Депо-управляемый вход кальция в клеточной модели болезни Хантингтона

Вигонт, Владимир Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Депо-управляемый вход кальция в клеточной модели болезни Хантингтона
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Депо-управляемый вход кальция в клеточной модели болезни Хантингтона"

На правах рукописи

005048265

вигопт

Владимир Александрович

ДЕПО-УПРАВЛЯЕМЫЙ ВХОД КАЛЬЦИЯ В КЛЕТОЧНОЙ МОДЕЛИ БОЛЕЗНИ ХАНТИНГТОНА

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

і о янв т

Санкт-Петербург 2012

005048265

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии Российской академии наук, Санкт-Петербург

Научный руководитель: доктор биологических наук

Елена Валентиновна Казначссиа Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Ирина Владимировна Гужова Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

кандидат биологических наук Константин Викторович Большаков Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург

Ведущая организация: Институт физиологии им. И.П.Павлова

РАН, Санкт-Петербург

Защита состоится «25» января 2013 года в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.230.01 на базе Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4

С*

Сайт института: www.cytspb.rssi.ru

Адрес электронной почты института: іч'!)Ьіо'(/іпсг:^.ги

Факс института (812) 297-03-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН Реферат разослан « » декабря 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

'{уЛ^и^* Е.В. Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Взаимодействие клеток и передача физиологически важных сигналов от плазматической мембраны клетки к ее органеллам происходит путем активации многочисленных специфических рецепторов, локализованных в плазматической мембране. При активации одного из наиболее распространенных сигнальных каскадов, а именно фосфатидилинозитолыюго (1Рз-каскад), наблюдается временное повышение концентрации свободных ионов кальция в цитозоле. Ионы кальция, в свою очередь, являются одним из универсальных вторичных посредников для передачи сигнала внутри клетки.

В состоянии покоя концентрация кальция в цитозоле поддерживается на очень низком уровне, порядка 10"7 M (Parekh et al., 2005). Столь низкая концентрация достигается за счет функционирования АТРаз, выкачивающих кальций из цитозоля в депо и во внеклеточное пространство, а также Na+/Ca2+ и Са2'/Н' обменников (Cafaroli et al., 2000; Болдырев и др, 2006). При различных видах стимуляции концентрация ионов кальция в цитозоле может увеличиваться примерно на порядок, достигая микромолярных значений (Ткачук, 2001). Основными путями повышения концентрации цитозольного кальция являются выброс кальция из внутриклеточных депо и вход кальция через каналы плазматической мембраны.

Один из наиболее общих типов притока кальция из внеклеточной среды -депо-управляемый кальциевый вход. Для его активации необходимо понижение концентрации кальция во внутриклеточных депо. Доминирующей гипотезой передачи сигнала от опустошенного депо к каналам плазматической мембраны является гипотеза конформациошгого сопряжения, предполагающая прямое взаимодействие между белками эндоплазматического ретикулума (ЭР) и белками плазматической мембраны (ПМ) (Parekh et al., 2005; Wang et al., 2009). Основные белки, принимающие участие в дспо-управляемом кальциевом ответе,- локализованные в мембранах ЭР белки STIM (кальциевые сенсоры ЭР) и IP3R (отвечает за выброс кальция из депо), а также белки ПМ, формирующие ионные поры каналов, а именно белки семейств TRPC и Orai (Wang et al., 2009; Hasan et al., 2010; Manjarres et al., 2010; Gruszczynska-Biegala et al., 2011). Наличие депо-управляемого кальциевого входа показано как для электроневозбудимых клеток (Poggioli et al., 1982), так и для нейронов (Bouron et al., 2005).

Нарушения в работе кальциевых ионных каналов связаны с множеством различных заболеваний и патологий, таких, например, как диабет (Graham et al., 2012) или латеральный амиотрофический склероз (Pieri et al., 2012).

Болезнь Хантингтона (БХ) является аутосомно-доминантным нейродегенеративным заболеванием, вызываемым увеличением числа глугамин-кодирующих повторов в первом экзоне гена белка хантингтина. В норме длина полиглутаминового тракта не должна превышать 35 остатков глутамина, в то время как при заболевании наблюдаются тракты длиной до 90 и более глутаминов (Vonsattel et al., 1985). В первую очередь при болезни Хантингтона поражаются срединные шипиковые нейроны стриатума. Тем не менее, связь между экспрессией мутантного хантингтина и процессами дегенерации нейронов до сих пор остается неясной.

Одной из токсических функций мутантного хантингтина является дестабилизация кальциевой сигнализации. Ранее показано, что мутантный хантингтин способен напрямую связываться с С-концом IP3RI. Такое связывание увеличивает аффинность IP3RI к своему лиганду, что может приводить к опустошению внутриклеточных кальциевых депо в ответ на базальные концентрации IP3 в цитозоле (Tang et al., 2003). Показано также, что экспрессия мутантного хантингтина вызывает усиление функции NR2B-содержащего рецептора NMDA (Zeron et al., 2002) и воздействует на потенциал-зависимые кальциевые каналы (VGCC) (Kaltenbach et al., 2007). Все вышеперечисленные пути ведут к повышению концентрации ионов кальция в цитозоле, что ведет к аномальному накоплению кальция в митохондриях (Bossy-Wetzel et al., 2008; Panov et al., 2002), активации кальпаинов (Vosler et al., 2008), патологическому запуску кальций-зависимых сигнальных путей, апоптотической активности и дегенерации нейронов стриатума.

Одним из механизмов повышения концентрации свободных ионов кальция в нейронах является вход кальция через депо-управляемые каналы ПМ (Bouron et al., 2005). Поскольку увеличение аффинности IP3RI к IP3 напрямую влияет на заполненность внутриклеточных кальциевых депо, логично предположить, что депо-управляемый вход кальция вовлечен в патогенез БХ. Тем не менее, до сих пор не было показано, как экспрессия мутантного хантингтина влияет на депо-управляемый кальциевый вход.

Цели н задачи исследования

Цель настоящей работы заключалась в исследовании влияния экспрессии мутантного хантингтина на депо-управляемый вход кальция в клетках нейробластомы человека SK-N-SH и в клетках первичной культуры нейронов стриатума мыши MSN. Были поставлены следующие задачи:

1. Определить влияние экспрессии мутантного белка хантингтина с длиной полиглутаминового тракта 138 остатков глутамина (Httl38Q) на уровень депо-управляемого входа кальция в клетки SK-N-SH.

2. Определить влияние экспрессии N-концевого фрагмента белка хантингтина, содержащего полиглутаминовый тракт длиной 138 остатков глутамина (Httl38Q-lexon), на уровень депо-управляемого входа кальция в клетки MSN.

3. Исследовать действие па депо-управляемый вход кальция в клетках SK-N-SH соединения EVP4593 (ингибитор активации NF-кВ сигнального пути).

4. Исследовать действие соединения EVP4593 на депо-управляемый вход кальция в клетках MSN.

5. Выяснить, какие белки ответственны за вход кальция по депо-управляемому механизму в клетках SK-N-SH.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В клеточных моделях болезни Хантингтона: в клетках нейробластомы человека (SK-N-SH) и шипнковых нейронов стриатума мыши (MSN), наблюдается аномально-большой депо-управляемый вход кальция.

2. Соединение EVP4593 способно снижать амплитуду депо-управляемых кальциевых токов в клетках SK-N-SH и MSN.

3. В клетках SK-N-SH за депо-управляемый вход кальция отвечают, в основном, каналы, содержащие белок TRPC1 как субъединицу канала и нуждающиеся в присутствии сенсора кальция в ЭР, белка STIM1.

Научная новизна исследования

В настоящей работе впервые продемонстрировано влияние экспрессии мутантного хантингтина на уровень депо-управляемого входа кальция в клетках SK-N-SH и MSN. Показано наличие аномально большого депо-управляемого входа кальция в клетках SK-N-SH и MSN, моделирующих БХ. Впервые показана способность соединения EVP4593 влиять на депо-управляемый вход кальция в указанных типах клеток. Показано также, что депо-управляемый вход кальция в клетки SK-N-SH Httl38Q опосредуется, в основном, каналами, содержащими белок TRPC1 и требующими присутствия сенсора кальция в ЭР, белка STIM1.

Теоретическое и практическое значение работы

По данным Всемирной организации здравоохранения в мире постоянно растет число людей, страдающих от различных нейродегенеративных заболеваний. Изучение большинства из них представляет немалую сложность, учитывая их спорадический характер и необходимость моделировать возрастные изменения. Именно поэтому во всем мире

уделяется большое внимание изучению молекулярных механизмов БХ, так как это заболевание является на 100% наследственным и достаточно легко моделируется. Расшифровка молекулярных причин БХ может дать толчок к развитию терапевтических подходов для лечения других нейродегенеративных заболеваний, как связанных, так и не связанных с полиглутаминовой экспансией.

Некоторые результаты настоящей работы позволяют надеяться на разработку лекарственного средства, которое можно будет использовать в терапии людей, страдающих от БХ и, возможно, других полиглутаминовых заболеваний.

Данное фундаментальное исследование вносит также вклад в общую картину кальциевой сигнализации, а именно в понимание организации и функционирования депо-управляемых кальциевых каналов.

Апробация работы

Основные положения работы доложены и обсуждены на «II Конференции молодых ученых Института цитологии РАН» (Санкт-Петербург, 2010); 14-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология—наука XXI века» (Пущино, 2010); Политехническом симпозиуме: «Молодые учёные - промышленности СевероЗападного региона», (Санкт-Петербург, 2010); «XXI Физиологическом съезде» (Калуга, 2010); 15-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология—наука XXI века» (Пущино, 2011); I Всероссийской конференции «Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет», (Санкт-Петербург, 2011); Конференции «Молекулярная и клеточная биология: прикладные аспекты», (Москва, 2012); «III Конференции молодых ученых Института цитологии РАН» (Санкт-Петербург, 2012); семинарах лаборатории ионных каналов клеточных мембран Института цитологии РАН.

По результатам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных журналах из перечня изданий, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 82 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы. Материал иллюстрирован 23 рисунками. Библиографический указатель содержит 160 источников.

Личный вклад автора Все экспериментальные процедуры и обработка результатов выполнены автором лично. Материалы, вошедшие в представленную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научным руководителем.

Финансовая поддержка работы

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки (ГК П332, ГК 14.740.11.0924), программы президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», Российского фонда фундаментальных исследований (гранты 11-04-12047, 10-04-01002, 10-04-00956), НШ-3796.2010.4, компании ОПТЭК (грант в поддержку молодых ученых), Правительства Санкт-Петербурга.

Материалы и методы

Клетки. Клетки нейробластомы человека SK-N-SH (любезно предоставлены лабораторией Б.А. Маргулиса, Институт цитологии РАН) культивировали в среде DMEM с добавлением 10% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота и антибиотика (80 мкг/мл гентамицина). За 1-2 сут. до начала эксперимента клетки высевали на фрагменты покровных стекол (3x3 мм). Для лучшей адгезии клеток стекла покрывали 0.01%-ным раствором полилизина.

Соединения EVP. EVP4593 (6-амино-4-(4-феноксифенетиламино)хиназолин) и EVP14808 (6-амино-4-(2-(3-пиридил)этиламино)хиназолин) описаны в опубликованных ранее работах (Tobe et al., 2003). Соединения EVP любезно предоставлены компанией «EnVivo Inc» (США).

Трансфекция и РНК интерференция. Мутантный хантингтин экспрессировали в клетках SK-N-SH с использованием конструкции на основе вектора cPI (Promega, США), содержащей Httl38Q (последовательность, кодирующая белок хантингтин с 138 остатками глутамина). Httl38Q встраивали в вектор cPI, обладающий устойчивостью к неомицину, по Xbal/EcoRl-сайтам. В контрольных экспериментах использовали плазмиду cPI, содержащую Httl5Q (последовательность, кодирующая нормальный хантингтин с 15 остатками глутамина). Трансфицированные клетки визуализировали при помощи котрансфекции с зеленым флуоресцентным белком (GFP) (соотношение Htt : GFP = 3:1). Котрансфекцию проводили с использованием трансфицирующего агента Унифектин56 (ИБХ, Москва).

В экспериментах с подавлением экспрессии TRPC1 (transient receptor potential canonical 1) использовали котрансфекцию клеток конструкцией для экспрессии хантингтина, плазмидой, несущей малую интерферирующую РНК (siRNA) против TRPC1 (pSHAG-lh

TRPC1 2219, любезно предоставлена Dr. L. Tsiokas, University of Oklahoma Health Science Center), и плазмидой, кодирующей GFP, в соотношении 3:3:2.

Для гиперэкспрессии TRPC1 в клетках SK-N-SH использовали котрансфекцию клеток геном Trpcl мыши в составе экспрессионного вектора pcDNA3 (конструкция любезно предоставлена Dr. S. Muallem, NIH, США) и плазмидой, кодирующей GFP, в соотношении 1 : 1.

В контрольных экспериментах использовали плазмиду с siRNA, не имеющей специфической мишени (контрольная siRNA, Sigma, США), и пустой экспрессионный (контрольный) вектор (Sigma, США).

Электрофорез и иммуноблотинг. Клетки выращивали в чашках Петри диаметром 50 мм. После трапсфекции клетки лизировали в буферном растворе следующего состава: 10 мМ трис-HCl pH 7.5, 150 мМ NaCl, 1%-ный тритон Х-100, 1%-ный NP40 (Nonidet Р40, неионный детергент нонилфенилполиэтиленгликоль), 2 мМ EDTA, 0.2 мМ PMSF (ингибитор сериновых протеаз, фенилметансульфонилфторид) с добавлением ингибиторов протеаз (PIC, Hoffmann-La Roche AG, Германия). Белки лизатов разделяли электрофоретически в 8%-ном полиакриламидном геле (для хантингтина в 6%-ном геле) в вертикальной камере и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Белки на иммуноблоте выявляли с использованием поликлональных антител против TRPC1 (Alomone labs, Израиль, в разведении 1 : 200) и моноклональных антител против хантингтина (Millipore, США, в разведении 1 : 1000). В качестве вторых антител брали антитела козы против константной части иммуноглобулинов кролика (1 : 30000) и антитела козы против константной части иммуноглобулинов мыши (1 : 30000). Белки на иммуноблотах выявляли с помощью субстрата Super Signal Chemiluminescent Substrate (Pierce, США). Эксперименты повторяли как минимум 3 раза, используя различные лизаты клеток. Для контроля равной загрузки дорожек использовали моноклональные антитела против а-тубулина в разведении 1 : 1000 (Sigma, США). Процентное содержание белка сравнивали с помощью стандартной программы сравнения интенсивности окрашивания сканированного иммуноблота.

Получение первичной культуры нейронов стриатума. Детенышей мышей первого дня жизни декапитировали. Стриатум выделяли в охлажденном (4°С) стерильном растворе для препарирования (на 1 литр: 3.9 г HEPES, 0.84 г NaHCCh, 100 мл 10Х HBSS, 5 мл раствора гентамицина 10 мг/мл, pH 7.4). Затем проводили центрифугирование (2 мин, 1000 g). Супернатант сливали. Для разделения нейронов к осадку добавляли растворы 0.1%-ного трипсина и 0.5%-ной ДНК-азы I. Разделенные нейроны рассеивали по чашкам

Петри с покровными стелами, обработанными 0,01%-пым поли-L-лизином. Состав среды: Neurobasal-A, 3%-ная FBS, 3%-ный В27, 0.6 мг/мл L-Gln.

Получение лентивируса и инфицирование нейронов. Шаттл-векторы, кодирующие N-концевые фрагменты белков Httl5Q-lexon (147 аминокислот) и Httl38Q-lexon (270 аминокислот), конъюгированные с НА-tag, HIV-1 вектор 8.9 и VSVG плазмиды покровных гликопротеинов для создания лентивирусов были предоставлены профессором И. Б. Безпрозванным (UT Southwestern Medical Center, США). Вирусы Lenti-Httl5Q-lexon и Lenti-Httl38Q-lexon созданы посредством котрансфекции шаттл-векторов с HIV-1 вектором 8.9 (Д8.9) и VSVG плазмид покровных гликопротеинов в пакующую клеточную линию НЕК293Т. После добавления раствора для трансфекции в среду чашки Петри с клетками инкубировали в термостате в течение 24 ч при температуре 37°С, а затем 72 часа при температуре 32°С. За это время упакованные вирусы выделялись клетками в среду. По истечению срока инкубации среда с вирусами была отфильтрована (0 0.45 мкм) и немедленно заморожена в жидком азоте. Хранение производилось при минус 80°С.

Для определения титра вируса использовался метод иммуноокрашивания с антителами к HA-tag. Долю инфицированных клеток от числа всех клеток на стекле определяли визуально с помощью микроскопа Pascal. В результате проверки эффективности инфицирования при измерении доли светящихся клеток выбиралось то соотношение среды с вирусом к среде культивирования, которое давало минимальную эффективность 90%.

Инфицирование нейронов проводили на 5-е сутки в культуре. К клеткам добавлялась культуральная среда с количеством лентивируса, дающим минимальную эффективность трансфекции 90%.

Электрофизиологические измерения. Ионные токи регистрировали с использованием метода локальной фиксации потенциала в условиях регистрации тока от целой клетки (Hamill, Sakmann, 1981). Измерения выполняли с помощью усилителя Axopatch 200В (Axon Instruments, США). Сопротивление микроэлектродов составляло 5-15 МОм. Последовательное сопротивление не компенсировали. Усиленный и предварительно отфильтрованный встроенным в усилитель двухполюсным фильтром Бесселя (частота среза 500 Гц) сигнал оцифровывали на частоте 5000 Гц с помощью платы АЦП L305 («L-Card», Россия). При записях интегральных токов клетки потенциал мембраны поддерживали при минус 40 мВ. Периодически (каждые 5 с) потенциал на мембране изменяли до минус 100 мВ (на 30 мс), а затем постепенно (с постоянной скоростью 1 мВ/мс) его величину изменяли до +100 мВ. Шаг измерения составлял 0.5 мВ. Записанные токи нормировали относительно

емкости клетки (10-30 пФ). Записи, полученные до активации исследуемых токов, использовали для вычитания тока утечки и тока через другие каналы. Данные на приведенных гистограммах представлены в виде средней величины ± среднеквадратичное отклонение.

Растворы. В измерениях тока целой клетки раствор регистрирующей пипетки содержал (в мМ): 135 СзС1, 10 ЕСТА-Св, 10 Нереэ-Сз, 4.5 СаС12, 1.5 М§С12, 4 №-АТР, 0.4 Каг-вТР (рСа7), рН 7.3. Внеклеточный раствор содержал (в мМ): 140 НМ1Х}-Азр, 10 ВаС12, 10 Нерев-Св, 0.01 тетродотоксина, 0.01 нифедипина, рН 7.3. Для активации депо-зависимых токов во внеклеточный раствор добавляли 1 мкМ тапсигаргина. ЕУР4593 и ЕУР14808 добавляли во внеклеточный раствор. Соединения подавали к объекту путем перфузии.

Результаты и обсуждение (1) В клетках нейробластомы человека SK-N-SH, моделирующих болезнь Хантингтона, наблюдается аномально-большой депо-унравляемый вход кальция

Чтобы смоделировать БХ в клетки нейробластомы человека SK-N-SH вводили конструкцию, кодирующую белок хантингтин с полиглутаминовым трактом из 138 остатков глутамина (Httl38Q). Контролем служили интактные клетки (Ctrl) и клетки, экспрессирующие хантингтин с полиглутаминовым трактом из 15 остатков глутамина (Httl5Q), что является нормой. Эффективность трансфекции была подтверждена иммуноблотом (рис. 1).

кД3 Control Htt 15Q Htt138Q 350 -

50 •

Хантингтин

а-тубулин

Рис. 1. Иммуноблот, показывающий экспрессию белка хантингтина в интактных клетках SK-N-SH (Control), в клетках, трансфицированных конструкцией для экспрессии Httl5Q, и в клетках, трансфицированных конструкцией для экспрессии Httl38Q.

На приведенном иммуноблоте видно, что выбранная линия клеток БК-М-ЗН экспрессирует эндогенный хантингтин с нормальной длиной полиглутаминового тракта. При введении в эти клетки конструкции для экспрессии Нй138(2 на иммуноблоте отчетливо видна вторая верхняя полоса, соответствующая экспрессии более тяжелой, мутантной формы

хантингтина. Нижняя полоса на иммуноблоте для клеток Httl38Q соответствует эндогенной экспрессии хантингтина с нормальным полиглутаминовым трактом (рис. 1).

Электрофизиологические опыты показали, что примерно у 80% интактных клеткок в ответ на пассивное опустошение депо, вызванное приложением 1 мкМ тапсигаргина, развивался входящий ток со средней амплитудой 0.5 пА/пФ при потенциале -80 мВ (рис. 2а-в). В клетках Httl5Q средняя амплитуда тока была практически такой же, как в интактных клетках (рис. 2а-«). В то же время, регистрация депо-управляемого входа ионов кальция в клетки Httl38Q, служащие моделью болезни Хантингтона, показала приблизительно 5-кратное увеличение тока по сравнению с контролем (рис. 2а-в).

Поскольку считается, что аппликация тапсигаргина ведет к пассивному опустошению депо и не влияет на другие клеточные сигнальные пути, зарегистрированный ток можно приписать работе депо-управляемых каналов. Таким образом, мы показали, что в клетках Httl38Q, моделирующих болезнь Хантингтона, наблюдается аномально большой депо-управляемый вход кальция (Глушанкова и др., 2010).

Нарушение кальциевой сигнализации в нейронах вовлечено в нейродегенеративные процессы. Различные эффекты экспрессии мутантного хантингтина дестабилизируют кальциевую сигнализацию так, что происходит накопление ионов кальция в цитозоле. Данное накопление происходит как за счет увеличения чувствительности IP3R к своему лиганду (Tang et al, 2003), в результате которого выброс из депо осуществляется в ответ на базальные концентрации 1Рз в цитозоле, так и за счет повышенного входа кальция из внеклеточной среды, например через рецептор NMDA. Такое повышение концентрации кальция в цитозоле создает дополнительную нагрузку на митохондрии, депонирующие излишки кальция. Когда митохондрия становится перегруженной кальцием, это может приводить к активации поры МРТ, выбросу в цитозоль кальция и факторов апоптоза и, соответственно, вести к клеточной гибели. Полученные нами результаты подтверждают факт, что мутантный хантингтин нарушает кальциевую сигнализацию в сторону увеличения концентрации ионов кальция в цитозоле. Нами показано, что пути аномального повышения цитозолыюго кальция в модели БХ не исчерпываются путями упомянутыми в обзоре литературы, но включают в себя еще и такой распространенный и важный путь притока кальция в клетку, как депо-управлясмый кальциевый вход. Аномально большой депо-управляемый вход кальция в клетки еще сильнее дестабилизирует депонирование кальция в клетке, что может приводить к активации МРТ поры митохондрий и вовлечению клеток в апоптоз. Таким образом, полученные нами данные могут свидетельствовать в пользу кальциевой гипотезы БХ.

пА/пФ

I ' I ' I ' i 'С

50 100 150 200

пА/пФ

1,5

1,0 0,5 -0,0 -0,5 -1.0 -1.5 -2,0 -2.5

■Ctrl Htt15Q Htt138Q

T-1—r~

Q -80 -40

пА/пФ

n=12

~1 1 I mB

40 80

n=8

«N

P-

Рис. 2. Влияние экспрессии белков HttlSQ и Httl38Q на дено-управляемый вход кальция в клетках SK-N-SII. а —

Развитие тока (отнесенного к емкости клетки), вызванное приложением 1 мкМ тапсигаргина в клетках SK-N-SH, экспрессирующих Httl5Q {белые

треугольники), Htt 13 8 Q (серые круги) и интактных SK-N-SH (Ctrl) (черные квадраты) при потенциале —80 мВ. Представлены данные трех

репрезентативных экспериментов, б — Средние вольт-амперные характеристики токов, полученных при пассивном опустошении депо тапсигаргином (1 мкМ), в клетках SK-N-SH, экспрессирующих Httl 5Q (светло-серая линия), Httl38Q (темно-серая линия) и интактных SK-N-SH (Ctrl) (черная линия) на стационарном уровне активности исследуемых токов. Количество экспериментов указано на панели (в), в — Стационарный уровень развития депо-управляемых токов при потенциале —80 мВ в ответ на подачу 1 мкМ тапсигаргина в клетках SK-N-SH, экспрессирующих Httl 5Q (без заливки), Httl38Q (черная заливка) и интактных SK-N-SH (Ctrl) (штриховка). Уровень достоверности при статистически отличающихся результатах составляет р < 0.05.

(2) В клетках первичиой культуры нейронов стриатума мыши, моделирующих болезнь Хантингтона, наблюдается аиомалыю-большой депо-управляемый вход кальция

Так как при БХ в первую очередь поражаются срединные шипиковые нейроны стриатума, представлялось важным получить данные о влиянии экспрессии мутантного хантингтипа на депо-управляемый кальциевый вход именно в клетках MSN и сравнить их с уже имеющимися данными, полученными на клетках SK-N-SH.

Необходимо отметить, что для моделирования заболевания на клетках MSN использовался не полноразмерный белок хантингтин, а продукт первого экзона гена белка хантингтина, с длинным полиглутаминовым трактом. Такое изменение модели было вызвано тем, что ген полноразмерного хантингтина оказался слишком велик для того, чтобы быть доставленным в клетки с помощью лентивирусной инфекции. А сама процедура заражения лентивирусом для доставки генетического материала в клетки была выбрана в связи с невозможностью трансфицирования нейрональной культуры стандартными методами.

Электрофизиологические опыты показали, что у интактных нейронов в ответ на пассивное опустошение депо тапсигаргином развивался входящий ток со средней амплитудой около 0.8 пА/пФ при потенциале -80 мВ (рис. За-в). В клетках Httl5Q-lexon средняя амплитуда тока была около 1 пА/пФ, что практически совпадает с ответом в интактных нейронах (рис. З а-в). В то же время регистрация депо-управляемого входа ионов кальция в нейроны, экспрессирующие Httl38Q-lexon, показала приблизительно 2-кратное увеличение тока по сравнению с контролем (рис. 3а-в).

Таким образом, в нейронах экспрессия фрагмента мутантного хантингтина также приводит к аномально высокому уровню входа кальция по депо-управляемому механизму.

пА/пФ Tg

0.0 -0,5 -1,0 ■ -1,5-2,0-

MSN Ctrl

-MSN Htt15Q-1exon - MSN Htt138Q-1exon

flu,

Щ?-

иже

Гп ЧА-

) 1 I 1 I ' I 1 I ' I

0 100150200250300350

пА/пФ

MSN Htt138Q-1exon MSN Htt15Q-1exon MSN Ctrl

пА/пФ в 2,52,01,54 1,0 0,5 0,0

n=15

n=7

Л1.

n=11

Рис. 3. Влияние экспрессии белков Httl5Q и HU138Q на депо-управляемый вход кальция а клетках MSN. а -Развитие тока (отнесенного к емкости клетки), вызванное приложением 1 мкМ гапсигаргина в клетках MSN, экспрессирующих Httl5Q-lexon (белые круги), Httl38Q-lexon (серые

треугольники) и интактных MSN (MSN Ctrl) (черные квадраты) при потенциале -80 мВ. Представлены данные трех репрезентативных экспериментов, б — Средние вольт-амперные характеристики токов, полученных при пассивном опустошении депо тапсигаргином (1 мкМ), в клетках MSN, экспрессирующих Httl5Q-lexon (светло-серая линия), Httl38Q-lexon (темно-серая линия) и интактных MSN (MSN Ctrl) (черная линия) на стационарном уровне активности исследуемых токов. Количество экспериментов указано на панели (в), в — Стационарный уровень развития депо-управляемых токов при потенциале -80 мВ в ответ на подачу 1 мкМ тапсигаргина в клетках MSN, экспрессирующих Httl5Q-lexon (без заливки), Httl38Q-lexon (серая заливка) и интактных MSN (MSN Ctrl) (черпая заливка). Уровень достоверности при статистически отличающихся результатах составляетр < 0.05.

(3) Соединение EVP4593 способно блокировать аномальный депо-управляемый вход кальция в клетках SK-N-SH Httl38Q и MSN IIttl38Q-lexon

В 2003 году Tobe и соавторы синтезировали структурные аналоги хиназолина (соединения EVP) и показали их способность ингибировать сигнальный путь NF-kB (Tobe et al., 2003). Считается, что сигнальный путь NF-кВ может играть непосредственную роль в патогенезе БХ. Действительно, гиперактивацию NF-кВ сигнального пути наблюдали в клетках РС12, трансфицированных конструкцией, кодирующей мутантный хантингтин (Khoshnan et al., 2004). Показано также, что различные соединения, оказывающие нейропротекторное действие на нейроны стриатума в модели острой эксайтотоксичности, снижают активность NF-кВ (Qin et al., 1998; Nakai et al., 2000). Поскольку для активации сигнального пути NF-кВ необходим депо-управляемый вход кальция (Stankunas et al., 1999; Okamura et al., 2001), было выдвинуто предположение, что EVP4593 может воздействовать на этот вход и таким образом снижать активность NF-кВ (Choi et al., 2006).

В нашей совместной работе с лабораторией И.Б. Безпрозванного (Dallas, США) и компанией Envivo Pharmaceuticals (Watertown, США) соединение EVP4593 было идентифицировано как агент, оказывающий положительное влияние на Drosophila melanogaster, моделирующих БХ, в тестах на моторику, а соединение EVP14808 не оказывало никакого эффекта и, таким образом, может использоваться в качестве негативного контроля (Wu, Shih, Vigont et al., 2011).

Итак, следующей задачей стало исследование влияния EVP4593 и его неактивного аналога EVP14808 на депо-управляемый вход кальция в клетках, экспрессирующих Httl38Q. Результаты электрофизиологических экспериментов, проведенных на клетках SK-N-SH, показали, что добавление 300 нМ EVP4593 приводит к выраженному уменьшению амплитуды (примерно на 60%) депо-управляемых токов, вызванных аппликацией 1 мкМ тапсигаргина в клетках HU138Q (рис. 4а-«). Следует подчеркнуть обратимость этого уменьшения: при отмывке EVP4593 восстанавливалась активность депо-управляемых каналов (рис. 4а). В то же время, добавление неактивного EVP14808 не оказывало статистически значимого влияния на токи в клетках Httl38Q (рис. 4а-в). Тапсигаргин и EVP растворимы в DMSO, поэтому, чтобы исключить влияние растворителя, были поставлены контрольные опыты. В них использовали клетки Httl38Q, в которых ток вызывали с помощью тапсигаргина, а затем добавляли внеклеточный раствор с тапсигаргином, содержащий DMSO в такой же концентрации, как и в опытах с EVP. Никаких эффектов, связанных с влиянием DMSO, не наблюдали (рис. 4а-е). Таким образом, можно заключить, что EVP4593 специфично блокировал аномальный депо-управляемый кальциевый вход в клетках Httl38Q.

ЕУР4593

-ншзво+ието

~Н«Ша+Е\'Р45ЭЗ

-НЮЗ«>Е\/Р14808

ПА/ПФ ОМЗО, ЕУР14808

а о,о-

-0.5 ■ -1.0 • -1,5 • -2.0 ■ -2,5 --3,0 -3,5

I ' I ''"' I ' I 1 с 0100 200 300 400

пА/пФ б 2

-НМ380*0М80

—~НШ330*ЕУР4593 • .........«0390+14809

0-1 -2 -3 ■

1 1 , ..1 А

: / 1 ' 1 • 1 1 1 1

-80 -40 0 40 80

, пА/пФ

# / ^

/ / л4

Рис. 4. Влияние соединений ЕУР на депо-управляемые токи в клетках НШ38<3. а -

Развитие тока (отнесенного к емкости клеток), вызванное приложением 1 мкМ тапсигаргина в клетках НИ 13 8(2 при потенциале -80 мВ при добавлении во внешний раствор 0.3% ОМЭО (тшвошмво) (черные квадраты), 300 нМ ЕУР14808 (НИ138О+-ЕУР14808) (белые треугольники), 300 нМ ЕУР4593 (ШШ8<2+ЕУР4593) (серые круги). Время добавления во внешний раствор ЕУР4593, ЕУР 14808 и ОМЗО показано линиями над графиком. Представлены данные трех репрезентативных экспериментов. 6 - Средние вольт-амперные характеристики токов, полученных при пассивном опустошении депо тапсигаргином (1 мкМ), в клетках Нй138С> на стационарном уровне развития токов при добавлении во внешний раствор 0.3% ОМЗО (НН1380+ОМ8О) (черпая линия), 300 нМ ЕУР14808 (НИ138О+ЕУР14808) {светло-серая линия), 300 нМ ЕУР4593 (Н«138(2+ЕУР4593) (темно-серая пиния). Количество экспериментов указано на панели (е). в — Стационарный уровень развития депо-управляемых токов при потенциале -80 мВ в ответ на подачу 1 мкМ тапсигаргина в клетках Нй1380 при добавлении во внешний раствор 0.3% ЭМБО (НИ1380+БМ8О) (черная заливка), 300 нМ ЕУР 14808 (Нй138О+ЕУР14808) (штриховка), 300 нМ ЕУР4593 (НШ380+ЕУР4593) (без заливки). Уровень достоверности при статистически

отличающихся результатах составляет р < 0.05.

Далее были проведены эксперименты, показывающие, как соединение EVP4593 влияет на депо-управляемый вход кальция в клетках MSN. Результаты электрофизиологических экспериментов показали, что добавление 300 нМ EVP4593 слабо влияло на уровень депо-управляемых токов в нейронах, однако повышение концентрации до 3 мкМ привело к выраженному уменьшению амплитуды (примерно на 60%) депо-управляемых токов, вызванных аппликацией 1 мкМ тапсигаргина в клетках MSN Httl38Q-lexon (рис. 5). Причем получившаяся амплитуда стала сравнимой с амплитудой депо-управляемых токов в контрольных нейронах (рис. 5).

пА/пФ 2.5-, п=11

Рис. 5. Влияние соединения EVP4593 на депо-управляемые токи в клетках MSN Httl38Q-lexon. Стационарный уровень развития депо-управляемых токов при потенциале —80 мВ в ответ на подачу 1 мкМ тапсигаргина в клетках MSN Httl38Q-lexon (черная заливка), в клетках MSN Httl38Q-lexon при добавлении во внешний раствор 3 мкМ EVP4593 (без заливки), в интактных клетках MSN (серая заливка) Уровень достоверности при статистически отличающихся результатах составляетр < 0.05.

Исходя из того, что EVP4593 снижает тапсигаргин-индуцируемые токи как в клетках нейробластомы человека, экспрессирующих мутантный HU138Q, так и в интактных клетках SK-N-SH, а также в клетках первичной культуры нейронов стриатума мыши, можно предположить, что EVP4593 является новым ингибитором депо-управляемого кальциевого входа. Если эти данные будут подтверждены на других типах клеток, соединение EVP4593 может стать новым инструментом в изучении кальциевой сигнализации.

Необходимо отметить, что обнаруженное нами обратимое ингибирование аномально большого депо-управляемого входа кальция в клетки открывает перспективы в использовании EVP4593 для создания лекарственного препарата, оказывающего терапевтический эффект на людей, страдающих от БХ. Было также показано в наших совместных работах с лабораторией И.Б. Безпрозванного нейропротекторное действие EVP4593 на культуру MSN, выделенных из модельных мышей УАС128 (Wu, Shih, Vigont et al., 2011).

(4) Белок TRPC1 входит в состав каналов, отвечающих за поддержание депо-управляемого входа кальция в клетках SK-N-SII Httl38Q

Молекулярная структура каналов, ответственных за депо-управляемый кальциевый вход, относительно слабо изучена в нервных клетках, однако в качестве потенциальных участников этого входа выделяют белки семейства TRPC и Orail (Berna-Erro et al., 2009; Hasan et al., 2010; Gruszczynska-Biegala et al., 2011). Для каналов, образованных Orail, характерны высокий потенциал реверсии и входящее выпрямление, в то время как каналы TRPC обычно относительно неселекггивны (Clapham et al., 2002). Полученные вольт-амперные характеристики (рис. 26), позволяют предположить, что в поддержании депо-управляемого входа кальция в клетках Httl 38Q важную роль играет белок TRPC1.

Белок TRPC1 относится к белкам семейства TRPC, представители которого содержат шесть трансмембранных доменов и могут гомо- или гетероолигомеризоваться с формированием ионной поры канала. Показано, что TRPC1 может принимать участие в депо-зависимом входе кальция в клетках различного типа (Wu et al., 2000; Ambudkar et al., 2007; Salido et al., 2009). Показано также, что TRPC1 экспрессируется в клетках нервной системы (Riccio et al., 2002). Ранее обсуждалась потенциальная значимость белков семейства TRPC в таких нейродегенеративных заболеваниях, как болезни Альцгеймера и Паркинсона (Yamamoto et al., 2007; Selvaraj et al., 2010). В частности, показано участие TRPC 1-каналов в эксайтотоксической гибели нейронов гиппокампа (Narayanan et al., 2008).

Следующим этапом работы стало определение роли каналообразующего белка TRPC1 в аномально большом депо-управляемом кальциевом ответе в клетках Httl38Q.

С помощью siRNA была подавлена экспрессия белка TRPC1 в клетках Httl38Q примерно на 70%. Эндогенная экспрессия TRPC1 в линии клеток SK-N-SH и эффективность супрессии подтверждена с помощью иммуноблота (рис. 6).

75 -

SO -

50 -

нгизао

SviRNA

кДа Control HII1380 TRFC'I

- TRPC1

i»-7yt>yruiM

Рис. 6. Иммуноблот, показывающий уровень экспрессии белка TRPC1 в

контрольных клетках SK-N-SH (Control); в клетках Httl38Q и в клетках Httl38Q, экспрессирующих плазмиду, несущую siRNA против TRPCl (Httl38Q siRNA TRPCl).

Амплитуда тапсигаргин-индуцированных токов в клетках НШ38<3 с подавленной экспрессией ТНРС1 (НШ38С> TRPCl(-)) при потенциале -80 мВ составила примерно 0.8 пА/пФ и стала сравнима с амплитудой аналогичных токов в клетках БК-М-ЗН, несущих

контрольную эЖЛЧА, не имеющую специфичную мишень (СШ+сМ эШ^А) (рис. 7). В сравнении с токами, которые развиваются в клетках Ш138С), трансфицированных контрольной эЫША (НШ38<3+с1т1 311У\1А), амплитуда токов в клетках Нй138С) ТКРС1(-) снизилась примерно на 65%. (рис. 7). Это позволяет сделать вывод, что каналы, имеющие в своем составе субъединицу ТЯРС1, опосредуют аномальный депо-управляемый ответ в клетках Ш138(3 (Вигонт и др., 2012).

Рис. 7. Влияние супрессии ТИРС1 па депо-управляемые токи кальция в клетках 1Ш138(2. Стационарный уровень развития депо-управляемых токов при потенциале -80 мВ в ответ на подачу

1 мкМ тапсигаргина в клетках НШ38С), экспрессирующих контрольную бЦША

(Ши380+сй-1 в11ША) {черная заливка), 511ША против ТЯРС1 (11111380 Т1*РС1(-)) (штриховка), 31КЫА против ТИРС! при добавлении во внешний раствор 300 нМ ЕУР4593 (Н«138(3 ТЯРС1(-)+ЕУР4593) (серая заливка), в контрольных клетках $К-1Ч-8Н, несущих контрольную з1БиЧА (СЫ+сЫ (без заливки). Уровень достоверности при статистически отличающихся результатах составляет р < 0.05.

ЕУР4593 также действовал на депо-управляемые токи в клетках Нй138<3 ТКРС1(-) (рис. 7), но степень ингибирования токов была значительно меньше, чем в клетках НШ38(2 без супрессии ТКРС1 (рис. 4в). Полученные данные позволяют говорить о том, что ЕУР4593 способен блокировать каналы, содержащие белок ТЯРС1 в качестве субъединицы, а также высказать предположение, что ТЯРС1 служит непосредственной молекулярной мишенью для ЕУР4593.

(5) ЕУР4593 не оказывает влияиие на депо-управляемый вход кальция в клетках вК-^вН с оверэкепреесией белка ТИРС I

Для того чтобы подтвердить или опровергнуть гипотезу о том, что белок ТИРС1 является непосредственной молекулярной мишенью для ЕУР4593, были взяты контрольные клетки ЗК-К-ЭН с оверэкспрессией ТИРСЛ. Если соединение ЕУР4593 воздействует на белок ТЯРС1 напрямую, оно должно блокировать гомоолигомерные каналы (состоящие только из субъединиц ТЯРС1), образующиеся в условиях оверэкспрессии белка ТЯРС1. Эффективность оверэкспрессии ТМ>С1 в клетках 8К-Ы-8Н была подтверждена с помощью иммуноблота (рис. 8).

Control ^ Control TRPC1{+) Рис. 8. Иммуноблот, показывающий уровень экспрессии TRPC1 в контрольных

75 —

50 — — TKI'Cl клетках SK-N-SH (Control) и в клетках SK-N-SH, несущих плазмиду для оверэкспрессии

— a-iyGv.niH белка TRPC1 (Control TRPC1(+)).

Депо-управляемые токи в клетках Ctrl TRPC1(+), индуцированные тапсигаргином, имели практически такую же амплитуду при потенциале -80 мВ (2.3 пА/пФ), как и токи в клетках Httl38Q (рис. 9а,б). Однако детальное сравнение этих токов показало значительное расхождение в вольт-амперных характеристиках, особенно заметное в области положительных потенциалов (рис. 9а). Напомним, что иммуноблот с антителами против TRPC1 также продемонстрировал, что в клетках IIttl38Q уровень экспрессии TRPC1 не выше, чем в интактных клетках SK-N-SH (рис. 6).

Эксперименты показали, что депо-управлямые токи в клетках Ctrl TRPC1(+) не блокируются EVP4593 в концентрации 300 нМ (рис. 96). Установлено, что увеличение концентрации EVP4593 в 10 и в 100 раз не влияло на гапсигаргин-индуцированные токи в клетках Ctrl TRPC1(+) (данные не представлены).

Из представленных результатов следует, что EVP4593 способен подавлять активность каналов, включающих TRPC1 как одну из субъединиц, но не гомоолигомерных каналов, состоящих исключительно из TRPC1. Таким образом, несмотря на то, что аномальный депо-управляемый ответ в клетках Httl38Q опосредуется каналами, содержащими TRPC1, сам белок TRPC1 не служит непосредственной молекулярной мишенью для EVP4593.

гА'пФ 3 2 1 О -1 -2 -3

с'/

~Г

-нгоаа * DMSO

-CtfiTRPCIM + DMSO

пА/яФ З.О-i 2.5 2,0 1,5 1.0 0.5 0.0

-80 -40 0 40 80

n=13

n=8

n=8 ^

Рис. 9. Влияние оверэкспрессии TRPC1 на дсгао-унравляемые токи кальция в клетках SK-N-SH. а — Средние вольт-амперные характеристики токов, полученных при пассивном опустошении депо тапсигаргином (1 мкМ) на стационарном уровне развития токов при добавлении во внешний раствор 0.3% DMSO в клетках Httl38Q (Httl38Q+DMSO) (черная линия), в клетках SK-N-SH, несущих плазмиду для оверэкспрессии TRPC1 (Ctrl TRPCl(+)+DMSO) (серая линия). Количество экспериментов указано на панели (б), б — Стационарный уровень развития депо-управляемых токов при потенциале -80 мВ в ответ на подачу 1 мкМ тапсигаргина при добавлении во внешний раствор 0.3% DMSO в клетках Httl38Q (Httl38Q+DMSO) (черная заливка), в клетках SK-N-SH, несущих плазмиду для оверэкспрессии TRPC1 (Ctrl TRPCl(+)+DMSO) (серая заливка). При добавлении во внешний раствор 300 нМ EVP4593 (Httl38Q+EVP4593) (без заливки), (Ctrl TRPCl(+)+EVP4593) (штриховка)-, Уровень достоверности при статистически отличающихся результатах составляет р < 0.05.

(6) Для активации дспо-унравлясмого входа кальция в клетках ШН38С> требуется присутствие белка вТШП

Следующей задачей пашей работы стало исследование роли белка 8Т1М1, являющегося кальциевым сенсором в люменальном пространстве ЭР (Ог1ас1ек й а1., 2007), в активации депо-управляемого входа в клетках БК^-ЭИ НЦ138С>. Для удобства исследования белок хантингтин со 138 остатками глутамина был заменен на его же ^концевой фрагмент, содержащий точно такой же длины полиглутаминовый тракт, а доставка экспрессионной конструкции стала осуществляться не с помощью трансфекции, а посредством заражения клеток лентивирусом, несущим нужную плазмиду.

Экспрессия ЗТ1М1 в клетках Ни138(3 была подавлена с помощью вгЕУЧА. Эффективность супрессии была подтверждена с помощью иммуноблота (рис. 10).

HttttBQ HII13SQ STIM1(-| Рис. 10. Иммуиоблот, показывающий уровень

6TW1 экспрессии 8Т1М1 в клетках 8К-Ы-5Н Ни1380-1ехоп

75кДа ЩщЙ (НМ1380) и в клетках 8К-К-8Н Н«1380-1ехоп,

экспрессирующих плазмиду, несущую з1КЫА против ЭТ1М1 (н«138д этшц-)).

50 кДа a-Tyb

Электрофизиологические эксперименты показали, что супрессия 8Т1М1 приводит к выраженному уменьшению амплитуды (примерно на 60%) тапсигаргин-индуцированных токов в клетках НШ38<2-1ехоп (рис. 11). Таким образом, можно сделать вывод, что белок 8Т1М1 является важным звеном в активации депо-управляемого ответа в клетках НИ138(3.

Рис. 11. Влияние супрессии 8Т1М1 па депо-управляемые токи кальция в клетках 1Ш138(2. Стационарный уровень развития депо-управляемых токов при потенциале -80 мВ в ответ на подачу 1 мкМ тапсигаргина в клетках НИ:138(2-1ехоп, экспрессирующих ОБР (Ни138<3-1ехоп) {черная заливка), экспрессирующих вРР и 31ЮЧА для супрессии 8Т1М1 (Ни138(2-1ехоп 8Т1М1(-)) (без запивки); Уровень достоверности при статистически отличающихся результатах составляет р < 0.05.

Более детальное рассмотрение депо-управляемых токов в клетках Ни138<3-1ехоп ЭТНУЩ-) показало, что эти токи можно условно разделить на два пула, различаемых по селективности (рис. 12). Полученные данные позволяют говорить о том, что в клетках НМ138(2 за депо-управляемый вход кальция отвечают, по меньшей мере, два различных типа каналов.

пА/пф 21 -0-1 -

-HS138Q

-HH138Q STIMH-) Low НИ1380 STIM1 (-) High

id...

Рис. 12. Средние вольт-амперные характеристики, полученные при пассивном опустошении депо 1 мкМ тапсигаргина на стационарном уровне развития токов в клетках Httl38Q-lexon, трансфицированных плазмидой для экспрессии контрольного белка GFP (Httl38Q) (черная линия), трансфицированных плазмидой для экспрессии контрольного белка GFP и siRNA, обеспечивающей супрессию STIM1: для токов с низким потенциалом реверсии (Httl38Q STIMl(-) Low) (темно-серая линия), для токов с высоким потенциалом реверсии (Httl38Q STIMl(-) High) (светло-серая линия)

Заключение

Полученные результаты демонстрируют, что экспрессия мутантного хантингтнна Httl38Q (или N-концевого фрагмента мутантного хантингтина) как в клетках нейробластомы человека (SK-N-SH), так и в первичной культуре нейронов стриатума мыши (MSN), приводит к аномально большому депо-управляемому входу кальция в цитозоль.

Выводы

1. В клетках нейробластомы человека SK-N-SH, экспрессирующих мутантную форму белка хантингтина (Httl38Q), депо-управляемый вход кальция повышен в 5 раз по сравнению с контролем.

2. В клетках первичной культуры нейронов стриатума мыши MSN, экспрессирующих N-концевой фрагмент мутантного белка хантингтина (Httl38Q-lexon), депо-управляемый вход кальция увеличен в 2 раза по сравнению с контролем.

3. Соединение EVP4593 способно осуществлять обратимый блок аномального большого депо-управляемого входа кальция в клетках SK-N-SH, экспрессирующих Httl38Q.

4. Соединение EVP4593 способно блокировать аномально большой депо-управляемый вход кальция в клетках MSN, экспрессирующих Httl38Q-lexon.

5. В клетках вК^-ЗН, экспрессирующих Нй138(3, депо-управляемый вход требует присутствия сенсора кальция в ЭР, белка 8Т1М1, и опосредуется, в основном, каналами, содержащими белок ТИРС!, как субъединицу канала.

Список публикаций по теме диссертации

1. Глушанкова Л.Н., Зимина О.А., Вигопт В.А.. Можаева Г.Н., Безпрозванный И.Б., Казначеева Е.В. «Изменение депо-управляемого входа кальция в клеточной модели болезни Хантингтона». // Доклады Академии Наук. 2010. Т. 433. № 6. С. 1-4.

2. Jun Wu*, Hsin-Pei Shih*. Vladimir Vigont*. Lori Hrdlicka, Len Diggins, Carol Singh, Matt Mahoney, Richard Chesworth, Gideon Shapiro, Michael Ahlijanian, Gerhard Koenig, Olga Zimina, Lyubov Glushankova, Elena Kaznacheyeva, Ilya Bezprozvanny. «Neuronal store-operated calcium entry pathway as a novel therapeutic target for Huntington's disease treatment». // Chemistry and Biology. 2011. V.18. №6. P. 777-793. * Равный вклад.

3. Вигопт B.A.. Зимина О.А., Глушанкова J1.H., Безпрозванный И.Б., Можаева Г.Н., Казначеева Е.В. «Депо-зависимый вход кальция в клетки нейробластомы человека SK-N-SH, моделирующие болезнь Хантингтона». // Биологические мембраны. 2012. Т. 29. № 12. С. 1-10.

Список цитируемой литературы 1. Болдырев А.А., Кяйвяряйнен Е.И., Илюха В.А. // Биомембранология. Петрозаводск: Кар НЦ РАН, 2006. С. 226. 2. Ткачук В.А. // Соросовский образовательный журнал. 2001. Т. 7. №. 1. С. 10-15. 3. Ambudkar I.S., Ong H.L., Liu X. et al. // Cell Calcium. 2007. V.42. №2. P. 213-223. 4. Berna-Erro A., Braun A., Kraft R. et al. // Sci. Signal. 2009. V.2. №93. ra67. 5. Bossy-Wetzel E., Petrilli A., Knott A.B. // Trends Neurosci. 2008. V.31. №12. P. 609-616. 6. Bouron A., Altafaj X., Boisseau S. et al., // Brain Res. Dev. Brain Res. 2005. V. 159 №1. P. 64-71. 7. Cafaroli E., Brini M. // Curr. Opin. Chem. Biol. 2000. V. 4. P. 152-161. 8. Clapham D.E. // Gen. Physiol. 2002. V. 120. P. 217-220. 9. Dziadek M.A., Johnstone L.S. // Cell Calcium. 2007. V.42. №2. P. 123-132. 10. Graham S., Yuan J.P., Ma R. // Exp. Biol Med. 2012. V.237. №2. P. 111-118. 11. G ruszczynska-Biegala J„ Pomorski P., Wisniewska M.B. et al., // PLOS One. 2011. V.6. №4. el9285. 12. Hamill O.P., Sakmann B. // Nature. 1981. V.294. №5840. P. 462-464. 13. Hasan G., Venkiteswaran G. // Front. Neural. Circuits. 2010. V.4. P. 10. 14. Kaltenbach L.S., Romero E., Becklin R.R. et al., // PLOS Genet. 2007. V.3. №5. e82. 15. Khoshnan А., Ко J., Watkin E.E. et al. // J. Neurosci. 2004. V.24. №37. P. 7999-8008. 16. Manjarrés I.M., Rodríguez-García A., Alonso M.T., García-Sancho J. // Cell Calcium. 2010. V.47.№5. P. 412—428. 17. Nakai M., Qin Z.H., Chen J.F., Wang Y., Chase T.N. // J. Neurochem. 2000. V.74. №2. P. 647-658. 18. Narayanan K.L., Irmady K., Subramaniam S., Unsicker K., von Bohlen und Halbach O. 2008. // Neurosci. Lett. 2008. V.446. №2-3 P. 117-122. 19. Okamura H., Rao A. // Curr. Opin. Cell Biol. 2001. V.13. №2. P. 239-243. 20. Panov A.V., Gutekunst C.A., Leavitt B.R. et al. // Nat. Neurosci. 2002. V.5. №8. 731-736. 21. Parekh A.B., Putney J.W. // Physiol. Rew. 2005. V.85. P. 757-810. 22. Pcinelt C., Vig M., Koomoa D.L. et al. // Nat.Cell Biol. 2006. V.8. №7. P. 771-773. 23. Pieri M., Caioli S., Canu N. // Exp. Neurol, pii: S0014-4886(12)00419-0. 24 Poggioli J., Putney J.W. // Pflugers Arch. 1982. V.392. №3. P. 239-243. 25. Qin. Z.H., Wang Y., Nakai M., Chase T.N. // Mol. Pharmacol. 1998. V.53. №1. P. 33-42. 26. Riccio A., Medhurst A.D., Mattei C. et al. // Brain Res. Mol. Brain Res. 2002. V.109. №1-2. P. 95-104. 27. Salido .M., Sage S.O., Rosado J.A. // Biochem. Biophys. Acta. 2009. V.1793. №2. P. 223-230. 28. Sclvaraj S., Sun Y„ Singh B.B. // CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 2010. V.9. №1. P. 94-104. 29. Stankunas K., Graef I.A., Neilson J.R., Park S.H., Crabtree G.R. // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1999. V.64. P. 505-516. 30. Tang T-Sh., Tu H., Chan Edmond Y.W. et al. // Neuron. 2003. V.39. №2. P. 227-239. 31. Tobe M., Isobe Y., Tomizawa H., et al. //Bioorg. Med. Chem. 2003. V.ll.№3. P. 383-391. 32. Vonsattel J.P., Myers R.H., Stevens T.J. et al. // J. Neuropathol. Exp. Neurol. 1985. V.44. №6. P. 559-577. 33. Vosler P.S., Brennan C.S., Chen J. // Mol Neurobiol. 2008. V.38. №1. P. 78-100. 34. Wang Y., Deng X., Zhou Y. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V.106. № 18. P. 7391-7396. 35. Wu

X., Babnigg G., Villereal M.L. // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2000. V.278. №3. P. 526-536. 36. Yamamoto S., Wajima T., Hara Y., Nishida M., Mori Y. // Biochim. Biophys. Acta. 2007. V.1772. №8. P. 958-967. 37. Yuan J.P., Zeng W., Worley P.F., Muallem S. // Nature Cell Biology. .2007. V.9. №6. P. 636-645. 38. Zeron M.M., Hansson O., Chen N. et al. // Neuron. 2002. V.33. №6. P. 849-860.

Подписано в печать 11.12.2012 Формат 60x90/16 Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,75 Тираж 100 экз. Заказ 667

Отпечатано в типографии «Адмирал» 199178, Санкт-Петербург, В.О., 7-я линия, д. 84 А

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Вигонт, Владимир Александрович

Список используемых сокращений.стр

Введение.стр

Цели и задачи исследования.стрб

Основные положения, выносимые на защиту.стр

1 Обзор литературы.стр

1.1 Ионы кальция как внутриклеточный посредник.стр

1.2 Внутриклеточные кальциевые депо.стр

1.2.1. Поддержание низкой концентрации кальция в цитозоле.стр

1.2.2. Выброс кальция из депо.стрЮ

1.2.3. Сенсоры кальция в ЭР: белки STIM1 и STIM2.стр

1.3.4. Каналы утечки в ЭР.стр

1.3 Кальциевые каналы плазматической мембраны.стр

1.3.1. Потенциал-управляемые кальциевые каналы.стр

1.3.2. Лиганд-управляемые каналы. Рецептор NMD А.cmpló

1.4 Депо-управляемый вход кальция.стр

1.4.1. CRAC каналы.стр

1.4.2. Каналы, образованные белками семейства TRP.стр

1.5 Путь активации транскрипционного фактора NF-kB.стр

1.6 Болезнь Хантингтона.стр 6.1. Белок хантингтин.стр

1.6.2. Белковые агрегаты.стр

1.6.3. Кальциевая гипотеза болезни Хантингтона.стр

2 Материалы и методы.стрЗЗ

2.1 Клетки.стрЗЗ

2.2 Соединения EVP.стрЗЗ

2.3 Трансфекция и РНК интерференция.стрЗЗ

2.4 Электрофорез и иммуноблоттинг.стр

2.5 Получение первичной культуры нейронов стриатума.стр

2.6 Получение лентивируса и инфицирование нейронов.стр

2.7 Электрофизиологические измерения.стрЗб

2.8 Растворы.стр

3 Результаты и обсуждение

3 1 В клетках нейробластомы человека SK-N-SH, моделирующих болезнь Хантингтона, наблюдается аномально-большой депо-зависимый вход кальция стр

3 2В клетках первичной культуры нейронов стриатума мыши, моделирующих болезнь Хантингтона, наблюдается аномально-большой депо-зависимый вход кальция стр

3 3 Соединение EVP4593 способно блокировать аномальный депо-управляемый вход кальция в клетках SK-N-SH Hit 13 8Q и MSN Httl 3 8Q-1 exon стр

3 4 Белок TRPC1 входит в состав каналов, отвечающих за поддержание депо-управляемого входа кальция в клетках SK-N-SH Httl38Q стр

3 5 EVP4593 не оказывает влияние на депо-зависимый вход кальция в клетках SK-N-SH с оверэкспрессией белка TRPC1 стр

3 6 Для активации депо-управляемого входа кальция в клетках Httl38Q требуется присутствие белка STIM1 стрбО

Введение Диссертация по биологии, на тему "Депо-управляемый вход кальция в клеточной модели болезни Хантингтона"

Взаимодействие клеток и передача физиологически важных сигналов от плазматической мембраны клетки к ее органеллам происходит путем активации многочисленных специфических рецепторов, локализованных в плазматической мембране (ПМ). При активации одного из наиболее распространенных сигнальных каскадов, а именно, фосфатидилинозитольного (1Рз-каскад) наблюдается временное повышение концентрации свободных ионов кальция в цитозоле. Ионы кальция, в свою очередь, являются одним из наиболее распространенных посредников для передачи сигнала внутри клетки.

В состоянии покоя концентрация кальция в цитозоле поддерживается на очень низком уровне, порядка 10"7 M (Parekh et al., 2005). Столь низкая концентрация достигается за счет функционирования АТРаз, выкачивающих кальций из цитозоля в депо и во внеклеточное пространство, а также Na+/Ca2b и Ca^/tT обменников (Cafaroli et al., 2000; Болдырев и др., 2006). При различных видах стимуляции концентрация ионов кальция в цитозоле может увеличиваться примерно на порядок, достигая микромолярных значений (Ткачук, 2001). Основными путями повышения концентрации цитозольного кальция являются выброс кальция из внутриклеточных депо и вход кальция через каналы ПМ.

Один из наиболее общих типов притока кальция из внеклеточной среды -депо-управляемый кальциевый вход. Для его активации необходимо понижение концентрации кальция во внутриклеточных депо. Доминирующей гипотезой передачи сигнала от опустошенного депо к каналам ПМ является гипотеза конформационного сопряжения, предполагающая прямое взаимодействие между белками эндоплазматического ретикулума (ЭР) и белками плазматической мембраны (Parekh et al., 2005; Wang et al., 2009). Основные белки, принимающие участие в депо-управляемом кальциевом ответе -эдоплазматические белки STIM (кальциевые сенсоры ЭР) и рецептор инозитол трифосфата (IP3R, отвечает за выброс кальция из депо), а также белки ПМ, формирующие ионные поры каналов, а именно белки семейств TRPC (transient receptor potential canonical) и Orai (Wang et al., 2009; Hasan et al., 2010; Manjarres et al., 2010; Gruszczynska-Biegala et al., 2011). Наличие депо-управляемого кальциевого входа показано, как для электроневозбудимых клеток (Poggioli et al., 1982), так и для нейронов (Bouron et al., 2005).

Нарушения в работе кальциевых ионных каналов связаны с множеством различных заболеваний и патологий таких, например, как диабет (Graham et al., 2012), латеральный амиотрофический склероз (Pieri et al., 2012).

Болезнь Хантингтона (БХ) является аутосомно-доминантным нейродегенеративным заболеванием, вызванным увеличением числа глутамин-кодирующих повторов в первом экзоне гена белка хантиигтина. В норме длина полиглутаминового тракта не должна превышать 35 остатков глутамина, в то время как при заболевании наблюдаются тракты длиной до 90 и более глутаминов (Vonsattel et al., 1985). В первую очередь при болезни Хантингтона поражаются срединные шипиковые нейроны стриатума (MSN). Тем не менее, связь между экспрессией мутантного хантингтина и процессами дегенерации нейронов до сих пор остается неясной.

Одной из токсических функций мутантного хантингтина является дестабилизация кальциевой сигнализации. Ранее показано, что мутантный хантингтин способен напрямую связываться с С-концом IP3RI. Данное связывание увеличивает аффинность IP3RI к своему л и га иду, что может приводить к опустошению внутриклеточных кальциевых депо в ответ на базальные концентрации IP3 в цитозоле (Tang et al., 2003). Показано также, что экспрессия мутантного хантингтина вызывает усиление функции МЯ2В-содержащего рецептора NMDA (Zeron et al., 2002), и воздействует на потенциал-зависимые кальциевые каналы (VGCC) (Kaltenbach et al., 2007). Все вышеперечисленные пути ведут к повышению концентрации ионов кальция в цитозоле, что ведет к аномальному накоплению кальция в митохондриях (Bossy-Wetzel et al., 2008; Panov et al., 2002), активации кальпаинов (Vosler et al., 2008), патологическому запуску кальций-зависимых сигнальных путей, апоптотической активности и дегенерации нейронов стриатума,

В нейронах в качестве одного из механизмов повышения концентрации свободных ионов кальция также используется вход кальция через депо-управляемые каналы ПМ (Bouron et al., 2005), Поскольку увеличение аффинности IP3RI к IP3 напрямую влияет на заполненость внутриклеточных кальциевых депо, логично предположить, что депо-управляемый вход кальция вовлечен в патогенез БХ. Тем не менее, до сих пор не было показано, как экспрессия мутантного хантингтина влияет на депо-управляемый кальциевый вход.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Определить влияние экспрессии мутантного белка хантингтина с длиной полиглутаминового тракта 138 остатков глутамина (Htt 138Q) на уровень депо-управляемого входа кальция в клетки SK-N-SH.

3. Исследовать действие на депо-управляемый вход кальция в клетках SK-N-SH соединения EVP4593 (ингибитор активации NF-кВ сигнального пути).

4. Исследовать действие соединения EVP4593 на депо-управляемый вход кальция в клетках MSN.

5. Выяснить, какие белки ответственны за вход кальция по депо-управляемому механизму в клетках SK-N-SH.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. В клеточных моделях болезни Хантингтона: в клетках нейробластомы человека (SK-N-SH) и шипиковых нейронов стриатума мыши (MSN), наблюдается аномально-большой депо-управляемый вход кальция.

2. Соединение EVP4593 способно снижать амплитуду депо-управляемых кальциевых токов в клетках SK-N-SH и MSN.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Вигонт, Владимир Александрович

выводы

2. В клетках первичной культуры нейронов стриатума мыши MSN, экспрессирующих

N-концевой фрагмент мутантного белка хантингтина (Httl38Q-lexon), депо-управляемый вход кальция увеличен в 2 раза по сравнению с контролем.

5. В клетках SK-N-SH, экспрессирующих Httl38Q, депо-управляемый вход требует присутствия сенсора кальция в ЭР, белка STIM1, и опосредуется, в основном, каналами, содержащими белок TRPC1, как субъединицу канала.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Глушанкова Л.Н., Зимина О.А., Вигонт В.А., Можаева Г.Н., Безпрозванный И.Б., Казначеева Е.В. «Изменение депо-управляемого входа кальция в клеточной модели болезни Хантингтона». // Доклады Академии Наук. 2010. Т. 433. № 6. С. 14.

3. Вигонт B.A., Зимина О.А., Глушанкова JI.H., Безпрозванный И.Б., Можаева Г.Н., Казначеева Е.В. «Депо-зависимый вход кальция в клетки нейробластомы человека SK-N-SH, моделирующие болезнь Хантингтона». //Биологические мембраны. 2012. Т. 29. № 12.

С. 110.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время степень важности депо-управляемого входа кальция в нейронах для нейродегенеративных процессов изучена относительно слабо. Тем не менее, стали появляться доказательства вовлеченности депо-управляемого входа кальция в патогенез, например, болезни Альцгеймера (Yamamoto et al., 2007), церебральной ишемии (Berna-Erro et al., 2009).

В данной работе впервые показана важная роль депо-управляемого входа кальция в патогенезе БХ.

Полученные результаты демонстрируют, что экспрессия мутантного хантингтина Httl 38Q (или N-концевого фрагмента мутантного хантингтина) как в клетках нейробластомы человека (SK-N-SH), так и в первичной культуре нейронов стриатума мыши (MSN), приводит к аномально-большому депо-управляемому входу кальция в цитозоль. Эти результаты подтверждаются проведенными нашими соавторами измерениями внутриклеточной концентрации кальция с помощью кальциевого зонда FURA-2 на клетках MSN, выделенных из линии мышей YAC128, моделирующих БХ, (Wu et al., 2011).

Результаты, демонстрирующие, что соединение EVP4593 способно снижать до контрольных значений аномально большой депо-управляемый вход кальция как в SK-N-SH, так и в MSN, позволяют надеяться на создание на основе этого соединения лекарственного средства для терапии БХ. Эти данные также подтверждены измерениями внутриклеточной концентрации кальция с помощью FURA-2. Кроме того, нашими соавторами показано нейропротекторное действие EVP4593 на клетки MSN YAC 128 при глутамат-индуцированном апоптозе и положительный эффект в тестах на моторику на Drosophüa melanogaster, моделирующих БХ (Wu et al., 2011).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Вигонт, Владимир Александрович, Санкт-Петербург

1. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная Биология Клетки Москва. Мир, 1994. Т. 2. С. 359.

2. Болдырев А.А., Кяйвяряйнен Е.И., Илюха В.А. Биомембранология. -Петрозаводск: Кар НЦ РАН, 2006. С. 226.

3. Зинченко В.П., Долгачева Л.П. Внутриклеточная сигнализация Пущино: Аналитическая микроскопия Эл. №77-6072, 2004 - С. 45.

4. Ткачук В. А. Мембранные рецепторы и внутриклеточный кальций. // Соросовский образовательный журнал. 2001. 7(1): 10-15.

5. Adunyah S.E., Dean W.L. Inositol triphosphate-induced Ca2+ release from human platelet membranes//Biochem Biophys Res Commun. 1985. 128(3): 1274-1280.

6. Ambudkar I.S., Bandyopadhyay B.C., Liu X., Lockwich T.P., Paria В., Ong H.L. Functional organization of TRPC-Ca2+ channels and regulation of calcium microdomains // Cell Calcium. 2006. 40(5-6): 495-504.

7. Ambudkar I.S., Ong H.L., Liu X., Bandyopadhyay B.C., Cheng K.T. TRPC1: the link between functionally distinct store-operated calcium channels // Cell Calcium. 2007. 42(2): 213-223.

8. Arrasate M., Mitra S., Schweitzer E.S., Segal M.R., Finkbeiner S. Inclusion bodyformation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death // Nature. 2004. 431(7010): 805-810.

9. Bailey C.D., Johnson G.V. Tissue transglutaminase contributes to disease progression in the R6/2 Huntington's disease mouse model via aggregate-independent mechanisms //

10. J Neurochem. 2005. 92(1): 83-92.

11. Basak S., Kim H., Kearns J.D., Tergaonkar V., O'Dea E., Werner S.L., Benedict C.A., Ware C.F., Ghosh G., Verma I.M., Hoffmann A. A fourth IkappaB protein within the NF-kappaB signaling module// Cell. 2007. 128(2): 369-381.

12. Bates G. Huntingtin aggregation and toxicity in Huntington's disease // Lancet. 2003. 361(9369): 1642-1644.

13. Berridge M.J. Inositol trisphosphate and calcium signalling //Nature. 1993. 361(6410): 315-325.

14. Bezprozvanny I.B., Ehrlich B.E. Inositol 1, 4, 5.-trisphosphate [lnsP3]-gated Ca Channels from Cerebellum: Conduction Properties for Divalent Cations and Regulation by Intraluminal Calcium. //J Gen Physiol. 1994. 104: 851-856.

15. Bezprozvanny I. Calcium signaling and neurodegenerative diseases // Trends Mol Med. 2009. 15(3): 89-100.

16. Bezprozvanny LB. Calcium signaling and neurodegeneration // Acta Naturae. 2010. 2(1): 72-82.

17. Birnbaumer L., Campbell K.P., Catterall W.A., Harpold M.M., Hofmann F., Home W.A., Mori Y., Schwartz A., Snutch T.P., Tanabe T., et al. The naming of voltage-gated calcium channels//Neuron. 1994. 13(3): 505-506.

18. Bootman M.D., Collins T.J., Peppiatt C.M., Prothero L.S., MacKenzie L., De Smet P., Travers M., Tovey S.C., Seo J.T., Berridge M.J., Ciccolini F., Lipp P. Calcium signaling an overview. II Cell and developmental biology. 2001. 12: 3-10.

19. Bollimuntha S., Selvaraj S., Singh B.B. Emerging roles of canonical TRP channels in neuronal function // Adv Exp Med Biol. 2011. 704: 573-593.

20. Bossy-Wetzel E, Petrilli A, Knott A.B. Mutant huntingtin and mitochondrial dysfunction//Trends Neurosci. 2008. 31(12): 609-616.

21. Brandman O., Liou J., Park W.S., Meyer T. STIM2 is a feedback regulator that stabilizes basal cytosolic and endoplasmic reticulum Ca2+ levels // Cell. 2007 131(7): 1327-1339.

22. Cafaroli E., Brini M. Calcium pumps: structural basis for and mechanism of calcium transmembrane transport. // Curr Opin Chem Biol. 2000. 4: 152-161.

23. Cafaroli E. Calcium signaling: a tale for all seasons. // PNAS. 2002. 99(3): 1115-1122.

24. Catterall W.A. Structure and function of voltage-gated ion channels // Annu Rev Biochem. 1995. 64: 493-531.

25. Choi W., Proctor L., Xia Q., Feng Y„ Gerner E.W., Chiao P.J., Hamilton S.R., Zhang W. Inactivation of IkappaB contributes to transcriptional activation of spermidine/spermine N(l)-acetyltransferase // Mol Carcinog. 2006. 45(9): 685-693.

26. Clapham D E Sorting out MIC, TRP and CRAC ion channel // Gen Physiol 2002 120 217-220

27. Courtois G , Gilmore T D Mutations in the NF-kappaB signaling pathway implications for human disease//Oncogene 2006 25(51) 6831-6843

28. DiFiglia M , Sapp E , Chase K O , Davies S W , Bates G P , Vonsattel J P , Aronin N Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain // Science 1997 277(5334) 1990-1993

29. Douglas P M, Summers D W, Cyr D.M Molecular chaperones antagonize proteotoxicity by differentially modulating protein aggregation pathways // Prion 2009 3(2) 51-58

30. Dowson A P Calcium signaling How do IP3 receptors work //Current Biology 1997 7 544-547

31. Dziadek M A , Johnstone L S Biochemical properties and cellular localization of ST1M proteins //Cell Calcium 2007 42(2) 123-132

32. Ehrnhoefer D E , Sutton L , Hayden M R Small changes, big impact posttranslational modifications and function of huntingtin in Huntington disease // Neuroscientist 2011 17(5) 475-492

33. Fan M M , Fernandes H B , Zhang L Y , Hayden M R , Raymond L A Altered NMD A receptor trafficking in a yeast artificial chromosome transgenic mouse model of Huntington's disease//J Neurosci 2007 27(14) 3768-3779

34. Favre B , Turowski P , Hemmings B A Differential inhibition and posttranslational modification of protein phosphatase 1 and 2A in MCF7 cells treated with calyculin-A, okadaic acid,and tautomycin. // J Biol Chem. 1997. 272(21): 13856-13863.

35. Finkbeiner S., Greenberg M.E. Ca2+ channel-regulated neuronal gene expression // J Neurobiol. 1998. 37(1): 171-189.

36. Gerfen C.R., Baimbridge K.G., Miller J.J. The neostriatal mosaic: compartmental distribution of calcium-binding protein and parvalbumin in the basal ganglia of the rat and monkey // Proc Natl Acad Sci USA. 1985. 82(24): 8780-8784.

37. Gokhale K.C., Newnam G.P., Sherman M.Y., Chernoff Y.O. Modulation of prion-dependent polyglutamine aggregation and toxicity by chaperone proteins in the yeast model // J Biol Chem. 2005. 280(24): 22809-22818.

38. Gomez T.M., Robles E., Poo M., Spitzer N.C. Filopodial calcium transients promote substrate-dependent growth cone turning// Science. 2001. 291(5510): 1983-1987.

39. Graham S., Yuan J.P., Ma R. Canonical transient receptor potential channels in diabetes // Exp Biol Med (Maywood). 2012. 237(2): 111-118.

40. Green H. Human genetic diseases due to codon reiteration: relationship to an evolutionary mechanism//Cell. 1993. 74(6): 955-956.

41. Gruszczynska-Biegala J., Pomorski P., Wisniewska M.B., Kuznicki J. Differential roles for STIM1 and STIM2 in store-operated calcium entry in rat neurons // PLOS One. 2011. 6(4): el9285.

42. Gwack Y., Srikanth S„ Feske S„ Cruz-Guilloty F., Oh-hora M., Neems D.S., Hogan P.G., Rao A. Biochemical and functional characterization of Orai proteins // J Biol Chem. 2007. 282(22): 16232-16243.

43. Hackam A.S., Singaraja R., Wellington C.L., Metzler M., McCutcheon K., Zhang T., Kalchman M., Hayden M.R. The influence of huntingtin protein size on nuclear localization and cellular toxicity//J Cell Biol. 1998. 141(5): 1097-1105.

44. Hamill O.P., Sakmann B. Multiple conductance states of single acetylcholine receptorchannels in embryonic muscle cells. //Nature. 1981. 294(5840): 462-464.

45. Harjes P., Wanker E.E. The hunt for huntingtin function: interaction partners tell many different stories // Trends Biochem Sci. 2003. 28(8): 425-433.

46. Hasan G., Venkiteswaran G. The enigma of store-operated ca-entry in neurons: answers from the Drosophila flight circuit // Front Neural Circuits. 2010. 4: 10.

47. Hehl S., Golard A., Hille B. Involvement of mitochondria in intracellular calcium sequestration by rat gonadotropes. // Cell calcium. 1996. 20(6): 515-524.

48. Heilbrunn L.V., Wiercenski F.J. The action of various cations on muscle protoplasm. // J Cell Comp Physiol. 1947.29: 15-32.

49. Hiroi Y., Nakao T., Tsuchiya N., Takeda N., Maemura K., Nakamura F., Ohno M., Hirata Y., Nagai R. Exacerbation of Lambert-Eaton myasthenic syndrome caused by an L-type Ca2+ channel antagonist // Jpn Heart J. 2003. 44(1): 139-144.

50. Hoffmann A., Leung T.H., Baltimore D. Genetic analysis of NF-kappaB/Rel transcription factors defines functional specificities // EMBO J. 2003. 22(20): 5530-5539.

51. Hoffmann A., Natoli G., Ghosh G. Transcriptional regulation via the NF-kappaB signaling module // Oncogene. 2006. 25(51): 6706-6716.

52. Hoffner G., Djian P. Protein aggregation in Huntington's disease // Biochimie. 2002. 84(4): 273-278.

53. Hoffner G., Djian P. Transglutaminase and diseases of the central nervous system // Front Biosci. 2005. 10: 3078-3092.

54. Hoth M , Penner R Depletion of intracelular calcium stores activates a calcium current in mast cells //Nature 1992 355 353-356

55. Hoth M , Penner R Calcium release-activated calcium current in rat mast cells // J Physiol 1993 465 359-386

56. Irvine R F 'Quantal' Ca2+ release and the control of Ca2+ entry by inositol phosphates a possible mechanism //FEBSLett 1990 263(1) 59

57. Jan L Y , Jan Y N Voltage-sensitive ion channels//Cell 1989 56(1) 13-25

58. Kaftan E J , Ehrlich B E , Watras J Inositol 1,4,5-tnsphosphate (InsP3) and calcium interact to increase the dynamic range of InsP3 receptor-dependent calcium signaling // J Gen Physiol 1997 110(5) 529-538

59. Kahlem P , Terré C, Green H, Djian P Peptides containing glutamine repeats as substrates for transglutaminase-catalyzed cross-linking relevance to diseases of the nervous system //Proc Natl Acad Sci U S A 1996 93(25) 14580-14585

60. Kahlem P , Green H , Djian P Transglutaminase action imitates Huntington's disease selective polymerization of Huntingtin containing expanded polyglutamine // Mol Cell 1998 1(4) 595-601

61. Karin M, Ben-Neriah Y Phosphorylation meets ubiquitination the control of NF-kappa.B activity//Annu Rev Immunol 2000 18 621-663

62. Khoshnan A, Ko J , Watkin E E , Paige L A, Reinhart P H, Patterson P H Activation of the IkappaB kinase complex and nuclear factor-kappaB contributes to mutant huntingtinneurotoxicity // J Neurosci. 2004. 24(37): 7999-8008.

63. Kloda A, Martinac B, Adams DJ. Polymodal regulation of NMD A receptor channels // Channels (Austin). 2007. (5): 334-343.

64. Lee C.H., Poburko D., Kuo K.H., Ceow C.Y., van Breemen C. Ca2' oscillations, gradients and homeostasis in vascular smooth muscle. // Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2002. 282: 1571-1583.

65. Lesort M., Chun W., Johnson G.V., Ferrante R.J. Tissue transglutaminase is increased in Huntington's disease brain // J Neurochem. 1999. 73(5): 2018-2027.

66. Li Z„ Liu L„ Deng Y., Ji W„ Du W., Xu P., Chen L„ Xu T. Graded activation of CRAC channel by binding of different numbers of STIM1 to Orail subunits // Cell Res. 2011 21(2): 305-315.

67. Linden R. The survival of developing neurons: a review of afferent control // Neuroscience. 1994. 58(4): 671-682.

68. Sci USA. 2007. 104(44): 17542-17547.

69. Lohmann C., Finski A., Bonhoeffer T. Local calcium transients regulate the spontaneous motility of dendritic filopodia // Nat Neurosci. 2005. 8(3): 305312.

70. Lucas P., Ukhanov K., Leinders-Zufall T., Zufall F. A diacylglycerol-gated cation channel in vomeronasal neuron dendrites is impaired in TRPC2 mutant mice: mechanism of pheromone transduction//Neuron. 2003. 40(3): 551-561.

71. Manjarrés I.M., Rodríguez-García A., Alonso M.T., García-Sancho J. The sarco/endoplasmic reticulum Ca(2+) ATPase (SERCA) is the third element in capacitative calcium entry//Cell Calcium. 2010. 47(5). 412-428.

72. Marambaud P., Dreses-Werringloer U., Vingtdeux V. Calcium signaling in neurodegeneration // Mol Neurodegener. 2009. 4: 20.

73. Matsuda K, Fletcher M, Kamiya Y, Yuzaki M. Specific assembly with the NMD A receptor 3B subunit controls surface expression and calcium permeability of NMDA receptors //

74. J Neurosci. 2003. 23(31): 10064-10073.

75. Meldolesi J., Pozzan T. The endoplasmic reticulum Ca2+ store: a view from the lumen. //Trends Biochem Sci. 1998.23(1): 10-14.

76. Minke B., Cook B. TRP channel proteins and signal transduction // Physiol Rev. 2002. 82(2): 429-472.

77. Mitchell I J., Griffiths M.R. The differential susceptibility of specific neuronalpopulations: insights from Huntington's disease // IUBMB Life. 2003. 55(6): 293-298.

78. Moreno Davila H. Molecular and functional diversity of voltage-gated calcium channels

79. Ann N Y Acad Sci. 1999. 868: 102-117.

80. Muchowski P J., Schaffar G., Sittler A., Wanker E.E., Hayer-Hartl M.K., Hartl F U Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. 97(14): 7841-7846.

81. Muilins F.M., Park C.Y., Dolmetsch R.E., Lewis R.S. STIM1 and calmodulin interact with Orail to induce Ca2+-dependent inactivation of CRAC channels // Proc Natl Acad Sci USA. 2009 106(36): 15495-15500

82. Nakai M., Qin Z.H., Chen J.F., Wang Y., Chase T.N. Kainic acid-induced apoptosis in rat striatum is associated with nuclear factor-kappaB activation // J Neurochem. 2000. 74(2): 647-658.

83. Narayanan K.L , Irmady K., Subramaniam S., Unsicker K., von Bohlen und Halbach O. Evidence that TRPC1 is involved in hippocampal glutamate-induced cell death Neurosci Lett. 2008 446(2-3): 117-122.

84. Naugler W.E., Karin M. NF-kappaB and cancer-identifying targets and mechanisms // Curr Opin Genet Dev. 2008. 18(1): 19-26.

85. Nelson O , Tu H., Lei T., Bentahir M., de Strooper B., Bezprozvanny I. Familial

86. Alzheimer disease-linked mutations specifically disrupt Ca2+ leak function of presenilin 1 II J Clin Invest. 2007. 117(5): 1230-1239.

87. North R.A. Molecular physiology of P2X receptors // Physiol Rev. 2002. 82(4): 1013-1067.

88. Novak M.J., Tabrizi S.J. Huntington's disease // BMJ. 2010. 340: c3109.

89. O'Dea E , Hoffmann A NF-kB signaling // Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med 2009 1(1) 107-115

90. Okamura H , Rao A Transcriptional regulation in lymphocytes // Curr Opin Cell Biol 2001 13(2) 239-243

91. Panov A V , Gutekunst C A, Leavitt B R, Hayden M R , Burke J R , Strittmatter W J , Greenamyre J T Early mitochondrial calcium defects in Huntington's disease are a direct effect of polyglutamines // Nat Neurosci 2002 5(8) 731-736

92. Panov AV, Burke JR, Strittmatter WJ, Greenamyre JT In vitro effects of polyglutamine tracts on Ca2+-dependent depolarization of rat and human mitochondria relevance to Huntington's disease // Arch Biochem Biophys 2003 410(1) 1-6

93. Paoletti P, Neyton J NMDA receptor subunits function and pharmacology // Curr Opin Pharmacol 2007 7(1) 39-47

94. Parekh A B , Putney J W Store-Operated Calcium Channels // Physiol Rew 2005 85 757-810

95. Parys JB , Missiaen L , Smedt HD , Sienaert I, Casteels R Mechanisms responsible for Ca24 release from inositol 1,4,5-trisphosphate-sesitive calcium stores // Pflugers Arch 1996 432(3) 359-367

96. Peinelt C , Vig M , Koomoa D L , Beck A , Nadler M J, Koblan-Huberson M , Lis A , Fleig A , Penner R, Kinet J P Amplification of CRAC current by STIM1 and CRACM1 (Orail) // Nat Cell Biol 2006 8(7) 771-773

97. Pelkey K A , Askalan R , Paul S , Kalia L V , Nguyen T H , Pitcher G M , Salter M W , Lombroso P J Tyrosine phosphatase STEP is a tonic brake on induction of long-term potentiation // Neuron 2002 34(1) 127-138

98. Pennuto M, Palazzolo I, Poletti A Post-translational modifications of expanded polyglutamine proteins impact on neurotoxicity//Hum Mol Genet 2009 18(R1) R40-47

99. Perret D, Luo ZD. Targeting voltage-gated calcium channels for neuropathic pain management // Neurotherapeutics. 2009. 6(4): 679-692.

100. Perutz M.F., Johnson T., Suzuki M., Finch J.T. Glutamine repeats as polar zippers: their possible role in inherited neurodegenerative diseases // Proc Natl Acad Sci USA. 1994. 91(12): 5355-5358.

101. Perutz M.F., Finch J.T., Berriman J., Lesk A. Amyloid fibers are water-filled nanotubes //Proc Natl Acad Sci USA. 2002. 99(8): 5591-5595.

102. Pieri M., Caioli S., Canu N., Mercuri N.B., Guatteo E., Zona C. Over-expression of N-type calcium channels in cortical neurons from a mouse model of Amyotrophic Lateral Sclerosis // Exp. Neurol. doi:pii: S0014-4886(12)00419-0.

103. Poggioli J., Putney J.W. Net calcium fluxes in rat parotid acinar cells: evidence for a hormone-sensitive calcium pool in or near the plasma membrane. // Pflugers Arch. 1982. 392(3): 239-243.

104. Putney J.W. A model for receptor-regulated calcium entry. // Cell Calcium. 1986. 7(1): 1-12.

105. Putney J.W. Capacitative calcium entry revisited. // Cell Calcium. 1990. 11:611-624.

106. Qin Z.H., Wang Y., Nakai M., Chase T.N. Nuclear factor-kappa B contributes to excitotoxin-induced apoptosis in rat striatum // Mol Pharmacol. 1998. 53(1): 33-42.

107. Reuter H. Measurements of exocytosis from single presynaptic nerve terminals revealheterogeneous inhibition be calcium channel blockers//Neuron 1995. 14(4): 773-779.

108. Riccio A., Medhurst A.D., Mattei C., Kelsell R.E., Calver A.R., Randall A.D., Benham C.D., Pangalos M.N. mRNA distribution analysis of human TRPC family in CNS and peripheral tissues//Brain Res Mol Brain Res. 2002. 109(1-2): 95-104.

109. Rockabrand E., Slepko N., Pantalone A., Nukala V.N., Kazantsev A., Marsh J.L.,

110. Sullivan P.G., Steffan J.S., Sensi S.L., Thompson L.M. The first 17 amino acids of Huntingtin modulate its sub-cellular localization, aggregation and effects on calcium homeostasis // Hum Mol Genet. 2007. 16(1): 61-77.

111. Romero E., Cha G.H., Verstreken P., Ly C.V., Hughes R.E., Bellen H.J., Botas J. Suppression of neurodegeneration and increased neurotransmission caused by expanded full-length huntingtin accumulating in the cytoplasm //Neuron. 2008. 57(1): 27-40.

112. Salido G M., Sage S.O., Rosado J.A. TRPC channels and store-operated Ca(2+) entry // Biochim Biophys Acta. 2009. 1793(2): 223-230.

113. Sattler R., Tymianski M. Molecular mechanisms of calcium-dependent excitotoxicity // J Mol Med (Berl). 2000. 78(1): 3-13.

114. Saudou F., Finkbeiner S., Devys D., Greenberg M.E. Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions // Cell. 1998. 95(1): 55-66.

115. Schwarcz R., Foster A.C., French E.D., Whetsell W.O. Jr, Köhler C. Excitotoxic models for neurodegenerative disorders//Life Sei. 1984. 35(1): 19-32.

116. Selvaraj S., Sun Y., Singh B.B. TRPC channels and their implication in neurological diseases // CNS Neurol Disord Drug Targets. 2010. 9(1): 94-104.

117. Shehadeh J., Fernandes H.B., Zeron Mullins M.M., Graham R.K., Leavitt B.R., Hayden

118. M.R., Raymond L.A. Striatal neuronal apoptosis is preferentially enhanced by NMDA receptor activation in YAC transgenic mouse model of Huntington disease // Neurobiol Dis. 2006. 21(2): 392-403.

119. Skibinska-Kijek A., Wisniewska M.B., Gruszczynska-Biegala J., Methner A., Kuznicki J., Immunolocalization of STIM1 in the mouse brain // Acta Neurobiol Exp (Wars). 2009. 69(4): 413-428.

120. Smyth J., Hwang S., Tomita T., DeHaven W., Mercer J., Putney J., Activation and regulation of store-operated calcium entry // J Cell Mol Med. 2010. 14: 2337-2349.

121. Stankunas K., Graef I.A., Neilson J.R., Park S.H., Crabtree G.R. Signaling through calcium, calcineurin, and NF-AT in lymphocyte activation and development // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1999. 64: 505-516.

122. Subramaniam S., Sixt K.M., Barrow R., Snyder S.H. Rhes, a striatal specific protein, mediates mutant-huntingtin cytotoxicity//Science. 2009. 324(5932): 1327-1330.

123. Sun Y., Savanenin A., Reddy P.H., Liu Y.F. Polyglutamine-expanded huntingtin promotes sensitization of N-methyl-D-aspartate receptors via post-synaptic density 95 // J Biol Chem. 2001. 276(27): 24713-24718.

124. Swayne L.A., Chen L., Hameed S., Barr W., Charlesworth E., Colicos M.A., Zamponi G.W., Braun J.E. Crosstalk between huntingtin and syntaxin 1A regulates N-type calcium channels //Mol Cell Neurosci. 2005. 30(3): 339-351.

125. Tang T.S., Guo C., Wang H., Chen X., Bezprozvanny I. Neuroprotective effects ofinositol 1,4,5-trisphosphate receptor C-terminal fragment in a Huntington's disease mouse model // J Neurosci. 2009. 29(5): 1257-1266.

126. Thibault O., Gant J.C., Landfield P.W. Expansion of the calcium hypothesis of brain aging and Alzheimer's disease: minding the store // Aging Cell. 2007. 6(3): 307317.

127. Tsien R.W., Ellinor P.T., Home W.A. Molecular diversity of voltage-dependent Ca2+ channels // Trends Pharmacol Sci. 1991. 12(9): 349-354.

128. Vig M., Kinet J.P. The long and arduous road to CRAC. // Cell Calcium. 2007. 42(2): 157-162.

129. Vonsattel J.P., Myers R.H., Stevens T.J., Ferrante R.J., Bird E.D., Richardson E.P. Jr. Neuropathological classification of Huntington's disease // J. Neuropathol. Exp. Neurol. 1985. 44(6): 559-577.

130. Vonsattel J.P., DiFiglia M. Huntington disease // J Neuropathol Exp Neurol. 1998. 57(5): 369-384.

131. Vosler P.S., Brennan C.S., Chen J. Calpain-mediated signaling mechanisms in neuronal injury and neurodegeneration // Mol Neurobiol. 2008.38(1): 78-100.

132. Wang Y., Deng X., Zhou Y., Hendron E., Mancarella S., Ritchie MF., Tang X.D., Baba Y., Kurosaki T., Mori Y., Soboloff J., Gill D.L. ST1M protein coupling in the activation of Orai channels // Proc Natl Acad Sci USA. 2009. 106(18): 7391-7396.

133. Warby S.C., Doty C.N., Graham R.K., Carroll J.B., Yang Y.Z., Singaraja R.R., Overall C.M., Hayden M.R. Activated caspase-6 and caspase-6-cleaved fragments of huntingtin specifically colocalize in the nucleus // Hum Mol Genet. 2008. 17(15): 2390-2404.

134. Wechsler A., Teichberg V.I. Brain spectrin binding to the NMDA receptor is regulated by phosphorylation, calcium and calmodulin // EMBO J. 1998. 17(14): 3931-3939.

135. Wenthold R.J., Prybylowski K., Standley S., Sans N., Petralia R.S. Trafficking of NMDA receptors // Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2003. 43: 335-358.

136. Wojda U., Salinska E., Kuznicki J. Calcium ions in neuronal degeneration // IUBMB Life. 2008. 60(9): 575-590.

137. Wu X., Babnigg G., Villereal M.L. Functional significance of human trpl and trp3 in store-operated Ca(2+) entry in HEK-293 cells // Am J Physiol Cell Physiol. 2000. 278(3): C526-536.

138. Yamamoto S., Wajima T., Hara Y., Nishida M., Mori Y. Transient receptor potential channels in Alzheimer's disease // Biochim Biophys Acta. 2007. 1772(8): 958-967.

139. Yu X.M., Askalan R., Keil G.J. 2nd, Salter M.W. NMDA channel regulation bychannel-associated protein tyrosine kinase Src // Science. 1997. 275(5300); 674-678.

140. Yuan J.P., Zeng W., Huang G.N., Worley P.F., Muallem S. STIM1 heteromultimerizes TRPC channels to determine their function as store-operated channels // Nat Cell Biol. 2007. 9(6): 636-645.

141. Zhou Y., Mancarella S., Wang Y., Yue C., Ritchie M., Gill D.L., Soboloff J. The short N-terminal domains of STIM1 and STIM2 control the activation kinetics of Orail channels. //J Biol Chem. 2009. 284(29): 19164-19168.

142. Zweifach A., Lewis R.S. Mitogen-regulated Ca2+ current of T lymphocytes is activated by depletion of intracellular Ca2+ stores // Proc Natl Acad Sci U S A. 1993. 90(13): 6295-6299.

Информация о работе

Вигонт, Владимир Александрович
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2013
ВАК 03.03.04

Диссертация

Депо-управляемый вход кальция в клеточной модели болезни Хантингтона - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы