В данной серии опытов были выяснены основные токсинотипы изоля-тов С1. perfringens, выделенных от здоровых и больных собак.

Методика исследования. Для исследования в ПЦР использовали набор для мультиплексной идентификации сра, срЫ, сре1х. ср\ генов и двойной набором для идентификации сре и срЬ2 генов. Исследовали ДИК, полученные от трех коллекций изолятов С/. реф11щет\ изоляты коллекции 1 были выделены из фекалий здоровых собак (п=43); коллекции 2 - из фекалий собак с различными поражениями желудочно-кишечного тракта (метеоризм, геморрагический энтерит, диарея, рвота, водянистый стул) (п=7); коллекции 3 - из содержимого полости удаленных маток от собак с диагнозом - «некроз матки» (п=12).

Результаты исследования отражены в таблице 8. Ген сра, ответственный за синтез токсина а, был обнаружен во всех исследованных образцах ДНК, гены срЫ, сре 1х, срг обнаружены не были, а все выделенные изоляты были идентифицированы как токсинотип (серотип) А. Гены сра, вместе с срЪ2 (генотип сра + срЫ) были обнаружены в 51,2 % изолятов, выделенных из фекалий здоровых собак и в 71,5 % изолятов, выделенных из фекалий собак с энтеропатиями. В образцах ДНК изолятов, полученных из содержимо-

го некротизированной матки, генотип сра + срЬ2 встретился только у одной собаки (8,3%).

Таблица 8. Патологические профили, ассоциированные с изолятами С1

Коллекция п Генотип сра, п (%) Генотип сра срЬ2, п (%)

1 43 21 (48,8) 22(51,2)

2 7 2 (28,5) 5(71,5)

3 12 И (91,7) 1 (8,3)

Как видно из таблицы, у здоровых собак отмечается приблизительно одинаковая инцидентность генотипов сра и сра+срЬ2 среди изолятов С/. pcrfringens токсинотипа А, тогда как у собак с энтеропатиямн отмечается превалирование генотипа сра+срЪ2, он встречался в 71,5% всех случаев поражения ЖКТ. При диагнозе «некроз матки» генотип сра определялся в 91,7% случаев.

Таким образом, было установлено, что основным возбудителем некроза матки у собак является Cl.perfringens токсинотип (серотип) А. Учитывая, что из фекалий у здоровых собак Cl.perfringens выделяется только в 17,3%, случаев, а выделенные изоляты в половине случаев являются генотипом сра + срЬ2, возможно, что источником контаминации матки является не только желудочно-кишечный тракт собаки, но и внешняя среда.

3.4. Сравнительная эффективность разных схем лечения собак с синдромом некроза матки

Лечение некроза матки требует предоперационной подготовки, ова-риогистерэктомии и послеоперационной терапии. Для разработки эффективной схемы лечения был поставлен следующий опыт.

Методика опыта. По принципу пар-аналогов животных, больных некрозом матки распределили на три группы (п=4), которых лечили по схемам 1-3 (рис. 4) соответственно, с последующей экстирпацией матки. Динамику заболевания отслеживали по его клиническому течению, основными показателями были СНК и диурез в млхч/кг, которые определяли каждый час.

Схема 1 Схема 2 Схема 3

1. Ацесол» - в/в. капель-но, 40-120 кап/мин (2448 ч); 2. Цитофлавин - в/в, в дозе объеме 0,2 мл/кг, 2 раза в сут. в течение 5 сут. разведенный в 100» 200 мл 5-10 % р-ре декстрозы или 0,9 % р-ре натрия хлорцад. 3. Метронидазол - в/в, капельно з разовой дозе 7,5 мг/кг р-ра (1,5 мл раствдра) 4. Цеоотаксим - в доз«; 50 мг/кг, 2 раза в сут. ]. Ацесоль - в/в, капельно, 40-120 кап/мин (24-48 ч)\ 2. Цитофлавин - в/в, в дозе в 'Вбъёме 0,2 мл/Кг, 2 раза в сут. в течение 5 сут. разведенный в ЮО-2СО мл 5-10 % р-ре декстрозы или 0,9 % р-ре натрия хлорида. 3. Метранидазо.т - е^в, кр-гкльно в разовой дозе 7,5 мг/кг 5% р-ра (1,5 ыл раствора) 4. Цефотаксим ■ в дозе 50 мг/кг, 2 раза в сут. 6. Дофамин - в'в, со скоростью 1,5-3,5 мкг/кг/мин. 1. Ацесоль - в/в, капельно, 40-120 кап/мин (2:4-48 ч); 2. Цитофлавин - в/в, в дозе в объёме 0,2 мл/кг, 2 раза в сут. и течение 5 сут разведенный в 100-200 мл 5-10 % р-ре декстрож или 0,9 % р-ре: натрия хлорида. 3. Меэронидазол - в/в, капельно в разовой дозе 7,5 мг/кг 5% р-ра (1,5 мл раствора) 4. Цефотаксим - в дозе 50 мг/кг, 2 раза в. сут. 6. Дофамин - в/в, со скоростью 1,5-3,5 мкг/кг/вдин. 7. ПеЕтаглобин - в доз^ 5 мл/кг однократно.

Рис. 4. Схемы лечения

Результаты эксперимента представлены на рисунке 5 и в таблице 9.

1-е 2е су та! 3 -е сузи 4 -е су-пси 5-е сутки 6 е -у щи ? -е суи£И 8-е сутаи9-е сутчи 10-е

д-жи сгпя Прс-доляретельносп, ле'-.ячя, гут

Л«с. Д Изменение диуреза в процессе терапии некроза матки

В начале лечения по первой схеме не удавалось увеличить диурез ни у одного животного. Все собаки были срочно прооперированы. К концу операции у всех животных диурез упал до, 0,5-2,0 мл*ч/кг. На вторые сутки после операции погибла 1 собака. У оставш)«:« в живых на 5 сутки появился аппетит, диу]: 1ез повысился до 25 млхч/кг, дачгися процесс выздоровления.

У всех животных 2 труппы после начала инфузеонной терапии отмечалась стабилизация дщ/реза на уровне 10 млхч/кг. На второй день после оперативного вмешательства диурез был на уровне 13-14 млхч/кг. На третий день животные начали принимать корм, вдчалет процесс выздоровления.

У всех животных 3 группы после начала инфузионной терапии отмечалась стабилизация диуреза на уровне 15-18 млхч/кг. На второй день после оперативного вмешательства диурез был на уровне 20-25 млхч/кг. На 3 день животные начали принимать корм, начался процесс выздоровления (табл. 9).

Таблица 9. Результаты лечения собак по различным схемам

Показатели Схемы лечения

1 2 3

Период реабилитации, сут. 9 7 3

Погибло во время оперативного вмешательства, гол. 1 1 -

Погибло после оперативного вмешательства, гол. 1 - -

Таким образом, наиболее эффективным способом лечения собак с некрозом беременной матки является схема 3.

3.5. Диагностико-терапевтический алгоритм некроза матки у беременных сук, вызванного Clostridium perfringens, принципы превентивной терапии

Быстро нарастающий токсический шок при некрозе матки и вытекающий отсюда неблагоприятный прогноз в отношении жизни и здоровья животных определяют актуальность создания объективного диагностико-терапевтического алгоритма.

На схемах приведены алгоритмы действий при контроле за суками на поздних стадиях щенности, в сроки от 50 до 55 дней с момента вязки, находящимися под наблюдением в ветеринарной клинике (рис.6) и при поступлении в ветеринарную клинику животного с началом родового процесса без клинических признаков некроза матки (рис. 7). При поступлении в ветеринарную клинику животного, имеющего признаки начала родового процесса с подозрением на некроз матки (имеются предпосылки: жаркая погода, сука имеет породную предрасположенности к некрозу беременной матки, у нее отмечаются клинические признаки некроза беременной матки), проводят терапию по схеме 3 (раздел 2.9) и ампутацию матки.

Применение диагностико-терапевтического алгоритма при некрозе матки у сук позволяет вовремя поставить правильный диагноз и назначить адекватную состояния животного терапию, что позволяет спасти жизнь животного, а в ряде случаев и его потомства.

Исследование образцов кала, мазков из влагалища, мочи и крови1 для лабораторного анализа на обнаружение ДНК C.perfrmgem

КЕСАРЕВО СЕЧЕНИЕ АМПУТАЦИЯ МАТКИ

терапия по схеме 2 терапия по схеме 3

-■'""*' повторное исследование на C.petftingens только крови

Рис. 6. Диагностика-терапевтический алгоритм при некрозе матки у сук при наблюдении за животными в клинике

3.6. Профилактика некротического эндометрита, вызванного Clostridium perfringens

Для разработки основных принципов профилактики некротического метрита, вызванного С/, perfringens были выделены основные факторы, способствующие возникновению некроза матки, установленные в наших исследованиях:

- жаркий период года;

- породная предрасположенность;

- выделение ДНК Cl.perfringens токсинотип (серотип) А, сра из кала;

- выделение ДНК Cl.perfringens из влагалищных мазков.

Холодная погода,

животное не предрасположено

Жар кал погода, предрасположенное лзсготное

I

Метрошшазол капельно

Исследование образцов мазков из влагалнша, мота и крови для лабораторного анализа на обнаружение ДНК Сл?^'"'.^'!-'

Пол олагг е лькые мазки из влагалища п (илнЧ моча

1

N ш^за эо л капельно

Полоизпельные обрззш.1 КрОЕП

Метрош^зззол капелько

КЕСАРЕВО СЕЧЕНИЕ АМПУТАЦИЯ МАТКИ

терапия по схеме 2 терапия по схеме 3

I - повторное исследование на только крови

Рис. 7. Диагноагшко-терапевтический алгоритм при поступлении в ветеринарную клинику животного с началом родового процесса без клинических признаков некроза беременной матки

Если планируемые роды должны попасть на жаркий период года, у всех сук, а, особенно, предрасположенных по породе, должны быть отобраны образцы кала, мазки из влагалища и мочи для лабораторного анализа на обнаружение ДНК а.реф^ею токсинотипа А, генотип сра. При обнаружении данного возбудителя в кале, моче или мазках из влагалища проводят терапию метронидазолом в таблетированной форме, в суточной дозе 7,5 мг/кг. массы тела в три приема в течение 10 дней. Данный курс следует проводить дважды, первый раз до вязки, второй раз за 5-10 дней до предполагаемой беременности.

4. ВЫВОДЫ

1. Тяжелые дистоции составляют 13 % от всех патологий родов у собак, при этом в 5,9% случаев имеет место синдром некроза матки.

2. В 85,7% случаев развития некроза матки, причиной являются С/. perfringens, при этом источником возбудителя является либо собственная микрофлора влагалища, либо биоценоз кишечника.

3. 9,9 % всех здоровых собак являются носителями Clostridium perfringens, выделяя ее во внешнюю среду из желудочно-кишечного тракта, у 67,4% из них Clostridium perfringens является также частью микробиоценоза влагалища.

4. К некрозу матки во время беременности предрасположены суки мелких и средних пород, на первом месте по предрасположенности стоят болонки (33,3%), той-терьеры (20,0%) и спаниели (18,9 %).

5. Синдром некроза матки является сезонным заболеванием, встречается только летом и осенью, при этом пик приходится на август-сентябрь.

6. Клинические признаки и гематологические изменения при некрозе матки у беременных сук соответствуют эндотоксикозу, а в тяжелых случаях -сепсису.

7. При развитии синдрома некроза матки уровень натрия в моче снижается до 60%, экскретируемая фракция натрия снижается в 10 раз, концентрация сиаловых кислот повышается в 2,6 раза, фибриногена - в 3 раза, С-реактивного белка - в 3,6 раз, уровень АлАТ возрастает в 2,6 раз, АсАТ - в 3,6 раза; мочевины - в 4,2 раза; креатинина - в 2,4 раза.

8. Основанием для постановки диагноза на некроз матки у сук, вызванный CI. perfringens, является выделение возбудителя бактериологическими методами или обнаружение его ДНК методом ПЦР. При изучении клинических образцов метод ПЦР проявил большую чувствительность по сравнению с классическим бактериологическим методом (100% против 60,6 %).

9. Cl.perfringens токсинотип А является основным возбудителем некроза матки у беременных сук. У здоровых собак отмечается одинаковая инцидентность генотипов сра и сра+срЬ2 среди изолятов CI. perfringens токсино-типа А, тогда как у собак с энтеропатиями отмечается превалирование гено-

типа cpa+cpb2, он встречается в 71,5% всех случаев поражения ЖКТ. При некрозе беременной матки у сук генотип сра детецируется в 91,7% случаев.

10. Применение разработанного нами диагностико-терапевтического алгоритма при некрозе матки у сук позволяет вовремя поставить правильный диагноз и назначить адекватную состояния животного терапию, что позволяет спасти жизнь животного, а в ряде случаев и его потомства.

11. Наиболее эффективной схемой терапии сук, больных некрозом матки, вызванном Clostridium perfringens, является схема, состоящая из раствора «Ацесоль», раствор для внутривенного введения «Цитофлавин», мет-ронидазола, цефотаксима, дофамина и пентаглобина.

12. С профилактической целью при обнаружении данного возбудителя в кале, моче или мазках из влагалища проводят терапию метронидазо-лом в таблетированной форме, в суточной дозе 7,5 мг/кг массы тела в три приема в течение 10 дней, данный курс проводят дважды.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для диагностики некроза матки у беременных сук использовать разработанный нами мультиплексный набор для детекции ДНК Clostridium perfringens с определением генотипа возбудителя.

2. В клинической практике для установления точного диагноза'к назначения адекватной терапии использовать разработанный нами диагностико-терапевтический алгоритм.

3. Для профилактики некроза матки у беременных сук использовать критериальные факторы способствующие возникновению некроза матки, и при их обнаружении назначать превентивную терапию.

4. Для лечения сук, больных некрозом матки, вызванным Clostridium perfringens, применять схему, состоящую из раствора «Ацесоль», раствора для внутривенного введения цитофлавина, метронидазола, цефотаксима, дофамина и пентаглобина.

5. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ:

1. Карташова, Е.В. Некоторые аспекты возникновения хронических эндометритов у собак / Е.В.Карташова, А.В.Шафикова, И.А.Ермакова // Ветеринария Кубани. - 2009,- № 2. - С. 21-23.

2. Гормональные нарушения в этиологии хронических эндометритов / Е.В.Карташова, А.В,Шафикова, Р.В.Клименко, И.А.Ермакова // Труды Кубанского государственного аграрного университета. Серия: Ветеринарные науки. - 2009. - №1 (ч.2). - С. 281-284.

3. Некротический эндометрит, вызванный Clostridium perfringens, -причина сепсиса у собак / Е.В.Карташова, И.А.Ермакова, С.ВЛобус, С.Н.Карташов // Ветеринарная патология. - 2011. - № 1(36). - С.28-32.

4. Роль Escherichia coli в развитии пиометры у собак / И.А.Ермакова, С.Н.Карташов, Г.Г.Корниенко и др. // Ветеринарная патология. - 2012. -№ 4 (42). - С. 16-20.

5. Некоторые аспекты патогенности основных возбудителей пиометры у собак / Е.В.Карташова, И.А.Ермакова, С.В.Лобус, С.Н.Карташов // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. - 2013.-№ 3. - С. 28-30.

Ермакова Ирина Александровна

ДИАГНОСТИКО-ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ АЛГОРИТМ ПРИ НЕКРОЗЕ МАТКИ У БЕРЕМЕННЫХ СУК, ВЫЗВАННОМ CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 15.11.13. Печать оперативная. Объем 1 усл. печ. тираж 120 экз. заказ №854 Издательско-полиграфическое предприятие ООО "МП Книга", г. Ростов -на-Дону, Таганрогское шоссе, 106