Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОЗИДМОНОФОСФАТКИНАЗА БАКТЕРИОФАГА Т5 (2.7.4.13): ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА БЕЛКА, ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНА

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОЗИДМОНОФОСФАТКИНАЗА БАКТЕРИОФАГА Т5 (2.7.4.13): ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА БЕЛКА, ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНА"

А

На правах рукописи

МИКУЛИНСКАЯ ГАЛИНА ВИКТОРОВНА

Дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназа бактериофага Т5 (2.7.4.13): выделение и свойства белка, идентификация и клонирование гена

03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пушино - 2004

№

9

Работа выполнена в Филиале Института биоорганической химии РАН

Научные руководители:

кандидат биологических наук Феофанов С.А.

кандидат биологических наук Зимин А.А.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, проф. Бурьянов Я.И.

доктор биологических наук Кулаковская Т.В,

Ведущая организация: Центр "Биоинженерия" РАН, г.Москва

Защита диссертации состоится «Лоу> 2004 г. в

часов на заседании Диссертационного совета Д002.038.01 в Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, г. Пущина Московской области, ИБК РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБК РАН Автореферат разослан л^сЗа/ис- 2004 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д002.038.0]/") Ц ^

кандидат биологических наук / ¡/¡Ар /смолихинаТ Л.

Л

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Фосфорнлнроваиие дезоксирибояукл еозидмонофосфато в до соответствующих дн фосфатов является одним из ключевых этапов биосинтеза предшественников ДНК

дезоксн р нбонуклеозидтр11 фосфатов - в клетках про- и эукариот. Эти реакции в живых клетках катализируют ферменты класса трансферам -дезоксирибонуклеозндмонсфосфаткшшы (дНМФ-киназы), в качестве донора фосфорила использующие АТФ или дАТФ.

дН МФ+(д)АТФ <=> дНДФ+(д)АДФ Бактерии, дрожжи и высшие эукариоты, как правило, индуцируют нуклеозидмонофосфаткиназы, специфичные к азотистому основанию субстрата — аде ннлаткпназы, гуаш шатки пазы и т.д.

Инфекция Eshcrichia coii колифагом сопровождается активной репликацией фаговой ДНК. Дтя обеспечения возросшей потребности в дНТФ бактериофаги индуцируют синтез менее специфичных к субстрату ферментов: так, дНМФ-киназы Т-четных колифагов (КФ 2.7.4.12) фосфорилнруют три субстрата, в том числе гилро кс и м етил нровзнны П дЦМФ, характерный для ДНК этих фагов. Бактериофаг Т5 также кодирует дНМФ-киназу (КФ 2.7.4.13), продукт гена (Ink. Этот ферменг обладает уникально широкой специфичностью к субстрату и фосфорилирует все четыре монофосфата, соответствующие каноническим основаниям ДНК - дГМФ, дТМФ, дАМФ и дЦМФ. Ранее фермент был частично очищен (Bessman ct all, 1964), что позволило авторам охарактеризовать ряд его биохимических свойств — субстратную специфичность, константы Михаэлнса для различных субстратов. При эгом невысокая степень очистки не позволила определить молекулярную массу фермента и его удельную активность. Кроме того, отсутствовали данные о первичной структуре гена. Ранее неоднократно предпринимались попытки "шотппГ-клонпрования фрагментов генома бактериофага Т5, но они не дали результата применительно к ранней области генома, в которой находится ген dnk.

Биосинтез нуклсозидтрифосфатов является объектом постоянного вннмания ученых, поскольку, помимо функции мономеров нуклеиновых кислот, эти макроэргическис соединения играют большую роль в процессах синтеза и распада белков, лишшов и углеводов, участвуют в регуляции метаболизма. Изучение ферментов биосинтеза дНТФ, в том числе и дНМФ-кимазы, на классической модели бактериофага обеспечит глубокое понимание механизмов регуляции этого процесса в нормальных и инфицированных вирусом клетках. Кроме того, широкая специфичность фермента бактериофага Т5 - потенциальный источник знаний о структурных основах субстратной специфичности киназ. Особое значение приобретает исследование дНМФ-кипазы бактериофага Т5 в связи с возможным применением т^кот_фсрм«нга_ЛЛ2_

энзиматического синтеза дезоксприбонуклсозндтрифосф^^ ^¡цюко

используемых в научных исследованиях и в медиц

научной литературы

Н®

Цель и задачи исследошшия.

Целью настоящей работы явилось структурно-функциональное и генетическое исследование дНМФ-киназы бактериофага Т5, а также выявление новых дНМФ-кииаз широкой специфичности. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Выделить и очистить до гомогенного состояния дНМФ-киназу бактериофага Т5 из иифшшроваииой фагом биомассы ЕхоН, определить молекулярную массу белка, изучить фнзнко-хи.мическне свойства фермента,

2. Секвеннровать область генома бактериофага Т5, содержащую ген сМ, и идентифицировать ген, пользуясь данными о фермагге.

3. Клонировать ген Ф>к н экспресс про вл г ь его в Е, соИ, разработать простой способ очистки белка из клеток штамма-иродунента с высоким выходом.

4. Провести анализ компьютерных баз данных на основании полученной информации о структуре киназ с целью поиска гомологичных ферментов из других источников.

Научная новизна.

В настоящей работе впервые описан процесс очистки дНМФ-кнназы бактериофага Т5 ло гомогенного состояния из инфицированной фагом биомассы Е.соИ и определены се физико-химические свойства — молекулярная масса, гаоэлектрическая точка, температурная стабильность, -а также аминокислотная последовательность Ы-конца белка. Выполнены секпсннрование фрагмента области С генома бактериофага, содержащего ген (1пк, и его описание (включающее находящиеся в нем открытые рамки считывания, потенциальные промоторы и терминаторы транскрипции). Ген <1пк идентифицирован и клонирован в шшмиду с эффективным промотором. Рекомбинантная дНМФ*киназа очищена из клеток штамм а-продуцента с высоким выходом двумя альтернативными способами. На основании полученной информации о нервичноН структуре дНМФ-кнназы бактериофага Т5 сделано предположение о возможном пространственном строении белка. В рамках исследования фаговых дНМФ* киназ также выделен и клонирован ген новой дНМФ-кнназы широкой специфичности, кодируемой бактериофагом фС31. Научили тактическая ценность.

Полученная в результате работы информация о новом гене расширяет представления о строении фаговых киназ и открывает новые возможности для изучения структуры ферментов данной группы и основ их субстрзтноГ! специфичности. Определение первичной последовательности фрагмента ДНК бактериофага Т5 важно для дальнейшего исследования фагового генома. Кроме того, в работе показана принципиальная возможность использования лНМФ-киназы бактериофага Т5 в технологии энзим этического синтеза нуклеотидов, в том числе модифицированных, что представляет интерес для молекулярной биологии и медицины.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на конференциях «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям» (Пушино, 2001). "Биология - наука XXI века" (Пущино,

2001), на международной научной школе-конфсрентши "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва,

2002), на VI чтениях, посвяшенных памяти академика Ю.А.Овчинникова (Москва-Пущнно, 2002).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 3 статьи, секвенированная последовательность помещена в Gen Bank (AY509815, AY 140897).

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на гУУ страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы (ссылок) и приложения. Диссертация иллюстрирована 33 рисунками и содержит f таблиц.

МЕТОДЫ

Стандартные методы. Концентрацию белка определяли метолом Брэдфорд (Bradford, 1976). Электрофорез белков в полиакриламидном геле проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1968). Секвенирование N-конца белка осуществляли методом деградации по Эдману при помощи газофазного анализатора модели 477/120А ("Applied Bíosystems", США). Молекулярную массу лативного фермента определяли методом аналитического равновесного ультрацентрифугирования (Bowen, 1971).

Бактериофаг для выделения геномной ДНК очищали равновесным центрифугированием в градиенте хлористого цезия, как описано (Maniatis et al., 1982). Для гидролиза ДНК бактериофагов и плазмид использовали следующие эндонуклеазы рестрикции и ДНК-модифицирующие ферменты: ЛссбЯ, SomHI, Cla\, Muni, Ndc\, Л'со1, щелочную фосфатазу Е.соН, ДНК-лигазу фага Т4, термостабильную ДНК-полимеразу Тац фирмы "Fermentas" (Литва).

Гибридизацию ДНК бактериофагов с зондом, получение компетентных клеток и трансформацию, получение бактериофагов в высоком титре и инфицированных фагом клеток E.coli, а также клонирование и скрининг колоний осуществляли, как описано (Maniatis et al., 1982).

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на приборе фирмы "Pcrkin Elmer" (США) в 25-50 мкл смеси, содержащей однократный буфер для Taq ДНК-пол им еразы, 1,5-2,5 мМ MgCl2, 200 мкМ каждого дезоксирибопуклеозидтрифосфата, 25 пмоль 5'- и З'-концевых праймеров, 0,01-1 мкг ДНК-матрицы, 1-2 ед. акт. ДНК-полимеразы Taq.

Нуклеотидную последовательность определяли методом Сэнгера (Sanger ct al., 1977) с использованием [а-"Р]дЛТФ и [а-32Р)яЛТФ. ПЦР

осуществляли при помощи кпга для секвеиироиання FcmtoMol DMA sequencing kit ("Promega", США), согласно протоколу фирмы. Пробы анализировали на 6-7% полиакриламидных гелях (550x280x0,2-0,4 мм), электрофорез вели, как описано (Краев, 1988), на приборе "Macrophore" (LKB, Швеция) при температуре 56°С и напряжении электрического поля 1900 V.

Для иммобилизации белка использовали сорбент на основе пористого стекла Силохром С-80 (завод "Люминофор", г. Ставрополь), аминопропилированный (обменная емкость по NH2-группам 0,25-1,00 ммоль/г) и активированный глутаровым диальдегндом.

Методы очистки белка. Для приготовления клеточного экстракта клетки суспендировали в четырехкратном объеме буфера, содержащего 40 мМ трис-HCl (рН 8,0), 200 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 20 мМ р-меркаптоэтапола, и разрушали ультразвуком. Клеточный дебрис осаждали центрифугированием {10000 g, 30 мин). Нуклеиновые кислоты из экстракта удаляли осаждением стрептомицинсульфаточ из расчета 1,5 мг/мл либо пропусканием через колонку с DEAE-Toyopearl 650 М. Ионообменную хроматографию проводили на приборе FPI.C, используя колонки с MonoQ различного объема. Белки элюировали линейным градиентом NaCl. Аффинную хроматографию вели, используя 1,5-мл колонку с Toyopcarl AF-Red 650М, адсорбировании ft белок смывали буфером, содержащим 5 мМ АТФ. Все процедуры проводит и при 4°С.

Секвеиированне фрагмента генома бактериофага Т5. На нервом этапе для секвенирования использовали "составную матрицу". Для ее получения геномную ДНК бактериофага Т5 гтшролизовали, выделяли Крп\ - КрпI фрагмент 7 (Rhoades, 1982), близкий к картированному гену dnk, К липкам концам фрагмента 7 лигировали синтетические олигонуклеотиды (5' GTACCACGGTCGGAGCCCCGGGCTC - олиго 1). Затем фрагмент амилифинировали с помощью олиго 2 (5' GAGCCCGGGGCTCCGACCGTG), комплементарного части олиго 1, и гнлрол изо вали рестрнкгазой Мип\. Один из полученных Крп\-Мип\ фрагментов использовали в качестве матрицы для секвенирования. Сскпснируюншм прайм ером являлся олиго 3

(5' CGGGGCTCCGACCGTG), представляющий собой укороченный олиго 2. Такой подход позволил получить первую последовательность длиной 200 п.н. без предварительного клонирования выбранного фрагмента.

На втором этапе секвенирования в качестве матрицы использовали геномную ДНК фага Т5, а также ПЦР-фрагменты, полученные методом "прыжков но хромосоме" (Забаровский, 2001). Этот подход состоял в получении пшролизата ДНК фага выбранной энлонуклеазой, его кольцевании лигазой и последующем проведении инвертированной ШЦ> с расходящимися праНмсрами и кольцевыми фрагментами в роли матрицы. В качестве рсстриктаз для "прыжка" использовались Лссб51 и Clal

Определение активности кнназ. Активность дНМФ-киназ определяли спектрофотометрнчсским методом, основанным на сопряжении образования нуклеозидд «фосфатов с окислением НАДН (Bessman, 1963). Для тестирования активности иммобилизованного фермента пробы после реакции анализировали полуколичественно метолом восходящей тонкослойной хроматографии на Kiesclgcl 60 F2n ("Merck", Германия) в системе диоксан:5М NH,OH:IM NHjCOOH (43:54:3).

Программное обеспечение. Нуклеотидные последовательности анализировали при помощи [фофамм Dm5 и Gene Runner v.3.0, подбор праймеров для клонирования осуществляли при помощи программы 01igo4. Для анализа аминокислотных последовательностей использовали программу BLAST Search {Altschul et at, ] 997), а также Multalin 3.0 (Corpet, 1988). Пространственную структуру киназы бактериофага Т5 анализировали при помощи программы Cn3D Viewer.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Выделение н свойства дНМФ-кнназы бактериофага TS 1.1. Очистка лНМФ-кнназы из инфицированные фагом клеток Е coli Дезокофибонукпеозкдмонофосфаткиназа бактериофага Т5 (КФ 2.7.4.13) была очищена до гомогенного состояния из клеток Escherichia coli, инфицированных нелизирующим мутантом бактериофага Т5 omHI28a, при помощи фракционирования сульфатом аммония, двух анионообменных хроматограф и Й при различных значениях рН и аффинной хроматофафии на Toyopearl AF-Red. Результаты стандартного выделения приведены в таблице 1. Фермент был очищен в 1190 раз с выходом 55,6 %.

Таблица 1. Очистка дНМФ-киназы бактериофага Т5.

стадия ОЧИСТКИ S У S о Ж й Ц % ■а Ú « Sa S 1 2С Ж ¡ 1 * я степень ОЧИСТКИ ПО íWv чр в" 1

грубы ft экстракт 100 2400 330 0,14 - 100,0

фракционирование сульфатом аммония 240 1920 2S8 0,15 1,07 87

1 я ионообменная хроматография Mono О. рН*8 0 27 25 240 9,1 65 73

осаждение сульфатом аммония 14 21 235 11,2 80 71

2я ионообменная кроиагография Mono О. рН*7.5 4 7,4 219 29,6 210 66

аффинная хроматография 1 М 183,5 166,8 1190 55,6

1.2. Фнчп ко-хи м н ч ее кие свойства белка

Полученный препарат белка давал одну полосу на геле прн электрофорезе в денатурирующих условиях, соответствующую белку размером около 29 кДа (см. рис. 1). Электрофорез в нативных условиях и аналитическое ул ктраце три фу гиро ванне показали, что белок существует в растворе как мономер с молекулярной массой 29,14 ± 3,03 кДа. Гомогенный препарат фермента катализировал фосфоршшрование четырех различных субстратов - дАМФ, дТМФ, дГМФ, дЦМФ, - с разной скоростью (табл. 2). Соотношение активностей соответствовало показанному предыдущими исследователями (Ветшал е! а1, 1964). Оптимум рН работы фермента лежит в области 7,0 - 7,5. Было показано, что фермент стабилен при 37ЙС, относительно стабилен прн 42°С и быстро инактивируется при нагревании его свыше 47°С.

Рис. 1. Денатурирующий ■электрофорез в

полиакрилачидном геле проб после каждой стадии очистки. I - грубый экстракт, 2 -фракционирование сульфатом аммония, 3 - первая ионообменная хроматография, 4 - осаждение сульфатом аммония, 5 - вторая ионообменная хроматография,

6 - аффинная хроматография,

7 - маркеры молекулярной массы.

Таблица 2. Соотношение удельной активности дНМФ-хиназы бактериофага Т5 на различных с>6стратах.

субстрат удельная активность, Е/мг относительная скорость реакции, %

дАМФ 232,0 100

дТМФ 166,8 71

лГМФ 153,6 65

дЦМФ 84,2 36

1 2 3 4 5 6 7

у»

„ 4—94,0 кДа ,, 4—66,0 кДа 45,0кДа

, — ^ зо,о кДа

4—20,1 кДа - 4—14.2 к Да

1.3. Определение N-конце во il после лопате л ьн ост» лмцнпкирлот

Для автоматического секвенировання по Эдману использовали 200 пМ гомогенного белка, перенесенного на Immobilon Р Transfer membrane (Mílliporc) методом блотшнга. В результате была определена 21-амлнокислотная последовательность xVLVGLHOEAGSOKDGVAKLH. Подчеркнутый участок представляет собой консервативный сайг связывания АТФ, имеющий обобщенную структуру GxxGxGK (Ikeda et al, 1988).

2. Структурная организация фрагмента ранней области С генома бактериофага Т5 (13-19,5 % генома)

2.1. Лначиз нуклеотндной последовательности

Для решения задачи поиска и идентификации retía dnk бактериофага Т5 был разработан подход к секвснированию, суп. которого описана в методической части. Это позволило определить первичную структуру фрагмента кластера С ранней области генома бактериофага длиной 7729 п.н. (GenBank Ac. No. AYI40897.AY509815).

Секвенированная область согласуется с рестрикцлонной картой (Rhoades, 1982) н охватывает от 13 до 19,5 % генома бактериофага. GC-содержанне данной области составляет 36,6%, транскрипция в секвенированном участке осуществляется справа налево, что согласуется с транскрипционной картой бактериофага (McCorquodale, Warner, 1987). В секвенированном непрерывном фрагменте обнаружены 17 открытых рамок считывания (ОРС), пять предполагаемых промоторов бактериофага Т5 и два потенциальных р-независимых терминатора транс крипиии. Нужно отмстить тесное расположение и даже перекрывание генов, что характерно для фаговых геномов. Также был обнаружен один из пяти "ннков" — одно не почечных разрывов фосфодиэфирной связи, свойстве иных ДНК бактериофага TS (Rhoades, 1977). Основные элементы приведены п таблице 3.

2.2. Локализация открытых рамок считывания

Анализ ОРС, обнаруженных в ссквенированной последовательности, осуществляли с помощью программ Blast, Multalin и Gene Runner. Было показано, что продукты трансляции lys и orflic проявляют достоверное сходство с двумя белками, образующими систему лизиса многих фагов (Wang et al, 2000), - холи ном и эндолюнном (люоцимом). Интересно, что гены, кодирующие поздние функции, находятся в ранней области. При этом их общий промотор не обозначен на карте (McCorquodale, 1987), в то время как остальные четыре потенциальных промотора этой области можно сопоставить с промоторами карты Р5-Р8. Скорее всего, это означает, что промотор генов холина и лизоцнма поздний, то есть геном бактериофага Т5 организован мозаично, чего ранее не предполагалось. Однако, возможно, холин и лизошш - ранние белки, но существует механизм, регулирующий активность холина на стадиях развития фага, предшествующих лизису.

Таблица 3. Положение основных элементов структуры фрагмента области С генома бактериофага Т5, молекулярные массы (ММ) потенциальных продуктов, их возможные функции н сходство с последовательностями белков, депонированных в GenBank.

элемент позиция MM белка (кДа) потенциальная функция сходство О' /О идентичности ЙепВапк accession No

старт стоп

Р5 400 341 промотор промотор P-D/H 33 бактериофага Т5 86% (52/60) Ml 1600.1

Р6 918 844 промотор промотор P-F 30 бактериофага Т5 100% (75/75) M 11604.1

orf4c 1528 1007 20,20 фосфоэстераза фосфопшролаза (Coryncbacterium glutamicum) 30% (53/173) NC003450

or/5 с 2391 1528 32,58 прогсип-фосфатаза серии* i рео ж п ю вая протеин-фосфата за бактериофага 30% (80/265) NP040641.1

Р7 2713 2683 промотор

огрс 3027 2737 11,09 тиоредоксин тноредоксин (Pscudomonas syringae ) 39% (25/63) AA058669

Р8 3527 3458 промотор

Т1 4013 3963 терминатор

lys 4435 4022 15,25 Л1ПОЦИМ эцлолнзин (бактериофаг Р27) 41% (49/117) AJ298298

orfllc 5088 4432 24,85 холии холил (бактериофаг RB49) 30% (60/196) CAD48127

PN 5157 5088 промотор

п 5250 5200 терминатор

orfllc 5844 5245 22,83 иротеаза С1р протеина» (Mesorhizobium loti) 30% (27/90) BAB54350

dnk 6609 5857 28,67 дИМФ-кшгаза

ntek 6428 6427

orflèc >7734 7336 14,90 эндопуклеаза эндопуклеаза (бактериофаг ХрЮ) 34% (37/106) NP858997.1

Кроме того, был обнаружен ген тиоредоксина бактериофага Т5 {orftc\ а также ген {orfSc), продукт которого проявляет достоверное сходство с серин-треониновыми фосфатазами из разных организмов. Очевидна регуляторная функция этого белка - возможно, он обеспечивает временную модификацию белков клетки хозяина при переключении метаболизма на синтез белков бактериофага.

Следует упомянуть, что продукт orfl2c проявляет выраженное сходство с нротеазной субъеднницей АТФ-зависнмой С1р протеазы. Такие белки бактерий и эукариот осуществляют энергозавнеимый протеолиз, участвуя в защите клеток от теплового шока и других стрессовых факторов (Maurizi et а(„ 1990, Fedhila et al., 2002, Nair et al., 2003), Последние открытия говорят о широкой распространенности белков этого класса в клетках про* и эукариот.

Наконец, секвенирование позволило идентифицировать ген длиной 750 п.н., размер продукта которого (28,668 кДа) и N-кониевая аминокислотная последовательность практически совпали с определенными экспериментально значением молекулярной массы (29,14 кДа) и N-kohuom дНМФ-киназы бактериофага, соответственно. Это был искомый ген сInk,

2.3. Потенциальные рсгудяторрис элементы

В секвенированной области были обнаружены 5 потенциальных промоторов транскрипции (рис. 2), обладающих характерными чертами промоторов бактериофага Т5 для РНК-полимеразы Ecoli: содержание АТ-пар 75-85%, консервативные области -10, -33, расстояние между ними 17 п.н., область -43 АТ-богата (Gentz and Bujard, 1985), Два промотора имеют характерный для ранних промоторов бактериофага Т5 консенсус +7 TTGA. Один из них представляет собой известный ранний промотор фага P-F 30 и сопоставим с промотором Рб транскрипционной карты (MeCorquodaie, Warner, 1987). Другие (за исключением того, под контролем которого находятся гены лнзоцнма и холина) соответствуют Р5, Р7 и Р8 карты.

Во фрагменте также обнаружены два потенциальных р-независнмых терминатора транскрипции, имеющих все характерные черты: палиндром и U-богатую область за ннм (рис. 3).

-44

-33

-10

+ 1

+7

гь AAAAATTCAC^IGCXlpAAGCCTTAAMTTCTCpATAAlTUiCTTCATAAATTAATGAGAGAGG Р6 iiAAGTTTTRT ггсета WVATCCTTAJVGTTTCTC гатам ГACTTTATAAATTGATG7vGAAGGA р7 TTTATTTTAC tTGCTT rCAGCTAAAAATTTTGC гатаат VTTTGTATAGATTGATACGftGGAT РЭ AAAAAAGTAG гтсаст rTTAGCCCTAGTTATTi гатаат VTATACATAAATTAGTTAAGAGAG Pn TAAAAACCC/iEXflaa^T-CCTCCAAAATTAaEai^pGTACrGGTTAGACGAGGrTACAA

Рис. 2. Погеншшьные прочогери ссквенироаанного фрасчогта области С генома бактериофага Т5. Цифрами указаны координэты нухлеотндов отосителшэ точки начала транскрипции. Нумерации промоторов дама в соответствии с картой (McCotquoJale, Warner, 1987). Pn - промотор, не обозначенный на карте, Конссреэти«ные области -ЗЭ И -10 заключены в блоки.

2.4, Идентификация гена Ivs

Функция продукта гена lys была подтверждена экспериментально посредством экспрессии гена в E.coli. Ген был клонирован в плазм иду

а

ТА Л С

G С 7 Т

А-Т Т-А

G-C G-C

G=C G-C

G-C G-C

C=G A-T

G-C C«G

CTTAG-CTTTTT О G

GAATC-GAAAAA TAATTTTAAG-CTTTTCTTTT

C-G ATTАЛААТТС • G AAAAGAA AA

G-C X» G-C x**

OG G-C

C-G Т-Л

C-G C-G

T-A C>G

С G C=G

AT A-T

A A 7 С T

Рис. 3. Предполагаемые -герминаторы транскрипции бмггсриофаа Т5 секвеннрсеанного фрагмента области Сшгома бдктерис"}мга Т5.

рЕТЗа по сайтам Nde\-BamH\. Отобранные клоны были проверены посредством индукции синтеза белка при помощи ИПТГ (гоопропил-t-•mo-Ji-D-галактопиранозида) в клетках штамма E.coli BL21(DE3). Было показано, что рекомбинантные плазмиды инициировали синтез продукта ожидаемого размера — около 15 кДа. Лизоцим в клетках обоих клонов находился в растворимом состоянии. Анализ активности экстракта показал, что продукт гена lys способен лизировать извне клетки энтеробактерий и бацилл.

3. Функциональная характеристика гена dnk 3.1. Идентификация, клонирование и экспрессия в.fc.ffl/j С целью получения фермента в больших количествах для дальнейших исследований идентифицированный путем секвеннровання ген dnk, кодирующий дНМФ-киназу бактериофага Т5, был клонирован в плазм иду рЕТЗа по сайтам- Ndel-BamHl, Индукцию синтеза белка рекомбинантной плазм идой pdnkT5 осуществляли в клетках штамма E.coli BL21(DE3) при помощи ИПТГ, а также в клетках штамма E.coli Х129, содержащих вспомогательную нлазмиду pGPl-2, путем прогревания клеток при 42°С. На рисунке 4 показана динамика накопления фермента в клетках. Фермент в обоих случаях находился в клетке в растворимой форме,- Несмотря на некоторую токсичность продукта для Ecoli, уровень синтеза белка составлял в среднем 18% активного фермента по отношению к тотальному белку.

1 23 4 5 6 7 89

Рис. 4. Динамика накопления дНМФ-киназы бдктериофгиа Т5 а клеткач штамма-продуненп при индукции I мМ ИПТГ.

I • клетки до индукции, 2-8 - клетки через I, 1,5, 2, 2,5, 3, 4 и 5 часов после нкцукнии, ссютвеплвснно 9 - чзрксри молекулярной массы (94,66, 45,30,20,1,14,2 кДа).

3.2. Очистка и свойства ре комбинат-ной дЦМФ:#нназм бактериофага Т5

Рекомбинантная дНМФ-кииаза была очищена до гомогенности из клеток Е.соИ ВЬ21(ОЕЗ), содержащих плазмиду рсЗпкТ5, с использованием двух альтернативных подходов (рис. 5). Первый подход включал в качестве основного этапа ионообменную хроматографию на Мопор, второй - аффинную хроматографию на Тоуореаг1 ЛР-й.ес], Оба способа очистки дали хорошие результаты и высокий выход (63-65%) (табл. 4). Белок был очищен в 5,34 раза, при этом из 67 мг общего белка было получено 8 мг гомогенного фермента. Рекомбинангная дНМФ-киназа имела удельную активность и специфичность, идентичную таковым нативного фермента (см. табл. 2). Таким образом, было показзно генетически, что все четыре активности принадлежат одному белку.

1 о з 45 67 89 Гис. 5. Гель-электрофорез фракций

~ рекочбннлнтной дНМФ-кинмн

—____бактериофага Т5 после рагличныч стадий

— ¿3 t» «ei — ОЧНСШ1,

w S 9 T~* г** — 1,9 - маркеры молекулярной массы, 2 -

tÜ Нз '"t*1 экстракт инфицированных

** S « м ert бактериофагом T5 клеток К coli. 3 -

W £3 ™ '* ' экстракт клеток E. coli BL21(DH3),

w ¿Tj ■■■< Г ■ -M« — содержащих пла»«кду pdtikTJ, 4 -

CT г ^^ пропускание через коленку с Toyopearl

лтл •>—• ^ 650м, 5 - осаждение сульфатом

— „ аммония, 6 - ионообменная

хроматограф«», 7 - аффинная

<н» S5 ч-' ■ ** хрочаклрафи», 8 - гочо1енная дНМФ-

— " • ■ киназа, очищенная in инфицированные

клеток.

Таблица 4. Очистка рекомбинантноП дНМФ-киназы бактериофага Т5. Стадии, обозначенные звездочкой, представляют собой два альтернативных подхода. Активность фермента измеряли с дГМФ в качестве субстрата.

стадии очисти 5 st ü •8 ü i 5 S j 5 i i fí Ш O H t> g S.ÍL 8 M 1 P r* x d 5 с F 81 в" á v 2 «

грубый экстракт 18 3,75 109 29 1,00 100,0

пропускание через Toyopearl 65 ОМ 36 1,50 54 36 1,24 99,0

оезждение сульфатом аммония 32 1,50 60 40 1,38 98,0

а)ионообменная хроматография * 4,2 1,0 155 155 5,35 66,4

б) аЭДинная хроматография * 5,0 0,8 124 155 5,35 63,2

3.3. Анализ поте hi шальной структуры фермента

Кристаллическая структура более специфичной к субстрату дНМФ-кнназы бактериофага Т4 была получена с разрешением в 2,0 A (Teplyakov et al., 1993). Как и все нуклеозндмонофосфаткиназы, белок состоит из 3 доменов - основного, или CORE, НМФ-связывающего и LlD-домсна. Пространственное наложение аминокислотной последовательности киназы бактериофага Т5 на структуру киназы фага Т4 профаммой Cn3D Viewer показало сходство обоих белков в области АТФ-свяшваюшего сайта (Ф-петли), домена LID, а также дНМФ-связывающего кармана, включающего структуры основного домена м альфа-сшграль дНМФ-связывающсго домена, образованную аминокислотами 131-149. Отметим, что характерная для Ф-петли дНМФ-киназы бактериофага Т4 аспарагиновая кислота в положении 15, следующая за консервативным лизином Ф-петли, свойственна также белку Т5, и обобщенную структуру Ф-петли фаговых киназ можно представить как GxxxSGKD.

Можно заключить, что оба фермента имеют определенное сходство в строении активных центров, объясняемое их широкой специфичностью к субстрату. Отличия в поверхностных структурах белковой глобулы дНМФ-киназы бактериофага Т4 по сравнению с дНМФ-киназой фага Т5 могут быть обусловлены различным зарядом мал скул, разной субъединичной структурой (киназа фага Т4 является димером), а также взаимодействием этого фермента с другими белками, входящими в состав дНТФ-сиктезирующе го комплекса бактериофага Т4.

ЗА Ферментативный синтез лезоксирибоалс! mi wi-ct-т но три фосфата СдДТФоЯ)

Нуклсозид-а-тнофифосфаты применяются в молекулярной биологии как субстраты для получения фосфотноатных аналогов нуклеиновых кислот, защищенных от воздействия нуклеаз, а также для ссквеннрования и сайт-направленного мутагенеза (Eckstein, 19S5). Альтернативный химическому синтезу путь получения лНТФаБ заключается и использовании ферментативного фосфорнлирования. Основным преимуществом этого пути является возможность синтеза только одного, природного (Sp, или экзо), днасгерсомера дИТФаЯ.

Нами была исследована принципиальная возможность фосфорнлирования Sp-Rp смеси химически синтезиронанных тиофосфатов при помощи рекомбинантпой дНМФ-киназы бактериофага Т5. Для этого был получен иммобилизованный ферментный препарат (ИФП) на основе рекомбинантного фермента и проверена его способности к синтезу лезо ксир ибо ну клеозид-и-т по три фосфата аденозина in дАМФа5 по сравнению с синтезом дАТФ из дАМФ в одних и тех же условиях. Вторая стадия фосфорнлирования осуществлялась нес не пифической бактериальной нуклеозиддифосфокинаюй, содержащейся в ИФП.

Было показано, что дНМФ-киназа бактериофага Т5 фосфорилирует дАМФа5, но с меньшей скоростью, чем дАМФ. В случае контрольного ИФП (клетки Ecoli) синтеза трифосфата не наблюдалось. Полнота превращения модифицирован но го нуклеотида в трифосфат составила около 50%. Очевидно, в реакцию вступает только один из смеси диастереомеров модифицированного нуклеопша. Полученные результаты показывают, что дНМФ-киназу бактериофага Т5 можно рассматривать как потенШ1альныЙ нпструмснг для синтеза in vitro модифицированных нукпеотидов, многие из которых являются противоопухолевыми агентами.

4. Шнрокосиеиифичныс дНМФ-киназы других бактериофагов

4.1. Ген 52 бактериофага уСЗ! колирует лНМФ-киназу

С целью поиска новых шнрокоснсцлфнчиых моиофосфаткииаз был исследован продукт гена 52 бактериофага стрептоминетов фС31, проявляющий значительною гомологию с геном дНМФ-киназы бактериофага Т4 (Smith et al„ 1992). Для этого ген 52 бактериофага фСЗ 1 клонировали по сайгам Ncol-ВатШ в плазм иду рЕТ15Ь. В результате экспрессии гена 52 имел место синтез белка с ожидаемой молекулярной массой (рис. 6). Анализ клеточного экстракта показал, что продуцируемый в больших количествах белок находится в основном в телах включения. Однако, при измерении активности кипам в осветленных клеточных экстрактах было обнаружено, что уровень этого фермента превышает активность клеточных дНМФ-кшш в сотни раз. Таким образом, было показано, что ген 52 бактериофага <рСЗ I действительно кодирует дНМФ-кшшу.

1 2 цЦ-

»И Рис. б. Гель-элск"троформ «В рекомбинантноВ дНМФ-■ИШ пиши бактериофага 5» фСЛ. — ] - маркеры молекулярной массы,2-экстрактклеток штамма-продуш! гга после индукции

ш

Таблица 5. Соотношение активностей

§екомбннантных дНМФ-кнназ

актериофагов <рС31 и Т5. За 100% принимали активность ферментов с дТМФ.

субстрат активность. Е/мл аиивность, %

|?С31 TS <рС31 Т5

ТМФ зд 32,2 100 100

дГМФ 3.5 36,2 110 112

дАМФ 2.6 48J 81 150

дЦМФ 1.4 18,2 44 57

Рекомбинантный <}>ермент проявлял активность на всех четырех канонических дезо ксирибону клеозидмонофос фатах, оказавшись, таким образом, второй дНМФ-киназоЙ, обладающей столь широкой специфичностью к субстрату. При этом соотношение активностей дНМФ-киназы *рС31 на разных субстратах отличалось от такового дНМФ-киназы бактериофага Т5 (табл. 5). Тот факт, что фермент удалось получить лишь в телах включения, можно обьясшггь токсичностью дНМФ-киназы для Е,соН, связанной с нарушением оптимальных для функционирования клетки соотношений дНТФ.

Анализ аминокислотной и потенциальной пространственной структуры киназ бактериофагов Т4, Т5 и <рСЗ 1 показал, что эволюционно эти ферменты более близки друг к другу, чем к соответствующим ферментам бактерий-хозяев. Видимо, высокая потребность в дНТФ явилась движущей силой, которая обеспечила конвергентную эволюцию этих широкоспецифичных фаговых белков.

выводы

1. Дезо кс npi 1бону клеозндм о н офосфатк и i ша (дНМФ-кшша) бактериофага Т5 (КФ 2.7.4.13) впервые очищена до гомогенного состояния из клеток Kcoli, инфицированных бактериофагом Т5, с выходом 55,6% и степенью очистки 1190.

2. Изучены физико-химические и каталитические свойства дНМФ-кпначы бактериофага Т5. Молекулярная масса белка составляет 29,14 ± 3,03 кДа, оптимум рН работы фермента лежит в области 7,0—7,5. Определены удельная активность фермента к 20 аминокислот N-конца белка.

3. Установлена первичная структура фрагмента ранней области С генома бактериофага Т5 длиной 7736 п.н., содержащая кодирующий дНМФ-киназу ген Jnk. В секвеннровэнном непрерывном фрагменте обнаружены 16 открытых рамок считывания, ц том числе гены холииа, лизоиима, тиоредоксина, нротеннфосфатазы,

4. Ген cink, кодирующий дНМФ-киназу, клонирован в E.coIi и экс пресс ирован. Гекомбинантный белок очищен до гомогенного состояния двумя альтернативными способами. На основе имеющихся данных об ам и по кислот пой последовательности сделаны предположения о пространственной структуре белка.

5. Показана практическая возможность использования иммобилизованного препарата дНМФ-киназы бактериофага Т5 в технологии синтеза четырех канонических дезокенрибонуклеозидмо но фосфатов, а также дАМФаБ.

6. Установлено, что ген 52 бактериофага ^СЗ1 стреитомипетов кодирует дНМФ-киназу широкой специфичности, катализирующую фосфорилирование дЛМФ, дТМФ, дЦМФ и дГМФ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Galina V. Mikoulinskaia, Sergei [. Gubanov, Andrei A. Zimin, Igor V. Kolesnikov, Sergei A. Fcofanov, and Analolii I, Miroshnikov. Purification and characterization of the dcoxynuclcostdc monophosphate kinase of bacteriophage T5. Protein expression and purification, 2003,27, 195-201.

2. Антонов К,В., Есппов Р.С., Гуревич А.И., Чувиковский Д.В., Микулинская Г.В., Феофанов С.А., Мирошников А.Н. Химический и химико-ферментативный синтез а-т потри фосфатов нуклеозидов. Биоорганическая химия, 2003,6:616-622.

3. Galina V. Mikoulinskaia, Andrei A. Zimin, Sergei A. Feofanov, and Anatolii I. Miroshnikov. Identification, cloning and expression of bacteriophage T5 dnk gene encoding a broad specificity deoxyribonuclcoside monophosphate kinase (EC 2.7.4.13), Protein expression and purification, 2004,33,166-175,

4. M и кул »некая Г.В., Губанов СЛ., Шульга-Морской C.B., Зимин Л.Л., Веревкина К.Н., Пятков К. И., Феофаноо С. Л. Дезокс! ipi I боиуклеозидмонофосфатмгназы бактериофагов. IV Путинская конференция молодых ученых, Пушнно, 1999, с. 26-27.

5. Микулннская Г, В., Губанов С.И., Веревки на К.Н., Феофанов С.А., Новожилова Ю.К., Зимин Л.Л. Цитозиiсодержащие бактериофаги Т4-лша. Международная конференция "Проблемы современной микробиологии и биотехнологии", Ташкент, 27-29 октября, 1999, с. 43-44.

6. Микулннская Г.В., Губанов С.И., Зимин А.А., Колесников И.В., Феофанов С.А., Мирошннков А.Н. дНМФ-киназа бактериофага Т5; полупение гомогенного фермента и изучение его физико-химических свойств. "Биология - наука XXI века", Пушино, 2001, с. 39.

7. Микулннская Г.В., Зимин А.Л., Феофанов С.А., Мирошников Л.И. Ранняя область генома бактериофага Т5: структурные исследования. "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", 24-26 октября, Пушино, 2001, с. 81-82.

8. Микулннская Г.В., Зимин А.А., Феофанов С.А., Мирошников А. И. Структурно-функциональное исследование фрагмента раннеП области генома бактериофага Т5, V чтения, »освященные памяти академика Ю.А.Овчинникова,22-23 ноября, Пушнно,2001,с. II.

9. Микулннская Г.В., Зимин А.Л., Феофанов С.А., Мирошников А.И. Кластер С ранней области генома бактериофага Т5: структурное исследование, клонирование и экспрессия генов. Международная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 2002, с. 52.

10. Микулннская Г.В., Зимин А.А., Феофанов С.А., Мирошников А.И. Кодируемые бактериофагами дНМФ-кнназы: идентификация новых ферментов, клонирование генов и исследование свойств. VI Путинская школа-конференция молодых ученых, 20-24 мая, Пушино, 2002, с. 281.

11.Микулннская Г.В., Зимин А,А., Феофанов С.А., Мирошников А.И. Структурно-функциональное и эволюционное изучение дНМФ-киназ бактериофагов. VI * (тени я, посвященные памяти академика Ю.А.Овчинникова, 25 ноября-2 декабря, Москва-Пушино, 2002, с. 91-92.

Принято к исполнению 21/01/2004 Исполнено 22/01/2004

Заказ № 18 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)318-40-68 * ' www.autoreferat.ni