Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Деградация гербицида атразина базидиальными грибами и их ферментами

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Деградация гербицида атразина базидиальными грибами и их ферментами"

На правах рукописи иизоез юг

Горбатова Ольга Николаевна

ДЕГРАДАЦИЯ ГЕРБИЦИДА АТРАЗИНА БАЗИДИАЛЬНЫМИ ГРИБАМИ И ИХ ФЕРМЕНТАМИ

Специальность 03 00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 МАЙ 2007

Москва - 2007

003063102

Работа выполнена в группе «Ферментативные основы биодеградации» Института биохимии имени А Н Баха РАН

Научные руководители:

доктор биологических наук О.В. Королева

кандидат биологических наук А.В.Жердев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор

Т.А. Валуева

доктор химических наук,

профессор

С.А.Еремин

Ведущая организация: Институт биохимии

и физиологии микроорганизмов им Г К Скрябина РАН

Защита состоится «29» мая 2007 г в 11 00 на заседании диссертационного совета К 002 247 01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им А Н Баха РАН по адресу 119071, Москва, Ленинский проспект, д 33, корп 2

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу 119071, Москва, Ленинский проспект, д 33, корп 1

Автореферат разослан « » апреля 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Деградация ксенобиотиков в природе является процессом, интенсивное изучение которого вызвано, прежде всего, потребностями экологической безопасности В свете современных представлений изучение деградации ксенобиотиков, в частности пестицидов, следует проводить с учетом состава микрофлоры, имеющей непосредственный контакт с данным пестицидом в процессе его метаболизма в цепи растение - почва - воды (в том числе грунтовые) Особое внимание должно быть уделено поверхностному слою почвы с растительными остатками, который в качестве одного из ключевых компонентов микробного сообщества содержит базидиомицеты В ряде работ показан высокий потенциал базидиальных грибов как эффективных деструкторов ксенобиотиков, в том числе пестицидов

Гербицид атразин и продукты его метаболизма обнаруживаются в биогеоценозах многих стран и различных природных зон Мировое производство атразина составляет около 500 т/год Однако поскольку триазиновые гербициды на сегодняшний день продолжают оставаться неотъемлемой частью сельскохозяйственных технологий, то речь идет не об отказе от них, а о выборе оптимальных стратегий трансформации и удаления из окружающей среды

Существующие на сегодняшний день данные говорят о том, что ферменты, относящиеся к классу оксидоредуктаз, участвуют в детоксификации многих пестицидов, в том числе атразина В настоящее время показана возможность детоксификации ряда ксенобиотиков системами, содержащими лакказы или Мп-пероксидазы в присутствии редокс-медиаторов Редокс-медиаторами являются соединения, которые в процессе окисления ферментом образуют высокореакционные продукты В результате использования систем фермент/медиатор на лабораторном уровне разработаны технологии детоксификации хлорфенолов, полициклических углеводородов и некоторых других соединений

Учитывая вышеизложенное, остро стоит вопрос о новых биотехнологических методах для деструкции пестицидов, в том числе атразина Использование системы детоксификации на основе лакказы является перспективным направлением в разработке таких методов, а эффективное использование фермента в биотехнологических процессах должно базироваться на данных о его структурной организации и механизме действия

Цель работы и задачи исследования Целью настоящей работы являлось изучение деградации гербицида атразина базидиальными грибами и их ферментами

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

1 Провести сравнительное исследование индуцибельных и конститутивных форм грибных лакказ на примере лакказы базидиомицета Coriolus hirsutus,

2 Изучить деградацию атразина базидиальными грибами в отсутствие и в присутствии индукторов биосинтеза лакказ,

3 Охарактеризовать лакказу базидиомицета Conolopsis fulvocinerea, обладающего самым высоким детоксификационным потенциалом в отношении атразина,

4 Исследовать системы «атразин/лакказа/редокс-медиатор» и установить структуры продуктов трансформации атразина,

5 Установить механизм окисления атразина лакказой в присутствии редокс-медиатора

Научная новизна Впервые охарактеризованы индуцибельные формы лакказы базидиомицета Coriolus hirsutus, их биохимические и физико-химические свойства в сравнении с конститутивными изоформами лакказы С hirsutus и другими грибными лакказами

На примере модельного ксенобиотика атразина изучен процесс биодеградации ксенобиотиков базидиальными грибами Исследовано влияние индукторов биосинтеза лакказы (сирингалдазин и гваякол) на деградацию гербицида атразина при глубинном культивировании базидиальных грибов Показано, что индукторы не играют значимой роли в процессе биодеградации гербицида Установлена ключевая роль лакказы в деградации атразина in vivo

Изучено влияние редокс-медиаторов на окисление атразина лакказой в модельных системах Показано, что лакказа в отсутствие редокс-медиатора не окисляет атразин и что процесс окисления атразина инициируется 1 -гидроксибензотриазолом

Установлены продукты деградации атразина в системе атразин/медиатор/лакказа и предложен механизм данного процесса

Практическая ценность работы. Впервые установлена способность базидиальной лакказы деструктурировать триазиновый гербицид атразин в присутствии редокс-медиатора Это позволяет использовать данный фермент в процессах детоксификации структурно близких ксенобиотиков Предложенный механизм действия системы «лакказа-редокс-медиатор» может способствовать разработке новых систем детоксификации и биоремедиации Полученные данные о редокс-медиаторных свойствах субстратов лакказы обеспечивают целенаправленный поиск новых редокс-медиаторов фермента

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на научных конференциях First International

Conference on Remediation of Contaminated Sediments (Italy, Venice, 2001), Young Scientists Conference «Biotechnology for future» affiliated to the 3-rd International Symposium «EU—Russia Prospects for Cooperation in Biotechnology in the Seventh Framework Programme» (St Petersburg, Russia, 2006)

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 печатных работ, в том числе 2 статьи и один обзор в российских журналах

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы Работа изложена на 145 страницах Список цитируемой литературы включает 209 наименований Иллюстративный материал содержит 45 рисунков и 17 таблиц

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Индуцибельные и конститутивные изоформы лакказы базидиомицета Coriolus hirsutus. Известно, что при росте базидиальных грибов на природных субстратах продукты деградации выступают в качестве индукторов биосинтеза ферментов, в частности лакказ, которые могут принимать участие в детоксификации Данные скрининга коллекции базидиомицетов по продукции лигнолитических ферментов показали наличие нескольких штаммов, обладающих лакказной активностью Из этих штаммов для настоящего исследования был выбран штамм Coriolus hirsutus, уровень биосинтеза лакказы которого значительно превышал аналогичный показатель для других штаммов Целью этого исследования являлось получение гомогенных препаратов индуцибельных изоформ лакказы гриба С hirsutus и сравнение их биохимических и физико-химических свойств с конститутивными изоформами лакказы С hirsutus и другими грибными лакказами В качестве индуктора биосинтеза фермента использовали сирингалдазин

Выделение и очистку форм лакказы проводили по стандартной методике, заключительным этапом которой было изоэлектрофоретическое разделение ферментных препаратов

В результате были выделены два гомогенных препарата конститутивных форм лакказы Cl (80-82%) с изоэлектрической точкой (ИЭТ) 4,0 и С2 (18-20%) с ИЭТ 4,5, и два гомогенных препарата индуцибельных форм фермента II с ИЭТ 3,5 и 12 с ИЭТ 4,2, в соотношении по белку примерно 1 1

Методом электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях было определено, что все четыре изоформы в гомогенном состоянии представляют собой одноцепочечные гликопротеины

Молекулярные массы (мм) исследуемых изоформ, определенные методом гель-фильтрации, лежали в пределах 55-69 кДа, что согласуется с данными для других грибных лакказ

Углеводный состав изоформ был представлен маннозой, М-ацетилглюкозамином, Ы-ацстилглюкозой и галактозой и варьировал от 1 до 12% Следует отметить, что корреляции между содержанием углеводов и молекулярной массой изоформ не наблюдалось Высказанное рядом авторов предположение о стабилизирующей роли углеводной части фермента не подтверждается полученными данными для 12 (содержание углеводов 2%) период полуинактивации фермента (Т)/2) составлял 3 суток, а для II (содержание углеводов 7,2%) - 1 сутки

Были определены кинетические параметры изоформ лакказы для сирингалдазина и пирокатехина Константы Михаэлиса (Кш) исследованных изоформ лежали в микромолярном диапазоне, свидетельствуя о высокой эффективности катализа Сравнительная характеристика изоформ приведена в табл 1

Таблица 1 Сравнительная характеристика биохимических и физико-химических свойств конститутивных и индуцибельных форм лакказ (С1, С2, II, 12) из базидиомицета С ЫгзШш ____

Изоформы фермента Р1 м м, кДа Углеводы, % рН-оптимум Т-опти-мум, °С т1/2> сут Кш, цМ сирин-галда-зин Кш, цМ пирокатехин

С1 4,0 55 12,0 4,5 50 1,5 118 181

С2 4,5 67 1,0 4,4 50 2,0 42 297

11 3,5 69 7,2 4,4 50 1,0 162 55

12 4,2 65 2,0 4,5 50 3,0 24 190

Таким образом, по исследованным биохимическим и физико-химическим свойствам (ИЭТ, м м, углеводный состав и термостабильность) индуцибельные изоформы II и 12 лакказы С/г/г.ти/и.? незначительно отличались от конститутивных изоформ лакказы данного вида базидиомицета Исследованные физико-химические свойства и кинетические параметры индуцибельных форм фермента позволяют предположить его эффективное участие в процессах делигнификации и детоксификации и, в связи с этим, использовать его для решения биотехнологических задач

Влияние индукторов на биосинтез оксидоредуктаз и деградацию атразпна при глубинном культивировании базидиомицетов. Проведенное исследование влияния индукторов на биосинтез лакказы свидетельствует о целесообразности их применения при исследовании процесса биодеградации ксенобиотиков базидиальными грибами

Было изучено влияние атразина на биосинтез оксидоредуктаз (Мп-пероксидазы и лакказы) в присутствии и отсутствие индукторов (сирингалдазин и гваякол) при глубинном культивировании базидиомицетов С hirsutus, Cerrería maxima, Coriolopsis fulvocmerea и совместном культивировании С hirsutus/C maxima Данное исследование включало оценку роли индукторов (сирингалдазин и гваякол) в процессах деградации атразина

Активность Мп-пероксидазы (МпП) была обнаружена в трех культурах С maxima, С hirsutus, и С hirsutus/C maxima в условиях глубинного культивирования При росте базидиомицета С fulvocmerea были зафиксированы лишь следовые количества активности МпП

В культурах без атразина динамика активности МпП соответствовала характерной картине для биосинтеза лигнолитических ферментов при глубинном культивировании постепенное увеличение, достижение максимума и последующее падение активности (рис 1)

В присутствии атразина наблюдалась принципиально иная картина Активность МпП резко падала во всех трех культурах и ее уровень не превышал 10% от значений, достигаемых при культивировании в отсутствии ксенобиотика (см рис 1)

Динамику лакказной активности исследовали при культивировании С hirsutus, С maxima, С hirsutus/C maxima и С fulvocmerea Как было установлено, штамм С fulvocmerea синтезировал при глубинном культивировании преимущественно лакказу, что позволило корректно оценить роль индивидуального фермента - лакказы в процессе деструкции атразина данным базидиомицетом

Динамика биосинтеза лакказы в культурах С hirsutus, С maxima, С hirsutus/C maxima и С fulvocmerea в отсутствие атразина была характерна для глубинного культивирования (рис 2, кривая 1) Предполагалось, что добавление атразина даст один пик активности лакказы, подобно воздействию гваякола (рис 2, кривая 2) Однако при добавлении атразина регистрировалось несколько диффузных пиков активности фермента (рис 2, кривые 3 и 4) Присутствие ксенобиотика стимулировало биосинтез лакказы Наблюдался интенсивный синтез и выделение внеклеточного фермента в среду культивирования, причем на протяжении всей ферментации

МпП, ед Лакказа, уел ед

Рисунок 1 Динамика лакказной и Mn-пероксидазной активности в отсутствие и в присутствии атразина при глубинном культивировании С maxima 1 - Mn-пероксидазная активность в отсутствие атразина, 2 - Mn-пероксидазная активность в присутствии атразина, 3 — лакказная активность в отсутствие атразина, 4 — лакказная активность в присутствии атразина

сут

Рисунок 2 Динамика лакказной активности при глубинном культивировании С ЫгьиШ 1 - без индукторов, 2 - в присутствии гваякола, 3 - в присутствии атразина, 4 - в присутствии гваякола и атразина

За условную единицу активности лакказы (уел ед) принимали приращение оптической плотности в 1 мл реакционной смеси за 1 мин, за условную единицу Мп-пероксидазы (ед) - окисление 1 |дМ Мп (II) за 1 мин

Сравнение остаточной концентрации атразина с активностью оксидоредуктаз для штаммов С /г/г.то/гк, С тахта, С/\ilvocinerea и ко-культуры С ЫкШт/С тахта (рис 3) показало, что профили активностей лакказы и МпП во время культивирования в присутствии атразина были похожи, но к концу культивирования активность лакказы оставалась высокой, в то время как активность МпП падала почти до нулевого уровня примерно к 30 суткам

Концентрация Активность лакказы уел ед

атразина, % Активность МпП ед

Концентрация Активность лакказы уел ед

атразина, % Активность МпП, ед

сут

Концентрация атразина %

100 т,

Активность лакказы уел ед. Концентрация Активность МпП ед

100

Активность лакказы уел ед Активность МпП ед

100

Рисунок 3 Динамика активности лакказы и МпП и концентрации атразина в процессе глубинного культивирования базидиальных грибов А - Coriolus hirsutus, Б - Cerrería maxima, В - С hirsutus/C maxima, Г - С fulvocinerea (о) - остаточная концентрация атразина, (и) - активность лакказы, (А) - активность МпП

Проводилось сравнительное изучение активности лакказы для разных схем внесения индукторов при культивировании базидиомицетов С hirsutus, С fulvocinerea, С maxima и С hirsutus/C тахта 1) одновременное внесение атразина и индуктора (сирингалдазин или гваякол) на третьи сутки культивирования, 2) внесение атразина на третьи сутки культивирования, а индуктора - на шестые сутки культивирования

Изменения содержания атразина, определенные методом иммуноферментного анализа (ИФА), при его трансформации грибными культурами представлены в табл 2 За 100% принимали концентрацию внесенного атразина в среду культивирования При внесении индукторов на 3 сутки культивирования наблюдалось наибольшее разрушение атразина по сравнению с неиндуцированными культурами (см табл 2) Исключение составляет ко-культура для нее индуцирование на 3 сутки приводило к меньшей деградации гербицида (83-87%), а индуцирование на 6 сутки - к максимальной (93-96%) Однако следует учитывать, что именно ко-культура показывала максимальную активность МпП в среде с атразином во время культивирования Накопление МпП происходило в течение 10 суток культивирования и могло послужить причиной сдвига индукции

При индукции на 3 сутки 50%-ное изменение концентрации атразина достигалось на 8-11 сутки культивирования, в зависимости от штамма и индуктора

Уменьшение концентрации атразина различными культурами без индукторов составляло от 81 до 94%, а с индукторами - 77-98% Наименьшую остаточную концентрацию атразина (2%) показал штамм С fulvocinerea при добавлении в среду гваякола на 3 сутки культивирования

Таким образом, показано, что индукция на 3 сутки более эффективна, чем индукция на 6 сутки Возможно, полупродукты распада также индуцируют синтез лакказы Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что атразин стимулировал биосинтез лакказы в течение длительного времени Учитывая некоторое уменьшение концентрации атразина при внесении в среду индукторов по сравнению с неиндуцированными культурами, можно предположить, что сирингалдазильные и гваяцильные остатки, которые являются продуктами разрушения лигнина базидиомицетами, потенциально могут осуществлять в природе функцию редокс-медиаторов Все исследованные штаммы разрушали атразин и при этом синтезировали лакказы В присутствии атразина процесс синтеза лакказы шел постоянно, что позволяет предположить участие этого фермента в деградации атразина Из четырех исследованных культур наиболее эффективно деградировала атразин культура С fulvocinerea, причем процесс сопровождался высокой

лакказной активностью в среде культивирования Поэтому данная культура была выбрана в качестве штамма — продуцента лакказы для дальнейшего изучения биодеструкции атразина в модельных системах, содержащих фермент и редокс-медиатор

Таблица 2 Разложение атразина базидиальными грибами в присутствии индукторов при их внесении на 3 и 6 сутки культивирования_

Базидиомицет Индуктор Степень деструкции атразина, %

3/6 сутки культивирования

9 сутки 43 сутки

Сопо1т ЫгяМиз 38,0 86,0

Гваякол 50,0/7,0 87,5/88,0

Сирингалдазин 52,0/11,0 84,0/86,3

Сеггепа тахта 42,5 81,0

Гваякол 42,5/40,0 76,7/83,0

Сирингалдазин 65,0/15,0 82,5/78,0

С ¡игзШия/ С тахта 55,0 82,5

Гваякол 52,5/34,0 83,2/96,0

Сирингалдазин 57,5/37,0 86,5/93,0

Соп о1орз18 /иЬостегеа 50,0 94,0

Гваякол 50,0/32,0 98,0/94,0

Сирингалдазин 42,0/34,0 94,0/90,0

Характеристика внеклеточной лакказы базндиомицета СопоЩшн/,\tlvocmerea 0677.

Выделение и очистка лакказы базндиомицета С/иЬостегеа 0677 включали следующие стадии высаливание сульфатом аммония, хроматография на ДЭАЭ-вате, хроматография и рехроматография на ДЭАЭ -Тоуореаг1 650 М В результате был получен гомогенный препарат фермента, а степень очистки составляла 380

ИЭФ фермента показало, что лакказа имеет одну изоформу с ИЭТ, равной 3,5 Как и большинство лакказ, данный фермент является одноцепочечным гликопротеином, что подтверждено данными электрофореза в ПААГ в присутствии ДЦС - натрия Полученная в гомогенном состоянии лакказа С/иЬостегеа имела молекулярную массу 54±2 кДа

Согласно данным атомно-адсорбционного анализа молекула фермента содержала 4 иона меди Сведения о наличии четырех атомов меди в исследуемой лакказе были подтверждены спектрофотометрическим методом с использованием 2,2'-бихинолина

Оптические спектры показали характерный пик иона меди первого типа при длине волны 610 нм и плечо на 340 нм, свидетельствующие о

наличии бинарного комплекса меди третьего типа

Данные ЭПР подтвердили присутствие в исследуемом ферменте ионов меди первого типа и иона меди второго типа Параметры иона меди первого типа для лакказы С/иЬостегеа §х=2,030 шТ, тТ,

Ац=8,00х10"3 см"1 Спектры свидетельствуют о наличии четырех атомов азота в координационной сфере иона меди первого типа, значение составляло 1,00 шТ

Также отметим, что характеристики ионов меди аналогичны другим исследованным ферментам

Исследуемый фермент содержал аномально высокий уровень углеводов (35%) по сравнению с другими грибными лакказами (2-20%) Молекула лакказы содержала маннозу, галактозу, ацетилглюкозамин в соотношении 7,5 1 1

Однако растительные лакказы, содержащие аналогичное количество углеводов на молекулу фермента, имели довольно высокие значения молекулярных масс (65-75 кДа) Для лакказы С/иЬостегеа молекулярная масса была достаточно низкой (54 кДа) Преобладание маннозы в составе углеводной части также не характерно для грибных лакказ Очевидно, лакказа базидиомицета С/иЬостегеа значительно отличается по физиолого-биохимическим и молекулярно-генетическим характеристикам от других лакказ

рН-оптимум фермента С/иЬостегеа, измеренный в 0,1 М натрий-ацетатном буфере и в универсальном буфере, лежал ближе к нейтральной области и соответствовал рН 4,5-6

Исследование термостабильности проводилось в 0,1 М натрий-ацетатном буфере рН 4,5 при температуре 50°С 50%-ное сохранение активности соответствовало 155 ч инкубации

Константы Михаэлиса (Кт) были определены из зависимостей начальных скоростей ферментативной реакции от концентраций субстратов по убыли второго субстрата кислорода Исследуемая лакказа катализировала окисление различных субстратов, включая орто- и пара-дифенолы и неорганические ионы В ряду пирокатехин - ферроцианид калия — гваякол - гидрохинон - феруловая кислота - синаповая кислота наблюдалось уменьшение Кт от 320 до 10 цМ При сравнении этого параметра для указанных субстратов мы видим, что наблюдаемое 30-кратное различие обусловлено химической структурой субстратов

Полученные результаты позволяют заключить, что лакказа С/Ыхостегеа имеет более нейтральный рН-оптимум (рН 4,5-6,0) по сравнению с изученной нами ранее лакказой С ЫгбЫш (рН 4,5) Кроме того, лакказа С\ilvocmerea является высокотермостабильным ферментом по сравнению с другими грибными лакказами (сохраняет 50% активности в течение 6 суток) Эти результаты делают перспективным использование

лакказы в биотехнологических процессах, протекающих при довольно высоких температурах

Сравнительная характеристика различных субстратов, используемых в качестве медиаторов в реакции с лакказой из базидиомицета Coriolopsis fulvocinerea. В качестве редокс-медиаторов были выбраны 4 соединения сирингалдазин, 1-гидроксибензотриазол (ГБТ), [Ru(PhPy)(Phen)2]PF6 (К1) и [Ru(Bpy)2Cl2] (К2)

Все 4 соединения являются субстратами фермента Сирингалдазин также проявляет себя как хороший индуктор при биосинтезе фермента базидиомицетами и, возможно, является природным редокс-медиатором, образующимся in vivo Рядом авторов показано использование ГБТ в качестве медиатора некоторых ферментативных реакций, в том числе с участием лакказы Выбор рутениевых комплексов в качестве редокс-медиаторов был обусловлен данными о том, что комплексы рутения являются высокореакционноспособными субстратами таких оксидоредуктаз, как глюкозооксидаза и пероксидаза хрена

Сравнение выбранных соединений проводили по электрохимическим и кинетическим параметрам

Электрохимические измерения проводили методом циклической вольтамперометрии, определяя следующие характеристики величины анодного и катодного токов и потенциалы восстановления и окисления этих соединений В качестве рабочего электрода использовали стеклоуглеродный, электродом сравнения был Ag/AgCl, вспомогательным - платиновый электрод

Циклическая вольтамперометрия рутениевого комплекса К1 показала пик восстановления -115 мВ и пик окисления +163 мВ (рис 4, А) Рассчитанный потенциал средней точки (Есрт) между потенциалами катодного и анодного пиков составляет 24 мВ

Рутениевый комплекс К2 имеет пик восстановления +390 мВ и пик окисления +494 (рис 4, Б) Таким образом, потенциал средней точки Еср т равен 442 мВ

Циклическая вольтамперометрия сирингаладзина дала пик восстановления +372 мВ и пик окисления +431 мВ (рис 4, В) Потенциал средней точки равен 402 мВ

На вольтамперограмме ГБТ наблюдается один пик окисления при +885 мВ (рис 4, Г) Потенциал полуволны равен 789 мВ Циклическая вольтамперометрия ГБТ говорит о том, что происходит окисление ГБТ в результате необратимой реакции

10000 5000

о

-5000

-юооо н

-15000 -20000

I, пА

I, пА

-800 -400 0 400 Е, тУ

I, пА

800

-800

-400 0 400 Е, тУ

800

1200 800 400 0 -400

6000

4000-

2000-

0-

I, ПА

-2000

200 400 600 800 Е, тУ

О 200 400 600 800 1000 В. mV

Рисунок 4 Циклические вольтамперограммы исследуемых соединений А - [Ки(рЬру)(рЬеп)2]РР6 (26 цМ) V - 20 мВ/сек, Б - [Яи(Ьру)2С12] (500цМ) V - 40 мВ/сек, В - сирингалдазин (193 цМ) V - 20 мВ/сек, Г -ГБТ (350 цМ) V - 10 мВ/сек V - скорость записи циклических вольтамперограмм Все вольтамперограммы были записаны в 0,1 М натрий-ацетатном буфере рН 4,5

Сформулированные требования к редокс-медиаторам ферментов, в частности лакказ, включают в качестве ключевого параметра способность редокс-медиатора окисляться ферментом и существовать в устойчивой форме значительный промежуток времени Таким образом, необходимым (однако не всегда достаточным) условием использования химического соединения в качестве редокс-медиатора является его способность вступать в реакцию с ферментом, т е соединение должно быть субстратом фермента

При исследовании кинетики окисления комплексов [Ки(рЬру)(рЬеп)2]РР6 и [11и(Ьру)2С12] по зависимости начальных скоростей реакции от концентрации комплекса наблюдалась тенденция к выходу на 12

плато, т е получалась кривая насыщения Можно предположить, что окисление комплексов рутения в присутствии лакказы происходит с образованием фермент-субстратного комплекса, а не просто в результате аутосферного переноса электрона По этой причине экспериментальные данные для комплексов рутения также были обработаны, исходя из схемы Михаэлиса-Ментен

Кинетические параметры окисления исследованных субстратов лакказой из С/,иЬостегеа были определены спектрофотометрически по накоплению продукта для К1, К2 и сирингалдазина Кинетические параметры окисления ГБТ определяли по поглощению кислорода, используя электрод Кларка Полученные результаты приведены в табл 3

Таблица 3 Кинетические параметры окисления субстратов в присутствии лакказы (0,1 М натрий-ацетатный буфер рН 4,5,25°С)

Субстрат Кш, цМ КсаЪ с"1 Кса1/ Кш, М-1»с-1 р ср т мВ Реакционная способность (в порядке убывания)

[11и(р11ру)(рЬеп)2]РР6 (К1) 8,8 32700 3,7x10" 24 1

Сирингалдазин 11 205 1,9х107 402 2

[Яи(Ьру)2С12] (К2) 56 186 3,3х106 442 3

Гидроксибензотриазол* 290 0,18 6,2x102 789 4

* Для К1, К2 и сирингалдазина потенциал рассчитывался как потенциал средней точки Есрт = (Ек + Еа)/2 Для ГБТ потенциал рассчитывался как потенциал полуволны

Рассмотренные соединения по эффективности катализа лакказой из С/иЬосепегеа можно распределить в следующем порядке (по убыванию эффективности катализа) [Яи(рЬру)(рЬеп)2] РР6 > сирингалдазин > [Ки(Ьру)2(С1)2] > 1-гидроксибензотриазол Таким образом, комплекс К1 имеет более высокое сродство к лакказе, чем ГБТ При этом, как видно из табл 3, кинетические параметры выбранных соединений зависят от потенциалов этих соединений чем потенциал ниже, тем выше эффективность катализа, что согласуется с данными других авторов

Анализируя полученные данные, можно сделать предположение, что медитор должен являться хорошим субстратом лакказы, быть электрохимически обратимым соединением и иметь значительное время жизни Рутениевый комплекс К1 обладает наиболее перспективными характеристиками в качестве редокс—медиатора лакказы, удовлетворяя всем этим требованиям

Исследование трансформации атразина в модельных системах, содержащих лакказу С./иН'осепегеа и редокс-медиатор. Сравнительное исследование свойств редокс-медиаторов проводили в системе «атразин/лакказа/редокс-медиатор»

Для изучения трансформации атразина системой, содержащей фермент и редокс-медиатор, использовали метод ВЭЖХ, позволяющий исследовать как убыль атразина, так и накопление продуктов

Основные продукты, которые детектировались в контрольных системах «медиатор», «медиатор/лакказа» и «атразин/медиатор», при выбранных условиях проведения анализа отличались по времени удерживания от атразина и его производных Это позволило достоверно определять продукты взаимодействия лакказы с медиаторами и атразином

1 20 1 00

080

AU 060

040

020

000

2,00 4 00 6 00 8 00 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 30,00

Мин

Рисунок 5 Хроматограмма водного раствора ГБТ/Атр, соотношение ГБТ/Атр 1/1, концентрации исходных реагентов Атр - 100 цМ, ГБТ- 100 |iM, температура - 25°С, время инкубации - 7 суток

Показано, что в контрольных образцах «атразин/лакказа» и «атразин» (водный раствор) изменений концентрации атразина не происходило в течение всего времени эксперимента (10 суток), те лакказа Сfulvocinerea не вступала в реакцию с атразином Следует отметить, что из-за длительности анализа эксперимент проводился в стерильных условиях

Атр 20,6 | . 23,4 i

АААА л ала ал АА

При исследовании трансформации атразина в модельных системах, содержащих лакказу, было установлено, что из четырех выбранных соединений (сирингалдазин, ГБТ, К1 и К2) только ГБТ вызывал убыль атразина

Более детальное исследование компонентов модельной системы «атразин/лакказа/ГБТ» показало, что сам ГБТ реагировал непосредственно без участия лакказы с атразином и другими хлор-содержащими производными атразина (рис 5) и не взаимодействовал с гидрокси-производными атразина Это позволило предположить, что реакция ГБТ с атразином идет путем замещения атома хлора в положении (2) атразина

Образование продукта ГБТ/Атр происходило как в водном растворе, так и в органическом растворителе - метаноле Известно, что ГБТ в водных растворах может переходить в ионную форму Поэтому было сделано предположение, что могут образовываться два продукта, в структуру которых входят и ГБГ и атразин с образованием связи (-N-0-0-) в положении (2) атразина Предполагаемая схема происходящих реакций приведена на рис б

Рисунок 6 Предполагаемая схема реакций в модельной системе, содержащей атразин и ГБТ

о

Внесение лакказы в раствор ГБТ/Атр приводило к образованию ряда продуктов, причем один из них по времени удерживания соответствовал соединению ГБТ-Атр (рис 7)

В ферментативной реакции образовались два других продукта, которые имели времена удерживания 15,3 мин и 19,4 мин Сравнение со стандартами показало, что продукт со временем удерживания 15,3 мин соответствует деэтилатразину (ДЭА) Продукт со временем удерживания 19,4 мин может соответствовать соединению, образующемуся при взаимодействии ДЭА и ГБТ (рис 8) Таким образом, добавление фермента приводило к образованию новых продуктов, отличных от продукта, образующегося в реакции ГБТ с атразином

Рисунок 7 Хроматограмма водного раствора Атр/ГБТ/лакказа, соотношение Атр/ГБТ 1/1, концентрации исходных реагентов Атр - 100 цМ, ГБТ - 100 цМ, температура - 25°С, время инкубации - 7 суток

Рисунок 8 Предполагаемая схема взаимодействия Атр/ГБТ/лакказа и продукты, образующиеся в реакции

Исследование модельной системы «атразин/лакказа/ГБТ» проводили при различном мольном соотношении «атразин/медиатор» (от 9/1 до 1/9) и при двух концентрациях фермента (0,02 цМ и 1,0 цМ)

Было установлено, что убыль атразина возрастала с увеличением концентрации медиатора Уже при соотношении ГБТ/Атр 1/1 убыль атразина переходила 10%-ный порог В то же время при соотношении ГБТ/Атр, равном 9/1, и концентрации фермента 0,02 цМ наблюдалось максимальное уменьшение атразина - до 70% за 10 суток (табл 4) Для высокой концентрации фермента - 1,0 цМ - эффективность деструкции атразина была существенно ниже, составляя 28% за 10 суток (см табл 4)

Теоретически более высокая концентрация фермента должна приводить к увеличению степени деградации атразина При увеличении содержания фермента возрастает количество ГБТ, взаимодействующего с лакказой с образованием не только высокореакционноспособного промежуточного продукта, но и выводящегося из сферы реакции конечного продукта Вероятно, данный процесс снижает концентрацию

ГБТ и, соответственно, концентрацию комплекса ГБТ-атразин По этой причине высокая концентрация фермента не позволяет увеличить степень деструкции атразина

Таблица 4 Результаты ВЭЖХ модельных смесей «атразин/ГБТ/лакказа»

№ ГБТ, цМ Атразин, цМ Фермент, цМ ГБТ/ Атр Убыль атразина, %

4 сут 7 сут 10 сут

1 11,5 103,6 1,0 1/9 1,8 2,1 4,6

2 16,4 98,6 1,0 1/6 2,3 3,4 4,5

3 28,7 86,3 1,0 1/3 1,8 5,0 4,6

4 57,3 57,5 1,0 1 7,1 6,9 17,5

5 86,0 28,8 1,0 3 15,6 19,8 28,8

6 98,3 16,4 1,0 6 18,7 26,3 28,0

7 103,2 11,5 1,0 9 24,0 23,6 27,1

Контроль 0 57,5 0 - 0 0 0

Контроль 0 57,5 1,0 — 0 0 0

1 11,5 103,6 0,02 1/9 4,5 5,1 5,3

2 16,4 98,6 0,02 1/6 5,1 6,7 5,7

3 28,7 86,3 0,02 1/3 4,6 4,1 5,0

4 57,3 57,5 0,02 1 20,0 40,2 47,7

5 86,0 28,8 0,02 3 33,8 40,0 52,8

6 98,3 16,4 0,02 6 40,2 49,3 62,3

7 103,2 11,5 0,02 9 57,5 69,3 72,5

Контроль 0 57,5 0 — 0 0 0

Контроль 0 57,5 0,02 — 0 0 0

Использование метода протонного ядерного магнитного резонанса ('Н-ЯМР) позволило подтвердить образование продуктов в модельных системах «Атр/ГБТ» и «Атр/ГБТ/лакказа»

Подсчет протонов атразина в смеси «Атр/лакказа» подтвердил данные ВЭЖХ о том, что лакказа не окисляет атразин Т к реакционные смеси содержали много примесных пиков в области от 5,5 до 0 ррш, сравнение спектров проводили по ароматической области от 8,1 до 7,2 ррш, отличающейся чистотой спектра

Спектры ГБТ и смеси «ГБТ/лакказа» показали изменение структуры ГБТ при воздействии фермента (рис 9) При этом структура продукта менялась с течением времени, т е фактически шел распад ГБТ

В системах «Атр/ГБТ» и «Атр/ГБТ/лакказа» шло образование одинаковых продуктов (соединение Атр-ГБТ), но при этом в области 7,55-7,4 ррш в системе «Атр/ГБТ/лакказа» происходило небольшое смещение по сравнению с «Атр/ГБТ» (см рис 9) Это может говорить об образовании еще одного продукта, подобного соединению Атр-ГБТ Данные ВЭЖХ говорят о том, что этим продуктом является ДЭА-ГБТ

82 81 80 79 78 77 76 75 74 ррт

Рисунок 9 Спектры 'Н-ЯМР систем «ГБТ/лакказа», «Атр/ГБТ» и «Атр/ГБТ/лакказа»

Для установления структуры предполагаемых продуктов был использован метод высокоэффективной жидкостной хроматографии-тандемной масспектрометрии (ВЭЖХ-МС-МС) Полученные данные подтвердили наше предположение об образовании соединения в системе «Атр/ГБТ» (рис 10, А) и об образовании ДЭА и соединения ДЭА-ГБТ в системе «Атр/ГБТ/лакказа» (рис 10, Б)

Рисунок 10 А - продукты, образующиеся в системе «Атр/ГБТ», Б -продукты, образующиеся в системе «Атр/ГБТ/лакказа»

В реакции атразина с ГБТ образуется продукт с молекулярной массой 314 г/моль Он может существовать в двух формах протонированной с м м 315г/моль и дипротонированной с м м 316 г/моль (см рис 10, А) В реакции «Атр/ГБТ/лакказа» образуется ДЭА (см рис 10, Б), протонированная (м м 287 г/моль) и дипротонированная (м м 288 г/моль) формы продукта ДЭА-ГБТ (см рис 10, Б)

Базируясь на полученных данных о пяти установленных структурах продуктов, мы предложили схему окисления атразина системой «лакказа/ГБТ» (рис 11), которая включает неферментативную и ферментативную стадии (рис 12) На неферментативной стадии происходит образование продукта, состоящего из атразина и ГБТ Т к исходные реагенты и продукты в системе Атр/ГБТ находятся в

равновесии, введение в реакцию лакказы вызывает окисление ГБТ и образование радикала ГБТ (см рис 12) Радикал ГБТ реагирует с соединением Атр-ГБТ и инициирует распад связи (-N11-СН-), в результате чего образуются соединение ДЭА-ГБТ и этиловый спирт В свою очередь соединение ДЭА-ГБТ распадается с образованием продуктов — ДЭА и ГБТ Свойства ГБТ образовывать таутомерные формы и непосредственно реагировать с атразином позволили предположить, что ГБТ будет выведен из сферы реакции Однако, согласно предложенной схеме, при гидролизе ДЭА-ГБТ образуются ДЭА и ГБТ Это может быть одной из причин эффективности ГБТ в качестве редокс-медиатора лакказы

. Л сЛД"« сР^Л-^

^ Т 1 Л .. 14 лакказа II

О-

НС'

нм

А. Л.

г.

н/^ы ын н3с-?н сн,

сн3

'з -С.Н.ОН

лакказа

Н >СН-

он

уГ снз

о н^

ян

Н3С сн,

^г .У

I

IV

N №12

Н2КМЗН(СН3)г

Vм-

он

н3с-<гн сн.

Рисунок 11 А - общая предполагаемая схема трансформации атразина системой лакказа/ГБТ

I" о'^г^гО

он 2

нТ

-СН,

Ср^д^с

^ +

сн,

мн2

П

ГУм-оАА-£'сн>

^ м н 'сн.

-С,Н5ОН

' ГУч—т^у-К2 руы-^уш.

^Г схн3 уГ

у г"

о н^ ЯМ

Н3С сн3

'Л

—N

б - Н2ы—СН(СН,)

N.

ОН

I

XI +

О-

сн.

Рисунок 12 Ферментативная стадия предложенной схемы трансформации атразина системой лакказа/ГБТ

Отметим, что лакказа С/иЬостегеа не окисляла атразин в отсутствие медиатора Из четырех выбранных медиаторов (ГБТ, сирингалдазин, [Пи(рИру)(рЬеп)2]РР6 и [Ки(Ьру)2СЬ]) реакцию инициировал только ГБТ, из чего можно сделать вывод, что в данном случае электрохимическая обратимость медиатора и высокая эффективность катализа медиатор/лакказа не являются определяющими факторами деградации Атразин реагировал с ГБТ в отсутствие лакказы с образованием продукта Атр-ГБТ, все хлор-содержащие производные атразина также взаимодействовали с ГБТ, в отличие от гидрокси-производных атразина Это говорит об образовании продукта посредством замещения атома хлора в положении (2) атразина В реакции с участием лакказы образовывались продукты, отличные от продуктов в реакции «Атр/ГБТ», а именно ДЭА и ДЭА-ГБТ Важную роль в ферментативной реакции играло соотношение «ГБТ/атразин», рост этого соотношения вызывал увеличение деструкции атразина

выводы

1 Получены и охарактеризованы индуцибельные и

конститутивные изоформы лакказы базидиомицета Согю1т ¡игзгйт При внесении индуктора синтезируются две индуцибельные и две конститутивные формы фермента По изоэлектрической точке, молекулярной массе, углеводному составу и термостабильности индуцибельные формы фермента незначительно отличаются от конститутивных форм фермента Исследованные физико-химические свойства и кинетические параметры индуцибельных форм позволяют предположить их эффективное участие в процессах делигнификации и детоксификации ксенобиотиков

2 Показана возможность деградации гербицида атразина базидиальными грибами Сопо1ш ЫгвШиз, Сеггепа тссхта, Сопо1ор$1$ /иЬостегеа и ко-культурой Сопо1т ЫгзЫт/Сеггепа тахта в условиях глубинного культивирования Выявлена корреляция между уровнем деградации атразина и биосинтезом оксидоредуктаз (Мп-пероксидазы и лакказы)

3 Показано, что деградация атразина в модельных системах «атразин/медиатор» и «атразин/медиатор/лакказа» происходит при использовании в качестве редокс-медиатора 1-гидроксибензотриазола

4 Установлены продукты деградации гербицида атразина в системах «атразин/1-гидроксибензотриазол» и «атразин/ 1-гидроксибензотриазол/лакказа» В системе «атразин/ 1-гидроксибензотриазол» образуются два продукта - соединение атразин-1-гидроксибензотриазол в протонированной и дипротонированной форме, в системе «атразин/1-гидроксибензотриазол/лакказа» идет формирование 5 основных продуктов соединение атразин—1-гидроксибензотриазол в двух формах, соединение деэтилатразин-1-гидроксибензотриазол в протонированной и дипротонированной форме и деэтилатразин На основании полученных данных предложен механизм деградации атразина в системе «атразин/1-гидроксибензотриазол/лакказа»

ОСНОВНЫЕ РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1 Горбатова О H , Степанова Е В , Королева О В Изучение некоторых биохимических и физико-химических свойств индуцибельной формы внеклеточной лакказы базидиомицета Coriolus hirsutus Прикладная биохимия и микробиология, 2000, т 36, №3, с 212—211

2 Горбатова О H , Королева О В , Ландесман Е О , Степанова Е В , Жердев А В Индукция биосинтеза лакказы как способ увеличения потенциала детоксификации базидиомицетами Прикладная биохимия и микробиология, 2006, т 42, №4, с 468^74

3 Горбатова О H , Жердев А В Королева О В Триазиновые пестициды структура, действие на живые организмы, процессы деградации Успехи биологической химии, 2006, т 46, с 323-348

Тезисы

4 Gorbatova О , Koroleva О , Stepanova Е , Landesman Е , Zherdev А Degradation of herbicide atrazine by basidiomycetes producing extracellular laccases Proceedings of the «First International Conference on Remediation of Contaminated Sediments» Venice, Italy, October 10-12, 2001, p 321-324

5 Gorbatova О N, Koroleva О V The role of redox-mediators in biodégradation of herbicide atrazine by fungal laccase Young Scientists Conference «Biotechnology for future» affiliated to the 3-rd International Symposium «EU—Russia Prospects for Cooperation in Biotechnology in the Seventh Framework Programme» St Petersburg, Russia, June 6-8, 2006, p 23-24

Заказ № 239/04/07 Подписано в печать 26 04 2006 Тираж 100 экз Уел пл 1,5

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20

\) \\zww с/г ги , е-тай т/о@с/г ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Горбатова, Ольга Николаевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структура триазиновых пестицидов.

1.2. Циркуляция триазиновых пестицидов в экосистемах.

1.3. Общие принципы действия атразина на живые организмы и его метаболизм.

1.4. Действие триазиновых пестицидов на живые организмы.

1.4.1. Высшие растения и водоросли.

1.4.2. Беспозвоночные.

1.4.3. Позвоночные.

1.4.4. Бактерии и грибы.

1.5. Биодеградация триазиновых соединений.

1.5.1. Высшие растения и водоросли.

1.5.2. Млекопитающие.

1.5.3. Бактерии.

1.5.4. Грибы.

1.5.4.1 Лигнинпероксидазы.

1.5.4.2 Марганецпероксидазы.

1.5.4.3 Лакказы.

1.6. Неферментативная деструкция триазиновых соединений.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Деградация гербицида атразина базидиальными грибами и их ферментами"

Деградация ксенобиотиков в природе является процессом, интенсивное изучение которого вызвано, прежде всего, необходимостью создания экологически безопасных биотехнологий.

Пестициды выступают как мощный целенаправленный фактор в агроценозах, сокращая видовое разнообразие экосистем. Действие гербицидов приводит к сублетальным поражениям и смертности. Наиболее значительные изменения происходят при воздействии гербицидов на растительные сообщества. Уничтожение сорняков приводит к сокращению разнообразия фитофагов за счет выпадения видов, облигатно питающихся сорняками. Эти изменения затрагивают, прежде всего, личиночное и эмбриональное развитие. Под влиянием гербицидов изменяются микроклиматические условия.

В связи этим большое внимание в современных исследованиях уделяется вопросам транслокации и трансформации пестицидов в системах растение-почва-вода в сочетании с характеристикой токсического воздействия на компоненты природных сообществ.

Гербицид атразин и продукты его метаболизма широко представлены в биогеоценозах многих стран и различных природных зон. Мировое производство атразина составляет около 500 т/год. Поскольку триазиновые гербициды на сегодняшний день являются одним из наиболее широко используемых классов пестицидов и остаются неотъемлемой частью сельскохозяйственных технологий, то речь идет не об отказе от них, а о выборе оптимальных стратегий трансформации и удаления из окружающей среды.

Атразин, как и продукты его метаболизма, токсичны и лабильны; они легко уходят в грунтовые воды и широко распространяются в вертикальных и горизонтальных биогеоценозах. Описаны разнообразные последствия воздействия триазиновых гербицидов как на растительные, так и на животные организмы [Bester К. и др. 2000, Dewey S.L. и др. 1986, Lakshminarayana J.S.S. и др. 1992, Graymore М. и др. 2001, Hall L.W. и др. 1997]. Показана генотоксичность атразина; имеется ряд данных о его негативном влиянии на человеческий организм [U.S.ЕРА 2002, Sanderson J.T. и др. 2001, Timchalk С. и др. 1990, Buchholz В.А. и др. 1999, Ribas G. и др. 1998].

С нашей точки зрения, изучение деградации ксенобиотиков, в частности пестицидов, в природных сообществах следует проводить с учетом состава микрофлоры, 7 имеющей непосредственных контакт с данным пестицидом в процессе его метаболизма в цепи: растение - почва - воды (в том числе грунтовые). Основываясь на этом положении, особое внимание необходимо уделять поверхностному слою почвы с растительными остатками, основным компонентом микробиальных консорциумов которого являются базидиомицеты. В ряде работ показан высокий потенциал базидиальных грибов как эффективных деструкторов ксенобиотиков, в том числе и пестицидов [Jonas U. и др. 1998, Mougin С. и др. 2002, Mayer A.M. и др. 2002, Kang К.-Н. и др. 2002].

Имеющиеся на сегодняшний день данные говорят о том, что пероксидазы, тирозиназы и лакказы, относящиеся к классу оксидоредуктаз, участвуют в детоксификации многих пестицидов, в том числе и атразина. Огромную роль в процессах окисления играет именно лакказа. Косвенно эту гипотезу подтверждает тот факт, что грибные лакказы в присутствии редокс-медиаторов могут деструктировать хлорфенолы, полициклические углеводороды и некоторые соединения нервно-паралитического действия [Leontievsky A.A. и др. 2001, Bressler D.C. и др. 2000, Johannes С. и др. 1996, Cho S.-J. и др. 2002]. Но механизмы этой деградации до сих пор не изучены.

Представленный выше анализ ситуации свидетельствует об актуальности создания новых биотехнологических методов деструкции пестицидов, в том числе атразина. Лакказа является перспективным детоксифицирующим компонентом таких систем, а эффективное использование фермента в биотехнологических процессах должно базироваться на данных о его структурной организации и механизме действия.

Цель работы и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение деградации гербицида атразина базидиальными грибами и их ферментами.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести сравнительное исследование индуцибельных и конститутивных форм грибных лакказ на примере лакказы базидиомицета Coriolus hirsutus\

2. Изучить деградацию атразина базидиальными грибами в отсутствие и в присутствии индукторов биосинтеза лакказ;

3. Охарактеризовать лакказу базидиомицета Coriolopsis fulvocinerea, обладающего самым высоким детоксификационным потенциалом в отношении атразина;

4. Исследовать системы «атразин/лакказа/редокс-медиатор» и установить структуры продуктов трансформации атразина;

5. Установить механизм окисления атразина лакказой в присутствии редокс-медиатора.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Горбатова, Ольга Николаевна

выводы

1. Получены и охарактеризованы индуцибельные и конститутивные изоформы лакказы базидиомицета Coriolus hirsutus. При внесении индуктора синтезируются две индуцибельные и две конститутивные формы фермента. По изоэлектрической точке, молекулярной массе, углеводному составу и термостабильности индуцибельные формы фермента незначительно отличаются от конститутивных форм фермента. Исследованные физико-химические свойства и кинетические параметры индуцибельных форм позволяют предположить их эффективное участие в процессах делигнификации и детоксификации ксенобиотиков.

2. Показана возможность деградации гербицида атразина базидиальными грибами Coriolus hirsutus, Cerrería maxima, Coriolopsis fulvocinerea и ко-культурой Coriolus hirsutus/Cerrena maxima в условиях глубинного культивирования. Выявлена корреляция между уровнем деградации атразина и биосинтезом оксидоредуктаз (Mn-пероксидазы и лакказы).

3. Показано, что деградация атразина в модельных системах «атразин/медиатор» и «атразин/медиатор/лакказа» происходит при использовании в качестве редокс-медиатора 1 -гидроксибензотриазола.

4. Установлены продукты деградации гербицида атразина в системах «атразин/1-гидроксибензотриазол» и «атразин/1-гидроксибензотриазол/лакказа». В системе «атразин/1-гидроксибензотриазол» образуются два продукта - соединение атразин-1-гидроксибензотриазол в протонированной и дипротонированной форме; в системе «атразин/1-гидроксибензотриазол/лакказа» идет формирование пяти основных продуктов: соединение атразин-1-гидроксибензотриазол в двух формах, соединение деэтилатразин-1-гидроксибензотриазол в протонированной и дипротонированной форме и деэтилатразин. На основании полученных данных предложен механизм деградации атразина в системе «атразин/1-гидроксибензотриазол/лакказа».

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Горбатова, Ольга Николаевна, Москва

1. Болобова A.B., Аскадский A.A., Кондращенко В.И., Рабинович М.Л. Теоретические основы биотехнологии древесных композитов. Ферменты, модели, процессы. М.: 2002. В 2-х тт. Т. 2.

2. Вайткявичус Р.К., Вельжите В.А., Ченас Н.К. Выделение и кинетические параметры лакказы Polyporus anicoporus. Биохимия. 1984. Т. 49, N 6, сс. 1000-1003.

3. Вилесов A.C. Исследование взаимодействия координационных комплексов рутения и грибной лакказы Coriolus hirsutus. Дипломная работа. Институт биохимии им.А.Н.Баха РАН Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова. М.: 2006.

4. Горбатова О.Н., Королева О.В., Ландесман Е.О., Степанова Е.В., Жердев A.B. Индукция биосинтеза лакказы как способ увеличения потенциала детоксификации базидиомицетами. Прикл. биохим. микробиол. 2006. Т. 42, N 4, сс. 268-274.

5. Горбатова О.Н., Степанова Е.В., Королева О.В. Изучение некоторых биохимических и физикохимических свойств индуцибельной формы внеклеточной лакказы базидиомицета Coriolus hirsuius. Прикл. биохим. микробиол. 2000. Т. 36, N 3, сс. 272-277.

6. Деградация пестицидов при комплексной защите сельскохозяйственных культур от вредных организмов. Сборник трудов Симпозиума. Л.: 1990.

7. Каспаров В.А., Промоненков В.К. Применение пестицидов за рубежом. Агропромиздат. М.: 1990.

8. Ларина Г.Е. Комплексная оценка действия гербицидов на компоненты агроценоза. Агрохимия. 2002. Т.4, сс. 54-64.

9. Леонтьевский А.А., Мясоедова Н.М., Коломиец Э.И., Головлева J1.A. Индукция лигнолитических ферментов гриба белой гнили Partus tigrinus 8/18. Биохимия. 1991. Т. 6, N9, сс. 1665-1675.

10. Мартыненко В.И., Промоненков В.К., Кукаленко С.С. и др. Пестициды. Справочник. М. Агропромиздат: 1992.

11. Мельников Н.Н. Пестициды. Химия, технология и применение. М.: 1987.

12. Мельников Н.Н., Новожилов К.В., Белан С.Р. Пестициды и регуляторы роста растений. Справочник. М.: 1995.

13. Микробная деградация пестицидов. Под ред. док. Либерштейна И.И. Кишинев:1991.

14. Поведение пестицидов и химикатов в окружающей среде. Труды советско-американского симпозиума, Айова-Сити, США, октябрь 1987. Л.: 1991.

15. Рабинович М.Л., Болобова А.В., Васильченко Л.Г. Разложение природных ароматических структур и ксенобиотиков грибами (обзор). Прикл. биохим. микробиол. 2004. Т.40, N1, сс. 5-23.

16. Скоробогатько О.В., Степанова Е.В., Гаврилова В.П., Ярополов А.И. Влияние индукторов на синтез внеклеточной лакказы базидиомицетом Coriolus hirsutus. Прикл. биохим. микробиол. 1996. Т. 32, N 5, сс. 524-528.

17. Agdi К., Bouaid A., Esteban A.M., Hernando P.F., Azmani A., Camara C. Removal of atrazine and four organophosphorus pesticides from environmental waters by diatomaceous earth-remediation method. J. Environ. Monit. 2000. V. 2, pp. 420-423.

18. Agostinelli E.A., Cervoni L., Morpurgo L., Stability of japanese-laquer-tree (Rhus vernicifera) laccase to thermal and chemical denaturation: comparison of ascorbate oxydase. Biochem.j. 1995. V. 306, N3, pp. 697-702.

19. Aktas N., Tanyola? A. Kinetics of laccase-catalyzed oxidative polymerization of catechol. J. of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2003. V. 22, pp. 61-69.

20. Ander P., Marzullo L. Sugar oxidoreductases and veratryl alcohol oxidase as related to lignin degradation. J. of Biotechnology. 1997. V. 53, pp. 115-131.

21. Ander P., Messner K. Oxidation of 1-hydroxybenzotriazole by laccase and lignin peroxidase. Biotechnology Techniques. 1998. V. 12, N 3, pp. 191-195.

22. Appelbaum L., Heinrichs C., Demtschuk J., Michman M., Orona M., Schafer H.J., Schumann H. Ru(CH3CN)3Cl3, preparation and use as a mediator for the electrooxidation of hydrocarbons. J. of Organometallic Chemistry. 1999. V. 592, pp. 240-250.

23. Arico A.S., Antonucci P.L., Modica E., Baglio V., Kim H., Antonucci V. Effect of Pt-Ru alloy composition on high-temperature methanol electro-oxidation. Electrochimica Acta. 2002. V. 47, pp. 3723-3732.

24. Babu V.V.S., Gopi H.N. Rapid and efficient synthesis of peptide fragment, containing a-aminoisobutyric acid using Fmoc-amino acid chlorides/potassium salt of 1-hydroxybenzotriazole. Tetrahedron Letter. 1998. V. 39, pp. 1049-1050.

25. Balakshin M., Chen C.-L., Gratzl J. S., Kirkman A. G., Jakob H. Biobleaching of puip with dioxygen in laccase-mediator system-effect of variables on the reaction kinetics. J. of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2001. V. 16, N 3-4, pp. 205-215.

26. Barcelo D. Occurrence, handling, and chromatographic determination of pesticides in aquatic environment. Analyst. 1991. V. 116, pp. 681-689.

27. Barreca A. M., Fabbrini M., Galli C., Gentili P., Ljunggren S. Laccase/mediated oxidation of a lignin model for improved delignification procedures. J. of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2003. V. 26, pp. 105-110.

28. Bending G.D., Friloux M., Walker A. Degradation of contrasting pesticides by white rot fungi and its relationship with ligninolytic potential. FEMS Microbiology Letters. 2002. V. 212, pp. 59-63.

29. Berglund J., Pascher T., Winkler J.R., Gray H.B. Photoinduced oxidation of horseradish peroxidase. J. of the American Chemical Society. 1997. V. 119, pp. 2464-2469.

30. Bester K. Effects of pesticides on seagrass beds. Helgol Mar. Res. 2000. V. 54, pp. 95-98.

31. Bichat F., Sims G.K., Mulvaney R.L. Microbial utilization of heterocyclic nitrogen from atrazine. Soil Sci. Soc. Amer. J. 1999. V. 63, pp. 100-110.

32. Bode M., Stobe P., Thicdc B., Schuphan I., Schmidt B. Biotransformation of atrazine in transgenic tobacco cell culture expressing human P450. Pest. Manag. Sci. 2004. V. 60, pp. 4958.

33. Bourbonnais R., Leech D., Paice M.G. Electrochemical analysis of the interactions of laccase mediators with lignin model compounds. Biochimica and Biophysica Acta. 1998. V. 1379, pp. 381-390.

34. Bressler D. C., Fedorak P. M., Pickard M. A. Oxidation of carbazole, N-ethylcarbazole, fluorene, and dibenzothiophene by the laccase of Coriolopsis gallica. Biotechnology Letters. 2000. V. 22, pp. 1119-1125.

35. Broman L., Malmstrom B.G., Aasa R., Vanngard T. Quantitative electron spin resosnance studies on native and denaturated ceruloplasmin and laccase. J. Mol. Biol. 1962. V. 5, N3-4, pp. 301-310.

36. Bromberg N., Duran N. Violacein transformation by peroxidases and oxidases: implications on its biological properties. J. of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2001. V. 11, N 4-6, pp. 463-467.

37. Buchholz B.A., Fultz E., Haack K.W., Vogel J.S., Gilman S.D., Gee S.J., Hammock B.D., Hui X., Wester R.C., Maibach H.I. HPLC-accelerator MS measurement of atrazine metabolites in human urine after dermal exposure. Anal. Chem. 1999. V. 71, pp. 3519-3525.

38. Call H.P., Mucke I. History, overview and applications of mediated lignolytic systems, especially laccase-mediator-systcms (Lignozym-process). J. of Biotechnology. 1997. V. 53, pp. 163-202.

39. Cameselle C., Pazos M., Lorenzo M., Sanroman M.A. Enhanced decolourisation ability of laccase towards various synthetic dyes by an electrocatalysis technology. Biotechnology Letters. 2003. V. 25, pp. 603-606.

40. Campos C., Snoeyink V.L., Marinas B., Baudin I., Lainea J.M. Atrazine removal by powedered activated carbon in floe blanket reactors. Water Research. 2000. V. 34, N 16, pp. 4070-4080.

41. Cantarella G., Galli C., Gentili P. Free radical versus electron-transfer routes of oxidation of hydrocarbons by laccase/mediator systems. Catalytic or stoichiometric procedures. J. of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2003. V. 22, pp. 135-144.

42. Cantarella G., Galli C., Gentili P. Oxidation of non-phenolic substrates with the laccase/N-hydroxyacetanilide system: Structure of the key intermediate from the mediator and mechanistic insight. New J. Chem. 2004. V. 28, pp. 366 372.

43. Carunchio F., Crescenzi C., Girelli A. M., Messina A., Tarola A. M. Oxidation of ferulic acid by laccase: identification of the products and inhibitory effects of some dipeptides. Talanta. 2001. V. 55, pp. 189-200.

44. Chen C.-L., Potthast A., Rosenau T., Gratzl J. S., Kirkman A. G., Nagai D., Miyakoshi T. Laccase-catalyzed oxidation of l-(3,4-dimethoxyphenyl)-l-propene using ABTS as mediator. J. of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2000. V. 8, pp. 213-219.

45. Cho S.-J., Park S. J., Lim J.-S., Rhee Y. H., Shin K.-S. Oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbons by laccase of Coriolus hirsutus. Biotechnology Letters. 2002. V. 24, pp. 13371340.

46. Chua H., Yu P.H.F., Lo W., Sin S.N. The degradation of xenobiotic branched carboxylic acids in anaerobic sediment of the Pearl Rover in Southern China. Science Total Envir. 2001. V. 266, pp. 221-228.

47. Colao M. C., Lupino S., Garzillo A. M., Buonocore V., Ruzzi M. Heterologous expression of lccl gene from Trametes trogii in Pichia pastoris and characterization of the recombinant enzyme. Microbial Cell Factories. 2006. V. 5, N 31.

48. Coleman N.V., Nelson D.R., Duxbury T. Aerobic biodégradation of hexahydro-1,3,5-trinitro-l,3,5-triazine (RDX) as a nitrogen source by a Rhodococcus sp., strain DN22. Soil Biol. Biochem. 1998. V. 30, N 8/9, pp. 1159-1167.

49. Copley S.D. Evolution of a metabolic pathway for degradation of a toxic xenobiotic: the patchwork approach. TIBS. 2000. V. 25, pp. 261-265.

50. Crawford J.J., Sims G.K., Mulvaney R.L., Radosevich M. Biodégradation of atrazine under denitrifying conditions. Appl.Microbiol.Biotechnol. 1998. V. 49, pp. 618-623.

51. Crawford J.J., Traina S.J., Tuovinen O.H. Bacterial degradation of atrazine in redox potential gradients in fixed-film sand columns. Soil Sci. Soc. Am. J. 2000. V. 64, pp. 624-634.

52. Cui H., Hwang H.-M., Zeng K., Glover H., Yu H., Liu Y. Riboflavin-photosensitized degradation of atrazine in a freshwater environment. Chemosphere. 2002. V. 47, pp. 991-999.

53. D'Annibale A., Crestini C., Di Mattia E., Sermanni G.G. Veratryl alcohol oxidation by manganese-dependent peroxidase from Lentinus edodes. J. of Biotechnology. 1996. V. 48, pp. 231-239.

54. Davies P.E., Cook L.S.J., Barton J.L. Triazine herbicide contamination of Tasmanian streams: sources, concentrations and effects on biota. Aust. J. Mar. Freshwater Res. 1994a. V.45,pp.209-226.

55. Davies P.E., Cook L.S.J., Goenarso D. Sublethal responses to pesticides of several species of Australian freshwater fish and crustaceans and rainbow trout. Envir. Toxicol. Chem. 1994b. V. 13, pp. 1341-1354.

56. De Souza M.L., Seffernick J., Martinez B., Sadowsky M.J., Wackett L.P. The atrazine catabolism genes atzABC are widespread and highly conserved. J. of Bacteriology. 1998a. V. 180, pp.1951-1954.

57. De Souza M.L., Newcombe D., Alvey S., Crowley D.E., Hay A., Sadowsky M.J., Wackett L.P. Molecular basis of bacterial consortium: interspecies catabolism of atrazine. Appl. Environ. Microbiol. 1998b. V. 64, pp. 178-184.

58. Degani. Y., Heller A. Electrical communication between redox centers of glucose oxidase and electrodes via electrostatically and covalently bound redox polymers. J. Am. Chem. Soc. 1989. V. Ill, pp. 2357-2358.

59. Dubowchik G.M., King H.D., Pham-Kaplita K. Efficient mytomycin C coupling with stable p-nitrophenyl-benzyl carbonates using N-hydroxybenzotriazole as catalytic additive. Tetrahedron Letters. 1997. V. 30, N 30, pp. 5261-5264.

60. Durr H. Bossmann S. Ruthenium polypyridine complexes. On the route to biomimetic assemblies asmodels for the photosynthetic reaction center. Accounts of Chemical Research. 2001. V. 34, N 11, pp. 905-917.

61. Eggert C., Temp U., Dean J.F.D., Eriksson K.-E. L. A fungal metabolite mediates degradation of non-phenolic lignin structures and synthetic lignin by laccase. FEBS Letters. 1996. V. 391, pp. 144-148.

62. Fabbrini M., Galli C., Gentili P., Macchitella D. An oxidation of alcohols by oxygen with the enzyme laccase and mediation by TEMPO. Tetrahedron Letters. 2001. V. 42, pp. 7551-7553.

63. Fabbrini M., Galli C., Gentili P. Comparing the catalytic efficiency of some mediators of laccase. J. of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2002a. V. 16, pp. 231-240.

64. Fabbrini M., Galli C., Gentili P. Radical or electron-transfer mechanism of oxidation with some laccase/mediator systems. J. of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2002b. V. 18, pp. 169-171.

65. Fahraeus G., Reinhammer B., Large scale production and purification of laccase from cultures of fungus Polyporus versicolor and some properties of laccase. Acta Chem.Scand. 1967. V. 21, N9, pp. 2367-2378.

66. Fang C., Radosevich M., Fuhrmann J. J. Atrazine and phenanthrene degradation in grass rhizosphere soil. Soil Biology & Biochemistry. 2001. V. 33, pp. 671-678.

67. Fernandez-Sanchez C., Tzanov T., Gubitz G.M., Cavaco-Paulo A. Voltammetric monitoring of laccase-catalysed mediated reactions. Bioelectrochemistry. 2002. V. 58, pp. 149— 156.

68. Freire R.S., Duran N., Kubota L.T. Effects of fungal laccase immobilization procedure for the development of a biosensor for phenol compounds. Talanta. 2001. V. 54, pp. 681-686.

69. Fujisawa M., Hirai H., Nishida T. Degradation of polyethylene and nylon-66 by the laccase-mediator system. J. of Polymers and the Environment. 2001. V. 9, N 3, pp. 103-108.

70. Galhaup C., Goller S., Peterbauer C.K., Strauss J., Haltrich D. Characterization of the major laccase isoenzyme from Trametes pubescens and regulation of its synthesis by metal ions. Microbiology. 2002. V. 148, pp. 2159-2169.

71. Gallard H., De Laat J. Kinetic modeling of Fe(III)/H202 oxidation reactions in dilute aqueous solution using atrazine as model organic compound. Wat. Res. 2000. V. 34, N 12, pp. 3107-3116.

72. Gallard H., De Laat J. Kinetics of oxidation of chlorobenzenes and phenyl-ureas by Fe(II)/H202 and Fe(III)/H202. Evidence of reduction and oxidation reactions of intermediates by Fe(II) or Fe(III). Chemosphere. 2001. V. 42, pp. 405^413.

73. Gebendinger N., Radosevich M. Inhibition of atrazine degradation by cyanazine and exogenous nitrogen in bacterial isolate M91-3. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. V. 51, pp. 375-381.

74. Gehlen J.N., Daizaden I., Stuchebrukhov A.A., Marcus R.A. Tunneling matrix element in Ru-modified blue copper proteins: pruning the protein in search of electron transfer pathways. Inorg. Chim.Acta. 1996. V. 243, pp. 271-282.

75. Geng X., Li K., Xu F. Investigation of hydroxamic acids as laccase-mediators for pulp bleaching. Appl Microbiol Biotechnol. 2004. V. 64, pp. 493^496.

76. Ghauch A., Suptil J. Remediation of s-triazines contaminated water in a laboratory scale apparatus using zero-valent iron powder. Chemospere. 2000. V. 41, pp. 1835-1843.

77. Giardina P., Palmieri G., Scaloni A., Fontanella B., Faraco V., Cennamo G., Sannia G. Protein and gene structure of a blue laccase from Pleurotus ostreatus. Biochem. J. 1999. V. 341, pp. 655-663.

78. Gray H. B., Winkler J. R. Electron Transfer in Proteins. Annu. Rev. Biochem. 1996. V. 65, pp. 537-561.

79. Graymore M., Stagnitti F., Allinson G. Impacts of atrazine in aquatic ecosystems. Environment International. 2001. V. 26, pp. 483^495.

80. Graziani M.T., Antonilli L., Sganga P., Citro G., Mondovi B., Rosei M.A. Biochemical and immunological studies of deglycosylated Rhus vernicifera laccase. Biochem. Int. 1990. V. 21, N6, pp. 1113-1124.

81. Haas R., Tsivunchyk O., Steinbach K., v. Low E., Scheibner K., Hofrichter M. Conversion of adamsite (phenarsarzin chloride) by fungal manganese peroxidase. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2004. V. 63, pp. 564-566.

82. Halasz A., Groom C., Zhou E., Paquet L., Beaulieu C., Deschamps S., Corriveau A., Thiboutot S., Ampleman G., Dibois C., Hawari J. Detection of explosives and their degradation products in soil environments. J. Chromatogr. A. 2002. V. 963, pp. 411-418.

83. Hall L.W., Anderson R. D., Ailstock M. S. Chronic toxicity of atrazine to sago pondweed at a range of salinities: Implications for criteria development and ecological risk. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 1997. V. 33, pp. 261-267.

84. Han M.-J., Choi H.-T., Song H.-G. Purification and characterization of laccase from white rot fungus Trametes versicolor. The J. of Microbiology. 2005. V. 43, N6, pp. 555-560.

85. Harvey S.D., Galloway H., Krupsha A. Trace analysis of military high explosives (2,4,6-trinitrotoluene and hexahydro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazine) in agricultural crops J. Chromatogr. A. 1997. V. 775, pp. 117-124.

86. Henriksson G., Sild V., Szabo I. J., Pettersson G., Johansson G. Substrate specificity of cellobiose dehydrogenase from Phanerochaete chrysosporium. Biochimica et Biophysica Acta. 1998. V. 1383, pp. 48-54.

87. Henriksson G., Zhang L., Li J., Ljungquist P., Reitberger T., Pettersson G., Johansson G. Is cellobiose dehydrogenase from Phanerochaete chrysosporium a lignin degrading enzyme? Biochimica et Biophysica Acta. 2000. V. 1480, pp. 83-91.

88. Hequet V., Gonzalez C., Le Cloirec P. Photochemical processes for atrazine degradation: methodological approach. Wat. Res. 2001. V. 35, N 18, pp. 4253-4260.

89. Hequet V., Le Cloirec P., Gonzalez C., Meunier B. Photocatalytic degradation of atrazine by porphyrin and phthalocyanine complexes. Chemosphere. 2000. V. 41, pp. 379-386.

90. Hilden L., Johansson G., Pettersson G., Li J., Ljungquist P., Henriksson G. Do the extracellular enzymes cellobiose dehydrogenase and manganese peroxidase form a pathway in lignin biodégradation? FEBS Letters. 2000. V. 477, pp. 79-83.

91. Hofrichter M. Review: lignin conversion by manganese peroxidase (MnP). Enzyme and Microbial Technology. 2002. V. 30, pp. 454-466.

92. Hogan C. F., Forster R. J. Mediated electron transfer for electroanalysis: transport and kinetics in tin films of Ru (bpy)2PVPi0. (C104)2. Analytica Chimica Acta. 1999. V. 396, pp. 1321.

93. Hublik G., Schinner F. Characterization and immobilization of the laccase from Pleorotus ostreatus and its use for the continuous elimination of phenolic pollutants. Enzyme and Microbial Technology. 2000. V. 27, pp. 330-336.

94. Huston P.L., Pignatello G.G. Degradation of selected pesticide active ingredients and commercial formulations in water by the photo-assisted Fenton reaction. Water Research. 1999. V. 3,N 5,pp. 1238-1246.

95. Johannes C., Majcherczyk A., Huttermann A. Degradation of anthracene by laccase of Trametes versicolor in the presence of different mediator compounds. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996. V. 46, pp. 313-317.

96. Kang K.-H., Dec J., Park H., Bollag J.-M. Transformation of the fungicide cyprodinil by a laccase of Trametes villosa in the presence of phenolic mediators and humic acid. Wat.Res. 2002. V. 36, pp. 4907-4915.

97. Katz I., Dosoretz C.G., Mandelbaum L.T., Green M. Atrazine degradation under denitrifying conditions in continuous culture of Pseudomonas ADP. Water Research. 2001. V. 35,N 13,pp. 3272-3275.

98. Kauffmann C., Mandelbaum R. T. Entrapment of atrazine chlorohydrolase in sol-gel glass matrix. J. of Biotechnology. 1998. V. 62, pp. 169-176.

99. Kawai S., Nakagawa M., Ohashi H. Aromatic ring cleavage of a non-phenolic P-O-4 lignin model dimer by laccase of Trametes versicolor in the presence of 1-hydroxybenzotriazole. FEBS Letters. 1999b. V. 446, pp. 355-358.

100. Kiiskinen L.-L., Kruus K., Bailey M., Ylosmaki E., Siika-aho M., Saloheimo M. Expression of Melanocarpus albomyces laccase in Trichoderma reesei and characterization of the purified enzyme. Microbiology. 2004. V. 150, pp. 3065-3074.

101. Kiiskinen L.-L., Viikari L., Kruus K. Purification and characterisation of a novel laccase from the ascomycete Melanocarpus albomyces. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. V. 59 pp. 198-204.

102. Klonowska A., Gaudin C., Fournel A., Asso M., Le Petit J. Characterization of a low redox potential laccase from the basidiomycete C30. Eur. J. Biochem. 2002. V. 269, pp. 61196125.

103. Ko E.-M., Leem Y.-E., Choi H. T. Purification and characterization of laccase isozymes from the white-rot basidiomycete Ganoderma lucidum. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. V. 57, pp. 98-102.

104. Kodama T., Ding L., Yoshida M., Yajima M. Biodégradation of an s-triazine herbicide, simazine. J. of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2001. V. 11, pp. 1073-1078.

105. Kornerova M., Hola D., Chodova D. The effect of irradiance on Hill reaction activity of atrazine-resistant and -susceptible biotypes of weeds. Photosynthetica. 1998. V. 35, pp. 265-268.

106. Ma J., Graham N.J.D. Degradation of atrazine by manganese-catalysed ozonation-influence of radical scavengers. Wat. Res. 2000. V. 34, N 15, pp. 3822-3828.

107. Mandelbaum R.T., Allan B.H., Wackett L.P. Isolation and characterization of a Pseudomonas sp. that mineralizes the s-triazine herbicide atrazine. Appl. Environ. Microbiol. 1995. V.61,pp. 1451-1457.

108. Mayer A. M., Staples R. C. Laccase: new functions for an old enzyme. Phytochemistry. 2002. V. 60, pp. 551-565.

109. Moldes D., Couto S. Rodriquez, Cameselle C., Sanroman M.A. Study of the degradation of dyes by MnP of Phanerochaete chrysosporium produced in a fixed-bed bioreactor. Chemosphere. 2003. V. 51, pp. 295-303.

110. Mori T., Kondo R. Degradation of 2,7-dichlorodibenzo-p-dioxin by wood-rotting fungi, screened by dioxin degrading ability. FEMS Microbiology Letters. 2002. V. 213, pp. 127-131.

111. Mougin C., Kollmann A., Jolivalt C. Enhanced production of laccase in the fungus Trametes versicolor by the addition of xenobiotics. Biotechnology Letters. 2002. V. 24, pp. 139142.

112. Newcombe D. A., Crowley D. E. Bioremediation of atrazine-contaminated soil by repeated applications of atrazine-degrading bacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. V. 51, pp. 877-882.

113. Nishimura K., Yamamoto M., Nakagomi T., Takiguchi Y., Naganuma T., Uzuka Y. Biodégradation of triazine herbicides on polyvinylalcohol gel plates by the soil yeast Lipomyces starkeyi. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. V. 58, pp. 848-852.

114. Oh K.-H., Kim Y.-J. Degradation of explosive 2,4,6-trinitrotoluene by s-triazine degrading bacterium isolated from contaminated soil. Bull. Environm. Contain. Toxicol. 1998. V.61,pp. 702-708.

115. Orth A.B., Tien M. Biotechnology of lignin biodégradation. In: Kuck (Ed.). The mycota II. Genetics and biotechnology. Springer-Verlag Berlin Heidelberg CO. 1995. pp. 289-302.

116. Palma C., Moreira M.T., Feijoo G., Lema J.M. Enhanced catalytic properties of MnP by exogenous addition of manganese and hydrogen peroxide. Biotechnology Letters. 1997. V. 19, N 3, pp. 263-267.

117. Paszczynski A., Crawford R.L., Huynh V.-B. Methods Enzymology. 1988. V. 161, pp. 264-271.

118. Pesticide Chemistry and Bioscience. The Food Environment Challenge. Cambridge: The Royal Society of Chemistry. Thomas Graham House. 1999. Pp. 259-262.

119. Petrier C., David B., Laguian S. Ultrasonic degradation at 20 kHz and 500 kHz of atrazine and pentachlorophenol in aqueous solution: preliminary results. Chemosphere. 1996. V. 32, N9, pp. 1709-1718.

120. Piutti S., Hallet S., Rousseaux S., Philippot L., Soulas G., Martin-Laurent F. Accelerated mineralisation of atrazine in maize rhizosphere soil. Biol. Fertil. Soils. 2002. V. 36, pp. 434-441.

121. Pointing S.B. Feasibility of bioremediation by white-rot fungi. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. V. 57, pp. 20-33.

122. Ralebitso T.K., Senior E., van Verseveld H.W. Microbial aspects of atrazine degradation in natural environments. Biodégradation. 2002. V. 13, pp. 11-19.

123. Reyes P., Pickard M.A., Vazquez-Duhalt R. Hydroxybenzotriazole increases the range of textile dyes decolorized by immobilized laccase. Biotechnol. Letters. 1999. V. 21, pp. 875-880.

124. Rhine E.D., Fuhrmann J.J., Radosevich M. Microbial community responses to atrazine exposure and nutrient availability: Linking degradation capacity to community structure. Microb. Ecol. 2003. V. 46, pp. 145-160.

125. Ribas G., Surralles J., Carbonell E., Creus A., Xamena N., Marcos R. Lack of genotoxicity of the herbicide atrazine in cultured human lymphocytes. Mutation Research. 1998. V. 416, pp. 93-99.

126. Rodriguez E., Pickard M. A., Vazquez-Duhalt R. Industrial dye decolorization by laccases from ligninolytic fungi. Current Microbiology. 1999. V. 38, pp. 27-32.

127. Rogalski J., Dawidowicz A., Jozwik E., Leonowicz A. Immobilization of laccase from Cerrena unicolor on controlled porosity glass. J. of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 1999. V.6, pp. 29-39.

128. Rogalski J., Jozwik E., Hatakka A., Leonowicz A. Immobilization of laccase from Phlebia radiata on controlled porosity glass. J. of Molecular Catalysis A: Chemical. 1995. V. 95, p. 99-108.

129. Ryabov A.D. Mechanisms of intramolecular activation of C-H bonds in transition metal complexes. Chem. Rev. 1990. V. 90, N 2, pp. 403-424.

130. Saari L.L. Prognosis for discovering new herbicide sites of action. Cambridge: The Royal Society of Chemistry. Thomas Graham House. 1999. pp. 368-385.

131. Saglio P., Trijasse S. Behavioral responses to atrazine and diuron in goldfish, Arch, environ, contam. Toxicology. 1998. V. 35, pp. 484—491.

132. Salas C., Lobos S., Larrain J., Salas L., Cullen D., Vicuna R. Properties of the laccase isoenzymes of the basidiomycete Ceriporiopsis subvermispora. Biotechnol. Appl. Biochem. 1995. V. 21, N3, pp. 323-333.

133. Sannino F., Gianfreda L. Pesticide influence on soil enzymatic activities. Chemosphere. 2001. V. 45, pp. 417-425.

134. Scheel T., Holker U., Ludwig S., Hofer M. Differential expression of manganese peroxidase and laccase in white-rot fungi in the presence of manganese or aromatic compounds. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. V. 54, pp. 686-691.

135. Scheel T., Holker U., Ludwig S., Hofer M. Evidence for and expression of a laccase gene in three basidiomycetes degrading humic acids. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. V. 52, pp. 66-69.

136. Schliephake K., Mainwaring D.E., Lonergan G.T., Jones I.K., Baker W.L. Transformation and degradation of the disazo dye Chikago Sky Blue by a purified laccase from Pycnoporus cinnabarinus. Enzyme and Microbial Technology. 2000. V. 27, pp. 100-107.

137. Shimada M., Akamtsu Y., Tokimatsu T., Mii K., Hattori T. Possible biochemical roles of oxalic acid as a low molecular weight compound involved in brown-rot and white-rot wood decays. J. of Biotechnology. 1997. V. 53, pp. 103-113.

138. Shleev S., Christenson A., Serezhenkov V., Burbaev D., Yaropolov A., Gorton L., Ruzgas T. Electrochemical redox transformations of T1 and T2 copper sites in native Trame tes hirsuta laccase at gold electrode. Biochem. J. 2005. V. 385, pp. 745-754.

139. Slomczynski D., Nakas J.P., Tanenbaum S.W. Production and characterization of laccase from Botrytis cinerea 61-34. Appl. and Environm. Microbiology. 1995. V. 61, N 3, pp. 907912.

140. Soares Graca M.B., de Amorim M.T.P., Costa-Ferreira M. Use of laccase together with redox mediators to decolourize Remazol Brilliant Blue R. J. of Biotechnology. 2001. V. 89, pp. 123-129.

141. Soares Graca M.B., Amorim M.T.P., Oliveira-Campos A. M., Hrdina R., Costa-Ferreira M. Specificity of phenolic disazo dyes in relation to transformation by laccase. Enzyme and Microbial Technology. 2002. V. 30, pp. 607-612.

142. Solomon E.I., Sundaram U.M., Machonkin T.E. Multicopper oxydases and oxygenases. Chem. Rev. 1996. V. 96, N7, pp. 2563-2605.

143. Soskic M., Plavsic D., Trinajstic N. Inhibition of the Hill reaction by 2-methylthio-4,6-bis(monoaIkylamino)-l,3,5-triazines: A QSAR study. J. Mol. Struct. 1997. V. 394, pp. 57-65.

144. Srebotnik E., Hammel K.E. Degradation of non-phenolic lignin by the laccase/ 1-hydroxybenzotriazole system. J. of Biotechnology. 2000. V. 81, pp. 179-188.

145. Sullivan B.P., Salmon D.J., Meyer T.J. Inorg. Chem. 1978. V. 17, pp. 3334.

146. Temp U. and Eggert C. Novel interaction between laccase and cellobiose dehydrogenase during pigment synthesis in the white rot fungus Pycnoporus cinrtabarinus. Appl. Environm. Microbiology. 1999. V. 65, N 2, pp. 389-395.

147. Timchalk C., Dryzga M.D., Langvardt P.W., Kastl P.E., Osborne D.W. Determination of the effect of tridiphane on the pharmacokinetics of 14C.-atrazine following oral administration to male fischer 344 rats. Toxicology. 1990. V. 61, pp. 27^0.

148. Topp E. A comparison of three atrazine-degrading bacteria for soil bioremediation. Biol. Fertil. Soils. 2001. V. 33, pp. 529-534.

149. Topp E., Mulbry W.M., Zhu H., Nour S.M., Cuppels D. Characterization of s-triazine herbicide metabolism by a Nocardioides sp. isolated from agricultural soils. Appl. Environ. Microbiol. 2000a. V. 66, pp. 3134-3141.

150. Topp E., Zhu H., Nour S.M., Houot S., Lewis M., Cuppels D. Characterization of an atrazine-degrading Pseudaminobacter sp. isolated from Canadian and French agricultural soils. Appl. Environ. Microbiol. 2000b. V. 66, pp. 2773-2782.

151. U.S.EPA Office of Pesticide Programs. Health Effect Division. The grouping of a series of triazine pesticides based on a common mechanism of toxicity. March 2002.

152. Van Aken B., Agathos S.N. Implication of manganese (III), oxalate, and oxygen in the degradation of nitroaromatic compounds by manganese peroxidase (MnP). Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. V. 58, pp. 345-351.

153. Wackett L.P., Sadowsky M.J., Martinez B., Shapir N. Biodégradation of atrazine and related s-triazine compounds: from enzymes to field studies. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. V. 58, pp. 39-45.

154. Wang C.-J., Thiele S., Bollag J.-M. Interaction of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) and 4-amino-2,6-dinitrotoluene with humic monomers in the presence of oxidative enzymes. Arch.Environ.Contam.Toxicol. 2002. V.42, pp. 1-8.

155. Wang Y.-S., Duh J.-R., Lin K.-Y., Chen Y.-L. Movement of three s-triazine herbicides atrazine, simazine, and ametryn in subtropical soils. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1996. V. 57, pp. 743-750.

156. Westermeier R. Electrophoresis in practice. 1993. VCH.

157. Wilhelms K.W., Cutler S.A., Proudman J.A., Anderson L.L., Scanes C.G. Atrazine and the hypothalamo-pituitary-gonadal axis in sexually maturing precocial birds: studies in male Japanese quail. Toxicol. Sci. 2005. V. 86, pp. 152-160.

158. Xu F. Oxidation of phenols, anilines and benzenethiols by fungal laccases: correlation between activity and redox potentials as well as halide ingibition. Biochemistry. 1996a. V. 35, N 23, pp. 7608-7614.

159. Xu H., Lai Y.-Z., Slomczynski D., Nakas J.P., Tanenbaum S.W. Mediator-assisted selective oxidation of lignin model compounds by laccase from Botrytis cinerea. Biotechnology Letters. 1997. V. 19, N 10, pp. 957-960.

160. Yang Q., Yang M., Pritsch K., Yediler A., Hagn A., Schloter M., Kettrup A. Decolorization of synthetic dyes and production of manganese-dependent peroxidase by new fungal isolates. Biotechnology Letters. 2003. V. 25, pp. 709-713.

161. Youn H.-D., Hah Y.C., Kang S.-O, Role of laccase in lignin degradation by white-rot fungi. FEMS Microbiology Letters. 1995. V. 132, pp. 183-188.

162. Zelonka R.A., Baird M.C. Benzene complexes of Ruthenium(II). Can. J. Chem. 1972. V. 50, pp. 3063-3072.

163. Zille A., Tzanov T., Gubitz G.M., Cavaco-Paulo A. Immobilized laccase for decolourization of Reactive Black 5 dyeing effluent. Biotechnology Letters. 2003. V. 25, pp. 1473-1477.

164. Zongmao C., Haibin W. Degradation of pesticides on plant surfaces and its prediction a case study on tea plant. Environmental Monitoring and Assessment. 1997. V. 44, pp. 303-313.1. ВЫРАЖЕНИЕ ПРИЗНАТЕЛЬНОСТИ

165. Также хочу поблагодарить за помощь в подготовке диссертации ЦКП Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и проф. Рябова А.Д. и других сотрудников кафедры химической энзимологии МГУ им. A.B. Ломоносова.

166. Большое спасибо хочу сказать своим оппонентам проф. Валуевой Татьяне Александровне и проф. Еремину Сергею Александровичу.

167. Также я благодарю всех, кто консультировал меня, поддерживал, не давал усомниться и оказывал разностороннюю помощь.