Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ДЕГРАДАЦИЯ НЕФТИ АССОЦИАЦИЕЙ АЭРОБНЫХ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ В РАЗЛИЧНЫХ ТИПАХ ПОЧВ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ДЕГРАДАЦИЯ НЕФТИ АССОЦИАЦИЕЙ АЭРОБНЫХ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ В РАЗЛИЧНЫХ ТИПАХ ПОЧВ"

Я'ЗЗбУ^

На правах рукописи

ПАВЛИКОВА Татьяна Алексеевна

ДЕГРАДАЦИЯ НЕФТИ АССОЦИАЦИЕЙ АЭРОБНЫХ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ В РАЗЛИЧНЫХ ТИПАХ ПОЧВ

Специальность 03.00.07—микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена на кафедре микробиологии Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева

Научный руководитель

доктор сельскохозяйственных наук, профессор О Д Сидоренко, доктор биологических наук, профессор ИМ Яшин, кандидат биологических наук, И А Борзенков

Официальные оппоненты

Ведущая организация Всероссийский Научно-исследовательский Институт Сельскохозяйственной Биотехнологии РАСХН

Защита состоится 23 июня 2004г в 15°°часов на заседании диссертационного совета Д 220 043 03 Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева

Адрес 127550, Москва, Тимирязевская ул, д 49 Ученый совет МСХА им К А Тимирязева

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ МСХА

Автореферат разослан «_» мая 2004 г

Ученый секретарь

диссертационного совета, профессор В А Калинин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В настоящее время следствием безудержного и неконтролируемого внедрения человека в природу оказывается загрязнение почвы и водоемов ксенобиотиками, несвойственными биосфере. Наиболее серьезным и трудно устраняемым техногенным нарушением природы является нефтезагрязнение (Пиковский, 1988; Гузев и др., 1989; Киреева, 2001).

Значительный вклад в процесс биологического разрушения нефти вносят углеводородокисляющие микроорганизмы, являющиеся постоянным компонентом экосистемы. В последнее время успешно разрабатываются микробиологические технологии очистки природных сред от нефтяного загрязнения, основанные на использовании ассоциаций углеводородокисляющих микроорганизмов в сочетании с различными веществами, стимулирующими , их активность (Сидоров и др., 1997; Чугунов и др., 200; Ягафарова, 2001). Важным условием

микробиологической очистки загрязненных почв является способность различ-

' ««'fJ~\: -Uj

ных групп микроорганизмов (бактерий, актиромицетов, дрожжей и мйкромице-

• .v • ч '.'i-r'-ü

tob), обладая высокой интродукционной'; жизнеспособностью, совместно разрушать углеводороды нефти (Звягинцев, 1989; Корнелли,2001 ¡Якушева, 2002).

Изучение ассоциаций углеводородокисляющих ^микроорганизмов и разработка методов их успешной интродукции в природные экосистемы позволят в дальнейшем развить экологическую биотехнологию в нашей стране.

Цель я задаче исследования. Основной целью нашей работы было выделение и подбор ассоциации аэробных углеводородокисляющих микроорганизмов, активно утилизирующих углеводороды нефти, изучение их способности к биоремедиации нефтезагрязненных почв и изучение влияния сырой нефти на почвенную микробиоту.

Для решения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Выявить, выделить и подобрать условия культивирования чистых культур микроорганизмов, способных к усвоению углеводородов нефти.

2. Отобрать штаммы микроорганизмов-деструкторов с наибольшей глубиной окисления углеводородов нефти.

, UHG МСХА

3 Установить таксономическую принадлежность и физиолого-биохимические особенности микроорганизмов-деструкторов нефти

4. Разработать комплексный микробный биопрепарат, приводящий к деградации углеводородов нефти

5. Исследовать действие сырых нефтей разных месторождений на почвенную

микрофлору и изучить особенности микробоценозов загрязненных нефтью почв Научная новизна.

- В работе впервые выделены в чистую культуру штаммы бактерий и микромицстов, использующие углеводороды высоко- и среднепарафинистой нефти в качестве единственного источника углерода Выделенные штаммы микроорганизмов изучены и идентифицированы до вида Rodococcus ruber PS-02 Pseudomonas putida SP 203, Tnchoderma caraxmnde Wetarrhzam amscphae AF-7S, Aspergillus cameie SU-TM 03

- Установлено, что ассоциация аэробных углеводородокисляющих микроорганизмов обладает высокой интродуктивной жизнеспособностью в нефте-загрязненных почвах Они высоко активны в деструкции сырой нефти и ее легких фракций (н-алканов) при относительно-низких температурах (8-15°С)

- Впервые изучены микробоценозы нефтезагрязненных почв модифицированным методом прямого микроскопирования

- Выявлена роль углеводородокисляющих штаммов микроорганизмов в деградации нефти в почвах и аллювиальном песке речной террасы

Практическая ценность работы. На основе созданной ассоциации выделенных штаммов-деструкторов углеводородов нефти разработан комплексный биопрепарат, показавший высокую активность в окислении сырой нефти Сугмутского и Харьягинского месторождений Препарат позволяет в течение 4 месяцев снизить токсичность почвы, загрязненной сырой нефтью, до уровня, не препятствующего росту растений Результаты исследований могут служить основой для разработки технологии получения биопрепаратов для очистки почв и

водоемов, загрязненных сырой нефтью в широком температурном диапазоне (t=15 -28" С). ' '•' ' '• "" ' !

Апробация работы. Основные положения и результаты исследований представлены и одобрены на 36-ой Международной научной конференции «Агрохимические аспекты повышения продуктивности сельскохозяйственных культур» (Москва, 2002); на Всероссийской научно-технической конференции с международным участием «Высокоэффективные технологии, методы и способы для их реализации» (Москва, 2003); на заседании кафедры микробиологии МСХА им. К.А. Тимирязева (25 марта 2004 г).

Публикации. Основное содержание диссертации изложено в 4 опубликованных работах, оформляется патент Российской Федерации.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов исследований, выводов и списка литературы. Экспериментальный материал приведен в таблицах и рисунках. Список литературы включает 130 наименований, в том числе 26 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Основными объектами исследований служили чистые культуры углевод-ородокисляющих микроорганизмов, выделенные в ходе эксперимента: Pseudomonas putida SP-203 (выделенный из нефтезагрязненной черноземной почвы), Rhodococcus ruber PS-02 (выделенный из нефтезагрязненной дерново-подзолистой почвы), Trichoderma citrinoviride VS-89 (выделенный из компоста,), Metarrhizium anisopliae AF-78 (выделенный из красновато-бурой почвы), Aspergillus carneus SU-TM-03 (выделенный из сырой нефти Сугмутского месторождения).

Материалом исследования являлись образцы почв: 1) дерново-подзолистая средиесуглистая почва (лесная опытная дача МСХА). 2) типичный

з

чернозем тяжелосуглинистый (Липецкая область) 3) аллювиальный песок речной террасы (пойма реки Волга) В работе дополнительно использовали красновато-бурую почву сухих саванн, компост высокого нагрева, запатентованный как органический почвогрунт (Сидоренко, патент РФ № 2110170).

Экспериментальное загрязнение почв проводили нефтью двух типов, полученных в НИИ газа и нефти им Крылова (г. Москва)

-Нефть-А' нефть Харьягинского месторождения характеризуется как вы-сокопарафинистая, сернистая, температура застывания нефти +29 °С

-Нефть-Б. нефть Сугмутского месторождения среднепарафинистая, сернистая, температура застывания нефти +10°С

Для изучения упеводородокисляющей активности микроорганизмы культивировали на жидкой минеральной среде Раймонда (Raymond, 1961) с 1% NaCl и сырой нефтью, легкими фракциями нефти (керосин, соляровое масло), тяжелой фракцией (мазут), а также ароматической фракцией (тол>ол) (0,5 -10%) (температура инкубирования 26-28°С)

Идентификацию полученных культур микроорганизмов проводили по культуральным, морфологическим и биохимическим признакам, используя определители бактерий Берджи, 1997, Вейант и др , 1999, Смирнов, 1990, определители грибов Domsch, Grams,, Anderson, 1980, Саттон, Фотергилл, 2001, Би-лай и др, 1988, а также определитечь грибов рода Trichaderma Samuel's, Petini, Kuhes, 2000

Культивирование проводили при разных температурных режимах при при 37°С, 28°С, 16°С и при 8°С, а также при разной аэрации, в стационарной культуре и на качалке (при 100 об/мин)

Изменение химического состава нефти и трансформацию углеводородов в процессе микробиологического воздействия изучали методом газовой хроматографии Экстракцию углеводородов проводили по методу, принятому в лаборатории нефтяной микробиологии Института микробиологии им С Н. Вино-градского РАН, в собственной модификации. Анализу подвергали растворенную гексаном алифатическую фракцию нефти, анализировали на содержание в

нем различных групп углеводородов. Газохроматографический анализ углеводородного состава нефти проводили на хроматографе НР- 5890 серии 2 с использованием пламенно-ионизационного детектора. Условия проведения анализа: газ-носитель - гелий, скорость гелия через колонку-2 мл/мин, начальная температура - 100°С, конечная - 320°С.

Активность биопрепарата, созданного нами на основе выделенных уг-леводородокисляющих штаммов, проверяли в стеклянных сосудах с массой почвы 300г. Схема опыта:

м Образцы почв Нефть (ЗООмг/кг) Компост (3% от веса почвы) Биопрепарат (100мг/кг)

1.1 Дерново-подзолистая почва - - -

1.2 Черноземная почва - - -

1.3. Аллювиальный песок - - -

2.1 Дерново-подзолистая почва - + -

2.2 Черноземная почва . - • +

2.3 Аллювиальный песок - + ■ -

3.1 Дерново-подзолистая почва Нефть А - -

3.2 Черноземная почва Нефть А - -

3.3 Аллювиальный песок Нефть А -

3.4 Дерново-подзолистая почва Нефть Б -

3.5 Черноземная почва Нефть Б - -

З.б Аллювиальный песок Нефть Б - -

4.1 Дерново-подзолистая почва Нефть А + -

4.2 Черноземная почва Нефть А + -

4.3 Аллювиальный песок Нефть А -

4.4 Дерново-подзолистая почва Нефть Б + -

4.5 Черноземная почва Нефть Б + -

4.6 Аллювиальный песок Нефть Б +

5.1 Дерново-подзолистая почва Нефть А - +

5.2 Черноземная почва Нефть А - +

5.3 Аллювиальный песок Нефть А +

5.4 Дерново-подзолистая почва Нефть Б - ■ +

5.5 Черноземная почва Нефть Б ■ - ' +■

5.6 Аллювиальный песок Нефть Б - +

Примечание: -Нефть - А: нефть Харьягинского месторождения

- Нефть - Б: нефть Сугмутского месторождения \ '

Согласно схеме опыта в верхние слои почвы вносили нефти в массе ЗООмг/кг от веса почвы, 3 % компоста и биопрепарат (Титр=]010КОЕ/г препарата) на основе ассоциации углеводородокисляющих микроорганизмов в коли-

5

честве 100мг/кг Углеводородокисляющую микрофлору активировали внесением растворов минеральных солей.

Изучали влияние нефтяного загрязнения на динамику микрофлоры Учитывали численность мезофильных гетеротрофных микроорганизмов, численность микромицетов и углеводородокисляющих микроорганизмов

Исследования ценозов микроорганизмов нефтезагрязненных почв проводили прямым методом учета, предложенным Н Г Холодным (стекла обрастания) в нашей модификации препараты окрашивали по Граму При микроско-пировании препаратов изучали структуру микробного ценоза, плотность обрастания и распределение микроорганизмов. Учитывали доминирующие формы, проводили микрофотосъемки

Анализ остаточного содержания нефти в почве осуществляли методом извлечения суммы неполярных и малополярных углеводородов органическим растворителем - четыреххлористым углеродом (ССЦ) (Семенов и др, 1976, Эрнестова, 1979) Изменяли интенсивность попощения каждого раствора на инфракрасном спектрометре модели "Jasco JR - S" (Япония) в интервале длин волн 2800-3200 см 1 Одну кювету (из кристаллов NaCl) заполняли ССЦ, предварительно пропущенного через колонку с окисью алюминия (кювета сравнения), другую — исследуемым раствором Содержание нефти рассчитывали методом базисной линии Последнюю проводили как касатечьную к основанию двух пиков, соответствующих симметричным и асимметричным валентным колебаниям -СНу- и -СН3- групп Анализ вели по полосе асимметричных валентных колебаний метиленовых групп (2926см ')

Биологический тест на остаточную токсичность почвы определяли по прорастанию семян тест - растений, кресс-салата (Lepidium sativum) и пшеницы сорта "Московская - 35" (Triticum durum) В сосуды вносили семена тест растений Фиксировали процент проросших семян и длину проростков Пороговым считали промежуток времени, при котором прорастает лишь 70% (LD70) семян тест-растения По всхожести семян и скорости роста тест - растений су-

дили об остаточной токсичности почвы в сравнении с контролем (интактная и нефтезагрязненная почва без биопрепарата). .

Повторность опытов трехкратная. Результаты экспериментов обрабатывались методами математической статистики и выражались в виде графиков и таблиц с помощью пакета программ «Microsoft Excel». Обработку данных проводили с помощью программы "Stars", считали достоверный порог значимости полученных значений при Р>0,05 (критерий -' Сгьюдента). Текстаяого-редакционную работу выполняли с помощью пакета "Microsoft Word 2000".

Результаты исследований и их обсуждение Выделение и отбор штаммов микроорганизмов, активно усваивающих углеводороды нефти

Методом накопительных культур из различных субстратов (искусственно загрязненные нефтью дерново-подзолистая и черноземная почвы; красновато-бурая почва; аллювиальный песок; компост высокого нагрева и образцы нефти Сугмутского и Харьягинского месторождений) на минеральной среде Раймонда с нефтью и 1% NaCl выделены 30 наиболее активных штаммов углеводоро-докисляющих микроорганизмов. При отборе использовали следующие показатели: помутнение среды (водной фазы), появление пигментов, образование осадка, эмульгирование и распад нефти, а также снижение рН культуральной жидкости.

При первичном скрининге общего числа выделенных углеводород-окисляющих микроорганизмов оставлены 13. Газохроматографический анализ показал их высокую активность в деструкции насыщенной фракции углеводородов (табл. 1). Для дальнейших исследований методом селективного аналитического отбора и по данным газохроматографического анализа нами оставлены наиболее активные штаммы микроорганизмов. Критериями отбора активных деструкторов служили такие показатели, как избирательное удаление нормальных н-алканов в насыщенной фракции нефти и снижение соотношения коэффициента труднодоступных соединений нефти пристан/фитан (табл. 1 ).

Определена таксономическая принадлежность активных штаммов микро-

организмов В автореферате дана их краткая характеристика

- Культуры с зеленовато-синей пигментацией, грамотрицательные, клетки палочковидные, вегетативные клетки подвижны; спор не обнаружено. Колонии вызывают посинение сред - Pseudomonas puttda (Смирнов, 1981, Берджи, 1997; Вейант и др, 1999)

- Культуры с розовой или кремовой пигментацией, грамположительные, аэробы, с палочковидными или нитевидными, часто ветвящимися клетками (810-12 мкм), складывающимися в характерные V-формы Воздушный мицелий отсутствует - Rhodococcus ruher (Берджи, 1997)

- Гифы септированные, бесцветные, многократно супротивно разветвленные конидиеносцы, фиалиды вздутые у основания, расположенные на кони-диеносце в большинстве под углом 90° и несущие шаровидные конидии, собранные в головки, каждая из которых состоит из 10-20 одноклеточных бесцветных конидий Колонии зеленого цвета с участками рыхлой войлочной поверхности - Tnchoderm citrinoviride fDomsch et al, 1980, Gary Samuel's, 2000)

- Гифы септированные, бесцветные, фиалоконидии удлиненные, одноклеточные, почти бесцветные, -ишпсоидные, размером 6-9 ч 2,5-4,5 мкм Конидии сгруппированы в цепочки и козонки, а массе дают зеленую окраску Колонии бетые, цилиндрические, диаметром 5 6 мм С возрастом их диаметр увеличивается до 15-20 мм и они становятся серыми - Kfetarrbvzium amsophae (Domsch et al, 1980, Саттон и др, 2001)

- Гифы септированные, бесцветные Конидиеносцы 250-400 мкм в высоте, изогнутые, бесцветные Апикальное расширение вздутий полушаровидное, практически полностью покрытое фиалидами Стеригмы двухъярусные, располагаются рыхло в 2 яруса Конидии шаровидные 2,5-3,5 мкм Колонии дымчатые, серовато-зеленые, быстрорастущие По фактуре колонии шерстистые - Aspergillus carneus (Domsch et al, 1980, Билай, 1988)

Выделенные активные цггаммы углеводородокисляющих микроорганизмов депонированы в коллекции микроорганизмов кафедры микробиологии Московской сельскохозяйственной академии им. К А Тимирязева под кодом Asp carneus SU-TM-03, Met anisopliae AF-78 Trich citrinoviride VS-89, Rh ruber PS-02, Ps putida SP-203

s

Таблица 3. Влияние аэрации на рост углеводородокисляющих

микроорганизмов

м Температура Штамм — 16°C 28°C

Аэрирование Отсутствует 100 об /мин Отсутствует 100 об/мин

1 Ps. putida SP-203 8-5 10 8-5 10

2 Rh. ruber PS-02 8-5 ' 10 - 10 10

■3 Trich. citrinoviride VS-89 4-3 2-1 8-5 4-3

4 Asp. cameus SU-TM-02 8-5 4-3 4-3 2-1

5 Met. anisopliae AF-03 4-3 2-1 10 4-3

Примечание: рост микроорганизмов оценивши в условных единицах (баллы) (Хомякова, 2003). '

Рост бактерий Ps. putida SP-203 и Rh. ruber PS-02 при аэрации заметно возрастает (как при 1б°С, так и при 28°С) (таб. 3). Обратно противоположная тенденция роста и развития при аэрации наблюдается у углеводородокисляю-щих микромицетов: Trich. citrinoviride К?-89, Asp. cameus SU-TM-02 и Met. anisopHae AF-03. Стационарные условия роста являются наиболее оптимальными дня их развития.

Таким образом, все выделенные нами штаммы углеводородокисляющих микроорганизмов являются строгими аэробами с оптимальной температурой развития в28°С.

Химическая трансформация углеводородов нефти выделенными микроорганизмами

Нефть - сложная смесь алканов (парафиновых и ациклических насыщенных углеводородов), нафтенов и аренов различной молекулярной массы. Дополняют их кислородные, сернистые и азотистые производные углеводородов (Петров, 1984). В настоящее время известно, что окислению могут быть подвергнуты практически любые углеводороды, причем скорость их деградации прямо зависит от вида микроорганизма (Киреева, 1995; Корнелли, 2003).

Результаты проведенных нами газохроматографических исследований

и

выявили, что ассоциация микроорганизмов (Ps putida SP — 203, Rh. ruber PS — 02, Trich. citrinovmde VS - 89, Asp carneus SU - TM— 02 и Met amsopliae AF -05) при росте в жидкой среде Раймонда с 5% нефти Харьягинского месторождения и 1% NaCl (t=26-28°C) в течение 10 дней разлагает более 50% углеводородов нефти.

На 5 сутки отмечается снижение содержания нефти на 18-25% Происходит избирательное удаление н-алканов состава Си - С30 (с 44,1% до 26,3%), снижается соотношение коэффициента труднодоступных соединений нефти пристан/фитан с 1,14 до 1,02.

На 10 сутки отмечается снижение содержания углеводородов нефти более чем на 50%. Суммарная концентрация нормальных алканов состава Сп — Сю уменьшается с 44,1% до 13,3%

Рис 1 Хроматограмма насыщенной фракции контрольного образца нефти Харьягинского месторождения

J jJJLllll

у.,,,., ., ,[.„

sbsss ggg gfee a

Рис. 2 Окисление углеводородов нефти ассоциацией микроорганизмов Хроматограмма насыщенной фракции нефти Харьягинского месторождения после 10-дневной инкубации ассоциацией аэробных углеводородокисляющих микроорганизмов

Увеличивается значение изопреноидного коэффициента с 11,05 до 18,7 Это свидетельствует о первом этапе окисления, когда происходит избиратель-

Таблица 1. Изменение состава насыщенных фракций углеводородов нефти в процессе микробной деградации.

Результаты газохроматш рафического анализа

Исследуемый микроорганизм пристан/ фитан пристан/ нС17 фитан/ нС1В % н-алканов в насыщ фракции % ацикл изопрен, в насыщ фракции ациклич. изопренУ н-алканы

контроль (нефть А) 1,14 0,76 0,76 44,1 11,05 0,25

Bacillus spp 1 05 1 16 1,71 35 51 12 56 0,35

Candida spp 106 1 89 1 68 32 25 14 21 0 44

Arthrobacter spp 1,01 1 02 1 35 35 55 13 32 0 37

Rhodococcus spp 0,85 2,54 1,91 18,56 19,97 1,07

Aspergillus spp. 0,98 1,98 1,51 29,13 15,62 0,56

Trihoderma spp 0,99 2,01 1,52 20,18 15,5 0,76

Pseud aeruginosa 1 05 1,16 1,01 29,9 122 04

Micrococcus spp 1,08 1,15 1,14 28 9 138 0 47

Fusarium spp 1,03 1 08 1 86 30 2 12 5 0 41

Mhetarisium spp 0,88 2,98 3,49 18,33 19,9 1,08

Pseudomonas putida 0,96 2,47 2,88 20,15 16,88 0,83

Nocardia spp 1,09 1,05 1 98 35 8 1001 0 27

Рост выделенных углеводородокисляишшд микроорганизмов

Характер роста микроорганизмов обусловлен видом микроорганизма, условиями культивирования и особенностями углеводорода (Корнелли и др., 2001).

Таблица 2. Рост выделенных углеводородокисляющих микроорганизмов при разных температурных режимах

JV5? —■----Температура Штамм ~~--- 8°C 16°C 28°C 37°C

1 Pseudomonas putida SP-203 8-5 8-5 10 8-5

2 Rhodococcus ruber PS-02 8-5 to 10 4-3

3 Trichoderma citrinoviride VS-89 4-3 8-5 10 4-3

4 Aspergillus cameus SU-TM-02 4-3 10 8-6 1-2

5 Metarrhizium anisopliae AF-03 1-2 4-3 10 4-3

Примечание:_рост бактерий и микромщетов оценивали в условных единицах (баллы) (Хомякова, 2003). За 10 баллов принимали активный быстрый рост с максимальным накоплением биомассы, в 8-5 баллов оценивали средний рост, в 4-3 - слабый рост, в 1-2 - очень слабый и медленный рост. 0 баллов - отсутствие роста за 20 дней культивирования.

Нами установлена психроактивность выделенных штаммов и способность нормально расти при температуре от 8°С до 16°С (табл. 2). Бактериальные штаммы Rh. ruber PS-02 и Ps. putida SP-203 способны к активному росту и использованию нефти при пониженной температуре 8°С. Микромицеты относятся к мезофильным микроорганизмам. Оптимальная температура для развития микромицета Asp.carneusSU-TM-02 - I6°C. ¡

В" настоящее время доказано, что углеводородокисляющие бактерии способны окислять углеводороды нефти как в присутствии, так и в отсутствии кислорода. Однако, основная роль принадлежит аэробному процессу биодеградации (Самосова и др., 1982). ;

ное удаление легкодоступных н-алканов из насыщенной фракции нефти. В ходе окисления углеводородов снижается коэффициент пристан/фитан (с 1,14 до

I 2

0,69), меняется нефтяной паспорт и общий химический тип нефти (А -* А'), что, предположительно, может рассматриваться в качестве основного геохимического процесса, приводящего к эволюции нефтей и определяющего, таким образом, большое разнообразие их состава в природе (Петров, 1984)

Таким образом, результаты изучения трансформации нефти выявили, что ассоциация микроорганизмов (Ps putida SP - 203, Rh ruber PS - 02, Tnch citri-novtride VS - 89, Asp carneus SU- TM- 02 и Met m amsopltae AF - 03) обладает высокой активностью в деструкции сырой нефти и ее легких фракций (н-алканов)

Особенности интродукции углеводородокисляющнх микроорганизмов в компост и почву

Эффективность биологической очистки напрямую зависит от соблюдения и выполнения всех тонкостей процесса интродукции микроорганизмов в субстрат и далее в нефтезагрязненные системы (Гузев, Звягинцев, 1998)

Упеводородокисляющие микроорганизмы, составляющие основу разработанного нами биопрепарата, обчадают высокой жизнеспособностью при внесении их в почву Титр бактериальных клеток при инокуляции в компост составляет 1х1012 КОЕ/г, спор микромицетов - 1x10s КОЕ/г По истечении 5, а далее 10 суток наблюдается постепенное снижение количества интродуцирован-ных микроорганизмов, что можно объяснить временной адаптацией внесенных в субстрат штаммов Данная тенденция снижения численности интродуциро-ванных микроорганизмов стабилизируется лишь к 30 суткам и составляет в среднем от 1х106 до 3,5х10п КОЕ/г. Также выявлено отсутствие Asp carneus SU — TM— 02 в субстрате на 30 сутки

Численность подавляющего большинства микроорганизмов после внесения их в нефтезагрязненную почву стабилизируется на определенном уровне В редких случаях популяция гибнет. Как правило, гибель отмечается у микроор-

ганизмов, которые не могут переносить низких значений рН. Они отличаются большой интенсивностью обмена и требуют непрерывного притока питательных веществ (Киреева и др., 1997). .

Таблица 4. Численность углеводородокисляющих микроорганизмов

в компосте

№ Штаммы Титр иннокулированных в субстрат микроорга-' - низмов (КОЕ/г субстрата)

В день ин- HOKVJUtUUU Через 5 cvmoK Через 10 суток Через 30 суток

1. Ps. putida SP - 203 (n=9) 1,1х1012± 9,8 *1,8 х Ю" ± 8,8* 2,2 х iolg± 7,8* 1,7 х Ю10± 8,9

2. Rh. Ruber PS- 02 (n=9) 1,4 х 1012± 10,1 3,5 х 10" ± 10,0* 2,8 х 10" ± 10,5*' 1,8 х Ю11 ± 11,0

3. Met. Anisopliae AF-78 (n=9) 1,1 х Ю8± 10,0 4,1 х 10'± * 9,1 5,2 х 10" ± 10,1* 1,8 х 10° ± • ' 5,5

4. Trich. citrinoviride VS-89 (n-9) 1,4* 10s ± 7,5 8,9 х 10'± • 8,1 6,8 х Ю'± * 9,7 4,9 х ю' ± 10,0

5. Asp. carneus SU — TM— 03 (n=9) Uxio'i 7,5 1,1 х Ю'± ♦ 6,5 0,5 х 10" ± * 5,7 0x0°'

6. Ps. putida SP-203 + Rh. ruber PS - 02 (n=9) l^x 101Jt 7,5 9,8 х ю" ± * 7,7 7,8 х ю" ± 5,8 3,5 х Ю11 ± 10,3*

7. Met. anisopliae AF — 78 ■f Trich .citrinoviride VS-89 + Asp.carneus SU - TM- 03 (n=9) 1,2* Ю'± 8,5 4,2 х Ю7± 10,0* 2,1 х 106 ± * 8,5 1 х 10® ±9,6

8. Все штаммы вместе (n=9) 1,2 х 101О± 7Д 9,5 х Ю®± # 1U 8,0 х 10® ± 7,8 6,6 х Ю9 ± 10,2

Примечание: п — количество значений в выборке; М±ш — средняя арифметическая и её ошибка; - достоверная разница (р > 0,5) при сравнении показателей во времени (5—»10—»30 дней). , '•...■■

Выживаемость микроорганизмов изучена путем внесения соответствую-' щих штаммов с компостом в различные типы нефтезагрязненных почв. Активная приспосабливаемость определена у бактериальных штаммов, менее активная - у микромицетов. Высокой жизнеспособностью обладает ассоциация Ps. putida SP - 203 и Rh ruber PS - 02. Данная ассоциация сохраняет высокую численность даже по истечении 4 месяцев эксперимента. Наиболее благоприятные условия для развития интродуцированкых микроорганизмов и наибольшая чис-

тенность выявлены в нефтезагрязненной черноземной почве Наибольший процент интродуцированных микроорганизмов отмечен в почвах, загрязненных нефтью Сугмутского месторождения. Установлено отсутствие Asp carneusSU-

тм-яз..

Таким образом, выявлена высокая жизнеспособность углеводородокис-лякицих микроорганизмов (за исключением штамма Asp carneus SU-TM-03) при интродукции их в компост и нефтезагрязненные почвы.

Конструирование микробного консорциума для биопрепарата, разрушающего нефть

Одним из главных способов интенсификации микробного разложения углеводородов нефти является внесение различных биопрепаратов, содержащих биомассу специально подобранных штаммов углеводородокисляюших микроорганизмов В России наиболее известными биопрепаратами на основе углево-дородокиспяющих микроорганизмов является «Путидойл (Евдокимова и яр, 1994), «Псевдомин» (Ьмцев, Станкевич, 2002), «Экойл» (Ермоленко и др, 1994), «Деворойл» (Сидоров, Борзенков и др, 1997) и т д Однако, в литературе практически отсутствуют упоминания о применении штаммов микромицетов как одних из наиболее перспективных деструкторов нефти

Для усовершенствования биотехнологических методов рекультивации нефтезагрязненных почв нами был сконструирован биопрепарат на основе штаммов угле во доро до кисл яющих микроорганизмов Ps s putida SP-203, Rh. ruber PS-02, Trich citrinovmde VS-89 и Met anisophae AF-03 и органического субстрата, который показал хорошие результаты в лабораторных экспериментах по очистке почвы от сырой нефти В качестве субстрата использовали компост высокого нагрева. После стерилизации компост заражали чистыми культурами углеводородокисляюших микроорганизмов В стерильные пакеты с субстратом отдельно вносили бактериальные разведения (Часть №1, Титр=1х101гКОЕ/г) и разведения спор микромицетов (Часть №2, Титр=1х108 КОЕ/г) (рис.3).

Рис. 3. Структура и состав биопрепарата «Макродегрин» на основе ассоциации углеводородокисляющих штаммов микроорганизмов

Влияния нефти на динамику численности различных групп микроорганизмов

Эффект воздействия нефти на почву проявляется в изменении комплекса почвенных микроорганизмов в целом. Нефть оказывает селекционное действие на почвенную микробиоту, вызывая изменение состава, численности и организации микробного сообщества почвы. (Пиковский, 1991; Славина, 1992; Кирее-ва, 2001). . .

В лабораторном опыте по изучению динамики численности микроорганизмов в нефтезагрязненной почве с дополнительным внесением биопрепарата на основе углеводородокисляющих штаммов установлено: "

Общее содержание микроорганизмов в нефтезагрязненных почвах в течение первых недель значительно снижается. При этом снижается доля доминирующих микроорганизмов контрольной почвы: Вас. mycoides, Mucor spp. и др, и возрастает доля Ps. spp., Penicillum spp., Asp. Spp и др. Внесение в почву углеводородокисляющих микроорганизмов обеспечивает на начальном этапе

эксперимента увеличение общей численности микроорганизмов в вариантах с внесением биопрепарата

По истечении двух и более шести месяцев эксперимента наблюдается достоверное увеличение числа гетеротрофов, микромицетов и углеводородо-кисляющих микроорганизмов в исследуемых почвах с внесением биопрепарата. В вариантах без дополнительного внесения углеводородокисляющих микроорганизмов общая численность была на порядок ниже.

Таким образом, дополнительное внесение биопрепарата повышает общую численность исследуемых групп микроорганизмов Также нефть, за счет содержания веществ, стимулирующих рост микроорганизмов, активирует жизнедеятельность гетеротрофной и углеводородокисляющей микрофлоры Особенности мнкробоценозов нефтезагрязненных почв В задачу наших исследований входило описание микробных ценозов кефтезагрязненных почв Данные иссдетования по изучению нефтезагрязнен-ных почв проведены нами впервые и представляют не только научный, но и практический интерес

Наблюдения, проведенные в течение 10 месяцев эксперимента, показывают на доминирование в микробных пейзажах нефтезагрязненных почв гифов грибов(рис 4)

Рис.4

• •» г'

« I ч

Рис.5

Рис. 6 Рис.7

Микробоценозы нефтезагрязненных почв (хЮОО) Часто обнаруживается обрастание мицелия бактериальными клетками, что неоднократно встречается в вариантах с нефтезагрязненной черноземной

почвой. В одних случаях это приводит к гибели и лизису гриба, в других - оба микроорганизма выигрывают от такого тесного сожительства.

Бактериальная флора нефтезагрязненных почв характеризуется четкой дифференцировкой во времени. В начальные стадии (до 2 мес.) в загрязненных нефтью почвах доминируют представители палочек разной величины (рис.5). Далее (по истечении 2 месяцев) главенствующее место занимают гифы актино-мицетов и грибов. В вариантах без внесения биопрепарата часто доминируют дрожжеподобные клетки (рис.6).

Отмечена своеобразность ценозов аллювиального песка. Здесь преобладают гифы актиномицетов (рис.4) в течение практически всего эксперимента. В некоторых вариантах с нефтезагрязненным песком наблюдается обилие кокковых форм и палочек, в частности, в вариантах с внесением углеводородокис-ляющих микроорганизмов.

Рассматривая распределение микроорганизмов в почве необходимо подчеркнуть, что в вариантах с внесением биопрепарата в исследуемые почвы и песок наблюдается перераспределение основных доминирующих форм микроорганизмов нефтезагрязненной почвы на представителей интродуцированной ассоциации (Тпск сИгтохтск-, рис. 7).

Исследование степени деградации нефти в почве

Первоначальное содержание нефти в почве рассматривали как 100%. К концу эксперимента (через 6 месяцев) наблюдалось достоверное снижение количества нефти во всех исследуемых вариантах (рис.8). Количество нефти снизилось в среднем на 50-60%. В вариантах с внесением биопрепарата содержание нефти понизилось на 79-82%. С наибольшей эффективностью процесс деградации нефти наблюдался в дерново-подзолистой почве (73-82%), менее активно - в черноземной почве (70-79%), наименее слабо - на речном песке (4045%).

Следует отметить, что в нефтезагрязненных почвах более эффективным процесс окисления установлен в вариантах со среднепарафинистой нефтью

Сугмутского месторождения В загрязненном нефтью аллювиальном песке наиболее эффективно процесс деградации наблюдался с высокопарафинистой нефтью Харьягинского месторождения (рис 8)

Дерново-подзолистая почва Черноземная почва Аллювиальный песок

%0 82 79,7

1131 34414451 541232354245525513333643465356

Варианты опыта

Рис. 8. Изменение содержания нефти по сравнению с первоначальным внесением, %. (Примечание штриховка - варианты с внесением нефти Харьягинского месторожде шя бе > штриховки - нефть Сугмутского месторождения )

Биологический тест на токсичность почвы

При оценке токсичности загрязненных нефтью почв успешное применение находят фитопробы с тест - растениями (Фомченков и др , 1996)

Нами оценивалась степень фитотоксичности нефтезагрязненной почвы В качестве тест объектов использовали семена тест — растений- кресс-салата (Lepidium sativum) и пшеницы сорта «Московская - 35» (Tnticum durum)

Выявлено, что токсическое действие нефти на всхожесть семян тест -растений проявляется при концентрации 3% от веса почвы. Семена тест-растений частично теряют всхожесть сразу после внесения нефти. Наименьшая всхожесть наблюдается в вариантах с песком, что свидетельствует о наибольшем угнетающем действии ксенобиотика К четвертому месяцу исследований происходит полное снижение фитотоксичности Всхожесть семян составляет 65-80% в вариантах без внесения биопрепарата В вариантах с внесением ассоциации углеводородокисляющих микроорганизмов всхожесть семян достигает от 85 до 95% в зависимости от типа почвы Наибольшее снижение токсичности отмечается в вариантах с внесением среднепарафинистой нефти Сугмутского

месторождения.

В результате действия разработанного нами микробиологического препарата на основе ассоциации углеводородокисляющих микроорганизмов наблюдается снижение токсичности нефтезагрязненной почвы до уровня, не препятствующего росту и развитию тест-растений.

Таким образом, в настоящей работе представлена дополнительная информация об углеводородокисляющих микроорганизмах и испытания нового биопрепарата, показавшего высокую эффективность при очистке почв от нефти. Данные исследования открывают дальнейшие перспективы его практического использования.

1 ВЫВОДЫ

1. Выделены микроорганизмы, усваивающие углеводороды нефти в качестве единственного источника углерода. Данные микроорганизмы изучены и идентифицированы: Pseudomonas putida SP-203, Rhodococcus ruber PS-02, Trichoderma citrinoviride VS-89, Metarrhizium anisopliae AF-78, Aspergillus carneus SU-TM-03. Являясь психроактивными, они могут быть использованы при очистке нефтезагрязненных почв в районах с непродолжительным теплым периодом.

2. Разработан оригинальный способ культивирования углеводородокисляющих микроорганизмов на компосте высокого нагрева в качестве органического субстрата. На основе выделенных штаммов микроорганизмов создан биопрепарат для борьбы с нефтезагрязнениями, на который оформляется патент Российской Федерации.

3. Результаты газохроматографического анализа и ИК-спектроскопии служат показателями изменения фракционного состава нефти при культивировании микроорганизмов на модифицированных питательных средах с добавлением нефти. Газохроматографический анализ подтверждают высокую углево-дородокисляющую активность выделенной ассоциации (более 50% н-алканов за 10 дней культивирования).

4. Модифицирован и впервые использован метод Н.Г. Холодного при изучении динамики формирования структуры микробного ценоза, плотности обрастания и распределения доминирующих микроорганизмов в различных типах нефтезагрязненных почв.

5 Выделенные микроорганизмы-деструкторы, участвующие в кометабо-лическом разложении сырой нефти, существенно снижают токсичность почв и способствуют не только прорастанию семян, но и росту тест-растений (кресс-салата и пшеницы)

6 Результаты эксперимента по очистке почв биопрепаратом показывают высокую активность микроорганизмов по отношению к углеводородам нефти (до 85% от начального содержания в почве) Разработанный биопрепарат может быть рекомендован как один из эффективных при очистке почв для ускоренной деструкции нефти и восстановления ее биологической активности

7 Предложенная стратегия рекультивации нефтезагрязненных почв базируется на усилении биологической активности почв путем внесения ассоциации культур микроорганизмов-деструкторов

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1 Павликова Т А Биоремидиация почвы ассоциацией углеводородокис-ляющих микроорганизмов //Материалы Международной научной конференции «Агрохимические аспекты повышения продуктивности сельскохозяйственных культур» - «Бюллетень ВИУА №16» - M Агроконсалт, 2002 - С 445-447

2 Сидоренко О Д , Войно JI И, Павликова Т А Влияние нефти на микрофлору почв и подбор ассоциации микроорганизмов, способных к ее деструкции //Сб докл Всероссийской научно-технической конференции- выставки с международным участием «Качество и безопасность продовольственного сырья и продуктов питания» M Изд-во МГУП, 2002 -С 176-178

3 Сидоренко О Д, Павликова Т А Деградация нефти ассоциацией угле-водородокисляющих микроорганизмов //Доклады ТСХА Вып 275 M Изд-во МСХА,2003 -С 265-272

4 Войно JIИ, Павликова Т А, Сидоренко О Д Устойчивость и изменение численности почвенных микроорганизмов при нефтезагрязнении почвы //Сб докл Всероссийской научно-технической конференции- выставки «Высокоэффективные технологии, методы и способы для их реализации» - M • Изд-во МГУП, 2003 -С 160-162

Зак 217

Уел печ л 1 16

АНО «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул Тимирязевская, 44

Тир 100 экз