Дальнекрасные флуоресцентные белки

Щербо, Дмитрий Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Дальнекрасные флуоресцентные белки
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Дальнекрасные флуоресцентные белки"

Учреждение российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

на правах рукописи

Щербо Дмитрий Сергеевич

ДАЛЬНЕКРАСНЫЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ БЕЛКИ

специальность - 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва 2010

2 5 НОЯ 2010

004613967

Работа выполнена в группе флуоресцентных инструментов для иммунологии и нейробиологии Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (ИБХ).

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Дмитрий Михайлович Чудаков

Официальные оппоненты:

Алексей Валерьевич Феофанов, доктор биологических наук, доцент, руководитель лаборатории оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Сергей Владимирович Тиллиб, кандидат биологических наук, руководитель группы эпигенетических механизмов регуляции активности генов Института биологии гена РАН

Ведущая организация:

Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН

Защита состоится «24» ноября 2010 г. в 10:00 на заседании диссертационного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117871, ГСП-7, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (ИБХ].

Автореферат разослан «22» октября 2010 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

доктор физико-математических наук г? д п ппии.^пд

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Со времени открытия феномена флуоресценции зелёного белка (GFP) медузы Aequorea victoria прошло уже почти пятьдесят лет. Однако лишь в конце XX века благодаря бурному развитию технологий рекомбинантных ДНК с одной стороны и технических возможностей оптической микроскопии с другой, флуоресцентные белки нашли широкое прикладное применение в биологии. Множество исследовательских групп в течение двух последних десятилетий занято получением и описанием новых вариантов GFP-подобных белков, а также разработкой методик и технологий на их основе. Из организмов, относящихся к различным таксономическим группам, выделены десятки флуоресцентных белков, на основе которых с помощью рационального дизайна созданы тысячи мутантных вариантов, оптимизированных для решения конкретных прикладных задач и обладающих теми или иными уникальными свойствами. На сегодняшний день исследователям доступны флуоресцентные белки с эмиссией почти в любой части видимого спектра. Единственным существенным пробелом остаётся дальнекрасная область, где отсутствуют белки, обладающие яркой стабильной флуоресценцией, пригодные для практического применения. Однако ткани животных наиболее эффективно пропускают свет именно в дальнекрасной и инфракрасной областях за счёт низких значений поглощения и рассеяния. По этой причине получение ярких GFP-подобных белков с максимумами эмиссии флуоресценции более 630 нм является актуальной задачей. Получение таких белков позволит значительно повысить чувствительность методов визуализации, требующих проникновения сигнала через толщу живых тканей, например, в экспериментальной онкологии (для исследования развития опухолей, метастазирования и эффективности терапии], при изучении стволовых клеток, в биологии развития, нейрологии и многих других областях биомедицинской науки. Кроме того, получение белков, флуоресцирующих в дальнекрасной области видимого спектра, позволит расширить возможности многоцветного мечения, создать принципиально новые пары донор-акцептор для методов, основанных на безызлучательном переносе энергии (FRET), откроет новые возможности в дизайне биосенсоров.

Цели и задачи работы. Целью настоящей работы являлось получение новых вариантов GFP-подобных флуоресцентных белков с максимумами эмиссии флуоресценции в красной, дальнекрасной и околоинфракрасной областях видимой части спектра, обладающих яркой и стабильной флуоресценцией и предназначенных для эффективной визуализации в лабораторных животных. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Получить и охарактеризовать максимально яркий красный флуоресцентный белок.

2. На его основе, получить флуоресцентные белки, характеризующиеся максимальным батохромным сдвигом спектра эмиссии при минимальных потерях в яркости флуоресценции.

3. На основе полученных красных и дальне-красных флуоресцентных белков, получить мономерные версии со сходными спектральными характеристиками, применимые для мечения белков слияния для визуализации в живых клетках и тканях.

Научная новизна и практическая ценность работы. В результате работы получен набор GFP-подобных флуоресцентных белков с эмиссией флуоресценции в диапазоне от красной до околоинфракрасной. Наряду с димерными вариантами получены мономерные аналоги, предназначенные для мечения целевых белков. Все белки охарактеризованы in vitro и

протестированы на моделях in vivo от культур клеток, до лабораторных животных. Полученные белки активно используются во многих лабораториях мира. Впервые был получен яркий и пригодный для практического применения флуоресцентный белок с максимумом эмиссии более 630 нм, а также белок с одним из самых длинноволновых максимумов эмиссии [при 670 нм). Описаны некоторые эффекты влияния аминокислотных замен в микроокружении хромофора на характеристики GFP-подобных белков: фотостабильность, яркость, спектры возбуждения и эмиссии флуоресценции. Экспериментально подтверждено расположение некоторых аминокислотных остатков, отвечающих за олигомеризацию.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 100 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 137 ссылок. Диссертация содержит 16 рисунков и 1 таблицу.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены на Ежегодном съезде Германского Общества клеточных биологов (Франкфурт-на-Майне, 2007]; Международном научно-методическом семинаре «Инновационные методы микроскопии в исследовании живых систем» (Санкт-Петербург, 2008); Ежегодном съезде Европейского молекулярно-биологического общества (Амстердам, 2009); Конференции «Физиология 2010» (Манчестер, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано шесть статей в международных рецензируемых журналах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Получение ярких красных флуоресцентных белков

В связи с тем, что дальнекрасные флуоресцентные белки до настоящего момента не были обнаружены в природе, для получения белков со спектрами эмиссии флуоресценции смещёнными в более длинноволновую область, оптимальным предшественником является максимально яркий красный флуоресцентный белок. Получение такого белка и стало нашей первоочередной задачей.

1.1. Получение белков TurboRFP и TagRFP

Из морского анемона Entacmaea quadricolor (рис. 1 а) нами была клонирована кДНК красного флуоресцентного белка, названного eqFP578, с максимумами возбуждения и эмиссии флуоресценции при 552 и 578 нм, соответственно. Белок eqFP578 имеет молярный коэффициент экстинкции 102 000 М1 см1, квантовый выход 0,54, и суммарную яркость в 1,5 раза большую, чем DsRed2. Хромофорная группа ближайшего гомолога eqFP578 - белка eqFP611 (76% гомология аминокислотных последовательностей), также полученного из Е. quadricolor, находится в состоянии транс-изомеризации, что является нетипичным для флуоресцентных белков. Так как хромофоробразующая триада аминоксилотных остатков (M-Y-G) и ключевые остатки микроокружения хромофора (N148, S165, Н203) в белках eqFP578 и eqFP611 идентичны, можно заключить, что хромофор eqFP578 также транс-изомеризован.

Белок eqFP578 дикого типа имеет относительно низкую скорость созревания хромофора при 37°С. Для решения этой проблемы мы провели несколько раундов

случайного ПЦР-мутагенеза, направленных на оптимизацию созревания белка eqFP578. В ходе каждого раунда после инкубации в течение 15 часов при +37°С проводился визуальный отбор индивидуальных бактериальных клонов по яркости с использованием флуоресцентного стереомикроскопа. В результате был отобран оптимальный вариант, названный TurboRFP, с увеличенной относительно eqFP578 яркостью и значительно более быстрым созреванием.

Так как большинство природных красных флуоресцентных белков являются олигомерами, актуальным является искусственное получение их мономерных вариантов. Для решения проблемы олигомеризации TurboRFP нами был проведён анализ структуры гомологичного белка eqFPóll и определены основные точки в составе гидрофильного интерфейса, отвечающие за димеризацию. По результатам анализа в аминокислотную последовательность белка с помощью сайт-специфичного мутагенеза нуклеотидной последовательности были введены следующие замены: R162E, Q166D, S180N, F198V, F200Y. Для предотвращения минорной тетрамеризации TurboRFP была введена замена N126R, предотвращающая, по данным для белка eqFPöll, межсубъединичные взаимодействия через гидрофобный интерфейс. Введение этих замен значительно снизило скорость созревания и яркость полученного варианта, но по данным гель-фильтрации, оказалось достаточным для нивелирования существования олигомерных форм. Для восстановления утраченных яркости и скорости созревания мы провели семь раундов случайного ПЦР-мутагенеза, сохраняя при помощи праймеров ключевые для сохранения мономерности мутации (так называемый «полуслучайный» мутагенез). После каждого раунда проводился скрининг индивидуальных бактериальных клонов с отбором вариантов, как и при получении TurboRFP. Финальный вариант получил название TagRFP.

1.2. Характеристика белков TurboRFP и TagRFP

По данным электрофореза белок TurboRFP в нативных условиях существует в виде гомодимера. Максимумы возбуждения и эмиссии флуоресценции составляют 553 и 574 нм, соответственно. Для TurboRFP характерны высокая pH-стабильность (рКа = 4,4), быстрое и полное созревание при 37°С, и высокая яркость: молярный коэффициент экстинкции составляет 92 ООО М-1см-1, а квантовый выход флуоресценции 0,67 (суммарная яркость больше таковой DsRed2 в 1,7 раза). Для подтверждения отсутствия агрегации в эукариотических клетках нами были получены эукариотические экспрессионные вектора pTurboRFP-N и pTurboRFP-C. Через 5-7 дней после трансфекции клеток линии Phoenix Eco, флуоресцентный белок TurboRFP был равномерно распределён в цитоплазме, не формируя видимых агрегатов, что свидетельствует о достаточно низкой токсичности, позволяющей создавать стабильные клеточные линии и трансгенных животных экспрессирующих TurboRFP.

Молярный коэффициент экстинкции белка TagRFP составляет 100 ООО М 'см1, а квантовый выход равен 0,48 (суммарная яркость в 2,2 раза превышает таковую аналогичного мономерного красного флуоресцентного бела mCherry). TagRFP отличается высокой pH-стабильностью (рКа < 4), а также быстрым и полным созреванием хромофора с отсутствием зелёной формы, что показано на спектре поглощения белка, с единственным максимумом при 556 нм (рис. 1 в). Максимумы возбуждения и эмиссии флуоресценции TagRFP приходятся на 555 и 584 нм соответственно (рис. 1 б). По данным гель-фильтрации, TagRFP сохранил мономерную природу (рис. 1 и).

Нами был получен ряд эукариотических экспрессионных векторов, содержащих как TagRFP (pTagRFP-N, pTagRFP-C), так и слитные химерные конструкции TagRFP-ß-актин и TagRFP-a-тубулин (pTagRFP-ß-acitn и pTagRFP-a-tubulin}, для проверки возможности использования белка в качестве генетически кодируемой флуоресцентной метки. Клетки линий HeLa и Phoenix Eco были трансфицированы pTagRFP-N и pTagRFP-C. В клетках линии Phoenix Eco обычно наблюдается высокий уровень экспрессии генетических конструкций, содержащих ориджин репликации SV40 с промотор CMV, поэтому они подходят для характеристики белков в условиях высоких концентраций in vivo. Появление красной яркой флуоресценции наблюдалось в клетках Phoenix Eco через 8 часов после трансфекции, а в клетках HeLa - через 12 часов. При этом, мы не наблюдали формирования видимых агрегатов даже через 5 дней после трансфекции (рис. 1 г). При экспрессии слитных химерных конструкций TagRFP-ß-актин и TagRFP-a-тубулин в живых клетках мы наблюдали мечение актиновых филаментов и микротрубочек без неспецифичной локализации или агрегации (рис. 1д-з). Чтобы показать возможность мечения органелл с помощью белка TagRFP мы получили рекомбинантную плазмиду pTagRFP-mito, содержащую

г — д

ж 3 'у* ¿V- ff " • ' Vil .yf

400 500 600 700 Длина волны (нм)

в 1

о.в

О 0,6

i 0.4

о 5 0,2

с 0

400 500 600 700 Длина волны (нм)

Рисунок 1. Характеристки белков TurboRFP и TagRFP

а. Морской анемон Entacmaea quadricolor. б. Нормализованные спектры возбуждения (прерывистая линия) и эмиссии (непрерывная линия) TagRFP. в. Нормализованный спектр поглощения белка TagRFP. г. Клетки линии Phoenix Eco, трансфицированные рекомбинантной плазмидой pTagRFP-N, 5 дней после трансфекции. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, д, ж. Клетки линии ЗТЗ, трансфицированные рекомбинантной плазмидой pTagRFP-a-tubulin, 5 дней после трансфекции. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, е. Клетки линии HeLa, трансфицированные рекомбинантной плазмидой pTagRFP-ß-actin, 5 дней после трансфекции. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, з. Клетки линии HeLa, трансфицированные рекомбинантной плазмидой pTagRFP-mito, 5 дней после трансфекции. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, и. Результаты гель-фильтрации белков TurboGFP (димер, зелёная прерывистая линия), EGFP (мономер, зелёная непрерывная линия) и TagRFP (мономер, красная непрерывная линия).

35 40 45 50 55 Объём (мл)

TagRFP и последовательность нуклеотидов, кодирующую сигнал митохондриальной локализации предшественника VIII субъединицы оксидазы цитохрома С человека. В трансфицированных pTagRFP-mito клетках линии HeLa мы наблюдали специфичное мечение митохондрий и отсутствие анормальных органелл или агрегатов флуоресцентного белка даже через 3 дня после трансфекции.

Важной характеристикой флуоресцентных белков является фотостабильность флуоресценции. Мы проверили скорость фотообесцвечнивания белка TagRFP в клетках HeLa под воздействием лазерного излучения. Время полуобесцвечивания (снижения интенсивности флуоресценции на 50%) TagRFP [364 сек.) оказалось сходным с таковым ряда широко используемых флуоресцентных белков: Cerulean (287 сек.), EYFP (417 сек.), mCherry (352 сек.) и mPlum (300 сек.).

Полученные экспериментальные данные показывают, что TagRFP может быть с успехом использован для мечения индивидуальных белковых молекул, органелл и клеток. Белки TagRFP и TurboRFP обладают яркой красной флуоресценцией по сравнению с наиболее часто используемыми аналогами, низкой токсичностью, высокой рН-стабильностью.

2. Получение дальнекрасных флуоресцентных белков

2.1. Получение белков Katushka и mKate

Для разработки дальнекрасного флуоресцентного белка за основу был взят белок TurboRFP. Поиск ключевых положений аминокислотных остатков для сайт-специфичного мутагенеза был основан на данных рентгеноструктурного анализа гомологичного белка eqFPöll. Так как спектральные характеристики GFP-подобных белков зависят от микроокружения хромофора, мы остановились на трёх ключевых положениях аминокислотных остатков, находящихся в непосредственной близости от хромофорной группы: N148, S165 и F181. Для создания библиотек кодирующих последовательностей мы провели сайт-специфичный ПЦР-мутагенез с использованием вырожденных по соответствующим кодонам праймеров. Таким образом, нами были получены три библиотеки кодирующих последовательностей с различными возможными комбинациями аминокислотных остатков в выбранных положениях. Первая библиотека содержала замены N148GATCS, S165GATCS, F181FLIMV (125 возможных комбинаций), вторая - замены N148FLIMV, S165GATCS, F181FLIMV (125 возможных комбинаций), третья - замены N148NKDEQHY, S165GATCS, F181FLIMV (175 возможных комбинаций). Так как любые изменения в микроокружении хромофора могут отрицательно сказаться на яркости и/или скорости созревания флуоресцентного белка, мы провели случайный ПЦР-мутагенез каждой библиотеки для последующего отбора вариантов с дополнительными заменами в окружении хромофора, которые могли бы компенсировать последствия направленного мутагенеза. Для скрининга библиотек клетки Е. coli XL1 Blue были трансформированы полученными рекомбинантными плазмидами и высеяны на чашки Петри с твёрдой селективной средой. С использованием флуоресцентного стереомикроскопа Olympus SZX-12 с соответствующим набором светофильтров (фильтр возбуждающего света 520-620 нм, фильтр эмиссии 650LP) нами было подвергнуто скринингу около 100 000 индивидуальных клонов, при этом спектры эмиссии флуоресценции вариантов, обладавших наиболее яркой флуоресценцией, регистрировались при помощи спектрофотометра SMS2VIS, встроенного в стереомикроскоп. На этом этапе нами был найден вариант белка, обладавший максимумом

эмиссии флуоресценции при 635 нм. Была определена кодирующая последовательность отобранного варианта: в положении 148 и 165 он содержал остатки серина, а в положении 181 - лейцина. Кроме того, замены H199Y и H203R были получены в ходе случайного ПЦР-мутагенеза. Аминокислотный остаток в положении 203 находится в непосредственной близости от хромофорной группы, и замена остатка гистидина на остаток аргинина способна значительно влиять на спектральные свойства флуоресцентного белка. Впоследствии мы провели ещё 4 раунда случайного ПЦР-мутагенеза для оптимизации отобранного варианта по яркости и скорости созревания при 37°С, отбирая при этом для каждого следующего раунда при помощи скрининга варианты, наиболее соответствующие искомым характеристикам. После завершения всех раундов случайного ПЦР-мутагенеза мы отобрали вариант яркого дальнекрасного флуоресцентного белка, названный Katushka.

Следующим этапом нашей работы стало получение мономерного варианта белка Katushka. Так как ранее был успешно получен мономерный вариант белка TurboRFP -TagRFP, мы взяли его за основу и с помощью сайт-специфичного ПЦР-мутагенеза внесли ряд замен аминокислотных остатков в микроокружение хромофора, аналогичных таковым белка Katushka: R69K, N148S, F181L и H203R. Этих изменений оказалось достаточно для получения мономерного белка, обладающего сходными спектральными характеристиками с белком Katushka, названного mKate.

2.2. Характеристика белков Katushka и mKate

2.2.1. Характеристика и сравнение с аналогами in vitro

Мы провели ряд измерений in vitro для определения основных характеристик полученных белков. По данным флуориметрии белки Katushka и mKate обладают практически идентичными спектрами возбуждения и эмиссии флуоресценции. Максимум возбуждения приходится на 588 нм, максимум эмиссии флуоресценции - на 635 нм, что приближает спектральные характеристики этих флуоресцентных белков к оптимальным для использования при визуализации в лабораторных животных (рис. 2 а, б). Для подтверждения полного созревания хромофорной группы нами были сняты спектры поглощения полученных белков, обладающие единственным узким пиком, максимум которого совпадает с максимумом возбуждения флуоресценции (рис. 2 в). Эти данные свидетельствуют об отсутствии в зрелых белках Katushka и mKate промежуточных форм существования хромофора. По данным гель-фильтрации белок mKate является мономером при нанесении в концентрациях до 10 мг/мл, что позволяет использовать его для мечения индивидуальных белковых молекул in vivo. Ещё одной важной характеристикой флуоресцентных белков является зависимость интенсивности флуоресценции от значения рН среды. Измерения рН-стабильности полученных белков показали, что Katushka обладает высокой рН-стабильностью (рКа = 5,5), в то время как mKate несколько уступает по этому показателю (рКа = 6,0) (рис. 2 г). Квантовый выход флуоресценции белка Katushka составляет 0,34, а молярный коэффициент экстинкции 65 ООО М1 см1. Для белка mKate эти характеристики составляют 0,33 и 45 000 М1 см1, соответственно.

400 600 800 Длина волны, нм

500 600 700 800 Длина волны, нм

500 600 700 Длина волны,нм

— -Kattuhka —mPIum

— Dslted txpress

— mChcrry -- mKdbpberry -- eqFPOII

550 600 650 700 750 S00 Длина волны, нм

- fr !

0ПШ

Рисунок 2. Характеристики белков Katushka mKate in vitro

а. Спектры поглощения основных внутриклеточных абсорберов: оксигемоглобина, гемоглобина (усреднены, черная сплошная линия] и меланина (чёрная пунктирная линия], а также спектр эмиссии белка Katushka (красная линия]. Данные получены из http://omlc.ogi.edu.

б. Спектры возбуждения и эмиссии флуоресцентных белков Katushka (чёрная линия] и mKate (красная линия]

в. Спектры поглощения белков Katushka (чёрная линия) и mKate (красная линия).

г. рН-стабильность флуоресценции белков Katushka (чёрная линия) и mKate (красная линия).

д. Спектры эмиссии некоторых флуоресцентных белков, данные пропорционально их относительной яркости.

е. Яркости флуоресценции сравниваемых флуоресцентных белков в пределах оптического окна, вычисленные как определённые интегралы в пределах 650-800 нм.

После исследования основных спектральных характеристик полученных флуоресцентных белков мы сравнили их in vitro с рядом аналогов. Мы проанализировали и нормализовали по относительной яркости спектры эмиссии белков Katushka, mKate и ряда наиболее используемых красных и дальнекрасных флуоресцентных белков: mPIum, eqFP611, mRaspberry, mCherry, TurboRFP, DsRed2, DsRed-Express, AQ143 и HcRed. (рис. 2 д). После этого мы вычислили относительные яркости флуоресценции сравниваемых белков в области оптического окна (650-800 нм) как определённые интегралы от спектров эмиссии в этих пределах. По проведённым расчетам яркость ближайшего конкурента белка Katushka -eqFP611 в этих пределах составляет около 60% от яркости Katushka (рис. 2е). Благодаря высоким значениям квантового выхода и молярного коэффициента экстинкции яркость флуоресценции белка Katushka в 7-10 раз превышает яркость флуоресценции спектрально близких белков HcRed и mPIum.

2.2.2. Характеристика и сравнение с аналогами in vivo

Для тестирования полученных флуоресцентных белков на токсичность мы провели ряд трансфекций клеток линий HeLa и Phoenix Eco рекомбинантными плазмидами, содержащими последовательности нуклеотидов, кодирующие флуоресцентные белки под контролем промотора CMV. Через 5-7 дней после трансфекции в клетках, экспрессирующих кодирующие последовательности белков DsRed2 и DsRed-Express наблюдалась локализация этих белков преимущественно в комплексе Гольджи, а в клетках, экспрессирующих кодирующие последовательности белков mCherry и mRaspberry - небольшие точечные агрегаты. Формирование крупных белковых агрегатов может быть токсичным для клеток, что затрудняет использование агрегирующих белков для получения стабильно экспрессирующих клеточных линий и трансгенных животных. В то же время в клетках, экспрессирующих кодирующие последовательности белков Katushka и mKate не наблюдалось видимой их агрегации, равно как и неспецифичной локализации (рис. 3 к). При этом яркий флуоресцентный сигнал появлялся через 10-14 часов после трансфекции, что свидетельствует о быстром созревании полученных белков в клетках млекопитающих.

Для проверки возможности использования мономерного белка mKate в качестве флуоресцентной метки в химерных конструкциях с другими белками мы использовали модель визуализации ß-актина и а-тубулина. Для этого нами были получены рекомбинантные плазмиды, содержащие химерные генетические конструкции, где последовательность mKate находилась в одной рамке считывания с кодирующей последовательностью ß-актина или а-тубулина. В клетках линий HeLa и ЗТЗ, трансфицированных полученными рекомбинантными плазмидами наблюдалось специфичное мечение актиновых филаментов или микротрубочек без присутствия видимых агрегатов флуоресцентной метки или её неспецифической локализации (рис. 3 л-

н).

Таким образом, нами было показано отсутствие негативных эффектов при экспрессии Katushka и mKate в клетках млекопитающих, а также описана возможность использования белка mKate для флуоресцентного мечения целевых белков in vivo.

Мы провели сравнение фотостабильности белков Katushka и mKate с рядом флуоресцентных белков в клетках линии HeLa двумя методами: выжигания во флуоресцентном микроскопе с помощью ртутной лампы и в конфокальном микроскопе с использованием лазерного света высокой интенсивности. При этом результаты напрямую зависели от использованного источника света. Мы предположили, в качестве возможного объяснения, что ртутная лампа постоянно облучает светом всё поле зрения, а конфокальное сканирование подразумевает небольшое время экспозиции каждой точки сканируемой области.

Время полувыгорания белка Katushka в конфокальном микроскопе превышало время полувыгорания белков Cerulean, EYFP, mCherry и mPlum приблизительно в два раза. Под воздействием излучения ртутной лампы (светофильтр 540-580 нм, мощность 200 мВт/см2) в первые 90 сек. наблюдалось небольшое увеличение интенсивности флуоресцентного сигнала белка Katushka, далее кинетика выгорания была близка к таковой mCherry. При этом белок mKate показал сходную кинетику изменения флуоресцентного сигнала, включающую стадию увеличения сигнала, при экспериментах с использованием конфокального микроскопа, где время полувыгорания составило 1154 сек, что превышало аналогичное значение для белка mRaspberry в 3,6 раза. При воздействии излучения ртутной

лампы тКа1е показал самую высокую фотостабильность флуоресценции среди всех исследованных мономерных флуоресцентных белков.

Завершающим этапом стала проверка возможности использования белка КаШэИка в экспериментах, связанных с визуализацией объектов в многоклеточных организмах. В качестве модели мы визуализировали мышечные ткани лягушки Хепориз 1аеу15. Работа с лягушками проводилась в лаборатории молекулярных основ эмбриогенеза ИБХ РАН А.Г.Зарайским и коллегами. Для тканеспецифической экспрессии кодирующих последовательностей белков КаШвИка, ОэКесЬЕхргезз и тР1шп мы использовали контроль фрагмента промотора кардиоактина X. Iaevis длиной 800 п.о., обладающий специфической активностью в скелетных мышцах и кардиомиоцитах лягушек. В трансгенных эмбрионах, экспрессирующих Ка^Ика мы наблюдали яркую флуоресценцию в области сомитов и зачатка сердца, при этом в эмбрионах, экспрессирующих Й5Яей-Ехргезз флуоресцентный сигнал из области сердца практически не проникал через богатые желтком ткани, в то время как сомиты могли быть с лёгкостью визуализированы (рис. 3 а, в, д, ж). Это можно объяснить тем, что сомиты покрыты лишь тонким слоем эпидермиса, в отличие от зачатка сердца, окружённого богатыми желтком клетками, что свидетельствует о лучшем проникновении через такни более длинноволновой флуоресценции. При этом

DsRea-ExD'ess Ka;ush*a "1

в щ сердце "" СОМИТЫ СОМИГМ г а "сердце i г»

ЯН е • ш

Ж « сердце "** С0МИ1Ы иь и

0 +

Юцл

л -Й jfff *

ft* 10 им

M н

10 цм 10 цм

Рисунок 3. Белки Katushka и mKate in vivo

а-з. Трансгенные эмбрионы X.laevis, экспрессирующие Katushka (а-г) и DsRed-Express (д-з) под контролем промотора кардиоактина. Фотографии в белом свете (а, б и д, е) и флуоресцентные изображения (родаминовый фильтр, в, г и ж, з) передней части трансгенных эмбрионов с левой стороны (а, в, д, ж) и поперечного сечения (б, г, е, з) в плоскостях, показанных пунктиром (направление указано стрелками), и. Фотография в белом свете [верхняя) и флуоресцентное изображение (нижнее) 2,5-месячных лягушек, экспрессирующих DsRed-Express (слева) и Katushka (справа).

Работа с лягушками выполнена в лаборатории молекулярных основ эмбриогенеза ИБХ РАН.

к. Клетки линии Phoenix Eco, трансфицированные рекомбинантной плазмидой pmKate-N, пять дней после

трансфекции. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия.

л. Клетки линии HeLa, трансфицированные рекомбинантной плазмидой pmKate-ß-actin. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия.

м, н. Клетки линии ЗТЗ, трансфицированные рекомбинантной плазмидой pmKate-a-tubuilin. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия.

флуоресценция в дальнекрасной области спектра белка mPlum, обладающего в ~10 раз менее яркой флуоресценцией, чем Katushka, также практически не проникала через ткани зародыша, что говорит о важности для такого проникновения не только длины волны, но и интенсивности флуоресценции. Впоследствии было проведено поперечное рассечение эмбрионов в области сердца. При исследовании среза яркая флуоресценция в области сердечного зачатка наблюдалась у эмбрионов, экспрессирующих как Katushka, так и DsRed-Express (рис. 3 б, г, е, з). Кроме того, в лягушках, достигших возраста 2,5 месяца белок Katushka удавалось визуализировать через всё тело, в то время как сигнал DsRed-Express слабо проникал через ткани (рис. 3 и).

Таким образом, нами были показаны преимущества белка Katushka для визуализации объектов в многоклеточных организмах в сравнении с белками DsRed-Express и mPlum.

2.1. Получение белков mKate2 и tdKatushka2

Для объяснения сложной кинетики процесса фотообесцвечивания белка mKate, включающей фазу усиления флуоресцентного сигнала, а также относительно невысокой рН-стабильности флуоресценции этого белка нашими коллегами из Лаборатории кристаллографии макромолекул Национального института онкологии США были получены данные кристаллографии mKate. Был проведён рентгеноструктурный анализ кристаллов mKate, полученных при трёх значениях рН: 2,0, 4,2 и 7,0. Было установлено, что в mKate наблюдается рН-зависимая цис-транс изомеризация хромофорной группы. При рН 2,0 90% хромофорных групп находятся в нефлуоресцентном транс- положении. Наиболее яркая флуоресценция mKate наблюдается при значении рН 7,0; в этом случае наблюдается наличие лишь 10% транс- изомеров. При рН 4,2 количество транс- и цис- форм составляет ~70% и ~30% соответственно. Незначительная фотоактивация при облучении зелёным светом также может объясняться фотоиндуцируемой цис-транс изомеризацией хромофора. На основании этих данных мы предположили, что стабилизация хромофорной группы во флуоресцентном цис- положении за счёт изменения микроокружения позволит значительно повысить яркость и рН-стабильность флуоресценции mKate. Из данных рентгеноструктурного анализа можно заключить, что остаток серина в положении 165 стабилизирует транс- конформацию хромофора, как это происходит в eqFP611 и хромобелках, в то время как остаток серина в положении 148 стабилизирует цис-конформацию, по аналогии с большинством красных флуоресцентных белков, включая DsRed.

Для дестабилизации транс-изомера хромофора mKate и смещения равновесия в сторону преимущественного существования флуоресцентной цыс-формы мы получили с помощью сайт-специфичного ПЦР-мутагенеза библиотеку последовательностей mKate, содержащую варианты с кодонами всех двадцати возможных аминокислот в положении 165. На основе библиотеки были получены бактериальные экспрессионные конструкции. После трансформации компетентных клеток последние были помещены на твёрдую селективную среду с ампициллином и инкубировались в течение 12-15 часов при +37°С. В результате скрининга индивидуальных клонов по яркости был отобран наиболее яркий вариант, содержащий замену аминокислотного остатка S165A. Этот результат согласуется с выдвинутым нами предположением, так как в отличие от гидрофильного полярного остатка серина гидрофобный неполярный остаток аланина не способен принимать участие в комплексе водородных взаимодействий, стабилизирующих хромофорную группу mKate в транс-конформации. Изменение соотношения конформеров в пользу флуоресцентной цис-

формы должно при этом приводить к увеличению яркости при кислых и физиологических значениях pH. Для улучшения скорости созревания полученного варианта mKate мы провели два раунда случайного ПЦР-мутагенеза, сопровождавшихся отбором наиболее ярких и быстро созревающих белков. Вариант, наиболее соответствовавший искомым характеристикам, содержал дополнительные аминокислотные замены V48A и K238R и получил название mKate2. Эти замены значительно ускоряют созревание белка при +37°С, что показано в Escherichia coli, при этом аргинин в положении 238 содержится также в белке eqFP578.

После получения mKate2 мы решили проверить влияние замены S165A на характеристики белка Katushka. Как и ожидалось, введение с помощью сайт-специфичного мутагенеза соответствующих нуклеотидных замен в кодирующую последовательность Katushka увеличило яркость белка на ~20%. Чтобы получить вариант, пригодный для мечения индивидуальных белковых молекул мы решили создать тандем, состоящий из двух субъединиц димерного белка, ковалентно связанных полипептидным GS-богатым линкером. Полученная псевдомономерная метка была названа tdKatushka2.

2.2. Характеристика белков tdKatushka2 и mKate2

2.2.1. Характеристика и сравнение с аналогами in vitro

Спектральные характеристики белка mKate2 (максимумы возбуждения и эмиссии флуоресценции при 588 и 633 нм соответственно) сходны с таковыми белка mKate. Яркость флуоресценции mKate2 составляет 74% от яркости EGFP, что в 10 раз больше яркости белка mPlum. По сравнению с mKate молярный коэффициент экстинкции увеличен в ~2 раза (и составляет 62 500 М км1), а квантовый выход флуоресценции в ~1,4 раза (и составляет 0,4). Удельная яркость tdKatushka2 на молекулу больше таковой EGFP в 1,46 раза (молярный коэффициент экстинкции tdKatushka2 равен 2 х 66 250 М^см"1, а квантовый выход 0,37). Созревание хромофорной группы протекает быстро и полно. Время полусозревания mKate2 - менее 20 минут, при 40 минутах для mCherry, 75 минутах для mKate и 100 минутах для TagRFP. На спектре поглощения mKate2 выделяется единственный пик, соответствующий красной форме хромофора (совпадающий по форме со спектром возбуждения флуоресценции) (рис. 4 а). Сохранение мономерности при получении mKate2 было подтверждено при помощи гель-фильтрации.

Как и ожидалось, mKate2 обладает значительно лучшей pH-стабильностью флуоресценции по сравнению с mKate (рКа mKate = 6,2; рКа mKate2 = 5,4) (рис. 4 б), что даёт mKate2 преимущество при использовании в качестве метки как в кислой среде (лизосомы, поздние эндосомы), так и при физиологических значениях pH. рКа для белка tdKatushka2 также равна 5,4. Для определения фотостабильности флуоресценции белков mKate2 и tdKatushka2 и сравнения её с наиболее известными аналогами (mKate, mCherry, mRaspberry и mPlum) использовались химерные конструкции флуоресцентных белков с гистоном H2B, синтезируемые в клетках HeLa. Фотостабильность определялась как при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа (рис. 4 г), оборудованного лазерами с длинами волн 488 нм и 543 нм, так и с использованием флуоресцентного микроскопа (рис. 4 д). Белок mKate2 оказался фотостабильнее, чем mKate, mRaspberry и mPlum в обоих случаях. Кроме того, как и предполагалось, мы не наблюдали стадии фотоактивации, характерной для mKate. Таким образом, можно заключить, что хромофор белка mKate2 благодаря аминокислотной замене S165A стабилизируется, в основном, во флуоресцентной цис-конформации.

Оптическое окно

400 500 600 700 800 Длина волны, нм

-- tdKatushka2

/ ч - mKate2

у — - mKate

\--mCherry

* - mRaspberry

^ - • mPlum

1 \ \

t S \ %

\ s

\ \

/ - > \ \

г _

550 600 650 700 750 800 Длина волны, нм

--tdKatushka2

- mKate2

— - - mKate

--mCherry

--mRaspberry

— - - mPlum

--tdKatushka2

- mKate2

— - - mKate

--mCherry

- mRaspberry

- - - mPlum

О ©

04----—

2000 3000 Время, сек

Рисунок 4. Характеристики белков tdKatushka2 и mKate2 in vitro

а. Нормализованные спектры поглощения (чёрная линия), возбуждения [прерывистая красная линия), эмиссии флуоресценции (непрерывная красная линия) белка mKate2.

б. рН-стабильность флуоресценции белков mKate (чёрная линия) и mKate2 (красная линия).

в. Спектры эмиссии сравниваемых флуоресцентных белков, данные пропорционально их относительной яркости.

г. Фотостабильность флуоресценции сравниваемых флуоресцентных белков в лазерном сканирующем конфокальном микроскопе.

д. Фотостабильность флуоресценции сравниваемых флуоресцентных белков во флуоресцентном микроскопе.

2.2.2. Характеристика и сравнение с аналогами in vivo

Чтобы охарактеризовать белки mKate2 и tdKatushka2 in vivo в эукариотических клетках мы получили рекомбинантные генетические конструкции, содержащие кодирующие последовательности этих белков (mKate2-N и tdKatushka2-N) и провели ряд трансфекций клеток линий HeLa и Phoenix Eco. При микроскопии трансфицированных клеток мы наблюдали равномерную цитоплазматическую и ядерную локализацию яркого флуоресцентного сигнала при отсутствии видимых агрегатов или неспецифичной локализации через 4 дня после трансфекции. Эти данные говорят о низкой токсичности полученных белков и о принципиальной возможности их использования в стабильно трансфицированных клеточных линиях. Следующим этапом нашей работы стала проверка белков mKate2 и tdKatushka2 в качестве генетически кодируемых меток для индивидуальных белковых молекул. Мы получили 20 слитных химерных конструкций, содержащих кодирующие последовательности mKate2 и tdKatushka2 и различных клеточных белков, а также сигналов внутриклеточной локализации. Для большинства слитных белков наблюдалась правильная локализация и функциональность. Например,

Рисунок 5. Белки mKate2 и tdKatushka2 в живых клетках

Изображения клеток, трансфицированных рекомбинантными генетическими конструкциями, кодирующими следующие слитные белки: А-а - тКа1е2-[->-актин; А-б - mKate2-3nHTon-RhoB-GTPa3bi (локализация в эндосомах); А-в - тКа1е2-ламин; А-г - шКа!е2-клатрин (лёгкая цепь); А-д - mKate2-PTS (сигнал пероксисомальной локализации); А-е - mKate2-c-Ha-Ras (мембранная локализация); А-ж - тКа1е2-а-тубулин; А-з - mKate2-VASP (vasodilator-stimulated phosphoprotein); А-и - mKate2-aHHeKCHH-A4; А-к - mKate2-паксиллин-12; А-л - тКа1е2-а-актинин; А-м - тКа1е2-виментин; А-н - mKate2-Golgi (81 N-концевой аминокислотный остаток $-1,4-галактозилтрансферазы, локализация в комплексе Гольджи); А-о - mKate2-ЕВЗ (белок семейства RP/EB, ассоциированный с микротрубочками); А-п - тКа1е2-цитокератин; А-р -тКа1е2-зиксин; А-с - mKate2-KOHHeKCHH-43; А-т - mKate2-H2B; А-у - тКа1е2-субъединица-УШ-цитохром-с-оксидазы (митохондриальная локализация); А-ф - mKate2-лизосомальный-мембранный-гликопротеин (лизосомальная локализация); Б-а - td КаШ8Ька2-клатрин (лёгкая цепь); Б-б - tdKatushka2-(S-aKTHH; Б-в -tdKatushka2-VASP (vasodilator-stimulated phosphoprotein); Б-г - tdKatushka2-c-Ha-Ras (мембранная локализация); Б-д - tdKatushka2-фибpиллapин; Б-е - tdKatushka2-PTS (сигнал пероксисомальной локализации); Б-ж - tdKatushka2-Golgi (81 N-концевой аминокислотный остаток f5-l,4-галактозилтрансферазы, локализация в комплексе Гольджи); Б-з - tdKatushka2-3HKCHH; Б-и - tdKatushka2-p2-коннексин; Б-к - tdKatushka2-лизocoмaльный-мeмбpaнный-гликoпpoтeин (лизосомальная локализация); Б-л - tdKatushka2-KaflrepHH; Б-м - tdKatushka2-VSVG (гликопротеин вируса визикулярного стоматита, мембранная локализация); Б-н - tdKatushka2^aMHH; Б-о - tdKatushka2-EB3 (белок семейства RP/EB, ассоциированный с микротрубочками); Б-п - tdKatushka2-пaкcиллин. Клетки линии HeLa на всех изображениях, кроме А-а, А-ж, А-о, Б-о, где использованы клетки FoLu. Флуоресцентная микроскопия.

слитный белок тКа1е2-аннексин-1У при воздействии иономицина на клетку перемещался, как и ожидалось, из цитоплазмы на ядерную и клеточную мембраны.

Чтобы проверить возможность использования mKate2 для визуализации объектов в многоклеточных организмах мы поместили кодирующую последовательность mKate2 под контроль фрагмента промотора Xanfl X.laevis. Полученные рекомбинантные плазмиды экспрессировались в трансгенных X.laevis (работа с лягушками была выполнена в

лаборатории молекулярных основ эмбриогенеза ИБХ РАН). Как и ожидалось, мы наблюдали яркий флуоресцентный сигнал в передней части головы, включая глаза и назальные плакоды. Для сравнения яркости и скорости созревания mKate и mKate2 при использовании для визуализации в лабораторных животных мы провели микроинъекции конструкций mKate-N и mKate2-N в эмбрионы Xlaevis на стадии двух бластомеров. При этом яркость флуоресцентного сигнала mKate2 оказалась значительно выше. В качестве модели мечения индивидуальных белковых молекул в целом организме мы использовали Xlaevis, экспрессирующие рекомбинантные генетические конструкции, кодирующие слитный химерный белок mKate-2-зиксин. При этом, несмотря на высокий уровень экспрессии обеспечиваемый промотором CMV, мы не наблюдали проявлений токсичности слитного белка: головастики выглядели здоровыми и выживаемость была сопоставима с контрольными головастиками, экспрессирующими EGFP. Эти результаты свидетельствуют о низкой токсичности mKate2 для живых организмов.

3. Получение околоинфракрасных флуоресцентных белков

После того, как нами был получен и охарактеризован набор ярких дальнекрасных GFP-подобных белков, следующей задачей стало дальнейшее смещение спектров эмиссии флуоресценции вариантов GFP-подобных белков в более длинноволновую (околоинфракрасную) область спектра. Флуоресцентный сигнал белков с максимумами эмиссии при длинах волн больших 640 нм должен ещё более эффективно проникать через живые ткани. Кроме того, так как в экспериментах, связанных с визуализацией в лабораторных животных, обычно требуются высокие концентрации репортера, критичной является низкая цитотоксичность метки. Хотя, по имеющимся у нас данным, токсичность белка Katushka достаточно низка даже при высоких концентрациях для создания стабильных линий Xenopus laevis и Danio reno мы поставили перед собой задачу получить варианты с ещё более низкой токсичностью.

3.1. Получение белков eqFP650 и eqFP670

В недавней работе Стрэка и соавт. была предложена методика отбора нетоксичных вариантов флуоресцентных белков, основанная на бактериальной экспрессионной системе. Мы использовали описанный метод для поиска наименее цитотоксичных вариантов белка Katushka среди его предшественников, полученных ранее. По результатам скрининга был отобран вариант Katushka-9-5, обладавший практически идентичными спектральными характеристиками, но проявлявший значительно более низкую токсичность, оказывая в высокой концентрации наименьшее влияние на рост бактерий. В то же время, ни Katushka-9-5, ни Katushka не проявляли видимой цитотоксичности в живых клетках линии HeLa. Для окончательного сравнения токсичности in vivo мы провели микроинъекции рекомбинантных плазмид, содержащих кодирующие последовательности Katushka-9-5 и Katushka в эмбрионы Xenopus laevis на стадии двух клеток (работа с лягушками была выполнена в лаборатории молекулярных основ эмбриогенеза ИБХ РАН). Суммарно было проведено 600 микроинъекций в пяти независимых экспериментах, при этом учитывалось количество эмбрионов, доживших до стадий 25 и 42. По результатам экспериментов в Xlaevis наименее токсичным оказался вариант Katushka-9-5 (рис. 6 а) и именно он был отобран для дальнейшего смещения спектров возбуждения и эмиссии флуоресценции в более длинноволновую область спектра.

На основании анализа трёхмерной структуры mKate, в высокой степени гомологичной структуре Katushka, мы выбрали ряд положений аминокислотных остатков, потенциально способных влиять на спектральные характеристики белка: М14, L16, М44, Т62, Y121, S148, S165, М167, R203 и L205 и провели сайт-специфичный мутагенез соответствующих кодонов. Полученные библиотеки содержали по несколько вариантов аминокислотных замен в этих ключевых положениях в различных комбинациях и подвергались впоследствии случайному ПЦР-мутагенезу. Суммарно скринингу во флуоресцентном бинокуляре подверглось более миллиона индивидуальных клонов и в результате было отобрано два варианта, наиболее соответствующих искомым характеристикам. Белки, обладавшие максимумами эмиссии флуоресценции при 650 и 670 нм [рис. 6 б), получили названия eqFP650 и eqFP670 соответственно. Определение кодирующих последовательностей белков показало, что eqFP650 содержал аминокислотные замены N24G и М44А, a eqFP670 - замены М14Т, N24G, М44С, S148N и S165N. Следует отметить, что остаток метионина в положении 44 также заменён на остаток небольшого размера в двух недавно опубликованных дальнекрасных флуоресцентных белках: mNeptune, полученном Рождером Тьеном и коллегами на основе mKate и E2-Crimson, полученном Бенджамином Гликом и коллегами на основе DsRed-Express2. Образующаяся в результате такой замены полость занята молекулой воды, формирующей водородную связь с ацилиминным кислородом хромофорной группы. Таким образом, вполне вероятно, что введение небольшого аминокислотного остатка в положении 44 является универсальным способом смещения спектра эмиссии флуоресценции в более длинноволновую область спектра для всех белков, несущих DsRed-подобный хромофор.

3.2. Характеристика белков eqFP650 и eqFP670

3.2.1. Характеристика и сравнение с аналогами in vitro

eqFP650, обладая высокой яркостью, характеризуется значительным батохромным сдвигом эмиссии флуоресценции: максимум возбуждения флуоресценции приходится на 592 нм (при 588 нм у Katushka), а максимум эмиссии - на 650 нм (при 635 нм у Katushka). На сегодняшний день eqFP650 обладает самой высокой яркостью среди всех флуоресцентных белков с максимумами эмиссии более 635 нм. Квантовый выход eqFP650 составляет 0,24, а молярный коэффициент экстинкции равен 65 ООО М1 см1. eqFP670 обладает не столь высокой яркостью (квантовый выход - 0,06, молярный коэффициент экстинкции -70 000 М-1 см1), однако для него характерен значительно больший батохромный сдвиг как спектра эмиссии так и спектра возбуждения флуоресценции: максимумы при 670 нм и 605 нм соответственно. Максимумом эмиссии при 670 нм к настоящему времени среди всех флуоресцентных белков обладает только eqFP670, что делает его первым в мире GFP-подобным белком со столь значительно смещённым в длинноволновую область спектром эмиссии флуоресценции. Флуоресценция eqFP670 эффективно возбуждается широко распространёнными лазерами с длинами волн 633 или 635 нм.

Отсутствие промежуточных форм существования хромофоров после созревания белков eqFP650 и eqFP670 подтверждается наличием единственного узкого пика на спектре поглощения каждого из них (рис. 6 в). eqFP670 обладает высокой рН-стабильностью (pKaeqFP67o = 4,5, рКа eqFP650 = 5,7) и крайне высокой фотостабильностью флуоресценции (рис. 6 г, д), что важно при проведении длительных экспериментов с продолжительным облучением и накоплением флуоресцентного сигнала. Такая неординарная фотостабильность (равно как и высокая рН-стабильность) может объясняться уникальной комбинацией аминокислотных остатков 148N и 165N, ранее не встречавшаяся во

дожившие до стадии 42

500 600 700 800 Длина волны,нм

400 500 600 Длина волны, нм

Время, сек

Рисунок б. Характеристики eqFP650 и eqFP670 in vitro

а. Сравнение цитотоксичности Katushka-9-5 (оранжевые столбцы) и Katushka (красные столбцы) в эмбрионах Xenopus laevis. Показано количество эмбрионов, доживших до стадий 25 и 42, соответственно, б. Нормализованные спектры возбуждения (пунктирные линии) и эмиссии (непрерывные линии) флуоресценции белков epFP650 (красные линии) и eqFP670 (чёрные линии), в. Нормализованные спектры поглощения белков eqFP650 (красная линия) и eqFP670 (чёрная линия), г, д. Нормализованные кривые фотообесцвечивания сравниваемых белков - eqFP650 (красная линия), eqFP670 (чёрная линия), mNeptune (оранжевая линия), E2-Crimson (тёмно-красная линия) - во флуоресцентном (г) и конфокальном (д) микроскопах.

флуоресцентных белках. Возможно, два остатка аспарагина в этих положениях способствуют плотной упаковке хромофорной группы, не оставляя полостей вокруг, что способствует изоляции хромофора от внешних воздействий.

3.2.2. Характеристика и сравнение с аналогами in vivo

eqFP650 и eqFP670 характеризуются высокой скоростью созревания при 37°С в Escherichia coli: яркие флуоресцентные сигналы наблюдаются после 12 часов инкубации. По сравнению с Katushka-9-5 белки eqFP650 и eqFP670 отличаются одной аминокислотной заменой на наружной поверхности белка (N24G), характерной для avGFP и E2-Crimson. Эта замена не должна оказывать влияния на цитотоксичность полученных белков, что подтверждено тестами в бактериях, показавшими, что токсичность epFP650, eqFP670 и Katushka-9-5 одинакова. В эукариотических клетках линии HeLa через 14 часов после трансфекции мы наблюдали высокий уровень сигнала eqFP650, сигнал eqFP670 также можно было детектировать. В клетках линии НЕК-293Т, отличающихся более высоким уровнем экспрессии последовательностей под контролем промотора CMV, сигналы обоих полученных белков были высоки через 14 часов после трансфекции, при этом eqFP650 и eqFP670 были равномерно распределены по эукариотическим клеткам, видимые агрегаты отсутствовали. Следующим этапом нашей работы стало определение эффективности белков

30 им

eqFP650

eqfP670

mNeptune

E2-Crimson

Katushka

780 820 фильтра, нм

Рисунок 7. Визуализация eqFP650 и eqFP670 в мышах

а. Изображения в отражённом свете (возбуждение 605/30 нм, эмиссия 660/20 нм] мышей после внутримышечных микроинъекций клеток линии НЕК-293Т, продуцирующих белки E2-Crimson, mNeptune и eqFP650. б, в. Интенсивность флуоресцентного сигнала инъецированных клеток, регистрируемого с помощью наборов заграждающих фильтров (длина волны отложена по оси абсцисс) при использовании фильтров возбуждающего света 570/30 (б) и 605/30 (в). Значения были нормализованы на интенсивность сигнала светлячковой люциферазы. Эксперименты на мышах были проведены в Мичиганском университете, США, на оборудовании IVIS Spectrum system (Caliper).

eqFP650 и eqFP670 при визуализации объектов в целых организмах. Для этого клетки линии НЕК-293Т, трансфицированные рекомбинантными генетическими конструкциями, обеспечивающими экспрессию кодирующих последовательностей Katushka, eqFP650, eqFP670, mNeptune и E2-Crimson в эукариотических клетках, были внутримышечно инъецированы в ягодицу мыши. Для нормализации эффективности трансфекции и общего числа введённых клеток, последние были также котрансфицированы рекомбинантными генетическими конструкциями, несущими кодирующую последовательность светлячковой люциферазы. Изображения мышей, показанные на рисунке 7 а, были получены с использованием фильтра возбуждающего света 605/30 нм и фильтра эмиссии 660/20 нм, при этом eqFP650 обладал наиболее интенсивным флуоресцентным сигналом. Количественные данные, полученные при детекции с помощью фильтров возбуждающего света 570/30 нм и 605/30 нм также выявили более высокие уровни сигналов в случае eqFP650 (рис. 7 б, в).

4. Заключение

В результате проделанной работы нами был получен и охарактеризован набор из восьми флуоресцентных белков, флуоресцирующих в красной, дальнекрасной и околоинфракрасной областях спектра, с максимумами эмиссии флуоресценции в диапазоне от 570 до 670 нм. Все флуоресцентные белки, полученные в ходе данной работы являются мутантными вариантами белка eqFP578 дикого типа из морского анемона Entacmaea quadricolor. Выравнивание аминокислотных последовательностей приведено на рисунке 8. Флуоресцентные белки были оптимизированы для решения определённых экспериментальных задач; проверки в модельных системах показали высокую эффективность полученных белков по сравнению с существующими аналогами. Многие из разработанных белков обладают уникальными характеристиками. Katushka2 - наиболее яркий белок среди всех GFP-подобных белков с максимумами эмиссии более 620 нм. eqFP670 имеет наиболее длинноволновый максимум эмиссии флуоресценции среди всех флуоресцентных белков, известных на сегодняшний день, кроме того, для него характерна

а возбуждение эмиссия

605/30 нм 660/20 нм

возбуждение 570/30 нм

E2-Cfimson mNeptune eqFP650

1,0 0,8 0,6 0,4 0,2

- eqFP650

- eqFP670

mNeptune —- E2-Crimson - Katushka

620 660 700 740 780 820 Длина волны эмиссионного фильтра, нм

± 1,0

° 0,8 а;

§ 0,6

5 0,4 и

8. 0,2 g. о

с; ©

возбуждение 605/

660 700 740 / Длина волны эмиссионного

крайне высокая фотостабильность флуоресценции. Сочетание низкой токсичности, эмиссии в околоинфракрасной области спектра и высокой яркости делает белок eqFP650 предпочтительным для экспериментов, связанных с визуализацией объектов в многоклеточных организмах. Белки TurboRFP и TagRFP отличаются высокой яркостью в красном диапазоне. Мономерные флуоресцентные белки TagRFP, mKate и mKate2, а также псевдомономерная метка tdKatushka2 должны стать как подходящим дополнением для многоцветного мечения белков, так и основой для разработки различных биосенсоров, в том числе, основанных на FRET.

avGFP MSKGEELFTGWPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLT1KFICTTG-KLPVPWPTLVTTFSÏGVQCFSRYPDHMK

DsRed MRSSKNVlKEFMRFKVRMEGTVNGHEFEIEGEGEGRPyEGHNTVKLKVTKGGPLPFAWDlLSPQFQYGSKVYVKHPADIP

eqFP578 mselikenmhmklymegtvnnhhfkctsegerkpyegtqtmkikvveggplpfafdilatsfmygsktfinhtqgip

TurboRFP mselikenmhmklymegtvnnhhfkctsegegkpyegtqtmkikvveggplpfafdilatsfmygskafihhtqgip

Katushka msvlitemmhmklymegtvmdhhfkctsegegkpyegtqtmkikvveggplpfafdilatsfmygsktfinhtqgip

eqFP650 mgedsBlxSenmhmklymegtvnghhfkctsegegkpyegtqtBkikweggplpfafdilatsfmygsktfinhtqgip

eqFP670 mgeds|li@enmh@klymegtvnghhfkctsegegkpyegtqtgkikvveggplpfafdilatsfmygsktfinhtqgip

TagRFP mselikenmhmklymegtvmhhhfkctsegegkpyegtqtmrikweggplpfafdilatsfmygsrtfinhtqgip

mKate mselikenmhmklymegtvnnhhfkctsegegkpyegtqtmrikweggplpfafdilatsfmygsktfinhtqgip

mKate2 mvselikenmhmklymegtvmnhhfkctsegegkpyegtqtmrikaveggplpfafdilatsfmygsktfimhtqgip

avGFP OHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGMYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKG1DFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKN

DsRed --DYKKL3FPEGFKWERVKNFEDGGVVTVTQDSSLQDC-CFIYKVKFIGVNFPSDGPVMQKKTM-GWEASTERLYPR—DG

eqFP57 8 —DLFKQSFPEGFTWERITTYEDGGVLTATQDTSLQNGCIIYNVKINGVNFPSNGSVMQKKTL-GWEANTEMLYPA—DG

TurboRFP —DFFKQSFPEGFTWERITTYEDGGVLTATQDTSFQNGCIIYNVKINGVNFPSNGPVMQKKTR-GWEANTEMLYPA—DG

Katushka —dffkqsfpegftherittyedggvltatqdtslqngcliynvkingvnfpsngpvmqkktl-gweaStemlypa—ds

eqFP650 —dffkqsfpegftwerittyedggvltatqdtslqngcliynvkingvnfpsngpvmqkktl-gwea§temlypa—ds

eqFP670 —dffkqsfpegftwerittyedggvltatqdtslqngclxynvkingvnfpsngpvmqkktl-gweantemlypa--ds

TagRFP —dffkqsfpegftwervttyedggvltatqdtslqdgcliynvkiHgvnfpsngpvmqkktl-gweantemlypa—dg

mKate —dffkqsfpegftwervttyedggvltatqdtslqdgcliynvkiBgvnfpsngpvmqkktl-gwea0temlypa--dg

mKate2 —dffkqsfpegftwervttyedggvltatqdtslqdgcliynvki0gvnfpsngfvmqkktl-gwea§tetlypa--dg

avGFP GIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGD-GPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHKVLLEFVl'AAGIThGMDELYK

DsRed VLKGEIHKALKLKDGGHYLVEFKSIYMAKKP---VQLPGYYYVDSKLDITSB-NEDY'-IVEQYERTEGRHHLFL

eqFP578 GLRGHSQMALKLVGGGYLHCSFKTTYRSKKPAKNLKMPGFHFVDHRLERIKE-ADKETYVEQHEMAVAKYCDLPSKLGHR

TurboRFP GLRGHSQMALKLVGGGYLHCSFKTTYRSKKPAKNLKMPGFHFVDHRLERIKE-ADKETYVEQHEMAVAKYCDLPSKLGHR

Katushka glrghsqmalklvgggylhcslkttyrskkpaknlkmpgfyfvdSrlerike-adketyveqhemavarycdlpsklghs

eqFP650 glrghsqmalklvgggylhcslkttyrskkpaknlkmpgfyfvd^lerike-adketyveqhemavarycdlpsklghs

eqFP670 GLRGHjJbMALKLVGGGYLHCSLKTTYRSKKPAKNLKMPGFYFVD^lerike-ADKETYVEQHEMAVARYCDLPSKLGHS

TagRFP glBgÉs8malklvggghlic|fkttyrskkpaknlkmpgKyHvdhrlerike-adketyveqhevavarycdlpsklghk

mKate GlBgHs BMALKLVGGGHLIcSLKTTYRSKKPAKNLKMPGfflYyVDfflRLERIKE-ADKETYVEQHEVAVARYCDLPSKLGHK

mKate2 gl@g^Smalklvggghlic|!|lkttyrskkpaknlkmpgByhvdSrlerike-adketyveqhevavarycdlpsklghr

Рисунок 8. Выравнивание аминокислотных последовательностей

Хромофоробразующие триады аминокислотных остатков подчёркнуты. Отмечены замены аминокислотных остатков относительно белка ецРР578: тёмно-красным фоном выделены замены, приводящие к батохромоному сдвигу спектра эмиссии флуоресценции; синим фоном выделены замены, приводящие к разрушению межсубъединичных взаимодействий в молекуле белка; ярко-красным фоном выделена замена 165А, ключевая для увеличения яркости тКа1е2, зелёным фоном выделены замены, отличающие КаШзЬка-9-5 от КаШ^Ика, т.е. приводящие к снижению токсичности; серым фоном отмечены прочие замены, приводящие к ускорению фолдинга белка или замены, эффект которых точно не определён.

0,6

0,4

0,2

0,0 -

едРР670

620

Длина волны, нм

Рисунок 9. Общая схема работы

На рисунке дана зависимость яркости флуоресценции полученных белков от длины волны максимумов эмиссии. Чёрными стрелками показана последовательность работы (для каждого этапа приведены основные введённые аминокислотные замены]. Димерные белки изображены двумя кругами, мономерные - одним кругом.

выводы

1. Получен и охарактеризован яркий красный флуоресцентный белок TurboRFP, а также его мономерная версия - TagRFP; показана применимость TagRFP для мечения исследуемых белков в живых клетках.

2. Установлено положение основных аминокислотных остатков (126, 162, 166, 180, 198, 200], отвечающих за димеризацию флуоресцентного белка eqFP578.

3. Установлено положение ряда аминокислотных остатков (14, 44, 69, 148, 165, 181, 203), влияющих на смещение спектра эмиссии флуоресцентного белка eqFP578 в длинноволновую часть спектра.

4. Получен и охарактеризован первый яркий дальнекрасный флуоресцентный белок Katushka, а также его мономерная версия - mKate. Для мечения целевых белков получены улучшенные версии - mKate2 и тандем tdKatushka2. Показана их эффективность при визуализации в лягушках Xenopus laevis.

5. Получены околоинфракрасные низкотоксичные флуоресцентные белки eqFP650 и eqFP670. Показано, что белок eqFP650 является на сегодняшний момент предпочтительным маркером для визуализации в толще живых тканей в лабораторных животных.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Е. M. Merzlyak, J. Goedhart, D. Shcherbo, M. E. Bulina, A. S. Shcheglov, A. F. Fradkov, A. Gaintzeva, K. A. Lukyanov, S. Lukyanov, T. W. Gadella and D. M. Chudakov. Bright monomeric red fluorescent protein with an extended fluorescence lifetime. Nat Methods. 2007.4(7]: p. 555-7.

2. D. Shcherbo, E. M. Merzlyak, T. V. Chepurnykh, A. F. Fradkov, G. V. Ermakova, E. A. Solovieva, K. A. Lukyanov, E. A. Bogdanova, A. G. Zaraisky, S. Lukyanov and D. M. Chudakov. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nat Methods. 2007.4(9): p. 741-6.

3. S. Pletncv, D. Shcherbo, D. Chudakov, N. Pletneva, E. Merzlyak, A. Wlodawer, Z. Dauter and V. Pletnev. A crystallographic study of bright far-red fluorescent protein mKate reveals pH-induced cis-trans isomerization of the chromophore. 1 Biol Chem. 2008. 283(43): p. 28980-7.

4. D. Shcherbo, E. A. Souslova, J. Goedhart, T. V. Chepurnykh, A. Gaintzeva, I.I. Shemyakina, T. W. Gadella, Lukyanov S. and D. M. Chudakov. Practical and reliable FRET/FL1M pair of fluorescent proteins. BMC Biotechnol. 2009. 9(1): 24.

5. D. Shcherbo, C. S. Murphy, G. V. Ermakova, E. A. Solovieva, T. V. Chepurnykh, A. S. Shcheglov, V. V. Verkhusha, V. Z. Pletnev, K. L. Hazelwood, P. M. Roche, S. Lukyanov, A. G. Zaraisky, M. W. Davidson and D. M. Chudakov. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem I. 2009.418(3): p. 567-74.

6. D. Shcherbo, I.I. Shemiakina, A. V. Ryabova, К. E. Luker, В. T. Schmidt, E. A. Souslova, T. V. Gorodnicheva, L. Strukova, К. M. Shidlovskiy, О. V. Britanova, A. G. Zaraisky, K. A. Lukyanov, V. B. Loschenov, G. D. Luker and D. M. Chudakov. Near-infrared fluorescent proteins. Nat Methods. 2010. 7(10): 827-9.

Тезисы докладов на конференциях

1. D. Shcherbo, E. M. Merzlyak. Super-bright monomeric and far-red fluorescent proteins. Annual Meeting of the German Society far Cell Biology. Frankfurt, Germany, 2007.

2. E.A. Souslova, D.S. Shcherbo, V.V. Belousov, K.A. Lukyanov, V.V. Verkhusha, D.M. Chudakov. Novel fluorescent proteins and instruments on their base. International scientific-methodical seminar "Innovative methods of microscopy in research of living systems". Saint-Petersburg State University, Saint-Petersburg, Russia, 2008.

3. D.S. Shcherbo, M.W. Davidson, D.M. Chudakov. Far-red fluorescent tags for protein labeling. The EMBO Meeting 2009. Amsterdam, The Netherlands, 2009.

4. E.A. Souslova, D.S. Shcherbo, I.I. Shemiakina, K.A. Lukyanov, D.M. Chudakov. Novel far-red and near infra-red fluorescent proteins. Physiology 2010 Meeting. Manchester, UK, 2010.

Заказ № 127-а/10/10 Подписано в печать 19.10.2010 Тираж 80 экз. Усл. п.л. 1

¿"А ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

()у www.cfr.ru ; е-таИ:т/о@с/г.ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Щербо, Дмитрий Сергеевич

Содержание.

Введение.

Список сокращений.

1. Обзор литературы.

1.1. Структура и свойства СРР-подобных белков.

1.1.1 Семейство СРР-подобных белков.

1.1.2 Структура и свойства СРР-подобных белков.

1.1.2.1 Хромофорные группы.

1.1.2.2 Олигомерный статус.

1.1.3 Цветовое разнообразие СРР-подобных белков.

1.2. Применение СРР-подобных белков.

1.2.1 Мониторинг экспрессии генов.

1.2.2 Изучение локализации и перемещения белков.

1.2.3 Внутриклеточные индикаторы (биосенсоры].

1.3. Визуализация в лабораторных животных.

1.3.1 Обзор методов визуализации.

1.3.2 Оптические флуоресцентные методы визуализации.

1.3.3 Использование флуоресцентных белков для ШВ1.

2. Материалы и методы.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Оборудование и реактивы.

2.2. Ъ Оборудование.

2.2.2 Реактивы.

2.2.3 Буферные растворы.

2.2.4 Микробиологические среды.

2.2.5 Бактериальные штаммы и клеточные линии.

2.3. Методы исследования и анализа данных.

2.3.1 Амплификация фрагментов ДНК.

2.3.2 Сайт-специфичный ПЦР-мутагенез.

2.3.3 Случайный ПЦР-мутагенез.

2.3.4 Трансформация клеток Е. coli.

2.3.5 Выделение плазмидной ДНК.

2.3.6 Выделение и очистка рекомбинантных белков.

2.3.7 Спектроскопия.

2.3.8 Трансфекция эукариотических клеток.

2.3.9 Микроскопия.

2.3.10 Гель-фильтрация.

2.3.11 Отбор нетоксичных вариантов белков в Е. coli.

2.3.12 Получение рекомбинантных генетических конструкций.

2.3.12.1 Получение прокариотических эксперссионных векторов.

2.3.12.2 Получение эукариотических экспрессионных векторов.

2.3.12.3 Получение библиотеки кДНК Entacmaea quadricolor.

2.3.12.4 Получение TurboRFP.

2.3.12.5 Получение TagRFP.

2.3.12.6 Получение Katushka.

2.3.12.7 Получение mKate.

2.3.12.8 Получение mKate2.

2.3.12.9 Получение tdKatushka2.

2.3.12.10 Получение eqFP650 и eqFP670.

2.3.13 Трансгенные Xenopus laevis.

2.3.14 Визуализация в мышах.

Результаты и обсуждение.

3.1. Получение ярких красных флуоресцентных белков.

3.1.1 Получение белков TurboRFP и TagRFP.

3.1.2 Характеристика белков TurboRFP и TagRFP.

3.2. Получение дальнекрасных флуоресцентных белков.

3.2.1 Получение белков Katushka и mKate.

3.2.2 Характеристика белков Katushka и mKate.

3.2.2.1 Характеристика и сравнение с аналогами in vitro.

3.2.2.2 Характеристика и сравнение с аналогами in vivo.

3.2.3 Получение белков mKate2 и tdKatushka2.

3.2.4 Характеристика белков tdKatushka2 и mKate2.

3.2.4.1 Характеристика и сравнение с аналогами in vitro.

3.2.4.2 Характеристика и сравнение с аналогами in vivo.

3.3. Получение околоинфракрасных флуоресцентных белков.

3.3.1 Получение белков eqFP650 и eqFP670.

3.3.2 Характеристика белков eqFP650 и eqFP670.

3.3.2.1 Характеристика и сравнение с аналогами in vitro.

3.3.2.2 Характеристика и сравнение с аналогами in vivo.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Дальнекрасные флуоресцентные белки"

Зелёный флуоресцентный белок - Green Fluorescent Protein [GFP] -был впервые выделен в 1961 году О. Шимомурой и коллегами из медузы Aequorea Victoria1 (avGFP), и в течение довольно продолжительного времени оставался интересен узкому кругу исследователей. Только в 1994 году, через два года после клонирования кодирующей последовательности avGFP, было предложено использование зелёного флуоресцентного белка в качестве генетически кодируемого маркера экспрессии генов. Уникальность GFP как генетически кодируемого маркера, обладающего низкой токсичностью, высокой яркостью и фотостабильностью, а также независимость возникновения флуоресценции от наличия специфических субстратов или воздействия ферментов, вызвала резкий рост интереса к новым открывшимся возможностям для in vivo микроскопии. Впоследствии целое семейство GFP-подобных белков, включая красные флуоресцентные белки и нефлуоресцентные хромобелки было обнаружено в различных таксономических группах организмов. Множество лабораторий по всему миру в течение вот уже более пятнадцати лет заняты поиском и изучением новых и модификацией' ранее найденных флуоресцентных белков, а также разработкой различных методик с их использованием' для решения тех или иных прикладных и фундаментальных задач. Благодаря развитию технологий рекомбинантных ДНК с одной стороны и оптической микроскопии с другой, флуоресцентные белки нашли широкое применение в молекулярной и клеточной биологии. Как следствие, по данным системы PubMed, с 2004 года в свет ежегодно выходит более 2500 публикаций, содержащих ключевые слова "green fluorescent protein", а в 2008 году признанием важности для науки проделанной работы послужило присуждение Нобелевской премии по химии «за открытие и разработку зелёного флуоресцентного белка».

Сегодня GFP-подобные белки широко используются как удобные генетически кодируемые маркёры для биологических и медицинских

1 Синоним Aequorea aequorea. исследований in vivo. К настоящему времени различными группами исследователей создано большое число вариантов флуоресцентных белков, обладающих уникальными свойствами, что позволило значительно расширить диапазон их применений. Получены фотоактивируемые белки, изменяющие спектральные характеристики при действии света определённой длины. Большое разнообразие созданных на основе флуоресцентных белков внутриклеточных индикаторов (биосенсоров), изменяющих спектральные свойства при изменении того или иного параметра микроокружения, позволяет наблюдать течение многих совершенно разнородных процессов в живых клетках в реальном времени.

Цветовая палитра полученных к настоящему времени флуоресцентных белков покрывает почти всю видимую область спектра, за исключением длинноволновой её части, в которой отсутствуют белки, обладающие яркой и стабильной флуоресценцией. В то же время, одним из перспективных применений GFP-подобных белков является визуализация объектов - от отдельных клеток до тканей и органов - в интактных животных. В организме млекопитающих большая часть суммарного поглощения приходится на меланин, гемоглобин и воду таким образом, что оно остаётся минимальным в диапазоне от 650 до 1100 нм. Этот диапазон соответствует дальнекрасной и околоинфракрасной областям видимой части спектра и инфракрасному излучению. По этой причине, актуальной проблемой остаётся получение флуоресцентных белков, обладающих яркой флуоресценцией с максимумами эмиссии флуоресценции, смещёнными в длинноволновую область спектра. Создание таких генетически кодируемых меток позволит с большей эффективностью исследовать многие процессы, протекающие в многоклеточных организмах: визуализировать метастазирование и выявлять первичную локализацию опухолей на модельных животных; исследовать миграцию определённых типов'клеток в многоклеточных организмах; изучать эмбриональное развитие и проводить другие исследования, в которых требуется проникновение флуоресцентного сигнала через толщу живых тканей. Кроме того, такие белки расширят возможности выбора при многоцветном мечении, в проточной цитофлуориметрии и в исследованиях, основанных на FRET.

Разработке и получению GFP-подобных флуоресцентных белков с эмиссией, смещённой в длинноволновую область видимого спектра и посвящена данная работа.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ПЗС прибор с зарядовой связью;

УФ ультрафиолетовая область спектра; avGFP Aequorea victoria green fluorescent protein (зелёный флуоресцентный белок из медузы Aequorea victoria);

BFP blue fluorescent protein (синий флуоресцентный белок);

BRET bioluminiscence resonance energy transfer (биолюминисцентный резонансный перенос энергии);

CFP cyan fluorescent protein (голубой флуоресцентный белок);

CP chromoprotein (хромобелок);

FP fluorescent protein (флуоресцентный белок);

FRET fluorescence* resonance energy transfer (флуоресцентный резонансный перенос энергии);

G2F gIobular-2 fragment (глобулярный фрагмент 2);

GFP green fluorescent protein (зелёный флуоресцентный белок); hDAT human dopamine transporter (человеческий транспортер допамина);

MI molecular imaging (визуализация на молекулярном*уровне);

MRI magnetic resonance imaging (магнитно-резонансная визуализация);

PALM photo-activated localization microscopy (фотоактивационная локализационная микроскопия)

PET positron emission tomography (позитрон-эмиссионная! томография);

RFP red fluorescent protein (красный флуоресцентный белок);

SPECT single photon emission computed tomography (гамма-томография);

SPIM selective plane illumination microscopy (микроскопия с селективным облучением плоскости);

WBI whole-body imaging (визуализация в целом организме);

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Щербо, Дмитрий Сергеевич

4. ВЫВОДЫ

4. Получен и охарактеризован первый яркий дальнекрасный флуоресцентный белок Katushka, а также его мономерная версия -mKate. Для мечения целевых белков получены улучшенные версии -mKate2 и тандем tdKatushka2. Показана их эффективность при визуализации в лягушках Xenopus laevis.

3.4. Заключение

10 20 30 40 50 60 70

11111 II avGFP MSKGEELFTGWPILVELPGPVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTG-KLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMK

ОэКеа MRSSKNVIKEFMRFKVRMEGTVNGHEFEIEGEGEGRPYEGHNTVKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKVYVKHPADIP ецГР578 М5ЕЫКЕШНМКЬУМЕ6ТУЫЫННЕКСТЗЕСЕККРУЕ6Т0ТМК1КУУЕССРЬРГАГР1ЬАТЗЕМУСЗКТГ1ЫНТ0С1Р

ТигЬс^РР MSELIKENMHMKLYMEGTVNNHHFKCTSEGEGKPYEGTQTMKIKWEGGPLPFAFDILATSFMYGSKAFINHTQGIP

Katushka МЗУЬ1ТЕШНМКЬУМЕСТУЫРННРКСТЗЕСЕ6КРУЕСТ0ТМК1КУУЕ66РЬРГАРР1ЬАТЗГМУСЗКТГ1ШТ061Р едГР650 М6ЕОзЯыВЕЫМНМКЬУМЕСТУЫвННГКСТЗЕ6ЕСКРУЕСТ0тИк1КУУЕССРЬРГАРО1ЬАТЗР№ГСЗКТГ1ЫНТ0С1Р еяЕР670 МСЕРЗЙЫ§ЕНМНВКЪУМЕ6ТУЫ6ННГКСТЗЕОЕ6КРУЕСТОТ1К1КУУЕССРЬРГАЕР1ЬАТЗГМУСЗКТЕ1ЫНТОС1Р ТадИГР МЗЕЫКЕШНМКЪУМЕСТУЫЫННГКСТЗЕСЕСКРУЕСТОТМЯ1КУУЕССРЬРЕАГР1ЪАТЗтУ63ЯТГ1МНТОС1Р тКа1е МЗЕЫКЕШНМКЬУМЕСТУШННГКСТЗЕСЕСКРУЕ6Т0ТМЕ1КУУЕ66РЬРГАГР1ЬАТЗ™УСЗКТГ1ШТ0С1Р mKate2 МУЗЕЫКЕШНМКЬУМЕСТУЫЫННГКСТЗЕ6ЕСКРУЕвТ0ТМК1КАУЕ6СРЬРЕАЕР1ЬАТЗГМТСЗКТГ1ЫНТ0С1Р

80 90 100 110 120 130 140 150

11111111 avGFP QHPFFKSAMPEGYVQERTIFFKPPGNYKTRAEVKFEGPTLVNRIELKGIPFKEPGNILGHKLEYNYNSHNVYIMAPKQKN

РзНес! —DYKKLSFPEGFKWERVMNFEPGGWTVTQPSSLQPGCFIYKVKFIGVNFPSPGPVMQKKTM-GWEASTERLYPR—РС еяГР57 8 —РЬГКОЗГРЕСЕТИЕЕ1ТТУЕРССУЬТАТОРТЗЬОЫСС11УЫУК1ЫСУЫГРЗЫСЗУМОККТЬ-6ИЕАЫТЕМЬУРА—Р6 ТигЬсЛГР —PFFKQSFPEGFTWERITTYEPGGVLTATQPTSFQNGCIIYNVKINGVNFPSNGPVMQKKTR-GWEANTEMLYPA—РС КаШэЬка —ОРГКОЗГРЕ6ГТИЕК1ТТУЕ06СУЬТАТООТЗЬОЫССЬ1УОТК1НСУЫГРЗМСРУМОККТЪ-6ИЕАЯТЕМ1.УРА—РБ едГР650 —PFFKQSFPEGFTWERITTYEPGGVLTATQPTSLQNGCLIYNVKINGVNFPSNGPVMQKKTL-GWEAgTEMLУPA—РЭ едГР67 0 —РГГКОЗГРЕСГТИЕР1ТТУЕРССУЬТАТОРТЗЬОЫ6СЬ1УОТК1ЫСтаГРЗШРУМОККТЪ-СИЕАЫТЕМЬУРА—РЭ

TagRFP —РГГКОЗГРЕСГТ1«ЕРУТТУЕР6СУЬТАТОРТЗЬООССЫ¥ЫУК1Е" mкate2 —PFFKQSFPEGFTWERVTTYEPGGVLTATQDTSLQDGCLIYNVKIB

ЗУ^РЗШРУМОККТЪ-СЮЕАЫТЕМЬУРА—Рй ЗУЫГРЗШРУМОККТЬ-СКЕАНТЕМЬУРА—Р6 ЗУЫГРЗЫСРУМ<2ККТЬ-СИЕА0ТЕТЬУРА—РС

160 170 180 190 200 210 220 230

1111 1111 avGFP GIKVNFKIRHNIEPGSVQLAPHYQQNTPIGP-GPVLLPPNHYLSTQSALSKPPNEKRPHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK

PsRed УЬКСЕ1НКАЬКЬКРССНУЬУЕГК31УМАККР---VQLPGYYYVPSKLPITSH-NEPYTIVEQYERTEGRHHLFL еяГР57 8 GLRGHSQMALKLVGGGYLHCSFKTTYRSKKPAKNLKMPGFHFVPHRLERIKE-APKETYVEQHEMAVAKYCPLPSKLGHR ТигЬоРГР GLRGHSQMALKLVGGGYLHCSFKTTYRSKKPAKNLKMPGFHFVPHRLERIKE-ADKETYVEQHEMAVAKYCPLPSKLGHR Ка^эЬка GLRGHSQMALKLVGGGYLHCSLKTTYRSKKPAKNLKMPGFYFVD^RLERIKE-ADKETYVEQHEMAVARYCDLPSKLGHS еяГР65 0 GLRGHSQMALKLVGGGYLHCSLKTTYRSKKPAKNLKMPGFYFVDИLERIKE-APKETYVEQHEMAVARYCPLPSKLGHS едГР67 0 6ЬРСНЯОМАЬКЬУСССУЬНСЗЬКТТУРЗККРАКЫЬКМРСГУГУРЩЬЕН1КЕ-АОКЕТУУЕОНЕМАУАЕУСРЬР5КЬСН$ TagRFP GLЯGИS■MALKLVGGGHLICИFKTTYRSKKPAKNLKMPGBYЯVDHRLERIKE-APKETYVEQHEVAVAKYCPLPSKLGHK mKate GLlGlsB^mLKLVGGGHLICИLKTTYRSKKPAKNLKMPG■Y■VPlRLERIKE-APKETYVEQHEVAVARYCDLPSKLGHK mKate2 ПT.иdfcHмДTlKT.VGGGHLIcЖктTYRSKKPAKNT,KMPrЛY^piRT,KRTKE-ADKETYVF.OHF,VAVARYГ.DLPSKT,GHR

Рисунок 15. Выравнивание аминокислотных последовательностей

Хромофоробразующие триады аминокислотных остатков подчёркнуты. Отмечены замены аминокислотных остатков относительно белка еяРР578: тёмно-красным фоном выделены замены, приводящие к батохромоному сдвигу спектра эмиссии флуоресценции; синим фоном выделены замены, приводящие к разрушению межсубъединичных взаимодействий в молекуле белка; ярко-красным фоном выделена замена 165А, ключевая для увеличения яркости тКа1е2, зелёным фоном выделены замены, отличающие Ка^Ика^-Б от Ка^Ика, т.е. приводящие к снижению токсичности; серым фоном отмечены прочие замены, приводящие к ускорению фолдинга белка или замены, эффект которых точно не определён. от 570 до 670 нм (основные характеристики приведены в таблице 1]. Все флуоресцентные белки, полученные в ходе данной работы являются мутантными вариантами белка eqFP578 дикого типа из морского анемона Entacmaea quadricolor. Выравнивание аминокислотных последовательностей приведено на рисунке 15. Флуоресцентные белки были оптимизированы для решения определённых экспериментальных задач; проверки в модельных системах показали высокую эффективность полученных белков по сравнению с существующими аналогами. Многие из разработанных белков обладают уникальными характеристиками. Katushka2 - наиболее яркий белок среди всех GFP-подобных белков с максимумами эмиссии более 620 нм. eqFP670 имеет наиболее длинноволновый максимум эмиссии флуоресценции среди всех флуоресцентных белков, известных на сегодняшний день, кроме того, для него характерна крайне высокая фото стабильность флуоресценции. Сочетание низкой токсичности, эмиссии в околоинфракрасной области, спектра и высокой яркости делает белок eqFP650 предпочтительным для экспериментов, связанных с визуализацией объектов в многоклеточных организмах. Белки TurboRFP и TagRFP отличаются высокой яркостью в красном,диапазоне. Мономерные флуоресцентные белки TagRFP, mKate и mKate2, а также псевдомономерная метка tdKatushka2 должны стать как подходящим дополнением для многоцветного мечения белков, так и основой для разработки различных биосенсоров, в том числе, основанных на FRET.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Щербо, Дмитрий Сергеевич, Москва

1. , van Thor, J.J., G.Y. Georgiev, M. Towrie, и J.T. Sage, Ultrafast and lowbarrier motions in the photoreactions of the green fluorescent protein. J Biol Chem, 2005. 280(39): p. 33652-9.

2. Konig, K., Multiphoton microscopy in life sciences. . Microsc, 2000. 200(Pt 2): p. 83-104.

3. Зубова, H.H., А.Ю. Булавина, и С.А. П., Спектральные и физико-химические свойства зелёного (GFPJ и красного (drFP583) флуоресцирующих белков. Успехи биологической химии, 2003. 43: р. 163-224.

4. Reid, B.G. и G.C. Flynn, Chromophore formation in green fluorescent protein. Biochemistry, 1997. 36(22): p. 6786-91.

5. Labas, Y.A., N.G. Gurskaya, Y.G. Yanushevich, A.F. Fradkov, K.A. Lukyanov, S.A. Lukyanov, и M.V. Matz, Diversity and evolution of the green fluorescent protein family. Proc Natl Acad Sci USA, 2002. 99(7): p. 4256-61.

6. Yarbrough, D., R.M. Wachter, K. Kallio, M.V. Matz, и S.J. Remington, Refined crystal structure ofDsRed, a red fluorescent protein from coral, at 2.0-A resolution. Proc Natl Acad Sci USA, 2001. 98(2): p. 462-7.

7. Ntziachristos, V., J. Ripoll, L.V. Wang, и R. Weissleder, Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat Biotechnol, 2005. 23(3): p. 313-20.

8. Hopf, M., W. Gohring, A. Ries, R. Timpl, и E. Hohenester, Crystal structure and mutational analysis of a perlecan-binding fragment of nidogen-1. Nat Struct Biol, 2001. 8(7): p. 634-40.

9. Matz, M.V., Y.A. Labas, и J. Ugalde, Evolution of function and color in GFP-like proteins. Methods Biochem Anal, 2006.47: p. 139-61.

10. Chudakov, D.M., S. Lukyanov, и K.A. Lukyanov, Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. Trends Biotechnol, 2005. 23(12): p. 605-13.

11. Morin, J.G. h J.W. Hastings, Energy transfer in a bioluminescent system. J Cell Physiol, 1971. 77(3): p. 313-8.

12. Shimomura, 0., F.H. Johnson, h Y. Saiga, Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol, 1962. 59: p. 223-39.

13. Matz, M.V., A.F. Fradkov, Y.A. Labas, A.P. Savitsky, A.G. Zaraisky, M.L. Markelov, h S.A. Lukyanov, Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. Nat Biotechnol, 1999.17(10): p. 969-73.

14. Verkhusha, V.V. h K.A. Lukyanov, The molecular properties and applications of Anthozoa fluorescent proteins and chromoproteins. Nat Biotechnol, 2004. 22(3): p. 289-96.

15. Baird, G.S., D.A. Zacharias, h R.Y. Tsien, Biochemistry, mutagenesis■, and oligomerization ofDsRed, a red fluorescent protein from coral. Proc Natl Acad Sci USA, 2000. 97(22): p. 11984-9.

16. Wall, M.A., M. Socolich, h R. Ranganathan, The structural basis for red fluorescence in the tetrameric GFP homolog DsRed. Nat Struct Biol, 2000. 7(12): p. 1133-8.

17. Yanushevich, Y.G., D.B. Staroverov, A.P. Savitsky, A.F. Fradkov, N.G. Gurskaya, M.E. Bulina, K.A. Lukyanov, h S.A. Lukyanov, A strategy for the generation of non-aggregating mutants of Anthozoa fluorescent proteins. FEBS Lett, 2002. 511(1-3): p. 11-4.

18. Kelmanson, I.V. h M.V. Matz, Molecular basis and evolutionary origins of color diversity in great star coral Montastraea cavernosa (Scleractinia: FaviidaJ. Mol Biol Evol, 2003. 20(7): p. 1125-33.

19. Field, S.F., M.Y. Bulina, I.V. Kelmanson, J.P. Bielawski; h M.V. Matz, Adaptive evolution of multicolored fluorescent proteins in reef-building corals. J Mol Evol, 2006. 62(3): p. 332-9.

20. Prasher, D.C., V.K. Eckenrode, W.W. Ward, F.G. Prendergast, h M.J. Cormier, Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene, 1992.111(2): p. 229-33.

21. Perozzo, M.A., K.B. Ward, R.B. Thompson, h W.W. Ward, X-ray diffraction and time-resolved fluorescence analyses of Aequorea green fluorescent protein crystals. J Biol Chem, 1988. 263(16): p. 7713-6,

22. Ormo, M., A.B. Cubitt, K. Kallio, L.A. Gross, R.Y. Tsien, h S.J. Remington, Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Science, 1996.273(5280): p. 1392-5.

23. Yang, F., L.G. Moss, h G.N. Phillips, Jr., The molecular structure of green fluorescent protein. Nat Biotechnol, 1996.14(10): p. 1246-51.

24. Phillips, G.N., Jr., Structure and dynamics of green fluorescent protein. Curr Opin Struct Biol, 1997. 7(6): p. 821-7.

25. Ward, W.W., Biochemical and physical properties of green fluorescent protein. Methods Biochem Anal, 2006. 47: p. 39-65.

26. Niwa, H., S. Inouye, T. Hirano, T. Matsuno, S. Kojima, M. Kubota, M. Ohashi, h F.I. Tsuji, Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci USA, 1996. 93(24): p. 13617-22.

27. Patterson, G.H., A new harvest of fluorescent proteins. Nat Biotechnol, 2004. 22(12): p. 1524-5.

28. Cody, C.W., D.C. Prasher, W.M. Westler, F.G. Prendergast, h W.W. Ward, Chemical structure of the hexapeptide chromophore of the Aequorea green-fluorescent protein. Biochemistry, 1993. 32(5): p. 1212-8.

29. Chalfie, M., Y. Tu, G. Euskirchen, W.W. Ward, h D.C. Prasher, Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science, 1994. 263(5148): p. 802-5.

30. Li, X., G. Zhang, N. Ngo, X. Zhao, S.R. Kain, h C.C. Huang, Deletions of the Aequorea victoria green fluorescent protein define the minimal domain required for fluorescence. J Biol Chem, 1997. 272(45): p. 28545-9.

31. Sniegowski, J.A., J.W. Lappe, H.N. Patel, H.A. Huffman, h R.M. Wachter, Base catalysis of chromophore formation in Arg96 and Glu222 variants of green fluorescent protein. J Biol Chem, 2005. 280(28): p. 26248-55.

32. Sniegowski, J.A., M.E. Phail, h R.M. Wachter, Maturation efficiency, trypsin sensitivity, and optical properties of Arg96, Glu222, and Gly67 variants of green fluorescent protein. Biochem Biophys Res Commun, 2005. 332(3): p. 657-63.

33. Ehrig, T., D.J. O'Kane, h F.G. Prendergast, Green-fluorescent protein mutants with altered fluorescence excitation spectra. FEBS Lett, 1995. 367(2): p. 163-6.

34. Brejc, K., T.K. Sixma, P.A. Kitts, S.R. Kain, R.Y. Tsien, M. Ormo, h S.J. Remington, Structural basis for dual excitation and photoisomerization of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci USA, 1997. 94(6): p. 2306-11.

35. Petersen, J., P.G. Wilmann, T. Beddoe, A.J. Oakley, R.J. Devenish, M. Prescott, h J. Rossjohn, The 2.0-A crystal structure of eqFP 611, afar red fluorescent protein from the sea anemone Entacmaea quadricolor. J Biol Chem, 2003. 278(45): p. 44626-31.

36. Mizuno, H., T.K. Mal, K.I. Tong, R. Ando, T. Furuta, M. Ikura, h A. Miyawaki, Photo-induced peptide cleavage in the green-to-red conversion of a fluorescent protein. Mol Cell, 2003.12(4): p. 1051-8.

37. Verkhusha, V.V., D.M. Chudakov, N.G. Gurskaya, S. Lukyanov, h K.A. Lukyanov, Common pathway for the red chromophore formation in fluorescent proteins and chromoproteins. Chem Biol, 2004.11(6): p. 84554.

38. Gross, L.A., G.S. Baird, R.C. Hoffman, K.K. Baldridge, h R.Y. Tsien, The structure of the chromophore within DsRed, a red fluorescent protein from coral Proc Natl Acad Sci USA, 2000. 97(22): p. 11990-5.

39. Karasawa, S., T. Araki, T. Nagai, H. Mizuno, h A. Miyawaki, Cyan-emitting and orange-emitting fluorescent proteins as a donor/acceptor pair forfluorescence resonance energy transfer. Biochem J, 2004. 381 (Pt 1): p. 307-12.

40. Kikuchi, A., E. Fukumura, S. Karasawa, H. Mizuno, A. Miyawaki, и Y. Shiro, Structural characterization of a thiazoline-containing chromophore in an orange fluorescent protein, monomeric Kusabira Orange. Biochemistry, 2008. 47(44): p. 11573-80.

41. Remington, S.J., R.M. Wachter, D.K. Yarbrough, B. Branchaud, D.C. Anderson, K. Kallio, и К.A. Lukyanov, zFP538, a yellow-fluorescent protein from Zoanthus, contains a novel three-ring chromophore. Biochemistry, 2005.44(1): p. 202-12.

42. Pakhomov, A.A., N.V. Pletneva, T.A. Balashova, и V.I. Martynov, Structure and reactivity of the chromophore of a GFP-like chromoprotein from Condylactisgigantea. Biochemistry, 2006. 45(23): p. 7256-64.

43. Пахомов, A.A., Ю.А. Третьякова, и В.И. Мартынов, Посттрансляционные реакции, приводящие к смещению спектров белка asFP595 из Anemonia sulcata в длинноволновую область. Биоорг. химия, 2010. 36(1): р. 117-121.

44. Heim, R. и R.Y. Tsien, Engineering green fluorescent protein for improved brightness, longer wavelengths and fluorescence resonance energy transfer. Curr Biol, 1996. 6(2): p. 178-82.

45. Tomosugi, W., T. Matsuda, T. Tani, T. Nemoto, I. Kotera, K. Saito, K. Horikawa, и Т. Nagai, An ultramarine fluorescent protein with increased photostability and pH insensitivity. Nat Methods, 2009. 6(5): p. 351-3.

46. Ai, H.W., N.C. Shaner, Z. Cheng, R.Y. Tsien, и R.E. Campbell, Exploration of new chromophore structures leads to the identification of improved blue fluorescent proteins. Biochemistry, 2007.46(20): p. 5904-10.

47. Shaner, N.C., R.E. Campbell, P.A. Steinbach, B.N. Giepmans, A.E. Palmer, и R.Y. Tsien, Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol, 2004. 22(12): p. 1567-72.

48. Shu, X., N.C. Shaner, C.A. Yarbrough, R.Y. Tsien, и S.J. Remington, Novel chromophores and buried charges control color in mFruits. Biochemistry, 2006. 45(32): p. 9639-47.

49. Zacharias, D.A., Sticky caveats in an otherwise glowing report: oligomerizing fluorescent proteins and their use in cell biology. Sci STKE, 2002. 2002(131): p. PE23.

50. Zacharias, D.A., J.D. Violin, A.C. Newton, h R.Y. Tsien, Partitioning oflipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science, 2002. 296(5569): p. 913-6.

51. Campbell, R.E., 0. Tour, A.E. Palmer, P.A. Steinbach, G.S. Baird, D.A.i

52. Zacharias, h R.Y. Tsien, A monomeric red fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci USA, 2002. 99(12.: p. 7877-82.

53. Olenych, S.G., N.S. Claxton, G.K. Ottenberg, h M.W. Davidson, The fluorescent protein color palette. Curr Protoc Cell Biol, 2007. Chapter 21: p. Unit 21 5.

54. Patterson, G.H., S.M. Knobel, W.D. Sharif, S.R. Kain, h D.W. Piston, Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophys J, 1997. 73(5): p. 2782-90.

55. Cubitt, A.B., L.A. Woollenweber, h R. Heim, Understanding structure-function relationships in the Aequorea victoria green fluorescent protein. Methods Cell Biol, 1999. 58: p. 19-30.

56. Mena, M.A., T.P. Treynor, S.L. Mayo, h P.S. Daugherty, Blue fluorescent proteins with enhanced brightness and photostability from a structurally targeted library. Nat Biotechnol, 2006. 24(12): p. 1569-71.

57. Rizzo, M.A., G.H. Springer, B. Granada, h D.W. Piston, An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nat Biotechnol, 2004. 22(4): p. 445-9.

58. Matsuda, T., A. Miyawaki, h T. Nagai, Direct measurement of protein dynamics inside cells using a rationally designed photoconvertible protein. Nat Methods, 2008. 5(4): p. 339-45.

59. Zacharias, D.A. h R.Y. Tsien, Molecular biology and mutation of green fluorescent protein. Methods Biochem Anal, 2006.47: p. 83-120.

60. Richards, B., L. Zharkikh, F. Hsu, C. Dunn, A. Kamb, h D.H. Teng, Stable expression of Anthozoa fluorescent proteins in mammalian cells. Cytometry, 2002. 48(2): p. 106-12.

61. Karasawa, S., T. Araki, M. Yamamoto-Hino, h A. Miyawaki, A green-emitting fluorescent protein from Galaxeidae coral and its monomeric version for use in fluorescent labeling. J Biol Chem, 2003. 278(36): p. 34167-71.

62. Nagai, T., K. Ibata, E.S. Park, M. Kubota, K. Mikoshiba, h A. Miyawaki, A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol, 2002. 20(1): p. 87-90.

63. Rekas, A., J.R. Alattia, T. Nagai, A. Miyawaki, h M. Ikura, Crystal structure of venus, a yellow fluorescent protein with improved maturation and reduced environmental sensitivity. J Biol Chem, 2002. 277(52): p. 505738.

64. Griesbeck, O., G.S. Baird, R.E. Campbell, D.A. Zacharias, h R.Y. Tsien, Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications. . Biol Chem, 2001. 276(31): p. 29188-94.

65. Nguyen, A.W. h P.S. Daugherty, Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. Nat Biotechnol, 2005. 23(3): p. 355-60.

66. Verkhusha, V.V., I.M. Kuznetsova, O.V. Stepanenko, A.G. Zaraisky, M.M. Shavlovsky, K.K. Turoverov, h V.N. Uversky, High stability of Discosoma DsRed as compared to Aequorea EGFP. Biochemistry, 2003. 42(26): p. 7879-84.

67. Bevis, B.J. h B.S. Glick, Rapidly maturing variants of the Discosoma red fluorescent protein (DsRedJ. Nat Biotechnol, 2002. 20(1): p. 83-7.

68. Wang, L., W.C. Jackson, P.A. Steinbach, h R.Y. Tsien, Evolution of new nonantibody proteins via iterative somatic hypermutation. Proc Natl Acad Sei USA, 2004.101(48): p. 16745-9.

69. Gurskaya, N.G., A.F. Fradkov, A. Terskikh, M.V. Matz, Y.A. Labas, V.l. Martynov, Y.G. Yanushevich, K.A. Lukyanov, h S.A. Lukyanov, GFP.-like chromoproteins as a source of far-red fluorescent proteins. FEBS Lett, 2001. 507(1): p. 16-20.

70. Terskikh, A., A. Fradkov, G. Ermakova, A. Zaraisky, P. Tan, A.V. Kajava, X. Zhao, S. Lukyanov, M. Matz, S. Kim, I. Weissman, h P. Siebert, "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science, 2000. 290(5496): p. 1585-8.

71. Miyawaki, A., A. Sawano, h T. Kogure, Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores. Nat Cell Biol, 2003. Suppl: p. Sl-7.

72. Lippincott-Schwartz, }., N. Altan-Bonnet, h G.H. Patterson, Photobleaching and photoactivation: following protein dynamics in living cells. Nat Cell Biol, 2003. Suppl: p. S7-14.

73. Patterson, G.H. m J. Lippincott-Schwartz, A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science, 2002. 297(5588): p. 1873-7.

74. Chudakov, D.M., V.V. Verkhusha, D.B. Staroverov, E.A. Souslova, S. Lukyanov, h K.A. Lukyanov, Photoswitchable cyan fluorescent protein for protein tracking. Nat Biotechnol, 2004. 22(11): p. 1435-9.

75. Chudakov, D.M., V.V. Belousov, A.G. Zaraisky, V.V. Novoselov, D.B. Staroverov, D.B. Zorov, S. Lukyanov, h K.A. Lukyanov, Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling. Nat Biotechnol, 2003. 21(2): p. 191-4.

76. Ando, R., H. Mizuno, h A. Miyawaki, Regulated fast nucleocytoplasmic shuttling observed by reversible protein highlighting. Science, 2004. 306(5700): p. 1370-3.

77. Miesenböck, G., D.A. De Angelis, h J.E. Rothman, Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature, 1998. 394(6689): p. 192-5.

78. Abad, M.F., G. Di Benedetto, P.J. Magalhaes, L. Filippin, h T. Pozzan, Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant. J Biol Chem, 2004. 279(12): p. 11521-9.

79. Wachter, R.M. h S.J. Remington, Sensitivity of the yellow variant of green fluorescent protein to halides and nitrate. Curr Biol, 1999. 9(17): p. R628-9.

80. Siegel, M.S. h E.Y. Isacoff, A genetically encoded optical probe of membrane voltage. Neuron, 1997.19(4): p. 735-41.

81. Guerrero, G., M.S. Siegel, B. Roska, E. Loots, h E.Y. Isacoff, Tuning FlaSh: redesign of the dynamics, voltage range, and color of the genetically encoded optical sensor of membrane potential. Biophys J, 2002. 83(6): p. 3607-18.

82. Nakai, J., M. Ohkura, h K. Imoto, A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol, 2001. 19(2): p. 137-41.

83. Ting, A.Y., K.H. Kain, R.L. Klemke, h R.Y. Tsien, Genetically encoded fluorescent reporters of protein tyrosine kinase activities in living cells. Proc Natl Acad Sci USA, 2001. 98(26): p. 15003-8.

84. Sato, M. h Y. Umezawa, Imaging protein phosphorylation by fluorescence in single living cells. Methods, 2004. 32(4): p. 451-5.

85. Ye, K. h J.S. Schultz, Genetic engineering of an allostericaJly based glucose indicator protein for continuous glucose monitoring by fluorescence resonance energy transfer. Anal Chem, 2003. 75(14): p. 3451-9.

86. DiPilato, L.M., X. Cheng, h J. Zhang, Fluorescent indicators of cAMP and Epac activation reveal differential dynamics of cAMP signaling within discrete subcellular compartments. Proc Natl Acad Sci USA, 2004. 101(47): p. 16513-8.

87. Ozawa, T., S. Nogami, M. Sato, Y. Ohya, h Y. Umezawa, A fluorescent indicator for detecting protein-protein interactions in vivo based on protein splicing. Anal Chem, 2000. 72(21): p. 5151-7.

88. Cassidy, P.J. h G.K. Radda, Molecular imaging perspectives. J R Soc Interface, 2005. 2(3): p. 133-44.

89. Blasberg, R.G. h J.G. Tjuvajev, Molecular-genetic imaging: current and future perspectives. J Clin Invest, 2003.111(11): p. 1620-9.

90. Li, K.C. h M.D. Bednarski, Vascular-targeted molecular imaging using functionalized polymerized vesicles. J Magn Reson Imaging, 2002. 16(4): p. 388-93.

91. Weinmann, H.J., R.C. Brasch, W.R. Press, h G.E. Wesbey, Characteristics of gadolinium-DTPA complex: a potential NMR contrast agent. AJR Am J Roentgenol, 1984.142(3): p. 619-24.

92. Sharmaj V., G.D. Luker, h D. Piwnica-Worms, Molecular imaging of gene expression and protein function in vivo with PET and SPECT. J Magn Reson Imaging, 2002.16(4): p. 336-51.

93. Mandl, S., C. Schimmelpfennig, M. Edinger, R.S. Negrin, h C.H. Contag, Understanding immune cell trafficking patterns via in vivo bioluminescence imaging. J Cell Biochem SuppI, 2002. 39: p. 239-48.

94. Kaijzel, E.L., G. van der Pluijm, h C.W. Lowik, Whole-body optical imaging in animal models to assess cancer development and progression. Clin Cancer Res, 2007.13(12): p. 3490-7. , •

95. Wu, J.C., M. Inubushi, G. Sundaresan, H.R. Schelbert, h S.S. Gambhir, Optical imaging of cardiac reporter gene expression in living rats. Circulation, 2002.105(14): p. 1631-4.

96. Hoffman, R.M., The multiple uses of fluorescent proteins to visualize cancer in vivo. Nat Rev Cancer, 2005. 5(10): p. 796-806.

97. Huisken, J., J; Swoger, :F. Del Bene, J. Wittbrodt, h E.H. Stelzer, Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science, 2004. 305(5686): p. 1007-9.

98. Hell, S.W., M. Dyba, . h J. S., Concepts for nanoscale resolution in fluorescence microscopy. Curr Opin Neurobiol; 2004.14(5): p. 599-609.

99. Yang, Mi, E. Baranov, A.R. Moossa, S. Penman, h R.M. Hoffman, Visualizing gene expression by whole-body fluorescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000. 97(22): p. 12278-82.

100. Vincent, P., U. Maskos, I. Charvet, L. Bourgeais, L. Stoppini, N. Leresche, J.P. Changeux, R. Lambert, P. Meda, h D. Paupardin-Tritsch, Live imagingof neural structure and function by fibred fluorescence microscopy. EMBO Rep, 2006. 7(11): p. 1154-61.

101. Sugita, M. h Y. Shiba, Genetic tracing shows segregation of taste neuronal circuitries for bitter and sweet. Science, 2005. 309(5735): p. 781-5.

102. Hirrlinger, P.G., A. Scheller, C. Braun, M. Quintela-Schneider, B. Fuss, J. Hirrlinger, h F. Kirchhoff, Expression of reef coral fluorescent proteins in the central nervous system of transgenic mice. Mol Cell Neurosci, 2005. 30(3): p. 291-303.

103. Wang, J.W., A.M. Wong, J. Flores, L.B. Vosshall, h R. Axel, Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell, 2003.112(2): p. 271-82.

104. Bozza, T., J.P. McGann, P. Mombaerts, h M. Wachowiak, In vivo imaging of neuronal activity by targeted expression of a genetically encoded probe in the mouse. Neuron, 2004. 42(1): p. 9-21.

105. Yu, D., G.S. Baird, R.Y. Tsien, h R.L. Davis, Detection of calcium transients in Drosophila mushroom body neurons with camgaroo reporters. J Neurosci, 2003. 23(1): p. 64-72.

106. Higashijima, S., M.A. Masino, G. Mandel, h J.R. Fetcho, Imaging neuronal activity during zebraflsh behavior with a genetically encoded calcium indicator. J Neurophysiol, 2003. 90(6): p. 3986-97.

107. Wilson, J.M., D.A. Dombeck, M. Diaz-Rios, R.M. Harris-Warrick, h R.M. Brownstone, Two-photon calcium imaging of network activity in XFP-expressing neurons in the mouse. J Neurophysiol, 2007. 97(4): p. 311825.

108. Kerr, R., V. Lev-Ram, G. Baird, P. Vincent, R.Y. Tsien, h W.R. Schafer, Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle ofC. elegans. Neuron, 2000. 26(3): p. 583-94.

109. Shimozono, S., T. Fukano, K.D. Kimura, I. Mori, Y. Kirino, h A. Miyawaki, Slow Ca2+ dynamics in pharyngeal muscles in Caenorhabditis elegans during fast pumping. EMBO Rep, 2004. 5(5): p. 521-6.

110. Nyqvist, D., G. Mattsson, M. Kohler, V. Lev-Ram, A. Andersson, P.O. Carlsson, A. Nordin, P.O. Berggren, h L. Jansson, Pancreatic islet functionin a transgenic mouse expressing fluorescent protein. J Endocrinol, 2005. 186(2): p. 333-41.

111. Ho, S.N., H.D. Hunt, R.M. Horton, J.K. Pullen, h L.R. Pease, Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene, 1989. 77(1): p. 51-9.

112. Mohun, T.J., N. Garrett, h J.B. Gurdon, Upstream sequences required for tissue-specific activation of the cardiac actin gene in Xenopus laevis embryos. EMBO J, 1986. 5(12): p. 3185-93.

113. Wiedenmann, J., B. Vallone, F. Renzi, K. Nienhaus, S. Ivanchenko, C. Rocker, h G.U. Nienhaus, Red fluorescent protein eqFP611 and its genetically engineered dimeric variants. J Biomed Opt, 2005. 10(1): p. 14003.

114. Shcherbo, D., E.A. Souslova, J. Goedhart, T.V. Chepurnykh, A. Gaintzeva, Shemyakina, II, T.W. Gadella, S. Lukyanov, h D.M. Chudakov, Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins. BMC Biotechnol, 2009. 9(1): p. 24.

115. Fradkov, A.F., V.V. Verkhusha, D.B. Staroverov, M.E. Bulina, Y.G. Yanushevich, V.I. Martynov, S. Lukyanov, h K.A. Lukyanov, Far-red fluorescent tag for protein labelling. Biochem J, 2002. 368(Pt 1): p. 1721.

116. Strack, R.L., D.E. Strongin, D. Bhattacharyya, W. Tao, A. Berman, H.E. Broxmeyer, R.J. Keenan, h B.S. Glick, A noncytotoxic DsRed variant for whole-cell labeling. Nat Methods, 2008.

117. Strack, R.L., B. Hein, D. Bhattacharyya, S.W. Hell, B.J. Keenan, h B.S. Glick, A rapidly maturing far-red derivative of DsRed-Express2 for whole-cell labeling. Biochemistry, 2009.

Информация о работе

Щербо, Дмитрий Сергеевич
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.03

Диссертация

Дальнекрасные флуоресцентные белки - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы