Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Деградация гербицидов 2,4-Д и 2,4,5-Т культурой Nocardioides simplex 3E

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Деградация гербицидов 2,4-Д и 2,4,5-Т культурой Nocardioides simplex 3E"

РГ6 од

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИ! МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

Козырева Людмила Павловна

УДК 579. 873. 6. 0117. 7

ДЕГРАДАЦИЯ ГЕРБИЦИДОВ 2,4-Д И 2,4,5-Т

КУЛЬТУРОЙ НОСШЮШЕЗ БИОРИХ ЗЕ

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Цущино - 1993

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАБ.

Научный руководитель - доктор биологических наук проф. Л. А. Головлева

Официальные оппоненты - д. б. к. Н. А. Ковдэенко

к. С. н. Э. Г. Суровцева

Ведущее учреждение - Институт почвоведения и фотосинтеза РАН

Защита диссертации состоится и^ОЯЛ^- 19дз г>

в М час. мин. на заседании Специализированного

Совета Д 002.69.01 при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, г. Пушено, Мэсковской области.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Автореферат разослан " ^" ЛьСЬА- 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

д. б. н. В. М. Вагабов

Актуальность проблемы. В последние десятилетия огромное количество синтетических органических соединений поступает в окружающую среду в результате интенсивной деятельности человека. Существенная роль в их минерализации принадлежит микроорганизмам. Вместе с тем, многие из этих соединений устойчивы к микробному разложению и способны накапливаться, представляя серьезную опасность для окружающей среды и здоровья человека. Среди них наибольшую опасность представляют полихлорированные соединения, такие, как полихлорбифеншш, ддт, полихлорфенолы, 2,4,5-Т. Эти ксенобиотики кроме своей персистентности имеют еше одно, весьма отрицательное свойство - способность метабо-лизироваться с образованием чрезвычайно токсичных интермедиа-тов типа подихлордиоксинов или полихлордибенз(о)фуранов. Биологический метод очистки, с использованием как природных, так и геюга-инкэнерных штаммов микроорганизмов-деструкторов, наиболее эффективен для детоксикации такого рода соединений. В последние годы он приобрел большое значение, особенно для био-ремедиации загрязненных почв, промышленных стоков и грунтовых вод. Изучение механизмов биодеградации устойчивых поллютантов представляет значительный интерес.

Состояние вопроса, цель и задачи исследования. В последние годы достигнут значительный прогресс в выделении микроорганизмов, разлагающих особо устойчивые соединения, например такие как, полихлорбифенилы (Ahmed & Focht, 1973; Mokross et al., 1990) и полихлорфенолы (Chu & Kirsch, 1973;. Apajalahti et al., 1986; Golovleva et al., 1991; Kiychara et al., 1992). Более десяти лет назад методом молекулярного бридинга был получен пггамм Pseudomonas cepacia AC 1100, осуществляющий полную утилизацию такого персистентного соединения, как 2,4,5-Т (Kilbane et al., 1982). Штамм характеризовался способностью разлагать хлорзамещенные фенолы, но не был способен минерализовать 2,4-Д С аналог 2,4,5-Т). В лаборатории энзиматической деградации органических соединений ШЕЙ РАН был выделен штамм Nocardio-ides sinplex ЗЕ, разлагающий и 2,4,5-Т и 2,4-Д ( Головлева, Шрцова, 1990). Это свойство штамма- утилизировать оба гербицида - является уникальным и не встречается у других известых деструкторов этих токсикантов.

- г -

Основной целью диссертационной работы было изучение деградации гербицидов 2,4-Д и 2,4,5-Г культурой Nocardioides simplex ЗЕ.

В задачи данного исследования входило:

1. Изучение динамики разложения хдорфеноксиалкановых кислот штаммом N. simplex ЗЕ.

2. Установление путей деградации 2,4-Д и 2,4,5-Т.

3. Исследование возможности разложения смеси 2,4-Д и 2,4,5-Т штаммом N. simplex ЗЕ.

4. Анализ ключевых ферментов разложения данных гербицидов у штамма N. simplex ЗЕ.

5. Оценка возможности применения штамма N. simplex ЗЕ для Сиоремедиации почв, загрязненных 2,4-Д и 2,4,5-Т.

Научная новизна. Впервые продемонстрирована способность природного штамма N. simplex ЗЕ разлагать смесь гербицидов 2,4-Д и 2,4,5-Т. Показано существование нового пути метаболизма 2,4-Д, включаодэго образование из 3,5-ДХПК тригидроксилиро-ванного производного - 3,5- дихлоргидроксигидрохинона. Показано участие гидроксигидрохинон 1,2-диоксигеназы в расщэплении ароматического кольца в процессе разложения данных гербицидов. Установлено, что способность N. simplex ЗЕ разлагать смеси 2,4-Д и 2,4,5-Т обусловлена сходством метаболических путей деградации 2,4-Д и 2,4,5-Т.

Практическая значимость. Штамм N. simplex ЗЕ является уникальным природным штаммом, использующим широкий спектр хлор-ароматических соединений в качестве единственных источников углерода и энергии. ПЬцюкий метаболический потенциал штамма позволяет предложить его к использованию для очистки загрязненных территорий и промышленных сточных вод предприятий, выпускающих гербициды и хлорфэюлы. Показано ускорение разложения 2,4-Д и 2,4,5-Т в почве при интродукции штамма N. simplex ЗЕ.

Апробация работа Основные положения диссертационной работы были представлены на 4-ой Всесоюзной научной конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (Пущине, 1992), 5-ой конфе-

ренции Российской Федерации "Новые направления биотехнологии" (Цущино, 1992).

Публикации. ГЬ материалам диссертации опубликовано 5 работ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (2 главы), экспериментальной части (4 главы), обсуждения результатов, выводов и списка литературы, содержало литературных источников, в том числе /69

иностранных. Работа излояена на ¿V страницах машинописного текста, включая б таблиц и рисунков.

Сократ нкя, используеше в работе.

2,4,5-Т - 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная кислота

2,4-Д - 2,4-дихлорфэноксиуксусная кислота

2,4,5-TKD - 2,4,5-трихлорфенол

2,4-ДХО - 2,4-дихлорфенол

3,5-ДХПК - 3,5-дихлорпирокатехип

2,5-ДХГХ - 2,5-дихлоргидрохинон

6-ХГГХ - 6-хлоргидроксйгидрохинон

тех - тонкослойная хроматография

взях - высокоэффективная дидкостная хроштография

кзхоодп и отцци

Условия культивирования микроорганизма Для культивирования N.sinplex ЗЕ использовали кинеральнуп среду, не содержащую ионов хлора, состава (г/л): КИ^РСЦ- 0,1; (NfyjgНРО4- 2,0; Na2S0/, -0,1; i&SO^- 0,3; KNO5-I; рН среды 7,0. Источники углерода вносили в следующих концентрациях (г/л) : 2,4-Д - 0,25; 0,5; 1,0-, 2,0; 2,4,5-7 -0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 2,4-®® и 2,4,5-TXD вносили дробно до конечной концентрации 0,163 (1 мЫ) и 49,бмг/л (0,25 мМ), соответственно. Ацетат добавляли в концентрации 1 г/л. В качестве индукторов вносили 2,4-Д и 2,4,5-Т в концентрации 0,1 г/л. Культивирование проводили на качалке в колбах Эр-ленмейера, содержащих 200 ил среды, при 180 об/мин и 29° С. Рост культуры контролировали нефелоыетрически на фотоэлектро-колориметре 0ВК60 с зеленым светофильтром.

Отмытые клетки штамма получали как онисано ранее (Golovleva

et al., 1990).

Методы анализа 2.4-Д. 2,4,5-Т и юс метаболитов. Идентификацию продуктов разложения 2,4-Д и 2,4,5-Т проводили, используя методы ТСХ, ЕЭЖХ, масс-спектрометрии, УФ- и ИК-спектроскопии, как описано ранее (Golovleva et al., 1990).

Количественное определение хлорфеноксиалкановых кислот и продуктов их деградации проводили при помощи ЕЭЖХ в системе растворителей метанол : 5мЫ KH^PCtyípH 2,0) 80 : 20 (об/об), используя метод внешних стандартов.

Концентрацию ионов хлора определяли при помощи хлорселек-тивного электрода на анализаторе ионов "Ion Analyzer ЕА940" (Orion Research Inc., Cambridge MA, США) или спектрофотометри-ческим методом по Florence et al, 1971.

Методы определения ферментативных активностей. Активности ферментов определяли в бесклеточных экстрактах и с отмытыми клетками штамма N. simplex ЗЕ. Определение проводили спектрофо-тометрически на спектрофотометре "Specord М-40". Активность пирокатехаэы (КФ 1.13.11.1) определяли модифицированным методом Хаяиси с соавторами (Hayaishi et al., 1957); метапирокате-хазы (МПК) (КФ 1.13.11.2) - по методу Kojima et al., 1961; протокатехоат 3,4-диоксигеназы (ПКК 3,4- ДО)(КФ 1.13.11.3) -по методу Fujuisawa, Hayaishi, 1968; протокатехоат 2,3-диокси-геназы (ПКК 2,3-ДС) (КФ 1.13.11) - по методу Crawford, 1975; гомогентизат оксигенааы (ГГО) (КФ 1.99.2.5) - по методу Adachi et al., 1966; гентизат 1,2 -диоксигеназы (ГДО) (КФ 1.13. 11.4) методам Crawford et al., 1975. Определение активностей ферментов модифицированного орто-пуги - муконатциклоизомеразы, диен-лактонгидродазы и малеидацегатредуктаэы, проводили по описанным Елеманном с соавторами методикам (Schlorrann et al, 1990). Активности всех ферментов выражали в наномолях превращенного (потребленного) субстрата в минуту в пересчете на 1 мг белка.

Определение активности гидроксигидрохинон 1,2-диоксигеназы (ГГХ 1,2-ДО) проводили полярографически (Sze, Dagley, 1984). Активность выражали в наномолях потребленного кислорода в минуту на 1 мг белка.

Активность дехлорирующего фермента определяли по убыли субстрата и выделению минерального хлора

Определение активности фермента, отщепляющего двууглеродный фрагмент проводили с отмытыми клетками, контролируя методом ВЭЖХ убыль хлорфеноксиалкановых кислот и образование соответствующих хлорфенолов. Активность рассчитывали в пересчете на белок. Белок определяли по Ьо»гу ег а1., 1951.

Условия проведения полевых экспериментов. Полевые эксперименты проводили в лизиметрах садово-огородной почвы размером 40 х 40 см, взрыхленных на глубину 10 см.

2,4-Д и 2,4,5-Т вносили в виде сильно разбавленных растворов натриевых солей в концентрациях 62,5 и 31,25 мг/кг почвы , соответственно. В лизиметры со смесью субстратов вносили по 31,25 мг/ кг почвы 2,4-Д и 2,4,5-Т. В опытные лизиметры также добавляли выращенную на ацетате 4-Д культуру N. зигр1ех ЗЕ в количестве, равном 1,0-1,5 х 10 кл/г почвы.

Определение содерлания 2,4-Д и 2,4,5-Т в почвенных образцах проводили методом ВЭЖХ, после экстракции почвенной вытяжки диэтиловым эфиром.

Определение численности клеток микроорганизмов в анализируемых образцах проводили по Звягинцеву (1980). N. яшр1ех ЗЕ идентифицировали по морфологии колоний, на чашках с минеральной средой, содержащей 2,4,5-Г (500мг/л).

РЕЗУЛЬТАТЫ И НХ ОЗСУВДНШЕ.

Рост N. зигр!ех ЗЕ на хлорфеноксиалкановых кислотах и продуктах их метаболизма. N. вапр1ех ЗЕ характеризуется способностью к росту на широком спектре хлораромагических соединений, однако 2,4-Д и 2,4,5-Т являются наилучшими ростовыми субстратами.

Показано, что рост штамма на 2,4-Д и 2,4,5-Т сопровождался убылью субстратов и выделением эквимолярного количества ионов хлора в среду к концу культивирования, что свидетельствовало о полноте утилизации гербицидов (рис.1). С наибольшей скоростью токсиканты разлагались в экспоненциальную фазу роста культуры.

Максимальные утилизируемые концентрации составляли 4 мМ для

Рис.1. Динамики роста N.sinplex ЗЕ на 2,4,5-Т (1) (А) и 2,4-Д (1) (Б), убыли субстрата (2) и выделения ионов хлора (3).

Ростовыми субстратами N. simplex ЗЕ явились также 2,4-ДХФ и 2,4,5-ТХФ, - предполагаемые метаболиты 2,4-Д и 2,4,5-Т. Показано, что они более токсичны, чем исходные хлорфеноксиалкано-вые кислоты, при этом особой токсичностью обладал 2,4,5-ТХФ. Добавление к растущэй культуре 0,08 мЫ 2,4,5-ТХФ полностью ин-гибировало ее рост.

В реальных условиях- в загрязненных почьах и промышленных стоках нередко содержатся смеси хлорфеноксиалкановых кислот и продуктов их трансформации. В связи с этим была исследована возможность штамма N. simplex ЗЕ разлагать смесь 2,4,5-Т и 2,4-Д. До настоящего исследования разложение смеси 2,4-Д и 2,4,5-Т природными штаммами не было продемонстрировано.

Цри одновременном внесении в среду 2,4-Д и 2,4,5-Т наблюдался активный рост N. sinplex ЗЕ. С ростом коррелировали

убыль субстратов и выделение стехиометрического количества ионов хлора (рис.2).

Показано, что подготовка инокулята и соотношение концентраций 2,4-Д и 2,4,5-Т в среде влияли на продолжительность лаг-фазы и скорость деградации токсикантов.

250р==щ

- Т Г 4 р S / ¡5 У £

бремя культи Виробсхни», су/пси Рис. 2. Влияние индукции 2,4,5-Т и 2,4-Д на разложение хлорфеноксиалкановых гербицидов культурой N. sinplex ЗЕ. Инокуляг: I - без индукции; II - с индукцией. 2,4,5-Т;

III - с индукцией 2,4-Д. 1- рост; 2 - выделение ионов хлора; 3 - убыль 2,4,5-Т(в), 2,4-Д (о).

Длительная лаг-фаза и наименьшая скорость разложения гербицидов в смеси была при использовании инокулята, выращенного на ацетате (рис.2,1). Индукция инокулята внесением 2,4,5-Т (рис.2, II) или 2,4-Д (рис. 2, III) сокрап^ла лаг-фазу и увеличивала скорость деградации гербицидов в смеси. При этом, использование для индукции 2,4-Д было более эффективным, чем использование 2,4,Б-Г . Изучение динамики потребления каждого компонента показало, что 2,4,5-Т и 2,4-Д усваивались культурой практически одновременно.

Цри изменении в среде концентрации 2,4-Д и 2,4,5-Т тенденция к их одновременному потреблению сохранялась, независимо от того, увеличивали ли концентрацию обоих гербицидов в равном соотношении, или увеличивали концентрацию одного из компонентов смеси. Шказано, что увеличение в среде концентрации 2,4,5-Т приводило к более длительной задержке роста и снижению скорости утилизации гербицидов.

Установление путей катаболизма 2,4-Д и 2,4,5-Т.

Используя методы ТСХ , ЕЭЖХ и масс-спектрометрии были идентифицированы начальные продукты деградации 2,4-Д и 2,4,5-Т.

ИНтермедиаты деградации 2,4-Д. Разложение 2,4-Д штаммом ЗЕ начиналось с отщепления двууглеродного фрагмента и образования

2.4-ДХФ. 2,4-ДХФ превращался затем в 3,5-ДХПК. Эти этапы деградации 2,4-Д характерны для большинства культур, разлагающих данный ксенобиотик. Дальнейшее превращение 3,5-ДХПК этими штаммами осувдэствляется по модифицированному орто-пути (Tiedje et al. , 1969; Schwine et al., 1988; Pieper et al., 1991). Однако, мы не обнаруживали продуктов, образующихся в результате функционирования этого пути. Используя отмытые клетки штамма и

3.5-ДХПК в качестве субстрата , обнаружены два последовательно образующихся продукта MI и MII. Метаболиты различались по хро-матографической подвижности (MI - Rf=0,67 и MII- Rf=0,15), однако оба проявляли характерные реакции на наличие ароматических ОН-групп и атомов хлора. На основании маес-спектрометрических данных доказано, что MI является продуктом парагидрок-

силирования 3,5-ДХПК - 3,5-дихлоргидроксигидрохиноном. Определение масс-спектрометрических характеристик МП, установление его элементного состава и сравнение с элементным составом М1 показало, что превращение М1 в МП сопровождается отщеплением атома хлора и присоединением трех атомов водорода. Подобной стехиометрии отвечает одна из возможных структур или соответствующие таутомерные формы:

f^NpH_ ^ОН г-^хОН _ ^ОН

oJv^JtiH но-Ц^он ОЧ^ФН но-Ц^он

С1 С1 С1 С1

G1 CI CI С1

Г^ЧРн— (^ури [^Чон _ (fSoH

о^Ам но-ч-Л)Н оК^он ноД^он

меон ,

Данные УФ ( ^-тах = 257 нм; хромофор: -С=£-С=С- и/или -С=С-С=0 ) И ИК-спектроскопии ( ОН: 3050-3450 см' ; СН : 28003000 си1-, "С=С-Н И/ИЛИ -С%С=0 : 1400 см"1; -С=0: 1720 см"1) не противоречат такой возможности.

Эти результаты позволили идентифицировать МП как хлортри-гидроксициклогексадиен.

Ингермедиаты деградации 2,4,5-Г. Разложение 2,4,5-Т штаммом N. simplex ЗЕ также начиналось с образования 2,4,5-ТХФ, появление которого было зафиксировано как в ростовых условиях, так и в экспериментах с отмытыми клетками. Мы предположили, что его дальнейшее превращение осуществляется по хлоргидрохиноновому пути, описанному для разложения полихлорфенолов (Haggblom, 1990). Для проверки данной гипотезы в лаборатории был синтезирован 2,5-ДХГХ и продемонстрировано его эффективное превращение отмытыми клетками штамма до нехлорированных алифатических продуктов (рис.3). К сожалению, мы не смогли их выделить и идентифицировать.

? m-

if 4L)

30

ч

ы 20

10

n

0 15 30 45 60 время инкубации, мин Рис.3. Динамика убыли 2,5-ДХГХ отмытыми клетками N. simplex ЗЕ.

Анализ ключевых ферментов катаболизма 2,4-Д и 2,4,5-Т. Определение ключевых ферментов разложения 2,4-Д и 2,4,5-Т явилось необходимым этапом для установления путей их деградации.

Определение активности фермента, осуществляющего первую реакцию - отщепление двууглеродного фрагмента от ароматического кольца, не выявило существенной разницы в активности фермента в зависимости от используемого ростового субстрата (таблица 1).

Таблица 1. Активность фермента, отщепляющего двууглерод-ный фрагмент у N.sinplex ЗЕ (мкмол/мин/мг белка).

Субстрат реакции Ростовой субстрат

ацетат + 2,4,5-Т ацетат + 2,4-Д

2,4,5-Т 2,4-Д 2,41 ± 0,818 3,09 ± 0,727 2,63 ± 0,91 2,09 + 1,07

Образование менее хлорированных продуктов, чем 2,4,5-Т (2,5-ДХГХ и хлоргадрохинона, идентифицированного ранее ((Зо1оу1еуа а1., 1990), предполагает существование эффективной дехлорирующей системы. Исследования, проведенные как с отмытыми клетками штамма, так и с Сесклеточным экстрактом, показали наличие у N. БЩр1ех ЗЕ дехлорирующей активности. Ингибирование дехлорирующей активности молекулярным кислородом исключает окислительное дехлорирование, как возможный механизм, предполагая

дехлорирование по гидролитическому и восстановительному механизмам.

Обнаружение 3,5-ДХПК при разложении 2,4-Д предполагало возможность функционирования модифицированного орто-пути. Однако,' мы не обнаруживали совсем или обнаруживали следовые количества активностей ферментов данного пути -пирокатехазы, муконатцик-лоизомеразы и диенлактонгидролазы.

Показано, что при росте штамма на 2,4-Д, 2,4,5-Т и смеси этих гербицидов индуцировалась активность только одного фермента расщепления ароматического кольца - гидроксигидрохинон 1,2-диоксигеназы (таблица 2).

Таблица 2. Удельные активности ферментов расщепления ароматического кольца в бесклеточных экстрактах N. simplex ЗЕ

Ростовой ГГХ 1,2-ДО ыпк ПКК 3, 4-ДО ПКК 2,3-ДО гдо гго

субстрат

_____

субстрат реакции

ГГХ 6-ХГГХ ПК пкк ПКК ГК ггк

июль 0г/шн/мг нмоль / мин/ № белка

2,4,5-Т 14,09 4,8 0 0 0 0 0

2,4-Д 13,84 6,59 0 0 0 0 0

2,4,5-Т

+ 2,4-Д 17,28 6,67 - - - - -

Ацетат 0 0 0 0 0 0

Ацетат +

2,4,5-Т 2,18 0 0 0 0 0

" - " - не определяли ГГХ 1,2-ДО проявляла активность как с гидроксигидрохиноном, так и с его хлорзамещенным производным - 6-хлоргидроксигидро-хиноном. Относительная активность фермента с хлорзамещенным субстратом не различалась существенно, как при росте.штамма на 2,4 -Д, так и на 2,4,5-Т, и на смеси этих гербицидов и составляла приблизительно 302 от уровня активности с незамешэнным

субстратом. Вероятно, в разложении 2,4-Д и 2,4,5-Т задействована одна х та ле ферментная система.

Продуктом расщепления гидроксигидрохинона ГГХ 1,2-ДО является малеилацетат. Активность малеилацетатредуктааы, фермента, катализирующего превращение малеилацетата в Jb- кетоадипат, была обнаружена в экстрактах из клеток, выращенных на 2,4-Д, 2,4,5-Т и их смеси, и составляла 9,46, 7,4 и 9,2 нмол/мин/мг белка (по определению с НАДН), соответственно.

Таким образом, на основании идентификации продуктов разложения 2,4-Д и 2,4,5-Т и определения активностей ключевых ферментов мы предложили следующие пути для разложения этих гербицидов (рис. 4).

В пути разложения 2,4-Д впервые показано превращение 3,5-ДХПК в тригидроксилированное соединение - 3,5-дихлоргид-роксигидрохинон, из которого образуется хлортригидроксицикло-гексадиен. Последнее соединение, вероятно, в результате реаро-матизации превращается в (хлор)гидроксигидрохинон, расщепляющийся ГГХ 1,2-ДО. Наличие активности фермента с монохлорзаме-щенныы аналогом гидроксигидрохинона не исключает возможность расщепления не полностью дехлорированного кольца.

Путь катаболизма 2,4,5-Т осуществляется по хлоргидрохиноно-вому пути с образованием в качестве промежуточного продукта 2,5-ДХГХ Дальнейшая судьба 2,5-ДХГХ может быть двояка. Так, в результате восстановительного дехлорирования 2,5-ДХГХ в 5-ом положении может образовываться хлоргидрохинон. Хлоргидрохинон затем способен превращаться в гидроксигидрохинон, который подвергается орто-расщэплению ГГХ 1,2-ДО. Не исключен другой вариант, при котором из 2,5-ДХГХ в реакции гидролитического дехлорирования может образовываться 5-хлоргидроксигидрохинон. Такой путь разломвния 2,4,5-Т описан у P. cepacia АС1100 (Sangodkar et al., 1989). Далее возможно как непосредственное расщепление данного интермедиата, так и его дехлорирование с последущим расщеплением образующегося гидроксигидрохинона ГГХ 1,2-ДО.

ОСН2СООН CI

2,4-Д

CI

OH

2,4-ДХФ

CI

CI

I

OH

HOvfV CI

3,5-ДХПК

CI

OH

OCH2COOH

J?"

CI

I

OH

J$ra

CI OH

j5t°

OH

ci

OH

2,4,5-T

2,4,5-ТХФ

2,5-ДХГХ

3,5-ДИ- ОН хлор-

хлор- С1 гидро-

гидрокси- ОН хикон ОН .

он

W ОН

С1

ОН

гидрохинон

С1 С1

ОН

хлортри- СК^Н' ОН гидрокси-циклогек- ОН' садиен

б-ХГГХ

ОН

Ыуг^Ц-он

V -,

он J

У 5-хлоргидрокси-/ч гидрохинон

ОН "1V

он

гидрокси-гидрохинон

о р 1 о - расщепление

Рис.3. Предполагаемые пути метаболизма 2,4-Д и 2,4,5-Г штаммом Nocardicins simplex ЗЕ.

Таким образом, разложение 2,4-Д и 2,4,5-Т штаммом N.simplex ЗЕ осуществляется по принципиально схожим путям, через образование тригидроксилированных соединений и их последующее расщепление ГГХ 1,2-ДО. По-видимому, именно благодаря этой особенности метаболизма штамм способен эффективно утилизировать смеси 2,4-Д и 2,4,5-Т.

Деградация 2,4-Д, 2,4,5-Т и их смеси в почве при интродукции штамма N. Simplex ЗЕ.

Показано, что внесение штамма Я. Simplex ЗЕ в обработанную гербицидами почву в полевых условиях стимулировало процесс их деградации по сравнению с контролем (рис. 5).

Наибольшая убыль гербицидов наблюдалась в первые три недели эксперимента. Так, содержание 2,4-Д через три недели составляло 2,6% от исходно определяемого количества, что в 10 раз шньпе, чем в контроле. Через два месяца обнаруживали только 0,6% 2,4-Д, а через три месяца 2,4-Д не обнаруживали совсем (рис.5, I).

Убыль 2,4,5-Т происходила медленнее и через три недели в почве определяли около 9% гербицида, что было в 5,5 раз меньше, чем в контроле. К моменту окончания эксперимента в почве оставалось 0,23Х 2,4,5-Т (3,7% в контроле) (рис.5, II).

Очень аффективно разлагалась смесь 2,4-Д и 2,4,5-Г. При этом 2,4-Д не обнаруживали уже через 8 недель, а 2,4,5-Т к моменту окончания эксперимента составлял 0,12% (рис. 5,111).

Снижение содержания гербицидов в контрольных вариантах может быть связано с сорбцией токсикантов с частицами почвы, значительно затрудняющую их количественную экстракцию ( Рачинский с соавт. , 1989), образованием конъюгатов, или образованием летучих продуктов - соответствуют}« хлоранизолов (MsCall et al. ,1981).

Наблюдения за динамикой численности клеток штамма продемонстрировали ее постепенное снижение по мере разложения гербицидов. Так через три месяца проведения эксперимента во всех вариантах опыта она снизилась на порядок ( с 10 исходно вне-

сенной культуры до 10 ), а через пять месяцев падала до неопределяемого уровня, что свидетельствует в пользу того, что присутствие ксенобиотиков в почве стабилизировало штамм.

недели

Рис.5. Разложение 2.4-Д (I), 2,4,5-Т (II) и смеси 2,4-Д+ 2,4,5-Т (III) в почве, в условиях полевого эксперимента. Контроли: 1 - 2,4-Д; 2 - 2,4,5-Т.

Опыт (с внесением штамма N.siirplex ЗЕ ): 3 - 2,4-Д; 4 - 2,4,5-Т.

- 16 -выводы

1. Изучена динамика разложения хлорфеноксиалкановых гербицидов 2,4-Д и 2,4,5-Т штаммом ЫосагхИоШез БИгр1ех ЗЕ. Показано, что убыль гербицидов сопровождается выделением в культуральную среду стехиометрического количества ионов хлора и приростом биомассы.

2. Установлены пути деградации 2,4,5-Т и 2,4-Д штаммом. Показано, что основной путь метаболизма 2,4,5-Т протекает через образование трихдорфенола, хлоргидрохинонов, превращющихся в гидрокси- или хлоргидрскеигвдрохинош, подвергающиеся дальнейшему орторасщеплению. В пути метаболизма 2,4-Д впервые обнаружено иревращэние 3,5-дихлорпирокатехина, образующегося на первых этапах деградации ксенобиотика, в 3,5-дихлоргидроксигидро-хинон. Дальнейшее превращение 3,5-дихлоргидроксигидрохинона включает этап восстановительного дехлорирования с образованием соединения, охарактеризованного как хлортригидроксициклогекса-диен.

3. Определены активности ключевых ферментов деградации 2,4-Д и 2,4,5-Т штаммом N. БИпр1ех ЗЕ. Установлено, что расвдпление ароматического кольца гидроксигидрохинона, - ключевого интер-медиата их превращения, осуществляется гидроксигидрохинон 1,2-диоксигенааой. Данный фермент проявлял активность как с неза-меш/знным гидрокеигидрохиноном, так и с его монохлорсодержащим аналогом - 6-хлоргидроксигидрохиноном.

4. Впервые показана возможность разложения смеси двух гербицидов 2,4-Д и 2,4,5-Т природным штаммом N. SJгр1ех ЗЕ. Установ лено, что разложение обоих гербицидов осуществляется по хлор-гидрохиноновому пути. Скорость разложения гербицидов в смеси зависит от соотношения 2,4-Д и 2,4,5-Т. Увеличение концентрации 2,4,5-Т приводит к длительной задержке роста и снижению скорости деградации смеси.

5. Продемонстрирована способность штамма N. зтр1ех ЗЕ разлагать 2,4-Д, 2,4,5-Т и их смесь в почве в условиях полевого эксперимента, что открывает возможность его использования для биоремедиации загрязненных почв.

Ш материалам диссертации опубликованы следующее работы: 1. Козырева Л. IL , Пэрцова Р. H , Головлева Л. А. Особенности превращения 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты Nocardioides simplex. Микробиология, 1992, т. 61, вып. 4, с. 609-614.

2. Козырева Л.П. Разложение смеси 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной и 2,4-дихлорфеюксиуксусной кислот культурой Nocardioides simplex ЗЕ. В сб. : "Микроорганизмы в сельском хозяйстве", тезисы докладов 4-ой Всесоюзной научной конференции, Пущино, 1992, с. 96.

3. Козырева Л. Е , Синкелызтейн 3. И., И^рухин КХ Е , Баскунов Б. IL, Головлева JLA. Nocardioides simplex ЗЕ - деструктор хлорфеноксиалкановых кислот. В сб. : "Новые направления биотехнологии", тезисы докладов 5-ой конференции Российской Федерации, Цущино, 1992, С. 158.

4. Козырева Л. П., Щурухин К1 а , винкельштейн 3. И., Баскунов В. П., Головлева Л.А. Мэтаболизм гербицида 2,4-Д штаммом Nocardioides simplex. Микробиология, 1993, т. 62, вып. 1, с. 110-119

5. Козырева Л. П., Головлева JL А. Рост Nocardioides simplex на смеси гербицидов 2,4,5-Т и 2,4-Д. Микробиология, 1993, т. 62, вып. 1, с. 189-192.

18.05.93 г. Эак.5636Р. Тир.130 экз. Уч.-изд.л. 1.0

Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПЩ РАН